KR20120088551A - 보체 단백질 ｃ３ｂ를 표적화하는 항체를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

보체 단백질 ｃ３ｂ를 표적화하는 항체를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120088551A
KR20120088551A KR1020117029046A KR20117029046A KR20120088551A KR 20120088551 A KR20120088551 A KR 20120088551A KR 1020117029046 A KR1020117029046 A KR 1020117029046A KR 20117029046 A KR20117029046 A KR 20117029046A KR 20120088551 A KR20120088551 A KR 20120088551A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
antibodies
binding
human
seq
Prior art date
Application number
KR1020117029046A
Other languages
English (en)
Inventor
비잔 에테마드-길버트슨
브라이던 찰스 길드
용-인 김
잉고 클라게
알렉산드라 크라우스
마이클 로구스카
이고르 스플라우스키
케하오 자오
Original Assignee
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
Publication of KR20120088551A publication Critical patent/KR20120088551A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 및 시노몰구스 보체 단백질 C3b 둘 다에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편, 뿐만 아니라 그의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

보체 단백질 Ｃ３Ｂ를 표적화하는 항체를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANTIBODIES TARGETING COMPLEMENT PROTEIN C3B}
발명의 배경
연령 관련 황반 변성 (AMD)은 진행성 질환이고, 65세 이상 미국인에게서 시력 상실과 실명을 유발시키는 주요 원인이다. AMD는 주로, 글을 읽거나 운전을 하는데 필요한 높은 시력을 담당하는 망막 부분인 황반에 악영향을 미친다. 대다수의 AMD 환자는 드루젠으로 지칭되는 세포외 망막 침착물이 존재하는 것을 특징으로 하는 질병 초기 단계로 인해 고통받고 있다. 드루젠은 세포 파편, 염증성 매개자, 및 세포외 매트릭스 성분의 세포외 망막 침착물이다. AMD의 후기 단계는 건성 또는 습성 형태로서 그 징후가 나타나는데, 둘 다 시력 상실과 연관이 있다. 지도형 위축으로서 공지되기도 한 건성 AMD는 검안경 조사시 망막 색소화 상피 (PRE) 상실의 국소 부위에 상응하는, 명백하게 경계 지워진 영역으로서 나타난다. 습성 AMD는 맥락막의 신생혈관증식과 연관이 있는데, 이는 망막의 혈관 성장과 브루크막의 원형 상실을 유발시키고 망막에서 종종 출혈이 있을 수 있다. 이러한 누출은 망막 세포에 대한 영구적인 손상을 유발시켜 세포가 죽어가고 중심 시력에 맹점이 생겨난다.
선천적 인간 시스템은 보체 경로로 구성된다. 이러한 보체 경로는 선천성 및 적응성 면역을 가교시켜 주고 염증 손상과 면역 복합체의 생성물을 없애 주는, 화농성 박테리아 감염에 대항하여 방어하는 작용을 한다. 보체는 혈장 및 세포 표면 내의 캐스케이드 반응에 관여하고 있는 30개 초과의 단백질 시스템이다. 보체계 및 그의 보체 성분은 각종 면역 과정에 관여하고 있다. 예를 들어, 말단 복합체 또는 막 공격 복합체 (MAC)로 지칭되기도 하는 보체 C5b-9 복합체는 막 투과성 손상을 유도시킴으로써 세포 사멸에 있어 중요한 역할을 한다.
최근의 연구 결과, 보체 성분 C3 및 C5가 AMD 환자에서 드루젠의 주요 구성분이란 사실이 입증되었다 (문헌 [Mulling, R.F. et al. (2000) FASEB J 14, 835-46]). 이들의 존재 뿐만 아니라, 막 공격 복합체 (MAC) C5b-9, 및 드루젠을 덮고 있는 RPE 세포 내의 다른 급성 기 반응물 단백질의 존재가 보체 활성화 및 MAC의 형성을 촉발시킬 수 있는 과정에 관여하는 것으로 추측되었다 (문헌 [Johnson, L et al. (2001) Exp Eye Res 73, 887-896]). 따라서, 보체 성분이 선천성 면역의 단순한 매개자보다 더 많다는 증거가 증가하고 있다.
영양학적 개입이 건성 AMD가 습성 AMD로 진행되는 것을 억제하는 것으로 처방되어 왔다. 현재, FDA 승인된 유일한 습성 AMD 치료법으로는 광역학 요법 (PDT), 항-VEGF 압타머 (예컨대 페가프타닙), 및 항-VEGF 항체, 라니비주맙이 있다. 이들 약물 또는 요법은 전형적으로 이미 상당한 시력 상실로 인해 고통받은 환자에게 투여된다.
현행 치료법을 대체 또는 보충할 수 있는 유효한 AMD 치료법을 개발해야 할 필요성은 여전히 대두되고 있다. 특히, 시력 상실의 조기 검진, 예방 또는 복원을 제공할 수 있는 치료법이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 인간 또는 시노몰구스 보체 C3b 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 상기 항체는 100 pM 이하의 KD로 인간 C3b에 결합하고, 200 pM 이하의 KD로 시노몰구스 C3b에 결합한다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM 이하의, 바람직하게는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 또는 11 pM 이하만큼 높은 KD로 인간 C3b에 결합할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 10 pM 이하의 Kd로 인간 C3b에 결합하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 9 pM 이하, 8 pM 이하, 7 pM 이하, 6 pM 이하, 5 pM 이하, 4 pM 이하, 3 pM 이하, 2 pM 이하의, 또는 1 pM 이하만큼 높은 KD로 C3b에 결합할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 250 pM 이하, 240 pM 이하, 230 pM 이하, 220 pM 이하, 210 pM 이하, 200 pM 이하, 190 pM 이하, 180 pM 이하, 170 pM 이하, 160 pM 이하, 150 pM 이하, 140 pM 이하, 130 pM 이하, 120 pM 이하, 110 pM 이하, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 또는 31 pM 이하, 30 pM 이하, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 또는 11 pM 이하의, 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 pM 이하만큼 높은 KD로 시노몰구스 C3b에 결합할 수 있다.
바람직하게는, 본원에 기재된 항체의 결합 친화도는 용액 평형 적정 (SET)에 의해 측정된다. SET를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 아래 더욱 상세히 기재된다.
본 발명의 항체는 대체 보체 경로를 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편은 시험관내 용혈 검정에 의해 측정되는 바와 같이 70 nM 이하, 바람직하게는 65 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 바람직하게는 40 nM, 30 nM, 또는 20 nM 이하, 및 보다 바람직하게는 10 nM 이하의 IC50으로 대체 보체 경로를 억제할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편은 시험관내 용혈 검정에 의해 측정되는 바와 같이 100 nM 이하, 바람직하게는 90 nM 이하, 바람직하게는 80 nM 이하, 바람직하게는 75 nM 이하, 및 보다 바람직하게는 70 nM 이하의 IC50으로 시노몰구스에서의 대체 보체 경로를 억제할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편은 시험관내 C3b 침착에 의해 측정되는 바와 같이 30 nM 이하, 25 nM 이하, 20 nM 이하, 및 바람직하게는 10 nM 이하의 IC50으로 대체 보체 경로를 억제할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편은 시험관내 C3b 침착에 의해 측정되는 바와 같이 70 nM 이하, 50 nM 이하, 40 nM 이하, 및 바람직하게는 30 nM 이하의 IC50으로 시노몰구스에서의 대체 보체 경로를 억제할 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 그의 단편은 보체 막 공격 복합체의 침착에 의해 측정되는 바와 같이 5 nM 이하, 바람직하게는 4 nM, 3 nM, 2 nM 이하, 및 보다 바람직하게는 1 nM 이하의 IC50으로 대체 보체 경로를 억제할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편은 보체 막 공격 복합체의 침착에 의해 측정되는 바와 같이 20 nM 이하, 바람직하게는 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 또는 13 nM 이하, 및 보다 바람직하게는 10 nM 이하의 IC50으로 시노몰구스에서의 대체 보체 경로를 억제할 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 그의 단편은 C3a 및 C5a의 생성에 의해 측정되는 바와 같이 100 nM 이하, 바람직하게는 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 또는 20 nM 이하, 및 보다 바람직하게는 10 nM 이하의 IC50으로 대체 보체 경로를 억제할 수 있다.
본 발명에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 표 12에 도시된 바와 같은 Fab의 결합 특성을 갖는다.
본 발명은 또한 인간 또는 시노몰구스 보체 C3b 단백질에 특이적으로 결합하며, 표 1에 기재된 항체와 교차 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체, 인간 또는 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편 또는 ScFv 단편 및/또는 IgG 이소형일 수 있다.
본 발명의 항체는 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선 서열로부터의 항체 프레임워크로 대체된 프레임워크를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 C3에 결합하는 상기 항체의 친화도보다 1000배 이상 더 큰 친화도로 C3b에 결합한다.
본 발명은 표 1에서 항체 9556의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9611의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9612의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9609의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9610의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9674의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 더더욱 표 1에서 항체 9675의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9124의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9397의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9398의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9136의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9141의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 더더욱 표 1에서 항체 9373의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9423의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명은 표 1에서 항체 9556의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9611의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9612의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9609의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9610의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9674의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 더더욱 표 1에서 항체 9675의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9124의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9397의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9398의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9136의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9141의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 더더욱 표 1에서 항체 9373의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9423의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1; 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2; 및 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 보체 단백질 C3b에 결합한다. 추가 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 보체 단백질 C3b에 결합한다.
본 발명은 또한 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하며, 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 보체 단백질 C3b에 결합한다.
본 발명은 또한 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 보체 단백질 C3b에 결합한다.
본 발명은 또한 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 C3b에 결합한다. 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 C3b에 결합한다.
본 발명은 더더욱 서열 9, 23, 37, 51, 65, 79, 93, 107, 121, 135, 149, 163, 177 및 191로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 상기 항체는 C3b에 결합한다. 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다.
본 발명은 더더욱 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 상기 항체는 C3b에 결합한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 조성물 뿐만 아니라 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 표 1의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 항체 9556, 9611, 9612, 9609, 9610, 9674, 9675, 9124, 9397, 9398, 9136, 9141, 9373 또는 9423을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1의 2종 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 조합물을 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
본 발명은 또한 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 본원에 기재된 핵산 분자를 포함한 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 서열 및 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 서열을 포함하는 단리된 숙주 세포를 포함하며, 여기서 상기 DNA 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되며 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 항체가 인간 모노클로날 항체일 수 있는 것이 고려된다. 숙주 세포가 비-인간 포유동물 세포인 것 또한 고려된다.
본 발명은 더더욱 연령 관련 황반 변성의 치료가 필요한 대상체에게 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 연령 관련 황반 변성을 치료하는 방법에 관한 것이다. 대상체가 인간인 것이 고려된다.
본 발명은 또한 대체 보체 경로의 억제가 필요한 대상체에게 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 대체 보체 경로를 억제하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 C3b를 본원에 기재된 항-C3b 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, C3b가 인자 B, P 또는 H에 결합하는 것을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 C3b를 본원에 기재된 항-C3b 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, C3 전환효소, C4 전환효소, 및 C3b-C3b 이량체 형성을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 85, 86, 87, 88, 89 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80％, 85％, 90％, 및 적어도 95％까지의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 상기 항체는 보체 단백질 C3b에 결합한다.
본 발명은 또한 서열 1, 2, 3, 15, 16, 17, 29, 30, 31, 43, 44, 45, 57, 58, 59, 71, 72, 73, 85, 86 및 87로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 상기 항체는 C3b에 결합한다.
본 발명은 또한 서열 4, 5, 6, 18, 19, 20, 32, 33, 34, 46, 47, 48, 60, 61, 62, 74, 75, 76, 88, 89 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 상기 항체는 C3b에 결합한다.
본 발명은 또한 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1; 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2; 및 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73 및 87로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 단리된 항원 결합 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 항원 결합 폴리펩티드는 보체 단백질 C3b에 결합한다.
본 발명은 더더욱 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하는 항원 결합 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 항원 결합 폴리펩티드는 보체 단백질 C3b에 결합한다.
상기에 언급된 중쇄 CDR 서열을 포함하는 항원 결합 폴리펩티드 뿐만 아니라, 항원 결합 폴리펩티드는 또한 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항원 결합 폴리펩티드는 바람직하게는 100 pM 이하, 바람직하게는 10 pM 이하, 바람직하게는 2 pM 이하의 KD로 C3b에 결합한다. 또한, 항원 결합 폴리펩티드가 인간 및 시노몰구스 C3b 둘 다에 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 C3b의 조절을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, C3b를 조절하는 방법을 포함한다.
임의의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 업계의 당업자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 그의 단일 쇄를 포함한다. 천연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된, 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, VH라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하, VL이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지며, 이들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 각종 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분 (Clq)에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원 결합 부분"은 주어진 항원 (예를 들어, C3b)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편); F(ab)2 단편 (힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편); VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인 또는 VL 도메인으로 이루어지는 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (문헌 [Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
추가로, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되긴 하지만, 이들이 단일 단백질 쇄가 될 수 있게 하는 인공 펩티드 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 이들을 연결시킬 수 있고, 이에 따라 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)라 공지됨, 예를 들어 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426] 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 이러한 단일 쇄 항체는 항체의 1개 이상의 "항원 결합 부분"을 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득하고, 상기 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
항원 결합 부분은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기재로 하는 스캐폴드 내로 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재하고 있는 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
항원 결합 부분은 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역 쌍을 형성하는 직렬식 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있다 (문헌 [Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062] 및 미국 특허 번호 5,641,870).
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원성 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원성 부위 내에서 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하고, 상호작용이 많을수록 친화도가 더 강하다.
본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도에 관한 유용한 척도를 지칭한다. 이는 항체 에피토프 친화도, 항원과 항체 둘 다의 원자가, 및 상호작용 부분의 구조적 정렬의 3가지 주요 인자에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합하는 가능성을 규정한다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산, 및 또한 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것, 및 또한 이후에 변형된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 알파 탄소를 갖는 화합물을 지칭하고, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄이 있다. 이러한 유사체는 변형된 R기를 갖거나 (예를 들어, 노르류신) 변형된 펩티드 주쇄를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "결합 특이성"은 오직 하나의 항원 결정자와만 반응하는 개개의 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 항체의 결합 부위는 상기 분자의 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로 구축된다. 항체의 결합 친화도는 단일 항원성 결정자와 항체 상의 단일 결합 부위 사이의 반응 강도이다. 이것은 항원성 결정자와 항체의 결합 부위 사이에서 작용하는 인력 및 척력의 합이다.
2가지 물질 사이의 특이적 결합은 평형 상수 (KA)가 적어도 1 x 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 1013 M-1인 결합을 의미한다. 어구 항체 (예를 들어, C3b-결합 항체)에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는"은 단백질 및 다른 생물학적 물질의 불균일 집단에서 동족 항원 (예를 들어, 인간 C3b 또는 시노몰구스 C3b)의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 상기한 바와 같은 평형 상수 (KA) 이외에도, 본 발명의 C3b-결합 항체는 또한 전형적으로 약 1 x 10-2 s-1, 1 x 10-3 s-1, 1 x 10-4 s-1, 1 x 10-4 s-1 또는 그보다 낮은 값의 해리 속도 상수 (Kd)를 가지며, 비-특이적 항원 (예를 들어, C3)과의 결합에 대한 친화도보다 적어도 10배, 바람직하게는 100배, 또는 1000배 이상까지 더 높은 친화도로 C3b에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "네오-에피토프" 또는 "네오-항원"은 상호 교환적으로 사용되고, C3의 단백질 분해적 절단 후 C3b 상에 존재하는 단백질의 항원성 부분이다. 이들 네오-에피토프는 절단되지 않은 C3 상에서는 접근 가능하지 않다.
용어 "황반 변성과 관련된 상태 또는 장애"는 예를 들어 황반 세포의 성장 감소, 황반 세포 (예를 들어, RPE 세포)의 사멸 또는 재배열 증가, 정상적인 생물학적 기능의 손실, 또는 이러한 사건의 조합의 결과로서 망막 황반이 퇴화되거나 기능장애되는 임의의 수많은 상태를 지칭한다. 황반 변성으로 인해, 정상 황반의 세포외 매트릭스 및/또는 세포의 조직구조 완전성이 상실되고/되거나 황반 세포의 기능이 상실된다. 황반 변성 관련 장애의 예에는 AMD, 노스캐롤라이나 황반 이영양증, 소르스비 안저 이영양증, 스타르가르트병, 무늬 이영양증, 베스트병, 우성 드루젠, 및 말라티아 레벤티네스 (방사상 드루젠)가 포함된다. 상기 용어에는 또한, 황반의 변성 및/또는 기능장애 이전 또는 이후에 일어나는 황반외적 변화가 포괄된다. 따라서, 용어 "황반 변성 관련 장애"에는 또한 광범위하게, 황반의 완전성 또는 기능을 변경시키거나 이에 손상을 가하는 (예를 들어, RPE 또는 브루크 막에 대한 손상) 모든 질환이 포함된다. 예를 들어, 상기 용어에는 망막 박리, 맥락망막 변성, 망막 변성, 광수용체 변성, RPE 변성, 점액다당류증, 간상체-추상체 이영양증, 추상체-간상체 이영양증 및 추상체 변성이 포함된다.
용어 "보체 성분", "보체 단백질" 또는 "보체 성분 단백질"은 보체계의 활성화에 관여하는 분자를 지칭한다. 전통적 경로 성분에는, 예를 들어 C1q, C1r, C1s, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9, 및 C5b-9 복합체 (막 공격 복합체: MAC)가 포함된다. 대체 경로 성분에는, 예를 들어 인자 B, 인자 D, 프로페르딘, H 및 I가 포함된다.
용어 "조절" 또는 "조절하다"는 본원에서 상호 교화적으로 사용되며, 활성 또는 생물학적 과정 (예를 들어, 보체 과정)의 상향 조절 (즉, 활성화 또는 자극 (예를 들어, 효능작용 또는 강화에 의한)) 및 하향 조절 (즉, 억제 또는 저해 (예를 들어, 길항작용, 감소 또는 억제에 의한)) 둘 다를 지칭한다. "조절하다"는 과정의 상향 조절 또는 하향 조절 둘 다를 기재하는 것으로 의도된다. 특정한 자극에 의해 상향 조절된 과정은 상기 자극제에 대한 길항제에 의해 억제될 수 있다. 대조적으로, 특정한 변형제에 의해 하향 조절된 과정은 상기 변형제에 대한 효능제에 의해 억제될 수 있다.
용어 "보체 경로 관련 분자," "보체 경로 분자," 및 "보체 경로 관련 단백질"은 상호 교환적으로 사용되며, 보체 활성화, 및 활성화된 보체계에 의해 매개되거나, 그에 반응하거나 또는 그에 의해 촉발된 하류 세포 활성에서 소정의 역할을 하는 다양한 분자를 지칭한다. 이들에는 보체 경로의 개시제 (즉, 보체계의 활성화를 직접적으로 또는 간접적으로 촉발시키는 분자), 보체 활성화 동안에 생성되거나 소정의 역할을 하는 분자 (예를 들어, 보체 단백질/효소, 예컨대 C3, C5, C5b-9, 인자 B, 인자 D, MASP-1, 및 MASP-2), 보체 수용체 또는 억제제 (예를 들어, 클루스테린, 비트로넥틴, CR1, 또는 CD59), 및 활성화된 보체계에 의해 조절되거나 촉발되는 분자 (예를 들어, 막 공격 복합체-억제성 인자, MACIF; 예를 들어, 문헌 [Sugita et al., J Biochem, 106:589-92, 1989] 참조)가 포함된다. 따라서, 본원에 언급된 보체 단백질 이외에도, 보체 경로 관련 분자에는 또한 예를 들어 C3/C5 전환효소 조절제 (RCA), 예컨대 보체 수용체 유형 1 (CR1 또는 CD35로도 지칭됨), 보체 수용체 유형 2 (CR2 또는 CD21로도 지칭됨), 막 보조인자 단백질 (MCP 또는 CD46), 및 C4bBP; MAC 조절제, 예컨대 비트로넥틴, 클러스테린 ("SP40, 40"으로도 지칭됨), CRP, CD59, 및 상동성 제한 인자 (HRF); 이뮤노글로불린 쇄, 예컨대 Ig 카파, Ig 람다, 또는 Ig 감마); C1 억제제; 및 다른 단백질, 예컨대 CR3, CR4 (CD11 b/18), 및 DAF (CD 55)가 포함된다.
용어 "보체 경로에 의해 조절되는 세포 활성"에는 C5b-9 공격 복합체로 인한 세포 손상, 혈관 투과성 변화, 평활근 세포의 수축 및 이동, T 세포 증식, 면역 부착, 수지상 세포, 단핵구, 과립구 및 혈소판의 응집, 식세포작용, 호중구 (PMN) 및 대식세포의 이동 및 활성화가 포함된다.
추가로, 보체 경로를 활성화시키면 보체 경로 내의 부산물로 인한 염증유발 반응이 증가하게 된다. 보체 경로의 활성화와 연관된 장애에는 신장염, 천식, 재관류 손상, 혈액투석, 류마티스 관절염, 전신 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 이식, 알츠하이머병, aHUS, MPGN II, 또는 다른 모든 보체-매개 질환이 포함된다. 황반 변성과 관련된 장애에는 AMD, 노스캐롤라이나 황반 이영양증, 소르스비 안저 이영양증, 스타르가르트병, 무늬 이영양증, 베스트병, 우성 드루젠, 및 말라티아 레벤티네스 (방사상 드루젠), 황반의 변성 및/또는 기능장애 이전 또는 이후에 일어나는 황반외적 변화, 망막 박리, 맥락망막 변성, 망막 변성, 광수용체 변성, RPE 변성, 점액다당류증, 간상체-추상체 이영양증, 추상체-간상체 이영양증 및 추상체 변성이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "대상체"에는 인간 또는 비-인간 동물이 포함된다.
용어 "비-인간 동물"은 모든 비-인간 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 설치류, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 조류, 양서류, 파충류 등이 포함된다.
용어 "키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이한 또는 변경된 클래스, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 전혀 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나, 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 일부가 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다. 예를 들어, 마우스 항체는 그의 불변 영역을 인간 이뮤노글로불린으로부터의 불변 영역으로 대체함으로써 변형시킬 수 있다. 인간 불변 영역으로의 대체로 인해, 키메라 항체는 원래의 마우스 항체에 비해 인간에서 감소된 항원성을 가지면서도 항원을 인식하는 그의 특이성은 보유할 수 있다.
용어 "보체 C3b 단백질" 또는 "C3b"는 상호 교환적으로 사용되며, 상이한 종에서의 C3b 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 인간 C3b는 서열 197 (A 쇄) 및 198 (B 쇄)에서 설명된 서열을 갖는다. 인간 C3b는 컴플리먼트 테크놀로지 인크.(Complement Technology Inc., 텍사스주 타일러)로부터 수득될 수 있다. 시노몰구스 C3b는 하기 실시예 섹션에 설명된 것과 같이 생성될 수 있다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열의 경우, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 수많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 상기 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이 중 하나인 "침묵 변이"이다. 또한, 폴리펩티드를 코딩하는 본원에서의 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이도 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
폴리펩티드 서열의 경우, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이들을 제외하지 않는다. 다음 8개의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일부 실시양태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.
용어 "교차 차단", "교차 차단된" 및 "교차 차단성"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 표준 경쟁적 결합 검정에서 다른 항체 또는 결합제가 C3에 결합하는 것을 방해하는 항체 또는 다른 결합제의 능력을 의미한다.
항체 또는 다른 결합제가 C3에 대한 또 다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 이로써 본 발명에 따라 교차 차단하는 것으로 말해질 수 있는지 여부는 표준 경쟁적 결합 검정을 이용하여 결정할 수 있다. 적합한 검정 중 하나는 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술 (예를 들어 비아코어(BIAcore) 3000 기기 (비아코어, 스웨덴 웁살라)를 사용함)의 이용을 포함한다. 교차 차단을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA-기반 접근법을 이용한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기들로 이루어지고, 통상적으로 특정한 3차원 구조 특징 및 또한 특정한 전하 특징을 갖는다. 형태적 및 비-형태적 에피토프는, 형태적 에피토프에 대한 결합은 변성 용매의 존재하에 상실되지만 비-형태적 에피토프에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본원에서 사용된 바와 같이, IgG 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab 단편에 대한 용어 "고친화도"는 표적 항원에 대하여 KD가 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 또는 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하, 또는 10-13 M 이하인 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형마다 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 KD가 10-7 M 이하 또는 10-8 M 이하인 항체를 지칭한다. 한 측면에서, 본원에 기재된 항-C3b 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 1 nM 이하, 바람직하게는 200 pM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 및 보다 더 바람직하게는 10 pM 이하의 KD를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 상기 불변 영역 역시 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 버전으로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
"인간화" 항체는 비-인간 항체의 반응성은 보유하지만 인간에서의 면역원성은 덜한 항체이다. 이것은 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유시키고 항체의 나머지 부분 (즉, 불변 영역 뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 부분)을 그의 인간 대응물로 대체하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984]; [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988]; [Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991]; 및 [Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994]을 참조한다. 인간 조작 기술의 다른 예는 US 5,766,886에 개시된 엑소마(Xoma) 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성"(％)은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 상응하도록 비교하고 정렬하여 하기하는 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 결정하는 경우, 2개의 서열이 명시된 백분율(％)의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 (즉, 명시된 영역에 걸쳐서 또는 명시되지 않은 경우에는 전체 서열에 걸쳐서 60％의 동일성, 임의로는 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％의 동일성)를 가질 경우에 "실질적으로 동일한" 것이다. 임의로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 또는 그보다 많은 수의 뉴클레오티드 (또는 20개, 50개, 200개 또는 그보다 많은 수의 아미노산) 길이에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에는 하위서열 좌표를 지정하고 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수도 있고, 또는 대안적인 파라미터가 지정될 수도 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성(％)을 계산한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비교 윈도우"는 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 인접 위치의 동일 수의 참조 서열과 서열을 비교할 수 있는, 20개 내지 600개, 일반적으로는 약 50개 내지 약 200개, 더욱 일반적으로는 약 100개 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 임의의 하나의 절편에 대한 것을 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬의 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 전산화 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) (미국 위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575)) 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율(％) 결정에 적합한 알고리즘의 2가지 예는 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977]; 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990] 각각에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내 동일 길이의 워드(word)와 정렬되는 경우 약간의 양성 값의 역치 스코어 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 의문(query) 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 역치를 지칭한다 ([Altschul et al., 상기 문헌]). 이러한 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이것을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로 작용한다. 단어 히트는 누 스코어가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매치 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어, 항상 > 0) 및 N (미스매치 잔기에 대한 패널티 스코어, 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 누적 스코어 계산에 스코어링 매트릭스가 사용된다. 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음의 값으로 스코어링된 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 스코어가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 끝에 도달한 경우, 각각의 방향으로의 단어 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 양가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 3, 및 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4, 및 양가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률을 나타내는, 최소의 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교시에 최소의 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율(％)은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 도입된, 문헌 [E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열들 사이의 동일성 백분율(％)은 블로썸(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하고 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)에 도입된 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
상기 나타낸 서열 동일성(％) 외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 하기하는 바와 같이 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 전형적으로 제2 폴리펩티드에 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일함을 보여주는 또 다른 표시는 2개의 분자 또는 이들의 상보체가 하기하는 바와 같이 엄격한 조건 하에 서로에게 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일함을 보여주는 또 다른 표시는 동일 프라이머가 서열 증폭에 사용될 수 있다는 것이다.
용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, C3b와 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 C3b 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, C3b에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 추가로, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 이소형은 또한 이러한 클래스 중 하나의 변형된 버전을 포함하며, 여기서는 Fc 기능을 변경시키는 변형, 예를 들어 이펙터 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합이 증진되거나 감소되도록 하는 변형이 가해질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "K회합" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하는 것으로 의도되고, 본원에 사용된 용어 "K해리" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하고, Ka에 대한 Kd의 비율 (즉, Kd/Ka)로부터 구하며 몰 농도 (M)로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템을 이용하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물인 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호 교환적으로 사용되고, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 주쇄 잔기 또는 연결부를 함유하고, 합성, 천연 발생 및 비-천연 발생이며, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
달리 언급하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만이 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열까지도 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 아래에서 상세하게 설명된 바와 같이, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3의 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시켜 달성될 수 있다 (문헌 [Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985]; 및 [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994]).
용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이것은 전사되는 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조정하는 경우, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하여 위치한다 - 즉, 이들은 시스-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 이것이 전사를 증진시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 근접하여 위치할 필요가 없다.
본원에 사용된 용어 "최적화된"은, 뉴클레오티드 서열이 생성 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵 세포, 예를 들어 피키아(Pichia)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열 ("모" 서열이라고도 공지됨)을 완전하게 또는 가능한 한 많이 보유하도록 조작된다. 본원에서의 최적화된 서열은 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되었다. 그러나, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 이러한 서열의 최적화된 발현 역시 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 역시 최적화된 것으로 지칭된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 아미노산 잔기의 중합체를 나타내는데 사용된다. 상기 용어는 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체 뿐만이 아니라 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 언급하지 않는 한, 특정 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조말 동물 (예를 들어 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이 유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이 유발)을 행할 수 있기 때문에, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있지만, 생체내에서 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 해당 세포 뿐만이 아니라 이러한 세포의 자손까지도 지칭하고자 하는 것임을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에 이러한 자손이 모 세포와 사실상 동일하지 않을 수 있지만, 이것은 여전히 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.
용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 특별히 언급되는 경우를 제외하고는, "환자" 또는 "대상체"라는 용어는 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다.
용어 "치료하는"은 질환, 상태 또는 장애의 증상을 완화시키거나 추가의 진행을 정지 또는 억제하면서 질환 (예를 들어, AMD)의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 발병을 예방하거나 지연시키기 위한 조성물 또는 항체의 투여를 포함한다. 치료는 예방적 (질환 발병을 예방 또는 지연시키거나, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하기 위함)일 수도 있고, 또는 질환의 발현 후 증상의 치료적 저해 또는 완화일 수도 있다.
용어 "벡터"는 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 벡터의 한가지 유형은 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스 벡터 (AAV 또는 AAV2)인데, 여기서는 추가의 DNA 절편을 바이러스성 게놈에 연결시킬 수 있다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")라 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 교환적으로 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 형태의 벡터이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 보이는 발현 벡터의 이러한 다른 형태, 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C3b 활성"은 C3b의 생성의 하류에 있는 대체 보체 경로의 활성, 예를 들어 이들로 한정되지는 않지만, C3 전환효소의 활성, C5 전환효소의 활성을 의미한다. C3b 활성은 본원에 기재된 검정을 이용하여, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 용혈 검정, C3a 및 C5a의 생성을 측정하는 검정, C3b 침착 검정, 및 막 공격 복합체 (MAC) 침착 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "C3b 활성의 변화" 또는 "C3b 활성의 조절"은 본원에 기재된 하나 이상의 검정에 의해 C3b 활성의 측정치를 지칭하며, 여기서 C3b 활성은 관련 대조군에 비해 10％ 이상 증가되거나 감소된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 C3b의 활성이 항체 또는 단편의 부재 하에서의 C3b의 활성에 비해 항체 또는 단편의 존재 하에서 10％ 이상 감소되거나 증가될 때 C3b 활성을 조절하는 것이라고 말할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "시노" 또는 "시노몰구스"는 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 지칭한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 C3b 항체가 C3에 비해 1000배 이상 더 높은 선택성으로 C3b에 결합하는 것을 도시한다.
도 2는 10％ 인간 또는 시노몰구스 혈청에서 용혈을 억제하는 항-C3b 항체의 능력의 예를 도시한다.
도 3은 C3의 분해 생성물로서 C3b의 생성을 억제하는 C3b 항체의 능력의 예를 도시한다.
도 4는 MAC의 침착을 억제하는 C3b 항체의 능력을 입증하는 예시적 데이터를 도시한다.
도 5는 C3b 항체가 C3a 및 C5a의 생성을 억제함으로써 대체 경로-유도된 보체 활성화를 차단한다는 것을 도시한다.
도 6a는 틱-오버 전환효소 효소 활성의 억제를 보여주는 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 도 6b는 6a에서 겔에서 C3b 생성 억제의 정량화를 도시한다. 도 6c는 항-C3b 항체가 사전-형성된 C3 전환효소 효소 활성을 억제한다는 것을 도시한다.
도 7은 항-C3b 항체가 시험관내 C5 전환효소 효소 활성을 억제한다는 것을 도시한다.
도 8a는 C3b 항체에 의해 인자 B의 C3b로의 결합을 억제하는 것을 도시한다. 도 8b는 C3b 항체에 의해 인자 P의 C3b로의 결합을 억제하는 것을 도시한다. 도 8c는 C3b 항체에 의해 인자 H의 C3b로의 결합을 억제하는 것을 도시한다. 도 8d는 C3b 항체에 의해 C3b-C3b 이량체 형성을 억제하는 것을 도시한다.
도 9는 C3d에 대한 항체 교차 반응성 검정의 결과를 도시한다.
도 10은 C5에 대한 항체 교차 반응성 검정의 결과를 도시한다.
도 11은 C3b 항체가 iC3b 또는 C3c에 결합하는지 여부를 측정하기 위해 수행된 결합 검정으로부터의 결과를 도시한다.
도 12는 종 교차 반응성 연구로부터의 결과를 도시한다. 도 12a는 래트 교차 반응성을 도시한다. 도 12b는 토끼 교차 반응성을 도시한다. 도 12c는 돼지 교차 반응성을 도시한다. 도 12d는 마우스 교차 반응성을 도시한다. 도 12e는 기니아 피그 교차 반응성을 도시한다. 도 12f는 개 교차 반응성을 도시한다.
상세한 설명
본 발명은 부분적으로 인간 및 시노몰구스 C3b 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체 분자의 발견에 기초한다. 본 발명은 완전 IgG 포맷 항체 (예를 들어, 항체 9556, 9611, 9612, 9609, 9610, 9674 및 9675 참조) 뿐만 아니라, 그의 항원 결합 단편, 예컨대 Fab 단편 (예를 들어, 항체 9124, 9397, 9398, 9136, 9141, 9373 및 9423 참조) 둘 다에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 보체 C3b 단백질 (예를 들어, 인간 C3b, 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체, 제약 조성물, 생산 방법, 이러한 항체, 및 조성물의 사용 방법을 제공한다.
C3b 항체
본 발명은 C3b (예를 들어, 인간 C3b, 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 및 시노몰구스 C3b 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 단리된 인간 모노클로날 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는, C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 하기 표 1에 열거된 임의의 하나의 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함하는, C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 하기 표 1에 열거된 임의의 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 VH CDR을 포함하는 (또는 대안적으로 이들로 이루어지는), C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는, C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 하기 표 1에 열거된 임의의 하나의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함하는, C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 하기 표 1에 열거된 임의의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3 또는 그 이상의 VL CDR을 포함하는 (또는 대안적으로 이들로 이루어지는), C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 항체는 돌연변이되었지만, 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 CDR 영역에서 적어도 60％, 70％, 80％, 85％, 90％ 또는 95％의 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이것은 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교할 때 CDR 영역에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산만이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다 (예를 들어, 표 1은 항체 9556, 9611, 9612, 9609, 9610, 9674 및 9675, 뿐만 아니라 Fab 단편 9124, 9397, 9398, 9136, 9141, 9373 및 9423의 중쇄 및 경쇄를 위해 최적화된 핵산 서열을 도시함).
<표 1>
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
본 발명의 다른 항체는 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만, 표 1에 기재된 서열과 적어도 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 또는 95％의 동일성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이것은 표 1에 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교할 때 가변 영역에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산만이 돌연변이되고 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하는 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
각각의 이들 항체는 C3b에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매치"되어 본 발명의 다른 C3b-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치"된 C3b-결합 항체는 당업계 공지의 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹션에 기재된 다른 검정)으로 시험할 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공하며, 여기서 항체는 C3b (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 9, 23, 37, 51, 65, 79, 93, 107, 121, 135, 149, 163, 177 및 191로 이루어진 군으로부터 선택된, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄, 및 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 모노클로날 항체; 또는 (ii) 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 C3b-결합 항체를 제공한다. 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183에 도시된다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184에 도시된다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185에 도시된다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186에 도시된다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187에 도시된다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188에서 도시된다. CDR 영역은 카바트(Kabat) 시스템을 이용하여 도시된다 (문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]).
각각의 이들 항체가 C3b에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공되기 때문에, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매치"될 수 있지만 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매치될 수 있음), 각각의 항체는 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유해야만 본 발명의 다른 C3b-결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치"된 C3b-결합 항체는 당업계 공지의 결합 검정 및 실시예에 기재된 방법 (예를 들어, ELISA)으로 시험할 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 당업자에게는, 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 나타낸 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규한 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있음이 매우 명확할 것이다. 상기 뿐만 아니라, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 항원 결합 단편은 VH CDR1, 2 및 3 또는 VL CDR 1, 2 및 3을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 단편은 단일 가변 도메인으로서 C3b에 결합한다.
따라서, 본 발명은 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공하며, 여기서 항체는 C3b에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 표 1에서 항체 9556의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9611의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9612의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9609의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9610의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9674의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 더더욱 표 1에서 항체 9675의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 표 1에서 항체 9124의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9397의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9398의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9136의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9141의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 더더욱 표 1에서 항체 9373의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1에서 항체 9423의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 2의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 4의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 5의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 6의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C3b에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 서열 15의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 16의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 18의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 19의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C3b에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 서열 29의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 30의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 31의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 32의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 33의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 34의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C3b에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 서열 43의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 44의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 45의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 46의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 47의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 48의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C3b에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 서열 57의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 58의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 59의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 60의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 61의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 62의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C3b에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 서열 71의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 72의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 73의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 74의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 75의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 76의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C3b에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 서열 85의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 86의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 87의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 88의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 89의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 90의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C3b에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, C3b에 특이적으로 결합하는 항체는 표 1에 기재된 항체이다. 바람직한 실시양태에서, C3b에 결합하는 항체는 항체 9556이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, C3b에 결합하는 항체는 항체 9610이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, C3b에 결합하는 항체는 항체 9674이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, C3b에 결합하는 항체는 항체 9675이다. 여전히 추가의 바람직한 실시양태에서, C3b에 결합하는 항체는 항체 9609이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정 배선 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열 (즉, 동일성(％)이 가장 큰 것)인 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인할 수 있다. 특정 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 인간 항체는 배선 서열에 비해, 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 가질 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선별된 인간 항체는 전형적으로 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 90％이고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예컨대, 뮤린 배선 서열)과 비교할 때 인간 항체를 인간의 것으로 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정한 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 적어도 95％ 또는 심지어는 적어도 96％, 97％, 98％ 또는 99％일 수 있다. 전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과는 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정한 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자의 예에는 이들로 한정되지 않지만 하기 기재된 가변 도메인 배선 단편, 뿐만 아니라 DP47 및 DPK9가 포함된다.
상동성 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 결합하고, 표 1에 기재된 항체의 원하는 기능적 특성을 보유하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 항원 결합 단편)을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 도메인은 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 80％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 도메인은 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 80％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 C3b (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하고, 항체는 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제할 수 있다. 구체적 예에서, 이러한 항체는 용혈 검정에서 10％ 인간 또는 시노몰구스 혈청에서 50 nM 미만의 IC50 값을 갖는다.
다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1에 설명된 서열과 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성일 수 있다. 다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 표 1에 기재된 항체의 VH 및 VL 영역과 높은 (즉, 80％ 또는 그 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 각각 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175, 189, 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 의해 수득될 수 있고, 그 후 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 보유된 기능에 대해 코딩되고 변경된 항체를 시험할 수 있다.
다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 1에 기재된 서열과 50％ 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성일 수 있다. 각각 임의의 서열 9, 23, 37, 51, 65, 79, 93, 107, 121, 135, 149, 163, 177 및 191의 전장 중쇄, 및 임의의 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192의 전장 경쇄와 높은 (즉, 80％ 또는 그 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 각각 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 의해 수득될 수 있고, 그 후 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 보유된 기능에 대해 코딩되고 변경된 항체를 시험할 수 있다.
다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 상기 기재된 서열과 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성일 수 있다.
다른 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 상기 기재된 서열과 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 서열들 사이의 동일성(％)은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수와 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성(％) = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 2개 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율의 결정은 하기하는 비-제한적인 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 이루어질 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열들을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "의문 서열"로서 추가로 사용될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반한 특정 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 C3b-결합 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184, 및 그의 보존적 변형로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187, 및 그의 보존적 변형로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR3 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역은 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188, 및 그의 보존적 변형로 이루어진 군으로부터 선택되고, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 C3b에 특이적으로 결합하고, 본원에 기재된 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제한다.
다른 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 갖고, 여기서 이들 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반한 특정 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 C3b-결합 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어진, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 전장 중쇄는 서열 9, 23, 37, 51, 65, 79, 93, 107, 121, 135, 149, 163, 177 및 191, 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 전장 경쇄는 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192, 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며; 항체는 C3b (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하고; 항체는 본원에 기재된 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제한다. 구체적 실시양태에서, 이들 항체는 용혈 검정에서 10％ 인간 또는 시노몰구스 혈청에서 50 nM 미만의 IC50 값을 갖는다.
동일한 에피토프에 결합하는 항체
본 발명은 표 1에 기재된 C3b-결합 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 따라서, 추가의 항체는 C3b 결합 검정에서 본 발명의 다른 항체와 교차 경쟁하는 (예를 들어, 본 발명의 다른 항체의 결합을 통계적으로 유의한 방식으로 경쟁적으로 억제하는) 능력을 기초로 하여 확인될 수 있다. C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 C3b와의 결합에 대해 상기 항체와 경쟁할 수 있음을 입증하고, 이러한 항체는 비-제한적인 이론에 따라 C3b 단백질 상에서 이것이 경쟁하는 항체와 동일하거나 관련이 있는 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체와 C3b의 동일 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 경쟁 항체가 경쟁 항체의 106 x KD보다 높은 경쟁 항체 농도의 존재 하에서 본 발명의 항체의 C3b 결합을 50％ 넘게 억제할 때, 항체는 "경쟁한다".
조작되고 변형된 항체
추가로, 본 발명의 항체는, 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본원에 제시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 상기 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 2개의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 존재하는 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형시켜 조작되어, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킬 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 유형 중 하나는 CDR 이식이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이로한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 밖의 서열보다 개개의 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 이식된 특이적 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525]; [Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter) 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen 등) 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체의 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 간행된 문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷상에서 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함), 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836] (이들 문헌 각각의 내용은 본원에 명백하게 참고로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열을 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역으로 이식시킬 수도 있거나, 또는 CDR 서열을 배선 서열과 비교해서 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역으로 이식시킬 수 있다. 예를 들어, 특정의 경우에는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증강시키는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen 등) 참조). 본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단편을 구축하기 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있는 프레임워크에는 VH1A, VH1B, VH3, Vk1, Vl2 및 Vk2가 포함되지만, 이로 제한되지 않는다. 추가의 프레임워크는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1에서 월드 와이드 웹에 기초한 vBase 데이터 베이스에서 확인할 수 있다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜서 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이다 ("친화도 성숙"이라 공지됨). 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발을 수행하여 돌연변이(들)을 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성을 본원에 기재된 바와 같고 실시예에서 제공되는 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가할 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 추가로, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183을 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184, 또는 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185, 또는 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186, 또는 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187, 또는 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188, 또는 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역으로 이루어진, 단리된 C3b-결합 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
대안적 프레임워크 또는 스캐폴드로의 항원-결합 도메인의 이식
생성된 폴리펩티드가 C3b에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 결합 영역을 포함하는 한은, 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드를 사용할 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5가지 주요 이디오타입 또는 그의 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여, 단일 중쇄 항체, 예컨대 낙타류에서 확인된 것들에 특별한 관심이 있다. 신규한 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 당업자에 의해 계속 발견되고 개발된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 이식될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린을 기초로 하는 항체를 생성시키는 것에 관한 것이다. 공지된 또는 미래의 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 표적 C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한은 이들이 사용될 수 있다. 공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴 (컴파운드 쎄라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 왈탐), 안키린 (몰레큘라 파트너즈 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 매사추세츠주 캠브릿지, 및 아블린크스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 즈뷔나아르드), 리포칼린 (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이싱), 작은 모듈형 면역-의약품 (트루비온 파카슈티칼즈 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (스실 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기초로 한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7개 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥들을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각 가장자리에는 이러한 루프가 적어도 3개 존재하고, 여기서 상기 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418 참조). 이러한 피브로넥틴-기재의 스캐폴드는 이뮤노글로불린은 아니지만, 전반적인 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 것과 밀접한 관련이 있다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 항체의 것과 성질 및 친화도에서 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이러한 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에서 사용될 수 있다. 이러한 피브로넥틴-기재의 분자는 표준 클로닝 기술을 이용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로 사용될 수 있다.
안키린 기술은 상이한 표적들에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하도록 안키린 유래의 반복 모듈을 갖는 단백질을 스캐폴드로 사용하는 것을 기초로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행한 α-나선 및 β-턴으로 이루어진 33개 아미노산의 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 LRP-1에서 유래된다. 이러한 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서는 250종 초과의 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기초로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 수많은 상이한 "A-도메인" 단량체들 (2개 내지 10개)로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법을 이용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머가 생성될 수 있다.
아피바디 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기초로 하는 3개의 나선 다발로 이루어진 작고 단순한 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, US 5,831,012 참조). 아피바디 분자는 항체를 모방하고, 항체의 분자량이 150 kDa인데 비해 분자량은 6 kDa이다. 아피바디 분자는 작은 크기에도 불구하고 이것의 결합 부위가 항체의 결합 부위와 유사하다.
안티칼린은 피에리스 프로테오랩 아게 회사에 의해 개발된 제품이다. 이들은 화학적으로 감수성이거나 불용성인 화합물의 생리적인 수송 또는 저장과 일반적으로 관련있는 광범위한 군의 작고 강한 단백질인 리포칼린으로부터 유래된다. 몇몇 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 생성된다. 단백질 구조는 초가변 루프가 단단한 프레임워크의 최상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 이것의 재조합 단편과는 대조적으로, 리포칼린은 160개 내지 180개 아미노산 잔기의 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어져서 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간만 더 크다. 결합 포켓을 이루는, 4개 루프의 집합은 두드러진 구조적 유연성을 나타내고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 독점적인 방법에서는 상이한 형태의 규정된 표적 분자들을 고친화도 및 특이성으로 인식하도록 결합 부분을 재성형시킬 수 있다. 리포칼린 패밀리의 한 단백질인, 피에리스 브라시카에(Pieris Brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)은 4개 루프의 집합을 돌연변이 유발시킴으로써 안티칼린을 개발하는데 사용되었다. 안티칼린을 기재하는 특허 출원의 한 예는 PCT 공보 WO 199916873이다.
아필린 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 디자인된 작은 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 신규 아필린 분자는 상이한 인간 유래의 스캐폴드 단백질을 각각 기초로 하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선별될 수 있다. 아필린 분자는 이뮤노글로불린 단백질과 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 현재, 2종의 아필린 스캐폴드가 사용되는데, 이중 하나는 감마 결정질의 인간 구조적 눈 수정체 단백질이고, 나머지 하나는 "유비퀴틴" 거대부류 단백질이다. 두 인간 스캐폴드 모두 매우 작고, 높은 온도 안정성을 나타내며, pH 변화 및 변성제에 거의 내성을 갖는다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래의 단백질의 예는 WO 200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO 2004106368에 기재되어 있다.
단백질 에피토프 모방체 (PEM)는 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1 내지 2 kDa)이다.
인간 또는 인간화 항체
본 발명은 C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체를 제공한다. 키메라 또는 인간화 항체와 비교할 때, 본 발명의 인간 C3b-결합 항체는 인간 대상체에게 투여될 때 더욱 감소된 항원성을 갖는다.
인간 C3b-결합 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키는데 이용되는 인간조작 기술이 있다. 미국 특허 공개 번호 20050008625는 비-인간 항체와 비교할 때 동일한 결합 특징을 유지하거나 또는 보다 양호한 결합 특징을 제공하면서 항체에서 비-인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하는 생체내 방법을 기재한다. 상기 방법은 비-인간 참조 항체의 가변 영역을 에피토프에 따라 완전 인간 항체로 대체하는 것을 기초로 한다. 생성되는 인간 항체는 일반적으로 참조 비-인간 항체와 구조적으로 관련이 있지는 않지만, 참조 항체와 동일한 항원상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간략하게 설명하면, 일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 접근법은, 항원에 대한 참조 항체의 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재하에 제한된 양의 항원과의 결합에 대한 "경쟁자"와 시험 항체의 다양한 하이브리드 라이브러리 ("시험 항체") 사이의 세포내 경쟁을 확립함으로써 가능하게 된다. 경쟁자는 참조 항체 또는 그의 유도체, 예컨대 단일 쇄 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 항원 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 시험 항체는 비-인간 참조 항체로부터의 공통적인 1개의 항원 결합 V-영역, 및 다양한 공급원, 예를 들어 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선택된 다른 V-영역을 갖는다. 참조 항체로부터의 공통적인 V-영역은 가이드로서 기능하여 시험 항체를 항원상의 동일한 에피토프에 동일한 배향으로 위치시켜서, 선택시에 참조 항체에 대해 가장 높은 항원 결합 충실도 쪽으로 편향되도록 한다.
많은 유형의 리포터 시스템이 시험 항체와 항원 사이의 원하는 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 항원에 결합할 때에만 단편 상보성에 의한 리포터 활성화가 일어나도록 상보성 리포터 단편을 항원 및 시험 항체 각각에 연결할 수 있다. 시험 항체- 및 항원-리포터 단편 융합체가 경쟁자와 동시 발현될 때, 리포터 활성화는 항원에 대한 시험 항체의 친화도에 비례하는, 경쟁자와 경쟁하는 시험 항체의 능력에 의존하게 된다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 특허 출원 번호 10/208,730 (공개 번호 20030198971)에 개시된 바와 같은 자가억제된 리포터 재활성화 시스템 (RAIR)의 재활성화제 또는 미국 특허 출원 번호 10/076,845 (공개 번호 20030157579)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.
일련의 에피토프 유도된 상보성 대체 시스템을 사용하여, 경쟁자, 항원 및 리포터 성분과 함께 단일 시험 항체를 발현하는 세포를 확인하는 선별을 수행한다. 이러한 세포에서, 각각의 시험 항체는 제한된 양의 항원과의 결합에 대해 경쟁자와 1:1로 경쟁한다. 리포터의 활성은 시험 항체에 결합된 항원의 양에 비례하고, 이는 다시 항원에 대한 시험 항체의 친화도 및 시험 항체의 안정성에 비례한다. 시험 항체는 처음에는 시험 항체로 발현될 때 참조 항체의 활성에 대한 이들의 활성을 기초로 하여 선별된다. 제1 라운드의 선별 결과는 "하이브리드" 항체의 세트이고, 이것 각각은 참조 항체로부터의 동일한 비-인간 V-영역 및 라이브러리로부터의 인간 V-영역으로 이루어지고, 이것 각각은 항원상에서 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 제1 라운드에서 선별된 하이브리드 항체 중 하나 이상은 항원에 대한 친화도가 참조 항체와 유사하거나 그보다 더 높을 것이다.
제2의 V-영역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선별된 인간 V-영역이 나머지 비-인간 참조 항체 V-영역을 동족 인간 V-영역의 다양한 라이브러리로 인간 대체하기 위한 선택의 가이드로서 사용된다. 제1 라운드에서 선별된 하이브리드 항체는 또한 제2 라운드의 선별을 위해 경쟁자로서 사용될 수도 있다. 제2 라운드의 선별 결과는 참조 항체와 구조적으로 상이하지만, 동일 항원과의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체의 세트이다. 선별된 인간 항체 중 일부는 참조 항체와 동일한 항원상의 동일 에피토프에 결합한다. 이들 선별된 인간 항체 중 1종 이상은 참조 항체와 유사하거나 그보다 더 높은 친화도로 동일 에피토프에 결합한다.
상기 기재된 마우스 또는 키메라 C3b-결합 항체 중 하나를 참조 항체로서 사용함으로써, 상기 방법은 동일한 결합 특이성 및 동일하거나 더 양호한 결합 친화도로 인간 C3b에 결합하는 인간 항체를 생성하는데 쉽게 이용될 수 있다. 또한, 이러한 인간 C3b-결합 항체는 또한 인간 항체를 통상적으로 생산하는 회사, 예를 들어 칼로바이오스, 인크.(KaloBios, Inc.) (캘리포니아주 마운틴뷰)로부터 구입할 수 있다.
낙타류 항체
신세계 구성원, 예를 들어 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉 낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 칼레루스 드로마데리우스(Calelus dromaderius)) 부류의 구성원으로부터 얻은 항체 단백질을 인간 대상체에 대해 크기, 구조적 복합도 및 항원성에 관하여 특성화하였다. 자연계에서 발견되는 바와 같이 이러한 부류의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체에는 경쇄가 없어서, 다른 동물로부터의 항체의 경우에서의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 상이하다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일자로 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.
VHH로서 확인된 작은 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 "낙타류 나노바디"라고 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성시키는, 표적에 대해 고친화도를 갖는 작은 단백질을 얻도록 하는 유전자 조작으로 수득할 수 있다. 1998년 6월 2일자로 허여된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고, 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261]; [Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788]; [Pleschberger, M. et al., 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448]; [Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int J Cancer 89: 456-62]; 및 [Lauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 시판되고 있으며, 예를 들어 아블린크스(Ablynx, 벨기에 겐트)가 시판한다. 비-인간 기원의 다른 항체와 같이, 낙타류 항체의 아미노산 서열을 재조합 방식으로 변경시켜 인간 서열과 보다 근접하게 유사한 서열을 수득할 수 있으며, 즉, 나노바디를 "인간화"할 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 천연적으로 낮은 항원성을 추가로 저하시킬 수 있다.
낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터에 불과한 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기가 갖는 결과 중 하나는 보다 큰 항체 단백질의 경우에는 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이고, 즉, 낙타류 나노바디는 고전적인 면역학적 기술을 이용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기가 갖는 또 다른 결과는, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 결합한 결과로 억제할 수 있기 때문에 고전적인 항체의 기능보다 고전적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 작용할 수 있다는 것이다.
이러한 저분자량 및 조밀한 크기로 인해, 극도로 열 안정적이고 극한 pH 및 단백질분해 소화에 대해서도 안정적이고 낮은 항원성을 갖는 낙타류 나노바디가 추가로 생성된다. 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환 시스템으로부터 조직 내로 쉽게 이동하고 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 약물 수송을 추가로 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일자로 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이러한 특징은 높은 치료 가능성을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특징은 C3b에 고친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 천연적으로 생성되는데, 즉, 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 이용하여 C3b 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후의 낙타류에 의해 생성된다. 대안적으로, C3b-결합 낙타류 나노바디는 조작되는데, 즉 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 C3b를 사용하는 패닝 절차를 이용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선택함으로써 생산된다. 조작된 나노바디는 수여 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 적합화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열로 이식하여 수득하였다.
이중특이적 분자 및 다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 C3b-결합 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 영역은 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부분 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고, 이러한 다중특이적 분자 역시 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이중특이적 분자"에 포함된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 1개 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 회합 등에 의함)될 수 있어서 이중특이적 분자가 생성된다.
따라서, 본 발명은 C3b에 대해 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대해 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 C3b의 또 다른 에피토프이다.
추가로, 본 발명에서 이중특이적 분자가 다중특이적인 경우, 상기 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 대한 것 이외의 제3 결합 특이체를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 1종 이상의 항체 또는 그의 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv를 포함한다. 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner 등)에 기재된 바와 같이, 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예를 들어 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.
디아바디는 VH 및 VL 도메인이 동일한 쇄상에서 이들 2개 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 연결된, 단일 폴리펩티드 쇄로 발현된 2가의 이중-특이적 분자이다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성함으로써, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일 세포 내에서 구조 VHA-VLB와 VHB-VLA (VH-VL 형태) 또는 VLA-VHB와 VLB-VHA (VL-VH 형태)의 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현하여 생성될 수 있다. 이들 대부분은 박테리아 내에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단일 쇄 디아바디 (scDb)는 대략 15개 아미노산 잔기의 링커로 2개의 디아바디-형성 폴리펩티드 쇄를 연결하여 생성된다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30]; [Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30]; [Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36]; [Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105]; [Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21] 참조). 디아바디를 Fc와 융합시켜 "디-디아바디"를 생성시킬 수 있다 (문헌 [Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65] 참조).
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체를 별도로 생성시킨 후에 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위해 각종 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132]; [Brennan et al., 1985 Science 229:81-83], 및 [Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들을 포함한다. 접합제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 다 피어스 케미컬 캄파니(Pierce Chemical Co., 일리노이주 록포드)가 시판함)이다.
결합 특이체가 항체인 경우, 이들을 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합시켜 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 두 결합 특이체 모두가 동일 벡터에서 코딩되어 동일 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 2개 이상의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은, 예를 들어 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (REA), FACS 분석, 생물학적 검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정으로 확인할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로 특별히 관심이 있는 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예컨대, 항체)을 이용함으로써 상기 복합체의 존재를 검출한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 C3b에 결합하는 본 발명의 항체의 2개 이상의 동일하거나 상이한 항원 결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원-결합 부분들은 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이적 분자에 대해 기재된 바 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교시켜서 4가 화합물을 수득할 수 있다.
삼량체화 도메인은 예를 들어 특허 EP 1 012 280B1 (Borean)에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
반감기가 연장된 항체
본 발명은 생체내 반감기가 연장된, C3b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
많은 인자가 단백질의 생체내 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분화 및 면역원성 반응 (예를 들어, 항체에 의한 단백질 중화, 및 대식세포 및 수상돌기 세포에 의한 흡수). 다양한 전략을 이용하여 본 발명의 항체의 반감기를 연장시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드, 및 탄수화물 쉴드로의 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페린에 결합하는 단백질과의 유전자 융합에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디 및 안티칼린에 결합하는 다른 결합 잔기와의 (유전적 또는 화학적) 커플링에 의해; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질 및 Fc와의 유전자 융합에 의해; 또는 나노담체, 서방형 제제 또는 의료 장치로의 도입에 의해 이루어진다.
항체의 생체내 혈청 순환을 연장시키기 위해서, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 PEG를 다관능성 링커를 사용하거나 사용하지 않고 항체 또는 그의 단편에 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위 특이적 접합을 통해 또는 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해 부착시킬 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응으로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질, 예를 들어 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 온 모든 형태의 PEG를 포괄한다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 최소한의 생물학적 활성의 소실을 일으키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 항체에 대한 PEG 분자의 적당한 접합을 확인하기 위해서 접합 정도를 SDS-PAGE 및 질량 분광법으로 면밀히 모니터링할 수 있다. 미반응 PEG는 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화 항체는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정을 이용하여 결합 활성 및 또한 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura 등) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa 등)를 참조한다.
다른 변형된 PEG화 기술은, 화학적으로 명시된 측쇄를 tRNA 신테타제 및 tRNA를 포함하는 재구축 시스템을 통해 생합성 단백질에 혼입하는, 직교 지시된 조작 기술의 화학적 재구축 (ReCODE PEG)을 포함한다. 상기 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포에서 30개 초과의 새로운 아미노산을 생합성 단백질에 혼입할 수 있게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치한 임의의 부위에 비-천연 아미노산을 혼입시켜서, 정지 코돈의 앰버가 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호하는 코돈으로 전환되게 한다.
또한, 재조합 PEG화 기술 (rPEG)은 혈청 반감기 연장을 위해 사용될 수도 있다. 이 기술은 300개 내지 600개 아미노산의 비구조화 단백질 테일을 기존의 제약 단백질에 유전적으로 융합시키는 것을 포함한다. 이러한 비구조화 단백질 쇄의 겉보기 분자량은 그의 실제 분자량보다 약 15배 더 크기 때문에, 상기 단백질의 혈청 반감기는 크게 증가된다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 통상적인 PEG화와는 달리, 제조 공정이 크게 간소화되고 생성물은 균일하다.
폴리시알화는 활성 수명을 연장시키고 치료 펩티드 및 단백질의 안정성을 개선시키기 위해서 천연 중합체 폴리시알산 (PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산의 중합체 (당)이다. 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달을 위해 사용되는 경우, 폴리시알산은 접합체에 보호 미세환경을 제공한다. 이것은 순환계 내 치료 단백질의 활성 수명을 증가시키고, 이것이 면역계에 의해 인식되지 않도록 방지한다. PSA 중합체는 인간 신체에서 천연적으로 발견된다. 특정 박테리아는 수백만년에 걸쳐서 자신의 벽을 이것으로 코팅하도록 진화하였다. 이후, 이러한 천연 폴리시알화 박테리아는 분자 모방에 의해 신체의 방어 시스템을 이겨낼 수 있었다. 자연계의 궁극적인 도피 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로 소정의 물리적 특징을 갖는 것으로서 쉽게 생산될 수 있다. 박테리아 PSA는 인간 신체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 단백질에 커플링될 때조차도 완전하게 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분에서 유래된 변형된 천연 중합체이며, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 일반적으로 부족한 혈액 부피를 채우고 혈액의 유동성을 개선시키기 위해 투여된다. 항체의 HES화(hesylation)는 상기 분자의 안정성을 증가시키고 또한 신장 청소율을 감소시켜서 순환 반감기의 연장을 가능하게 하여 생물학적 활성을 증가시킨다. 여러가지 파리미터, 예컨대 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 광범위한 범위의 HES 항체 접합체가 맞춤 제조될 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한 1개 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 98/23289; 국제 공개 번호 WO 97/34631; 및 미국 특허 번호 6,277,375를 참조한다.
또한, 항체 또는 항체 단편이 생체내에서 더욱 안정하게 만들거나 더욱 긴 생체내 반감기를 갖도록 하기 위해 항체를 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민; HSA)에 접합시킬 수 있다. 상기 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 93/15199, WO 93/15200 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 번호 EP 413,622를 참조한다. 또한, 상술한 바와 같은 이중특이적 항체와 관련하여, 항체의 특이성은 항체의 제1 결합 도메인은 C3b에 결합하는 반면에 항체의 제2 결합 도메인은 혈청 알부민, 바람직하게는 HSA에 결합하도록 고안될 수 있다.
반감기를 증가시키는 전략은 나노바디, 피브로넥틴-기재의 결합제, 및 생체내 반감기를 증가시키고자 하는 기타 항체 또는 단백질에 특히 유용하다.
항체 접합체
본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 단편, 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합 방식으로 융합되거나 화학적으로 접합 (공유 접합 및 비-공유 접합 둘 다를 포함함)되어 융합 단백질을 생성하는, C3b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 항체 또는 항체 단편에 융합 또는 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 및 5,112,946; 유럽 특허 번호 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 번호 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌 [Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539]; [Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600]; 및 [Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링 (통칭하여, "DNA 셔플링"이라 지칭함)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 활성 변경 (예를 들어, 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체 또는 그의 단편)에 사용될 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 번호 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 및 5,837,458; 문헌 [Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33]; [Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82]; [Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76]; 및 [Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313] (각각의 이들 특허 및 간행물은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. 항체 또는 그의 단편, 또는 코딩된 항체 또는 그의 단편은 재조합 전에 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 기타 방법에 의한 무작위 돌연변이유발의 실시로 변경될 수 있다. C3b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 이종 분자의 1종 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
추가로, 항체 또는 그의 단편을 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하는 펩티드와 융합시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 특히 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.), 미국 91311 캘리포니아주 채스트워쓰 에톤 애비뉴 9259)에서 제공되는 태그이며, 많은 것들이 시판된다. 예를 들어 문헌 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 혈구응집소 ("HA") 태그 (문헌 [Wilson et al., 1984, Cell 37:767]), 및 "플래그" 태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 진단제 또는 검출제에 접합된다. 이러한 항체는 특정 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발생, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 예측하는데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를 검출가능한 물질, 예를 들어 이로 제한되는 것은 아니지만 다양한 효소, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제; 보결 분자단, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린; 형광 물질, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 루미놀; 생체발광 물질, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린; 방사능 물질, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 요오드 (131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브덴 (99Mo), 크세논 (133Xe), 불소 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin, 및 양전자 방출 금속 (다양한 양전자 방출 단층촬영술을 이용함), 및 비-방사능 상자성 금속 이온에 커플링시켜 달성될 수 있다.
본 발명은 치료 잔기에 접합된 항체 또는 그의 단편의 사용을 추가로 포함한다. 항체 또는 그의 단편은 치료 잔기, 예컨대 세포독소, 예를 들어 세포증식 억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사능 금속 이온, 예를 들어 알파-방출자에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다.
추가로, 항체 또는 그의 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료 잔기 또는 약물 잔기에 접합될 수 있다. 치료 잔기 또는 약물 잔기는 고전적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 약물 잔기는 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 세포자멸제, 항혈관신생제, 또는 생물학적 반응 개질제, 예를 들어 림포카인을 포함할 수 있다.
추가로, 항체는 치료 잔기, 예컨대 방사능 금속 이온, 예컨대 알파-방출자, 예컨대 213Bi, 또는 방사선금속 이온, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 폴리펩티드에 접합시키는데 유용한 마크로시클릭 킬레이터에 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이고, 이것은 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있다. 이러한 링커 분자는 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 문헌 [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90]; [Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7]; 및 [Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50] (이들 문헌 각각은 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
치료 잔기를 항체에 접합시키는 기술은 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.
항체는 또한 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수도 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체의 생성 방법
항체를 코딩하는 핵산
본 발명은 상기 기재된 C3b-결합 항체 쇄의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산의 일부는 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189에 나타난 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176에 나타난 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1에서 확인된 것들이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에서 확인된 것들의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 65％, 80％, 95％ 또는 99％ 동일함) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현되는 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 C3b 항원 결합 능력을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 기재한 C3b-결합 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 1개 이상의 CDR 영역 및 일반적으로는 모든 3개의 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 상기 기재한 C3b-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열을 모두 또는 실질적으로 모두 코딩한다. 코드의 축중성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다를 코딩할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열의 일부는 서열 9, 23, 37, 51, 65, 79, 93, 107, 121, 135, 149, 163, 177 및 191에 나타낸 성숙한 중쇄 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80％, 90％ 또는 99％) 성숙한 중쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 핵산 서열은 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192에 나타낸 성숙한 경쇄 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80％, 90％ 또는 99％) 성숙한 경쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 C3b-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존의 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 데 노보(de novo) 고체-상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법, 문헌 [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법, 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법, 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법으로 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열로 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992]; [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990]; [Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991]; 및 [Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 기재된 C3b-결합 항체를 생성하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. C3b-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생성하기 위해 바이러스-기재 및 비-바이러스 발현 벡터 둘 다 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 에피솜 벡터 (전형적으로, 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 가짐), 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 C3b-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 발현시키는데 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현과 관련하여 당업계에 공지된 수많은 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기초로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스를 기초로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 (SFV)를 기초로 하는 벡터를 포함한다. 문헌 [Brent et al., 상기 문헌], [Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995]; 및 [Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 따라 달라진다. 전형적으로, 발현 벡터는 C3b-결합 항체 쇄 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 유도가능 프로모터는 유도 조건 하인 경우 이외에는 삽입된 서열의 발현을 저해하기 위해 사용된다. 유도가능 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 보다 양호하게 허용되는 서열을 코딩하는 집단으로 편향되지 않으면서 비-유도 조건 하에서 증식될 수 있다. 프로모터 이외에도, C3b-결합 항체 쇄 또는 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 요구되거나 요망될 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용하는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함시켜 증진될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994]; 및 [Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현 증가를 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 삽입된 C3b-결합 항체 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하는 분비 신호 서열 위치를 제공할 수도 있다. 보다 흔히, 삽입된 C3b-결합 항체 서열을 신호 서열에 연결시킨 후에 벡터에 포함시킨다. C3b-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는데 사용되는 벡터는 때때로 또한 불변 영역 또는 그의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서의 가변 영역의 발현을 허용함으로써 무손상 항체 또는 그의 단편을 생성할 수 있다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
C3b-결합 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 원핵 숙주 중 하나이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예를 들어 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae), 예를 들어 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 공지된 프로모터, 예를 들어 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 종료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 C3b-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 다른 미생물, 예를 들어 효모가 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 C3b-결합 폴리펩티드를 발현시키고 제조하는데 사용된다. 예를 들어, 이들은 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 (예를 들어, 하기 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사망할 동물 또는 인간 세포, 또는 정상적이거나 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 개발된 바 있다. 포유동물 조직 세포 배양을 이용하여 폴리펩티드를 발현시키는 것은 예를 들어 문헌 [Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에서 일반적으로 논의된다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조정가능하거나 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도가능 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라시클린-유도가능 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 당업계에 공지된 프로모터-인핸서 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 사용되고, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다. (일반적으로, 문헌 [Sambrook, et al., 상기 문헌] 참조). 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포좀-매개 형질전환, 주입 및 미세주입, 발리스트(ballistic) 방법, 비로좀, 이뮤노리포좀, 다중양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (문헌 [Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997]), DNA 흡수 증진제, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간 고수율 생성을 위해, 종종 안정적인 발현을 원할 것이다. 예를 들어, C3b-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주는, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 벡터의 도입 후에 세포를 1일 내지 2일 동안 영양강화 배지에서 성장시킨 후, 선별 배지로 전환할 수 있다. 선별가능한 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하기 위한 것이고, 이것의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선별 배지에서 성장하게 한다. 안정적으로 형질감염된 내성 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술로 생성할 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하는 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환을 이용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생성하는 것은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 관심 뮤린 하이브리도마로부터 얻고 이것을 조작하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해서, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly 등) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해서, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5225539 (Winter) 및 미국 특허 번호 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370 (Queen 등)을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. C3b에 대해 지시된 이같은 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조믹 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모조믹 마우스는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스라고 각각 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서는 이들을 통칭하여 "인간 Ig 마우스"라고 지칭한다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께 재배열되지 않는 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 감소를 나타내고, 면역화에 대한 반응시에 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나서 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (문헌 [Lonberg, N. et al., 1994 상기 문헌]; [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 고찰). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 보유되는 게놈 변형은 하기 문헌에 추가로 기재되어 있다: [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724]; [Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830]; [Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591]; 및 [Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851] (상기 모든 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 구체적으로 참고로 포함됨). 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani 등); PCT 공개 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (Korman 등)를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모좀 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"라 지칭되며, PCT 공보 WO 02/43478 (Ishida 등)에 상세하게 기재되어 있다.
추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 C3b-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (압제닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))라고 지칭되는 대안적인 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati 등)에 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스크로모조믹 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 C3b-결합 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"라고 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀 둘 다를 보유하는 마우스를 사용할 수 있고, 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더우기, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 암소가 당업계에 보고되었고 (문헌 [Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894]), 이를 사용하여 본 발명의 C3b-결합 항체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 제조할 수도 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에서 확립되어 있거나 하기 실시예에서 기재된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner 등); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower 등); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty 등); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths 등)을 참고한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역 세포를 재구축한 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역화시에 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson 등)에 기재되어 있다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 더욱 구체적으로는, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 이러한 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 이것의 배선 형태로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "역돌연변이" 항체 역시 본 발명에 포함된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜서 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 "탈면역화"라고도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr 등)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가하여 또는 이러한 변형에 대한 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시키는 변형을 Fc 영역 내에 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수도 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 잔기를 항체에 부착시킬 수 있음) 또는 이것의 글리코실화를 변경시켜, 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형시킬 수도 있다. 각각의 이러한 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역 내 잔기의 번호매김은 카바트의 EU 지수의 번호매김이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer 등)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이시켜서 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 더욱 구체적으로, 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입하여 항체가 본래의 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward 등)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 하기 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta 등)에 기재된 바와 같이, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시켜서 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터의 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 이펙터 기능을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하게 할 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter 등)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜서 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 저하되거나 제거된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 갖도록 할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie 등)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜서 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 94/29351 (Bodmer 등)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력이 증가되고/되거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도가 증가되도록 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 추가로, 인간 IgG1에서 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부분이 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재된 바 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 탈글리코실화 항체가 생성될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도가 증가되도록 변형시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 하는 1개 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이러한 탈글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co 등)에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체가 생성될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시켜서 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang 등)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고, 이로 인해 상기 숙주 세포 내에서 발현된 항체에서 저푸코실화가 일어난다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana 등)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 이와 같이 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이분화 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
변경된 항체를 조작하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에서 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 C3b-결합 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시켜서 새로운 C3b-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 C3b-결합 항체의 구조적 특징을 이용하여 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 인간 C3b에 대한 결합 및 또한 C3b의 하나 이상의 기능적 특성의 억제 (예를 들어, 용혈 검정에서 적혈구 용해의 억제) 특성을 보유하는, 구조적으로 관련이 있는 C3b-결합 항체를 생성한다.
예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합적으로-조작된 C3b-결합 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 상기 섹션에 기재된 것들을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 후에 이러한 "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어진 C3b-결합 항체를 제조하고, 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜서 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고, 상기 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 9, 23, 37, 51, 65, 79, 93, 107, 121, 135, 149, 163, 177 및 191의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 중쇄 항체 서열; 및 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어진, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 C3b-결합 항체를 제조하고; 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
변경된 항체 서열은 또한 고정된 CDR3 서열 또는 미국 20050255552에 기재된 바와 같은 최소 필수 결합 결정자, 및 CDR1 및 CDR2 서열에서의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝하여 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터의 항체를 스크리닝하기에 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에 기재된 C3b-결합 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이며, 기능적 특성은 인간 및/또는 시노몰구스 C3b에 대한 특이적 결합을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 상기 항체는 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제한다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에 이용가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정, 예를 들어 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체의 조작 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 C3b-결합 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 C3b-결합 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 (Short)은 포화 돌연변이 유발, 합성 라이게이션 조립, 또는 이들의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, PCT 공개 WO 03/074679 (Lazar 등)는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하는 전산 스크리닝 방법을 이용한 방법을 기재한다.
본 발명의 항체의 특성화
본 발명의 항체는 다양한 기능적 검정에 의해 특성화될 수 있다. 예를 들어, 이들은 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제하는 능력, C3b 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C3b)에 대한 친화도, C3a 또는 C5a 생성을 억제하는 능력, C3b 침착을 억제하는 능력, 에피토프 비닝, 단백질분해에 대한 내성 및 보체 캐스케이드의 차단 능력, 예를 들어 MAC 형성을 억제하는 능력을 특징으로 할 수 있다.
다양한 방법을 이용하여 보체 경로 분자의 존재 및 보체계의 활성화를 결정할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,087,120 및 문헌 [Newell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982]). 예를 들어, 보체 활성은 (i) 적혈구의 보체-매개 용해 (용혈)의 억제 측정, (ii) C3 또는 C5의 절단을 억제하는 능력 측정, 및 (iii) 대체 경로 매개 용혈의 억제 측정을 통해 모니터링할 수 있다.
가장 흔히 사용되는 2가지 기술은 용혈 검정 (예를 들어, 문헌 [Baatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:892-7, 1992] 참조) 및 면역학적 검정 (예를 들어, 문헌 [Auda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990] 참조)이다. 용혈 기술은 전체 서열의 기능적 능력 (고전적 또는 대체 경로)을 측정한다. 면역학적 기술은 특정 보체 성분 또는 분열 생성물의 단백질 농도를 측정한다. 본 발명의 방법에서 보체 활성화를 검출하거나 보체 성분의 활성을 측정하는데 이용될 수 있는 다른 검정은, 예를 들어 T 세포 증식 검정 (문헌 [Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987]), 및 지연형 과민증 (DTH) 검정 (문헌 [Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629]; [Hallidayet al., 1982, in Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp. 1-26]; [Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406] 및 미국 특허 번호 5,843,449)을 포함한다.
용혈 기술에서는, 모든 보체 성분이 존재해야 하고 기능적이어야 한다. 따라서, 용혈 기술은 보체계의 기능적 완전성과 결핍 둘 다를 스크리닝할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dijk et al., J Immunol Methods 36: 29-39, 1980]; [Minh et al., Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983]; 및 [Tanaka et al., J Immunol 86: 161-170, 1986] 참조). 고전적 경로의 기능적 능력을 측정하기 위해, 헤모리신 (양 적혈구에 대한 토끼 IgG)으로 피복된 양 적혈구, 또는 토끼 항-닭 항체로 감작화된 닭 적혈구를 표적 세포 (감작 세포)로서 사용한다. 이들 Ag-Ab 복합체는 고전적 경로를 활성화시키고, 성분들이 기능적이고 적절한 농도로 존재하는 경우에는 표적 세포를 용해시킨다. 대체 경로의 기능적 능력을 결정하기 위해, 토끼 적혈구를 표적 세포로서 사용한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,087,120 참조).
MAC (막 공격 복합체) 형성을 억제하는 항체의 능력을 시험하기 위해, MAC 침착 검정을 수행할 수 있다. 간략하게 설명하면, 지모산을 사용하여 대체 경로를 활성화시킬 수 있고, IgM을 사용하여 고전적 경로를 활성화시킬 수 있다. Fab를 인간 혈청과 사전 인큐베이션하고, 지모산 또는 IgM으로 코팅된 플레이트에 첨가한다. MAC 침착의 억제율(％)은, 기준선 (EDTA 처리된 인간 혈청) 및 양성 대조군 (인간 혈청)과 비교하여 각 샘플에 대해 계산될 수 있다.
대체 경로에서 보체 단백질 C3을 억제하는 본 발명의 항체의 능력을 시험하는 것은 지모산에 침착되는 C3 분해 생성물인 C3b의 생성을 측정하는 것이다. C3b 침착을 측정하기 위한 구체적인 방법은 하기 실시예에서 상세히 기재된다.
C5 분해 생성물인 C5a의 생성을 억제하는 항체의 능력은 예를 들어 특이적 항-C5a 항체, 예컨대 유에스 바이올로직스(US Biologics)로부터 입수가능한 마우스 항-인간 C5a-des-Arg 항체를 사용하는 ELISA 검정에 의해 측정될 수 있다.
C3b에 결합하는 항체의 능력은 관심 항체를 직접 표지하여 검출할 수도 있고, 또는 항체를 표지하지 않고 결합을 당업계 공지의 다양한 샌드위치 검정 포맷을 이용하여 간접적으로 검출할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 C3b-결합 항체는 C3b 폴리펩티드에 대한 참조 C3b-결합 항체의 결합을 차단하거나 이것과 경쟁한다. 이들은 상기 기재된 완전 인간 C3b-결합 항체일 수 있다. 이들은 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 마우스, 키메라 또는 인간화 C3b-결합 항체일 수 있다. 참조 항체 결합을 차단하거나 이것과 경쟁하는 능력은 시험 중인 C3b-결합 항체가 참조 항체에 의해 규정된 것과 동일하거나 유사한 에피토프, 또는 참조 C3b-결합 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분하게 근접한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 항체는 특히 참조 항체에 대해 확인된 유리한 특성을 공유할 가능성이 있다. 참조 항체를 차단하거나 이것과 경쟁하는 능력은 예를 들어 경쟁 결합 검정으로 결정할 수 있다. 경쟁 결합 검정에서, 시험 중인 항체는 공통의 항원, 예컨대 C3b 폴리펩티드에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 조사된다. 과량의 시험 항체가 참조 항체의 결합을 실질적으로 억제한다면, 시험 항체는 항원과의 특이적 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제는 시험 항체가 참조 항체의 특이적 결합을 일반적으로 적어도 10％, 25％, 50％, 75％ 또는 90％ 감소시킨다는 것을 의미한다.
C3b 단백질과의 결합에 대한 C3b-결합 항체와 참조 C3b-결합 항체의 경쟁을 평가하는데 사용될 수 있는 공지된 경쟁 결합 검정이 많이 있다. 이들은 예를 들어 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983] 참조), 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986] 참조), 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow ＆ Lane, 상기 문헌] 참조), I-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988] 참조), 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990] 참조), 및 직접 표지된 RIA (문헌 [Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990] 참조)를 포함한다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원, 또는 표지되지 않은 시험 C3b-결합 항체 및 표지된 참조 항체 중 하나를 보유하는 세포의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정하여 측정된다. 통상적으로, 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정 (경쟁 항체)으로 확인된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 참조 항체가 결합하는 에피토프에 입체 장애를 일으키기에 충분히 근접하게 위치한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
선택된 C3b-결합 모노클로날 항체가 특유의 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해서, 각각의 항체를 시판 시약 (예를 들어, 피어스 (일리노이주 록포드)의 시약)을 사용하여 비오티닐화시킬 수 있다. 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 비오티닐화 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구는 C3b 폴리펩티드 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다. 정제된 C3b-결합 항체의 이소형을 결정하기 위해서, 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 1 ㎍/mL의 항-인간 IgG로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 1％ BSA로 차단한 후, 상기 플레이트를 1 ㎍/mL 이하의 모노클로날 C3b-결합 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 주위 온도에서 1시간 내지 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 이어서, 플레이트를 발색시키고 분석하여 정제된 항체의 이소형을 결정할 수 있다.
C3b 폴리펩티드를 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 C3b-결합 항체의 결합을 입증하기 위해, 유동 세포계측을 이용할 수 있다. 간략하게 설명하면, C3b를 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장시킴)를 0.1％ BSA 및 10％ 태아 송아지 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 C3b-결합 항체와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플은 단일 세포에 대해 게이팅되는, 광 및 측면 산란 특성을 이용한 FACScan 기기로 분석할 수 있다. 유동 세포계측 검정에 추가하여 또는 그 대신에 형광 현미경을 사용한 대안적인 검정이 이용될 수 있다. 세포를 상기한 바와 같이 정확하게 염색하고 형광 현미경으로 검사할 수 있다. 상기 방법은 개개의 세포의 가시화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 감도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 C3b-결합 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 C3b 폴리펩티드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게 설명하면, 정제된 C3b 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 C3b를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 10％ 소 태아 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출할 수 있고, BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chem. Co.), 미국 미주리주 세인트 루이스)로 발색시킬 수 있다.
기능적 검정의 예는 또한 아래 실시예 섹션에 기재된다.
예방 및 치료 용도
본 발명은 보체 활성 증가와 관련이 있는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 보체 활성 증가와 관련이 있는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 연령 관련 황반 변성 (AMD)의 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 연령 관련 황반 변성 (AMD)을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 특히 건성 AMD의 습성 AMD로의 진행 예방, 지도형 위축의 저속화 및/또는 진행 예방, 황반 부종의 치료 또는 예방, 및 건성 AMD 진행으로 인한 시력 손실의 개선에 사용될 수 있다. 또한, 이것은 습성 AMD 환자의 치료를 위해 항-VEGF 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 보체 관련 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 보체 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 공지된 보체 관련 질환 또는 장애의 예는 다음을 포함한다: 신경계 장애, 다발성 경화증, 졸중, 길랑 바레 증후군, 외상성 뇌 손상, 파킨슨병, 부적절하거나 바람직하지 못한 보체 활성화 장애, 혈액투석 합병증, 초급성 동종이식 거부반응, 이종이식 거부반응, IL-2 요법 동안 인터루킨-2 유도된 독성, 염증 장애, 자가면역 질환의 염증, 크론병, 성인 호흡 곤란 증후군, 화상 또는 동상을 포함하는 열 손상, 허혈후 재관류 상태, 심근 경색, 풍선 혈관성형술, 심폐 우회술 또는 신장 우회술에서의 펌프 후 증후군, 혈액투석, 신장 허혈, 피부선 재구축 후의 장간막 동맥 재관류, 감염성 질환 또는 패혈증, 면역 복합체 장애 및 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), SLE 신염, 증식성 신염, 용혈성 빈혈 및 중증 근무력증. 또한, 기타 공지된 보체 관련 질환은 폐 질환 및 장애, 예컨대 호흡곤란, 객혈, ARDS, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 기종, 폐 색전증 및 경색, 폐렴, 섬유형성 분진 질환, 불활성 분진 및 광물 (예를 들어, 규소, 석탄 분진, 베릴륨 및 석면), 폐 섬유증, 유기 분진 질환, 화학적 손상 (자극제 기체 및 화학물질, 예를 들어 염소, 포스겐, 이산화황, 황화수소, 이산화질소, 암모니아 및 염산으로 인함), 연기흡입 손상, 열 손상 (예를 들어, 화상, 동상), 천식, 알레르기, 기관지 수축, 과민성 폐렴, 기생충 질환, 굿패스츄어 증후군, 폐 혈관염, 및 면역 복합체 관련 염증이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 보체 관련 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 보체 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 질환 또는 장애는 천식, 관절염 (예를 들어, 류마티스성 관절염), 자가면역 심장 질환, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 허혈-재관류 손상, 바라케-시몬스 증후군, 혈액투석, 전신 루푸스, 홍반성 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 이식, 중추신경계 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 다른 신경변성 상태, aHUS, 사구체신염, 수포성 유천포창 또는 MPGN II이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 사구체신염의 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 투여하여 사구체신염을 치료하는 방법을 제공한다. 사구체신염의 증상은 단백뇨; 사구체 여과율 (GFR)의 감소; 혈청 전해질 변화, 예컨대 질소혈증 (요독증, 과도한 혈액 우레아 질소-BUN) 및 염 저류 (고혈압 및 부종을 야기하는 수분 저류를 유도함); 혈뇨 및 비정상적인 소변 침전물, 예컨대 적혈구 원주; 저알부민혈증; 고지혈증; 및 지질뇨증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH)의 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 투여하여 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH)을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 체외 순환과 관련이 있는 면역 및 지혈 시스템의 기능이상 감소가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 투여하여 체외 순환과 관련이 있는 면역 및 지혈 시스템의 기능이상을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 환자의 혈관으로부터의 환자의 혈액을 보체 활성화, 혈소판 활성화, 백혈구 활성화, 또는 혈소판-백혈구 부착 중 하나 이상을 야기할 수 있는 물질을 포함하는 관강 표면을 갖는 도관을 통해 다시 환자의 혈관으로 순환시키는 것을 수반하는 임의의 절차에 사용될 수 있다. 이러한 절차는 모든 형태의 ECC, 뿐만 아니라 인공 또는 외래 장기, 조직 또는 혈관을 환자의 혈액 회로로 도입하는 것을 수반하는 절차를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 치료제로 치료할 대상체에게는 황반 변성과 관련이 있는 상태를 치료하는 것으로 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 번호 6,218,368에 기재된 바와 같은 항생체 처치를 이용하여 다른 치료제를 투여할 수도 있다. 다른 치료법에서는, 시클로스포린과 같은 면역억제제가 면역 반응을 억제할 수 있는 작용제이다. 이들 작용제는 세포독성 약물, 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID), 특이적 T-림프구 면역억제제, 및 항체 또는 그의 단편을 포함한다 (문헌 [Physicians' Desk Reference, 53rd edition, Medical Economics Company Inc., Montvale, N.J. (1999)] 참조). 면역억제제 처치는 전형적으로 1주, 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년의 기간 동안 간격을 두고 지속된다. 일부 환자에서는, 환자의 나머지 일생 동안 치료제를 투여한다.
본 발명의 치료제가 또 다른 작용제와 함께 투여되는 경우, 이들 2가지 물질은 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체는 제2 작용제 (예를 들어, 베르테포르핀)를 사용한 요법도 수행 중인 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 결합 분자는 외과 치료와 관련하여 투여된다.
C3b-결합 항체를 사용한 조합 치료에 적합한 작용제는 보체 성분의 활성을 조정할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 작용제를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,808,109 참조). 보체-매개 활성을 저하시키는 다른 작용제가 보고된 바 있다. 이러한 작용제에는 아미노산 (문헌 [Takada, Y. et al., Immunology 1978, 34, 509]); 포스포네이트 에스테르 (문헌 [Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289]); 다가음이온성 물질 (문헌 [Conrow, R. B. et al., J. Med. Chem. 1980, 23, 242]); 술포닐 플루오라이드 (문헌 [Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160] 및 그에 인용된 문헌); 폴리뉴클레오티드 (문헌 [DeClercq, P. F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255]); 피마르산 (문헌 [Glovsky, M. M. et al., J. Immunol. 1969, 102, 1]); 포르핀 (문헌 [Lapidus, M. and Tomasco, J. Immunopharmacol. 1981, 3, 137]); 몇 가지 소염제 (문헌 [Burge, J. J. et al., J. Immunol. 1978, 120, 1625]); 페놀 (문헌 [Muller-Eberhard, H. J. 1978, in Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D. et al., eds. Academic Press, New York, p. 65]); 및 벤자미딘 (문헌 [Vogt, W. et al., Immunology 1979, 36, 138])이 포함된다. 이들 작용제 중 일부는 프로테아제 및 에스테라제의 일반적 억제를 통해 기능한다. 다른 작용제는 보체 경로 중 어떠한 특정 중간 단계에도 특이적이지 않지만, 대신에 보체 활성화의 하나 초과의 단계를 억제한다. 후자 화합물의 예는 C1, C4 및 C3b 사용을 차단하는 벤즈아미딘을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Vogt et al., Immunol. 1979, 36, 138] 참조).
보체 성분의 활성을 억제할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 추가의 작용제는 스타키보트리스(Stachybotrys)로부터의 진균 대사물인 K-76을 포함한다 (문헌 [Corey et al., J. Amer. Chem. Soc. 104: 5551, 1982]). K-76 및 K-76 COOH 둘 다 주로 C3b 단계에서 보체를 억제하고 (문헌 [Hong et al., J. Immunol. 122: 2418, 1979]; [Miyazaki et al., Microbiol. Immunol. 24: 1091, 1980]), 정상적인 인간 보체로부터의 화학주성 인자의 생성을 방지 (문헌 [Bumpers et al., Lab. Clinc. Med. 102: 421, 1983])하는 것으로 나타났다. 고 농도의 K-76 또는 K-76 COOH에서는, 이들 각각의 이전 중간체와 C2, C3, C6, C7 및 C9의 반응이 일부 억제되는 것으로 나타난다. K-76 또는 K-76 COOH는 또한 보체의 C3b 불활성화 시스템을 억제하는 것으로 보고된 바 있다 (문헌 [Hong et al., J. Immunol. 127: 104-108, 1981]). 본 발명의 방법을 실시하는데 적합한 기타 작용제는 그리세오풀빈 (문헌 [Weinberg, in Principles of Medicinal Chemistry, 2d Ed., Foye, W. O., ed., Lea & Febiger, Philadelphia, Pa., p. 813, 1981]), 이소판나린 (문헌 [Djura et al., Aust. J. Chem.36: 1057, 1983]), 및 시포노딕티온 코랄리-파굼(Siphonodictyon coralli-phagum)의 대사물 (문헌 [Djura et al., Aust. J. Chem.36: 1057, 1983])을 포함한다.
조합 요법은 부가적일 수도 있고 상승작용적 결과 (예를 들어, 보체 경로 활성의 감소가 2종의 작용제의 조합 사용에 대해 예상된 것보다 더 큼)를 야기할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 C3b-결합 항체 및 항혈관신생제, 예컨대 항-VEGF 작용제를 사용하여 AMD 또는 상기한 바와 같은 또 다른 보체 관련 질환을 예방 및/또는 치료하는 조합 요법을 제공한다.
진단 용도
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)에서 또는 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 AMD와 관련이 있는 장애가 발생할 위험이 있는 개체로부터 C3b 단백질 및/또는 핵산 발현 및 또한 C3b 단백질 기능을 결정하는 진단 검정을 포함한다.
진단 검정, 예컨대 경쟁적 검정은 표지된 유사체 ("추적자")가 시험 샘플 분석물질과 공통의 결합 파트너에 존재하는 제한된 수의 결합 부위에 대해 경쟁하는 능력에 따라 달라진다. 일반적으로 경쟁 전 또는 경쟁 후에 결합 파트너를 불용화시킨 후에 결합 파트너에 결합된 추적자 및 분석물질을 미결합 추적자 및 분석물질로부터 분리한다. 이러한 분리는 경사분리 (결합 파트너가 사전에 불용화된 경우) 또는 원심분리 (결합 파트너가 경쟁 반응 후에 불용화된 경우)에 의해 달성된다. 시험 샘플 분석물질의 양은 마커 물질의 양으로 결정되는 바와 같은 결합된 추적자의 양에 반비례한다. 공지된 양의 분석물질을 이용한 용량-반응 곡선을 작성하고, 이것을 시험 결과와 비교하여 시험 샘플에 존재하는 분석물질의 양을 정량적으로 결정한다. 이러한 검정은, 측정가능한 마커로서 효소가 사용되는 경우에 ELISA 시스템이라 지칭된다. 이러한 형태의 검정에서는, 항체와 C3b-결합 항체 사이의 경쟁적 결합으로 인해 결합된 C3b 단백질, 바람직하게는 본 발명의 C3b 에피토프가 생성되는데, 이는 혈청 샘플 중의 항체, 가장 특히 혈청 샘플 중의 중화 항체의 척도가 된다.
상기 검정의 유의한 이점은 중화 항체 (즉, C3b 단백질, 구체적으로는 에피토프의 결합을 방해하는 항체)를 직접 측정한다는 점이다. 특히 ELISA 시험 형태의 이러한 검정은 임상 환경 및 통상적인 혈액 스크리닝에 상당한 정도로 적용되고 있다.
면역학적 기술은 다양한 보체 성분 (예를 들어, C3, C4, C5)의 상이한 에피토프에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 예를 들어 보체 성분의 분열 생성물을 검출한다 (예를 들어, 문헌 [Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980]; [Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981]; [Linder et al., J Immunol Meth 47: 49-59, 1981]; 및 [Burger et al., J Immunol 141: 553-558, 1988] 참조). 이어서, 항체가 공지된 농도의 표지된 분열 생성물과 경쟁하여 분열 생성물과 결합하는 정도를 측정할 수 있다. 다양한 검정, 예를 들어 방사선면역검정, ELISA 및 방사상 확산 검정이 보체 분열 생성물의 검출에 이용가능하다.
면역학적 기술은 보체 활성화를 검출할 수 있는 높은 감도를 제공하는데, 이는 이러한 기술로 황반 변성 관련 장애가 있거나 없는 시험 대상체 및 대조군 대상체로부터의 혈액 중 분열 생성물의 형성을 측정할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 일부 방법에서, 안구 장애와 관련이 있는 장애의 진단은, 시험 대상체로부터의 혈액 혈장 중 보체 성분의 가용성 분열 생성물의 정량화를 통해 비정상적인 보체 활성화를 측정함으로써 이루어진다. 이러한 측정은 예를 들어 문헌 [Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981]; 및 [Bhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 오직 생체내 형성된 보체 활성화만이 측정된다. 이것은 보체계의 억제제를 함유하는 매질에 해당 대상체로부터의 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈청)을 수집한 후에 상기 샘플에서의 보체 활성화를 측정 (예를 들어, 분열 생성물의 정량화)하여 달성할 수 있다.
안구 질환 또는 장애와 관련된 장애를 갖는 환자의 임상적 진단 또는 모니터링시에, 정상 대상체로부터의 상응하는 생물학적 샘플에서의 수준과 비교해서 보체 단백질이 검출된다는 것은 환자가 황반 변성과 관련이 있는 장애를 갖는다는 지표이다.
생체내 진단 또는 영상화가 US2006/0067935에 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 이들 방법은 일반적으로, 비-침습성 방법에 의해 검출 가능한 마커 또는 표지에 작동가능하게 부착된 C3b 결합 분자의 진단상 유효량을 환자에게 투여 또는 도입하는 단계를 포함한다. 항체-마커 접합체를 안구에 국소화하고 안구 내에서 보체 단백질과 결합하기에 충분한 시간을 제공한다. 이어서, 환자를 검출 장치에 노출시켜 검출 가능한 마커를 확인함으로써, 환자의 안구 내에서의 C3b 결합 분자의 위치 영상을 형성시킨다. C3b 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 존재는 항체-마커가 안구의 성분과 결합하는지 여부를 결정하여 검출된다. AMD 질환이 없는 정상 개체와 비교해서 선택된 보체 단백질 또는 단백질 조합물의 수준 증가가 검출된 것은, 황반 변성과 관련이 있는 장애에 대한 소인 및/또는 상기 장애 발병의 지표이다. 본 발명의 이러한 측면은 또한 안구 영상화 방법 및 복합 혈관신생 진단 및 치료 방법에 사용하기에 바람직하다.
본 발명은 또한 진단 검정, 예후 검정, 약리유전학 및 임상 시험 모니터링을 예후 (예측) 목적으로 사용함으로써 개체를 예방적으로 치료하는 예측 의학 분야에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개체가 보체 경로 활성의 조절이상과 관련이 있는 장애가 발병할 위험에 있는지의 여부를 결정하기 위한 예후 (또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, C3b 유전자 내의 돌연변이를 생물학적 샘플에서 검정할 수 있다. 이러한 검정을 예후 또는 예측 목적으로 사용함으로써, C3b 단백질, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 이와 관련이 있는 장애의 발병 전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 개체에서 C3b 핵산 발현 또는 C3b 단백질 활성을 결정함으로써 상기 개체에게 적절한 치료제 또는 예방제를 선별하는 방법을 제공한다 (본원에서 "약리유전학"이라 지칭됨). 약리유전학은 개체의 유전자형 (예를 들어, 개체가 특정한 작용제에 대해 반응하는 능력을 결정하기 위해 조사한 개체의 유전자형)을 기초로 하여 개체를 치료적 또는 예방적 처치하기 위한 작용제 (예를 들어, 약물)을 선택할 수 있게 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상 시험에서 C3b 단백질의 발현 또는 활성에 대한 작용제 (예를 들어, 약물)의 영향을 모니터링하는 것에 관한 것이다.
제약 조성물
본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 C3b-결합 항체 (무손상 또는 결합 단편)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 보체-관련 질환 (예를 들어, AMD)을 치료 또는 예방하기에 적합한 1종 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 생리적으로 상용가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항-진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 변한다. 투여가 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하이거나, 표적 부위에 근접하게 투여되는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 안구 안으로 유리체내 투여될 수 있도록 제제화된다. 제약상 허용되는 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
조성물은 멸균되고 유체여야 한다. 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액제의 경우에는 필요한 입도의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 유도될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 널리 공지되고 통상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000]; 및 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에서 제조된다. 전형적으로, C3b-결합 항체의 치료 유효 용량 또는 효능 용량이 본 발명의 제약 조성물에 사용된다. C3b-결합 항체는 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투약법은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수도 있고, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 정해지는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여량 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약력학 인자, 예를 들어 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 처치 기간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 기타 인자에 따라 달라진다.
전문의 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 항체의 투여를 원하는 치료 효과 달성에 필요한 것보다 더 낮은 수준에서 시작할 수 있고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 알레르기성 염증성 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 처치가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 비롯한 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능이 최적화되도록 적정할 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우, 투여량 범위는 약 0.0001 내지 100 mg/kg (숙주 체중), 더욱 일반적으로는 0.01 내지 15 mg/kg의 범위이다. 예시적인 치료법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반하였다. 항체를 유리체내 투여하는 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 약 10 mg의 범위이다. 예시적인 치료법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반하였다.
항체는 일반적으로 여러회 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 C3b-결합 항체의 혈액 수준을 측정하여 나타나는 바에 따라 불규칙할 수도 있다. 전신 투여의 일부 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 ㎍/mL, 일부 방법에서는 25 내지 500 ㎍/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다. 대안적으로, 빈도를 덜하게 하여 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비-인간 항체보다 더 긴 반감기를 보인다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방을 위한 것인지 치료를 위한 것인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방을 위해 적용하는 경우에는 비교적 낮은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격으로 장기간의 시간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 일생 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서는, 때때로 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법제를 투여할 수 있다.
<실시예>
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 다른 변형은 당업자에게 매우 명백할 것이고, 첨부하는 특허청구범위에 포함된다.
실시예 1: 항원의 제조 및 품질 관리
비오티닐화 C3b의 생성
정제된 C3b를 피어스로부터의 표지화 시약을 이용하여 20배 몰 과량의 비오티닐화 시약으로 비오티닐화하였다. 비오티닐화는 실온에서 수행하였고, 접합되지 않은 비오틴은 0.5 ml 제바 스핀(Zeba Spin) 탈염 칼럼을 이용하여 분리하였다. C3b의 리신 잔기는 EZ-링크 NHS-LC-LC-비오틴을 이용하여 표지화하고, 시스테인 잔기는 EZ-링크 말레이미드-PEG2-비오틴을 이용하여 표지화하였다. 비오티닐화의 정도는 HABA 검정 및 LC-MS/MS를 이용하여 정량화하였다. C3 상에서의 티오에스테르 결합 형성에 관여하는 단일 시스테인의 비오티닐화는 LC-MS/MS에 의해 확인하였다.
아가로스 비드에 결합된 C3b의 생성
정제된 C3b (퀴델(Quidel) A413, lot 903726)를 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences) (17-0851-01)로부터의 PD-10 탈염 칼럼을 사용하여 커플링 완충제 (50 mM 트리스, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5)로 완충제 교환하였다. 술포링크 커플링 겔 (피어스 20401) 및 모든 다른 시약을 실온으로 평형화시켰다. 술포링크 커플링 겔을 4 겔-층 부피의 커플링 완충제로 평형화시키고, 회전시키고, 상청액을 제거하였다. 이어서, 완충제-교환된 C3b 단백질 용액을 첨가하여, 평형화된 술포링크 커플링 겔을 회전시켰다. 혼합물을 실온에서 15 분 동안 진동시킨 다음, 30 분 동안 혼합하지 않고 정치시킨채 두었다. 이어서, 접합된 C3b-커플링 겔을 3 겔-층 부피의 커플링 완충제로 세척하였다. 그 후, 1 겔-층 부피의 켄칭 시약 (커플링 완충제 중 50 mM L-시테인-HCL (44889))을 C3b-커플링 겔에 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 진동시킨채 두었다. 15 분 후, 접합된 C3b-커플링 겔을 실온에서 혼합하지 않고 30 분 동안 두었다. 접합된 C3b-커플링 겔을 적어도 6 겔-층 부피의 세척 용액 (1M NaCl)으로 세척한 다음, 2 겔-층 부피의 탈기된 저장 완충제 (0.05％ 나트륨 아지드를 함유하는 포스페이트-완충된 염수)로 세척하였다. 최종 단계는 1 겔-층 부피의 저장 완충제를 추정된 1 mg/mL의 단백질에 겔-층 부피로 첨가하는 것이었다.
C3b-술포링크 커플링 겔 단백질 농도 측정
하기 양의 C3b를 환원 조건 하에서 4-12％ 변성 단백질 겔 상에 흘려보냈다: 2 ㎍, 1.5 ㎍, 1 ㎍, 0.75 ㎍, 0.5 ㎍ 및 0.25 ㎍. 이들 레인 다음에, 2 ㎕, 4 ㎕ 및 8 ㎕의 50％ 비드 현탁액 (C3b-커플링 겔) 또한 환원 조건에서 로딩하였다. 알파 쇄가 상기 비드에 공유 결합하기 때문에, 이는 단백질 겔 상에서는 보이지 않을 것이며, 따라서 단백질 농도는 베타 쇄를 비교함으로써 측정하였다. 약 1 ㎍의 C3b가 1 ㎕의 커플링 겔에 커플링되어 90％ 초과의 커플링 효율이 달성된 것으로 추정되었다.
술포링크 커플링 겔 상에서 활성 C3b 백분율 계산
4가지 상이한 농도 (0.122 μM, 0.244 μM, 0.367 μM 및 0.489 μM)의 인자 B, 고정된 농도의 가용성 C3b (4 경우 모두에서 0.294 μM), 및 고정된 농도의 인자 D (4 경우 모두에서 0.47 μM)로 4가지 대조군을 설정하였다. 이들 대조군 반응에서 인자 P는 생략하였다. 반응물을 37℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이 시점에서, 모든 대조군 샘플을 즉시 4X 샘플 완충제에 첨가하고, 95℃에서 10 분 동안 두어 이후 4-12％ 비스-트리스 단백질 겔 상에 흘려보냈다. C3b-커플링된 비드는 1 mg 층 부피 당 약 1 mg C3b의 농도였다. 하기 7가지 반응은 고정된 농도의 커플링된 C3b 비드 (0.294 μM), 고정된 인자 P (2.68 μM), 및 고정된 인자 D (0.95 μM)로 이루어졌다. 인자 B에 대한 농도는 다음과 같다: 0.367 μM, 0.489 μM, 0.978 μM, 1.467 μM, 1.955 μM, 2.933 μM, 및 3.910 μM. 이들 7가지 반응의 경우, 모두는 아니지만 인자 D를 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 30 인큐베이션 후에, 0.95 μM 인자 D를 첨가하고, 반응물을 2 분 동안 인큐베이션하였다. 이 시점에서, 모든 샘플을 즉시 4X 샘플 완충제에 첨가하고, 환원 조건 하에서 4-12％ 비스-트리스 겔 상에 흘려보냈다. 데이터를 분석할 때, Bb 밴드를 모든 레인에서 비교하였다.
비드-C3b 안정성
C3b-술포링크 커플링 겔 접합 후에, 비드를 회전시키고, 100％ 글리세롤에 부드럽게 재현탁시켰다 (50％의 최종 글리세롤 농도로 만듬). 이어서, 비드를 몇회의 동결 해동 (3회까지 시험)을 위해 -80℃에 두었다. 이어서, 비드를 얼음 상에서 해동시키고, 15 ml 원추형 튜브로 옮겼다. 5 칼럼 부피의 1XPBS를 첨가하여 비드를 재현탁시켰다. 이를 850 g에서 5 분 동안 회전시켰다. 10 칼럼 부피의 1XPBS로 2회 추가의 세척을 완료하였다. 최종 단계는 비드를 1XPBS로 재현탁시켜 최종 50％ 슬러리 용액으로 만드는 것이었다. 각각의 동결 해동을 Bb 생성에 대해 시험하였다: 3 μM 인자 B, 0.5 μM 인자 D, 1 μM C3b-비드, 및 5 mM MgCl을 1 시간 동안 인큐베이션하여, 완전한 Bb 생성을 확인하였다. 뿐만 아니라, Bb 생성을 통해 몇주 동안 -80℃에서 저장한 후, 동결된 비드를 시험하였다.
시노 C3의 정제 및 시노 C3b의 생성
시노 혈장을 알파제네시스(Alphagenesis, 사우쓰 캐롤라이나주 예마시)로부터 구입하였다. 50 ml 혈장을 PBS, 10 mM EDTA 및 2개의 완전 칵테일 억제제 정제 (로슈(Roche))에 의해 200 ml로 희석하였다. 40％ PEG6000을 4％의 최종 농도가 되도록 상기 용액에 천천히 첨가하고, 4℃에서 추가 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. 17,500 rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. PEG6000을 12.5％의 최종 농도가 되도록 상청액에 다시 첨가하고, 4℃에서 30 분 동안 교반하였다. 175,000 rpm에서 20 분 동안 동안 원심분리한 후, 상청액을 폐기하였다. 펠릿을 50 ml 1XPBS에 재용해시키고, 10 mM EDTA 완충제 및 C3 함유 용액을 15 ml 단백질 G (GE) 칼럼에 2회 통과시켜, 시노 IgG를 제거하였다. 단백질 G 칼럼으로부터의 흐름을 밤새 4L의 20 mM 트리스 pH 8.0, 10 mM EDTA에 대해 투석하였다. 한편, 칼럼 기준선이 투명해지고 평형화될 때까지, 20 ml 모노Q 칼럼 (GE)을 0.5M NaOH, 이어서 물 및 다량의 20 mM 트리스 pH 8.0 및 10 mM EDTA로 세정하였다. 이어서, 투석된 용액을 ATKA 100 (GE)에 의해 0.8 ml/분의 유속으로 모노Q 칼럼에 로딩하였다. 로딩 후, 칼럼을 10 칼럼 부피의 20 mM 트리스 pH 8.0 및 10 mM EDTA로 또는 기준선이 안정해질 때까지 세척하였다. 단백질을 20 칼럼 부피의 NaCl 선형 구배 0 내지 500 mM에 의해 칼럼으로부터 용리시키고, 분획을 4 ml/튜브로 수집하였다. C3 단백질 피크를 비환원 및 환원 조건 하에서 분획에 대한 SDS-PAGE 겔에 의해 확인하였다. 추가로, C3을 웨스턴 블롯 및 MS 펩티드 맵핑 분석에 의해 확인하였다. 이어서, 85％ 순수한 C3 분획을 모아서, 추가로 PBS 완충제를 사용하여 2660 세파크릴 300 겔 여과 칼럼 (GE)에 의해 정제하였다. C3 피크 분획을 SDS-PAGE 및 MS 분석에 의해 다시 확인하였다. 순수한 분획을 모아서, 밀리포어 농축기에 의해 약 1 mg/ml로 농축시키고, 분취하고, 후속 사용을 위해 -80℃ 동결기에서 저장하였다.
시노 C3을 PBS 완충제 중에서 500 ㎍/mL로 희석하였다. PBS 완충제 중의 0.4 μM fB (콤프텍(Comptech)), 0.05 μM fD (콤프텍) 및 5 mM MgCl2를 첨가하여 C3을 C3b로 완전히 전환시키고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, C3b를 2660 세파크릴 300 겔 여과 칼럼에 의해 추가로 정제하였다. C3b 함유 피크 분획을 모아서, 밀리포어 농축기에 의해 농축시켰다. 시노 C3b의 활성을 C3 전환효소 검정으로 시험하였다. 단백질은 인간 C3b (콤프텍)와 필적할만한 Bb 생성 활성을 나타내었다.
보체 인자 및 시판 항체에 의한 결합에 의한 C3b 시약의 품질 관리
효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 결합 (에피토프 보존)
비오티닐화 C3b 분자를 ELISA에서 비-비오티닐화 C3b와 비교하여, 시판 항체에 의해 인식되는 C3b 에피토프의 보존을 평가하였다.
맥시소르프 플레이트를 코팅 완충제 (비카르보네이트 pH 9.5-9.8) 중 2 ㎍/mL의 시판 항-C3 또는 항-C3b 항체 100 ㎕/웰로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후, 플레이트를 300 ㎕/웰 희석제 (신블록(Synblock), 에이비디 세로텍(AbD Serotec))로 실온에서 2 시간 동안 차단시켰다. 차단 용액을 흡인시킨 후, 희석제로 희석된 100 ㎕ C3b (+/- 비오틴) 샘플을 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 희석제 (폴리-HRP 희석제) 또는 HRP-접합된 항-C3 Ab로 1:5000로 희석된 100 ㎕/웰 Strep-HRP (폴리-HRP 스트렙타비딘)을 30 분 동안 첨가하였다. PBST로 4회 세척한 후, 100 ㎕/웰 TMB 기질 (울트라 TMB 기질 용액)을 5 내지 10 분 동안 첨가하였다. 50 ㎕/웰 정지 용액 (2N H2SO4)으로 반응을 중단시켰다. 흡광도를 판독하고 (A450-A570), 소프트맥스 프로(SoftMax Pro)를 이용하여 분석하였다.
보체 인자 및 시판 Ab에 의한 결합
아가로스 비드 상에 고정된 C3b를 시판 항체 및 보체 인자 단백질에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다.
4 ㎕의 C3b 비드 슬러리 (~1 ㎍의 C3b에 상응함)를 각각의 튜브에 첨가하였다. 비드를 100 ㎕ 희석제에 재현탁시켰다. 이어서, 튜브에서의 총 부피를 희석제 + Ab 또는 보체 인자 단백질에 의해 200 ㎕로 만들었다. 튜브를 실온에서 1 시간 동안 진동시킨 다음, 희석제로 1회 세척하였다. 비드 슬러리를 미니 칼럼에 적용하고, 2회 더 세척하였다. 나머지 액체를 신속히 회전시켰다 (1,200G에서 1 분 동안). 칼럼을 막은 다음, 희석제 중의 500 ㎕의 2차 항체 (1:5000), 또는 항-보체 인자 Ab를 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 희석제로 4회 세척하였다. [보체 인자의 경우, 2차 Ab와 함께 상기 단계를 반복하였다]. 나머지 액체를 신속히 회전시켰다 (1,200G에서 1 분 동안). 칼럼을 막은 다음, 100 ㎕의 TMB 기질을 첨가하였다. 액체를 새로운 튜브로 신속히 회전시켰다 (1,200G에서 1 분 동안). 용액을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 50 ㎕/웰 정지 용액 (2N H2SO4)에 의해 반응을 정지시켰다. 흡광도를 판독하고 (A450-A570), 데이터를 소프트맥스 프로를 사용하여 분석하였다.
실시예 2. HuCAL 골드(HuCAL GOLD ® ) 라이브러리로부터 C3b-특이적 항체의 생성
항체 변이체 단백질의 공급원으로서 시판되는 파지 디스플레이 라이브러리, 모르포시스(MorphoSys) HuCAL 골드® 라이브러리를 사용하여 높은 결합 친화도를 갖는 클론을 선별함으로써 항-C3b 항체를 생성하였다. HuCAL 골드® 라이브러리는 모든 6개 CDR이 적절한 돌연변이에 의해 다양화되고, Fab를 파지 표면에 연결하기 위해 시스디스플레이(CysDisplay™) 기술 (예를 들어, WO01/05950 참조)을 이용하는 Fab 라이브러리 (문헌 [Knappik et al., 2000])이다.
HuCAL 골드® 파지-항체를 12개의 별개의 서브라이브러리: VH1κ, VH1λ, VH2κ, VH2λ, VH3κ, VH3λ, VH4κ, VH4λ, VH5κ, VH5λ, VH6κ, VH6λ에 제공하였다. 상기 12개의 서브라이브러리를 특정한 실험의 요건에 따라 임의의 조합으로서 모을 수 있다. C3b에 결합하는 항체를 선별하기 위해, 3가지 상이한 패닝 전략을 적용하였다:
a) 파지-항원 복합체가 스트렙타비딘 자기 비드에 의해 포획되는, 비오티닐화 인간 C3b를 이용하는 용액 패닝,
b) C3b가 아가로스 비드에 결합하는, 비드 기반 패닝, 및
c) 담체 단백질에 커플링된 펩티드에 대한 선별 라운드를 전장 C3b (비오티닐화되거나 또는 아가로스 비드에 결합됨)에 대한 선별 라운드로 대체한, 차별적 펩티드 패닝.
파지미드 구조, 파지 증폭 및 정제
HuCAL 골드® 라이브러리를 34 ㎍/mL 클로람페니콜 및 1％ 글루코스를 함유하는 2xYT 배지 (2xYT-CG) 중에서 증폭시켰다. OD600nm 0.5 (진탕시키지 않고 37℃에서 30분, 250 rpm의 진탕하에 37℃에서 30분)에서 VCSM13 헬퍼 파지로 감염시킨 후, 세포를 회전시키고 (4120 g, 5분, 4℃), 2xYT/34 ㎍/mL 클로람페니콜/50 ㎍/mL 카나마이신/0.25 mM IPTG 중에 재현탁시켜 22℃에서 밤새 성장시켰다. 상기 상청액으로부터 파지를 PEG-침전시켜 PBS/20％ 글리세롤 중에 재현탁하고, -80℃에서 저장하였다. 2회의 패닝 라운드 사이의 파지 증폭은 다음과 같이 수행하였다: 중간-로그 단계의 이. 콜라이 TG1 세포를 용리된 파지로 감염시키고, 1％ 글루코스 및 34 ㎍/mL 클로람페니콜이 보충된 LB 아가 (LB-CG 플레이트)에 플레이팅하였다. 30℃에서 밤새 인큐베이션한 후, TG1 콜로니를 아가 플레이트로부터 긁어내고, OD600nm 0.5에 도달할 때까지 2xYT-CG에 접종해 두었다. VCSM13 헬퍼 파지를 상기한 바와 같이 감염을 위해 첨가하였다.
용액 패닝
이 패닝 전략에 사용된 항원은 비오티닐화 C3b이었다. 비오티닐화 C3b의 두가지 상이한 비오티닐화 변이체가 존재한다. 한 변이체에서 비오틴은 C3b 상의 시스테인 잔기에 부착된 말레이미드-PEG-링커를 통해 C3b에 연결된다. 이 변이체는 이후 C3b-시스테인-비오틴으로 불린다. 다른 변이체에서 비오틴은 C3b 상의 3개의 상이한 리신 잔기에 부착된 술포-NHS-LCLC-링커를 통해 C3b에 연결된다. 이 변이체는 이후 C3b-리신-비오틴으로 불린다. 링커 분자에 결합하는 파지를 선별하지 않도록, 두가지 상기한 변이체에 대한 선별을 선별 라운드에서 교대시킨다.
스트렙타비딘 자기 비드 (다이나비즈(Dynabeads) M-280, 다이날(Dynal))를 PBS로 1회 세척하고, 케미블로커(Chemiblocker)로 실온에서 2시간 동안 차단시켰다. 또한, PBS 희석된 파지를 케미블로커로 실온에서 1 내지 2 시간 동안 회전기 상에서 차단시켰다. 차단된 파지를 차단된 스트렙타비딘 자기 비드에 대해 30 분 동안 2회 사전-흡착시켰다. 파지 상청액을 새로운 차단된 2 mL 반응 튜브로 옮기고, 인간 비오티닐화 C3b를 첨가하여 실온에서 1 내지 2 시간 동안 회전기 상에서 인큐베이션하였다. 100 ㎕의 차단된 스트렙타비딘 자기 비드를 각각의 패닝 풀에 첨가하여 회전기 상에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 비드를 대략 2.5 분 동안 입자 분리기 (다이날 MPC-E)에 의해 수집하고, 용액을 조심스럽게 제거하였다.
이어서, 비드를 회전기를 사용하여 PBST로 7회 세척한 후, PBS로 3회 더 세척하였다. 다이나비즈로부터의 파지 용리는 10 mM 트리스/HCl (pH 8) 중 200 ㎕의 20 mM DTT를 각가의 튜브에 첨가하고 10 분 동안 인큐베이션하여 수행하였다. 자기 입자 분리기에 의해 다이나비즈를 제거하고, 상청액을 OD600nm 0.6 내지 0.8로 성장시킨 이. 콜라이 TG-1 배양물 14 mL에 첨가하였다. 파지 감염을 위해서, 상기 배양물을 50 mL 플라스틱 튜브에서 37℃에서 45 분 동안 진탕시키지 않고 인큐베이션하였다. 4120 x g에서 5 분 동안 원심분리한 후, 박테리아 펠릿을 각각 800 ㎕의 2xYT 배지 중에 재현탁하고, 3xYT-CG 아가 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 파지를 상기한 바와 같이 구조하고 증폭시켰다. 제2 및 제3 라운드의 선별을 제1 라운드의 선별과 동일한 방식으로 수행하였다.
C3b-특이적 파지를 선별하기 위해, C3 단백질을 이용하는 몇몇 상이한 차단 접근법을 다양한 하위 풀에 적용하였다. 일반적으로, 파지를 케미블로커로 차단시킬 때, 정제된 C3 또는 C3 함유 혈청을 첨가하고, 회전기 상에서 1 내지 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 따라서, 잠재적인 C3b/C3 교차 반응 파지는 C3b와 접촉시에 이미 항원에 결합되어야 하고, C3b-특이적 파지만이 선별되어야 한다. 패닝 1812.1을 위해, 정제된 C3을 10배 몰 과량으로 첨가하였다 (제1 라운드 동안에만). 패닝 1889의 하위 풀 1-6의 경우에는 차단을 적용하지 않았다. 하위 풀 7-12의 경우, 인간 혈청을 이용하는 다양한 차단 조건을 3회의 모든 선별 라운드에 적용하였다. 하위 풀 7 및 8의 경우, 희석되지 않은 인간 혈청을 첨가하여, C3b에 비해 대략 70배 몰 과량의 C3을 생성하였다. 본 발명자들은 혈청 인자가 C3b를 분해할 수도 있다고 걱정하였기 때문에, 프로테이나제 억제제를 첨가하였다 (페파블럭 SC(Pefabloc SC), 로슈, 최종 농도 4 mM). 하위 풀 9-12의 경우, 희석된 인간 혈청을 첨가하여 C3b에 비해 대략 2배 몰 과량의 C3을 생성하였다. 하위 풀 9 및 10은 프로테이나제 억제제를 함유하였고, 풀 11 및 12의 경우에는 억제제가 첨가되지 않았다.
비드 기반 패닝
비드 기반 패닝에 사용된 항원은 술포링크 아가로스 비드에 커플링된 C3b이었다. 차단된 비드에 파지를 사전 흡착시키기 위해 사용된 비드는 아가로스 비드 (술포링크 커플링 겔)을 시스테인 (술포링크 고정화 시행 키트로부터)으로 처리함으로써 모르포시스에 의해 생산되었으며, 이는 비드 상의 모든 가능한 결합 부위를 차단한다.
PBS 희석된 파지를 회전기 상에서 실온에서 1 내지 2 시간 동안 케미블로커에 의해 차단시켰다. 차단된 파지를 차단된 아가로스 비드에 대해 30 분 동안 2회 사전-흡착시켰다. 파지 상청액을 새로운 차단된 2 ml 반응 튜브로 옮기고, 인간 C3b에 커플링된 아가로스 비드를 첨가하고, 혼합물은 회전기 상에서 실온에서 1 내지 2 시간 동안 배양하였다. 아가로스 비드를 탁상용 원심분리기에서 원심분리에 의해 (1000g, 1분) 수확하고, 상청액을 폐기하였다. 펠릿을 1 ml의 세척 용액에 부드럽게 재현탁시킴으로써 반복 세척하고, 세척 완충제 중에서 인큐베이션하고, 원심분리에 의해 수확하였다.
아가로스 비드로부터의 파지 용리는 10 mM 트리스/HCl (pH 8) 중 200 ㎕의 20 mM DTT를 각각의 튜브에 첨가하고 10 분 동안 인큐베이션하여 수행하였다. 비드를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 OD600nm 0.6 내지 0.8로 성장된 이. 콜라이 TG-1 배양물 14 ml에 첨가하였다. 파지 감염을 위해서, 상기 배양물을 50 mL 플라스틱 튜브에서 37℃에서 45분 동안 진탕시키지 않고 인큐베이션하였다. 4120 x g에서 5 분 동안 원심분리한 후, 박테리아 펠릿을 각각 800 ㎕의 2xYT 배지 중에 재현탁시키고, 3xYT-CG 아가 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 파지를 상기한 바와 같이 구조하고 증폭시켰다. 제2 및 제3 라운드의 선별을 제1 라운드의 선별과 동일한 방식으로 수행하였다.
아가로스 비드의 펠릿은 확인이 어렵고, 상청액에 용이하게 용해되었다. 따라서, 펠릿을 확인할 수 있도록 25 ㎕ 이상의 비드를 사용하기로 결정하였다. 이는 상이한 부피가 사용되었기 때문에 제1 라운드에서 모든 하위 풀에 대해 상이한 비교적 높은 항원 농도를 생성하였다. 제1 라운드의 하위 풀에서 C3b의 농도는 대략 다음과 같았다: 하위 풀 1820.1에서 189 nM, 하위 풀 1820.2에서 128 nM, 하위 풀 1820.3에서 257 nM, 하위 풀 1820.4에서 98 nM, 하위 풀 1820.5 및 1820.6에서 66 nM. 제2 선별 라운드에서 C3b 농도는 하위 풀 1820.1-3에서 112 nM이고, 하위 풀 1820.4-6에서 57 nM이었다. 제3 선별 라운드에서 C3b의 농도는 모든 하위 풀에서 57 nM이었다.
C3으로의 차단은 하위 풀 1820.4-6에 대한 제1 라운드에서 정제된 C3을 대략 475 nM의 최종 농도로 첨가함으로써 적용되었다.
차별적 펩티드 패닝
차별적 펩티드 패닝에 사용된 항원은 C3b 상에서 상이한 에피토프를 나태내는 펩티드이었다. 이러한 펩티드는 C3b와 C3 상의 표면 노출된 잔기를 비교하는 단백질 구조 분석에서 C3b-특이적인 것으로 확인되었었다. 두가지 상이한 담체 단백질, BSA와 트랜스페린에 대한 커플링은 상기 기재한 바와 같이 모르포시스에 의해 수행되었다. 담체 단백질에 결합하는 파지를 선별하지 않도록, 두가지 상이한 담체 단백질을 선별 라운드 동안에 교대시켜야 한다. 또한, 선별된 파지가 바르게 폴딩된 전장 C3b에 결합하는 것을 보장하기 위해, 펩티드에 대한 선별 라운드를 전장 C3b에 대한 선별 라운드와 교대시켰다.
펩티드 패닝에서 실제 패닝 절차는 맥시소르프 플레이트에 결합된 항원으로서 펩티드 커플링된 담체 단백질을 사용하는 고체 상 패닝이다. 맥시소르프 플레이트 (F96 Nunc- 이뮤노플레이트)의 적절한 수의 웰 (사전-차단된 파지의 부피에 따라)을 PBS 중 50 ㎍/mL의 농도에서 펩티드에 커플링된 담체 단백질 300 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 밤새 배양시켰다.
코팅된 웰을 400 ㎕ PBS로 2회 세척하고, 마이크로타이터 플레이트 진탕기 상에서 350 ㎕ PBS/5％ 분유로 실온에서 2 시간 동안 차단시켰다. 파지를 회전기 상에서 PBST/5％ 분유 및 최종 농도 0.5％ (v/v)의 커플링되지 않은 담체 단백질로 실온에서 2 시간 동안 차단시켰다. 차단 절차 이후, 코팅된 웰을 400 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 300 ㎕의 사전-차단된 파지를 각각의 코팅된 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 400 ㎕ PBST를 몇회 첨가함으로써 세척을 수행한 후, PBS로 몇회 세척하였다 (상세한 내용에 대해서는 표 8 및 10 참조).
플레이트로부터 파지의 용리를 10 mM 트리스/HCl (pH 8) 중 300 ㎕/웰의 20 mM DTT를 이용하여 10 분 동안 수행하였다. DTT 파지 용리물을 37℃에서 2YT 배지에서 OD600 0.6-0.8로 성장시킨 14 mL의 이. 콜라이 TG1에 첨가하고, 파지 감염을 위해 진탕시키지 않고 50 ml 플라스틱 튜브에서 37℃에서 45 분 동안 인큐베이션하였다. 4120 x g에서 5 분 동안 원심분리한 후, 박테리아 펠릿을 각각 600 ㎕ 2xYT 배지에 재현탁시키고, 3xYT-CG 아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 파지를 본원에 기재된 바와 같이 구조하고 증폭시켰다.
패닝 1849의 경우, 제1 및 제3 선별 라운드는 상기 기재된 바와 같이 수행된 펩티드 패닝이었다. 제2 라운드는 본원에 기재된 바와 같이 아가로스 비드에 결합된 C3b에 대한 선별이었으나, 약간의 변형이 있었다: 파지 사전-흡착을 위해 사용된 아가로스 비드 상의 결합 부위를 시스테인 대신에 분유를 사용하여 차단시켰고, 또한 파지를 상기 기재된 바와 같이 PBST/5％ 분유로 차단시켰다. 패닝 1883의 경우, 제1 및 제3 선별 라운드는 본원에 기재된 바와 같이 수행된 비오티닐화 C3b를 사용하는 용액 패닝이었다. 제2 라운드는 상기 (이 섹션) 기재된 바와 같은 펩티드 패닝이었다.
패닝 결과
3회 라운드의 패능 이후 선별된 클론을 발현 벡터에 서브클로닝한 다음, C3b 또는 선별에 사용된 펩티드로의 결합에 대해 스크리닝하였다. 백그라운드 수준에 비해 2배 이상의 결합 신호를 나타내는 클론은 주요 히트로서 고려된다.
제1 용액 패닝 1812의 결과물을 531개의 주요 히트를 생성하는 뉴트라비딘 플레이트 상에서 비오티닐화 C3b로의 결합에 대해 스크리닝하였다. C3b-스크린과 동시에 수행된 비오티닐화 C3에 대한 스크리닝에 의해 78개의 클론이 확인되었고, 이는 C3에 비해 C3b에 대해 더 강한 신호를 나타내었다. 78개의 클론의 서열 분석은 27개의 독특한 서열을 나타내었고, 이 중 19개를 통합시켜 정제할 수 있었다. 이들 클론 중 소량만이 포획 ELISA에서 시노 C3b와 교차 반응성을 나타내었다. 시노 교차 반응성 C3bneo 항체는 본 발명의 항체의 바람직한 특성인 것으로 확인되었고, C3bneo 결합제는 구체적으로 시노 교차 반응성을 위해 선택되었다. 시노 C3b 단백질을 시노 원숭이 혈장으로부터 정제하고, 스크린 과정 동안에 순수한 시노 C3b 단백질을 인간 C3b와 함께 항원으로서 사용하였다. 시노 원숭이는 우수한 비-인간 영장류 안전성/독성 종이었다. 시노에 대한 C3bneo 항체의 효능 및 친화도는 인간의 5-10배 이내인 것이 바람직하였다. 이 기준은 시노에서 C3b 농도의 현저한 억제를 달성하기 위해 선택되었고, 따라서 C3b 농도의 현저한 억제에 의해 초래되는 잠재적인 독성을 평가할 수 있게 한다. 스크리닝 상에서, 여러 클론은 시노 교차 반응성이 약하거나 없어서 폐기되어야 하였다. 더 많은 시노 교차 반응성 클론을 확인하기 위해, 패닝 1812의 재스크리닝을 수행하였다. 재스크린 178의 경우, 뉴트라비딘 플레이트 상에서 C3b에 대해 유의한 결합을 나타내며 (백그라운드에 비해 5배 이상) 사전에 서열분석되지 않은 클론을 선택하였다. 178개 중에서 38개는 시노 C3b에 대한 결합을 나타내었고, 이들을 C3 카운터-스크린에 추가로 적용하였다. 38개의 클론 중에서 10개가 상기 카운터-스크린을 통과하였으며, 1개의 새로운 독특한 클론이 생성되었고, 이를 정제하였다.
술프히드릴-플레이트를 사용하는 ELISA를 이용하여 비드 기반 패닝 1820의 스크리닝을 수행하였다. 79개의 주요 히트 중에서 49개가 C3에 비해 C3b에 대해 더 강한 신호를 나타내었다. 이들은 서열분석하여 13개의 독특한 서열이 생성되었으며, 이 중 7개를 통합하여 정제하였다.
차별적 펩티드 패닝 1849로부터 유래된 미세 발현된 Fab를 각각의 선별에 사용된 펩티드에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 펩티드에 커플링된 담체 단백질을 ELISA에서 직접 코팅된 항원으로서 사용하였다. 2944개 중에서 566개의 주요 히트를 확인하였지만, 22개의 주요 히트만이 백그라운드에 비해 5배 이상의 신호를 나타내었다. 이들 22개의 클론 및 32개의 추가의 클론 (백그라운드에 비해 5배에 가까운 신호를 나타냄)을 전장 C3b에 대한 결합에 대해 체크하기 위해 추가로 스크리닝하였다. 54개의 클론 중에서 어느 것도 전장 C3b에 결합하지 않았다.
이전의 차별적 펩티드 패닝과는 대조적으로, 전장 C3b에 대한 2회 선별 라운드 및 펩티드에 대한 1회 라운드만을 차별적 펩티드 패닝 1883에서 수행하였다. 패닝 1883의 결과물을 포획 ELISA에서 C3b에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 4416개의 클론의 스크리닝은 497개의 주요 히트를 생성하였다. 백그라운드에 비해 5배 이상의 결합 신호를 나타내는 275개의 주요 히트를 카운터 스크린에 추가로 적용하였다. 카운터 스크린을 통과한 183개의 클론을 서열분석하여 9개의 독특한 클론이 생성되었다. 상기 독특한 클론 중 7개를 통합할 수 있었으며, 이를 정제하였다.
제2 용액 패닝 1889의 결과물을 포획 ELISA에서 C3b에 대한 결합에 대해 스크리닝하여, 4416개 중에서 2878개의 주요 히트가 생성되었다. 대부분의 주요 히트 (2469/2878)는 백그라운드에 비해 5배 이상의 결합 신호를 나타내었다. 상이한 패닝 하위 풀로부터 유래되고 상이한 신호 강도를 갖는 396개의 대표적인 클론을 카운터-스크린에 추가로 적용하기로 결정하였다. 396개의 클론 중에서 158개가 카운터-스크린을 통과하였고, 이를 서열분석하여, 14개의 독특한 서열 및 최종적으로 11개의 정제된 Fab가 생성되었다. 임의의 관심 클론을 놓치지 않기 위해, 카운터 스크린을 거치지 않았으며 C3b에 대한 백그라운드에 비해 5배의 결합 신호를 갖는 나머지 클론 (2073/2469)을 시노 C3b에 대한 결합에 대해 시험하였다. 생성된 129개 시노 교차 반응성 클론을 C3b 대 C3 특이성에 대해 스크리닝하였다. 25개의 클론이 C3 결합에 비해 C3b 친화도를 나타내었고, 최종적으로 4개의 새로운 서열이 생성되었다. 4개의 클론 중에서 3개를 통합하여 정제할 수 있었다.
에피토프 비닝
정제된 Fab를 키트 (ECL 단백질 비오티닐화 모듈, GE)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 비오티닐화시켰다. 비오티닐화 Fab를 제바 탈염 스핀 칼럼 (피어스)에 대해 작동시킴으로써 결합되지 않은 비오틴으로부터 세정하였다. 비오티닐화 Fab의 인간 C3b에 대한 결합 활성을 포획 ELISA (본원에 기재됨)에서 그의 비-비오티닐화 조상과 직접 비교하여 시험하였다. 결합 활성이 비오티닐화에 의해 영향을 받지 않은 Fab만을 이후 사용하였다.
에피토프 비닝을 경쟁 ELISA에 의해 수행하였다. 사용된 포획 항체는 C3b의 하위 도메인인 C3d 단백질 토끼 폴리클로날 항-인간 C3d Ab (아브캄(Abcam))를 지정하는 항체이었다. 맥시소르프 플레이트의 웰을 PBS 중에서 2 ㎍/mL로 희석된 포획 항체로 충전하였다. 플레이트를 밀봉하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.
다음 날, 플레이트 상에서 남아있는 결합 부위를 PBST/5％ 분유의 첨가에 의해 차단시켰다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST로 2회 세척하였다. C3b를 PBST/0.5％ 분유로 희석된 2.5 ㎍/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST로 2회 세척하였다.
동시에, 최종 농도 2.5 ㎍/mL의 C3b, 비오티닐화 Fab 및 비-비오티닐화 Fab (비오티닐화 Fab에 비해 100배 몰 과량) (모두 PBS로 희석됨)를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST로 2회 세척하였다.
비오티닐화 Fab의 검출을 위해, AP-접합된 스트렙타비딘 (지메드(Zymed))을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, TBST로 5회 세척하였다. 형광 기질 AttoPhos를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 테칸 제니오스 프로(Tecan GENios Pro) 플레이트 판독기에서 형광을 측정하였다.
에피토프 비닝을 상기 기재된 바와 같이 경쟁 ELISA에 의해 수행하였다. 비오티닐화 Fab 및 비-비오티닐화 Fab (100배 과량)의 혼합물을 인간 C3b에 첨가하였다. 비오틴 표지를 검출하였다. 음성 대조군 Fab MOR03207에 대해 수득된 신호를 100％ 값으로 설정하였다. 상기 100％ 신호와 비교하여 억제율을 분류하였다.
6가지 에피토프 군이 확인되었다 (하기 표에 요약됨). 군 B 및 C 및 또한 군 D 및 E는 부분적으로 중복되는 에피토프를 공유하였다.
<표 2>
Figure pct00028
실시예 3. 친화도 성숙 및 최적화
친화도 성숙 라이브러리의 생성
선택된 항체 단편의 친화도 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해, L-CDR3 및 H-CDR2 영역을 트리뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발을 이용하는 카세트 돌연변이유발 (문헌 [Virnekas et al., 1994])로 대등하게 최적화하면서 프레임워크 영역은 변하지 않게 유지하였다. 친화도 성숙을 위한 클로닝 전에, 모든 모 Fab 단편을 상응하는 발현 벡터 (pMORPH®X9_FH)로부터 시스디스플레이™ 벡터 pMORPH®25_LHC로 XbaI/EcoRI를 통해 이동시켰다. pMORPH®25_LHC는 HuCAL 골드® 디스플레이 벡터 pMORPH®23_LHC로부터 H-CDR2 최적화를 위한 라이브러리 클로닝을 방해하는 1개의 BssHII 부위의 제거에 의해 생성되었다.
모 Fab의 L-CDR3을 최적화하기 위해, 경쇄 (405 bp)의 L-CDR3, 프레임워크 4 및 불변 영역을 BpiI/SphI로 제거하고, 프레임워크 4 및 불변 도메인과 함께 다양화된 L-CDR3의 레퍼토리로 대체하였다. 대략 1.5 ㎍의 Fab 벡터 단편을 다양화된 L-CDR3을 보유하는 3배 내지 5배 몰 과량의 삽입 단편과 라이게이션시켰다. 제2 라이브러리 세트에서는, H-CDR2 (XhoI/BssHII)를 다양화하면서 연결 프레임워크 영역은 변하지 않게 유지시켰다. 클로닝 효율을 모니터링하기 위해, 모 H-CDR2를 다양화된 H-CDR2 카세트의 클로닝 이전에 가공물(dummy)로 대체하였다.
라이브러리의 라이게이션 혼합물을 108 내지 109개의 독립적인 콜로니를 생성하는 4 ml의 이. 콜라이 TOP10F 세포 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 전기천공시켰다. 이 라이브러리 크기는 이론적인 다양성의 범위를 보장하였다. 라이브러리의 증폭을 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 품질 관리를 위해, 단일 클론을 무작위로 골라서 서열분석하였다.
친화도 성숙 패닝을 위한 파지의 제조
HuCAL® 성숙 라이브러리를 34 ㎍/mL 클로람페니콜 및 1％ 글루코스를 함유하는 2xYT 배지 (2xYT-CG) 중에서 증폭시켰다. OD600nm 0.5 (진탕시키지 않고 37℃에서 30분, 250 rpm에서 진탕하에 37℃에서 30분)에서 VCSM13 헬퍼 파지로 감염시킨 후, 세포를 수확하고 (4120 x g, 5분, 4℃), 2xYT/34 ㎍/mL 클로람페니콜 /50 ㎍/mL 카나마이신/0.25 mM IPTG 중에 재현탁시켜 22℃에서 밤새 성장시켰다. 상기 상청액으로부터 파지를 2회 PEG-침전시켜 PBS 중에 재현탁하고, 하기하는 성숙 패닝에 사용하였다.
(a) 성숙 패닝
성숙에 이용된 선별 절차는 상기 기재된 용액 패닝이었다. 패닝 엄격도를 증가시키고 개선된 오프-레이트에 대해 선별하기 위해, 항원 농도를 감소시키고, 연장된 세척 조건 (24 시간 이하)을 적용하였다. 밤새 세척 단계는 4℃에서 수행하였고, 다른 모든 세척 단계는 실온에서 수행하였다.
친화도 성숙을 위한 후보의 선택
1차 패닝으로부터 유래된 Fab를 다양한 검정으로 특성화하였다. 이들을 하기 기준에 따라 분류하여 잠재적인 성숙 후보로서 군집화하였다:
ㆍ C3에 대한 결합과 비교한 C3b에 대한 결합의 선택성
ㆍ 용혈 검정에서 효능
ㆍ C3b 및 MAC 침착 검정에서의 효능
ㆍ 작용 방식
ㆍ 에피토프 빈
ㆍ 친화도
8개의 1차 항체가 성숙되었으며, 따라서 이후 "모" 항체라고 불린다.
모 항체 MOR08035, 8598 및 8599는 1차 패닝 이후에 발견된 Fab 중 가장 큰 군에 속하였다. 이들은 에피토프 빈 D의 구성원이며, 기능적 검정에서 활성을 나타내고, C3- 및 C5-전환효소를 억제한다. 인자 B와 C3b의 결합은 이들 항체에 의해 강력하게 억제되고, 인자 H와의 결합은 덜 확장되었다.
모 항체 MOR08552는 약간 상이한 에피토프 (빈 C)를 갖는 것을 제외하고는 동일한 특성을 나타내었다.
MOR08672 및 MOR08675 둘 다 에피토프 빈 D에 속하였다. 이들은 인자 H의 결합을 상당히 잘 억제하지만, 다른 인자의 결합은 약하게만 억제하였다. 이들은 상기 항체와는 상이한 메카니즘을 통해 작용할 수 있다. 또한, 다른 인자에 의한 경쟁의 결여는 동일한 효능에서 저친화도를 달성하게 한다. 이러한 논의는 특히 합리적인 효능을 나타내지만 C3b에 대한 친화도는 매우 낮은 MOR08675에 적용될 수 있다.
MOR08555는 에피토프 군 C의 구성원이며, MOR08305-군과 유사한 특징을 나타내지만, C5-전환효소를 억제하지 않았다.
MOR08653은 에피토프 빈 B에 속하며, 부분적으로 빈 C와 중복되었다. 기능적 검정에서 그의 존재는 시험된 모든 메카니즘의 억제를 나타내었다: 인자 P, 인자 B 및 인자 H의 결합, C3b-이량체 형성의 억제, 및 C3- 및 C5-전환효소의 억제.
패닝 풀의 조성에서의 유연성을 유지하기 위해, 각각의 모체로부터의 성숙 라이브러리를 별도로 구축하였다. 이후, 풀들을 모았다. 각각의 모 항체의 경우, 표적 KD 값을 그 항체에 의해 발휘되는 주요 억제 메카니즘에 따라 정의하였다. MOR08598 및 MOR08653 및 또한 MOR08555 및 MOR08599를 각각 2개의 풀로 모았다. 각각의 풀 내에서, 항체는 항원과 유사한 친화도를 나타내고, 잘 발현되고, 동일한 표적 KD를 가지며, 중복되는 에피토프를 공유하였다.
친화도 성숙을 위한 라이브러리
친화도 성숙은 LCDR3 및 HCDR2 카세트의 평행 교환에 의해 수행하였다. CDR 서열을 트리뉴클레오티드-지정된 카세트 돌연변이유발에 의해 최적화시켰다. 발현 벡터 pMORPH®x9_Fab_MH로부터의 Fab 단편을 파지미드 벡터 pMORPH®25에 클로닝시켰다.
16개의 상이한 친화도 성숙 라이브러리 (각각의 모 항체로부터 1개의 LCDR3 및 1개의 HCDR3 라이브러리)를 표준 클로닝 절차에 의해 및 다양화된 클론의 전기-전능 이. 콜라이 TOP10F' 세포 (인비트로젠)로의 형질전환에 의해 생성하였다. 라이브러리 크기는 5 x 108 - 4 x 109의 범위로 양호하였다. 무작위로 고른 클론의 서열분석은 100％ 다양성을 나타내었다. 고른 클론 중에서 모 결합제는 발견되지 않았다. 최종적으로, 16개의 모든 라이브러리의 파지를 별도로 제조하였다.
친화도 성숙을 위한 패닝 전략
HCDR2 및 LCDR3 라이브러리를 선별 동안에 별도로 유지하였다. 8개의 모체 중에서 4개를 대표로 처리하였고, 다른 4개의 모체는 각각 2개의 풀에 정렬시켰다. 생성된 친화도 성숙 라이브러리로부터 구조된 약 1012개의 파지를 성숙 패닝에 적용하였다.
각각의 파지 풀을 사용하는 용액 패닝을 인간 및 시노 C3b 사이에서 교대하면서 비오티닐화 항원을 사용하여 수행하였다. 패닝 엄격도를 증가시키고 개선된 오프-레이트에 대해 선별하기 위해, 항원 농도를 감소시키고, 연장된 세척 조건 (24 시간 이하)을 적용하였다. 패닝 및 세척 조건은 상기에 요약되어 있다. 성숙 패닝 이후, 풍부한 파지미드 풀을 pMORPH®x9_MH 발현 벡터로 서브클로닝하였다.
친화도 스크리닝 및 성숙 패닝 결과
모든 패닝으로부터 유래된 총 2464개의 클론을 인간 C3b에 대한 개선된 친화도를 위해 박테리아 용해물로서 스크리닝하였다. 예비 친화도를 용액 평형 적정 (SET)에 의해 추정하였다. 그들의 모 클론에 비해 친화도가 승인된 것으로 추정되는 클론은 주요 히트로 고려되었다.
주요 히트는 각각의 패닝 하위 풀로부터 수득하였고, 8305-LCDR3 라이브러리를 제외한 모든 주요 히트를 서열분석하였고, 여기서 65개의 주요 히트 중에서 최상의 17개를 서열분석하였다. 서열분석한 261 주요 히트 중에서 총 173개의 독특한 서열이 확인되었다. MOR08598을 제외하고 모든 모 Fab로부터의 유도체가 확인될 수 있었다. HCDR2-성숙 유도체는 모 MOR08552 및 MOR08599로부터 확인되지 않았다.
단백질 정제를 위해 친화도 최적화된 Fab의 선별
독특한 주요 히트를 마이크로웰 배양 플레이트로 골라서, Fab의 미세발현을 위해 사용하였다. Fab 용해물을 포획 ELISA에서 인간 C3b, 시노 C3b에 대한 결합에 대한 2차 스크리닝 시험, 포획 ELISA에서 카운터 표적 C3d 및 C5에 대한 교차 활성화의 체크, 및 카운터스크리닝의 수행을 위해 사용하였다. 스크린을 통과한 클론을 이후 사용하였다. 이는 각각의 모체로부터의 대략 12개의 유도체를 대규모로 발현시키고 정제하기 위해서였다. 12개 초과의 유도체가 2차 스크리닝을 통과한 경우, 단백질 정제에 대한 선별은 서열 변동성을 기준으로 하였다. 하기 문단은 각각의 패닝 하위 풀에 대한 선별 과정을 상세하게 기재한다.
모 MOR08305로부터, HCDR2에서 성숙된 23개의 독특한 클론 및 LCDR3에서 성숙된 11개의 클론을 확인하였다. 23개 중에서 21개의 HCDR2-성숙 클론이 카운터-스크린을 통과하였고, 21개 중에서 18개는 인간 C3b에 잘 결합하였다. 그러나, 18개의 클론 중에서 1개만이 시노 C3b에 양호하게 결합하였다. 이 클론 (MOR09124)을 대규모 정제를 위해 선택하였다. 추가 5개의 클론을 서열 변동성에 따라 대규모 정제를 위해 선택하였다. MOR09122의 경우에는 정제를 수행하지 않았다. 11개 중에서 3개의 LCDR3-성숙 클론은 카운터-스크린을 통과하지 않았지만, 3개 중에서 2개는 대규모 정제에 포함시켰고 (MOR09130 및 9131), 이는 인간 C3b에 대한 그들의 높은 결합 신호가 저친화도를 암시하였고, 혈청에 대한 잔여 결합을 유도할 것이기 때문이었다. MOR09132에 대해서는 정제를 수행하지 않았다.
모 8552로부터, 16개의 LCDR3-성숙 유도체가 확인되었다. 16개의 유도체 중에서 7개를 상기 기재된 것과 유사한 기준에 따라 대규모 정제를 위해 선택하였다. 그러나, 이들 모두에 대해 정제가 실패하였다. 따라서, 나머지 9개 모두의 유도체를 대규모 정제를 위해 사용하였다. 정제는 9개 중에서 2개에 대해서만 수행하였다 (MOR09308 및 9313).
모 MOR08555로부터, HCDR2에서 성숙된 1개의 독특한 클론 및 LCDR3에서 성숙된 3개의 클론이 확인되었다. 총 4개의 유도체만이 있었기 때문에, 2차 스크리닝에서 그들의 거동과는 무관하게 이들 모두를 정제하기로 결정하였다.
모 MOR08599로부터, LCDR3에서 성숙된 25개의 독특한 클론이 확인되었다. 이들 대부분은 2차 스크리닝 동안에 수행된 모든 시험에서 잘 수행되었다. 대규모 정제를 위한 클론의 선별은 서열 변동성을 기준으로 하였다.
모 MOR08653으로부터, HCDR2에서 성숙된 25개의 독특한 클론 및 LCDR3에서 성숙된 10개의 독특한 클론이 확인되었다. 각각의 하위 집합 중 1개만이 카운터-스크린에서 잘 수행되었다. 이들 클론 (MOR09198 및 9202)을 이후 사용하였다. 다른 클론의 선별은 서열 변동성을 기준으로 하였다.
모 MOR08672로부터, HCDR2에서 성숙된 5개의 독특한 클론 및 LCDR3에서 성숙된 29개의 독특한 클론이 확인되었다. 5개 중에서 1개의 HCDR2-성숙 클론만이 카운터-스크린을 통과하고, 이후 사용되었다 (MOR09139). 추가 2개의 HCDR2-성숙 클론이 선별되었다. 정제는 MOR09137에 대해서만 수행되었다. 대부분의 LCDR3-성숙 클론이 2차 스크리닝에서 잘 수행되었다. 이들 클론의 선별은 서열 변동성을 기준으로 하였다.
모 MOR08675로부터, HCDR2에서 성숙된 7개의 독특한 클론 및 LCDR3에서 성숙된 17개의 독특한 클론이 확인되었다. 7개 중에서 1개의 HCDR2-성숙 클론만이 인간 및 시노 C3b에 결합하였고, 이들은 제외되었다. 나머지 6개의 클론 중에서 3개만이 잠재적인 글리코실화 부위를 함유하지 않았고, 이들을 대규모 정제에 사용하였다. 잠재적인 글리코실화 부위를 함유하는 추가 2개의 클론이 선별에 포함되었다. 대부분의 LCDR3-성숙 클론은 2차 스크리닝에서 잘 수행되었다. 이들 클론의 선별은 서열 변동성을 기준으로 하였다.
추가로 사용되는 친화도 최적화된 Fab의 선별
도시되지 않은 친화도 최적화된 Fab의 특성화 (예를 들어, 결합 친화도, 용혈의 억제, C3b 침착의 억제)와 관련된 데이터를 비롯하여, 이전 선별에 제시된 모든 가능한 데이터를 검토한 후, 최상의 Fab를 추가로 사용하기 위해 선별하였다. 상기 선별은 22개의 성숙 Fab로 이루어지며, 이들은 4개의 상이한 모 항체로부터 유래되었다. 표 5는 선별된 Fab의 특성을 요약한다.
<표 5>
Figure pct00029
최적화된 Fab의 IgG 전환 및 IgG 수준에서의 교차-클로닝
8개 모두의 모 Fab, 몇몇 성숙 Fab, 및 원하는 프로파일을 갖는 몇몇 성숙 변형 (잠재적인 글리코실화 부위가 제거된) Fab를 인간 IgG 포맷에 서브클로닝하였다.
IgG 수준에서의 교차-클로닝은 경쇄 및 중쇄 구축물의 조합물로 세포를 형질감염시킴으로써 달성되었다. MOR09124는 확인된 유일한 HCDR2 성숙 클론이기 때문에, 교차-클로닝은 각각의 패밀리 (MOR08305-유도체)에 대해서만 가능하였고, MOR09124의 중쇄를 다른 성숙 패밀리 구성원의 경쇄와 합하였다. 교차-클론은 신규한 MOR 번호를 제공하였고, 이들을 표 8에 요약하였다.
<표 8>
Figure pct00030
상기 친화도 성숙 Fab, 변형 Fab (글리코실화 부위가 제거됨), 및 교차-클로닝된 Fab 중에서, Fab 9124, 9397, 9398, 9136, 9141, 9373 및 9423의 결합 특성을 본원에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 표 9는 결합 친화도, 기능적 효능, 및 이들 Fab에 대한 보체 인자 결합의 억제를 요약한다.
<표 9>
Figure pct00031
표 8에 요약된 Fab의 결합 친화도 및 기능적 특성을 측정하는데 이용되는 방법이 하기에 상세하게 기재된다. 표 8에서의 데이터로부터 확인될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 Fab 단편은 100 pM 이하 및 여러 경우 10 pM 이하의 친화도로 인간 및 시노몰구스 C3b 둘 다에 결합할 수 있다. 또한, Fab 단편은 100 nM 이하 및 여러 경우 50 nM 이하의 IC50으로 인간 및 시노몰구스 C3b 둘 다에 대한 기능적 효능을 입증한다.
실시예 4. IgG 포맷 C3b 결합제의 생성 및 특성화
IgG의 배선화
배선화된 서열을 매치하고, 포유동물 세포에서의 발현에 적합하지 않은 코돈을 피하고, 애매한 스플라이스 부위를 피하기 위해, 경쇄 및 중쇄의 이뮤노글로불린 가변 영역을 코딩하는 pM2 발현 벡터에서의 영역을 제니어트(Geneart, 제니어트 아게(Geneart AG), 독일 레겐스부르크)에 의해 배선화하고 최적화시켰다. 말단 Q는 피로글루타민을 형성할 수 있기 때문에, 모든 중쇄의 N-말단 QVQ를 EVQ로 변경시켰다. 각각의 모 패밀리로부터의 항체를 배선화/최적화를 위해 선택하였다. 간략히, 항체를 하기와 같이 IgG 포맷으로 배선화하고 발현시켰다.
IgG로의 전환
전장 이뮤노글로불린을 발현시키기 위해, Fab 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 Fab 발현 벡터로부터 IgG1 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 제한 효소 MfeI 및 BlpI를 사용하여 VH 도메인 단편을 pMORPH®2_h_IgG1AA (위치 234 및 235의 류신이 알라닌으로 돌연변이되어 FcRγ 결합을 없애고 이펙터 기능을 감쇠시킴)로 서브클로닝하였다. VL 도메인 단편을 pMORPH®2_h_Igκ로 서브클로닝하는 것은 EcoRV 및 BsiWI 부위를 통해 수행하였고, pMORPH®2_h_Igλ2로의 서브클로닝은 EcoRV 및 HpaI를 사용하여 수행하였다.
인간 IgG의 일시적 발현 및 정제
진핵 HKB11 및 HEK293 세포를 1:1 비의 IgG 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포 배양 상청액을 형질감염 후 제3일 또는 제7일에 수확하고, 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맵셀렉트 슈어(MabSelect SURE), 지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에 적용하였다. 달리 언급하지 않는다면, 1x 둘베코 PBS (pH 7.2, 인비트로젠)로의 완충제 교환을 수행하였고, 샘플은 멸균 여과 (0.2 ㎛)된 것이었다. IgG의 순도를 SDS-PAGE로 변성된 환원 및 비-환원 조건 하에 분석하거나, 또는 애질런트(Agilent) 바이오애널라이저(BioAnalyzer)를 사용하고 HP-SEC에 의해 천연 상태로 분석하였다.
배선화 항체에는 표 10에 나타난 바와 같이 새로운 MOR 번호가 제공되었다.
<표 10>
Figure pct00032
이들 중에서 배선화 항체 9556, 9611, 9612, 9609, 9610, 9674 및 9675를 추가로 특성화하였다.
친화도 측정
C3bneo 항체는 C3b 분자 상의 네오에피토프에 결합함으로써 보체 활성화를 차단하였다. C3b 상의 네오에피토프는 또한 혈장 중의 다른 풍부한 보체 단백질, 예를 들어 인자 H, 인자 B, 및 인자 P에 대한 결합 부위이며, 이는 대체 경로를 통해 보체 활성화를 조절한다. 따라서, C3b에 결합하는 이들 보체 단백질을 차단함으로써 보체 활성화를 효과적으로 차단하기 위해 이들 풍부한 보체 단백질과 경쟁하도록 C3bneo 항체는 고친화도를 가져야 한다. 고친화도는 낮은 치료 용량을 달성하기 위해 필요하다. 예를 들어, 혈장 중 인자 H의 농도는 대략 3 μM이고, 인자 H의 C3b에 대한 결합 친화도 (Kd)는 대략 30 nM이며; 인자 H 농도는 그의 Kd에 비해 100배 더 높다. C3bneo 항체가 C3b와의 결합을 위해 인자 H와 경쟁하는 경우, 이는 인자 H가 C3b에 결합하는 것을 50％ 억제하기 위해 1 nM 농도의 10 pM Kd C3bneo 항체 (그의 Kd보다 100배 높은 항체 농도)를 필요로 할 것이다. 따라서, 10 pM Kd 이하의 C3bneo 항체는 적절한 치료 항체 용량에 의해 대채 경로 보체 활성화의 효과적인 차단을 달성할 것이다. 따라서, 본 발명의 항체 분자는 65 pM 이하, 바람직하게는 10 pM 이하의 범위의 높은 결합 친화도를 갖도록 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 분자는 C3b에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 pM 이하의 결합 친화도 (즉, 2 pM 미만의 높은 친화도)를 갖도록 선택된다.
C3b 결합에 대한 배선화 IgG 항체의 친화도는 하기와 같이 비아코어 및 용액 평형 적정 (SET)에 의해 측정하였다.
비아코어 측정
비아코어 역학 실험은 25℃에서 CM5 센서 칩 (지이 헬쓰케어, BR-1005-30)을 사용하는 비아코어 T100 (지이 헬쓰케어)에 의해 수행하였다. 유동 완충제는 HBS-EP(+) (지이 헬쓰케어, BR-1001-88)이었다. 간략하게, 하기 단계는 결합 친화도를 측정하기 위해 수행되었다.
ㆍ 항-C3d IgG 고정된 센서 칩의 제조: 토끼 항-C3d 폴리클로날 항체 (아브캄, ab-15981) (아세테이트 (pH 5.0) 커플링 완충제 중 50 ㎍/mL (지이 헬쓰케어, BR-1003-51))를 공급자의 지시에 따라 (지이 헬쓰케어, BR-1000-50) 아미노-커플링 절차를 이용하여 CM5 칩 상에서 10 ㎕/분 유속으로 600 초 동안 2가지 상이한 유세포 (Fc1 및 2)에 커플링시켰다. 최종 고정 수준은 >7000RU일 것이다.
ㆍ 제2 유세포 상에서 C3b 포획: 유동 완충제 중 1 ㎍/mL의 C3b를 제2 유세포 (Fc2)에 대해 10 ㎕/분으로 주사하여, Fab의 경우 대략 70RU 또는 IgG 역학 분석의 경우 대략 20RU의 포획 수준에 도달하였다.
ㆍ 두 유세포 상에서 상이한 농도로 항-C3b Fab 또는 IgG의 주사: 두 유세포 (Fc1 및 2)에 대한 항-C3b 용액 (유동 완충제 중 0.3125 nM 내지 10 nM; 1:2 계열 희석)을 60 ㎕/분으로 240 초 동안 주사하였다.
ㆍ 해리: 두 유세포 상에서 HBS-EP(+) 유동 완충제를 60 ㎕/분으로 주사하여, C3b와 항-C3b Fab/IgG 사이의 해리를 모니터링하였다. 해리 시간은 5 nM 및 2.5 M Fab/IgG 농도의 경우 2400 초, 및 또 다른 5 nM Fab/IgG 농도를 비롯한 다른 모든 농도의 경우 300 초로 설정하였다.
ㆍ 재생: 두 유세포에 대해 각각의 주기의 마지막에 글리신-HCl pH 1.6 (글리신-HCl pH 1.5 및 글리신 pH 2.0으로부터 제조됨, 지이 헬쓰케어) + 0.05％ P20 계면활성제 (지이 헬쓰케어, BR-1000-54)에 의해 60 ㎕/분의 유속으로 40 초 동안 2회 재생을 수행하였다.
ㆍ 역학 분석: 역학 속도 상수는 비아이벨류에이션(BIAevaluation) 1.1 소프트웨어를 이용하여 1:1 결합 모델을 적용하여 수득되었고, 여기서 Rmax 값은 국소적으로 대입되었다.
비아코어 결합 역학 측정의 결과를 하기 표 11에 요약하였다. 도시된 바와 같이, 본원에 기재된 항체가 전형적으로 10 pM 이하 및 여러 경우 5 pM 이하의 KD 값으로 인간 C3b에 대해 높은 결합 친화도를 나타내었다. 이들 항체는 또한 시노 C3b (200 pM 미만의 결합 친화도)에 대해 매우 높은 친화도를 나타낸다.
<표 11>
Figure pct00033
SET 측정
용액 평형 적정 (SET)에 의한 KD 측정을 위해, 항체 단백질의 단량체 분획 (90％ 이상의 단량체 함량, 분석용 SEC로 분석함; 각각 Fab의 경우 슈퍼덱스75(Superdex75, 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)), 또는 IgG의 경우 토소(Tosoh) G3000SWXL (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))을 사용하였다.
용액 중 친화도 측정은 기본적으로 문헌 [Friguet et al., 305-19]에 기재된 바와 같이 수행하였다. SET 방법의 감도 및 정확도를 개선하기 위해, 고전적 ELISA에서 ECL 기반 기술로 바꾸었다 (문헌 [Haenel et al., 2005]).
1 mg/mL 염소-항-인간 (Fab)2 단편 특이적 항체 (디아노바)를 MSD 술포-태그™ NHS-에스테르 (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 미국 메릴랜드주 개이터스버그)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 표지하였다.
실험은 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트에서 검정 완충제로서 0.5％ BSA 및 0.02％ 트윈 20을 함유하는 PBS (pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 표지되지 않은 인간 C3b 또는 시노 C3b를 예상된 KD보다 적어도 10배 더 높은 농도로 출발하여 2n 계열로 희석하였다. 항원이 없는 웰을 사용하여 Bmax 값을 결정하였고, 검정 완충제를 갖는 웰을 사용하여 백그라운드를 결정하였다. 예를 들어, 10 pM Fab (최종 부피 60 ㎕ 중의 최종 농도)의 첨가 후에, 혼합물을 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 적용된 Fab 농도는 예상된 KD와 유사하거나 그보다 낮은 값이었다.
표준 MSD 플레이트를 PBS (30 ㎕/웰) 중 0.05 ㎍/mL 인간 C3b로 밤새 코팅하고, PBS 중 3％ BSA로 1 시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 검정 완충제로 세척한 후, 평형화된 샘플을 이들 플레이트로 옮기고 (30 ㎕/웰), 20 분 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 30 ㎕/웰의 MSD-술포-태그 표지된 검출 항체 (염소 항-인간 (Fab)2)를 1:1500의 최종 희석으로 MSD 플레이트에 첨가하고, 에펜도르프 진탕기 상에서 (700 rpm) 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 세척하고, 30 ㎕/웰의 MSD 판독 완충제 T를 계면활성제와 함께 첨가한 후, 전기화학발광 신호를 섹터 이미저(Sector Imager) 6000 (메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 개이터스버그)로 검출하였다.
데이터를 맞춤형 핏팅 모델을 적용시킨 XLfit (IDBS) 소프트웨어로 평가하였다. Fab 분자의 KD 측정을 위해, 하기 대입 모델을 사용하였다 (문헌 [Haenel et al., 2005]에 따라, [Abraham et al., 1996]에 따라 변형):
[Fab]t: 적용된 총 Fab 농도
x: 적용된 총 가용성 항원 농도 (결합 부위)
Bmax: 항원의 부재시에 Fab의 최대 신호
KD: 친화도
원칙적으로, 하기 차이점을 제외하고는 동일한 프로토콜을 적용하여 IgG 분자의 KD 값을 측정하였다: Fab 분자 대신에 전체 IgG 분자를 계열 희석된 항원에 첨가하고, 실온에서 밤새 평형화시켰다. 후속적으로, 샘플을 상기 기재된 바와 같이 처리하였다.
데이터 평가, 즉 IgG 분자의 KD 측정을 위해, IgG에 대한 하기 대입 모델을 사용하였다 (문헌 [Piehler et al., 1997]에 따라 변형):
Figure pct00035
[IgG]: 적용된 총 IgG 농도
x: 적용된 총 가용성 항원 농도 (결합 부위)
Bmax: 항원의 부재시에 IgG의 최대 신호
KD: 친화도
구체적으로 도시되진 않았지만, SET 데이터는 본원에 기재된 항체가 10 pM 이하 및 여러 경우 5 pM 이하의 범위에서 결합 친화도를 갖는 인간 C3b에 대한 고친화도 결합제임을 확인시켰다. 유사하게, 본원에 기재된 항체는 전형적으로 200 pM 이하 범위의 KD로 높은 친화도로 시노몰구스 C3b에 결합하였다.
C3b 항체는 C3에 대해 유의한 결합 선택성을 나타낸다
C3b 항체가 C3b 전구체 C3에 비해 C3b에 결합하는데 선택적인지 여부를 결정하기 위해 그들을 시험하였다. 간략하게, C3b에 대한 결합 선택성은 하기 단계를 수행함으로써 결정되었다. 맥시소르프 플레이트 Nunc (442404)를 카르보네이트 완충제 중 2 ㎍/mL의 항-C3d 토끼 모노클로날 (아브캄 17453) 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 흡인시키고, PBS/0.5％ 트윈 20으로 3회 세척하였다. 플레이트를 희석제 (PBS, 4％ BSA 분획 V (피셔(Fisher) ICN16006980), 0.1％ 트윈 20 (시그마 P1379), 0.1％ 트리톤 X-100 (시그마 P234729))로 차단시키고, 실온에서 2 시간 동안 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBS/0.5％ 트윈 20으로 1회 세척하였다. 정제된 C3b (컴플리먼트 테크놀로지즈 A114 lot 21) 및 C3 (컴플리먼트 테크놀로지즈 A113c)을 희석제 중 1 ㎍/mL로 희석하고, 웰당 100 ㎕를 플레이팅하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, PBS/0.5％ 트윈 20으로 3회 세척하였다. Fab를 100 nM에서 희석하고, 후속적으로 희석제 중에서 (또는 더높은 농도) 희석하고, 웰당 100 ㎕를 플레이팅하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.5％ 트윈 20으로 3회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 항-히스티딘-HRP 모노클로날 검출 항체를 희석제 중 1:400으로 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, PBS/0.5％ 트윈 20으로 4회 세척하였다. 100 ㎕의 TMB 기질 (피어스 34028)을 첨가하고, 실온에서 5 분 이하 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 정지 용액 (2N 황산)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 450nm에서 판독하고, 570nm에서의 플라스틱 판독을 위해 보정하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, C3b 항체는 C3 결합에 대해 선택적이었다. 상기 항체는 C3 결합에 비해 1000배가 넘는 C3b 결합 선택성을 달성하였다. 도 1이 항체 9556에 대한 결합 선택성의 예를 도시하지만, 1000배 결합 선택성은 본원에 개시된 7개의 IgG C3b 항체가 보유한 특성이다.
C3b 항체는 대체 보체 경로를 억제한다
항-C3b 항체가 대체 보체 경로를 억제하는 것을 입증하기 위해, 하기 검정을 수행하였다.
용혈 검정
용혈 검정은 보체 활성화를 시험하는 기본적인 기능적 검정이며, 이를 이용하여 항-인간 C3b mAb 및 Fab 분자가 보체 경로에 의해 적혈구 세포 (RBC)의 용해를 차단하는 능력을 평가하였다 (문헌 [Evans et al. (1995). In vitro and in vivo inhibition of complement activity by a single-chain Fv fragment recognizing human C5. Mol Immunol 32, 1183-1195]; [Thomas et al. (1996). Inhibition of complement activity by humanized anti-C5 antibody and single-chain Fv. Mol Immunol 33, 1389-1401]; [Rinder et al. (1995). Blockade of C5a and C5b-9 generation inhibits leukocyte and platelet activation during extracorporeal circulation. J Clin Invest 96, 1564-1572]). 간략하게, 고전적 경로 검정의 경우, 민감화된 적혈구 세포를 혈청에 존재하는 보체 단백질에 의한 용해에 대한 표적으로서 사용하였다. 이 검정은 고친화도 항-인간 C3b mAb의 특성화 및 스크리닝의 면에서 흥미로웠다.
이 절차는 문헌 [Rinder et al., (1995)] 및 [Thomas et al., (1996)]으로부터 적합화되었다.
시약:
토끼 적혈구 세포 (Rb RBC) - 램파이어(Lampire), Cat# 7246408
인간 혈청 - 노바티스(Novartis) 혈액 연구 프로그램; 또는 시노 혈청 - 알파 제네시스
젤라틴 베로날 완충제 (GVB) - 보스톤 바이오프로덕츠(Boston BioProducts), Cat# IBB-300
EGTA - 보스톤 바이오프로덕츠, Cat# BM-151
MgCl2
U-바닥 96-웰 플레이트 - 코닝(Corning), Cat# 3795
편평-바닥 96-웰 플레이트 - 코닝, Cat# 3370
NP-40 - 시그마, Cat# 74385
프로토콜:
1. Rb RBC를 세척하고, GVB/EGTA/Mg++ 중 8.33e7 세포/ml로 조정하였다.
2. GVB로 희석된 50 ㎕의 Ab를 96-웰 둥근 바닥 플레이트 중의 웰에 첨가하였고, Ab는 목적하는 최종 농도의 2배 농도이어야 한다.
3. EGTA 및 Mg++를 갖는 GVB로 희석된 50 ㎕의 혈청을 첨가하였다.
a. 대조군 웰의 제조: 혈청 + 0 nM Ab, 0％ 용해 대조군 (완충제 단독), 100％ 용해 대조군 (0.1％ NP-40), 및 혈청, 완충제, 및 NP-40 블랭크.
b. 10％ 혈청에 대해 Ab를 시험하는 경우에는 10 mM EGTA 및 5 mM Mg++ (최종)를 사용하였고, 50％ 혈청에 대해 Ab를 시험하는 경우에는 15-30 mM EGTA, 5 mM Mg++ (최종)를 사용하였다.
4. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
5. 30 ㎕의 Rb RBC를 샘플 및 대조군 웰에 첨가하고, 30 ㎕의 완충제를 블랭크 웰에 첨가하였다. 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
6. 플레이트를 2000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다.
7. 상청액을 수확하고, 편평-바닥 플레이트로 옮겼다.
8. OD415 및 OD570을 판독하였다. 용혈％를 계산하였다:
Figure pct00036
도 2는 항-C3b 항체가 10％ 인간 또는 시노몰구스 혈청에서 용혈을 억제하는 능력의 예를 도시한다. 본원에 기재된 각각의 C3b 항체는 50 nM 이하의 IC50으로 용혈을 억제하였다.
대조적으로, 고전적 보체 경로의 활성화를 실험하기 위해 검정을 민감화된 적혈구 세포를 사용하여 수행하는 경우, 본원에 기재된 항-C3b 항체는 고전적 보체 경로를 활성화시키지 않는 것으로 확인되었다 (데이터는 도시하지 않음).
C3b 침착 검정
대체 경로에서 보체 C3에 대한 억제 활성을 측정하는 한 방법은, 지모산 상에서 그의 분해 생성물인 C3b 침착을 측정하는 것이다. 이 ELISA 기반 검정은 하기 단계에 따라 수행하였다: 카르보네이트 완충제, pH 9.6 (피어스 Cat# 28382) 중 25 ㎕의 1 mg/ml 지모산 A (시그마 Z4250)를 맥시소르프 384-웰 ELISA 플레이트 (Nunc 464718)에 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 다음 날, 지모산-코팅된 플레이트를 흡인시키고, 100 ㎕/웰의 ELISA 차단 완충제, 신블록 (에이비디 세로텍 BUFO34C)으로 실온에서 2 시간 동안 차단시켰다. 별도의 반응에서, 젤라틴 베로날 완충제 (보스톤 바이오프로덕츠 IBB320-10 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 0.1％ 젤라틴, 0.5 mM MgCl2, 10 mM EGTA)로 계열 희석된 억제제를 1 mM MgCl2 및 10 mM EGTA의 최종 총 반응 농도로 MgCl2 및 EGTA가 보충된 10％ 혈청에 첨가하였다. 양성 대조군은 억제제를 함유하지 않았고, 음성 대조군은 25 mM EDTA를 가졌다. 혼합물을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션함으로서 평형에 도달하게 하였다. 차단 완충제를 제거하기 위해, 플레이트를 흡인시키고, TBS/0.05％ 트윈-20으로 1회 세척하였다. 억제제 또는 대조군을 함유하는 10％ 혈청 25 ㎕/웰을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다 (지모산 상에서 C3b 침착의 선형 범위 내에서 시간-경과에 의해 미리 측정됨). 30 분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 TBS/0.05％ 트윈-20으로 3회 세척하였다. 지모산 상에서 C3b 침착을 검출하기 위해, 제조자의 지시에 따라 PBS 중에서 2％BSA 분획 V (피셔 Cat# ICN 16006980), 0.1％ 트윈20 (시그마 Cat# P1379), 및 0.1％ 트리톤X-100 (시그마 Cat# P234729)으로 희석된 25 ㎕/웰의 닭 항-인간 C3-HRP 접합된 폴리클로날 항체 (이뮤놀로지 컨설턴트 래버러토리, 인크.(Immunology Consultants Laboratory, Inc.) Cat# CC3-80P-1)를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 TBS/0.05％ 트윈-20으로 3회 세척한 다음, 25 ㎕의 울트라 TMB 기질 용액 (피어스 Cat#34028)을 첨가하였다. 웰 중의 용액이 청색으로 변하였을 때, 15 ㎕의 2N 황산에 의해 반응을 정지시켰다. 플레이트를 스펙트로맥스(Spectromax)를 사용하여 450nm에서 판독하고, 570nm에서의 플라스틱 플레이트에 대해 보정하였다 (OD 450-570nm 판독). 지모산 상에서 C3b 침착의 백분율을 하기 식을 이용하여 계산하였다:
Figure pct00037
도 3은 C3의 분해 생성물로서 C3b의 생성을 억제하는 C3b 항체의 능력의 예를 도시한다. 시험된 각각의 항체는 적어도 10 nM 이하의 IC50으로 C3b 침착하는 것으로 나타났다.
MAC 침착 검정
C3b 항체가 대체 보체 경로를 억제하는 기능적 능력을 측정하는 또 다른 검정은 C3b의 가공의 하류에 있는 막 공격 복합체 (MAC)를 억제하는 상기 항체의 능력을 측정하는 것이다. 간략하게, 지모산 A (시그마)를 카르보네이트 완충제 (pH 9.5) 중 1 mg/ml로 플레이트 상에 코팅하여, 대체 경로를 활성화시켰다. 각각의 Fab 또는 IgG를 혈청 (2％ 혈청, 5 mM MgCl2, 10 mM EDTA)과 함께 사전 인큐베이션한 다음, 플레이트에 첨가하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST로 3회 세척한 후, MAC를 항-C5b-9-ALP (디아텍(Diatec))와 1 시간 동안 인큐베이션한 후, TBST로 3회 세척하고, 2 mM MgCl2로 보충된 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 (피셔)와 함께 30 분 동안 인큐베이션함으로써 검출하였다. 0.2M EDTA에 의해 반응을 정지시키고, 플레이트를 ex=355nm, em=460nm에서 판독하였다. MAC 침착의 억제는 각각의 샘플을 기준선 (EDTA 처리된 인간 혈청) 및 양성 대조군 (인간 혈청)과 비교하여 계산하고, 이를 이용하여 PRISM에 의해 IC50 곡선을 생성하였다.
도 4는 C3b 항체가 MAC의 침착을 억제하는 능력을 입증하는 예시적인 데이터를 도시하며, 따라서 상기 항체가 대체 보체 경로를 억제함을 나타낸다. 구체적으로, 상기 항체는 MAC 침착을 5 nM 이하의 IC50으로 억제하였다.
C3a 및 C5a 생성의 억제
C3b 항체가 대체 보체 경로를 억제하는 능력을 입증하기 위해 이용될 수 있는 또 다른 검정은, 대체 경로에서 C3b의 하류 활성화 생성물인 C3a 및 C5a의 생성을 측정하는 것이다.
간략하게, 본 출원인은 용혈 검정에서 억제성이었던 항체가 또한 C5에서 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하는지를 확인하기 위해 용혈 동안의 C5a 생성을 측정하는 C5a-des-Arg ELISA를 개발하였다.
맥시소르프 플레이트를 코팅 완충제 (pH 9.5 내지 9.8의 비카르보네이트) 중 1 ㎍/mL의 마우스 항-인간 C5a-des-Arg (유에스 바이올로직스) 100 ㎕/웰로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후에 상기 플레이트를 300 ㎕/웰 희석제 (신블록, 에이비디 세로텍)로 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. 상기 차단 용액을 흡인한 후, 100 ㎕의 샘플 또는 표준물 (희석제로 희석함)을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 표준물은 다음과 같이 제조하였다: 출발은 20 ng/mL 표준물 (rC5a-des-Arg)이었고, 7-점 곡선을 위한 1:4 계열 희석물을 제조하였다. 용혈 검정의 샘플을 희석제 중에 1:5로 희석하였다 (용혈 검정 상청액은 C5a ELISA에서 사용할 때까지 -80℃에서 저장해야 함). 사이마다 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다.
희석제로 희석한 0.4 ㎍/mL의 검출 항체 (비오틴-염소 항-인간 C5a, 알앤디 시스템즈(R＆D Systems))를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 HRP 희석제 (폴리-HRP 희석제) 중에 1:5000으로 희석한 Strep-HRP (폴리-HRP 스트렙타비딘)를 100 ㎕/웰로 30분 동안 첨가하였다. PBST로 4회 세척한 후, 100 ㎕/웰의 TMB 기질 (울트라 TMB 기질 용액)을 5분 내지 10분 동안 첨가하였다. 반응을 50 ㎕/웰의 정지 용액 (2 N H2SO4)으로 정지시켰다. 흡광도를 판독 (A450 내지 A570)하고, 데이터를 소프트맥스 프로로 분석하였다.
유사하게, 본 출원인은 용혈 검정에서 억제성이었던 항체가 또한 C3의 C5a 및 C3b로의 절단을 억제하는지를 확인하기 위해 용혈 동안의 C3a 생성을 측정하는 C3a-des-Arg ELISA를 개발하였다.
맥시소르프 플레이트를 코팅 완충제 (pH 9.5 내지 9.8의 비카르보네이트) 중 1 ㎍/mL의 마우스 항-인간 C3a-des-Arg neo (유에스 바이올로직스) 100 ㎕/웰로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후에 상기 플레이트를 300 ㎕/웰 희석제 (신블록, 에이비디 세로텍)로 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. 상기 차단 용액을 흡인한 후, 100 ㎕의 샘플 또는 표준물 (희석제로 희석함)을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 표준물은 다음과 같이 제조하였다: 출발은 1 ㎍/mL 표준물 (rC3a-des-Arg)이었고, 8-점 곡선을 위한 1:3 계열 희석물을 제조하였다. 용혈 검정의 샘플을 희석제 중에 1:5로 희석하였다 (용혈 검정 상청액은 C5a ELISA에서 사용할 때까지 -80℃에서 저장해야 함). 사이마다 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다.
희석제로 희석한 10 ㎍/mL의 검출 항체 (비오틴-마우스 항-인간 C3a, 케미콘(Chemicon) 및 사내 비오티닐화)를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 HRP 희석제 (폴리-HRP 희석제) 중에 1:5000으로 희석한 Strep-HRP (폴리-HRP 스트렙타비딘)를 100 ㎕/웰로 30분 동안 첨가하였다. PBST로 4회 세척한 후, 100 ㎕/웰의 TMB 기질 (울트라 TMB 기질 용액)을 5분 내지 10분 동안 첨가하였다. 반응을 50 ㎕/웰의 정지 용액 (2N H2SO4)으로 정지시켰다. 흡광도를 판독 (A450 내지 A570)하고, 데이터를 소프트맥스 프로로 분석하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, C3b 항체는 C3a 및 C5a의 생성을 억제함으로써 대체 경로-유도된 보체 활성화를 차단시킬 수 있었다. 보다 구체적으로는, 본원에 기재된 C3b 항체는 50 nM 이하의 IC50으로 C3a 및 C5a 생성의 억제에 의해 측정된 바와 같이 대체 경로를 억제하였다.
C3b 항체는 시험관내 C3 전환효소 효소 활성을 억제한다
C3 물 틱-오버 전환효소 겔 기반 검정
이 검정에서, Fab/IgG를 C3을 함유하는 10％ C3-물과 함께 사전 인큐베이션하여, 인자 D 및 인자 B가 첨가되었을 때 C3 물 틱-오버를 통한 전환효소 활성을 측정하였다. 단백질 시약은 하기 최종 농도로 사용되었다: 천연 인자 B (100 nM), 인자 D (40 nM), C3 (400 nM), MgCl (5 mM) 및 Fab/IgG 1000 nM (후속적으로 희석). 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서, 다양한 희석률의 Fab/IgG를 첨가하였다 (PBS 대조군 샘플 포함). 여기에 C3을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 인자 B, 인자 D, 및 MgCl의 저장 혼합물을 1XPBS로 만들었다. 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 적절한 양의 반응 혼합물을 각각의 웰 중의 Fab/IgG-C3에 첨가하였다. 즉시 영점을 취하고, 4X 샘플 완충제를 첨가하고, 95℃에서 두었다. 전환효소 반응을 허용하도록 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 최종 시점을 취하고, 4X 샘플 완충제를 첨가하고, 95℃에서 두었다. 각각의 샘플에 대한 전체 부피를 환원 조건 하에서 4-12％ 비스-트리스 겔 상에 흘려 보냈다. (영점은 또한 인자 D를 생략하여 별도의 반응에서 생성될 수 있다).
C3b 겔 기반 전환효소 검정
이 검정은 Fab/IgG를 C3b와 사전 인큐베이션하도록 고안되었다. 인큐베이션 후에, 이를 C3-반응 혼합물에 첨가하여 전환효소 활성에 대해 체크하였다. 단백질 시약은 하기 최종 농도로 사용되었다: 천연 C3b (32 nM), 천연 인자 B (100 nM), 인자 D (40 nM), C3 (400 nM), MgCl (5 mM) 및 Fab/IgG 1000 nM (후속적으로 희석). 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서, 다양한 희석률로 적절한 부피의 Fab/IgG를 첨가하였다 (PBS 대조군 샘플 포함). 여기에 웰당 적절한 양의 C3b를 첨가하였다. 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 인자 B, 인자 D, 및 MgCl의 저장 혼합물을 1XPBS로 만들었다. 1 시간 동안 인큐베이션한 후, C3을 저장 혼합물에 첨가하고, 즉시 적절한 양의 반응 혼합물을 각각의 웰 중의 Fab/IgG-C3에 첨가하였다. 즉시 영점을 취하고, 4X 샘플 완충제를 첨가하고, 95℃에서 두었다. 전환효소 반응을 허용하도록 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 최종 시점을 취하고, 4X 샘플 완충제를 첨가하고, 95℃에서 두었다. 각각의 샘플에 대한 전체 부피를 환원 조건 하에서 4-12％ 비스-트리스 겔 상에 흘려 보냈다. (영점은 또한 인자 D를 생략하여 별도의 반응에서 생성될 수 있다).
사전 형성된 C3 전환효소 겔 기반 검정
이 검정은 안정적인 전환효소가 C3b, 인자 B 돌연변이체 및 인자 D를 사용하여 생성되도록 고안되었다. 여기에 Fab/IgG를 첨가하고, 인큐베이션시켰다. 이어서, C3을 첨가하고, 분석을 위해 샘플을 취하였다. C3b는 전환효소를 형성할 수 없었다. 단백질 시약은 하기 최종 농도로 사용되었다: 천연 C3b (32 nM), 인자 B 돌연변이체 (16 nM), 인자 D (40 nM), C3 (400 nM), MgCl (5 mM) 및 Fab/IgG 1000 nM (후속적으로 희석). 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서, C3b, 인자 B, 인자 D 및 MgCl을 첨가하고, 37℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 적절한 희석률의 Fab/IgG (PBS 대조군)를 첨가하고, 37℃에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, C3을 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 즉시 영점을 취하고, 4X 샘플 완충제를 첨가하고, 95℃에서 두었다. 전환효소 반응을 허용하도록 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 최종 시점을 취하고, 4X 샘플 완충제를 첨가하고, 95℃에서 두었다. 각각의 샘플에 대한 전체 부피를 환원 조건 하에서 4-12％ 비스-트리스 겔 상에 흘려 보냈다. (영점은 또한 인자 D를 생략하여 별도의 반응에서 생성될 수 있다).
도 6에 도시된 바와 같이, C3b 항체는 대체 경로 시험관내 C3 전환효소 효소 활성을 억제하였다. 도 6a는 틱-오버 전환효소 효소 활성의 억제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 도 6b는 6a에서 겔 중 C3b 생성의 억제의 정량화를 도시한다. 도 6c는 항-C3b 항체가 사전-형성된 C3 전환효소 효소 활성을 억제함을 나타낸다.
C3b 항체는 시험관내 C5 전환효소 효소 활성을 억제한다
항-C3b 항체가 대체 보체 경로를 억제하는 능력을 추가로 특성화하기 위해, 항체가 C5 전환효소의 활성화를 억제하는 능력을 실험하였다. 간략하게, C3b를 실온에서 정제된 C3 및 트립신 (시그마)과 함게 10 분 동안 인큐베이션하여 지모산 A (시그마) 상에 침착시켰다. 지모산을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 정제된 C3, fB, fD, 및 NiCl2의 첨가에 의해 C3b를 증폭시켰다. 지모산 상에 목적하는 밀도의 C3b가 달성될 때까지 증폭 단계를 반복하였다.
Fab/IgG를 지모산-C3b와 함께 실온에서 45 분 동안 사전 인큐베이션하였다. 정제된 단백질을 첨가하였다 (컴플리먼트 테크): C5 (100 nM), C6 (100 nM), fB (500 nM), fD (160 nM), 및 5 mM NiCl2. 반응물을 37℃에서 5 분 동안 인큐베이션하고, 1:10 희석에 의해 빙랭 GVB + 10 mM EDTA로 정지시켰다. C5bC6 수준을 용혈 검정을 이용하여 반응 생성물을 chRBC (8E7/ml) 및 2％ 인간 혈청에 첨가하고, 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션함으로써 정량화하였다. 세포를 2000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 A415/A570에서 판독하였다. 정제된 C5bC6 단백질 (컴플리먼트 테크)을 표준 곡선으로서 사용하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, C3b 항체는 대체 경로 시험관내 C5 전환효소 효소 활성을 억제하였다.
C3b 항체에 의한 C3b에 결합하는 보체 인자의 차단
하기 실험을 수행하여 항-C3b 항체가 C3b와 대체 보체 경로의 다른 구성원 사이의 상호작용을 억제하는 능력을 측정하였고, 따라서 상기 항체가 대체 보체 경로를 억제하는 잠재적인 메카니즘을 입증하였다. 간략하게, 정제된 C3b 및 fP를 실온에서 48 시간 동안 인큐베이션하는 동안 아미노링크 환원제 (피어스)를 사용하여 비접합 수용자 또는 공여자 비드 (퍼킨엘머(PerkinElmer))에 접합시켰다. 카르복시메톡실아민 헤미히드로클로라이드 (알드리치(Aldrich))를 사용하여 비드를 켄칭시키고, 13000 rpm에서의 원심분리 및 0.1M TBST로의 3회 세척에 의해 정제하였다. 정제된 fB(D24G/N260D) 및 fH를 20배 몰 과량의 NHS-색소성-비오틴 (피어스)과 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 동안 비오티닐화시키고, 제바 0.5ml 탈염 칼럼 (피어스)을 이용하여 정제하였다.
C3b-C3b 및 C3b-fP 인접성을 위해, Fab 또는 IgG 각각을 C3b-수용자 비드 (20 ㎍/mL)와 함께 실온에서 60 분 동안 사전 인큐베이션하였다. 이어서, C3b-공여자 비드 또는 fP-공여자 비드 (20 ㎍/mL)를 첨가하고, 판독하기 전에 플레이트를 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. C3b-fB 및 C3b-fH 인접성을 위해, 항체를 C3b-수용자 비드 (20 ㎍/mL)와 함께 실온에서 60 분 동안 사전 인큐베이션하였다. 이어서, 비오티닐화 fB(D24G/N260D) 또는 fH를 첨가하고, 실온에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, SA-공여자 비드를 첨가하고 (20 ㎍/mL), 판독하기 전에 플레이트를 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 BMG 페라스타(Pherastar) (ex=680, em=520-620) 상에서 판독하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, C3b 항체는 몇몇 보체 인자가 C3b에 결합하는 것을 억제하였다. 상기 도면에서 확인되는 바와 같이, 항-C3b 항체는 대체 보체 경로를 차단시키기 위해 상이한 작용 메카지즘을 이용하였다. 도 8a는 C3b 항체에 의해 인자 B의 C3b로의 결합을 억제하는 것을 도시한다. 도 8b는 C3b 항체에 의해 인자 P의 C3b로의 결합을 억제하는 것을 도시한다. 도 8c는 C3b 항체에 의해 인자 H의 C3b로의 결합을 억제하는 것을 도시한다. 도 8d는 C3b 항체에 의해 C3b-C3b 이량체 형성을 억제하는 것을 도시한다.
C3b 항체는 인간 C3d 또는 인간 C5와 교차반응하지 않는다
항-C3b 항체를 인간 C3d 및 C5와의 교차 반응성에 대해 시험하였다.
인간 C3b, 인간 C3d 또는 시노 C3b에 대한 결합에 대해 시험하는 ELISA에 사용된 포획 항체는 C3b의 하위 도메인인 C3d 단백질 토끼 폴리클로날 항-인간 C3d Ab (아브캄)에 대해 지정된 항체이다. 맥시소르프 플레이트의 웰을 PBS 중 2 ㎍/mL로 희석된 포획 항체로 충전하였다. 플레이트를 밀봉하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. Fab와 C5의 결합을 시험하기 위해, 포획 항체는 5 ㎍/mL의 최종 농도를 사용되는 항-C5 항체 (유에스 바이올로지컬스)이었다.
다음 날, 플레이트 상의 나머지 결합 부위를 PBST/5％ 분유의 첨가에 의해 차단시켰다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST로 2회 세척하였다. C3b를 PBST/0.5％ 분유로 희석된 2.5 ㎍/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST로 3회 세척하였다. Fab를 계열 희석한 다음, 차단된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 내지 2 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST로 3회 세척하였다.
Fab의 검출을 위해, 항-HIS AP-접합된 항체 (인비트로젠, 46-0284)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, TBST로 5회 세척하였다. 형광 기질 AttoPhos를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 테칸 제니오스 프로 플레이트 판독기에서 형광을 측정하였다.
C3d 및 C5에 대한 이들 실험의 결과를 각각 도 9 및 10에 도시하였다. 도시된 바와 같이, C3b 항체는 C3d 또는 C5와 결합하지 않았다.
C3b 항체는 iC3b 및 C3c를 동등하게 잘 인식한다
본원에 기재된 항-C3b 항체가 보체 경로 성분 iC3b 및 C3c에 결합할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 하기 단계를 수행하였다: 카르보네이트 완충제 중 2 ㎍/mL의 iC3b (컴플리먼트 테크놀로지즈 A115), C3d (컴플리먼트 테크놀로지즈 A117), 또는 C3c (컴플리먼트 테크놀로지즈 A116)를 코트 맥시소르프 플레이트 Nunc (442404)에 100 ㎕/웰로 직접 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 흡인시키고, PBS/0.5％ 트윈 20으로 3회 세척하였다. 플레이트를 희석제 (PBS, 4％ BSA 분획 V (피셔 ICN16006980), 0.1％ 트윈 20 (시그마 P1379), 0.1％ 트리톤 X-100 (시그마 P234729))로 차단시키고, 실온에서 2 시간 동안 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBS/0.5％ 트윈 20으로 1회 세척하였다. Fab를 100 nM로 희석하고, 후속적으로 희석제로 (또는 경우에 따라 더 높은 농도) 희석하고, 웰당 100 ㎕로 플레이팅하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.5％ 트윈 20으로 3회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 항-히스티딘-HRP 모노클로날 검출 항체를 희석제 중 1:400으로 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, PBS/0.5％ 트윈 20으로 4회 세척하였다. 100 ㎕의 TMB 기질 (피어스 34028)을 첨가하고, 실온에서 5 분 이하 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 정지 용액 (2N 황산)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 450nm에서 판독하고, 570nm에서의 플라스틱 판독을 위해 보정하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, C3b 항체는 iC3b 및 C3c 둘 다와 교차 반응하였다.
종 교차 반응성
인간 및 시노몰구스 이외에, 본원에 기재된 항-C3b 항체가 다른 종으로부터의 C3b에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 기재된 바와 같이 용혈 검정을 수행하였다. 각각의 종에 대해 사용된 혈청 농도는 다음과 같다: 10％ 래트 혈청; 20％ 토끼 혈청; 10％ 돼지 혈청; 20％ 마우스 혈청; 10％ 기니아 피그 혈청; 및 10％ 개 혈청. 도 12에 도시된 바와 같이, C3b 항체는 래트, 토끼, 돼지, 마우스 및 기니아 피그를 비롯한 몇몇 종과 교차 반응할 수 있었다.
Fab 포맷 C3bneo 결합제
상기 기재된 완전 IgG 포맷 항-C3b 항체 이외에, 동일한 가변 도메인을 사용하여 Fab 포맷 항원 결합 단편을 구축하였다. 항-C3b Fab가 상기 기재된 방법에 따른 결합 특성을 측정하기 위해 평가하였다. 표 11은 Fab의 하위 집합에 대한 결합 친화도, 기능적 효능, 및 보체 인자 결합의 억제를 요약한다.
<표 12>
Figure pct00038
본 발명의 실시양태
본 발명은 하기 실시양태를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다:
1. 인간 또는 시노몰구스 보체 C3b 단백질에 특이적으로 결합하며, 100 pM 이하의 KD로 인간 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 또한 250 pM 이하의 KD로 시노몰구스 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 10 pM 이하의 KD로 인간 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 2 pM 이하의 KD로 인간 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 용혈 검정에 의해 측정되는 바와 같이 65 nM 이하의 IC50으로 인간 대체 보체 경로를 억제하는 단리된 항체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 C3b 침착에 의해 측정되는 바와 같이 50 nM 이하의 IC50으로 인간 대체 보체 경로를 억제하는 단리된 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 막 공격 복합체의 침착에 의해 측정되는 바와 같이 5 nM 이하의 IC50으로 인간 대체 보체 경로를 억제하는 단리된 항체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, C3a 및 C5a의 생성에 의해 측정되는 바와 같이 100 nM 이하의 IC50으로 대체 보체 경로를 억제하는 단리된 항체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 시노몰구스 보체 C3b 단백질에 특이적으로 결합하며, 표 1에 기재된 항체와 교차 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 단리된 항체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체인 단리된 항체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체인 단리된 항체.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 쇄 항체인 단리된 항체.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편 또는 ScFv 단편인 단리된 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 이소형인 단리된 항체.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환되어 있는 프레임워크를 포함하는 단리된 항체.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, C3에 결합하는 상기 항체의 친화도보다 1000배 이상 더 큰 친화도로 C3b에 결합하는 단리된 항체.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1; 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2; 및 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하며, 보체 단백질 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하며, 상기 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 보체 단백질 C3b에 결합하는 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 추가로 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함하며, 보체 단백질 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9, 23, 37, 51, 65, 79, 93, 107, 121, 135, 149, 163, 177 및 191로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하며, C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하며, C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 추가로 포함하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
29. 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
30. 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
31. 제29항 또는 제30항의 핵산을 포함하는 벡터.
32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 서열, 및 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 서열을 포함하고, 상기 DNA 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되며 숙주 세포에서 발현될 수 있는 것인, 단리된 숙주 세포.
33. 제32항에 있어서, 상기 항체가 인간 모노클로날 항체인 단리된 숙주 세포.
34. 제32항에 있어서, 비-인간 포유동물 세포인 단리된 숙주 세포.
35. 연령 관련 황반 변성의 치료가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 연령 관련 황반 변성을 치료하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
37. 대체 보체 경로의 억제가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 대체 보체 경로를 억제하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
본원에 인용되는 모든 특허, 특허 출원, 및 공개 참조문은 그 전문을 본원에 참고로 포함된다. 본 발명은 그의 바람직한 실시양태를 참조하여 구체적으로 제시되고 설명되었지만, 당업자는 첨부된 특허청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 상세한 내용에 있어서 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Kim, Yong-in <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANTIBODIES TARGETING COMPLEMENT PROTEIN C3B <130> 53586 <160> 198 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Ser Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 5 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 448 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 11 gaggtgcaat tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctactgga tgacatgggt gcgccaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtgtccagc atcaagatca agcccgacgg ctacgccgcc 180 tccgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 240 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccagact gttctaccag 300 tacttcgccc ggatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag ctca 354 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 12 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgcc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcaacc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacgacagct acagccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 13 <211> 1404 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 13 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtcgccgctc ccagatgggt gctgtccgag 60 gtgcaattgg tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tactggatga catgggtgcg ccaggcccct 180 ggcaagggac tggaatgggt gtccagcatc aagatcaagc ccgacggcta cgccgcctcc 240 gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg 300 aacagcctgc gggccgagga caccgccgtg tactactgcg ccagactgtt ctaccagtac 360 ttcgcccgga tggactactg gggccagggc accctggtga ccgtgagctc agcctccacc 420 aagggtccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag cagcgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 14 <211> 642 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 14 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgcc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcaacc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacgacagct acagccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 15 Ser Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 16 Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 17 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 18 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 19 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 20 Gln Gln His Asp Thr Phe Arg Pro Thr 1 5 <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Thr Phe Arg Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 448 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Thr Phe Arg Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 354 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 25 gaggtgcaat tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctactgga tgacatgggt gcgccaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtgtccagc atcaagatca agcccgacgg ctacgccgcc 180 tccgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 240 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccagact gttctaccag 300 tacttcgccc ggatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag ctca 354 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 26 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcaatc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatttcctc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cacgacacct tccggcccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 27 <211> 1404 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 27 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtcgccgctc ccagatgggt gctgtccgag 60 gtgcaattgg tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tactggatga catgggtgcg ccaggcccct 180 ggcaagggac tggaatgggt gtccagcatc aagatcaagc ccgacggcta cgccgcctcc 240 gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg 300 aacagcctgc gggccgagga caccgccgtg tactactgcg ccagactgtt ctaccagtac 360 ttcgcccgga tggactactg gggccagggc accctggtga ccgtgagctc agcctccacc 420 aagggtccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag cagcgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 28 <211> 642 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 28 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcaatc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatttcctc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cacgacacct tccggcccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 29 Ser Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 30 Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 31 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 32 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 33 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 34 Gln Gln Trp Asp Ser Phe Ser Pro Thr 1 5 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Ser Phe Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 448 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 38 <211> 214 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Ser Phe Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 39 <211> 354 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 39 gaggtgcaat tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctactgga tgacatgggt gcgccaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtgtccagc atcaagatca agcccgacgg ctacgccgcc 180 tccgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 240 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccagact gttctaccag 300 tacttcgccc ggatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag ctca 354 <210> 40 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 40 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcaatc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatctcctc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tgggacagct tcagccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 41 <211> 1404 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 41 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtcgccgctc ccagatgggt gctgtccgag 60 gtgcaattgg tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tactggatga catgggtgcg ccaggcccct 180 ggcaagggac tggaatgggt gtccagcatc aagatcaagc ccgacggcta cgccgcctcc 240 gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg 300 aacagcctgc gggccgagga caccgccgtg tactactgcg ccagactgtt ctaccagtac 360 ttcgcccgga tggactactg gggccagggc accctggtga ccgtgagctc agcctccacc 420 aagggtccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag cagcgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 42 <211> 642 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 42 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcaatc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatctcctc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tgggacagct tcagccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 43 Ser Tyr Thr Phe Ser 1 5 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 44 Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 45 Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu Asp Val 1 5 10 15 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 46 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 47 Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 48 Gln Gln Ser Trp Ser Val Pro Pro Phe Thr 1 5 10 <210> 49 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 50 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Val Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 51 <211> 455 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 52 <211> 215 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Val Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 53 <211> 375 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 53 gaggtgcaat tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaagc ccggcagcag cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc agctacacct tcagctgggt gcgccaggcc 120 ccaggacagg gcctggaatg gatgggcaac atcctgccca tcttcggcga cgccaactac 180 gcccagaagt tccagggcag agtcaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaacaag 300 ggcgccttct actacatgag cacctacccc agcctggacg tgtggggcca gggcaccctg 360 gtgaccgtga gctca 375 <210> 54 <211> 324 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 54 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gaacatcaac tactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccttcagcc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatttcctc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tcttggagcg tgcccccctt caccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caag 324 <210> 55 <211> 1365 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 55 gaggtgcaat tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaagc ccggcagcag cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc agctacacct tcagctgggt gcgccaggcc 120 ccaggacagg gcctggaatg gatgggcaac atcctgccca tcttcggcga cgccaactac 180 gcccagaagt tccagggcag agtcaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaacaag 300 ggcgccttct actacatgag cacctacccc agcctggacg tgtggggcca gggcaccctg 360 gtgaccgtga gctcagcctc caccaagggt ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420 aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600 ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660 aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 720 gaagcagcgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 840 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 900 gaggagcagt acaacagcac gtaccgggtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 960 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1020 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1080 ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1140 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1200 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1260 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1320 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa 1365 <210> 56 <211> 645 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 56 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gaacatcaac tactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccttcagcc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatttcctc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tcttggagcg tgcccccctt caccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 57 Ser Tyr Thr Phe Ser 1 5 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 58 Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 59 Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu Asp Val 1 5 10 15 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 60 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 61 Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 62 Gln Gln Ser Ile Ala Val Pro Pro Phe Thr 1 5 10 <210> 63 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 64 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Ala Val Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 65 <211> 455 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 66 <211> 215 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 66 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Ala Val Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 67 <211> 375 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 67 gaggtgcaat tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaagc ccggcagcag cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc agctacacct tcagctgggt gcgccaggcc 120 ccaggacagg gcctggaatg gatgggcaac atcctgccca tcttcggcga cgccaactac 180 gcccagaagt tccagggcag agtcaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaacaag 300 ggcgccttct actacatgag cacctacccc agcctggacg tgtggggcca gggcaccctg 360 gtgaccgtga gctca 375 <210> 68 <211> 324 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 68 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gaacatcaac tactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccttcagcc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatttcctc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcattgccg tgcccccctt caccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caag 324 <210> 69 <211> 1365 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 69 gaggtgcaat tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaagc ccggcagcag cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc agctacacct tcagctgggt gcgccaggcc 120 ccaggacagg gcctggaatg gatgggcaac atcctgccca tcttcggcga cgccaactac 180 gcccagaagt tccagggcag agtcaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaacaag 300 ggcgccttct actacatgag cacctacccc agcctggacg tgtggggcca gggcaccctg 360 gtgaccgtga gctcagcctc caccaagggt ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420 aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600 ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660 aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 720 gaagcagcgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 840 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 900 gaggagcagt acaacagcac gtaccgggtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 960 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1020 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1080 ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1140 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1200 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1260 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1320 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa 1365 <210> 70 <211> 645 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 70 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gaacatcaac tactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccttcagcc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatttcctc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agcattgccg tgcccccctt caccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 71 Ser Tyr Ser Met His 1 5 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 72 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 73 Met Leu Arg Phe Asp Val 1 5 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 74 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 75 Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 76 Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Ser Asp Ser Pro Val 1 5 10 <210> 77 <211> 115 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Leu Arg Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 78 <211> 113 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 78 Glu Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr 85 90 95 Ser Asp Ser Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 79 <211> 445 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Leu Arg Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 80 <211> 217 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 80 Glu Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr 85 90 95 Ser Asp Ser Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 81 <211> 345 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 81 gaggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcgcttc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacagca tgcactgggt ccggcaggct 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggcctg atcaacccct acaacggcaa cacccactac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccgggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatgctg 300 cggttcgacg tgtggggcca gggcaccctg gtcaccgtca gctca 345 <210> 82 <211> 333 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 82 gagagcgccc tgacccagcc tgccagcgtg tctggcagcc ctggccagag catcaccatc 60 agctgcaccg gcaccagcag cgacggcgga ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 120 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacggcgtga gcaaccggcc cagcggggtg 180 tccaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat ctctgggctg 240 caggctgagg acgaggccga ctactactgc cagacctaca ccagatacag cgacagccct 300 gtgttcggag gcggaacaaa gttaaccgtc cta 333 <210> 83 <211> 1335 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 83 gaggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcgcttc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacagca tgcactgggt ccggcaggct 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggcctg atcaacccct acaacggcaa cacccactac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccgggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatgctg 300 cggttcgacg tgtggggcca gggcaccctg gtcaccgtca gctcagcctc caccaagggt 360 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagcagcgg ggggaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgggtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gtaaa 1335 <210> 84 <211> 651 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 84 gagagcgccc tgacccagcc tgccagcgtg tctggcagcc ctggccagag catcaccatc 60 agctgcaccg gcaccagcag cgacggcgga ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 120 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacggcgtga gcaaccggcc cagcggggtg 180 tccaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat ctctgggctg 240 caggctgagg acgaggccga ctactactgc cagacctaca ccagatacag cgacagccct 300 gtgttcggag gcggaacaaa gttaaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480 aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600 acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 85 Gly Tyr Tyr Ile Asn 1 5 <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 86 Ile Ile Ser Pro Asn Gln Gly Thr Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 87 Gly Asn Tyr Asp His Leu Asp Tyr 1 5 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 88 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 89 Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 90 Gln Gln Asp Trp His Thr Leu Pro Val Thr 1 5 10 <210> 91 <211> 117 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Ser Pro Asn Gln Gly Thr Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Asp His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 92 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 92 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Trp His Thr Leu Pro 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 93 <211> 447 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 93 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Ser Pro Asn Gln Gly Thr Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Asp His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 94 <211> 215 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 94 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Trp His Thr Leu Pro 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 95 <211> 351 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 95 gaggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcgcttc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctactaca tcaactgggt ccggcaggct 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggcatc atcagcccca accagggcac aaccggctac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccgggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaggcaac 300 tacgaccacc tggactactg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a 351 <210> 96 <211> 324 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 96 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccagcaccc tgcagagcgg cgtgcctagc 180 agattctccg ggagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccattagctc actgcagcca 240 gaagacttcg ccacctacta ctgccagcag gactggcaca ccctgcccgt gaccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caag 324 <210> 97 <211> 1341 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 97 gaggtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtgaagaaac caggcgcttc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctactaca tcaactgggt ccggcaggct 120 ccagggcagg gactggaatg gatgggcatc atcagcccca accagggcac aaccggctac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccgggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaggcaac 300 tacgaccacc tggactactg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc agcctccacc 360 aagggtccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag cagcgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa a 1341 <210> 98 <211> 645 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 98 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccagcaccc tgcagagcgg cgtgcctagc 180 agattctccg ggagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccattagctc actgcagcca 240 gaagacttcg ccacctacta ctgccagcag gactggcaca ccctgcccgt gaccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 99 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 99 Ser Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 100 Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 101 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 102 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 103 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 104 Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro Thr 1 5 <210> 105 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 105 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 106 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 106 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 107 <211> 220 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 107 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 <210> 108 <211> 214 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 109 <211> 354 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 109 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttattgga tgacttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagctct attaagatta agcctgatgg ttatgctgct 180 tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tttttatcag 300 tattttgctc gtatggatta ttggggccaa ggcaccctgg tgacggttag ctca 354 <210> 110 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 110 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca ggatatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tatgattctt attctcctac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa a 321 <210> 111 <211> 660 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 111 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttattgga tgacttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagctct attaagatta agcctgatgg ttatgctgct 180 tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tttttatcag 300 tattttgctc gtatggatta ttggggccaa ggcaccctgg tgacggttag ctcagcgtcg 360 accaaaggtc caagcgtgtt tccgctggct ccgagcagca aaagcaccag cggcggcacg 420 gctgccctgg gctgcctggt taaagattat ttcccggaac cagtcaccgt gagctggaac 480 agcggggcgc tgaccagcgg cgtgcatacc tttccggcgg tgctgcaaag cagcggcctg 540 tatagcctga gcagcgttgt gaccgtgccg agcagcagct taggcactca gacctatatt 600 tgcaacgtga accataaacc gagcaacacc aaagtggata aaaaagtgga accgaaaagc 660 <210> 112 <211> 642 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 112 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca ggatatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tatgattctt attctcctac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacggtg gctgctccga gcgtgtttat ttttccgccg 360 agcgatgaac aactgaaaag cggcacggcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420 ccgcgtgaag cgaaagttca gtggaaagta gacaacgcgc tgcaaagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctatt ctctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcaaggt 600 ctgagcagcc cggtgactaa atcttttaat cgtggcgagg cc 642 <210> 113 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 113 Ser Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 114 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 114 Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 115 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 115 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 116 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 116 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 117 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 118 Gln Gln His Asp Thr Phe Arg Pro Thr 1 5 <210> 119 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 119 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 120 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 120 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Thr Phe Arg Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 121 <211> 220 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 121 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 <210> 122 <211> 214 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 122 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Thr Phe Arg Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 123 <211> 354 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 123 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttattgga tgacttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagctct attaagatta agcctgatgg ttatgctgct 180 tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tttttatcag 300 tattttgctc gtatggatta ttggggccaa ggcaccctgg tgacggttag ctca 354 <210> 124 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 124 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca ggatatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag catgatactt ttcgtcctac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa a 321 <210> 125 <211> 660 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 125 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttattgga tgacttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagctct attaagatta agcctgatgg ttatgctgct 180 tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tttttatcag 300 tattttgctc gtatggatta ttggggccaa ggcaccctgg tgacggttag ctcagcgtcg 360 accaaaggtc caagcgtgtt tccgctggct ccgagcagca aaagcaccag cggcggcacg 420 gctgccctgg gctgcctggt taaagattat ttcccggaac cagtcaccgt gagctggaac 480 agcggggcgc tgaccagcgg cgtgcatacc tttccggcgg tgctgcaaag cagcggcctg 540 tatagcctga gcagcgttgt gaccgtgccg agcagcagct taggcactca gacctatatt 600 tgcaacgtga accataaacc gagcaacacc aaagtggata aaaaagtgga accgaaaagc 660 <210> 126 <211> 642 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 126 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca ggatatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag catgatactt ttcgtcctac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacggtg gctgctccga gcgtgtttat ttttccgccg 360 agcgatgaac aactgaaaag cggcacggcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420 ccgcgtgaag cgaaagttca gtggaaagta gacaacgcgc tgcaaagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctatt ctctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcaaggt 600 ctgagcagcc cggtgactaa atcttttaat cgtggcgagg cc 642 <210> 127 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 127 Ser Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 128 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 128 Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 129 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 130 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 131 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 132 Gln Gln Trp Asp Ser Phe Ser Pro Thr 1 5 <210> 133 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 133 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 134 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 134 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Ser Phe Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 135 <211> 220 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 135 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Lys Ile Lys Pro Asp Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Phe Tyr Gln Tyr Phe Ala Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 <210> 136 <211> 214 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 136 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Ser Phe Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 137 <211> 354 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 137 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttattgga tgacttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagctct attaagatta agcctgatgg ttatgctgct 180 tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tttttatcag 300 tattttgctc gtatggatta ttggggccaa ggcaccctgg tgacggttag ctca 354 <210> 138 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 138 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca ggatatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tgggattctt tttctcctac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa a 321 <210> 139 <211> 660 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 139 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttattgga tgacttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagctct attaagatta agcctgatgg ttatgctgct 180 tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tttttatcag 300 tattttgctc gtatggatta ttggggccaa ggcaccctgg tgacggttag ctcagcgtcg 360 accaaaggtc caagcgtgtt tccgctggct ccgagcagca aaagcaccag cggcggcacg 420 gctgccctgg gctgcctggt taaagattat ttcccggaac cagtcaccgt gagctggaac 480 agcggggcgc tgaccagcgg cgtgcatacc tttccggcgg tgctgcaaag cagcggcctg 540 tatagcctga gcagcgttgt gaccgtgccg agcagcagct taggcactca gacctatatt 600 tgcaacgtga accataaacc gagcaacacc aaagtggata aaaaagtgga accgaaaagc 660 <210> 140 <211> 642 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 140 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca ggatatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tgggattctt tttctcctac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacggtg gctgctccga gcgtgtttat ttttccgccg 360 agcgatgaac aactgaaaag cggcacggcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420 ccgcgtgaag cgaaagttca gtggaaagta gacaacgcgc tgcaaagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctatt ctctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcaaggt 600 ctgagcagcc cggtgactaa atcttttaat cgtggcgagg cc 642 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 141 Ser Tyr Thr Phe Ser 1 5 <210> 142 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 142 Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 143 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 143 Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu Asp Val 1 5 10 15 <210> 144 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 144 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 145 Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 146 Gln Gln Ser Trp Ser Val Pro Pro Phe Thr 1 5 10 <210> 147 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 147 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 148 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 148 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Val Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 149 <211> 227 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 149 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser 225 <210> 150 <211> 215 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 150 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Val Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 151 <211> 375 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 151 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatactt tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcaat atccttccga tttttggcga tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtaataag 300 ggtgcttttt attatatgtc tacttatcct tctcttgatg tttggggcca aggcaccctg 360 gtgacggtta gctca 375 <210> 152 <211> 324 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 152 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gaatattaat tattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgat gctttttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tcttggtctg ttcctccttt tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaa 324 <210> 153 <211> 681 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 153 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatactt tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcaat atccttccga tttttggcga tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtaataag 300 ggtgcttttt attatatgtc tacttatcct tctcttgatg tttggggcca aggcaccctg 360 gtgacggtta gctcagcgtc gaccaaaggt ccaagcgtgt ttccgctggc tccgagcagc 420 aaaagcacca gcggcggcac ggctgccctg ggctgcctgg ttaaagatta tttcccggaa 480 ccagtcaccg tgagctggaa cagcggggcg ctgaccagcg gcgtgcatac ctttccggcg 540 gtgctgcaaa gcagcggcct gtatagcctg agcagcgttg tgaccgtgcc gagcagcagc 600 ttaggcactc agacctatat ttgcaacgtg aaccataaac cgagcaacac caaagtggat 660 aaaaaagtgg aaccgaaaag c 681 <210> 154 <211> 645 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 154 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gaatattaat tattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgat gctttttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tcttggtctg ttcctccttt tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg gtggctgctc cgagcgtgtt tatttttccg 360 ccgagcgatg aacaactgaa aagcggcacg gcgagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttt 420 tatccgcgtg aagcgaaagt tcagtggaaa gtagacaacg cgctgcaaag cggcaacagc 480 caggaaagcg tgaccgaaca ggatagcaaa gatagcacct attctctgag cagcaccctg 540 accctgagca aagcggatta tgaaaaacat aaagtgtatg cgtgcgaagt gacccatcaa 600 ggtctgagca gcccggtgac taaatctttt aatcgtggcg aggcc 645 <210> 155 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 155 Ser Tyr Thr Phe Ser 1 5 <210> 156 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 156 Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 157 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 157 Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu Asp Val 1 5 10 15 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 158 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 159 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 159 Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 160 Gln Gln Ser Ile Ala Val Pro Pro Phe Thr 1 5 10 <210> 161 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 161 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 162 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 162 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Ala Val Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 163 <211> 227 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 163 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Leu Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Lys Gly Ala Phe Tyr Tyr Met Ser Thr Tyr Pro Ser Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser 225 <210> 164 <211> 215 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 164 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Ala Val Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 165 <211> 375 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 165 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatactt tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcaat atccttccga tttttggcga tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtaataag 300 ggtgcttttt attatatgtc tacttatcct tctcttgatg tttggggcca aggcaccctg 360 gtgacggtta gctca 375 <210> 166 <211> 324 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 166 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gaatattaat tattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgat gctttttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tctattgctg ttcctccttt tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaa 324 <210> 167 <211> 681 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 167 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatactt tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcaat atccttccga tttttggcga tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtaataag 300 ggtgcttttt attatatgtc tacttatcct tctcttgatg tttggggcca aggcaccctg 360 gtgacggtta gctcagcgtc gaccaaaggt ccaagcgtgt ttccgctggc tccgagcagc 420 aaaagcacca gcggcggcac ggctgccctg ggctgcctgg ttaaagatta tttcccggaa 480 ccagtcaccg tgagctggaa cagcggggcg ctgaccagcg gcgtgcatac ctttccggcg 540 gtgctgcaaa gcagcggcct gtatagcctg agcagcgttg tgaccgtgcc gagcagcagc 600 ttaggcactc agacctatat ttgcaacgtg aaccataaac cgagcaacac caaagtggat 660 aaaaaagtgg aaccgaaaag c 681 <210> 168 <211> 645 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 168 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gaatattaat tattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgat gctttttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tctattgctg ttcctccttt tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg gtggctgctc cgagcgtgtt tatttttccg 360 ccgagcgatg aacaactgaa aagcggcacg gcgagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttt 420 tatccgcgtg aagcgaaagt tcagtggaaa gtagacaacg cgctgcaaag cggcaacagc 480 caggaaagcg tgaccgaaca ggatagcaaa gatagcacct attctctgag cagcaccctg 540 accctgagca aagcggatta tgaaaaacat aaagtgtatg cgtgcgaagt gacccatcaa 600 ggtctgagca gcccggtgac taaatctttt aatcgtggcg aggcc 645 <210> 169 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 169 Ser Tyr Ser Met His 1 5 <210> 170 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 170 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 171 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 171 Met Leu Arg Phe Asp Val 1 5 <210> 172 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 172 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 173 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 173 Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 174 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 174 Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Ser Asp Ser Pro Val 1 5 10 <210> 175 <211> 115 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 175 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Leu Arg Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 176 <211> 111 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 176 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr 85 90 95 Ser Asp Ser Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 177 <211> 217 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 177 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Leu Arg Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 <210> 178 <211> 216 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 178 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr 85 90 95 Ser Asp Ser Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala 210 215 <210> 179 <211> 345 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 179 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggata tacctttact tcttattcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcctt atcaatccgt ataatggcaa tacgcattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatg acccgtgata ccagcattag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtatgctt 300 cgttttgatg tttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctca 345 <210> 180 <211> 333 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 180 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatggtggt ggttataatt atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtgttt ctaatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagacttata ctcgttattc tgattctcct 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt ctt 333 <210> 181 <211> 651 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 181 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggata tacctttact tcttattcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcctt atcaatccgt ataatggcaa tacgcattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatg acccgtgata ccagcattag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtatgctt 300 cgttttgatg tttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctcagcgtc gaccaaaggt 360 ccaagcgtgt ttccgctggc tccgagcagc aaaagcacca gcggcggcac ggctgccctg 420 ggctgcctgg ttaaagatta tttcccggaa ccagtcaccg tgagctggaa cagcggggcg 480 ctgaccagcg gcgtgcatac ctttccggcg gtgctgcaaa gcagcggcct gtatagcctg 540 agcagcgttg tgaccgtgcc gagcagcagc ttaggcactc agacctatat ttgcaacgtg 600 aaccataaac cgagcaacac caaagtggat aaaaaagtgg aaccgaaaag c 651 <210> 182 <211> 648 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 182 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatggtggt ggttataatt atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtgttt ctaatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagacttata ctcgttattc tgattctcct 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg 360 acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg 420 attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480 aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600 acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcc 648 <210> 183 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 183 Gly Tyr Tyr Ile Asn 1 5 <210> 184 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 184 Ile Ile Ser Pro Asn Gln Gly Thr Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 185 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 185 Gly Asn Tyr Asp His Leu Asp Tyr 1 5 <210> 186 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 186 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 187 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 187 Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 188 Gln Gln Asp Trp His Thr Leu Pro Val Thr 1 5 10 <210> 189 <211> 117 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 189 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Ser Pro Asn Gln Gly Thr Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Asp His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 190 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 190 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Trp His Thr Leu Pro 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 191 <211> 219 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 191 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Ser Pro Asn Gln Gly Thr Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Asp His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 <210> 192 <211> 215 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 192 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Trp His Thr Leu Pro 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 193 <211> 351 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 193 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggata tacctttact ggttattata ttaattgggt ccgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcatt atctctccga atcagggcac tacgggttac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatg acccgtgata ccagcattag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggtaat 300 tatgatcatc ttgattattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 194 <211> 324 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 194 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgat gcttctactt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacttatta ttgccagcag gattggcata ctcttcctgt tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaa 324 <210> 195 <211> 657 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 195 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggata tacctttact ggttattata ttaattgggt ccgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcatt atctctccga atcagggcac tacgggttac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatg acccgtgata ccagcattag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggtaat 300 tatgatcatc ttgattattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agcgtcgacc 360 aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct 420 gccctgggct gcctggttaa agattatttc ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc 480 ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat 540 agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc agcagcttag gcactcagac ctatatttgc 600 aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa gtggataaaa aagtggaacc gaaaagc 657 <210> 196 <211> 645 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 196 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgat gcttctactt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacttatta ttgccagcag gattggcata ctcttcctgt tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg gtggctgctc cgagcgtgtt tatttttccg 360 ccgagcgatg aacaactgaa aagcggcacg gcgagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttt 420 tatccgcgtg aagcgaaagt tcagtggaaa gtagacaacg cgctgcaaag cggcaacagc 480 caggaaagcg tgaccgaaca ggatagcaaa gatagcacct attctctgag cagcaccctg 540 accctgagca aagcggatta tgaaaaacat aaagtgtatg cgtgcgaagt gacccatcaa 600 ggtctgagca gcccggtgac taaatctttt aatcgtggcg aggcc 645 <210> 197 <211> 645 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser 1 5 10 15 Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro 20 25 30 Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser 35 40 45 Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val 50 55 60 Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg 65 70 75 80 Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu 85 90 95 Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly Tyr Leu Phe Ile Gln Thr 100 105 110 Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Leu Tyr Arg Ile Phe 115 120 125 Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly Arg Thr Val Met Val Asn 130 135 140 Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys Gln Asp Ser Leu Ser Ser 145 150 155 160 Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser Trp Asp Ile Pro Glu Leu 165 170 175 Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro 180 185 190 Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro 195 200 205 Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr 210 215 220 Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Phe Leu Tyr Gly 225 230 235 240 Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile Phe Gly Ile Gln Asp Gly 245 250 255 Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu Lys Arg Ile Pro Ile Glu 260 265 270 Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg Lys Val Leu Leu Asp Gly 275 280 285 Val Gln Asn Leu Arg Ala Glu Asp Leu Val Gly Lys Ser Leu Tyr Val 290 295 300 Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser Asp Met Val Gln Ala Glu 305 310 315 320 Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr 325 330 335 Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met Pro Phe Asp Leu Met Val 340 345 350 Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Arg Val Pro Val Ala 355 360 365 Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu Thr Gln Gly Asp Gly Val 370 375 380 Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser Gln Lys Pro Leu Ser Ile 385 390 395 400 Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser Glu Ala Glu Gln Ala Thr 405 410 415 Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr Val Gly Asn Ser Asn Asn 420 425 430 Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu Leu Arg Pro Gly Glu Thr 435 440 445 Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp Arg Ala His Glu Ala Lys 450 455 460 Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn Lys Gly Arg Leu Leu Lys 465 470 475 480 Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu Pro 485 490 495 Leu Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser Phe Arg Leu Val Ala Tyr 500 505 510 Tyr Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg Glu Val Val Ala Asp Ser 515 520 525 Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val Gly Ser Leu Val Val Lys 530 535 540 Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val Pro Gly Gln Gln Met Thr 545 550 555 560 Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg Val Val Leu Val Ala Val 565 570 575 Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys Asn Lys Leu Thr Gln Ser 580 585 590 Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp Ile Gly Cys Thr Pro Gly 595 600 605 Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser Asp Ala Gly Leu Thr Phe 610 615 620 Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln Arg Ala Glu Leu Gln Cys 625 630 635 640 Pro Gln Pro Ala Ala 645 <210> 198 <211> 915 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Ser Asn Leu Asp Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 Ser Glu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu 20 25 30 Pro Pro Lys Asn Gly Ile Ser Thr Lys Leu Met Asn Ile Phe Leu Lys 35 40 45 Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser Met Ser Asp Lys 50 55 60 Lys Gly Ile Cys Val Ala Asp Pro Phe Glu Val Thr Val Met Gln Asp 65 70 75 80 Phe Phe Ile Asp Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val Arg Asn Glu Gln 85 90 95 Val Glu Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu 100 105 110 Lys Val Arg Val Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala 115 120 125 Thr Thr Lys Arg Arg His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Val Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys Thr Gly Leu Gln 145 150 155 160 Glu Val Glu Val Lys Ala Ala Val Tyr His His Phe Ile Ser Asp Gly 165 170 175 Val Arg Lys Ser Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Ile Arg Met Asn Lys 180 185 190 Thr Val Ala Val Arg Thr Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly 195 200 205 Val Gln Lys Glu Asp Ile Pro Pro Ala Asp Leu Ser Asp Gln Val Pro 210 215 220 Asp Thr Glu Ser Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly Thr Pro Val Ala 225 230 235 240 Gln Met Thr Glu Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile 245 250 255 Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro 260 265 270 Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys 275 280 285 Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly 290 295 300 Tyr Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala 305 310 315 320 Phe Val Lys Arg Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys 325 330 335 Val Phe Ser Leu Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu 340 345 350 Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly 355 360 365 Val Phe Gln Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly 370 375 380 Leu Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu 385 390 395 400 Ile Ser Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser 405 410 415 Leu Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr 420 425 430 Met Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu 435 440 445 Ala Gln Met Gly Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr 450 455 460 Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr 465 470 475 480 Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys 485 490 495 Asp Phe Asp Phe Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg 500 505 510 Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe 515 520 525 Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Asp His Gln Glu Leu 530 535 540 Asn Leu Asp Val Ser Leu Gln Leu Pro Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr 545 550 555 560 His Arg Ile His Trp Glu Ser Ala Ser Leu Leu Arg Ser Glu Glu Thr 565 570 575 Lys Glu Asn Glu Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys Gly Gln Gly 580 585 590 Thr Leu Ser Val Val Thr Met Tyr His Ala Lys Ala Lys Asp Gln Leu 595 600 605 Thr Cys Asn Lys Phe Asp Leu Lys Val Thr Ile Lys Pro Ala Pro Glu 610 615 620 Thr Glu Lys Arg Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile 625 630 635 640 Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp Ala Thr Met Ser Ile Leu Asp 645 650 655 Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln 660 665 670 Leu Ala Asn Gly Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Glu Leu Asp Lys 675 680 685 Ala Phe Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu Asp Lys Val Ser 690 695 700 His Ser Glu Asp Asp Cys Leu Ala Phe Lys Val His Gln Tyr Phe Asn 705 710 715 720 Val Glu Leu Ile Gln Pro Gly Ala Val Lys Val Tyr Ala Tyr Tyr Asn 725 730 735 Leu Glu Glu Ser Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro Glu Lys Glu Asp Gly 740 745 750 Lys Leu Asn Lys Leu Cys Arg Asp Glu Leu Cys Arg Cys Ala Glu Glu 755 760 765 Asn Cys Phe Ile Gln Lys Ser Asp Asp Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg 770 775 780 Leu Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg 785 790 795 800 Leu Val Lys Val Gln Leu Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met Ala 805 810 815 Ile Glu Gln Thr Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val Gly Gln 820 825 830 Gln Arg Thr Phe Ile Ser Pro Ile Lys Cys Arg Glu Ala Leu Lys Leu 835 840 845 Glu Glu Lys Lys His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser Ser Asp Phe Trp 850 855 860 Gly Glu Lys Pro Asn Leu Ser Tyr Ile Ile Gly Lys Asp Thr Trp Val 865 870 875 880 Glu His Trp Pro Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Glu Glu Asn Gln Lys 885 890 895 Gln Cys Gln Asp Leu Gly Ala Phe Thr Glu Ser Met Val Val Phe Gly 900 905 910 Cys Pro Asn 915

Claims (38)

  1. 인간 또는 시노몰구스 보체 C3b 단백질에 특이적으로 결합하며, 100 pM 이하의 KD로 인간 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 또한 250 pM 이하의 KD로 시노몰구스 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 10 pM 이하의 KD로 인간 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 2 pM 이하의 KD로 인간 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 용혈 검정에 의해 측정되는 바와 같이 65 nM 이하의 IC50으로 인간 대체 보체 경로를 억제하는 단리된 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 C3b 침착에 의해 측정되는 바와 같이 50 nM 이하의 IC50으로 인간 대체 보체 경로를 억제하는 단리된 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 막 공격 복합체의 침착에 의해 측정되는 바와 같이 5 nM 이하의 IC50으로 인간 대체 보체 경로를 억제하는 단리된 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, C3a 및 C5a의 생성에 의해 측정되는 바와 같이 100 nM 이하의 IC50으로 대체 보체 경로를 억제하는 단리된 항체.
  9. 제1항에 있어서, 인간 또는 시노몰구스 보체 C3b 단백질에 특이적으로 결합하며, 표 1에 기재된 항체와 교차 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 단리된 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체인 단리된 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체인 단리된 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 쇄 항체인 단리된 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편 또는 ScFv 단편인 단리된 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 이소형인 단리된 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환되어 있는 프레임워크를 포함하는 단리된 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, C3에 결합하는 상기 항체의 친화도보다 1000배 이상 더 큰 친화도로 C3b에 결합하는 단리된 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1; 서열 2, 16, 30, 44, 58, 72, 86, 100, 114, 128, 142, 156, 170 및 184로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2; 및 서열 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171 및 185로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하며, 보체 단백질 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하며, 상기 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 보체 단백질 C3b에 결합하는 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  20. 제18항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 서열 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, 116, 130, 144, 158, 172 및 186으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 19, 33, 47, 61, 75, 89, 103, 117, 131, 145, 159, 173 및 187로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 20, 34, 48, 62, 76, 90, 104, 118, 132, 146, 160, 174 및 188로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 추가로 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함하며, 보체 단백질 C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9, 23, 37, 51, 65, 79, 93, 107, 121, 135, 149, 163, 177 및 191로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하며, C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하며, C3b에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  27. 제25항에 있어서, 서열 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, 122, 136, 150, 164, 178 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 추가로 포함하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  29. 서열 7, 21, 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119, 133, 147, 161, 175 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  30. 서열 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  31. 제27항 또는 제28항의 핵산을 포함하는 벡터.
  32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 서열, 및 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 서열을 포함하고, 상기 DNA 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되며 숙주 세포에서 발현될 수 있는 것인, 단리된 숙주 세포.
  33. 제30항에 있어서, 상기 항체가 인간 모노클로날 항체인 단리된 숙주 세포.
  34. 제30항에 있어서, 비-인간 포유동물 세포인 단리된 숙주 세포.
  35. 연령 관련 황반 변성의 치료가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 연령 관련 황반 변성을 치료하는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  37. 대체 보체 경로의 억제가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 대체 보체 경로를 억제하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
KR1020117029046A 2009-05-06 2010-05-05 보체 단백질 ｃ３ｂ를 표적화하는 항체를 위한 조성물 및 방법 KR20120088551A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17586009P 2009-05-06 2009-05-06
US61/175,860 2009-05-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120088551A true KR20120088551A (ko) 2012-08-08

Family

ID=43063291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117029046A KR20120088551A (ko) 2009-05-06 2010-05-05 보체 단백질 ｃ３ｂ를 표적화하는 항체를 위한 조성물 및 방법

Country Status (22)

Country Link
US (1) US20100291106A1 (ko)
EP (1) EP2427491A2 (ko)
JP (1) JP2012525829A (ko)
KR (1) KR20120088551A (ko)
CN (1) CN102459334A (ko)
AR (1) AR076655A1 (ko)
AU (1) AU2010252156A1 (ko)
CA (1) CA2760757A1 (ko)
CL (1) CL2011002756A1 (ko)
CO (1) CO6440515A2 (ko)
EA (1) EA201101593A1 (ko)
EC (1) ECSP11011445A (ko)
IL (1) IL216061A0 (ko)
MA (1) MA33402B1 (ko)
MX (1) MX2011011754A (ko)
PE (1) PE20120899A1 (ko)
SG (1) SG175432A1 (ko)
TN (1) TN2011000528A1 (ko)
TW (1) TW201043638A (ko)
UY (1) UY32612A (ko)
WO (1) WO2010136311A2 (ko)
ZA (1) ZA201107551B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023132547A1 (ko) * 2022-01-05 2023-07-13 주식회사 카나프테라퓨틱스 혈관신생 억제제가 결합된 항-c3b 항체 또는 항-c5 항체 및 이의 용도

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005107708A1 (en) 2004-04-30 2005-11-17 Allergan, Inc. Biodegradable intravitreal tyrosine kinase inhibitors implants
ES2523640T3 (es) 2006-06-21 2014-11-28 Musc Foundation For Research Development Direccionamiento del factor H del complemento para el tratamiento de enfermedades
RS20120461A1 (en) 2009-07-02 2013-06-28 Musc Foundation For Research Development METHODS FOR STIMULATION OF LIVER REGENERATION
US10239937B2 (en) 2009-11-05 2019-03-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, hemolytic anemias and disease states involving intravascular and extravascular hemolysis
NZ603560A (en) 2010-05-14 2014-09-26 Univ Colorado Regents Improved complement receptor 2 (cr2) targeting groups
EP2585110A4 (en) 2010-06-22 2014-01-22 Univ Colorado Regents ANTIBODIES AGAINST THE C3D FRAGMENT OF COMPONENT COMPONENT 3
EP2646821A4 (en) * 2010-11-29 2015-09-23 Novelmed Therapeutics Inc NEOANTIC BODY FOR THE DIAGNOSIS OF TISSUE INJURY
CA2869477C (en) * 2012-04-03 2020-06-09 Novelmed Therapeutics, Inc. Humanized and chimeric anti-factor c3 antibodies and uses thereof
US10413620B2 (en) 2012-08-17 2019-09-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Light-emitting versions of the monoclonal antibody to C3D (MAB 3D29) for imaging
AU2013302441B2 (en) 2012-08-17 2018-05-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for detecting complement activation
AU2013334229B2 (en) * 2012-10-25 2018-02-15 Bioverativ Usa Inc. Anti-complement C1s antibodies and uses thereof
KR20150088853A (ko) 2012-11-29 2015-08-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 활성화 단백질 c에 대한 인간화 모노클로날 항체 및 그의 용도
CA2897334A1 (en) 2013-03-29 2014-10-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
KR102448976B1 (ko) 2013-08-07 2022-09-29 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 비정형적 용혈성 요독증후군 (ahus) 바이오마커 단백질
CA2926812A1 (en) * 2013-10-07 2015-04-16 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods of preventing or reducing photoreceptor cell death
CA2934462A1 (en) * 2013-12-24 2015-07-02 Novelmed Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating ocular diseases
JP6643244B2 (ja) 2014-02-27 2020-02-12 アラーガン、インコーポレイテッドＡｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 補体因子Ｂｂ抗体
WO2017087391A1 (en) 2015-11-17 2017-05-26 Bayer Healthcare, Llc Epitope of optimized humanized monoclonal antibodies against activated protein c and uses thereof
US11007254B2 (en) 2016-10-17 2021-05-18 Musc Foundation For Research Development Compositions and methods for treating central nervous system injury
US11136381B2 (en) * 2018-04-03 2021-10-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Anti-C3 antibodies
EP3801772A1 (en) * 2018-06-11 2021-04-14 Aarhus Universitet Single domain antibodies for complement regulation
GB2583560A (en) 2018-12-11 2020-11-04 Admirx Inc Fusion protein constructs for complement associated disease
CA3214281A1 (en) * 2021-03-19 2022-09-22 Elpis Biopharmaceuticals Antibodies specific to sialic acid-binding ig-like lectin 15 and uses thereof
CN114874329A (zh) * 2022-05-19 2022-08-09 江苏大学 一种补体活化C1s酶荧光检测试剂盒及检测方法与应用
US20240228652A9 (en) * 2022-09-20 2024-07-11 Visterra, Inc. Treatment of complement mediated diseases and disorders with c3b antibodies
WO2024108529A1 (en) * 2022-11-25 2024-05-30 Linno Pharmaceuticals Inc. Properdin binding protein and use thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE452065B (sv) * 1986-04-11 1987-11-09 Ulf R Nilsson Antikroppspreparation vars antikroppar er specifika for determinanter i c3 b regionen hos denaturerat humant c3 samt dess anvendning och framstellning
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
DK2026073T3 (en) * 2000-04-29 2016-07-25 Univ Iowa Res Found Diagnosis and treatment of macular degeneration-related disorders
US7838165B2 (en) * 2004-07-02 2010-11-23 Kabushiki Kaisha Toshiba Carbon fiber synthesizing catalyst and method of making thereof
WO2006012621A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for regulating the alternative pathway of complement
KR20070086896A (ko) * 2004-12-02 2007-08-27 도만티스 리미티드 항­ｉｌ­1ｒ1 단일 도메인 항체 및 치료적 용도
SI2860192T1 (en) * 2005-10-12 2018-04-30 Morphosys Ag Generating and profiling fully human HuCAL GOLD-specific therapeutic antibodies specific to human CD38
GB0613209D0 (en) * 2006-07-03 2006-08-09 Ucb Sa Methods
US8192742B2 (en) * 2007-03-23 2012-06-05 NovelMed Therapeutics Method of inhibiting complement activation with human anti-factor C3 antibodies and use thereof
BRPI0812767A2 (pt) * 2007-06-07 2014-12-02 Genentech Inc Anticorpos para c3b e métodos para prevenção e tratamento de distúrbios associados ao complemento
CL2008003241A1 (es) * 2007-11-02 2009-07-31 Novartis Ag Molecula de enlace que comprende una porcion de enlace de antigeno que se enlaza con un neoepitopo de c3b; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar trastornos oculares

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023132547A1 (ko) * 2022-01-05 2023-07-13 주식회사 카나프테라퓨틱스 혈관신생 억제제가 결합된 항-c3b 항체 또는 항-c5 항체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
EA201101593A1 (ru) 2012-06-29
WO2010136311A2 (en) 2010-12-02
ZA201107551B (en) 2012-07-25
CO6440515A2 (es) 2012-05-15
MA33402B1 (fr) 2012-07-03
WO2010136311A3 (en) 2011-05-26
IL216061A0 (en) 2012-01-31
ECSP11011445A (es) 2012-01-31
EP2427491A2 (en) 2012-03-14
SG175432A1 (en) 2011-12-29
CN102459334A (zh) 2012-05-16
US20100291106A1 (en) 2010-11-18
MX2011011754A (es) 2011-11-29
AU2010252156A1 (en) 2011-11-10
TW201043638A (en) 2010-12-16
JP2012525829A (ja) 2012-10-25
PE20120899A1 (es) 2012-08-03
CA2760757A1 (en) 2010-12-02
TN2011000528A1 (en) 2013-05-24
CL2011002756A1 (es) 2012-03-23
AR076655A1 (es) 2011-06-29
UY32612A (es) 2010-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20120088551A (ko) 보체 단백질 ｃ３ｂ를 표적화하는 항체를 위한 조성물 및 방법
TWI417107B (zh) 標靶為補體蛋白質ｃ５之抗體之組合物及方法
KR102159843B1 (ko) 인자 p를 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법
KR101836501B1 (ko) 근육 성장을 증가시키기 위한 조성물 및 방법
JP2016513088A (ja) 補体関連疾患の予防及び治療のためのｃ５抗体及び方法
TW201536802A (zh) 凝集素樣氧化型ｌｄｌ受體１抗體及使用方法
JP2024026159A (ja) アクチビン２型受容体結合タンパク質及びその使用
US20210395390A1 (en) Reversal agents for neutralizing the therapeutic activity of anti-fxia antibodies
AU2014201433B2 (en) Compositions and methods for antibodies targeting complement protein C5

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid