CN108884153B - 与aimp2-dx2蛋白质特异性结合的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与AIMP2‑DX2蛋白质特异性结合的抗体，尤其涉及与AIMP2‑DX2特异性结合的抗体或抗体片段，其识别作为表位的多肽，该多肽包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列，涉及用于诊断癌症的包含该抗体或抗体片段的组合物，编码该抗体的多核苷酸和重组表达载体，使用该抗体或抗体片段转化的细胞以及用于制备该抗体或该抗体片段的方法。由于根据本发明的抗体不与野生型AIMP2蛋白结合，但与具有外显子2缺失的AIMP2‑DX2突变蛋白特异性结合，因此它可以有效地用于证实AIMP2‑DX2蛋白质的存在和表达水平。AIMP2‑DX2蛋白质与诸如癌症和炎性疾病的病理学相关，并且在癌症例如肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌等中过度表达。因此，本发明可用于开发一种癌症诊断组合物，通过检测作为生物标记物的AIMP2‑DX2来判断癌症的发展和进程。

Description

与AIMP2-DX2蛋白质特异性结合的抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年3月10日提交的韩国专利申请号10-2016-0028809的优先权，其全部内容通过引用并入本文，如同完整地在此阐述一样。
技术领域
本发明涉及与AIMP2-DX2特异性结合的抗体，尤其涉及与AIMP2-DX2特异性结合的抗体或抗体片段，其识别作为表位(epitope)的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，涉及用于诊断癌症的包含该抗体或抗体片段的组合物，编码该抗体的多核苷酸和重组表达载体，使用该抗体或抗体片段的转化细胞以及涉及一种用于制备该抗体或该抗体片段的方法。
背景技术
AIMP2(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctionalprotein 2)是参与形成氨酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase，ARS)复合物的蛋白质之一。已知AIMP2除了在蛋白质合成方面的原始功能外，还具有通过与作为新型肿瘤抑制剂(tumor suppressor)的Smad2/3直接相互作用来增强TGF-β信号传导的功能。
如本发明人在韩国专利No.10-0762995中所公开的，已经观察到AIMP2-DX2，一种AIMP2的缺失外显子(exon)2的变异体在各种诸如肺癌、肝癌、皮肤癌、乳腺癌、肾癌和骨肉瘤等的癌细胞系和组织中的过度表达。同时，当AIMP2-DX2通过转化正常细胞而被过度表达时，野生型(WT)AIMP2的水平大大降低并且AIMP2的活性受到抑制，从而阻止AIMP2向细胞核移动，c-myc表达增加，细胞生长得到促进，进而导致TGF-β信号功能异常。这表明AIMP2-DX2与癌症的发展和进展密切相关。
此外，韩国专利No.10-1067816首次公开了AIMP2通过与TRAF2的相互作用介导TNF-α的凋亡活性(apoptotic activity)，并且该活性受AIMP2-DX2调节。此外，还发现AIMP2-DX2影响炎症标志物COX-2的表达，并且表明抑制AIMP2-DX2活性可有效治疗炎性疾病。
由于AIMP2-DX2蛋白质已显示出与各种疾病的诱导和进展有关，AIMP2-DX2正成为新药开发的新靶物质。因此，有必要开发一种能够准确区分和检测野生型AIMP2和突变型AIMP2-DX2蛋白质的试剂和诊断方法的技术。
发明内容
由于人体AIMP2-DX2中的外显子2的缺失，本发明人筛选了用于连接(junction)外显子1和外显子3的Fab噬菌体文库(phage library)，从而通过选择不与AIMP2结合，仅与AIMP2-DX2特异性结合的抗体来完成本发明。
因此，本发明的一个方面是提供与AIMP2-DX2特异性结合的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段识别作为表位(epitope)的多肽，该多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
本发明的另一个方面是提供一种用于诊断癌症的组合物，其包含抗体或抗体片段。
本发明的另一个方面是提供编码抗体或抗体片段的多核苷酸。
本发明的另一个方面是提供包含该多核苷酸的重组表达载体。
本发明的另一个方面是提供用重组表达载体转化的细胞。
本发明的另一个方面是提供一种制备与AIMP2-DX2特异性结合的抗体或抗体片段的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用编码抗体或抗体片段的重组表达载体转化宿主细胞；
(b)培养宿主细胞并产生抗体或抗体片段；和
(c)获得宿主细胞中产生的抗体或抗体片段。
本发明的另一个方面是提供抗体或抗体片段在制备用于诊断癌症的药剂中的应用。
本发明的另一个方面是提供一种用于诊断受试者癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从受试者中获得生物样本；
(b)使用抗体或抗体片段测定生物样本中AIMP2-DX2蛋白质的水平；以及
(c)将测定的AIMP2-DX2蛋白质水平与正常受试者中AIMP2-DX2蛋白质的水平进行比较。
根据本发明的一个方面，提供了抗体或抗体片段，其与AIMP2-DX2特异性结合，该抗体或抗体片段识别作为表位(epitope)的多肽，该多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诊断癌症的组合物，其包含抗体或抗体片段。
根据本发明的另一个方面，提供了编码抗体或抗体片段的多核苷酸。
根据本发明的另一个方面，提供了包含该多核苷酸的重组表达载体。
根据本发明的另一个方面，提供了用重组表达载体转化的细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备与AIMP2-DX2特异性结合的抗体或抗体片段的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用编码抗体或抗体片段的重组表达载体转化宿主细胞；
(b)培养宿主细胞并产生抗体或抗体片段；和
(c)获得宿主细胞中产生的抗体或抗体片段。
根据本发明的另一个方面，提供了抗体或抗体片段在制备用于诊断癌症的药剂中的应用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于诊断受试者癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从受试者中获得生物样本；
(b)使用抗体或抗体片段测定生物样本中AIMP2-DX2蛋白质的水平；以及
(c)将测定的AIMP2-DX2蛋白质水平与正常受试者中AIMP2-DX2蛋白质的水平进行比较。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供与AIMP2-DX2特异性结合的抗体或抗体片段，其识别作为表位(epitope)的多肽，该多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在本发明中，‘AIMP2-DX2’是指突变体，在该突变体中，删除了在野生型(wildtype,WT)AIMP2蛋白中的外显子2(exon2)的区域。AIMP2(氨酰-tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白2)(aminoacyl-tRNAsynthetase complex-interacting multifunctionalprotein 2)蛋白质是参与形成含有氨酰-tRNA合成酶的复合物的蛋白质之一，也称为p38、JTV-1、JTV1或p38/JTV-1，并编码在人体的7号染色体(7p22)的AIMP2基因中。已发现AIMP2蛋白质是由312个或320个氨基酸(aa)组成的蛋白质，312aa蛋白质的氨基酸序列公开为Genbank登录号AAC50391.1或GI：1215669，320aa蛋白质的氨基酸序列公开为Genbank登录号AAH13630.1或GI：15489023等，并且也在文献(312aa version:Nicolaides,N.C.,Kinzler,K.W.and Vogelstein,B.Analysis of the 5'region of PMS2revealsheterogeneous transcripts and a novel overlapping gene,Genomics 29(2),329-334(1995)；320aa version:Generation and initial analysis of more than 15,000full-length human and mouse cDNA sequences,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26),16899-16903(2002))中有所描述。
因此，在本发明中，AIMP2-DX2蛋白质是指突变蛋白质，其中对应于外显子2的氨基酸序列从312aa或320aa的AIMP2蛋白质中缺失。AIMP2-DX2蛋白质包括在AIMP2以及AIMP2蛋白质的等同物(具有与AIMP2基本相同的活性的功能等同物，这是一种通过替换、缺失、插入氨基酸序列的突变体，或其组合；或具有与AIMP2基本相同的活性的功能衍生物，其具有增加或减少的物理化学性质的改变)的整个序列中具有外显子2区域缺失的蛋白质。另外，AIMP2-DX2蛋白质是指AIMP2的外显子2的总氨基酸序列缺失或者外显子2的部分序列缺失的蛋白质，从而使得与AIMP2的外显子1和外显子3对应的氨基酸序列足够接近以致可被本发明的抗体识别。此外，AIMP2-DX2蛋白质还指具有外显子1，外显子3和/或外显子4部分缺失的蛋白质。优选地，本发明的AIMP2-DX2蛋白质是AIMP2蛋白质的所有外显子2区域缺失的蛋白质，即由外显子2编码的69个氨基酸完全缺失，使得AIMP2的外显子1的最后一个氨基酸和外显子3的第一个氨基酸是相连的。
在本发明中，“抗体(antibody)”也称为免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，并且是通过选择性地作用于抗原而参与免疫的蛋白质的总称。在自然界中发现的整个抗体(wholeantibody)通常由两条轻链(LC)和两条重链(heavy chain，HC)和由多个结构域组成的多肽组成，或由两对作为基本单位的上述HC(heavy chain)/LC(light chain)组成。构成哺乳动物抗体的重链一共有五种：由希腊字母α、δ、ε、γ和μ表示。根据重链的类型，这些形成不同类型的抗体，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。构成哺乳动物抗体的轻链有两种：λ和κ。
根据氨基酸序列的可变性，抗体的重链和轻链在结构上分为可变区和恒定区。取决于抗体的类型，重链的恒定区由三个或四个重链恒定区组成，如CH1、CH2和CH3(IgA、IgD和IgG抗体)和CH4(IgE和IgM抗体)，而轻链由CL组成，CL是一个恒定区。重链或轻链的可变区分别由重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的一个结构域组成。轻链和重链通过单个二硫键(disulfide bond)连接，每个可变区和恒定区并排排列，并且与轻链连接的两个重链分子通过两个共价二硫键连接形成完整抗体。整个抗体通过重链和轻链的可变区与抗原特异性结合。由于整个抗体由两条重链和两条轻链(HC/LC)组成，因此整个抗体的一个分子具有单一特异性的二价性，通过两个可变区对与相同的两个抗原分子结合。与抗原结合的抗体可变区被称为抗体的抗原结合位点(antigen-binding site)，抗原表面上被抗体识别的区域被称为表位(epitope)。
包含抗原结合位点(antigen-binding site)的抗体的可变区包括具有低序列可变性的骨架区(framework region,FR)和互补决定区(complementary determiningregion,CDR)，其中互补决定区是具有高序列可变性的超变区(hypervariable region)。VH和VL中的每一个由三个CDR和四个FR组成，其以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序从N端到C端排列。在抗体的可变区中，CDR具有最高的序列可变性，直接与抗原结合，并且对于抗体的抗原特异性是最重要的。
根据本发明的抗体是抗体或抗体片段，其与AIMP2-DX2突变蛋白质特异性结合，并且特征性地识别一种作为表位(epitope)的多肽，该多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。SEQ ID NO：1的氨基酸序列(下文称为AIMP2-DX2抗原肽)是一个在一个区域中有11个氨基酸的序列，其中AIMP2-DX2蛋白质中的外显子1(exon1)和外显子3(exon3)在在该区域处连接，并且外显子(exon2)在AIMP2蛋白质中完全缺失，所述氨基酸序列为GHVQDYGALKD。N-端序列GHVQ对应于外显子1，C-端序列DYGALKD对应于外显子3(参见图1B)。由于SEQ ID NO：1的氨基酸序列不存在于没有外显子2缺失的野生型AIMP2蛋白质中，因此识别作为表位的SEQ ID NO：1的抗体或抗体片段不与野生型AIMP2蛋白质结合，而仅与AIMP2-DX2突变蛋白质特异性结合。
本发明人筛选了噬菌体展示(phage-displayed)的Fab文库，以开发识别作为表位(epitope)的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的抗体，并与AIMP2-DX2突变蛋白质特异性结合。简言之，将用于缀合载体蛋白与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的半胱氨酸(Cys)氨基酸添加至C-端并缀合载体蛋白和钥孔血兰素，并且将载体蛋白-缀合的肽注射到兔子中以诱导免疫应答。对应于兔抗体可变区的cDNA由从免疫应答被诱导的兔的脾中提取的mRNA合成，并与编码人体Fab的抗体恒定区的DNA组合，并插入用于噬菌体展示的pComb3XTT载体中。通过将编码兔/人嵌合体Fab的载体转化到大肠杆菌(ER2537)中并用辅助噬菌体(helper phage)感染而制备的Fab文库针对AIMP2-DX2蛋白质进行淘选，后选择与AIMP2-DX2蛋白质结合的克隆。
本发明人使用siRNA进行了诸如抗原预吸附(antigen pre-adsorption)和抑制抗原表达的实验，并发现选自Fab文库筛选的H5抗体及其片段(Fab)与AIMP2-DX2突变蛋白特异性结合。H5抗体和AIMP2-DX2变体之间的结合不受影响AIMP2-DX2变体蛋白溶解度的N-端氨基酸缺失的影响。特别地，通过仅与AIMP2-DX2蛋白质结合而完全不与野生型AIMP2蛋白质结合，本发明的抗体在选择性地检测AIMP2-DX2突变蛋白质方面非常有效。
根据本发明的抗体或抗体片段的优选特征在于包含：
重链可变区，其包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)1，含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链CDR3；和轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1，含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3。
此外，根据本发明的抗体或抗体片段的优选特征在于由以下组成：
重链可变区，其包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)1，含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链CDR3；和轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1，含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3。
此外，根据本发明的抗体或抗体片段的优选特征在于可以基本上由以下组成：
重链可变区，其包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)1，含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链CDR3；和轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1，含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3。
此外，根据本发明的抗体或抗体片段的特征在于包含重链和轻链的CDR，并且包含含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
此外，根据本发明的抗体或抗体片段的特征在于包含重链和轻链的CDR，并且由含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链可变区(VL)组成。
此外，根据本发明的抗体或抗体片段的特征在于包含重链和轻链的CDR，并且基本上由含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链可变区(VL)组成。
根据本发明的抗体的特征在于包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的轻链。
此外，根据本发明的抗体的特征在于由含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的轻链组成。
此外，根据本发明的抗体的特征在于基本上由包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的轻链组成。
根据本发明的抗体或抗体片段不受限制，只要其具有CDR、VH和VL，或轻链结构和重链结构，并且抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD形式的抗体。优选地，抗体或抗体片段可以是IgG形式的抗体。
此外，根据本发明的抗体片段是指保留与AIMP2-DX2抗原特异性结合的抗体片段，其尤其可以是Fab、F(ab)2、Fab'、F(ab')2、Fv、双抗体(diabody)、scFv等形式。Fab(fragmentantigen-binding)是抗体的抗原结合片段，由重链的一个可变区和一个恒定区和轻链的一个可变区和一个恒定区组成。F(ab')2是通过使用胃蛋白酶水解抗体产生的片段，并且具有在重链铰链(hinge)处通过二硫键连接(disulfide bond)的两个Fab的形式。F(ab')是单体抗体片段，其中将重链铰链添加到通过还原F(ab')2片段的二硫键获得的Fab中。Fv(variable fragment)(可变片段)是仅由重链和轻链的可变区组成的抗体片段。单链可变片段(single chain variable fragment,scFv)是重组抗体片段，其中VH和VL通过柔性肽接头连接。双抗体(diabody)是片段的一种形式，其中scFv的VH和VL通过非常短的接头连接，并且不能彼此结合，而是通过分别与相同类型的另一scFv的VL和VH结合形成二聚物。
此外，根据本发明的抗体可以是衍生自单个B细胞的单克隆(monoclonal)抗体或衍生自多个B细胞的多克隆(polyclonal)抗体，并且优选地是单克隆抗体，其是一组具有基本相同的抗体的重链和轻链的氨基酸序列的抗体。根据本发明的抗体或抗体片段可以衍生自任何动物，包括哺乳动物、鸟类等，包括人，并且可以是嵌合抗体(chimera)或具有不同物种的抗体序列的抗体片段。本发明的抗体或抗体片段可以与酶、荧光物质、放射性物质和蛋白质等缀合，但不限于此。
本发明还提供一种用于诊断癌症的组合物，其包含根据本发明的抗体或抗体片段。
AIMP2-DX2突变蛋白在多种癌症中过度表达，并且已知与癌症的发展和进展密切相关。根据本发明人(韩国专利No.10-0762995)，AIMP2-DX2在各种类型的癌细胞系和癌组织，例如肺癌、肝癌、皮肤癌、乳腺癌、肾癌、骨肉瘤等中特异性过度表达。当AIMP2-DX2过度表达时，具有肿瘤抑制(tumor suppressor)功能的野生型AIMP2的水平显著降低，并且其活性如移动至细胞核受到抑制。另外，AIMP2-DX2过度表达增加c-myc的表达，阻断AIMP2向细胞核迁移，引起TGF-β信号传导异常，并且AIMP2-DX2表达水平与癌症的发展和进展之间关系密切。因此，可以知道通过检测AIMP2-DX2的异常表达或异常过度表达可以诊断癌症。
根据本发明的用于诊断癌症的组合物可以无限制地诊断，只要待诊断的癌症是异常表达或过度表达AIMP2-DX2的癌症即可。例如，可以诊断结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌、黑色素瘤、淋巴瘤、再生障碍性贫血和血癌等，该组合物优选可用于诊断乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌症、肝癌、皮肤癌、肾癌、骨肉瘤等。除了根据本发明的抗体或抗体片段之外，根据本发明的用于诊断癌症的组合物还可以包含多个元素，该多个元素通常利用诸如二抗等的抗体，用于二抗比色反应的底物，辅因子等来检测蛋白。
本发明还提供了编码根据本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸。
具体地，多核苷酸可以是包含编码重链的SEQ ID NO.16的核苷酸序列的多核苷酸；或者是包含编码本发明抗体轻链的SEQ ID NO.18的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明还提供了重组表达载体，其包含编码根据本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸。
在本发明中，“重组(recombinant)”可以以与“遗传操作(geneticmanipulation)”相容的方式使用，并且是指使用分子克隆(molecular cloning)的实验技术，例如转化、切割或连接基因，来制备天然状态下不存在的基因。在本发明中，“表达(expression)”是指在细胞中产生蛋白质或核酸。
在本发明中，“重组表达载体”是能够在合适的宿主细胞(host cell)中表达所需蛋白质或核酸(RNA)的载体，并且是包含必要调节元件的基因构建体，该必要调节元件能够与多核苷酸(基因)插入物可操作地连接(operably linked)。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列和编码所需蛋白质或RNA的核酸序列之间的“功能性连接(functionallinage)”，以执行一般功能，并且该基因可以通过表达控制序列表达。“表达控制序列(expression control sequence)”是指DNA序列，其与特定宿主细胞中多核苷酸序列的表达可操作地连接并控制其表达。此类控制序列包括但不限于用于进行转录的启动子，用于调节转录的任何操纵序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，调节转录和翻译终止的序列，起始密码子，终止密码子，多腺苷酸化信号和增强子等。
本发明的重组表达载体没有特别限制，只要它是常规用于克隆和抗体产生领域的载体即可。重组表达载体的实例包括但不限于质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。衍生于大肠杆菌的质粒(pBR322、pBR325、pUC118和pUC119、pET-22b)(+))，衍生于枯草芽孢杆菌(pUB110和pTP5)的质粒和衍生于酵母的质粒(YEp13，YEp24和YCp50)可用作质粒，而动物病毒如逆转录病毒、腺病毒或痘苗病毒，昆虫病毒如杆状病毒等可用作病毒。可以使用通常用于噬菌体展示的pComb3家族的载体，并且为了表达哺乳动物细胞中的抗体，可以使用通常用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质的载体，例如pcDNA或pVITRO。
本发明还提供了用重组表达载体转化的细胞，所述重组表达载体包含编码根本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸。
对本发明的细胞没有特别限制，只要其是可用于表达编码本发明的重组表达载体中包含的抗体或其片段的多核苷酸的细胞即可。用根据本发明的重组表达载体转化的细胞(宿主细胞)可以是原核生物(例如大肠杆菌)、真核生物(例如酵母或其他真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人体细胞、猴细胞、仓鼠细胞(hamster)、大鼠细胞(rat cell)、小鼠细胞(mouse cell))、昆虫细胞或源自那些细胞的杂种细胞。例如，可以使用HEK293T或293F细胞。
能够表达本发明抗体或抗体片段的多肽的重组表达载体可以通过本领域已知的方法引入细胞以产生抗体或抗体片段来转化细胞，所述已知方法例如，但是不限于，瞬时转染(transient transfection)、显微注射、转导(transduction)、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染(liposome-mediated transfection)、DEAE葡聚糖介导的转染(DEAEDextran-mediated transfection)、聚凝胺介导的转染(polybrene-mediatedtransfection)、电穿孔(electroporation)、基因枪(gene gun)和用于将核酸引入细胞的已知方法。用根据本发明的重组表达载体转化的细胞产生根据本发明的抗体的重链、轻链或片段。
本发明还提供了制备与AIMP2-DX2特异性结合的抗体或其片段的方法，该方法包括以下步骤：(a)用包含编码本发明的抗体或抗体的片段的多核苷酸的重组表达载体转化宿主细胞；(b)培养宿主细胞并产生抗体或其片段；(c)获得宿主细胞中产生的抗体或其片段。
(a)是用重组表达载体转化宿主细胞以产生根据本发明的抗体或其片段的步骤，其中编码抗体或其片段的多核苷酸可操作地连接在重组表达载体中。
本领域技术人员可以通过根据重组表达载体的类型和所选择的宿主细胞选择如上所述的合适的转化方法来进行该步骤。包含重链和轻链碱基序列的重组表达载体可以共转化到相同的宿主细胞中，使得重链和轻链在单个细胞中表达，或者可以将包含重链和轻链碱基序列的重组表达载体分别转化为单独的细胞，从而分别表达重链和轻链。
(b)是从引入宿主细胞的重组表达载体中培养转化的宿主细胞以产生本发明抗体的重链、轻链或抗体片段的多肽的步骤。
本领域技术人员可以适当地选择培养基组分、培养条件、培养时间等，用于培养所选择的宿主细胞。宿主细胞中产生的抗体分子可以积聚在细胞的细胞质中，或者可以通过合适的信号序列分泌到细胞外或培养基中，或靶向(targeted)周质等。此外，优选通过使用本领域已知的方法重新折叠(refolding)根据本发明的抗体且该抗体具有功能构象(conformation)以维持对AIMP2-DX2的结合特异性。在产生IgG型抗体的情况下，重链和轻链可以在不同的细胞中表达，并且重链和轻链可以在分开的步骤中接触以形成完整的抗体，或重链和轻链可以在同一细胞中表达以在细胞内形成完整的抗体。
(c)是获得宿主细胞中产生的抗体或其片段的步骤。
本领域技术人员可以根据宿主细胞中产生的抗体或其片段多肽的特征、宿主细胞的特征、表达方式或多肽的靶向性，适当地选择和控制获得抗体或抗体片段的方法。例如，可以通过诸如对培养有宿主细胞的培养基通过离心除去杂质等方法回收培养基中分泌的抗体或其片段。如果需要，细胞可以以不影响抗体或其片段的功能结构的程度溶解，以将细胞中特定细胞器或细胞质中存在的抗体释放至到细胞外。此外，可以进一步对所得抗体进行去除杂质，并通过诸如色谱法，通过过滤器等过滤或透析等方法进行浓缩。
本发明提供了抗体或其片段在制备用于诊断癌症的药剂中的应用。
本发明提供了一种用于诊断受试者癌症的方法，该方法包括以下步骤：(a)从受试者中获得生物样本；(b)使用如权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段测定生物样本中AIMP2-DX2蛋白质的水平；(c)将测定的AIMP2-DX2蛋白质水平与正常受试者中AIMP2-DX2蛋白质的水平进行比较。
“生物样本”或“样本”包括具有生物来源的血液和其它液体样本，活检样本、例如组织培养的或其衍生的细胞的固体组织样本。更具体地，生物样本的实例可包括但不限于组织、提取物、细胞裂解物、全血、血浆、血清、唾液、眼内液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳汁、腹水、滑液、腹膜液等。样本可取自动物，优选哺乳动物，最优选人类。可以在用于检测之前对样本进行预处理。例如，可以通过过滤、蒸馏、萃取、浓缩、干扰组分的钝化、试剂添加等来预处理样本。另外，从样本中分离的核酸和蛋白质可用于检测。
本发明的“受试者”可以是动物，优选哺乳动物，特别优选包括人在内的动物，并且可以是动物来源的细胞、组织、器官等。受试者可以是需要诊断癌症的患者(patient)。
本发明的诊断方法可以通过将正常受试者的生物样本中的AIMP2-DX2蛋白质水平与疑似患有癌症的受试者的生物样本中的蛋白质水平进行比较来诊断实际的疾病发生。即，使用本发明的抗体或其片段检测疑似患有癌症的受试者的生物样本中的AIMP2-DX2蛋白质的水平，并且使用本发明的抗体或其片段检测正常受试者的生物样本中测量AIMP2-DX2蛋白质的水平，并且将这两种类型的AIMP2-DX2蛋白质的水平进行比较之后，在疑似患有癌症的受试者的AIMP2-DX2蛋白质水平与正常受试者相比出现异常表达或过度表达的情况下，可以将其诊断为相应的疾病。因此，诊断方法可以进一步包括步骤(d)，即当与正常受试者相比AIMP2-DX2蛋白质的表达水平异常表达或过度表达时确定癌症已经发展。在这方面，体液中AIMP2-DX2的水平是基于已经报道的会在各种癌症细胞系和组织，特别是肺癌、肝癌、皮肤癌、乳腺癌、肾癌、骨肉瘤等中增加的AIMP2-DX2的水平。所述确定的癌症如上所述。
诊断方法是通过AIMP2-DX2蛋白质与本发明的抗体或其片段之间的特异性抗原-抗体相互作用来完成的，并且通过反应产生的抗原-抗体复合物的量可以通过检测标签(detection label)的信号强度来定量确定。本发明中的术语“抗原-抗体复合物”是指AIMP2-DX2蛋白质与本发明的抗体或其片段的复合物，所述抗体或其片段对AIMP2-DX2蛋白质具有特异性。
检测标签可以选自酶、荧光材料、配体、发光材料、微粒(microparticle)、氧化还原分子和放射性同位素，但不限于此。当酶用作检测标签时，可用酶的实例可以是β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶、核糖核酸酶(RNase)、葡萄糖氧化酶、荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸、羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、磷酸丙酮酸脱羧酶、β-乳杆菌酶等，但不限于此。荧光材料的实例可以是荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺等，但不限于此。配体的实例可以是生物素衍生物等，但不限于此。发光材料的实例可以是吖啶酯、荧光素、荧光素酶等，但不限于此。微粒的实例可以是胶体金、有色乳胶等，但不限于此。氧化还原分子的实例可以是二茂铁、钌配合物、紫罗碱、醌、Ti离子、Cs离子、二亚胺、1,4-苯醌、氢醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU](bpy)3]2+、[MO(CN)8]4等，但不限于此。放射性同位素的实例可以是3H，14C，32P，35S，36Cl，51Cr，57Co，58Co，59Fe，90Y，125I，131I，186Re等，但不限于此。
用于测量蛋白质水平的分析方法包括蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散、奥克特洛尼免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学(immunohistochemistry)、免疫沉淀测定、补体结合测定、FACS、蛋白质芯片等，但不限于此。通过这些分析方法，可以比较在正常对照组中形成的抗原-抗体复合物的量与在疑似癌症患者中形成的抗原-抗体复合物的量，并且可以通过确定AIMP2-DX2的异常表达或过度表达，例如产生水平的增加来判定疑似患有疾病的患者的实际癌症发病率。
术语“包含(comprising)”与“含有”或“被表征”同义使用，并且不排除组合物和方法中未提及的其它成分或步骤。术语“由…组成(consisting of)”排除了未单独描述的其它元素、步骤或成分。术语“基本上由……组成(essentially consisting of)”是指在组合物或方法的范围内，该术语包括所述材料或步骤以及基本上不影响组合物或方法的基本特征的任何材料或步骤。
因此，本发明提供了与AIMP2-DX2蛋白质特异性结合的抗体或其片段，一种用于诊断癌症的包含该抗体或抗体片段的组合物，编码该抗体的多核苷酸，重组表达载体，用重组表达载体转化的细胞，以及用于制备抗体或抗体片段的方法。由于本发明提供的抗体和抗体片段与具有外显子2缺失的AIMP2-DX2突变蛋白特异性结合而不与野生型AIMP2反应，因此可有效确定AIMP2-DX2蛋白质的存在或表达水平，其与癌症和炎性疾病等各种病症有关。
附图说明
图1显示了证实H5 Fab与AIMP2-DX2抗原肽的结合特异性的实验。图1A显示使用含有抗原肽(epitope peptide，100μg/ml，表示为“+”)或不含抗原肽(表示为“-”)的H5 Fab检测H460细胞(肺癌细胞系)裂解物的蛋白质印迹的结果。图1B显示对应于用于筛选AIMP2-DX2的氨基酸序列中的H5抗体的抗原肽的部分，其中外显子2(exon2)在野生型AIMP2中缺失(下划线部分，氨基酸序列GHVQDYGALKD)。exon1、exon3和exon4分别以灰色、绿色和黑色显示。
图2显示了证实H5 Fab与AIMP2-DX2抗原的结合特异性的实验。图2A显示使用H5Fab和H460细胞裂解物的蛋白质印迹的结果，其中用AIMP2-DX2 siRNA(siDX2，“DX2”；si外显子4#1，“#1”；si外显子4#2，“#2”)转化H460细胞并将其培养72小时。图2B显示了实验中使用的siRNA的靶位点。siDX2靶向AIMP2-DX2的外显子-1外显子3接合点，和si外显子4#1和外显子4的#2分别靶向外显子4的不同区域。“c”表示对照组(control)。
图3显示了证实H5 Fab与N-端缺失的AIMP2-DX2蛋白质结合的实验。图3A显示使用含有抗原肽(epitope peptide，100μg/ml，“H5+抗原肽”)或不含抗原肽(“H5”)的H5 Fab检测HEK293T细胞裂解物的蛋白质印迹的结果，其中HEK293T细胞会在抗原肽中转化以表达各种形式的AIMP2-DX2蛋白质。在HEK293T细胞中表达的AIMP2-DX2蛋白质与链球菌标签结合，是全长蛋白质(F-DX2，“F”)，或缺少N-端氨基酸的蛋白质(“△2”，缺少2个氨基酸，△2-DX2；“△23”，缺少23个氨基酸，△23-DX2；“△33”，缺少33个氨基酸，△33-DX2)。该结果表明H5Fab识别含有表位的各种形式的AIMP2-DX2。“EV”表示空矢量(empty vector)。图3B显示上述AIMP2-DX2蛋白质(外显子1、外显子3和外显子4(exon1,exon3,exon4)分别由灰色、绿色和黑色表示，链球菌标签(strep tag)由橙色表示并由包含接头的30个氨基酸组成)和对应于AIMP2-DX2氨基酸序列(用黑色箭头和红色表示的氨基酸)的多个区域的示意图。
图4显示了证实H5 IgG抗体和AIMP2-DX2抗原肽之间的结合亲和力的表面等离子体共振(surface plasmon resonance)实验。将H5抗体和IgG蛋白包被在CM5薄片(CM5chip)上，并使AIMP2-DX2抗原肽以各种浓度流动，然后将抗原肽和抗体之间的结合反应程度显示为传感图(sensorgram)。传感图的x轴表示时间(秒，s)，y轴表示响应单位(response unit,RU)。传感图显示了AIMP2-DX2抗原肽的浓度(均以nM表示)，并且在图4的A和B中均相同。
图5显示了证实H5 Fab的结合特异性的Western印迹实验，其显示了H460细胞裂解物与#324抗体反应的电泳印迹的结果，其中#324抗体结合野生型AIMP2和AIMP2-DX2(图5A)或H5 Fab(图5B)。在印迹中，野生型AIMP2(“AIMP2”)和AIMP2-DX2(“DX2”)的蛋白质条带的位置用红色箭头表示。
具体实施方式
在下文中，将参考以下实施例详细描述本发明。
然而，以下实施例仅用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。
实施例1：嵌合Fab文库的构建
构建兔/人嵌合(chimeric)Fab文库以用于筛选与AIMP2-DX2特异性结合的抗原结合位点(antigen-binding site)。根据‘噬菌体展示：实验室手册’(Barbas,C.F.3rd.etal.Eds.Cold Spring Harbor Laboratory Press)中已知的方法进行兔免疫(immunization)，从兔脾细胞(splenocyte)中分离mRNA和cDNA合成。
具体地，将外显子1(exon1)和外显子3(exon3)在AIMP2-DX2中缀合的区域的多肽用作能够区分野生型AIMP2蛋白和AIMP2-DX2突变蛋白的表位(epitope)(参见图1B，氨基酸序列GHVQDYGALKD)。将半胱氨酸(C)氨基酸添加到AIMP2-DX2抗原肽的C端，以使肽与钥孔血兰素(keyhole limpet hemocyanin,KLH)(载体蛋白)缀合。将KLH-缀合的AIMP2-DX2抗原肽接种到兔中以诱导免疫应答，然后从兔的脾中分离出mRNA，并且使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产生构建嵌合Fab文库所必需的兔抗体可变区的互补DNA(complementary DNA,cDNA)。用于制备cDNA的引物如表1所示。通过结合使用表2中所示的引物和表3中所示的PCR条件来扩增制备的cDNA的兔抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA。在1.0％琼脂糖凝胶中通过电泳分离扩增的PCR产物，并使用凝胶提取试剂盒(gel extraction kit)对扩增的PCR产物进行纯化。
表1 RT-PCR引物
Figure BDA0001800692900000131
Figure BDA0001800692900000141
(引物下方括号中的数字表示相应引物的序列号)
表2.用于RT-PCR的引物的组合
Figure BDA0001800692900000142
表3.用于扩增重链可变区和轻链可变区的DNA的PCR条件
Figure BDA0001800692900000143
(∞表示没有时间限制)
通过PCR从含有人Fab的pComb3XTT获得构建嵌合Fab文库所需的人抗体(Fab)恒定区的DNA。使用pComb3XTT(2640.2ng/ml)质粒作为模板，以及分别使用一对引物HKC-F(正向，SEQ ID NO：53)和铅-b(反向，SEQ ID NO：54)和一对引物HIgCH1-F(正向，SEQ ID NO：51)和dpseq(反向，SEQ ID NO：52)，根据表4中所述的PCR条件扩增轻链恒定区和重链恒定区。使用凝胶提取试剂盒(gel extraction kit)纯化扩增的PCR产物。纯化的重链恒定区和轻链恒定区的DNA大小分别为400bp和350bp。
表4.用于扩增重链恒定区和轻链恒定区的DNA的PCR条件
Figure BDA0001800692900000144
(∞表示没有时间限制)
通过重叠延伸PCR(overlap extension PCR)连接上面制备的兔抗体可变区的DNA和人抗体(Fab)恒定区的DNA。将重链可变区DNA和恒定区DNA的混合物作为模板，并使用LeadVH(SEQ ID NO：55)和dpseq(SEQ ID NO：52)的引物对，通过PCR反应制备重链。将轻链可变区DNA和恒定区DNA的混合物作为模板，并使用RSC-SF(SEQ ID NO：56)和Lead-b(SEQID NO：54)的引物对，通过PCR反应制备轻链。PCR的条件如表5中所述。
表5.重叠延伸PCR的PCR条件
Figure BDA0001800692900000151
(∞表示没有时间限制)
使用凝胶提取试剂盒(gel extraction kit)分离并纯化如上所述制备的Fd重链片段(重链恒定区+重链可变区)和嵌合轻链(轻链恒定区+轻链可变区)的DNA。重链和轻链PCR产物分别为750bp和800bp。最后，为了结合Fd重链片段和嵌合轻链以形成Fab，将Fd重链和嵌合轻链混合物作为模板，并使用RSC-SF(SEQ ID NO：56)和dpseq(SEQ ID NO：52)的引物对，根据表6中所述的条件进行PCR反应。将从PCR产物获得的Fab(Fd重链+嵌合轻链)在1.5％凝胶上电泳，并通过凝胶提取试剂盒(gel extraction kit)纯化。最终产品的尺寸为1500bp。
表6.用于Fab构建的PCR条件
Figure BDA0001800692900000152
(∞表示没有时间限制)
如上所述制备的Fab DNA在噬菌体(phage)中表达并将其插入pComb3XTT载体中以构建噬菌体展示的(phage-displayed)Fab文库。具体地，用SfiI限制酶切割Fab PCR产物和pComb3XTT载体，然后在1％凝胶上对其进行电泳并纯化。通过分别使用2.5μl的SfiI限制酶切割5μg的FabDNA和30μg的pComb3XTT载体来进行限制酶反应。切割的Fab DNA和载体的大小分别为1500bp和3400bp。将消化的插入DNA与消化的载体以3：1的摩尔比混合，接着与T4连接酶(ligase)反应，然后用乙醇沉淀。
通过电穿孔(electroporation)将插入有嵌合Fab DNA的载体转移到大肠杆菌ER2537中。使用SOC培养基(添加有分解代谢物阻抑-葡萄糖的培养基)(Super OptimalBroth with Catabolite Repression-glucose added)进行电穿孔。向保持冷态的比色皿(cuvette)中，混合200μl的ER2537大肠杆菌感受态细胞(competent cell)和连接的载体，施加电击后，立即加入3ml的SOC。然后将细胞转移到50ml管中并在室温下温育1小时，将1，1/10，和1/100μl的转化细胞应用于预热的含有氨苄青霉素的100mm LB-琼脂(agar)培养皿。另外，也将其应用于在每半个培养中含有卡那霉素和氨苄青霉素的对半分的LB-琼脂培养皿上以检查污染。将接受过电击的残留大肠杆菌在4℃下离心4,000g 15分钟，除去上清液后，将其再分散在500μl的SOC中，并施加到150mm LB-氨苄青霉素琼脂培养皿上。将培养皿孵育约18小时。结果，第二天获得了约107个转基因菌落。
实施例2：噬菌体展示(phage-displayed)Fab文库的淘选和筛选
2-1：噬菌体展示Fab文库的淘选
根据已知方法(Bai,X.et al.PLoS ONE 2015,doi:10.1371/journal.pone.0141045)进行前一实施例中制备的抗体(Fab)文库的淘选(panning)，以选择具有与AIMP2-DX2抗原肽特异性结合的抗原结合位点的Fab。
作为淘选的第一步，进行文库拯救(library rescue)，其中将辅助噬菌体(helperphage)引入大肠杆菌中。将通过在实验前一天将大肠杆菌施加到150mm培养皿上而生长的菌落分散在5ml Luria-Bertani培养基(Luria-Bertani Broth LB)中并将其收集起来。将100μl收集的细菌接种到20ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的SB超培养基(Super Broth SB)中，振荡培养3小时。当培养基的在600nm(OD 600)处的吸光度达到0.5时，加入500μl的VCSM13辅助噬菌体(1012pfu)，并在37℃和120rpm振荡下培养1小时。然后加入卡那霉素(70μg/mL)并在30℃下以220rpm振荡培养额外18小时。将培养产物在12,000rpm，4℃下离心20分钟，收集上清液，加入5ml的5×聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀溶液(16％PEG-8000,12％NaCl)，然后将混合物放在冰上30分钟。然后，将通过在12,000rpm离心20分钟获得的药丸(pellet)再分散在含有1ml的3％BSA的PBS中以制备噬菌体溶液(phagesolution)，并将该混合物在室温下放置1小时。另外，用160μl的ER2537大肠杆菌接种10ml的LB，并在37℃，220rpm下振荡培养，220rpm不含抗生素。
向用于淘选的免疫管(immunotube,Nunc cat.No 470319)中加入1ml含有10μg的AIMP2-DX2抗原肽(与兔免疫中使用的肽相同，与BSA缀合)的PBS，并将管在37℃下温育1小时，以吸附试管内表面的抗原肽。之后，用补充有3％脱脂乳(skim milk)的PBST(含有tween-20的PBS)进行封闭(blocking)1小时，从而填充未吸附抗原的表面。用含有3％的脱脂乳和300μg的BSA的1ml PBST将噬菌体文库(1012pfu)封闭1小时。
将噬菌体文库加入到封闭的免疫管中，并在37℃下振荡孵育2小时，以使噬菌体上表达的Fab与抗原肽结合，并用5ml的PBST洗涤3次。在室温下用1ml三乙胺(triethylamine)(100mM in deionized water)洗脱与免疫管结合的噬菌体10分钟，并立即用0.5ml的Tris(1M，pH7.0)中和，并与8.5ml的中间对数阶段(mid-log phage)ER2537大肠杆菌混合。将大肠杆菌-噬菌体混合物在120rpm和37℃下振荡培养1小时，施加到含有2％葡萄糖和氨苄青霉素的LB琼脂培养皿上，并在37℃下培养过夜。将在培养皿上生长的108个大肠杆菌细胞接种到含有氨苄青霉素的20ml的SB培养基(super broth：3％胰蛋白胨，2％酵母提取物，1％MOPS，pH7.0)中并进行培养，然后在OD600达到0.7时，加入1012pfu的VCSM13辅助噬菌体。将混合物在80rpm，37℃下振荡1小时，并在30℃，200rpm下加入卡那霉素(70μg/ml)培养过夜。离心培养物，用5ml的5×PEG沉淀溶液(20％(w/v)PEG8000,15％(w/v)NaCl)沉淀噬菌体，并将其在冰上放置30分钟。将沉淀的噬菌体离心并再分散于0.3ml的PBS中，以用于下一步的淘选。以与上述相同的方式重复淘选4次，结果获得通过淘选选择的大肠杆菌菌落。
2-2：克隆筛选
证实了在实施例<2-1>的淘选中选择的菌落的噬菌体上表达的抗体(Fab)与AIMP2-DX2抗原肽特异性结合。
首先，在通过第2至第4淘选步骤选择的菌落中，根据Bai，X等人(2015)的方法，通过ELISA筛选与BSA缀合的AIMP2-DX2抗原肽结合的菌落。用AIMP2-DX2抗原肽(10μl/ml)包被用于ELISA实验的96孔免疫培养皿，并用180μl的3％BSA-PBST对该免疫培养皿进行封闭。将表达抗体(Fab)的大肠杆菌培养物以3500rpm离心15分钟，将细胞沉淀物分散在40μl的1×TES(20％蔗糖(sucrose)，1mM EDTA，50mM TRIS，pH8.0)中，然后加入60μl的0.2×TES以除去大肠杆菌外膜并制备周质提取物(periplasmic extract)。将混合物离心，并将25μl的上清液加入涂有抗原肽的免疫培养皿中，并使其反应1小时。用PBST洗涤培养皿3至4次，并加入25μl在3％BSA-PBST中稀释的抗人(anti-human)IgG(Fab specific)-HRP(1：1000)作为二抗。洗涤培养皿，然后通过向其加入25μl的四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)进行比色反应10分钟。加入25μl的硫酸(H2SO4,1mM)终止反应。ELISA实验的阴性对照是使用BSA代替抗原肽的实验，并且选择显示信号比背景(background)强三倍的菌落。
使用蛋白质印迹证实在ELISA中针对AIMP2-DX2选择的抗体克隆的结合特异性。将先前选择的大肠杆菌克隆在含有氨苄青霉素的20mL的SB培养基中培养，当OD600达到0.7时，加入IPTG(终浓度1mM)，并将细胞在30℃振荡培养过夜。将大肠杆菌培养物离心并再分散于1ml冷的1×TES中，并向其中加入1.5ml冷的0.2×TES，然后在冰上孵育30分钟以制备周质提取物。将通过离心获得的上清液与3％脱脂乳-PBST以1：1的比例混合，以用作蛋白质印迹的一抗(primary antibody)。二抗(secondary antibody)是反-HA标签抗体-HRP或反人Fab抗体-HRP。使用SW620细胞裂解物，表达AIMP2-DX2的结肠癌细胞系的蛋白质印迹显示克隆H5的抗体(Fab)与25kDa大小的AIMP2-DX2特异性结合(数据未显示)。
分析编码通过ELISA实验证实结合的H5克隆的Fab的DNA的序列。所鉴定的H5 Fab的重链和轻链CDR的DNA序列和氨基酸序列示于本说明书的序列表的SEQ ID NO：3至14中。另外，H5Fab的重链可变区和轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列如本说明书的序列表中的SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：18所示。SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：23中分别列出了H5 Fab的重链区的碱基序列和氨基酸序列(Fd，来自兔抗体的重链可变结构域和人抗体的重链CH1结构域)，且SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：21中分别描述了H5 Fab的轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列(源自兔抗体的轻链可变区和人抗体的轻链Cκ结构域)。
将具有如上所述的独特序列的H5 Fab转化为IgG型完整的抗体，其是更常用的形式。根据将Fab转化为IgG抗体的常规方法，通过PCR扩增重链可变区的DNA和H5 Fab的轻链，并将其插入pVITRO1载体中，其中使用适当的限制酶克隆人IgG1的重链恒定区和轻链恒定区的基因。本说明书中的序列列表中的SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:22中分别描述了如上制备的H5 IgG抗体重链(源自兔抗体的重链可变区和人抗体的重链恒定区)和H5 IgG抗体的轻链(源自兔抗体的轻链可变区和轻链恒定区Cκ结构域)的DNA序列和氨基酸序列。H5 IgG抗体的轻链的DNA序列和氨基酸序列与H5 Fab的轻链序列相同。含有H5 IgG DNA的载体在293F细胞系中表达，并通过蛋白G亲和层析(protein G affinity chromatography)分离/纯化。
实施例3：证实了所选克隆对AIMP2-DX2的结合特异性
进一步证实了H5抗体或片段(Fab)对AIMP2-DX2的结合特异性。
首先，通过抗原预吸附(antigen preadsorption)实验(图1)检测H5 Fab是否与AIMP2-DX2特异性结合。对H460细胞裂解物，表达AIMP2-DX2的肺癌细胞系进行电泳，然后使用含有AIMP2-DX2抗原肽(100μg/ml，图1A，“+”)或不含抗原肽(图1A，“-”)的H5 Fab进行蛋白质印迹。没有抗原肽的H5 Fab检测到AIMP2-DX2蛋白质条带，但具有抗原肽的H5 Fab完全不与AIMP2-DX2蛋白质条带反应，这些结果显示H5 Fab与AIMP2-DX2特异性结合。
此外，通过抑制H460细胞中AIMP2-DX2的表达证实了H5 Fab对AIMP2-DX2的结合特异性(图2)。用siRNA靶向外显子1(exon1)-外显子3(exon3)连接或AIMP2-DX2的外显子4(exon4)(图2B，分别为“siDX2”(SEQ ID NO：57)，“si外显子4(exon4)#1”(SEQ ID NO：58)，“si外显子4#2“(SEQ ID NO：59”)转染H460细胞，并培养72小时。用H5 Fab对培养的细胞裂解物进行蛋白质印迹(图2A)显示，用H5 Fab不仅未在用靶向AIMP2-DX2的外显子1-外显子3连接的siRNA转染的细胞裂解物中检测到AIMP2-DX2蛋白质条带，而且未在用靶向外显子4(exon4)的siRNA转染的细胞裂解物中检测到AIMP2-DX2蛋白质条带。认为AIMP2-DX2突变体的mRNA被siRNA完全降解。
我们检查了AIMP2-DX2蛋白质的N-端氨基酸缺失是否影响H5 Fab与AIMP2-DX2蛋白质的结合(图3)。已知AIMP2-DX2蛋白质N端的氨基酸残基对AIMP2-DX2蛋白质的溶解度具有显著影响(韩国专利申请号10-2014-0058634)。将链球菌标签连接至AIMP2-DX2变体，其中在AIMP2-DX2变体中在AIMP2-DX2蛋白质的N端缺失2个、23个或33个氨基酸(图3B)并在HEK293T细胞中表达，并且使用H5 Fab进行蛋白质印迹实验。如图3A所示，发现H5 Fab不仅与全长AIMP2-DX2蛋白质接合，还与具有N-端缺失的AIMP2-DX2异构体结合。同时，在存在AIMP2-DX2抗原肽的情况下，H5 Fab(“H5+epitope peptide”)不与全长或N端截短的AIMP2-DX2结合，再次证实H5 Fab与AIMP2-DX2蛋白质特异性结合。
通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance)实验(图4)证实了转化为IgG型的H5抗体与AIMP2-DX2抗原的结合亲和力。将H5抗体(IgG)和模拟IgG包被在CM5薄片上，并使AIMP2-DX2抗原肽以各种浓度流动，然后测量与H5抗体的结合反应程度。以15μl/min的流速注射分析样本和缓冲液6分钟并洗涤20分钟。通过从H5抗体或模拟IgG的反应值中减去未包被蛋白质的空白反应的值来获得传感图(sensorgram)。结果，如图4所示，H5抗体的结合随着抗原肽的浓度成比例地增加，但模拟IgG未显示出与抗原肽的任何显著结合。因此证实IgG重组的H5抗体也保留了Fab与AIMP2-DX2抗原的结合亲和力。
最后，确定H5抗体是否可以区分野生型(WT)AIMP2蛋白和AIMP2-DX2(图5)。使用#324抗体和H460细胞裂解物进行蛋白质印迹，其中#324抗体不区分野生型AIMP2和AIMP2-DX2，以及用H5 Fab和H460细胞裂解物进行蛋白质印迹，并比较结果。与抗体#324与野生型AIMP2和AIMP2-DX2的结合相反(图5A)，H5 Fab完全不与野生型AIMP2结合，但与AIMP2-DX2特异性结合(图5B)。换言之，证实了使用H5抗体可以仅选择性地检测AIMP2-DX2。由于H5IgG抗体含有H5 Fab的可变区且没有修饰，并且保留了与抗原的结合特征，因此可以看出H5IgG抗体可以给出与H5 Fab相同的结果。
工业适用性
如上所述，由于根据本发明的抗体不与野生型AIMP2结合，但与具有外显子2(exon2)缺失的AIMP2-DX2突变蛋白特异性结合，因此可有效地利用本发明的抗体来证实AIMP2-DX2蛋白质的存在和表达水平。AIMP2-DX2蛋白质与诸如癌症和炎性疾病的病理学相关，并且在诸如肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌等癌症中过度表达。因此，通过检测AIMP2-DX2作为癌症发展和进展的生物标志物，可以有效地利用AIMP2-DX2来开发用于诊断癌症的组合物。
<110> 医药生命融合研究团（Medicinal Bioconvergence Research Center）
梨花女子大学校产学协力团（ Ewha University - Industry CollaborationFoundation）
<120> 与AIMP2-DX2蛋白质特异性结合的抗体
<130> OP18-0114/PCT/CN
<150> KR 10-2016-0028809
<151> 2016-03-10
<150> PCT/KR 2017/002631
<151> 2017-03-10
<160> 59
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AIMP2-DX2 antigen peptide
<400> 1
Gly His Val Gln Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AIMP2-DX2 antigen peptide
<400> 2
ggccacgtgc aggattacgg ggcgctgaaa gac 33
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 heavy chain CDR1
<400> 3
Ser Tyr His Met Thr
1 5
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 heavy chain CDR1
<400> 4
agctaccaca tgacc 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 heavy chain CDR2
<400> 5
Val Ile Ser Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 heavy chain CDR2
<400> 6
gtcattagta atagtggtgg cacatcctac gcgaactggg cgaaaggc 48
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 heavy chain CDR3
<400> 7
Val Arg Gly Val Pro Gly Ile Asn Ser Asn Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 heavy chain CDR3
<400> 8
gtcagagggg tgcctggtat taatagtaac ttg 33
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 light chain CDR1
<400> 9
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Gly Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 light chain CDR1
<400> 10
cagtccagtc agagtgttta tagtggcaac tggttagcc 39
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 light chain CDR2
<400> 11
Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 light chain CDR2
<400> 12
tctacatcca ctctggcatc t 21
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 light chain CDR3
<400> 13
Ala Gly Asp Tyr Asp Gly Tyr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 light chain CDR3
<400> 14
gcaggcgatt atgatggtta caaaaatgct 30
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 heavy chain variable domain (VH)
<400> 15
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly
85 90 95
Val Pro Gly Ile Asn Ser Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ile Ser Ser
115
<210> 16
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 heavy chain variable domain (VH)
<400> 16
caggagcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtcacgc ctggaggaac cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt caccatcagt agctaccaca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg gatcggagtc attagtaata gtggtggcac atcctacgcg 180
aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga cctgaaaatc 240
accagtccga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg tcagaggggt gcctggtatt 300
aatagtaact tgtggggcca aggcaccctg gtcaccatct cctca 345
<210> 17
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 light chain variable domain (VL)
<400> 17
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Gly
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Val Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Asp Gly
85 90 95
Tyr Lys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 light chain variable domain (VL)
<400> 18
gctcaagtgc tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc agtccagtca gagtgtttat agtggcaact ggttagcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattctacat ccactctggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccgt cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atgatggtta caaaaatgct 300
ttcggcggag ggaccaaggt ggtcgtcaaa 330
<210> 19
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 IgG heavy chain (HC)
<400> 19
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly
85 90 95
Val Pro Gly Ile Asn Ser Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ile Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 20
<211> 1335
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 IgG heavy chain (HC)
<400> 20
caggagcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtcacgc ctggaggaac cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt caccatcagt agctaccaca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg gatcggagtc attagtaata gtggtggcac atcctacgcg 180
aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga cctgaaaatc 240
accagtccga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg tcagaggggt gcctggtatt 300
aatagtaact tgtggggcca aggcaccctg gtcaccatct cctcagcctc caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtccccgg gtaaa 1335
<210> 21
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 IgG light chain (LC)
<400> 21
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Gly
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Val Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Asp Gly
85 90 95
Tyr Lys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Gly Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 IgG light chain (LC)
<400> 22
gctcaagtgc tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc agtccagtca gagtgtttat agtggcaact ggttagcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattctacat ccactctggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccgt cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atgatggtta caaaaatgct 300
ttcggcggag ggaccaaggt ggtcgtcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540
accctgacgc tgggcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 23
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 Fd heavy chain (heavy chain portion of H5 Fab)
<400> 23
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly
85 90 95
Val Pro Gly Ile Asn Ser Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ile Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
<210> 24
<211> 663
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H5 Fd heavy chain (heavy chain portion of H5 Fab)
<400> 24
caggagcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtcacgc ctggaggaac cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt caccatcagt agctaccaca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg gatcggagtc attagtaata gtggtggcac atcctacgcg 180
aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga cctgaaaatc 240
accagtccga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg tcagaggggt gcctggtatt 300
aatagtaact tgtggggcca aggcaccctg gtcaccatct cctcagcctc caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
act 663
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVH1 primer
<400> 25
gcccaaccag ccatggccca ggagcagcta aggag 35
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVH2 primer
<400> 26
gcccaaccag ccatggccca ggagcagctg rtggag 36
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVH3 primer
<400> 27
gcccaaccag ccatggccca ggagcagctg gaggagtcc 39
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVH4 primer
<400> 28
gcccaaccag ccatggccca gtcgstggag gagtcc 36
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVH5 primer
<400> 29
gcccaaccag ccatggccca gtcggtgaag gagtcc 36
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVH6 primer
<400> 30
gcccaaccag ccatggccca gcagctggag cagtcc 36
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVK1 primer
<400> 31
taattggccc aggcggccga ccctatgctg acccag 36
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVK2 primer
<400> 32
taattggccc aggcggccga tgtcgtgatg acccag 36
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVK3 primer
<400> 33
taattggccc aggcggccgc agccgtgctg acccag 36
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVK4 primer
<400> 34
taattggccc aggcggccgc catcgatatg acccag 36
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVK5 primer
<400> 35
taattggccc aggcggccgc ccaagtgctg acccag 36
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVK6 primer
<400> 36
taattggccc aggcggccgc ccttgtgatg acccag 36
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVK7 primer
<400> 37
taattggccc aggcggccgc tcaagtgctg acccag 36
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVK8 primer
<400> 38
taattggccc aggcggccta tgtcatgatg acccag 36
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVL1 primer
<400> 39
taattggccc aggcggccca gcctgccctc actcag 36
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVL2 primer
<400> 40
taattggccc aggcggcctc ctatgagctg acacag 36
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVL3 primer
<400> 41
taattggccc aggcggcctc cttcgtgctg actcag 36
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVL4 primer
<400> 42
taattggccc aggcggccca gcctgtgctg actcag 36
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVL5 primer
<400> 43
taattggccc aggcggccag cgttgtgttc acgcag 36
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVL6 primer
<400> 44
taattggccc aggcggccca gtttgtgctg actcag 36
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RJH-b primer
<400> 45
tgggcccttg gtggaggctg argagayggt gaccagggt 39
<210> 46
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RJK1-b primer
<400> 46
agatggtgca gccacagttc gtttgatttc cacattggt 39
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RJK2-b primer
<400> 47
agatggtgca gccacagttc gttygacsac cacctyggt 39
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RJK3-b primer
<400> 48
agatggtgca gccacagttc gtaggatctc cagctcggt 39
<210> 49
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RJK4-b primer
<400> 49
agatggtgca gccacagttc gtttgatytc cascttggt 39
<210> 50
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RJL-b primer
<400> 50
agatggtgca gccacagttc ggcctgtgac ggtcagctgg gt 42
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIgCH1-f primer
<400> 51
gcctccacca agggccca 18
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dpseq primer
<400> 52
agaagcgtag tccggaacg 19
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HKC-f primer
<400> 53
actgtggctg caccatctg 19
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lead-b primer
<400> 54
ggccatggct ggttgggc 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LeadVH primer
<400> 55
gcccaaccag ccatggcc 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSC-SF primer
<400> 56
taattggccc aggcggcc 18
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siDX2 siRNA
<400> 57
ctggccacgt gcaggatta 19
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> si exon4 #1 siRNA
<400> 58
ggaacattgc acgtttctt 19
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> si exon4 #2 siRNA
<400> 59
gctgtcaacg caaccctta 19

Claims (13)

1.一种与AIMP2-DX2特异性结合的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段识别一种作为表位的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
所述抗体或抗体片段包含：
重链可变区，其包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3的重链互补决定区（CDR）1，氨基酸序列为SEQ ID NO：5的重链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO：7的重链CDR3；和
轻链可变区，其包含氨基酸序列为SEQ ID NO：9的轻链CDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO：11的轻链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的轻链。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE 和 IgD。
5.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述片段选自双抗体片段、Fab片段、 Fab'片段、 F(ab)2片段、 F(ab')2片段、 Fv片段和scFv 片段。
6.一种用于诊断癌症的组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗体片段。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述癌症选自结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌、黑色素瘤、淋巴瘤、再生障碍性贫血和血癌。
8.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗体片段。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的核酸序列。
10.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求8或9所述的多核苷酸。
11.一种细胞，其特征在于，所述细胞用如权利要求10所述的重组表达载体转换而成。
12.一种制备与AIMP2-DX2特异性结合的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）用如权利要求10所述的重组表达载体转化宿主细胞；
（b）培养所述宿主细胞并产生所述抗体或抗体片段；和
（c）获得所述宿主细胞中产生的所述抗体或抗体片段；
所述抗体或抗体片段包含：
重链可变区，其包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3的重链互补决定区（CDR）1，氨基酸序列为SEQ ID NO：5的重链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO：7的重链CDR3；和
轻链可变区，其包含氨基酸序列为SEQ ID NO：9的轻链CDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO：11的轻链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链CDR3。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗体片段在制备用于诊断癌症的药剂中的应用。
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