KR102448976B1 - 비정형적 용혈성 요독증후군 (ahus) 바이오마커 단백질 - Google Patents

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안질리 쿠크레자
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얀 얀
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Abstract

본원은 그의 농도 또는 활성 수준의 변화가 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS) 또는 보체 억제제를 사용하는 aHUS의 임상적으로 유의한 치료와 연관된 바이오마커 단백질을 제공한다. 생물학적 유체 내에서 하나 이상의 바이오마커 단백질의 농도 및/또는 활성을 조사하기 위한 조성물 및 방법을 또한 제공한다. 조성물 및 방법은 특히, aHUS가 발생할 위험을 평가하고/하거나, aHUS를 진단하고/하거나, 대상체가 aHUS의 최초 급성 징후를 겪는지 결정하고/하거나, aHUS의 진행 또는 완화를 모니터링하고/하거나, 보체 억제제를 사용하는 치료에 대한 반응을 모니터링하거나 그러한 치료를 최적화하기 위해 유용하다.

Description

비정형적 용혈성 요독증후군 (AHUS) 바이오마커 단백질{ATYPICAL HEMOLYTIC UREMIC SYNDROME (AHUS) BIOMARKER PROTEINS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 각각 2013년 12월 6일 및 2013년 8월 7일 출원된 미국 특허 가출원 61/913,180 및 61/863,299을 기초로 한 우선권을 주장한다. 상기 출원 및 본원 명세서 전체에 걸쳐 인용되는 임의의 특허, 특허 출원 및 참고문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명의 분야는 의학, 면역학, 분자 생물학 및 단백질 화학이다.
용혈성 요독증후군 (HUS)은 혈소판 감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈, 및 급성 신부전을 특징으로 한다. HUS는 다음 두 종류 중 하나로 분류된다: 설사-연관 (D+ HUS; 시가 (shiga) 독소 생산 이. 콜라이(E. coli) (STEC)-HUS 또는 정형적 HUS로도 불림) 및 비-설사 또는 비정형적 HUS (aHUS). D+ HUS가 가장 흔한 형태로서, 90% 초과의 사례에 해당하고, 시가-유사 독소-생산 박테리아, 예를 들어, 이. 콜라이 O157:H7에 의한 선행 질병에 의해 발생한다. aHUS는 드물고 사망률이 25% 이하이다. 상기 질환에 걸린 많은 환자는 영구적인 신경학적 또는 신장 손상을 받을 것이고, 예를 들어, 적어도 50%의 aHUS 환자는 말기 신부전 (ESRF)으로 진행한다. 예를 들어, 문헌 [Kavanagh et al. (2006) British Medical Bulletin77 and 78:5-22]을 참고한다.
aHUS는 유전성, 후천성, 또는 특발성일 수 있다. 유전가능 형태의 aHUS는 예를 들어, 보체 인자 H (CFH), 막 보조인자 단백질 (MCP), 보체 인자 I (CFI), C4b-결합 단백질 (C4BP), 보체 인자 B (CFB), 및 보체 성분 3 (C3)을 포함한 많은 인간 보체 성분의 돌연변이와 연관될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Caprioli et al. (2006) Blood 108: 1267-1279]을 참고한다. CD55를 코딩하는 유전자 내의 특정 돌연변이는 아직 aHUS에 관련됨이 제시되지는 않았지만 aHUS의 중증도와 연관된다. 예를 들어, 문헌 [Esparza-Gordillo et al. (2005) HumMol Genet 14:703-712]을 참고한다.
최근까지, aHUS 환자에 대한 치료 방법은 제한되고, 종종 혈장 주입 또는 혈장 교환술을 수반하였다. 몇몇 경우에, aHUS 환자는 일측 또는 양측 신장절제술 또는 신장 이식을 겪는다 (문헌 [Artz et al. (2003) Transplantation 76:821-826] 참조). 그러나, 치료받은 환자에서 질환의 재발이 흔하다. 최근에, 약물 솔리리스(Soliris)®를 사용한 aHUS 환자의 치료가 미국 및 유럽에서 승인받았다. 최종적으로 aHUS 환자의 치료에 유용한 약물의 확보에도 불구하고, aHUS 환자를 진단하고, aHUS의 진행 및 완화를 모니터링할 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 개요
본 개시내용은 특히, 생물학적 유체 내의 그의 활성 및/또는 농도가 aHUS로 고생하는 환자 및/또는 보체 억제제 요법을 받은 aHUS 환자에서 비정상적인 다양한 단백질을 제공한다. 이하에서, 상기 단백질은 "aHUS-연관 바이오마커 단백질" 또는 "aHUS 바이오마커 단백질"로 언급된다. 예를 들어, 본 발명자들은 혈액 (예를 들어, 혈청 및/또는 혈장) 및 소변 내의 여러 단백질의 농도 및/또는 활성이 aHUS 환자에서 비정상임을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 길항제 항-C5 항체 (에쿨리주맙)를 인간에게 투여한 후, 상기 단백질의 하위세트의 농도가 변함을 관찰하였다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 단백질의 농도가 정상화된다. 개시내용이 임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 매이지 않지만, 본 발명자들은 보체 억제제 (예컨대 항-C5 항체)로 치료된 환자를 하나 이상의 상기 단백질 - aHUS 바이오마커 단백질 -의 농도 변화에 대해 모니터링하는 것이 예를 들어 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있는 환자의 진단을 위해 유용하다고 생각한다. 하나 이상의 상기 바이오마커 단백질의 상태의 모니터링은 또한 aHUS 환자가 보체 억제제를 사용한 요법에 반응할지를 결정하기 위해 유용할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바이오마커의 상태의 평가는 인간에서 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질의 농도에 대한 그의 효과 때문에 질환에 대한 임상적으로 효과를 달성하기 위해 충분한 (즉, 보체-연관 질환, 예컨대 aHUS의 치료를 위해 충분한) 보체 억제제, 예컨대 항-C5 항체의 용량 (역치 용량)의 확인에도 유용하다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)-연관 바이오마커 단백질의 상태를 모니터링하거나 평가하는 방법 또는 대상체에서 적어도 하나의 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)-연관 바이오마커 단백질의 농도 및 활성 수준 중의 하나 또는 둘 모두를 평가하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 유체에서 (i) 생물학적 유체 내의 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도 중의 하나 또는 둘 모두를 측정하는 것을 포함하고, 여기서 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 표 1에 제시된 임의의 바이오마커, 예를 들어 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택된 바이오마커이다. 대상체는 예를 들어 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 인간일 수 있다. 대상체는 보체의 억제제 (예를 들어, 보체 성분 C5의 억제제, 예컨대 항-C5 항체)로 치료된 (또는 치료되고 있는) 대상체일 수 있다. 치료는 대상체로부터 샘플을 얻기 전 1개월 미만 (예를 들어, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 미만) 내에 실시된 것일 수 있다. 이 방법은 대상체에 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있는지 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체가 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)로 치료되었거나 치료되고 있는 경우, 방법은 환자가 보체 억제제 요법에 (치료상) 반응성인지 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)-연관 바이오마커 단백질의 상태를 모니터링하거나 평가하는 방법 또는 대상체에서 적어도 하나의 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)-연관 바이오마커 단백질의 농도 및 활성 수준 중의 하나 또는 둘 모두를 평가하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 (A) 생물학적 유체 내의 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도를 대상체로부터 얻은 생물학적 유체에서 측정하고, 여기서 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 표 1에 제시된 임의의 바이오마커, 예를 들어 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택된 바이오마커이고; 및 (B) 측정(들)의 결과를 (예를 들어, 전자적 환자 기록으로) 기록하거나 또는 측정(들)의 결과를 대상체, 대상체의 보호자, 또는 대상체가 그의 관리 하에 있는 의료 전문가에게 통보하는 것을 포함한다. 대상체는 예를 들어 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 인간일 수 있다. 대상체는 보체의 억제제 (예를 들어, 보체 성분 C5의 억제제, 예컨대 항-C5 항체)로 치료된 (또는 치료되고 있는) 대상체일 수 있다. 치료는 대상체로부터 샘플을 얻기 전 1개월 미만 (예를 들어, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 미만) 내에 실시된 것일 수 있다. 이 방법은 대상체에 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있는지 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체가 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)로 치료되었거나 치료되고 있는 경우, 방법은 환자가 보체 억제제 요법에 (치료상) 반응성인지 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 환자가 혈전성 미세혈관병증이 발생할 위험이 있는지 모니터링하거나 결정하기 위한 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (A) 생물학적 유체 내의 혈전증 또는 응고와 연관된 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4개의) 바이오마커 단백질의 농도를 대상체로부터 얻은 생물학적 유체에서 측정하고, 여기서 바이오마커 단백질은 표 1 또는 표 11에 제시된 임의의 상기 바이오마커, 예를 들어 F1+2 또는 D-이량체이고; (B) 측정(들)의 결과를 (예를 들어, 전자적 환자 기록으로) 기록하거나 또는 측정(들)의 결과를 대상체, 대상체의 보호자, 또는 대상체가 그의 관리 하에 있는 의료 전문가에게 통보하는 것을 포함한다. 대상체는 예를 들어 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 인간일 수 있다. 대상체는 보체의 억제제 (예를 들어, 보체 성분 C5의 억제제, 예컨대 항-C5 항체)로 치료된 (또는 치료되고 있는) 대상체일 수 있다. 치료는 대상체로부터 샘플을 얻기 전 1개월 미만 (예를 들어, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 미만) 내에 실시된 것일 수 있다. 이 방법은 본원에서 설명되는 임의의 방법을 사용하여 대상체에 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있는지 결정하는 (또는 aHUS의 진단을 확인하는) 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체가 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)로 치료되었거나 치료되고 있는 경우, 방법은 환자가 보체 억제제 요법에 (치료상) 반응성인지, 즉, 하나 이상의 혈전증 또는 응고-연관 바이오마커의 농도의 감소가 보체 억제제를 사용한 치료 후에 발생하는지 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)-연관 바이오마커 단백질의 상태를 모니터링하거나 평가하는 방법 또는 대상체에서 적어도 하나의 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)-연관 바이오마커 단백질의 농도 및 활성 수준 중의 하나 또는 둘 모두를 평가하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (A) 생물학적 유체 내의 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도를 대상체로부터 얻은 생물학적 유체에서 측정하고, 여기서 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 표 1에 제시된 임의의 바이오마커, 예를 들어 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)로 이루어지는 군으로부터 선택된 바이오마커이고; (B) 측정(들)의 결과를 (예를 들어, 전자적 환자 기록으로) 기록하거나 또는 측정(들)의 결과를 대상체, 대상체의 보호자, 또는 대상체가 그의 관리 하에 있는 의료 전문가에게 통보하는 것을 포함한다. 대상체는 예를 들어 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 인간일 수 있다. 대상체는 보체의 억제제 (예를 들어, 보체 성분 C5의 억제제, 예컨대 항-C5 항체)로 치료된 (또는 치료되고 있는) 대상체일 수 있다. 치료는 대상체로부터 샘플을 얻기 전 1개월 미만 (예를 들어, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 미만) 내에 실시된 것일 수 있다. 이 방법은 대상체에 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있는지 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체가 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)로 치료되었거나 치료되고 있는 경우, 방법은 환자가 보체 억제제 요법에 (치료상) 반응성인지 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 임의의 방법은 대상체에 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있는지 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 하나의 Ba, sC5b-9, C5a, sCD40L, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, vWF, FABP-1, β2M, 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 알부민, NGAL, CXCL10, CXCL9, IL-18, TNFR1, VCAM-1, MCP-1, VEGF, CCL5, IL-6, IFNγ의 동일한 종류의 정상 대조군 생물학적 유체 내의 농도에 비해 상승한 농도는 대상체에 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있음을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 임의의 방법은 보체 억제제를 사용한 치료에 반응했는지 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, (a) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 감소한 적어도 하나의 CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, sC5b9, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL10, CXCL9, 및 KIM-1의 농도; 또는 (b) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 증가한 CCL5의 농도는 대상체가 억제제를 사용한 치료에 반응성임을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 보체 성분 C5의 억제제를 사용하는 치료에 대한 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)의 반응을 모니터링하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 생물학적 유체 내의 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도를 측정하고, 여기서 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 표 1에 제시된 임의의 바이오마커, 예를 들어 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택된 바이오마커이다. 생물학적 유체는 (i) aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 및 (ii) 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 성분 C5의 억제제를 사용하여 치료되고 있는 (또는 예를 들어 최근에 치료받은) 대상체로부터 얻는다. 상기 방법에 따르면, (a) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 감소한 적어도 하나의 CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL10, CXCL9, 및 KIM-1의 농도; 또는 (b) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 증가한 CCL5의 농도는 대상체가 억제제를 사용한 치료에 반응성임을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 임의의 방법은 대상체가 보체 억제제를 사용한 치료에 반응했는지 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 감소한 적어도 하나의 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)의 농도.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 보체 억제제를 사용하는 치료에 대한 대상체의 반응성을 모니터링하는 방법을 특징으로 하고, 여기서 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 유체 내의 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도를 결정하는 것을 포함하고, aHUS-연관 바이오마커 단백질은 CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, IL-6, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL9, KIM-1, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 대상체는 aHUS가 존재하거나 존재하는 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있고, 대상체는 보체 억제제를 사용하여 치료되었거나 치료되고 있다. (A) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 감소한 적어도 하나의 CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, IL-6, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL9, 및 KIM-1의 농도; 또는 (B) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 증가한 CCL5의 농도는 대상체가 억제제를 사용한 치료에 반응성임을 나타낸다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 생리학적 변화를 유도하기에 충분한 방식으로 보체 억제제를 사용하여 혈전증 또는 응고와 연관된 적어도 2개의 바이오마커 단백질의 수, 빈도 또는 TMA의 발생, 발생 가능성, 또는 발생 위험을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 유체 내의 적어도 2개의 바이오마커 단백질의 농도를 결정하고, 여기서 바이오마커 단백질은 표 1 또는 11로부터 선택되고 혈전증 및/또는 응고 (예를 들어, D-이량체 또는 F1+2)와 관련되고; (b) TMA가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 대상체에게 보체의 억제제를 적어도 2개의 각각의 바이오마커 단백질의 생리학적 변화를 유발하기에 충분한 양과 빈도로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 생리학적 변화는 보체 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동등한 생물학적 샘플 내의 마커의 농도에 비해 적어도 2개의 바이오마커 단백질의 농도의 감소이다. 이 방법은 치료 전 및 후에 바이오마커의 농도를 모두 측정하는 것을 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제를 사용하여 치료된 aHUS 환자가 (i) 상이한 보체 억제제를 사용한 치료, 또는 (ii) 상이한 투여 일정 하에 동일한 보체 억제제를 사용한 치료를 필요로 하는지 결정하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (A) aHUS 환자가 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제를 사용한 치료에 반응성인지 결정하고, 여기서 결정은 생물학적 유체 내의 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도 및 활성 중의 하나 또는 둘 모두를 대상체로부터 얻은 생물학적 유체에서 측정하는 것을 포함하고, aHUS-연관 바이오마커 단백질은 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택되고, (a) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 감소한 적어도 하나의 CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, sC5b9, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL10, CXCL9, 및 KIM-1의 농도; 또는 (b) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 증가한 CCL5의 농도는 대상체가 억제제를 사용한 치료에 반응성임을 나타내고; (B) 환자가 보체 억제제를 사용한 치료에 반응성이 아니면, 환자에게 상이한 보체 억제제를 또는 미리 결정된 투여 일정에 비해 보다 많은 용량 또는 보다 빈번한 투여 일정으로 동일한 보체 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제를 사용하여 치료된 aHUS 환자가 (i) 상이한 보체 억제제를 사용한 치료, 또는 (ii) 상이한 투여 일정 하에 동일한 보체 억제제를 사용한 치료를 필요로 하는지 결정하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (A) aHUS 환자가 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제를 사용한 치료에 반응성인지 결정하고, 여기서 결정은 생물학적 유체 내의 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도 및 활성 중의 하나 또는 둘 모두를 대상체로부터 얻은 생물학적 유체에서 측정하는 것을 포함하고, aHUS-연관 바이오마커 단백질은 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, (a) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 감소한 적어도 하나의 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)의 농도는 대상체가 억제제를 사용한 치료에 반응성임을 나타내고; (B) 환자가 보체 억제제를 사용한 치료에 반응성이 아니면, 환자에게 상이한 보체 억제제를 또는 미리 결정된 투여 일정에 비해 보다 많은 용량 또는 보다 빈번한 투여 일정으로 동일한 보체 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
하나 이상의 단백질의 농도는 예를 들어, 면역검정 (예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성 면역검정 (RIA), 웨스턴 블로팅 (Western blotting), 또는 도트 블로팅) 또는 세포측정 비드 어레이 (CBA; 실시예 참조)를 이용하여 측정할 수 있다. 그러한 방법 및 방법을 수행하기 위해 유용한 키트는 본원에서 설명된다. vWF의 활성을 측정하기 위해 적합한 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 및 본원에서 설명된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 적어도 5개의 개별 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 적어도 10개의 개별 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 적어도 15개의 개별 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 적어도 20개의 개별 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 측정된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 유체는 혈액이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 유체는 혈액 분획, 예를 들어, 혈청 또는 혈장이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 유체는 소변이다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 모든 측정은 하나의 생물학적 유체에 대해 수행된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 측정은 대상체로부터 얻은 적어도 2개의 상이한 생물학적 유체에 대해 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 개별 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 측정되고, 제1 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도는 한 종류의 생물학적 유체에서 측정되고, 제2 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 제2 종류의 생물학적 유체에서 측정된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, 및 IL-12 p70 중 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4개의 또는 모든) 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, Ba 및 sC5b9 둘 모두의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, C5a 및 C5b9 중의 하나 또는 둘 모두의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, β2M, 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 및 FABP-1 중 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6개의, 또는 모든) 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, CXCL10, CXCL9, 및/또는 KIM-1의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, D-이량체 및 F1+2 중의 하나 또는 둘 모두의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, sCD40L, 프로트롬빈 단편 F1+2, 및 D-이량체 중 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4개의 또는 모든) 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린, VCAM-1, 및/또는 vWF의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, CXCL10, MCP-1, 및/또는 TNFR1의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, 및 IL-12 p70 중 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4개의 또는 모든) 농도가 측정된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 CXCL9, CXCL10, IL-1 베타, IL-12 p70, IFN-γ, MCP-1, CCL5, sCD40L, 및/또는 sTNFR1의 농도는 대상체의 혈청 내에서 측정한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 보체 성분 C5a, sC5b9, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL10, CXCL9, 및/또는 KIM-1의 농도는 대상체의 소변 내에서 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 NGAL, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, 트롬보모듈린, 및/또는 폰 빌레브란트 인자 (vWF)의 농도는 대상체의 혈장 내에서 측정한다.
몇몇 실시양태에서, 2개 이상의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의) 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)의 농도가 측정된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, Ba, sC5b-9, 및 C5a로 이루어지는 군 중 적어도 2개의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, Ba 및 sC5b9 중의 하나 또는 둘 모두의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, C5a 및 C5b9 중의 하나 또는 둘 모두의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, β2M, 클러스테린, 시스타틴 C, 알부민, TIMP-1, NGAL, 및 FABP-1로 이루어지는 군의 적어도 2개의 개별적인 멤버의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, CXCL10, CXCL9, IL-18, MCP-1, TNFR1, VEGF, IL-6, 및 IFNγ로 이루어지는 군의 적어도 2개의 개별적인 멤버의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, d-이량체 및 F1+2 중의 하나 또는 둘 모두의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, sCD40L, 프로트롬빈 단편 F1+2, 및 d-이량체로 이루어지는 군의 적어도 2개의 개별적인 멤버의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린, VCAM-1, 또는 vWF의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, TNFR1의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, IFN-γ, CXCL10, CXCL9, IL-18, TNFR1, VCAM-1, MCP-1, VEGF, CCL5, 및 IL-6으로 이루어지는 군의 적어도 2개의 개별적인 멤버의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, IFN-γ, CXCL10, CXCL9, IL-18, TNFR1, VCAM-1, MCP-1, VEGF, 및 IL-6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL10, CXCL9, 알부민, 및 KTM-1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 aHUS-연관 바이오마커의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, CXCL10, CXCL9, IL-18, MCP-1, TNFR1, VEGF, IL-6, CCL5, IFNγ, IL-8, ICAM-1, IL-1 베타, 및 IL-12 p70으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, CXCL9, CXCL10, IL-1 베타, IL-12 p70, IFN-γ, MCP-1, CCL5, sCD40L, 또는 sTNFR1의 농도는 대상체의 혈청 내에서 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL10, CXCL9, 알부민, 및 KIM-1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 aHUS-연관 바이오마커의 농도는 대상체의 소변 내에서 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, NGAL, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, 트롬보모듈린, 또는 폰 빌레브란트 인자 (vWF)의 농도는 대상체의 혈장 내에서 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, Ba의 농도가 측정된다 (예를 들어, 대상체로부터 얻은 혈장 샘플 내에서).
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 aHUS 바이오마커 단백질 농도의 측정된 값(들)의 기록을 필요로 한다. 기록은 서면으로 작성되거나 컴퓨터 판독가능 매체에 작성될 수 있다. 방법은 또한 적어도 하나의 aHUS 바이오마커 단백질 농도의 측정된 값(들)을 대상체 및/또는 대상체가 그의 관리 하에 있는 의료 전문가에게 통보하는 것을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 임의의 방법은 대상체가 미리 결정된 투여 일정 하에 억제제를 사용한 치료에 반응성이 아니면, 대상체에게 미리 결정된 투여 일정에 비해 보다 많은 용량 또는 증가된 투여 빈도로 보체 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 부분적으로는 대상체의 체중을 기준으로 하여 미리 결정된 투여 일정 하에 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 길항제 항-C5 항체 (예를 들어, 에쿨리주맙)의 경우에, 체중이 40 kg 이상인 대상체에 대해 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 7주 동안 투여될 수 있다: 적어도 800 mg의 항체, 4주 연속으로 주당 1회; 적어도 800 mg의 항체, 제5주 동안 1회; 및 이후, 적어도 800 mg의 항체, 격주 1회. 몇몇 실시양태에서, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 7주 동안 투여된다: 적어도 900 mg의 항체, 4주 연속으로 주당 1회; 적어도 1200 mg의 항체, 제5주 동안 1회; 및 이후, 적어도 1200 mg의 항체, 격주 1회.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 체중이 40 kg 미만이지만 30 kg 이상인 대상체에 대해, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 7주 동안 투여될 수 있다: 적어도 500 mg의 항체, 2주 연속으로 주당 1회; 적어도 700 mg의 항체, 제3주 동안 1회; 및 이후, 적어도 700 mg의 항체, 격주 1회. 몇몇 실시양태에서, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 5주 동안 투여된다: 적어도 600 mg의 항체, 2주 연속으로 주당 1회; 적어도 900 mg의 항체, 제3주 동안 1회; 및 이후, 적어도 900 mg의 항체, 격주 1회.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 대상체의 체중은 30 kg 미만이지만 20 kg 이상이고, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 5주 동안 투여된다: 적어도 500 mg의 항체, 2주 연속으로 주당 1회; 적어도 500 mg의 항체, 제3주 동안 1회; 및 이후, 적어도 500 mg의 항체, 격주 1회. 몇몇 실시양태에서, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 5주 동안 투여된다: 적어도 600 mg의 항체, 2주 연속으로 주당 1회; 적어도 600 mg의 항체, 제3주 동안 1회; 및 이후, 적어도 600 mg의 항체, 격주 1회.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 대상체의 체중은 20 kg 미만이지만 10 kg 이상이고, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 4주 동안 투여된다: 적어도 500 mg의 항체, 1주 동안 1회; 적어도 200 mg의 항체, 제2주 동안 1회; 및 이후, 적어도 200 mg의 항체, 격주 1회. 몇몇 실시양태에서, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 4주 동안 투여된다: 적어도 600 mg의 항체, 1주 동안 1회; 적어도 300 mg의 항체, 제2주 동안 1회; 및 이후, 적어도 300 mg의 항체, 격주 1회.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 대상체의 체중은 10 kg 미만이지만 5 kg 이상이고, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 5주 동안 투여된다: 적어도 200 mg의 항체, 1주 동안 1회; 적어도 200 mg의 항체, 제2주 동안 1회; 및 이후, 적어도 200 mg의 항체, 3주마다 1회. 몇몇 실시양태에서, 항체는 대상체에게 다음 일정 하에 적어도 5주 동안 투여된다: 적어도 300 mg의 항체, 1주 동안 1회; 적어도 300 mg의 항체, 제2주 동안 1회; 및 이후, 적어도 300 mg의 항체, 3주마다 1회. aHUS에 대한 추가의 예시적인 항-C5 항체 투여 일정 (예를 들어, 장기 투여 일정)은 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 2010/054403 (예를 들어, WO 2010/054403의 표 1 및 2)를 참고한다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 억제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 소분자, 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 펩티드 모방체, 또는 앱타머이다. 몇몇 실시양태에서, 억제제는 하나 이상의 보체 성분 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 인자 D, 인자 B, 프로페르딘, MBL, MASP-1, MASP-2, 또는 임의의 이들의 생물학적 활성 단편을 억제하는 것일 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 C5a와 연관된 아나필락시스 독성 (anaphylatoxic) 활성의 생성 및/또는 C5b와 연관된 막 공격 복합체의 조립 중의 하나 또는 둘 모두를 억제한다.
조성물은 또한 천연 생성 또는 가용성 형태의 보체 억제 화합물, 예컨대 CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59, 인자 H, 코브라 독 인자, FUT-175, 콤플레스타틴, 및 K76 COOH를 함유할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 a) CR2 (예를 들어, 인간 CR2) 또는 그의 단편을 포함하는 CR2 부분, 및 b) FH 또는 그의 단편을 포함하는 FH 부분을 포함하는 보체 수용체 2 (CR2)-인자 H (FH) 분자일 수 있고, 여기서 CR2-FH 분자 또는 그의 단편은 CR2 리간드에 결합할 수 있고, CR2-FH 분자는 대체 경로의 보체 활성화를 억제할 수 있다. 예시적인 CR2-FH 융합 단백질은 예를 들어, 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 2007/149567 및 WO 2011/143637에 기재되고 예시되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 예를 들어, 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 2011/163412에 기재된 표적화 도메인, 예컨대 CR2 또는 항-C3d 항체를 포함한다. 표적화 도메인과 다른 보체 억제제, 예컨대 CD59, CD55, 및 인자 H-유사 분자의 융합은 보체 억제제로서 본원에서 설명되는 방법에 사용될 수 있다. 상기 WO 2011/163412를 참고한다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 보체의 억제제는 길항제 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화 항체, 재조합 항체, 디아바디 (diabody), 키메라화 (chimerized) 또는 키메라 항체, 모노클로날 항체, 탈면역화 (deimmunized) 항체, 완전 인간 항체, 단일쇄 항체, Fv 단편, Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab')2 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 길항제 항체는 항-C5 항체, 예컨대 에쿨리주맙이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 항체는 항-C5 항체의 C5-결합 단편인 펙셀리주맙이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 보체의 억제제는 MB12/22, MB12/22-RGD, ARC187, ARC1905, SSL7, 및 OmCI로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 의사가 그로부터 하나 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의) 농도를 결정할 수 있는 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 하위세트는 다음일 수 있다: Ba, 트롬보모듈린, VCAM-1, TNFR1, F1+2, D-이량체, CXCL10, IL-6, 클러스테린, TIMP-1, FABP-1, β2M, 및 시스타틴 C.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 다수의 결합제를 포함하는 어레이를 특징으로 하고, 여기서 다수의 각각의 결합제는 어레이 상에 특유한 주소 (address)를 갖고, 어레이는 500개 이하의 특유한 주소를 포함하고, 다수의 각각의 결합제는 상이한 생물학적 분석물 단백질에 결합하고, 어레이는 표 1에 제시된, 예를 들어 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택된 4개 이상의 분석물 단백질에 결합하는 결합제를 포함한다. 어레이는 본원에서 설명되는 임의의 방법에 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 어레이는 단백질 칩이다. 몇몇 실시양태에서, 어레이의 각각의 주소는 검정 플레이트의 웰. 몇몇 실시양태에서, 어레이의 각각의 주소는 그 위에 결합제가 고정된 입자 (예를 들어, 비드)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합제"는 항원 (예를 들어, aHUS 바이오마커 단백질)에 결합하는 임의의 천연 생성, 합성 또는 유전적으로 조작된 물질, 예컨대 단백질을 포함한다. 결합제는 천연 생성 항체이거나 이로부터 유래될 수 있다. 결합 단백질 또는 물질은 특이적 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 유사하게 기능할 수 있다. 결합제 또는 단백질은 항체의 단리된 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 어레이는 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의) 분석물 단백질에 결합하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 어레이는 적어도 2개의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의) 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)에 결합하는 결합제/항체를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 어레이는 200개 이하 (예를 들어, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20개 이하)의 특유한 주소를 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 설명되는 하나 이상의 임의의 어레이, 및 임의로, (a) 대상체로부터 생물학적 샘플 (예를 들어, 생물학적 유체)의 획득 및/또는 처리 및/또는 (b) 대상체로부터의 생물학적 샘플 (예를 들어, 생물학적 유체) 내의 하나 이상의 분석물의 측정을 위한 설명서를 포함하는 진단 키트를 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 검정 플레이트 및 (b) 각각 상이한 생물학적 분석물에 결합할 수 있는 적어도 3개의 결합제를 포함하는 진단 키트를 특징으로 하고, 여기서 분석물은 표 1에 제시된, 예를 들어 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다. 몇몇 실시양태에서, 진단 키트는 인간 혈장 내에서 vWF의 활성을 측정하기 위한 하나 이상의 수단을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체를 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)이 존재하거나 발생할 위험이 있는 것으로 진단하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도를 생물학적 유체 내에서 측정하는 것을 포함한다. 생물학적 유체는 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 것이다. 방법에 따르면, 동일한 종류의 정상 대조군 생물학적 유체 내의 농도에 비해 상승한 적어도 하나의 Ba, sC5b-9, C5a, sCD40L, 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, vWF, FABP-1, β2M, 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 알부민, NGAL, CXCL10, CXCL9, IL-18, TNFR1, VCAM-1, MCP-1, VEGF, CCL5, IL-6, 또는 IFNγ의 농도는 대상체에 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커는 표 11, 즉, 적어도 2개의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의) 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개체" 또는 "대상체"를 수식하기 위해 사용될 때 용어 "정상"은 특정 질환 또는 병태 (예를 들어, aHUS)가 존재하지 않고 또한 질환 또는 병태가 존재하거나 발생할 위험이 있는 것으로 의심되지 않는 개체 또는 개체의 군을 나타낸다. 용어 "정상"은 또한 본원에서 정상 또는 건강한 개체 또는 대상체 (또는 상기 대상체의 군)으로부터 단리된 생물학적 검체 또는 샘플 (예를 들어, 생물학적 유체)을 수식하기 위해 사용된다 (예를 들어 "정상 대조군 샘플" 또는 "정상 대조군 생물학적 유체").
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 환자가 최초 급성 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS) 징후를 경험하고 있는지 결정하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 D-이량체의 농도 (예를 들어, d-이량체의 혈장 농도) 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)의 농도 (예를 들어, FABP-1의 소변 농도) 중의 하나 또는 둘 모두를 측정하는 것을 포함하고, 여기서 정상 대조군 샘플 내의 d-이량체의 농도에 비해 상승한 d-이량체 농도, 및 정상 대조군 샘플 내의 FABP-1의 농도에 비해 상승한 FABP-1 농도는 aHUS 환자가 최초 급성 aHUS 징후를 경험하고 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, d-이량체 및 FABP-1 중의 하나 또는 둘 모두의 농도 증가는 유의한 증가일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)의 치료 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 대상체에게 보체의 억제제 (예를 들어, 보체 성분 C5의 억제제)를 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 생리학적 변화를 유발하기에 충분한 양과 빈도로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 생리학적 변화는 (a) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 감소한 적어도 하나의 CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, sC5b9, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL10, CXCL9, 및 KIM-1의 농도; 또는 (b) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 증가한 CCL5의 농도로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 하나의 aHUS-연관 바이오마커는 표 11로부터, 즉, 적어도 하나의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의) 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)로부터 선택될 수 있다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 생리학적 변화를 유도하기에 충분한 방식으로 보체 억제제를 사용하여 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 유체 내의 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도를 결정하고, 여기서 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, IL-6, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL9, KIM-1, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택되고; (b) aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 대상체에게 보체의 억제제를 적어도 2개의 각각의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 생리학적 변화를 유발하기에 충분한 양과 빈도로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 생리학적 변화는 (a) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 감소한 적어도 하나의 CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, IL-6, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL9, 및 KIM-1의 농도; 또는 (b) 억제제를 사용한 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해 증가한 대상체로부터 얻은 생물학적 유체 내의 CCL5의 농도로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 방법은 또한 생리학적 변화가 발생했는지 결정하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커는 표 11, 즉, 적어도 2개의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의) 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C,TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 방법은 생물학적 유체 내의 적어도 2개의 개별적인 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 생물학적 유체는 대상체로부터 얻는다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커는 표 11, 즉, 적어도 2개의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의) 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 임의의 방법은 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의) 생리학적 변화가 발생했는지 결정하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, 및 IL-12 p70의 농도가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, Ba 및 sC5b9 둘 모두의 농도가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, 각각의 C5a 및 sC5b9의 농도 (예를 들어, 소변 농도)가 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6개의, 또는 모든) β2M, 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 및 FABP-1의 농도 (예를 들어, 소변 농도)가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, CXCL10, CXCL9, 및/또는 KIM-1의 농도 (예를 들어, 소변 농도)가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, D-이량체 및 F1+2 중의 하나 또는 둘 모두의 농도 (예를 들어, 혈장 농도)가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3개의, 또는 모든) sCD40L, 프로트롬빈 단편 F1+2, 및 D-이량체의 농도 (예를 들어, 혈청 및/또는 혈장 농도)가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린, VCAM-1, 및/또는 vWF의 농도가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, CXCL10, MCP-1, 및 TNFR1의 농도 (예를 들어, 혈청 농도)가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4개의 또는 모든) IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, 및 IL-12 p70의 농도 (예를 들어, 혈청 농도)가 감소한다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 생리학적 변화는 표 11, 즉, 적어도 2개의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의) 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), C5a, 트롬보모듈린, VCAM-1, 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, sTNFR1, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, TIMP-1, 및 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1)로부터 선택되는 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커의 농도의 감소일 수 있다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, Ba 농도 (예를 들어, 혈장 Ba 농도)는 치료 개시 후 6주까지 적어도 10% 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, Ba 농도 (예를 들어, 혈장 Ba 농도)는 치료 개시 후 12주까지 적어도 30% 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, C5a 농도 (예를 들어, 소변 C5a 농도)는 치료 개시 후 3주까지 적어도 40% 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, C5a 농도 (예를 들어, 소변 C5a 농도)는 치료 개시 후 6주까지 적어도 70% 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, C5b-9 농도 (예를 들어, 소변 또는 혈장 C5b-9 농도)는 치료 개시 후 3주까지 적어도 50% 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, F1+2 농도 (예를 들어, F1+2의 혈장 농도)는 치료 개시 후 6주까지 적어도 20% 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, d-이량체 농도 (예를 들어, d-이량체의 혈장 농도)는 치료 개시 후 6주까지 적어도 40% 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린 농도 (예를 들어, 트롬보모듈린의 혈청 농도)는 치료 개시 후 12주까지 적어도 20% 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, VCAM-1 농도 (예를 들어, VCAM-1의 혈청 농도)는 치료 개시 후 12주까지 적어도 20% 감소한다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 보체의 억제제는 3개 이상의 aHUS-연관 바이오마커의 생리학적 변화를 유발하기에 충분한 양과 빈도로 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 보체의 억제제는 적어도 4개의 aHUS-연관 바이오마커의 생리학적 변화를 유발하기에 충분한 양과 빈도로 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 보체의 억제제는 적어도 5개의 aHUS-연관 바이오마커의 생리학적 변화를 유발하기에 충분한 양과 빈도로 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 보체의 억제제는 적어도 10개의 aHUS-연관 바이오마커의 생리학적 변화를 유발하기에 충분한 양과 빈도로 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 보체 성분 C5의 억제제는 적어도 15개 이상의 aHUS-연관 바이오마커의 생리학적 변화를 유발하기에 충분한 양과 빈도로 대상체에게 투여된다.
몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 또는 그 초과의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 생리학적 변화는 억제제의 투여 (예를 들어, 장기 투여) 후 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 6주, 2개월, 9주, 또는 3개월 또는 그 초과의 기간 내에 발생한다.
몇몇 실시양태에서, 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도는 억제제의 투여 후에 적어도 5% (예를 들어, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70%) 감소한다.
몇몇 실시양태에서, 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도는 하나 이상의 용량의 억제제의 투여 후에 바이오마커 단백질의 정상 농도의 50% (예를 들어, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1%) 내로 감소한다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, FABP-1 (예를 들어, 소변 FABP-1)의 농도는 인간 보체의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)의 투여 후에 적어도 80% (예를 들어, 85, 90, 95, 또는 100%까지) 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 시스타틴-C (예를 들어, 소변 시스타틴-C)의 농도는 인간 보체의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)의 투여 후에 적어도 80% (예를 들어, 85, 90, 95, 99, 또는 100%까지) 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 클러스테린 (예를 들어, 소변 클러스테린)의 농도는 인간 보체의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)의 투여 후에 적어도 80% (예를 들어, 85, 90, 95, 98, 또는 100%까지) 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba)의 농도는 인간 보체의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)의 투여 후에 적어도 10% (예를 들어, 15, 20, 25, 30, 또는 40%) 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, sTNFR1의 농도는 인간 보체의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)의 투여 후에 적어도 80% (예를 들어, 85, 90%, 또는 그 초과) 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린 또는 sVCAM-1의 농도는 인간 보체의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)의 투여 후에 적어도 80% (예를 들어, 85, 90, 95, 또는 100%까지) 감소한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, F1+2 또는 D-이량체 중의 하나 또는 둘 모두의 농도는 인간 보체의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)의 투여 후에 적어도 80% (예를 들어, 85, 90, 95%, 또는 그 초과) 감소한다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도는 억제제의 투여 후에 정상화된다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 3개의 β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL10, CXCL9, 및 KIM-1의 농도 (예를 들어, 소변 농도)는 정상화된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, aHUS 바이오마커 단백질의 농도 또는 활성에 대한 보체 억제제 요법의 효과의 측면에서 용어 "정상화된" 또는 이와 유사한 문법적 용어는 건강한 개체 (정상 개체)의 집단으로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플에서 측정된 aHUS 바이오마커 단백질의 평균 농도 또는 활성 범위의 50% (예를 들어, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1%) 이내인, 바이오마커 단백질의 생물학적 유체에서 측정된 농도 또는 활성을 나타낸다. 예를 들어, 보체 억제제를 사용한 aHUS 환자의 치료는 상승된 소변 클러스테린 농도를, 예를 들어 클러스테린의 정상 평균 소변 농도 범위의 20% 내로 정상화할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제를 사용한 치료는 소변 클러스테린의 농도를 클러스테린의 정상 평균 소변 농도 범위 내로 회복시킬 것이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 대상체는 억제제를 사용한 치료 전에 3개월 (예를 들어, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1주) 이내에 투석을 적어도 1회 (예를 들어, 적어도 2회, 3회, 4회, 또는 5회 또는 그 초과로) 받았다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서 대상체는 보체 억제제 요법 실시 2개월 전에 투석을 1회 받았다. 또 다른 예에서, 대상체는 보체 억제제 요법 실시 3개월 전에 투석을 3회 받은 대상체일 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 건강한 대상체에서의 농도에 비해, 하나 이상의 TNFR1, Ba, 트롬보모듈린 단편 F1+2, 및 sC5b9의 농도가 상승한다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 건강한 인간에서의 농도 (예를 들어, 소변 농도)에 비해, 하나 이상의 β2M, sC5b9, C5a, 시스타틴 C, 클러스테린, TIMP-1, 및 NGAL의 농도가 상승한다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 최초 급성 aHUS 징후를 경험하고 있다. 예를 들어, 보체 억제제를 사용한 치료 전에, 대상체는 정상 농도에 비해 상승한 D-이량체 및 FABP-1 중의 하나 또는 둘 모두의 농도를 보일 수 있다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 aHUS가 존재하지만 임상 관해 상태로 여겨지는 대상체이다 (예를 들어, 대상체는 정상 수준의 혈소판 또는 다른 혈액학적 마커, 예컨대 LDH 또는 합토글로빈을 갖는 대상체이다). 몇몇 실시양태에서, 상기 대상체는 하나 이상의 Ba, D-이량체, VCAM-1, 및 프로트롬빈 단편 1+2를 포함하고 이로 제한되지 않는, 본원에서 설명되는 상승된 수준의 하나 이상의 aHUS 바이오마커를 갖는 대상체이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법에 대해, 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질의 농도 및/또는 활성이 결정될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 의사는 샘플 내의 vWF (또는 다른 바이오마커 단백질)의 농도에 대한 대용물 (proxy)로서 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 내의 vWF의 활성을 측정할 수 있다. 표 1에 제시된 aHUS 바이오마커 단백질의 샹대적인 활성을 평가하기 위한 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있다.
본원에서 (예를 들어, 실시예에서) 상세히 논의한 바와 같이, aHUS는 만성 보체 탈조절 (dysregulation)을 수반하는 생명을 위협하는 유전 질환이다. 이 질환으로 고생하는 환자는 특히, 뇌졸중 및 신부전을 야기할 수 있는 혈전성 미세혈관병증 (TMA)으로 고통받는다. 길항제 항-C5 항체인 에쿨리주맙은 TMA를 극적으로 감소시키고, 혈소판 수준을 정상화하고, aHUS 환자의 신장 기능을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, aHUS 환자에 대한 보체 억제제 요법의 분명하고 강력한 임상적 이점에도 불구하고, 몇몇 환자는 치료에도 불구하고 여러 aHUS 바이오마커 단백질의 상승된 수준을 계속 경험한다. 예를 들어, 본 발명자들은 몇몇 환자에서, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb)의 수준 (예를 들어, 혈장 내의)이 길항제 항-C5 항체를 사용한 치료 이후 정상화되지 않음을 밝혀내었다. 추가로, 몇몇 환자에 대해, 프로트롬빈 단편 1+2, D-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, TNFR1, 및 CXCL10 수준은 감소하지만, 시간에 걸쳐 정상화되지 않는다. 개시내용이 임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 매이지 않지만, 상기 관찰은 몇몇 환자에 대해, 낮은 수준의 염증 및 응고병증이 보체 억제제 요법에도 불구하고 지속될 수 있음을 시사한다. 따라서, 본 개시내용은 보체 억제제가 aHUS가 존재하는 몇몇 환자에서 낮은 수준의 지속적인 염증을 해결하기 위한 제2 요법과 조합하여 투여되는 방법을 고려한다.
따라서, 추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)의 치료 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에게 치료 유효량의 보체의 억제제 (예를 들어, 보체 성분 C5의 억제제) 및 치료 유효량의 (i) 항-응고제, (ii) 섬유소용해제; (iii) 소염제; 또는 (iv) IL-6, IL-8, CXCL-9, IL-18, 또는 VEGF의 억제제를 투여 (예를 들어, 장기적으로 투여)하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 보체의 2개의 억제제 (예를 들어, C5의 억제제 및 C3의 억제제, 예컨대, 항-인자 B 항체, 항-C3 항체, 또는 항-C3b 항체)가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, C5의 억제제를 사용한 요법의 중단시에, 보체 성분 C3의 억제제는 상류 대체 경로 활성화를 감소시키기에 충분한 시간 동안 환자에게 투여될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 aHUS 바이오마커의 상태를 모니터링하고, 제2 요법 (보체 억제제 요법에 추가로)을 개시할지 또는 aHUS 환자에게 투여되는 하나 이상의 제2 요법의 투여 요법을 변경할지 결정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보체 억제제를 사용하는 치료 (예를 들어, 만성 치료) 동안, 하나 이상의 aHUS 연관 바이오마커 단백질의 농도는 대상체로부터 얻은 하나 이상의 생물학적 유체에서 측정될 수 있다. 하나 이상의 바이오마커 단백질의 농도가 정상화되지 않고/않거나 상승한 상태로 유지되면, 의사는 상승된 바이오마커에 의해 발생하는 임의의 병리생리학적 효과를 해결하기 위한 하나 이상의 추가의 제2 작용제 (예를 들어, 소염제)를 대상체에게 투여하는 것을 선택할 수 있다.
보체 억제제는 본원에서 설명되는 임의의 것일 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 억제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 소분자, 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 펩티드 모방체, 또는 앱타머이다. 몇몇 실시양태에서, 억제제는 하나 이상의 보체 성분 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 인자 D, 인자 B, 프로페르딘, MBL, MASP-1, MASP-2, 또는 임의의 이들의 생물학적 활성 단편을 억제하는 것일 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 C5a와 연관된 아나필락시스 독성 활성의 생성 및/또는 C5b와 연관된 막 공격 복합체의 조립 중의 하나 또는 둘 모두를 억제한다.
조성물은 또한 천연 생성 또는 가용성 형태의 보체 억제 화합물, 예컨대 CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59, 인자 H, 코브라 독 인자, FUT-175, 콤플레스타틴, 및 K76 COOH를 함유할 수 있다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 보체의 억제제는 길항제 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화 항체, 재조합 항체, 디아바디, 키메라화 또는 키메라 항체, 모노클로날 항체, 탈면역화 항체, 완전 인간 항체, 단일쇄 항체, Fv 단편, Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab')2 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 길항제 항체는 항-C5 항체, 예컨대 에쿨리주맙이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 항체는 항-C5 항체의 C5-결합 단편인 펙셀리주맙이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 보체의 억제제는 MB12/22, MB12/22-RGD, ARC187, ARC1905, SSL7, 및 OmCI로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 항-응고제는 쿠마린, 헤파린, 인자 Xa 억제제, 및 트롬빈 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 항-응고제의 예는 예를 들어, 와파린 (쿠마딘 (Coumadin)), 아스피린, 헤파린, 페닌디온, 폰다파리눅스, 이드라파리눅스, 및 트롬빈 억제제 (예를 들어, 아가트로반, 레피루딘, 비발리루딘, 또는 다비가트란)를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 섬유소용해제는 안크로드, ε-아미노카프론산, 안티플라스민-a1, 프로스타시클린, 및 데피브로티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 소염제는 항-시토킨제, 예컨대 길항제 항체 (또는 그의 항원-결합 단편) 또는 가용성 시토킨 수용체이고, 이것은 염증성 시토킨에 결합하고 시토킨의 활성을 억제한다. 항-시토킨제는 예를 들어, TNF 억제제 (예를 들어, 항-TNF 항체 또는 가용성 TNF 수용체 단백질) 또는 항-CD20제일 수 있다.
소염제는 또한 예를 들어, 스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손), 비-스테로이드성 소염 약물 (NSAID) (예를 들어, 인도메타신, 나프록센, 술린닥, 디클로페낙, 아스피린, 플루비프로펜, 옥사프로진, 살살레이트, 디푸니살, 피록시캄, 에토돌락, 메클로페나메이트, 이부프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜, 나부메톤, 톨메틴, 콜린 마그네슘 살리실레이트, COX-2 억제제, TNF 알파 길항제 (에타너셉트, 아달리무맙, 인플릭시맙, 골리무맙), 질환 변형 항-류마티스 약물 (DMARDS) (예를 들어, 술파살라진, 메토트렉세이트), 시클로스포린, 레티노이드 및 코르티코스테로이드를 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)이 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 환자에서 상승할지 결정하기 위한 방법을 특징으로 하고, 여기서 방법은 (i) 표 11 (하기), 즉, 인자 B의 단백질 분해 단편, C5a, 가용성 C5b-9 (sC5b-9), 가용성 TNFR1 (sTNFR1), 가용성 VCAM-1 (sVCAM-1), 트롬보모듈린, 프로트롬빈 단편 1 및 2 (F1+2), D-이량체, 클러스테린, TIMP-1, FABP-1, 베타-2 마이크로글로불린 (β2m), 및 시스타틴-C로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커의 각각의 농도를 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 측정하고, (ii) 환자가 동일한 적어도 2개의 바이오마커의 정상 대조군 농도에 비해 상승한 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커의 각각의 농도를 갖는지 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 면역검정, 예컨대, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사성 면역검정 (RIA)을 사용하여 측정한다. 생물학적 유체는 예를 들어, 혈액, 혈액 분획 (예를 들어, 혈장 또는 혈청), 또는 소변일 수 있다. 임의의 2개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 상기한 aHUS-바이오마커의 임의의 조합이 본원에서 설명되는 방법에 따라 측정되고 분석될 수 있음이 이해된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 환자를 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)이 존재하는 것으로 진단하는 (또는 예를 들어 환자가 실시예 1에서 논의되는 2 이상의 포함 기준을 충족하는 경우 aHUS의 진단을 확인하는) 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 (i) aHUS가 존재하는 것으로 의심되거나 또는 aHUS가 발생할 위험이 있는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 인자 B의 단백질 분해 단편, C5a, 가용성 C5b-9 (sC5b-9), 가용성 TNFR1 (sTNFR1), 가용성 VCAM-1 (sVCAM-1), 트롬보모듈린, 프로트롬빈 단편 1 및 2 (F1+2), D-이량체, 클러스테린, TIMP-1, FABP-1, 베타-2 마이크로글로불린 (β2m), 및 시스타틴-C로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커의 각각의 농도를 측정하고, (ii) 각각의 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커의 농도가 동일한 적어도 2개의 바이오마커의 정상 대조군 농도에 비해 상승할 경우 환자를 aHUS가 존재하는 것으로 진단하는 (또는 aHUS의 진단을 확인하는) 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 aHUS-연관 바이오마커 단백질은 면역검정, 예컨대, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사성 면역검정 (RIA)을 사용하여 측정된다. 생물학적 유체는 예를 들어, 혈액, 혈액 분획 (예를 들어, 혈장 또는 혈청), 또는 소변일 수 있다. 임의의 2개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 상기한 aHUS-바이오마커의 임의의 조합이 본원에서 설명되는 방법에 따라 측정되고 분석될 수 있음이 이해된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법에서 사용되는 정상 대조군 농도는 예를 들어 1명 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40명 또는 그 초과의) 건강한 개체로부터 얻은 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플들 내의 주어진 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도일 수 있다 (또는 이를 기초로 할 수 있다). 몇몇 실시양태에서, 바이오마커의 정상 대조군 농도는 예를 들어 2명 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40명 또는 그 초과의) 건강한 개체로부터 얻은 모아진 샘플 내의 바이오마커의 농도일 수 있다 (또는 이를 기초로 할 수 있다). 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 모아진 샘플은 건강한 개체 또는, 적어도 aHUS가 존재하지 않거나 존재하는 것으로 의심되지 않는 (또는 발생 위험이 없는) 개체로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 대상체에 aHUS가 존재하는지 결정하는 것은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 (또는 여러 상이한 종류의 생물학적 샘플) 내의 하나 이상의 보체 성분 단백질 (예를 들어, 표 1 또는 표 11)의 측정된 농도를 비교하고 측정된 농도를 모아진 건강한 샘플 내의 동일한 단백질의 평균 농도와 비교하는 것을 수반할 수 있다. 그러한 건강한 인간 대조군 농도는 몇몇 실시양태에서 일정 범위의 값, 또는 상기 범위로부터 얻은 중간 또는 평균 값일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 적어도 하나의 aHUS-연관 바이오마커의 농도는 2 종류 이상의 생물학적 유체에서 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 aHUS 바이오마커 단백질 중 제1 단백질의 농도는 한 종류의 생물학적 유체에서 측정되고, 적어도 2개의 aHUS 바이오마커 단백질 중 제2 단백질의 농도는 제2 종류의 유체에서 측정된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 인자 B의 단백질 분해 단편의 농도가 측정된다. 단편은 예를 들어 Ba일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈장 샘플일 수 있다. 표 11에 기재된 바와 같이, Ba의 정상 대조군 농도는 1000 ng/mL 미만일 수 있다. Ba의 정상 대조군 농도는 600 ng/mL 미만일 수 있다. Ba의 정상 대조군 농도는 300 내지 600 ng/mL일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 Ba의 농도는 Ba의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 Ba의 농도는 Ba의 정상 대조군 농도보다 적어도 5배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 Ba의 농도는 적어도 1500 ng/mL일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 Ba의 농도는 적어도 2500 ng/mL일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, C5a의 농도가 측정된다. C5a가 측정되는 생물학적 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, C5a의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 2 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, C5a의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 1 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, C5a의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 0 내지 0.7 ng이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 C5a의 농도는 C5a의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 C5a의 농도는 C5a의 정상 대조군 농도보다 적어도 10배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 C5a의 농도는 C5a의 정상 대조군 농도보다 적어도 40배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 C5a의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 5 ng일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 C5a의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 9 ng일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, sC5b-9의 농도가 측정된다. sC5b-9가 측정되는 생물학적 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, sC5b-9의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 2 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, sC5b-9의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 1 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, sC5b-9의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 0 내지 0.6 ng이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sC5b-9의 농도는 sC5b-9의 정상 대조군 농도보다 적어도 10배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sC5b-9의 농도는 sC5b-9의 정상 대조군 농도보다 적어도 50배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sC5b-9의 농도는 sC5b-9의 정상 대조군 농도보다 적어도 100배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sC5b-9의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 20 ng일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sC5b-9의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 30 ng일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, sTNFR1의 농도가 측정된다. sTNFR1이 측정되는 생물학적 샘플은 혈청 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, sTNFR1의 정상 대조군 농도는 2000 pg/mL 미만이다. 몇몇 실시양태에서, sTNFR1의 정상 대조군 농도는 1500 pg/mL 미만이다. 몇몇 실시양태에서, sTNFR1의 정상 대조군 농도는 400 내지 1500 pg/mL이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sTNFR1의 농도는 sTNFR1의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sTNFR1의 농도는 sTNFR1의 정상 대조군 농도보다 적어도 5배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sTNFR1의 농도는 sTNFR1의 정상 대조군 농도보다 적어도 15배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sTNFR1의 농도는 적어도 10,000 pg/mL일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sTNFR1의 농도는 적어도 15,000 pg/mL일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, sVCAM-1의 농도가 측정된다. sVCAM-1이 측정되는 생물학적 샘플은 혈청 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, sVCAM-1의 정상 대조군 농도는 500 ng/mL 미만이다. 몇몇 실시양태에서, sVCAM-1의 정상 대조군 농도는 300 ng/mL 미만이다. 몇몇 실시양태에서, sVCAM-1의 정상 대조군 농도는 100 내지 500 ng/mL이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sVCAM-1의 농도는 sVCAM-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 10% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sVCAM-1의 농도는 sVCAM-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 30% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sVCAM-1의 농도는 sVCAM-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 50% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sVCAM-1의 농도는 적어도 550 ng/mL일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 sVCAM-1의 농도는 적어도 650 ng/mL일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린의 농도가 측정된다. 트롬보모듈린이 측정되는 생물학적 샘플은 혈청 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린의 정상 대조군 농도는 5 ng/mL 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린의 정상 대조군 농도는 3 ng/mL 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 트롬보모듈린의 정상 대조군 농도는 2 내지 6 ng/mL이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 트롬보모듈린의 농도는 트롬보모듈린의 정상 대조군 농도보다 적어도 10% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 트롬보모듈린의 농도는 트롬보모듈린의 정상 대조군 농도보다 적어도 30% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 트롬보모듈린의 농도는 트롬보모듈린의 정상 대조군 농도보다 적어도 50% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 트롬보모듈린의 농도는 적어도 8 ng/mL일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 트롬보모듈린의 농도는 적어도 10 ng/mL일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, F1+2의 농도가 측정된다. F1+2가 측정되는 생물학적 샘플은 혈장 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, F1+2의 정상 대조군 농도는 400 pmol/L 미만이다. 몇몇 실시양태에서, F1+2의 정상 대조군 농도는 300 pmol/L 미만이다. 몇몇 실시양태에서, F1+2의 정상 대조군 농도는 50 내지 400 pmol/L이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 F1+2의 농도는 F1+2의 정상 대조군 농도보다 적어도 30% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 F1+2의 농도는 F1+2의 정상 대조군 농도보다 적어도 50% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 F1+2의 농도는 F1+2의 정상 대조군 농도보다 적어도 100% 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 F1+2의 농도는 적어도 900 pmol/L일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 F1+2의 농도는 적어도 1000 pmol/L일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, D-이량체의 농도가 측정된다. D-이량체가 측정되는 생물학적 샘플은 혈장 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, D-이량체의 정상 대조군 농도는 500 ㎍/L 미만이다. 몇몇 실시양태에서, D-이량체의 정상 대조군 농도는 400 ㎍/L 미만이다. 몇몇 실시양태에서, D-이량체의 정상 대조군 농도는 100 내지 500 ㎍/L이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 D-이량체의 농도는 D-이량체의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 D-이량체의 농도는 D-이량체의 정상 대조군 농도보다 적어도 5배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 D-이량체의 농도는 D-이량체의 정상 대조군 농도보다 적어도 10배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 D-이량체의 농도는 적어도 1500 ㎍/L일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 D-이량체의 농도는 적어도 2500 ㎍/L일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 클러스테린의 농도가 측정된다. 클러스테린이 측정되는 생물학적 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 클러스테린의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 500 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 클러스테린의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 400 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 클러스테린의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 0 내지 500 ng이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 클러스테린의 농도는 클러스테린의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 클러스테린의 농도는 클러스테린의 정상 대조군 농도보다 적어도 5배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 클러스테린의 농도는 클러스테린의 정상 대조군 농도보다 적어도 10배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 클러스테린의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 900 ng일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 클러스테린의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 1200 ng일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, TIMP-1의 농도가 측정된다. TIMP-1이 측정되는 생물학적 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, TIMP-1의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 10 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, TIMP-1의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 5 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, TIMP-1의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 0 내지 10 ng이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 TIMP-1의 농도는 TIMP-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 TIMP-1의 농도는 TIMP-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 10배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 TIMP-1의 농도는 TIMP-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 20배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 TIMP-1의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 15 ng일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 TIMP-1의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 20 ng일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, FABP-1 (본원에서 L-FABP-1로도 언급됨)의 농도가 측정된다. FABP-1이 측정되는 생물학적 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, FABP-1의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 20 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, FABP-1의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 15 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, FABP-1의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 0 내지 20 ng이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 FABP-1의 농도는 FABP-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 FABP-1의 농도는 FABP-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 10배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 FABP-1의 농도는 FABP-1의 정상 대조군 농도보다 적어도 20배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 FABP-1의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 40 ng일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 FABP-1의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 50 ng일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, β2m의 농도가 측정된다. β2m이 측정되는 생물학적 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, β2m의 정상 대조군 농도는 5 ㎍/mg (소변 크레아티닌) 미만이다. 몇몇 실시양태에서, β2m의 정상 대조군 농도는 3 ㎍/mg (소변 크레아티닌) 미만이다. 몇몇 실시양태에서, β2m의 정상 대조군 농도는 0 내지 5 ㎍/mg (소변 크레아티닌)이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 β2m의 농도는 β2m의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 임의의 방법 중 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 β2m의 농도는 β2m의 정상 대조군 농도보다 적어도 10배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 β2m의 농도는 β2m의 정상 대조군 농도보다 적어도 20배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 β2m의 농도는 적어도 15 ㎍/mg (소변 크레아티닌)일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 β2m의 농도는 적어도 20 ㎍/mg (소변 크레아티닌)일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 시스타틴-C의 농도가 측정된다. 시스타틴-C가 측정되는 생물학적 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 시스타틴-C의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 400 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 시스타틴-C의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 300 ng 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 시스타틴-C의 정상 대조군 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 0 내지 400 ng이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 시스타틴-C의 농도는 시스타틴-C의 정상 대조군 농도보다 적어도 2배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 시스타틴-C의 농도는 시스타틴-C의 정상 대조군 농도보다 적어도 10배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 시스타틴-C의 농도는 시스타틴-C의 정상 대조군 농도보다 적어도 20배 더 클 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 시스타틴-C의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 900 ng일 때 상승한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 시스타틴-C의 농도는 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 1200 ng일 때 상승한 것으로 간주된다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 2개 이상의 인자 B의 단백질 분해 단편, C5a, 및 sC5b-9의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, C5a 및 sC5b-9의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, sVCAM-1 및 트롬보모듈린의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, F1+2 및 D-이량체의 농도가 측정된다. 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 2개 이상의 클러스테린, TIMP-1, β2m, FABP-1, 및 시스타틴-C의 농도가 측정된다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 보체 억제제, 예컨대, 항-C5 항체를 사용한 치료 전, 동안 또는 후에 aHUS가 존재하거나, aHUS가 존재하는 것으로 의심되거나, 또는 aHUS가 발생할 위험이 있는 환자에서 대체 경로 활성화의 수준을 평가하기 위한 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 보체 억제제 (예를 들어, 인간 보체 성분 C5의 억제제, 예컨대, 항-C5 항체)를 사용하여 치료된 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 내의 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb)의 농도를 측정하는 것을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 환자가 보체 억제제를 사용하는 요법에 반응했는지 (예를 들어, 혈전증 발생 위험이 감소했거나 또는 혈전성 미세혈관병증의 수, 빈도 또는 발생이 감소했는지) 결정하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 혈전성 미세혈관병증 (TMA)의 위험이 상승하거나, 이로 고통받거나, 이것이 존재하는 것으로 의심되고 보체 억제제로 치료된 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 표 1 또는 11에 제시된 혈전증 또는 응고의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, F1+2, D-이량체, vWF, 또는 트롬보모듈린의 농도를 측정하고, 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도가 보체 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비해 감소하면 환자가 요법에 반응한 것으로 결정하거나 또는 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도가 보체 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비해 감소하지 않으면 환자가 요법에 반응하지 않은 것으로 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 환자는 aHUS가 존재하거나 존재하는 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 aHUS 환자가 보체 억제제를 사용하는 요법에 반응했는지 결정하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있고 보체 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)로 치료된 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 표 1 또는 11에 제시된 말단 보체 활성화의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, C5a 및/또는 sC5b-9의 농도를 측정하고, 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도가 보체 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비해 감소하면 환자가 요법에 반응한 것으로 결정하거나 또는 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도가 보체 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비해 감소하지 않으면 환자가 요법에 반응하지 않은 것으로 결정하는 것을 포함한다. 따라서, 방법은 보체 억제제를 사용하여 치료된 aHUS 환자에서 말단 보체 차단을 평가하거나 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 환자가 요법에 비-반응성이거나 또는 덜 반응성인 실시양태에서, 방법은 또한 보체 억제제의 투여량 또는 투여 빈도를 변경하거나 또는 환자의 치료에 사용하기 위한 상이한 보체 억제제 (예를 들어, C3 활성화의 억제제)를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 aHUS 환자가 보체 억제제를 사용하는 요법에 반응했는지 결정하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 표 1 또는 11에 제시된 혈관 염증 또는 내피 활성화의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, sTNFR1, sVCAM-1, 또는 트롬보모듈린의 농도를 측정하고, 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도가 보체 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비해 감소하면 환자가 요법에 반응한 것으로 결정하거나 또는 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도가 보체 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비해 감소하지 않으면 환자가 요법에 반응하지 않은 것으로 결정하는 것을 포함한다. 따라서, 방법은 보체 억제제를 사용하여 치료된 aHUS 환자에서 혈관 염증을 평가하거나 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 환자가 요법에 비-반응성이거나 또는 덜 반응성인 실시양태에서, 방법은 또한 보체 억제제의 투여량 또는 투여 빈도를 변경하거나 또는 환자의 치료에 사용하기 위한 상이한 보체 억제제 (예를 들어, C3 활성화의 억제제)를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 aHUS 환자가 보체 억제제를 사용하는 요법에 반응했는지 결정하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 표 1 또는 11에 제시된 신장 손상의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 클러스테린, TIMP-1, FABP-1, β2m, 및/또는 시스타틴-C의 농도를 측정하고, 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도가 보체 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비해 감소하면 환자가 요법에 반응한 것으로 결정하거나 또는 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도가 보체 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비해 감소하지 않으면 환자가 요법에 반응하지 않은 것으로 결정하는 것을 포함한다. 따라서, 방법은 보체 억제제를 사용하여 치료된 aHUS 환자에서 신장 손상을 평가하거나 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 환자가 요법에 비-반응성이거나 또는 덜 반응성인 실시양태에서, 방법은 또한 보체 억제제의 투여량 또는 투여 빈도를 변경하거나 또는 환자의 치료에 사용하기 위한 상이한 보체 억제제 (예를 들어, C3 활성화의 억제제)를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 또한 aHUS 환자에서 말단 보체 활성화 마커 C5a 및 sC5b-9 농도 (예를 들어, 소변 농도)의 상대적인 상승이, 상기 환자에서 보체 대체 경로 활성화 마커 (예를 들어, Ba) 수준의 상대적인 상승보다 훨씬 더 높음을 밝혀내었다. 즉, aHUS 환자에서 C5a 및 sC5b-9의 중간 농도는 정상의 건강한 인간에서 상기 마커의 중간 농도보다 각각 45 및 305배 더 높은 반면, Ba의 중간 농도는 정상의 건강한 인간에서 Ba의 중간 농도보다 단지 약 5배 더 높았다. 임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 매이지 않지만, 본 발명자들은 대체 경로 활성화에 대한 말단 보체 활성화의 비율이 aHUS에 대한 유용한 진단 도구인 것으로 생각한다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 aHUS를 진단하거나 또는 aHUS의 진단을 확인하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 말단 보체 (예를 들어, sC5b-9 또는 C5a)의 활성화 수준을 상류 대체 경로 (예를 들어, Ba 또는 Bb)의 활성화 수준 (정상의 건강한 인간에 비해)과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 대체 경로 활성화에 비해 더 높은 정도의 말단 활성화는 환자에 aHUS가 존재함을 나타낸다. 예를 들어, aHUS를 나타내는 비율은 예를 들어 약 45:5 또는 305:5의 말단 보체 활성화의 유도 배수 대 대체 경로 활성화의 유도 배수일 수 있다. 또한, 본 발명자들은 상기 비율이 aHUS를, 말단 보체 및 상류 대체 경로 활성화 수준의 상기 차이를 보이지 않을 수 있는 다른 보체-연관 질환, 예컨대, 혈전성 혈소판감소 자반증 (TTP)과 구분하기 위해 유용할 수 있다고 생각한다.
"폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 교환가능하게 사용되고, 길이 또는 번역후 변형과 무관하게 아미노산의 임의의 펩티드-연결 사슬을 의미한다. 본원에서 설명되는 단백질은 야생형 단백질을 함유하거나 야생형 단백질일 수 있거나 또는 50개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개 이하)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체일 수 있다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 군 내의 치환을 포함한다: 글라이신 및 알라닌; 발린, 이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 라이신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.
본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 서열 동일성 비율 (%)은 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 서열 동일성 %를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 참조 서열 내의 아미노산과 동일한 후보 서열 내의 아미노산의 백분율로서 규정된다. 서열 동일성 %를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST 소프트웨어를 사용하여, 통상의 기술 범위 내의 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기 위해 적합한 파라미터는 공지의 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 전체 항체 및 전체 항체의 항원-결합 단편 둘 모두를 포함한다. 전체 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD, 및 IgE 항체를 포함하는 상이한 항체 이소형을 포함한다. 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라화 또는 키메라 항체, 인간화 항체, 영장류화 (primatized) 항체, 탈면역화 항체, 및 완전 인간 항체를 포함한다. 항체는 임의의 다양한 종, 예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 오랑우탄, 개코원숭이, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 원숭이, 토끼, 기니 피그, 겔르빌루스 (gerbil), 햄스터, 래트, 및 마우스에서 제조되거나 이로부터 유래될 수 있다. 항체는 정제된 또는 재조합 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 단편", "항원-결합 단편", 또는 유사한 용어는 표적 항원 (예를 들어, 인간 C5)에 결합하고 표적 항원의 활성을 억제하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 의미한다. 상기 단편은 예를 들어, 단일쇄 항체, 단일쇄 Fv 단편 (scFv), Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. scFv 단편은 그로부터 scFv가 유래되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 모두 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 또한, 인트라바디 (intrabody), 미니바디 (minibody), 트리아바디 (triabody), 및 디아바디도 항체의 정의에 포함되고, 본원에서 설명되는 방법에 사용하기 적합하다. 예를 들어, 그 개시내용 전부가 각각 본원에 참고로 포함된 문헌 [Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66]; [Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189]; [Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123]; 및 [Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283]을 참고한다. 이중특이적 항체 (DVD-Ig 항체; 하기 참조)도 용어 "항체"에 포함된다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 또한 예를 들어 단일 도메인 항체, 예컨대 낙타화 (camelized) 단일 도메인 항체를 포함한다. 예를 들어, 모두 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235]; [Nuttall et al. (2000) CurrPharm Biotech 1:253-263]; [Riechmann et al. (1999) J Immunol Meth 231:25-38]; PCT 출원 공개 WO 94/04678 및 WO 94/25591; 및 미국 특허 6,005,079를 참고한다. 몇몇 실시양태에서, 본 개시내용은 단일 도메인 항체가 형성되도록 하는 변형을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체를 제공한다.
달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 바람직한 방법 및 물질이 아래에서 설명되지만, 본원에서 설명되는 바와 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본원에서 개시되는 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전부가 참고로 포함된다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점, 예를 들어, 대상체에서 보체-연관 장애의 치료 방법은 다음 상세한 설명, 실시예, 및 청구의 범위로부터 자명해질 것이다.
도 1a는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 소변 내의 C5a의 농도 (ng/mg 소변 크레아틴)를 도시하는 점 도표 (dot plot)이다. 소변 C5a의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (NORM)로부터의 소변 내에서 측정하였다.
도 1b는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 소변 내의 sC5b-9의 농도 (ng/mg 소변 크레아틴)를 도시하는 점 도표이다. 소변 C5b9의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (NORM)로부터의 소변 내에서 측정하였다.
도 1c는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 혈장 내에 보체 성분 Ba의 농도 (ng/mL)를 도시하는 점 도표이다. Ba의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (정상)로부터 혈장 내에서 측정하였다.
도 1d는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후에 aHUS 환자 (N=26)에서 시간 경과에 따른 소변 C5a 수준 (Y-축)의 평균 감소 백분율 (%)을 도시하는 막대 그래프이다. x-축은 치료 개시 후 평가를 위한 aHUS 환자 방문의 주 수를 나타내고, 예를 들어, V3은 치료 개시 후 제3주에서 평가를 위한 환자 방문이다.
도 1e는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후에 aHUS 환자 (N=23)에서 시간 경과에 따른 소변 sC5b-9 수준 (Y-축)의 평균 감소 백분율 (%)을 도시하는 막대 그래프이다. x-축은 치료 개시 후 평가를 위한 aHUS 환자 방문의 주 수를 나타내고, 예를 들어, V3은 치료 개시 후 제3주에서 평가를 위한 환자 방문이다.
도 1f는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후에 aHUS 환자 (N=35)에서 시간 경과에 따른 혈장 Ba 수준 (Y-축)의 평균 감소 백분율 (%)을 도시하는 막대 그래프이다. x-축은 치료 개시 후 평가를 위한 aHUS 환자 방문의 주 수를 나타내고, 예를 들어, V3은 치료 개시 후 제3주에서 평가를 위한 환자 방문이다.
도 2a-2c는 기준선에서 (에쿨리주맙을 사용한 치료-전) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 소변 C5a (도 2a), 소변 sC5b9 (도 2b), 및 혈장 Ba (도 2c)의 정상화된 농도를 달성하는 aHUS 환자의 백분율을 도시하는 막대 그래프이다.
도 3a는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 혈장 내의 프로트롬빈 단편 1+2의 농도 (pmol/L)를 도시하는 점 도표이다. 혈장 F1+2의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (정상)로부터 혈장 내에서 측정하였다.
도 3b는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 혈장 내의 D-이량체의 농도 (㎍/L)를 도시하는 점 도표이다. 혈장 D-이량체의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (정상)로부터 혈장 내에서 측정하였다.
도 3c는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후에 aHUS 환자에서 시간 경과에 따른 혈장 프로트롬빈 단편 F1+2 수준 (Y-축)의 평균 감소 백분율 (%)을 도시하는 막대 그래프이다. x-축은 치료 개시 후 평가를 위한 aHUS 환자 방문의 주 수를 나타내고, 예를 들어, V3은 치료 개시 후 제3주에서 평가를 위한 환자 방문이다.
도 3d는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후에 aHUS 환자에서 시간 경과에 따른 혈장 d-이량체 수준 (Y-축)의 평균 감소 백분율 (%)을 도시하는 막대 그래프이다. x-축은 치료 개시 후 평가를 위한 aHUS 환자 방문의 주 수를 나타내고, 예를 들어, V3은 치료 개시 후 제3주에서 평가를 위한 환자 방문이다.
도 4a 및 4b는 기준선 (에쿨리주맙을 사용한 치료-전) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 혈장 프로트롬빈 단편 1+2 (도 4a) 및 혈장 D-이량체 (도 4b)의 정상화된 농도를 달성하는 aHUS 환자의 백분율을 도시하는 막대 그래프이다.
도 5a는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 혈장 (EDTA 처리된 혈장) 내의 트롬보모듈린의 농도 (ng/mL)를 도시하는 점 도표이다. 혈장 트롬보모듈린의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (정상)로부터 혈장 내에서 측정하였다. EOS는 "연구의 끝"에 얻어진 샘플의 분석 결과를 나타낸다.
도 5b는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 혈청 내의 VCAM-1의 농도 (ng/mL)를 도시하는 점 도표이다. 혈청 VCAM-1의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (정상 풀 (pool))로부터의 혈청 내에서 측정하였다. EOS는 "연구의 끝"에 얻어진 샘플의 분석 결과를 나타낸다.
도 5c는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 혈장 (EDTA 처리된 혈장) 내의 vWF의 활성 (mU/mL)을 도시하는 점 도표이다. vWF의 활성을 또한 정상의 건강한 개체 (정상)로부터 혈장 내에서 측정하였다. EOS는 "연구의 끝"에 얻어진 샘플의 분석 결과를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 기준선 (에쿨리주맙을 사용한 치료 전) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 정상화된 혈장 트롬보모듈린 농도 (도 6a) 및 혈장 vWF 활성 수준 (도 4b)을 달성하는 aHUS 환자의 백분율을 도시하는 막대 그래프이다.
도 6c는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후에 aHUS 환자 (N=33)에서 시간 경과에 따른 혈장 트롬보모듈린 수준 (Y-축)의 평균 감소 백분율 (%)을 도시하는 막대 그래프이다. x-축은 치료 개시 후 평가를 위한 aHUS 환자 방문의 주 수를 나타내고, 예를 들어, V3은 치료 개시 후 제3주에서 평가를 위한 환자 방문이다.
도 6d는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후에 aHUS 환자 (N=36)에서 시간 경과에 따른 혈청 VCAM-1 수준 (Y-축)의 평균 감소 백분율 (%)을 도시하는 막대 그래프이다. x-축은 치료 개시 후 평가를 위한 aHUS 환자 방문의 주 수를 나타내고, 예를 들어, V3은 치료 개시 후 제3주에서 평가를 위한 환자 방문이다.
도 7a는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 혈청 내의 TNFR1의 농도 (pg/mL)를 도시하는 점 도표이다. 혈청 TNFR1의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (정상 풀)로부터 혈청 내에서 측정하였다. EOS는 "연구의 끝"에 얻어진 샘플의 분석 결과를 나타낸다.
도 7b는 기준선 (에쿨리주맙을 사용한 치료 전) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 정상화된 혈청 TNFR1 농도를 달성하는 aHUS 환자의 백분율을 도시하는 막대 그래프이다.
도 8a는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 소변 내의 시스타틴 C (CysC)의 농도 (ng/mg 소변 크레아틴)를 도시하는 점 도표이다. 소변 CysC의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (NORM)로부터의 소변 내에서 측정하였다.
도 8b는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 소변 내의 β2M의 농도 (㎍/mg 소변 크레아틴)를 도시하는 점 도표이다. 소변 β2M의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (NORM)로부터의 소변 내에서 측정하였다.
도 8c는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 (Pre-Tx) 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 다양한 주 후에 aHUS 환자의 소변 내의 NGAL의 농도 (ng/mg 소변 크레아틴)를 도시하는 점 도표이다. 소변 NGAL의 농도를 또한 정상의 건강한 개체 (NORM)로부터의 소변 내에서 측정하였다.
도 9a-9e는 본원에서 설명되는 연구에 등록 이전에 투석을 받지 않는 aHUS 환자 (no 투석)에 비해 투석을 받는 aHUS 환자 (투석)에서 여러 aHUS 바이오마커 단백질의 평균 수준을 도시하는 일련의 막대 그래프이다. 도 9a는 혈청 TNFR1의 평균 농도 (pg/mL)를 도시하고; 도 9b는 소변 β2M의 평균 농도 (㎍/mg 소변 크레아틴)를 도시하고; 도 9c는 혈장 Ba의 농도 (ng/mL)를 도시하고; 도 9d는 소변 sC5b9의 농도 (ng/mg 소변 크레아틴)를 도시하고; 도 9e는 소변 C5a의 농도 (ng/mL)를 도시한 것이다.
도 10a는 기준선에서 및 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시의 1 내지 2.5주 후에, 안정한 임상 파라미터 (임상 관해)를 보이는 aHUS 환자(TMA 없는) 및 계속하여 상승된 합토글로빈 및 LDH 수준 (및 감소된 혈소판 계수)을 경험하는 aHUS 환자 (기타)에서 혈청 TNFR1의 농도 (pg/mL)를 도시하는 점 도표이다. 정상의 건강한 개체 (정상)로부터의 혈청 TNFR1의 농도를 또한 도시한다.
도 10b-10e는 각각 정상 혈액학적 마커 LDH 및 합토글로빈 ("정상 환자" 또는 임상 관해 상태로 여겨지는 환자)을 갖는 환자, 비정상적인 (상승된) 혈액학적 마커를 갖는 환자 ("비정상적 환자" 또는 활성 aHUS 제시를 갖는 환자), 및 건강한 대상체 ("정상")에서 주어진 바이오마커의 농도를 도시하는 일련의 막대 그래프이다. 도 10b는 상기 대상체 집단에서 혈장 Ba의 수준 (ng/mL)을 도시한 것이다. 도 10c는 대상체 집단에서 혈청 VCAM-1의 수준 (ng/mL)을 도시한 것이다. 도 10e는 집단에서 혈장 프로트롬빈 단편 1+2의 수준 (pmol/L)을 도시하고, 도 10d는 혈장 D-이량체의 수준 (㎍/L)을 도시한 것이다. 각각의 군 비교에 대한 P 값을 도면에 도시한다.
도 10f-10i는 각각 정상 혈소판 수준을 갖는 환자 ("정상 환자"), 비정상적인 (감소된) 혈소판 수준을 갖는 환자 ("비정상적 환자"), 및 건강한 대상체 ("정상")에서 주어진 바이오마커의 농도를 도시하는 일련의 막대 그래프이다. 도 10f는 이들 대상체 집단에서 혈장 Ba의 수준 (ng/mL)을 도시한 것이다. 도 10g는 대상체 집단에서 혈청 VCAM-1의 수준 (ng/mL)을 도시한 것이다. 도 10i는 집단에서 혈장 프로트롬빈 단편 1+2의 수준 (pmol/L)을 도시하고, 도 10h는 혈장 D-이량체의 농도 (㎍/L)를 도시한 것이다. 각각의 군 비교에 대한 P 값을 도면에 도시한다.
도 11은 완전 TMA 반응을 달성하는 aHUS 환자 및 여전히 TMA 사건을 겪고 있는 환자 (불완전 반응)에서 혈청 TNFR1 및 소변 클러스테린, C5a, 및 C5b9 수준의 평균 변화 백분율을 도시하는 막대 그래프이다. (주지하고 실시예에서 상술한 바와 같이, 완전 TMA 반응은 혈액학적 파라미터의 정상화 및 신장 기능의 보존을 나타낸다.)
도 12는 완전 TMA 반응을 경험하는 에쿨리주맙-치료된 aHUS 환자 및 그렇지 않은 에쿨리주맙-치료된 aHUS 환자 (기타)에서 혈장 Ba 수준의 평균 변화 백분율을 도시하는 막대 그래프이다.
도 13은 정상화된 수준의 혈장 Ba를 갖는 aHUS 환자 대 지속적으로 상승된 혈장 Ba 수준을 갖는 aHUS 환자에서, 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후에 제12-17주 및 제26주에 혈소판 계수 (109/L)의 기준선 (초기 방문, 에쿨리주맙을 사용한 치료 이전)으로부터 평균 변화를 도시하는 막대 그래프이다. 각각의 관찰에 대한 P 값을 또한 도면에 제공한다.
도 14a-14d는 특정 aHUS-연관 바이오마커가 기준선에서 비정상적인 TMA 마커를 갖는 aHUS 환자에서 상승된다는 관찰을 도시하는 일련의 막대 그래프이다. 도 14a는 감소된 혈소판 계수 (<150,000/㎕ 혈액)를 갖는 환자에 비해 정상 혈소판 계수 (>150,000/㎕ 혈액)을 갖는 aHUS 환자의 소변 내의 시스타틴 C (CysC)의 농도 (ng/mg 소변 크레아틴)를 도시한 것이다. 도 14b는 감소된 혈소판 계수 (<150,000/㎕ 혈액)를 갖는 환자에 비해 정상 혈소판 계수 (>150,000/㎕ 혈액)을 갖는 aHUS 환자의 소변 내의 클러스테린의 농도 (ng/mg 소변 크레아틴)를 도시한 것이다. 도 14c는 상승된 LDH 수준을 갖는 환자에 비해 정상 LDH 수준을 갖는 aHUS 환자의 혈청 내의 VCAM-1의 농도를 도시한 것이다. 도 14d는 상승된 LDH 수준을 갖는 환자에 비해 정상 LDH 수준을 갖는 aHUS 환자의 혈장 내의 d-이량체의 농도 (㎍/L)를 도시한 것이다. 각각의 관찰에 대한 P 값을 도면에 지시한다.
도 15는 반복 혈장 요법을 받은 (반복된 PT; N=23), 혈장 요법을 받지 않은 (No PT; N=3), 또는 정상 환자 (N=9)에서 기준선에서 aHUS 환자의 소변 내의 시스타틴 C의 수준 (ng/mg 소변 크레아틴)을 도시하는 막대 그래프이다.
도 16은 이들 바이오마커의 농도가 상승 유지되는 aHUS 환자에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 다양한 바이오마커 (혈장 Ba, 혈청 VCAM-1, 혈장 F1+2, 혈장 d-이량체, 및 소변 시스타틴 C)의 정상화된 수준을 달성하는 aHUS 환자에서 기준선 eGFR (mL/min/1.73 ㎡)에서 평균 변화를 도시하는 일련의 막대 그래프이다.
도 17a-e는 환자가 혈장 교환 (PE) 또는 혈장 주입 (PI) 요법을 받았는지 여부와 무관하게, 보체 억제제를 사용하는 치료 이전에 aHUS 환자에서 특정 aHUS-연관 바이오마커가 상승된다는 관찰을 도시하는 일련의 막대 그래프이다. 도 17a는 정상의 건강한 지원자 (NHV), PE 또는 PI 요법을 받고 있는 aHUS 환자 (PE/PI), 또는 PE/PI 요법을 받지 않는 aHUS 환자 (no PE/PI)의 혈장 내의 인자 B 단백질 분해 단편 Ba의 농도 (ng/mL)를 도시한 것이다. 도 17b는 정상의 건강한 지원자 (NHV), PE 또는 PI 요법을 받고 있는 aHUS 환자 (PE/PI), 또는 PE/PI 요법을 받지 않는 aHUS 환자 (no PE/PI)의 혈청 내의 sTNFR1의 농도 (pg/mL)를 도시한 것이다. 도 17c는 정상의 건강한 지원자 (NHV), PE 또는 PI 요법을 받고 있는 aHUS 환자 (PE/PI), 또는 PE/PI 요법을 받지 않는 aHUS 환자 (no PE/PI)의 혈청 내의 sVCAM-1의 농도 (ng/mL)를 도시한 것이다. 도 17d는 정상의 건강한 지원자 (NHV), PE 또는 PI 요법을 받고 있는 aHUS 환자 (PE/PI), 또는 PE/PI 요법을 받지 않는 aHUS 환자 (no PE/PI)의 혈장 내의 D-이량체의 농도 (㎍/L)를 도시한 것이다. 도 17e는 정상의 건강한 지원자 (NHV), PE 또는 PI 요법을 받고 있는 aHUS 환자 (PE/PI), 또는 PE/PI 요법을 받지 않는 aHUS 환자 (no PE/PI)의 소변 내의 시스타틴-C의 농도 (ng/mg 소변 크레아티닌)를 도시한 것이다. 각각의 관찰에 대한 P 값을 도면에 지시한다.
도 18a-e는 환자에서 혈소판 수준에 무관하게, 보체 억제제를 사용하는 치료 이전에 aHUS 환자에서 특정 aHUS-연관 바이오마커가 상승된다는 관찰을 도시하는 일련의 막대 그래프이다. 도 18a는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 혈소판 수준 (> 150 x 109)을 갖는 aHUS 환자, 또는 감소된 혈소판 계수 (<150 x 109)를 갖는 aHUS 환자의 혈장 내의 인자 B 단백질 분해 단편 Ba의 농도 (ng/mL)를 도시한 것이다. 도 18b는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 혈소판 수준 (> 150 x 109)을 갖는 aHUS 환자, 또는 감소된 혈소판 계수 (<150 x 109)를 갖는 aHUS 환자의 혈청 내의 sTNFR1의 농도 (pg/mL)를 도시한 것이다. 도 18c는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 혈소판 수준 (> 150 x 109)을 갖는 aHUS 환자, 또는 감소된 혈소판 계수 (<150 x 109)를 갖는 aHUS 환자의 혈청 내의 sVCAM-1의 농도 (ng/mL)를 도시한 것이다. 도 18d는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 혈소판 수준 (> 150 x 109)을 갖는 aHUS 환자, 또는 감소된 혈소판 계수 (<150 x 109)를 갖는 aHUS 환자의 혈장 내의 D-이량체의 농도 (㎍/L)를 도시한 것이다. 도 18e는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 혈소판 수준 (> 150 x 109)을 갖는 aHUS 환자, 또는 감소된 혈소판 계수 (<150 x 109)를 갖는 aHUS 환자의 소변 내의 시스타틴-C의 농도 (ng/mg 소변 크레아티닌)를 도시한 것이다. 각각의 관찰에 대한 P 값을 도면에 지시한다.
도 19a-e는 합토글로빈 (Hp) 또는 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준에 무관하게, 보체 억제제를 사용하는 치료 이전에 aHUS 환자에서 특정 aHUS-연관 바이오마커가 상승된다는 관찰을 도시하는 일련의 막대 그래프이다. 도 19a는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 Hp 및 LDH 수준을 갖는 aHUS 환자, 또는 상승된 (비정상적인) Hp/LDH를 갖는 aHUS 환자의 혈장 내의 인자 B 단백질 분해 단편 Ba의 농도 (ng/mL)를 도시한 것이다. 도 19b는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 Hp 및 LDH 수준을 갖는 aHUS 환자, 또는 상승된 (비정상적인) Hp/LDH를 갖는 aHUS 환자의 혈청 내의 sTNFR1의 농도 (pg/mL)를 도시한 것이다. 도 19c는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 Hp 및 LDH 수준을 갖는 aHUS 환자, 또는 상승된 (비정상적인) Hp/LDH를 갖는 aHUS 환자의 혈청 내의 sVCAM-1의 농도 (ng/mL)를 도시한 것이다. 도 19d는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 Hp 및 LDH 수준을 갖는 aHUS 환자, 또는 상승된 (비정상적인) Hp/LDH를 갖는 aHUS 환자의 혈장 내의 D-이량체의 농도 (㎍/L)를 도시한 것이다. 도 19e는 정상의 건강한 지원자 (NHV), 정상 Hp 및 LDH 수준을 갖는 aHUS 환자, 또는 상승된 (비정상적인) Hp/LDH를 갖는 aHUS 환자의 소변 내의 시스타틴-C의 농도 (ng/mg 소변 크레아티닌)를 도시한 것이다. 각각의 관찰에 대한 P 값을 도면에 지시한다.
도 20a-b는 aHUS 환자에서 말단 보체 활성화에 대한 지속적 에쿨리주맙 치료의 종적 (longitudinal) 효과를 도시하는 상자-수염 (Box-Whisker) 도표이다. 도 20a는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 소변 내의 소변 C5a의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 소변 C5a의 농도 (ng/mg 소변 크레아티닌)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 도 20b는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 소변 내의 소변 sC5b-9의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 소변 sC5b-9의 농도 (ng/mg 소변 크레아티닌)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 상자-수염 도표는 중앙, 25th, 및 75th 백분위수 및 범위를 보여준다. *수준이 기준선 (BL)에 비해 유의하게 감소한 제1 시점; 각각의 시점에서 기준선에 대한 P 값은 제한된 최대 가능성-기반 반복 측정 방안 (혼합 모델 (Mixed Model))을 이용하여 계산하였다. NHV에 비한 P 값은 윌콕슨 순위 합 검정 (Wilcoxon Rank Sumtest)을 이용하여 계산하였다.
도 21a-c는 aHUS 환자에서 신장 손상과 연관된 바이오마커 단백질의 농도에 대한 지속적 에쿨리주맙 치료의 종적 효과를 도시하는 상자-수염 도표이다. 도 20a는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 소변 내의 소변 FABP-1의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 소변 FABP-1의 농도 (ng/mg 소변 크레아티닌)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 도 21b는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 소변 내의 소변 시스타틴-C의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 소변 시스타틴-C의 농도 (ng/mg 소변 크레아티닌)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 도 21c는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 소변 내의 소변 클러스테린의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 소변 클러스테린의 농도 (ng/mg 소변 크레아티닌)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 상자-수염 도표는 중앙, 25th, 및 75th 백분위수 및 범위를 보여준다. *수준이 기준선 (BL)에 비해 유의하게 감소한 제1 시점; 각각의 시점에서 기준선에 대한 P 값은 제한된 최대 가능성-기반 반복 측정 방안 (혼합 모델)을 이용하여 계산하였다. NHV에 비한 P 값은 윌콕슨 순위 합 검정을 이용하여 계산하였다.
도 22는 aHUS 환자에서 보체 대체 경로 활성화에 대한 지속적 에쿨리주맙 치료의 종적 효과를 도시하는 상자-수염 도표이다. 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 혈장 내의 Ba의 농도 (ng/mL)의 시간 경과에 따른 변화를, 정상의 건강한 지원자 (NHV)에서 혈장 Ba의 농도와 함께 도시한다. 상자-수염 도표는 중앙, 25th, 및 75th 백분위수 및 범위를 보여준다. *수준이 기준선 (BL)에 비해 유의하게 감소한 제1 시점; 각각의 시점에서 기준선에 대한 P 값은 제한된 최대 가능성-기반 반복 측정 방안 (혼합 모델)을 이용하여 계산하였다. NHV에 비한 P 값은 윌콕슨 순위 합 검정을 이용하여 계산하였다.
도 23a-c는 aHUS 환자에서 염증, 내피 세포 활성화, 및 조직 손상과 연관된 바이오마커 단백질의 농도에 대한 지속적 에쿨리주맙 치료의 종적 효과를 도시하는 상자-수염 도표이다. 도 23a는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 혈청 내의 sTNFR1의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 혈청 내의 sTNFR1의 농도 (pg/mL)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 도 23b는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 혈청 내의 분석물의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 혈청 내의 sVCAM-1의 농도 (ng/mL)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 도 23c는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 혈장 내의 분석물의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 혈장 내의 트롬보모듈린의 농도 (ng/mL)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 상자-수염 도표는 중앙, 25th, 및 75th 백분위수 및 범위를 보여준다. *수준이 기준선 (BL)에 비해 유의하게 감소한 제1 시점; 각각의 시점에서 기준선에 대한 P 값은 제한된 최대 가능성-기반 반복 측정 방안 (혼합 모델)을 이용하여 계산하였다. NHV에 비한 P 값은 윌콕슨 순위 합 검정을 이용하여 계산하였다.
도 24a-b는 aHUS 환자에서 혈전증 및 응고와 연관된 바이오마커 단백질의 농도에 대한 지속적 에쿨리주맙 치료의 종적 효과를 도시하는 상자-수염 도표이다. 도 24a는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 혈장 내의 분석물의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 혈장 내의 F1+2의 농도 (pmol/L)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 도 24b는 정상의 건강한 지원자 (NHV)의 혈장 내의 분석물의 농도에 비해 에쿨리주맙 치료 후에 aHUS 환자의 혈장 내의 D-이량체의 농도 (㎍/L)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 것이다. 상자-수염 도표는 중앙, 25th, 및 75th 백분위수 및 범위를 보여준다. *수준이 기준선 (BL)에 비해 유의하게 감소한 제1 시점; 각각의 시점에서 기준선에 대한 P 값은 제한된 최대 가능성-기반 반복 측정 방안 (혼합 모델)을 이용하여 계산하였다. NHV에 비한 P 값은 윌콕슨 순위 합 검정을 이용하여 계산하였다.
보체계의 개요
보체계는 세포성 및 바이러스 병원체의 침입에 대해 방어하는 신체의 다른 면역학적 시스템과 함께 작용한다. 적어도 25가지의 보체 단백질이 존재하고, 이것은 혈장 단백질 및 막 보조인자의 복합체 집단으로서 발견된다. 혈장 단백질은 척추동물 혈청에서 약 10%의 글로불린을 구성한다. 보체 성분들은 일련의 복합하지만 정밀한 효소적 절단 및 막 결합 사건에서 상호작용함으로써 그들의 면역 방어 기능을 달성한다. 생성되는 보체 케스케이드는 옵소닌작용 (opsonic), 면역조절, 및 용해 기능을 갖는 생성물의 생산을 일으킨다. 보체 활성화와 연관된 생물학적 활성의 요약은 예를 들어 문헌 [The Merck Manual, 16th Edition]에 제공된다.
보체 케스케이드는 고전 경로, 대체 경로, 또는 렉틴 경로를 통해 진행한다. 이들 경로는 많은 성분을 공유하고, 초기 단계에서는 상이하지만, 활성화 및 표적 세포의 활성화를 책임지는 동일한 "말단 보체" 성분 (C5 내지 C9)으로 수렴하고 이를 공유한다.
고전 경로 (CP)는 대개 표적 세포 상의 항원 부위의 항체 인식, 및 그에 대한 결합에 의해 개시된다. 대체 경로 (AP)는 항체 비의존성일 수 있고, 병원체 표면 상의 특정 분자에 의해 개시될 수 있다. 추가로, 렉틴 경로는 대개 고-만노스 기질에 대한 만노스-결합 렉틴 (MBL)의 결합과 함께 개시된다. 이들 경로는 보체 성분 C3이 활성 프로테아제에 의해 절단되어 C3a 및 C3b를 생성하는 지점으로 수렴한다. 보체 공격을 활성화하는 다른 경로는 보체 기능의 다양한 측면을 일으키는 사건들의 순서에서 나중에 작용할 수 있다. C3a은 아나필락시스 독소 (anaphylatoxin)이다. C3b는 박테리아 및 다른 세포뿐만 아니라 특정 바이러스 및 면역 복합체에 결합하고, 순환계로부터 제거하기 위해 이들에 태그를 붙인다. C3b의 상기 옵소닌 기능은 일반적으로 보체계의 가장 중요한 항-감염 작용인 것으로 여겨진다. C3b는 또한 각각의 경로에 특유한 다른 성분과 함께 복합체를 형성하여 고전 또는 대체 C5 전환효소를 형성하고, 이것은 보체 성분 C5 (이하에서 "C5"로서 칭함)을 절단하여 C5a 및 C5b를 생성시킨다.
C5의 절단은 예를 들어 C5a (강력한 아나필락시스 독소 및 화학주성 (chemotactic) 인자), 및 C5b (이것은 일련의 단백질 상호작용을 통해 용해성 말단 보체 복합체인 C5b-9의 형성을 일으킨다)와 같은 생물학적 활성 종을 방출한다. C5a 및 C5b-9는 또한 하류 염증 인자, 예컨대 가수분해 효소, 반응성 산소 종, 아라키돈산 대사체 및 다양한 시토킨의 방출을 증폭시킴으로써 다표현형 (pleiotropic) 세포 활성화 특성을 갖는다.
C5b는 C6, C7, 및 C8과 조합하여 표적 세포의 표면에서 C5b-8 복합체를 형성한다. 여러 C9 분자의 결합 시에, 막 공격 복합체 (MAC, C5b-9, 말단 보체 복합체--TCC)가 형성된다. 충분한 수의 MAC가 표적 세포 막 내로 삽입되면, 이들이 생성하는 구멍 (MAC 공극)이 표적 세포의 신속한 삼투성 용해를 매개한다. MAC의 보다 낮은 비-용해 농도는 다른 효과를 생성할 수 있다. 특히, 내피 세포 및 혈소판 내로 소수의 C5b-9 복합체의 막 삽입은 유해한 세포 활성화를 유발할 수 있다. 몇몇 경우에, 활성화는 세포 용해에 선행할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, C3a 및 C5a는 활성화된 보체 성분이다. 이들은 비만 세포 탈과립을 촉발할 수 있고, 이것은 호염기구 및 비만 세포로부터 히스타민, 및 다른 염증 매개물질을 방출시켜, 평활근 수축, 증가된 혈관 투과성, 백혈구 활성화, 및 세포 과다를 일으키는 세포 증식을 포함한 다른 염증 현상을 일으킨다. C5a는 또한 염증유발 과립구를 보체 활성화의 부위로 끌어당기는 화학주성 펩티드로서 기능을 한다. C5a 수용체는 기관지 및 허파꽈리 상피 세포 및 기관지 평활근 세포의 표면 상에서 발견된다. C5a 수용체는 또한 호산구, 비만 세포, 단핵구, 중성구, 및 활성화된 림프구 상에서 발견되었다.
발명의 상세한 설명
본원에서 설명되고 실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 aHUS에 대한 바이오마커를 확인하였다. 예를 들어, 특정 단백질의 상승한 농도 또는 몇몇 경우에 감소한 농도가 aHUS의 존재와 연관됨이 밝혀졌다. 이와 유사하게, 보체 억제제를 사용하여 치료한 aHUS 환자로부터 얻은 생물학적 유체 내의 특정 단백질의 감소한 또는 상승한 농도 (또는 활성)는 환자가 억제제를 사용하는 요법에 반응하였음을 지시한다. 따라서, 상기 단백질의 농도 및/또는 활성 수준의 분석은 특히, aHUS에 대한 위험을 평가하고/하거나, aHUS를 진단하고/하거나, aHUS의 진행 또는 완화를 모니터링하고/하거나, 및/또는 보체 억제제에 대한 치료 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
aHUS 바이오마커 단백질 및 용도
aHUS 바이오마커 단백질 (및 이들이 발견되는 예시적인 생물학적 유체)을 표 1에 제시한다. 본원의 출원일 현재 이용가능한 GenBank (National Center for Biotechnology Information (NCBI))에서 표 1에 나열된 각각의 바이오마커의 명칭과 연관된 단백질 서열을 본원에 참고로 포함시킨다.
<표 1>
Figure 112020055722894-pat00001
Figure 112020055722894-pat00002
Figure 112020055722894-pat00003
* 예시적인 인간 서열에 대한 NCBI 기탁 번호를 표에 열거된 각각의 바이오마커 단백질에 대해 제공한다.
** 가용성 형태의 수용체는 막 결합된 형태의 수용체의 단백질 분해 처리에 의해 생성된다.
*** UniProtKB (컨소시엄: 유러피안 바이오인포매틱스 인스티튜트 (European Bioinformatics Institute, 영국 캠브리지); 스위스 인스티튜트 오브 바이오인포매틱스 (Swiss Institute of Bioinformatics; 스위스 제네바); 및 프로테인 인포메이션 리소스 (Protein Information Resource, 워싱턴 디.씨.)) - 트롬빈에 의해 절단되어 피브린을 형성하는 인간 피브리노겐 알파에 대한 명칭. D-이량체는 피브린의 분해 산물이다. 피브리노겐의 피브린으로의, 피브린의 D-이량체로의 절단-기반 전환에 대한 설명은 문헌 [Soheir et al. (2009) Blood 113(13):2878-2887]에 기재되어 있고, 적어도 D-이량체의 형성에 관련되기 때문에 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된다.
본원에 제공되는 바이오마커는 예를 들어, aHUS가 발생할 위험을 평가하고/하거나, aHUS를 진단하고/하거나, 대상체가 aHUS의 최초 급성 징후를 겪는지 결정하고/하거나, aHUS의 진행 또는 완화를 모니터링하고/하거나, 보체 억제제를 사용하는 치료에 대한 반응을 모니터링하고/하거나, 그러한 치료를 최적화하기 위해 단독으로 또는 표시자로서 조합하여 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 개별적인 aHUS 바이오마커 단백질이 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표 1로부터 선택되는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이상의 aHUS 바이오마커 단백질이 패널 (panel)로서 조합하여 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, aHUS 바이오마커 단백질은 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 (예를 들어, Ba 또는 Bb), 가용성 C5b9 (sC5b9), 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 프로트롬빈 단편 F1+2, D-이량체, CXCL10, MCP-1, TNFR1, IFN-γ, ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), CXCL9, KIM-1, IL-18, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), IL-6, 알부민, IL-8, 및 CCL5로부터 선택된다. 표 1의 하나 이상의 바이오마커 (또는 본원에서 언급된 바이오마커의 임의의 하위세트)의 농도 및/또는 활성이 측정될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 정상 대조군 샘플 내의 d-이량체의 농도에 비해 상승한 d-이량체 농도, 및 정상 대조군 샘플 내의 FABP-1의 농도에 비해 상승한 FABP-1 농도는 aHUS 환자가 최초 급성 aHUS 징후를 경험하고 있음을 나타낸다. 몇몇 예에서, 상기 aHUS 바이오마커 단백질 중의 하나 또는 둘 모두의 증가는 정상 대조군에 비해 유의한 증가일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 예를 들어 반복된 투석을 받지 않은 aHUS 환자의 샘플의 풀로부터 얻은 분석물의 대조군 농도에 비해 상승한, aHUS 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 TNFR1, Ba, C5b-9, F1+2, β2M, 클러스테린, TIMP-1, NGAL, CysC, 및 C5a (표 7 참조)의 농도는 환자가 반복된 투석을 받았음을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 예를 들어 신장 이식을 받지 않은 aHUS 환자의 샘플의 풀로부터 얻은 분석물의 대조군 농도에 비해 상승한, aHUS 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 내의 C5a 및 FABP-1 (예를 들어, 소변 C5a 및 FABP-1) 중의 하나 또는 둘 모두의 농도는 환자가 신장 이식을 받았음을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 예를 들어 반복 혈장 요법을 받지 않은 aHUS 환자의 샘플의 풀로부터 얻은 분석물의 대조군 농도에 비해 상승한, aHUS 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 내의 시스타틴 C (예를 들어, 소변 시스타틴 C)의 농도는 환자가 반복 혈장 요법을 받았음을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 Ba 농도에 비해 치료 후 Ba 농도 (예를 들어, 혈장 Ba 농도)의 적어도 10% (예를 들어, 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%)의 감소는 대상체가 완전한 혈전성 미세혈관 병증 (TMA) 반응 (즉, TMA 사건의 중지)을 가졌거나 이를 달성할 가능성이 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 감소는 보체 억제제를 사용한 제1 치료 후 제12주까지 발생한다. 몇몇 실시양태에서, 감소는 보체 억제제를 사용한 제1 치료 후 제12-17주 내에 발생한다. 몇몇 실시양태에서, 감소는 보체 억제제를 사용한 제1 치료 후 제26주까지 발생한다.
몇몇 실시양태에서, 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플(들) 내의 각각의 농도에 비해 치료 후 CCL5 및 sCD40L 중의 하나 또는 둘 모두의 적어도 10% (예를 들어, 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%)의 감소는 대상체가 증가된 혈소판 계수 (예를 들어, 혈소판 회복)를 가졌거나 이를 달성할 가능성이 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 치료 전에 대상체로부터 얻은 동일한 종류의 생물학적 유체의 샘플 내의 Ba 농도에 비해 치료 후 Ba 농도 (예를 들어, 혈장 Ba 농도)의 적어도 10% (예를 들어, 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%)의 감소 (또는 Ba 농도의 정상화)는 대상체가 완전한 혈전성 미세혈관 병증 (TMA) 반응 (즉, TMA 사건의 중지)을 가졌거나 이를 달성할 가능성이 있음을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 하나 이상의 aHUS 바이오마커의 상태는 보체 억제제를 사용하여 치료된 aHUS 환자에 대한 추정된 사구체 여과율 (eGFR)의 개선을 예측할 수 있다. 예를 들어, 프로트롬빈 F1+2 (예를 들어, 장기 치료 요법에서 초기 치료 후 4, 5, 또는 6주 내) 및/또는 d-이량체 (예를 들어, 장기 치료 요법에서 초기 치료 후 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17주 내)의 농도 감소는 보체 억제제를 사용하여 치료된 aHUS 환자가 eGFR의 임상적으로 유의한 개선을 달성하였거나 달성할 가능성이 있음을 나타낸다. eGFR의 임상적으로 유의한 개선의 달성 또는 달성 가능성은 또한 IL-6 및 IFN-γ 농도의 정상화 (예를 들어, 장기 치료 요법에서 보체 억제제를 사용하는 초기 치료 후 4, 5, 또는 6주 내)에 의해 표시된다. eGFR의 임상적으로 유의한 개선의 달성 또는 달성 가능성은 또한 Ba, CXCL9, CXCL10, 및 vWF 농도의 정상화 (예를 들어, 장기 치료 요법에서 초기 보체 억제제를 사용하는 초기 치료 후 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17주 내)에 의해 표시된다. 몇몇 실시양태에서, eGFR의 임상적으로 유의한 개선의 달성 또는 달성 가능성은 또한 Ba, CXCL9, CXCL10, β2M (예를 들어, 소변 내의), CysC (예를 들어, 소변 내의), vWF, d-이량체, 클러스테린 (예를 들어, 소변 내의), 및/또는 FABP-1 (예를 들어, 소변 내의) 농도의 정상화 (예를 들어, 장기 치료 요법에서 초기 보체 억제제를 사용하는 치료 후 26주 내)에 의해 표시된다.
대상체 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서 하나 이상의 비정형적 용혈성 요독증후군 (aHUS)-연관 바이오마커 단백질의 상태를 모니터링하거나 평가하는 방법은 생물학적 유체 내의 (i) 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의) aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도 중의 하나 또는 둘 모두를 대상체로부터 얻은 생물학적 유체에서 측정하는 것을 포함한다.
생물학적 샘플 내의 단백질 발현 수준을 측정하거나 결정하는 것은 임의의 적합한 방법에 의해 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY] 참조). 일반적으로, 단백질 수준은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질에 대한 결합제와 접촉시키고; 샘플 (예를 들어, 생물학적 유체)에서 결합제에 결합하는 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질의 수준을 검출하고; 샘플 내의 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질의 수준을 대조군 샘플 (예를 들어, 정상 샘플) 내의 대응하는 단백질 바이오마커의 수준과 비교함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, 적절한 결합제는 펩티드 성분이 존재하거나 존재하지 않는 리보솜, RNA 분자, 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질 마커의 폴리펩티드 서열, 그의 펩티드 변이체, 또는 상기 서열의 비-펩티드 모방체를 포함하는 폴리펩티드)이다.
적절한 결합제는 또한 본원에서 설명되는 aHUS 바이오마커 단백질에 특이적인 항체 (예를 들어, 표 1에 제시된 임의의 바이오마커에 특이적인 항체)를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기 적절한 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab 단편 또는 scFvs)을 포함한다. 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단편 및 키메라를 포함하는 항체는 관련 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497]; [Kozbor et al. (1985) J Immunol Methods 81:31-42]; [Cote et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-203]; 및 [Zhang et al. (2002) J Biol Chem 277:39379-39387] 참조). 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 관련 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해 정제될 수 있다. 또한, 항체는 상업적인 공급원으로부터 얻을 수 있다.
특정 실시양태에서, 결합제는 검출가능한 모이어티 (moiety)로 직접 또는 간접적으로 표지된다. 검출가능한 작용제의 역할은 단백질 마커 (또는 그의 단편)였에 대한 결합제의 결합에 의해 형성된 복합체의 가시화를 허용함으로써 진단 방법의 검출 단계를 용이하게 하는 것이다. 검출가능한 작용제는 측정될 수 있고 그의 강도가 분석되는 샘플에 존재하는 단백질 마커의 양에 관련되는 (바람직하게는 비례하는) 신호를 생성하도록 선택될 수 있다. 생물학적 분자, 예컨대 폴리펩티드 및 항체를 표지하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 매우 다양한 검출가능한 작용제가 본 발명의 실행시에 사용될 수 있다. 적절한 검출가능한 작용제는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 다양한 리간드, 방사성 핵종, 형광 염료, 화학발광제, 마이크로입자 (예컨대, 예를 들어, 양자점 (quantum dot), 나노결정, 인광체 등), 효소 (예컨대, 예를 들어, ELISA에 사용되는 것, 즉, 호스래디시 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 비색 표지, 자기 표지, 및 비오틴, 디곡시게닌 또는 그에 대한 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용가능한 다른 합텐 및 단백질.
특정 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 항체)는 운반체 또는 지지체 (예를 들어, 비드, 자기 입자, 라텍스 입자, 미량역가 플레이트 웰, 큐벳 (cuvette), 또는 다른 반응 용기) 상에 고정될 수 있다. 적절한 운반체 또는 지지체 물질의 예는 아가로스, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 덱스트란, 세파덱스(Sephadex)®, 세파로스(Sepharose)®, 리포솜, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 반려암 (gabbro), 여과지, 자철석, 이온-교환 수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 비단 등을 포함한다. 결합제는 제1 결합제에 특이적인 제2 결합제를 사용하여 간접적으로 고정될 수 있다 (예를 들어, 단백질 마커에 특이적인 마우스 항체는 운반체 또는 지지체에 코팅된 양 항-마우스 IgG Fc 단편 특이적 항체를 사용하여 고정될 수 있다).
생물학적 샘플 내의 단백질 발현 수준은 면역검정을 사용하여 결정될 수 있다. 상기 검정의 예는 시분해 (time resolved) 형광 면역검정 (TR-FIA), 방사성 면역검정, 효소 면역검정 (예를 들어, ELISA), 면역형광 면역침전, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 및 조직화학적 시험 관련 기술 분야에 잘 알려진 통상의 방법인 웨스턴 블롯 (Western blot)이다. 결합제가 단백질 마커에 결합함으로써 형성된 복합체에 의해 생성된 신호의 검출 및 정량 방법은 검정의 특성 및 검출가능한 모이어티 (예를 들어, 형광 모이어티)의 특성에 따라 결정될 것이다.
일례에서, 유전자의 단백질 발현의 존재 또는 양 (예를 들어, 표 1에 제시된 aHUS 바이오마커 단백질)은 웨스턴 블로팅 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 용해물은 생물학적 샘플로부터 제조될 수 있거나, 또는 생물학적 샘플 (예를 들어, 생물학적 유체) 자체가 림리 (Laemmli) 완충제와 접촉하고, 소듐-도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 적용될 수 있다. 이어서, 크기에 의해 분리된 SDS-PAGE-분리 단백질은 필터 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스)로 전달되고, 관심있는 단백질에 특이적인 검출가능하게-표지된 항체를 사용하여 면역블로팅 (immunoblotting) 기술에 적용될 수 있다. 결합된 검출가능하게-표지된 항체의 존재 또는 양은 생물학적 샘플 내의 단백질의 존재 또는 양을 나타낸다.
또 다른 예에서, 면역검정은 aHUS 바이오마커 단백질 (예를 들어, 표 1에 제시된 단백질)의 발현을 검출 및/또는 측정하기 위해 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이, 검출을 위해, 면역검정은 검출 모이어티 (예를 들어, 형광 물질 또는 효소)를 보유하는 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 생물학적 샘플로부터의 단백질은 고상 매트릭스 (예를 들어, 다중 웰 검정 플레이트, 니트로셀룰로스, 아가로스, 세파로스®, 코딩된 입자, 또는 자기 비드)에 직접 접합될 수 있거나 또는 특이적 결합쌍의 제2 멤버 (예를 들어, 스트렙타비딘 또는 비오틴)에 대한 결합시에 고상 매트릭스에 부착되는 특이적 결합쌍의 제1 멤버(예를 들어, 비오틴 또는 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다. 고상 매트릭스에 대한 상기 부착은 검출 항체와 접촉하기 전에 생물학적 샘플의 다른 방해 또는 무관한 성분으로부터 단백질의 정제를 허용하고, 또한 배결합된 항체의 후속 세척을 허용한다. 여기서, 상기한 바와 같이, 결합된 검출가능하게-표지된 항체의 존재 또는 양은 생물학적 샘플 내의 단백질의 존재 또는 양을 나타낸다.
별법으로, 단백질 발현 수준은 단백질의 검출을 위해 관련 기술 분야에 알려진 질량 분광 분석 기반 방법 또는 영상-기반 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 다른 적합한 방법은 2D-겔 전기영동, 단백질체학 (proteomics)-기반 방법, 예컨대 겔로부터 회수된 개개의 단백질의 확인 (예를 들어, 질량 분광 분석 또는 N-말단 서열결정에 의한) 및/또는 생물정보학 (bioinformatics)을 포함한다.
단백질 발현의 검출 또는 측정 방법은 임의로 다수 샘플의 신속한 제조, 처리 및 분석을 허용하는 방식으로 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어 다중 웰 검정 플레이트 (예를 들어, 96 웰 또는 386 웰) 또는 어레이 (예를 들어, 단백질 칩)에서 수행될 수 있다. 다양한 시약에 대한 원액은 수작업으로 또는 기계에 의해 제공될 수 있고, 후속적인 샘플 제조, 피펫 작업, 희석, 혼합, 분배, 세척, 인큐베이팅 (예를 들어, 혼성화), 샘플 판독, 데이타 수집 (광학 데이타) 및/또는 분석 (컴퓨터 보조 영상 분석)은 상업적으로 이용가능한 분석 소프트웨어, 로봇공학, 및 검정으로부터 생성된 신호를 검출할 수 있는 검출 기기를 사용하여 기계에 의해 수행될 수 있다. 상기 검출기의 예는 분광광도계, 광도계, 형광계, 및 방사성 동위원소 붕괴를 측정하는 장치를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 고속 (high-throughput) 세포 기반 검정 (예를 들어, 세포에서 표적 단백질의 존재 또는 수준을 검출)은 ArrayScan® VTI HCS Reader 또는 KineticScan® HCS Reader 기술 (셀로믹스 인크. (Cellomics Inc.), 미국 펜실베니아주 피츠버그)을 이용할 수 있다.
vWF의 활성을 결정하기 위한 방법은 또한 관련 기술 분야에 알려져 있고, 본원에서 설명된다 (예를 들어, 실시예). 또한, 예를 들어, 문헌 [Horvath et al. (2004) Exp Clin Cardiol 9(10):31-34]을 참고한다. 시판 키트가 또한 이용가능하다 - 인스트루멘테이션 래보러토리 (Instrumentation Laboratory, 미국 매사추세츠주 베드포드; 카탈로그 번호: 0020004700) 및 퀘스트 다이어그노스틱스 (Quest Diagnostics, 미국 뉴저지주 매디슨).
몇몇 실시양태에서, 적어도 2개의 aHUS 바이오마커 단백질 (예를 들어, 적어도 3개의 단백질, 적어도 4개의 단백질, 적어도 5개의 단백질, 적어도 6개의 단백질, 적어도 7개의 단백질, 적어도 8개의 단백질, 적어도 9개의 단백질, 적어도 10개의 단백질, 적어도 11개의 단백질, 적어도 12개의 단백질, 적어도 13개의 단백질, 적어도 14개의 단백질, 적어도 15개의 단백질, 적어도 16개의 단백질, 적어도 17개의 단백질, 적어도 18개의 단백질, 적어도 19개의 단백질, 적어도 20개의 단백질, 적어도 21개의 단백질, 적어도 22개의 단백질, 적어도 23개의 단백질, 또는 적어도 24개의 단백질 또는 그 초과)의 단백질 발현 수준 (또는 활성)이 평가 및/또는 측정될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, aHUS 바이오마커 단백질이 측정되는 생물학적 유체는 혈액이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 유체는 혈액 분획, 예를 들어, 혈청 또는 혈장이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 유체는 소변이다. 몇몇 실시양태에서, 모든 측정은 하나의 생물학적 유체 샘플 (예를 들어, 혈청 샘플)에 대해 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 측정은 대상체로부터 얻은 적어도 2개의 상이한 생물학적 유체에 대해 수행된다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질의 농도 또는 활성은 환자로부터 얻은 혈청 샘플에서 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 2개의 상이한 샘플 매트릭스에서 상이한 분석물의 시험을 허용하도록 혈액 샘플 및 소변 샘플이 이용가능하다.
대상체는 예를 들어 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 인간일 수 있다. 대상체는 보체의 억제제 (예를 들어, 보체 성분 C5의 억제제, 예컨대 항-C5 항체)로 치료된 (또는 치료되고 있는) 대상체일 수 있다. 치료는 대상체로부터 샘플을 얻기 전 1개월 미만 (예를 들어, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 미만) 내에 실시된 것일 수 있다.
이 방법은 대상체에 aHUS가 존재하거나 발생할 위험이 있는지 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체가 미리 결정된 투여 일정 하에 보체 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)로 치료되었거나 치료되고 있는 경우, 방법은 환자가 보체 억제제 요법에 (치료상) 반응성인지 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 aHUS 바이오마커 단백질 농도의 측정된 값(들)의 기록을 필요로 한다. 기록은 서면으로 작성되거나 컴퓨터 판독가능 매체에 작성될 수 있다. 방법은 또한 적어도 하나의 aHUS 바이오마커 단백질 농도의 측정된 값(들)을 대상체 및/또는 대상체가 그의 관리 하에 있는 의료 전문가에게 통보하는 것을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 임의의 방법은 대상체가 미리 결정된 투여 일정 하에 억제제를 사용한 치료에 반응성이 아니면, 대상체에게 미리 결정된 투여 일정에 비해 보다 많은 용량 또는 증가된 투여 빈도로 보체 억제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 방법 중의 일부는 aHUS 바이오마커 단백질의 측정된 농도 또는 활성 (대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 내에서 측정된)을 대조군 샘플에 비교하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 대조군 샘플은 대상체에게 보체 억제제 (예를 들어, C5 억제제, 예컨대 에쿨리주맙)를 투여하기 전에 대상체로부터 얻는다. 몇몇 실시양태에서, 대조군 샘플은 예를 들어 보체 억제제를 투여하지 않은 1명 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40명 또는 그 초과의) 건강한 개체로부터 얻은 샘플 집단일 수 있다 (또는 이를 기초로 할 수 있다). 몇몇 실시양태에서, 대조군 샘플은 예를 들어 2명 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40명 또는 그 초과의) 개체로부터 얻은 모아진 샘플일 수 있다 (또는 이를 기초로 할 수 있다). 본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 모아진 샘플은 건강한 개체, 또는 적어도, aHUS가 존재하지 않거나 존재하는 것으로 (발생할 위험이 있는 것으로) 의심되지 않는 개체로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 대상체가 aHUS가 존재하는 대상체인지 결정하는 것은 대상체 내의 하나 이상의 혈청 바이오마커의 측정된 농도를 비교하고, 측정된 농도를 모아진 건강한 샘플 내의 동일한 바이오마커의 평균 농도와 비교하는 것을 수반할 수 있다. 유사하게, aHUS 연관 바이오마커의 농도 또는 활성이 보체 억제제를 사용하는 치료 후에 감소되었는지 결정하는 것은 보체 억제제를 사용하는 치료 전에 대상체로부터 얻은 생물학적 유체 내의 단백질의 농도 또는 활성을 억제제를 사용한 치료 후에 (예를 들어, 억제제를 사용한 치료 (예를 들어, 장기적인 요법에서 일련의 치료의 최초 치료) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 6주, 2개월, 또는 3개월 후에) 환자로부터 얻은 동일한 생물학적 유체의 샘플 내의 단백질의 농도와 비교하는 것을 수반할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 보체 억제제가 인간에서 요구되는 효과 (예를 들어, aHUS 바이오마커 단백질의 농도 또는 활성의 감소)를 생성했는지 결정하는 것은 단백질의 치료 후 농도가 인간에서 보체 억제제에 대한 반응성을 나타내는 미리 결정된 범위에 해당하는지 조사함으로써 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제가 인간에서 요구되는 효과를 생성했는지 결정하는 것은 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질의 치료 후 농도 또는 활성이 미리 결정된 컷오프 (cut-off) 값을 초과하는지 또는 그 미만인지 조사하는 것을 포함할 수 있다. 컷오프 값은 일반적으로 그를 초과하는 값 또는 그 미만의 값이 특정 표현형 - 예를 들어, 보체 억제제를 사용하는 요법에 대한 반응성을 나타내는 것으로 생각되는, 제시된 생물학적 유체 내의 제시된 단백질의 농도 또는 활성이다.
본원에서 설명되는 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질의 농도 또는 활성의 변화가 발생했는지 결정하기 위해 동일한 의사가 대상체에게 보체 억제제를 투여할 수 있는 반면, 몇몇 실시양태에서는, 대상체에게 억제제를 투여한 의사는 반응이 대상체에서 발생했는지 결정하는 의사와 상이하다. 몇몇 실시양태에서, 의사는 억제제 투여 전에 대상체로부터 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플)을 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 의사는 대상체에게 억제제를 투여한 후 대상체로부터 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플)을 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 치료 후 샘플은 억제제를 대상체에게 투여한 후 48시간 미만 (예를 들어, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2시간 미만, 또는 심지어 1시간 미만) 내에 대상체로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 치료 후 샘플은 대상체에게 억제제를 투여한 후 20일 미만 (예를 들어, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일, 또는 심지어 1일 미만) 내에 대상체로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 억제제를 대상체에게 투여한 후 20일 이내에 (예를 들어, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 이내에) 대상체로부터 얻는다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법의 다양한 단계는 1명 초과의 의사에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 의사는 대상체로부터 얻은 치료 전 및 후 샘플을 분석할 수 있다 (예를 들어, 샘플 내의 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질의 농도 또는 활성을 측정할 수 있다). 또 다른 의사는 최초 의사에 의한 샘플의 분석에 대한 정보를 수령하고, 이에 의해, 예를 들어 대상체가 보체 억제제를 사용한 치료에 반응했는지 결정할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 추가의 또 다른 의사가 환자로부터 치료 전 생물학적 샘플을 얻을 수 있고, 제4의 의사는 대상체로부터 치료 후 생물학적 샘플을 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 모든 단계는 동일한 의사에 의해 수행된다.
생물학적 샘플 및 샘플 수집
본원에서 설명되는 방법에 사용하기 위한 적절한 생물학적 샘플은 예를 들어 임의의 생물학적 유체를 포함한다. 생물학적 샘플은 예를 들어 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)로부터 얻은 검체일 수 있거나 또는 상기 대상체로부터 유래될 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 생물학적 유체, 예컨대 소변, 전체 혈액 또는 그의 분획 (예를 들어, 혈장 또는 혈청), 타액, 정액, 가래, 뇌척수액, 눈물, 또는 점액일 수 있다. 생물학적 샘플은 요구될 경우, 관심있는 특정 분석물 (예를 들어, 단백질)을 함유하는 분획으로 추가로 분획화될 수 있다. 예를 들어, 전체 혈액 샘플은 혈청으로 또는 특정 종류의 단백질을 함유하는 분획으로 분획화될 수 있다. 요구될 경우, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 상이한 생물학적 샘플의 조합물, 예컨대 2개의 상이한 유체의 조합물일 수 있다.
본 발명에 적절한 생물학적 샘플은 대상체로부터 수집된 신선한 또는 동결된 샘플, 또는 진단, 치료 및/또는 결과 이력 (outcome history)이 알려진 보관 (archival) 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 대상체, 예를 들어 보체-연관 장애, 예컨대 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 대상체로부터 얻을 수 있다. 생물학적 샘플을 얻기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있지만, 예시적인 방법은 예를 들어, 정맥 절개, 면봉 채취 (예를 들어, 구강 면봉 채취), 세척 (lavage), 또는 미세침 흡인물 생검 절차를 포함한다. 생물학적 샘플은 또한 골수로부터 얻을 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 단백질 추출물이 생물학적 샘플로부터 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 단백질 추출물은 전체 단백질 함량을 포함한다. 단백질 추출 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Roe (2001) "Protein PurificationTechniques: A Practical Approach", 2nd Edition, Oxford University Press]를 참고한다. 많은 상이한 및 다목적 키트가 체액 및 조직으로부터 단백질을 추출하기 위해 사용될 수 있고, 그 예는 바이오라드 래보러토리스 (BioRad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘리스), 비디 바이오사이언시즈 클론테크 (BD Biosciences Clontech, 미국 캘리포니아주 마운튼 뷰), 케미콘 인터내셔날, 인크. (Chemicon International, Inc., 미국 캘리포니아주 테메큘라), 칼바이오켐 (Calbiochem, 미국 캘리포니아주 샌디에고), 피어스 바이오테크놀로지 (Pierce Biotechnology, 미국 일리노이주 록포드), 및 인비트로겐 코프 (Invitrogen Corp., 미국 캘리포니아주 칼스바드)로부터 상업적으로 이용가능하다.
생물학적 샘플에서 세포의 활성 또는 완전한 상태를 보존하는 샘플의 획득 및/또는 보관 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 하나 이상의 추가의 작용제, 예컨대 단백질 구조를 보존하거나 이의 변화 (예를 들어, 오스몰 농도 또는 pH의 변화)를 최소화하는 작용제를 의미하는 적절한 완충제 및/또는 억제제와 추가로 접촉될 수 있다. 상기 억제제는 예를 들어 킬레이터, 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA), 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF), 아프로티닌, 및 류펩틴을 포함한다. 전체 세포의 보관 또는 다른 조작을 위한 적절한 완충제 및 조건은 예를 들어, 문헌 [Pollard and Walker (1997), "Basic Cell CultureProtocols", volume 75 of Methods in molecular biology, HumanaPress]; [Masters (2000) "Animal cell culture:a practical approach", volume 232 of Practical approach series, Oxford University Press]; 및 [Jones (1996) "Human cell cultureprotocols", volume 2 of Methods in molecular medicine, HumanaPress]에 기재되어 있다.
샘플은 또한 저해 물질을 제거하거나 그의 존재를 최소화하기 위해 처리될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 관심 대상이 아닌 하나 이상의 물질 (예를 들어, 세포)를 제거하기 위해 분획화되거나 정제될 수 있다. 생물학적 샘플의 분획화 또는 정제 방법은 유동 세포측정, 형광 활성화 세포 분류, 및 침강을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
보체 억제제
임의의 인간 보체 성분에 결합하고 그의 생성 및/또는 활성을 억제하거나 다른 방식으로 억제하는 임의의 화합물이 본 개시내용에 따라 이용될 수 있다. 예를 들어, 보체의 억제제는 예를 들어, 소분자, 핵산 또는 핵산 유사체, 펩티드 모방체, 또는 핵산 또는 단백질이 아닌 거대분자일 수 있다. 상기 물질은 유기 소분자, RNA 앱타머, L-RNA 앱타머, 스피에겔머 (Spiegelmer), 안티센스 화합물, 이중가닥 RNA, 작은 간 RNA, 잠금 (locked) 핵산 억제제, 및 펩티드 핵산 억제제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 단백질 또는 단백질 단편일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조성물은 인간 보체 성분에 특이적인 항체를 함유한다. 몇몇의 화합물은, 보체 성분 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 인자 D, 인자 B, 인자 P, MBL, MASP-1, MASP-2, 프로페르딘, 또는 임의의 이들의 생물학적 활성 단편에 대해 작용하고 따라서 C5a와 연관된 아나필락시스 독성 활성의 생성 및/또는 막 공격 복합체 C5b-9의 조립을 억제하는 항체를 포함한다.
조성물은 또한 천연 생성 또는 가용성 형태의 보체 억제 화합물, 예컨대 CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59, 인자 H, 코브라 독 인자, FUT-175, 콤플레스타틴, 및 K76 COOH를 함유할 수 있다. 임의의 인간 보체 성분에 결합하거나 또는 이 성분의 생성 및/또는 활성을 다른 방식으로 차단하기 위해 이용될 수 있는 다른 화합물은 단백질, 단백질 단편, 펩티드, 소분자, RNA 앱타머, 예를 들어 ARC187 (아케믹스 코퍼레이션 (Archemix Corporation, 미국 매사추세츠주 캠브리지))로부터 상업적으로 이용가능함), L-RNA 앱타머, 스피에겔머, 안티센스 화합물, 세린 프로테아제 억제제, RNA 간섭 (RNAi)에 이용될 수 있는 분자, 예컨대 이중가닥 RNA, 예를 들어 작은 간섭 RNA (siRNA), 잠금 핵산 (LNA) 억제제, 펩티드 핵산 (PNA) 억제제 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 보체의 활성화를 억제한다. 예를 들어, 보체 억제제는 C1 (예를 들어, C1q, C1r, 또는 C1s)에 결합하고 그의 보체 활성화 활성을 억제할 수 있거나 또는 보체 억제제는 C2, C3, 또는 C4에 결합하고 그를 억제 (예를 들어, 그의 절단을 억제)할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 억제제는 보체의 대체 및/또는 고전 경로의 C3 전환효소 및/또는 C5 전환효소의 형성 또는 조립을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 말단 보체 형성, 예를 들어, C5b-9 막 공격 복합체의 형성을 억제한다. 예를 들어, 항체 보체 억제제는 항-C5 항체를 포함할 수 있다. 상기 항-C5 항체는 C5b의 형성 및/또는 생리학적 기능을 억제하도록 C5 및/또는 C5b와 직접 상호작용할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물은 인간 보체 성분 C5의 억제제 (예를 들어, 인간 보체 성분 C5 단백질 또는 그의 생물학적 활성 단편, 예컨대 C5a 또는 C5b에 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편)을 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "보체 성분 C5의 억제제"는 (i) 세포에 의한 보체 성분 C5 단백질의 발현, 또는 적절한 세포 내 수송 또는 분비; (ii) C5 절단 단편 C5a 또는 C5b의 활성 (예를 들어, C5a의 그의 동족체 (cognate) 세포 수용체에 대한 결합 또는 C5b의 C6 및/또는 말단 보체 복합체의 다른 성분에 대한 결합; 상기 참조); (iii) C5a 및 C5b를 형성하는 인간 C5 단백질의 절단; (iv) 세포에 의한 보체 성분 C5 단백질의 적절한 세포 내 수송 또는 분비; 또는 (v) C5 단백질 또는 C5 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성을 억제하는 임의의 작용제이다. 보체 성분 C5 단백질 발현의 억제는 다음을 포함한다: 인간 C5 단백질을 코딩하는 유전자의 전사의 억제; 인간 C5 단백질을 코딩하는 mRNA의 분해 증가; 인간 C5 단백질을 코딩하는 mRNA의 번역 억제; 인간 C5 단백질의 분해 증가; 프리-프로 (pre-pro) 인간 C5 단백질의 적절한 처리의 억제; 또는 세포에 의한 인간 C5 단백질의 적절한 수송 또는 분비의 억제. 후보 물질이 인간 보체 성분 C5의 억제제인지 결정하는 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있고 본원에서 설명된다.
인간 보체 성분 C5의 억제제는 예를 들어, 소분자, 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 핵산, 또는 핵산 유사체일 수 있다.
"소분자"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 분자량이 바람직하게는 약 6 kDa 미만, 가장 바람직하게는 약 2.5 kDa 미만인 물질을 나타내는 의미를 갖는다. 많은 제약 회사는 임의의 검정으로 스크리닝될 수 있는 소분자, 종종 진균, 박테리아, 또는 조류 추출물의 어레이를 포함하는 화학물질 및/또는 생물학적 물질의 혼합물의 광범한 라이브러리를 보유하고 있다. 본원은 특히 작은 화학물질 라이브러리, 펩티드 라이브러리, 또는 천연 생성물의 수집물을 사용하는 것을 고려한다. 문헌 [Tan et al.]은 최소화 세포 기반 (miniaturized cell-based) 검정에 적합한 2백만 개 초과의 합성 화합물이 존재하는 라이브러리를 설명한 바 있다 (J Am Chem Soc (1998) 120:8565-8566). 관심있는 표적 항원 (예를 들어, 보체 성분 C5)에 결합하는 물질을 스크리닝하기 위해 상기 라이브러리를 사용할 수 있는 것은 본원의 범위 내에 포함된다. 많은 상업적으로 이용가능한 화합물 라이브러리, 예컨대 켐브리지 다이버세트 (Chembridge DIVERSet)가 존재한다. 또한, 라이브러리는 학문적 연구자, 예컨대 NCI 개발 치료 프로그램 (developmental therapeutics program)의 다양성 (Diversity) 세트로부터 이용가능하다. 합리적인 약물 설계도 이용될 수 있다. 예를 들어, 합리적인 약물 설계는 인간 보체 성분 C5 단백질에 대한 결정 또는 용액 구조적 정보를 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hagemann et al. (2008) J Biol Chem 283(12):7763-75] 및 [Zuiderweg et al. (1989) Biochemistry 28(1):172-85]에 기재된 구조를 참고한다. 합리적인 약물 설계는 또한 알려진 화합물, 예를 들어 C5의 알려진 억제제 (예를 들어, 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편)을 기초로 하여 달성될 수 있다.
펩티드 모방체는 적어도 일부의 대상 폴리펩티드가 변형된 화합물일 수 있고, 펩티드 모방체의 3차원 구조는 대상 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 상태로 유지된다. 펩티드 모방체는 그 자체가 대상 폴리펩티드 서열 내에 하나 이상의 치환 또는 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드인 본 개시내용의 대상 폴리펩티드의 유사체일 수 있다. 별법으로, 적어도 일부의 대상 폴리펩티드 서열은 대상 폴리펩티드의 3차원 구조가 실질적으로 유지되도록 하는 비펩티드 구조로 교체될 수 있다. 즉, 대상 폴리펩티드 서열 내의 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기는 비-펩티드 구조로 교체될 수 있다. 또한, 대상 폴리펩티드의 다른 펩티드 부분이 비-펩티드 구조로 교체될 수 있지만, 반드시 교체될 필요는 없다. 펩티드 모방체 (펩티드 및 비-펩티딜 유사체 둘 모두)는 개선된 특성 (예를 들어, 단백질 분해 감소, 보유율 증가 또는 생체이용성 증가)을 가질 수 있다. 펩티드 모방체는 일반적으로 개선된 경구 이용성을 갖고, 이것은 펩티드 모방체를 인간 또는 동물의 장채 치료에 특히 적합하도록 만든다. 펩티드 모방체가 유사한 2차원의 화학적 구조를 갖거나 갖지 않을 수 있지만, 공통적인 3차원의 구조적 특징 및 기하학적 구조를 공유할 수 있음을 유의하여야 한다. 각각의 펩티드 모방체는 하나 이상의 특유한 추가의 결합 요소를 추가로 가질 수 있다.
핵산 억제제는 관심 있는 표적 항원에 결합하고 이를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 길항제는 예를 들어 앱타머일 수 있다. 앱타머는 세포 표면 단백질을 포함하는 거의 모든 분자를 인식하고 특이적으로 결합하기 위해 사용될 수 있는 짧은 올리고뉴클레오티드 서열이다. 지수 증식에 의한 리간드의 계통적 진화 (SELEX) 과정은 강력하고, 상기 앱타머를 쉽게 확인하기 위해 사용될 수 있다. 앱타머는 요법 및 진단에 중요한 광범위한 단백질, 예컨대 성장 인자 및 세포 표면 항원에 대해 제조될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 항체와 유사한 친화도 및 특이성으로 그의 표적에 결합한다 (예를 들어, 문헌 [Ulrich (2006) Handb Exp Pharmacol. 173:305-326] 참조).
몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 비-항체 스캐폴드 (scaffold) 단백질이다. 상기 단백질은 일반적으로 이미 존재하는 항원-결합 단백질의 조합 화학 기반 적응 (combinatorial chemistry-based adaptation)을 통해 얻는다. 예를 들어, 인간 트랜스페린 수용체에 대한 인간 트랜스페린의 결합 부위는, 그 일부가 상이한 항원에 대한 친화도를 획득한 트랜스페린 변이체의 다양한 라이브러리를 생성하기 위해 조합 화학을 사용하여 변형될 수 있다 (Ali et al. (1999) J Biol Chem 274:24066-24073). 수용체에 대한 결합에 관련되지 않는 인간 트랜스페린의 부분은 변하지 않은 상태로 유지되고, 변이체 결합 부위를 제시하기 위해 항체의 프레임워크 영역처럼 스캐폴드로서 기능한다. 이어서, 라이브러리는 항체 라이브러리처럼 표적 항원에 대한 최적 선택성 및 친화도를 갖는 변이체를 확인하기 위해 관심 있는 표적 항원에 대해 스크리닝된다. 비-항체 스캐폴드 단백질은 항체와 기능이 유사하지만, 항체에 비해 많은 이점을 갖는 것으로 제시되고 있고, 상기 이점은 특히 용해도 및 조직 투과성 향상, 보다 낮은 제조 비용 및 관심있는 다른 분자에 대한 접합 용이성을 포함한다 (Hey et al. (2005) TRENDS Biotechnol 23(10):514-522).
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 비-항체 스캐폴드 단백질의 스캐폴드 부분이 예를 들어 다음의 전부 또는 일부를 포함할 수 있음을 이해할 것이다: 에스. 아우레우스(S. aureus) 단백질 A의 Z 도메인, 인간 트랜스페린, 인간 10번째 피브로넥틴 타입 III 도메인, 인간 트립신 억제제의 쿠니츠 (kunitz) 도메인, 인간 CTLA-4, 안키린 본복 단백질, 인간 리포칼린, 인간 크리스탈린, 인간 유비퀴틴, 또는 이. 엘라테리움(E. elaterium)의 트립신 억제제. Id.
몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이다 (이하에서, 항체를 때때로 "항-C5 항체"로서 칭할 수 있다).
몇몇 실시양태에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질의 알파 사슬 내의 에피토프에 결합할 수 있다. C5의 알파 사슬에 결합하는 항체는 예를 들어, PCT 출원 공개 WO 2010/015608 및 미국 특허 6,355,245에 기재되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질의 베타 사슬 내의 에피토프에 결합할 수 있다. C5 베타 사슬에 결합하는 항체는 예를 들어, 문헌 [Moongkarndi et al. (1982) Immunobiol 162:397]; [Moongkarndi et al. (1983) Immunobiol 165:323]; 및 [Mollnes et al. (1988) Scand J Immunol 28:307-312]에 기재되어 있다.
인간 보체 성분 C5의 추가의 예시적인 항원 단편은 예를 들어 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,355,245에 개시되어 있다.
본원에서 설명되는 융합 단백질에 사용하기 적절한 추가의 항-C5 항체, 및 그의 항원-결합 단편은 예를 들어, 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 PCT 출원 공개 WO 2010/015608에 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질 (예를 들어, 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 C5 단백질)에 특이적으로 결합한다. 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다"는 생리학적 조건 하에서 비교적 안정한 복합체 (예를 들어, 항체와 보체 성분 C5 단백질 사이의 복합체)를 형성하는 2개의 분자를 의미한다. 일반적으로, 결합은 회합 상수 (Ka)가 106 M-1보다 클 때 특이적인 것으로 간주된다. 따라서, 항체는 적어도 106 M-1의 (또는 이보다 큰) (예를 들어, 적어도 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015 M-1 또는 이보다 큰) Ka로 C5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 인간 보체 성분 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 예는 예를 들어 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,355,245에 기재되어 있다.
본원에서 설명되는 항-C5 항체는 보체 성분 C5 단백질 (예를 들어, 인간 C5 단백질)의 C5a 및/또는 C5b 활성 단편의 생성 또는 활성의 차단시에 활성을 가질 수 있다. 상기 차단 효과를 통해, 항-C5 항체는 예를 들어 C5a의 염증유발 효과 및 세포의 표면에서 C5b-9 막 공격 복합체 (MAC)의 생성을 억제한다. C5a의 생성을 차단하는 능력을 갖는 항-C5 항체는 예를 들어, 문헌 [Moongkarndi et al. (1982) Immunobiol 162:397] 및 [Moongkarndi et al. (1983) Immunobiol 165:323]에 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 항-C5 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 보체 성분 C3b (예를 들어, AP 또는 CP C5 전환효소 복합체에 존재하는 C3b)에 결합하는 C5 단백질의 능력을 50% 초과 (예를 들어, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95% 또는 그 초과)의 수준만큼 감소시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, C5 단백질에 대한 결합시에, 항-C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 보체 성분 C4b (예를 들어, CP C5 전환효소에 존재하는 C4b)에 결합하는 C5 단백질의 능력을 50% 초과 (예를 들어, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95% 또는 그 초과)의 수준만큼 감소시킬 수 있다. 항체가 보체 성분 C5 단백질의 C5a 및/또는 C5b 활성 단편의 생성 또는 활성, 또는 보체 성분 C4b 또는 C3b에 대한 결합을 차단할 수 있는지 결정하는 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 미국 특허 6,355,245 및 문헌 [Wurzner et al. (1991) Complement Inflamm 8:328-340]에 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 조성물은 에쿨리주맙 (솔리리스®; 알렉시온 파마슈티컬스, 인크. (Alexion Pharmaceuticals, Inc., 미국 코네티컷주 체셔))을 포함하고/하거나, 항체는 에쿨리주맙이다 (예를 들어, 문헌 [Kaplan (2002) CurrOpin Investig Drugs 3(7):1017-23]; [Hill (2005) Clin Adv Hematol Oncol 3(11):849-50]; 및 [Rother et al. (2007) Nature Biotechnology 25(11):1256-1488] 참조). 몇몇 실시양태에서, 조성물은 펙셀리주맙 (알렉시온 파마슈티컬스, 인크., 미국 코네티컷주 체셔)을 포함하고/하거나, 항체는 펙셀리주맙이다 (예를 들어, 문헌 [Whiss (2002) CurrOpin Investig Drugs 3(6):870-7]; [Patel et al. (2005) Drugs Today (Barc) 41(3):165-70]; 및 [Thomas et al. (1996) Mol Immunol 33(17-18):1389-401] 참조).
몇몇 실시양태에서, C5 억제제는 C5a에 결합하는 항체 (때때로 본원에서 "항-C5a 항체"로 칭함)이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 C5a에 결합하지만, 전장 C5에는 결합하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 C5a에 대한 결합은 C5a의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. C5a 활성의 측정 방법은 예를 들어, 화학주성 검정, RIA, 또는 ELISA를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Ward and Zvaifler (1971) J Clin Invest 50(3):606-16] 및 [Wurzner et al. (1991) Complement Inflamm 8:328-340] 참조). 몇몇 실시양태에서, 항체의 C5a에 대한 결합은 C5a와 C5aR1 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. C5a와 C5aR1 사이의 상호작용의 검출 및/또는 측정을 위한 적합한 방법 (항체의 존재 및 부재 하에)은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Mary and Boulay (1993) EurJ Haematol 51(5):282-287]; [Kaneko et al. (1995) Immunology 86(1):149-154]; [Giannini et al. (1995) J Biol Chem 270(32):19166-19172]; 및 U.S. 특허 출원 공개 20060160726에 기재되어 있다. 예를 들어, 검출가능하게 표지된 (예를 들어, 방사성 표지된) C5a의 C5aR1-발현 말초 혈액 단핵 세포에 대한 결합은 항체의 존재 및 부재 하에 평가될 수 있다. 항체의 부재 하에서의 결합에 비해, 항체의 존재 하에서 C5aR1에 결합하는 검출가능하게-표지된 C5a의 양의 증가는 항체가 C5a와 C5aR1 사이의 상호작용을 억제함을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 C5a에 대한 결합은 C5a와 C5L2 사이의 상호작용을 억제할 수 있다 (하기 참조). C5a와 C5L2 사이의 상호작용의 검출 및/또는 측정 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Ward (2009) J Mol Med 87(4):375-378] 및 [Chen et al. (2007) Nature 446(7132:203-207]에 기재되어 있다 (하기 참조).
몇몇 실시양태에서, C5 억제제는 C5b에 결합하는 항체 (때때로 본원에서 "항-C5b 항체"로서 칭함)이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 C5b에 결합하지만, 전장 C5에는 결합하지 않는다. C5b의 구조는 예를 들어, 문헌 [Mueller-Eberhard (1985) Biochem Soc Symp 50:235-246]; 및 [Yamamoto and Gewurz (1978) J Immunol 120(6):2008-2015]에 기재되어 있다. 상기 설명된 바와 같이, C5b는 C6, C7, 및 C8과 조합하여 표적 세포의 표면에서 C5b-8 복합체를 형성한다. 일련의 조합 동안 형성되는 단백질 복합체는 C5b-6 (C5b 및 C6 포함), C5b-7 (C5b, C6, 및 C7 포함), 및 C5b-8 (C5b, C6, C7, 및 C8 포함)을 포함한다. 여러 C9 분자의 결합 시에, 막 공격 복합체 (MAC, C5b-9 말단 보체 복합체 (TCC))가 형성된다. 충분한 수의 MAC가 표적 세포 막 내로 삽입되면, 이들이 생성하는 구멍 (MAC 공극)이 표적 세포의 신속한 삼투성 용해를 매개한다.
몇몇 실시양태에서, 항체의 C5b에 대한 결합은 C5b와 C6 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 C5b에 대한 결합은 C5b-9 MAC-TCC의 조립 또는 활성을 억제할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 C5b에 대한 결합은 보체-의존 세포 용해를 억제할 수 있다 (예를 들어, 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서). 항체가 보체-의존 용해를 억제하는지 평가하기 위한 적합한 방법은 예를 들어, 용혈 검정 또는 가용성 C5b-9의 활성을 검출하기 위한 다른 기능 검정을 포함한다. 예를 들어, 항체의 존재 하의 보체의 세포 용해 능력의 감소는 문헌 [Kabat and Mayer (eds.), "Experimental Immunochemistry, 2nd Edition", 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), pages 135-139]에 기재된 용혈 검정, 또는 예를 들어 문헌 [Hillmen et al. (2004) N Engl J Med 350(6):552]에 기재되어 있는 닭 적혈구 용혈 방법과 같은 상기 검정의 통상적인 변형 방법에 의해 측정될 수 있다.
C5b에 결합하는 항체 및 상기 항체의 제조 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있다. 상업적으로 이용가능한 항-C5b 항체는 예를 들어 하이컬트 바이오테크놀로지 (Hycult Biotechnology) (카탈로그 번호: HM2080; 클론 568) 및 Abcam™ (ab46151 또는 ab46168)을 포함하는 많은 공급처로부터 이용가능하다.
특정 작용제가 인간 보체 성분 C5의 억제제인지 결정하는 방법은 본원에서 설명되고, 관련 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 체액 내의 C5a 및 C5b의 농도 및/또는 생리학적 활성은 관련 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. C5a 농도 또는 활성의 측정 방법은 예를 들어 화학주성 검정, RIA, 또는 ELISA를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Ward and Zvaifler (1971) J Clin Invest. 50(3):606-16] 및 [Wurzner et al. (1991) Complement Inflamm. 8:328-340] 참조). C5b의 경우, 용혈 검정 또는 본원에서 논의되는 가용성 C5b-9에 대한 검정이 사용될 수 있다. 관련 기술 분야에 알려진 다른 검정도 사용될 수 있다. 상기 또는 다른 적절한 종류의 검정을 사용하여, 예를 들어 본원에서 설명되는 방법에 유용한 화합물을 확인하고 상기 화합물의 적절한 투여 수준을 결정하기 위해, 인간 보체 성분 C5를 억제할 수 있는 후보 작용제, 예컨대 항-C5 항체를 스크리닝할 수 있다.
후보 화합물이 C5a 및 C5b를 형성하는 인간 C5의 절단을 억제하는지 결정하는 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Moongkarndi et al. (1982) Immunobiol 162:397]; [Moongkarndi et al. (1983) Immunobiol 165:323]; [Isenman et al. (1980) J Immunol 124(1):326-31]; [Thomas et al. (1996) Mol. Immunol 33(17-18):1389-401]; 및 [Evans et al. (1995) Mol. Immunol 32(16):1183-95]에 기재되어 있다.
인간 보체 성분 C5의 억제는 또한 대상체의 체액에서 보체의 세포 용해 능력을 감소시킬 수 있다. 존재하는 보체의 상기 세포 용해 능력의 감소는 관련 기술 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 문헌 [Kabat and Mayer (eds.), "Experimental Immunochemistry, 2nd Edition", 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), pages 135-139]에 기재된 용혈 검정과 같은 통상적인 용혈 검정, 또는 예를 들어 문헌 [Hillmen et al. (2004) N Engl J Med 350(6):552]에 기재되어 있는 닭 적혈구 용혈 방법과 같은 상기 검정의 통상적인 변형 방법에 의해 측정될 수 있다.
C3b에 결합하고, 예를 들어 C3b 전환효소를 억제하는 항체가 또한 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 그 개시내용 전부가 각각 본원에 참고로 포함된 PCT 출원 공개 WO 2010/136311, WO 2009/056631, 및 WO 2008/154251을 참고한다. 길항제 항-C6 및 항-C7 항체는 예를 들어 문헌 [Brauer et al. (1996) Transplantation 61(4):588-594] 및 미국 특허 5,679,345에 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 항-인자 B 항체 (예컨대 ATCC 기탁 번호 PTA-6230에 의해 생산된 모노클로날 항체 1379)이다. 항-인자 B 항체는 또한 예를 들어 문헌 [Ueda et al. (1987) J Immunol 138(4):1143-9]; [Tanhehco et al. (1999) Transplant Proc 31(5):2168-71]; 미국 특허 7,999,082 및 7,964,705; 및 PCT 공개 WO 09/029669에 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 항-인자 D 항체, 예를 들어 문헌 [Pascual et al. (1990) J Immunol Methods 127:263-269]; [Sahu et al. (1993) Mol Immunol 30(7):679-684]; [Pascual et al. (1993) EurJ Immunol 23:1389-1392]; [Niemann et al. (1984) J Immunol 132(2):809-815]; 미국 특허 7,439,331; 또는 U.S. 특허 출원 공개 20080118506에 기재된 항체이다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 항-프로페르딘 항체이다. 적절한 항-프로페르딘 항체는 또한 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, U.S. 특허 출원 공개 20110014614 및 PCT 출원 공개 WO2009110918에 기재된 것을 포함한다.
치료 방법
대상체 (예를 들어, 인간)에서 aHUS의 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법을 또한 본원에서 제공한다. 조성물 (예를 들어, 보체 억제제 및/또는 2차 작용제)는 부분적으로는 투여 경로에 따라 다양한 방법을 사용하여 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 경로는 예를 들어, 정맥내 주사 또는 주입 (IV), 피하 주사 (SC), 복강내 (IP) 주사, 또는 근내 주사일 수 있다.
투여는 예를 들어, 국소 주입, 주사에 의해, 또는 임플란트에 의해 수행될 수 있다. 임플란트 (implant)는 막, 예컨대 시알라스틱 (sialastic) 막, 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질일 수 있다. 임플란트는 조성물을 대상체에게 지속적으로 또는 주기적으로 방출하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 그 개시내용 전부가 각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 20080241223; 미국 특허 5,501,856; 4,863,457; 및 3,710,795; 및 유럽 특허 EP488401 및 EP430539를 참고한다. 조성물은 예를 들어 확산, 침식가능 또는 대류 시스템, 예를 들어, 삼투 펌프, 생분해성 임플란트, 전기확산 시스템, 전기삼투 시스템, 증기압 펌프, 전해질 (electrolytic) 펌프, 기체주입식 (effervescent) 펌프, 압전 펌프, 침식 기반 시스템, 또는 전자기계 시스템을 기초로 한 이식 가능 장치에 의해 대상체에게 전달될 수 있다.
대상체에서 aHUS를 치료하거나 예방할 수 있는 적절한 용량의 보체 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체 또는 그의 단편)는 예를 들어, 치료되는 대상체의 연령, 성별 및 체중 및 사용되는 특정 억제제 화합물을 포함하는 다양한 인자에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 동일한 환자의 치료에 필요한 항-C5 항체의 용량에 비해 상이한 용량의 인간 C5에 특이적인 siRNA가 aHUS가 존재하는 대상체의 치료를 위해 필요할 수 있다. 대상체에게 투여되는 용량에 영향을 주는 다른 인자는 예를 들어 aHUS의 종류 또는 중증도를 포함한다. 예를 들어, CFH-연관 aHUS가 존재하는 대상체는 MCP-연관 aHUS가 존재하는 대상체와는 상이한 용량의 억제제의 투여를 필요로 할 수 있다. 다른 인자는 예를 들어 대상체에게 동시에 또는 이전에 발병한 다른 의학적 장애, 대상체의 전체적인 건강 상태, 대상체의 유전적 소인, 식이, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 및 대상체에게 투여되는 임의의 다른 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 또한, 임의의 특정 대상체에 대한 특정 투여량 및 치료 요법은 치료 의료진 (예를 들어, 의사 또는 간호사)의 판단에 따라 결정될 것임을 이해하여야 한다.
억제제는 고정된 용량으로, 또는 "mg/kg" 용량 단위로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 용량은 또한 조성물 내의 하나 이상의 활성제에 대한 항체 또는 다른 숙주 면역 반응의 생성을 감소시키거나 방지하도록 선택될 수 있다. 어떠한 방식으로 제한하고자 하지 않으면서, 억제제, 예컨대 항-C5 항체의 예시적인 투여량은 예를 들어 1-100 mg/kg, 0.5-50 mg/kg, 0.1-100 mg/kg, 0.5-25 mg/kg, 1-20 mg/kg, 및 1-10 mg/kg (체중)을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항-C5 항체 (예를 들어, 에쿨리주맙)는 인간에게 약 12일마다 (예를 들어, 약 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 30, 42, 또는 49일 또는 그 초과의 일수마다) 약 900 mg의 용량으로 정맥 내로 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hill et al. (2005) Blood 106(7):2559]를 참고한다.
몇몇 실시양태에서, 항-C5 항체 (예를 들어, 에쿨리주맙)는 인간에게 임의로 2주 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 또는 그 초과) 동안 매주 약 600 mg (예를 들어, 약 625, 650, 700, 725, 750, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 또는 1,000 mg 또는 그 초과)의 용량으로 정맥 내로 투여될 수 있다. 초기 치료 이후, 항체는 인간에게 예를 들어 유지 용량으로서, 약 14일마다 (예를 들어, 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 30, 42, 또는 49일 또는 그 초과의 일수마다) 약 900 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hillmen et al. (2004) N Engl J Med. 350(6):552-9] 및 [Dmytrijuk et al. (2008) The Oncologist 13(9):993]를 참고한다.
몇몇 실시양태에서, 항-C5 항체 (예를 들어, 에쿨리주맙)는 인간에게 임의로 2주 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 또는 그 초과) 동안 매주 약 900 mg (예를 들어, 925, 950, 975, 1000, 1100, 또는 1200 mg 또는 그 초과)의 용량으로 정맥 내로 투여될 수 있다. 초기 치료 이후, 항체는 인간에게 예를 들어 유지 용량으로서, 약 14일마다 (예를 들어, 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 30, 42, 또는 49일 또는 그 초과의 일수마다) 약 1200 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2010/054403을 참고한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "장기적으로 투여되는", "장기 치료", "장기적으로 치료하는", 또는 그의 유사한 문법적 변형 표현은 장기간의 기간에 걸쳐서 환자에서 전신 보체 활성을 완전히 또는 실질적으로 억제하기 위해 환자의 혈액 내의 치료제의 특정 역치 농도를 유지하기 위해 사용되는 치료 요법을 나타낸다. 따라서, 보체 억제제를 사용하여 장기적으로 치료되는 환자는 환자의 혈액 내의 억제제의 농도를 환자에서 전신 보체 활성을 억제하거나 실질적으로 억제하는 농도로 유지하기에 충분한 양과 투여 빈도로 억제제로 2주 이상 동안 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52주; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안; 또는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 또는 12년 또는 환자의 일생의 나머지 동안) 치료될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 혈청 용혈 활성을 20% (예를 들어, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5%) 이하로 유지하기 위해 효과적인 양과 빈도로 그를 필요로 하는 환자에게 장기적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hill et al. (2005) Blood 106(7):2559]를 참고한다. 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 혈청 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준을 LDH에 대한 정상 범위의 적어도 20% (예를 들어, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5%) 내로 유지하기 위해 효과적인 양과 빈도로 환자에게 투여될 수 있다 ([Hill et al. (2005) 상기 문헌] 참조). 몇몇 실시양태에서, 보체 억제제는 혈청 LDH 수준을 550 IU/L 미만 (예를 들어, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 또는 270 IU/L 미만)으로 유지하기 위해 효과적인 양과 빈도로 환자에게 투여된다. 환자에서 전신 보체 억제를 유지하기 위해, 보체 억제제는 환자에게, 예를 들어 1주 1회, 2주 1회, 1주 2회, 1일 1회, 1개월마다 1회, 또는 3주마다 1회로 장기적으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 치료 유효량의 인간 보체 성분 C5의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편)을 포함할 수 있다. 상기 유효량은 부분적으로는 투여되는 억제제의 효과, 또는 하나 초과의 활성제가 사용될 경우, 항체와 하나 이상의 추가의 활성제의 조합 효과를 기초로 하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 인간 보체 성분 C5의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)의 치료 유효량은 또한 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 요구되는 반응, 예를 들어, 적어도 하나의 병태 파라미터의 개선, 예를 들어 aHUS의 적어도 하나의 증상의 개선을 유도하는 항체 (및 하나 이상의 추가의 활성제)의 능력과 같은 인자에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 치료 유효량의 인간 보체 성분 C5의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)는 혈소판 감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈, 신부전, 및/또는 관련 기술 분야에 알려져 있거나 본원에서 설명되는 aHUS의 증상 중의 임의의 하나를 억제하고 (그 중증도를 완화하거나 그 발생을 제거하고)/하거나 예방할 수 있다. 치료 유효량은 또한 조성물의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료상 유익한 효과가 더 큰 양이다.
용어 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량", 또는 본원에서 사용되는 유사한 용어는 목적하는 생물학적 또는 의학적 반응 (예를 들어, aHUS의 하나 이상의 증상의 개선)을 유도하는 작용제 (예를 들어, 인간 보체 성분 5의 억제제)의 양을 의미하고자 의도된다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물은 치료 유효량의 인간 보체 성분 C5의 억제제를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물은 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 치료 유효량의 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 조성물이 전체로서 치료상 효과적이도록 인간 보체 성분 C5의 2개 이상의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 또는 그 초과의) 상이한 억제제를 함유한다. 예를 들어, 조성물은 인간 C5 단백질에 결합하는 항체 및 인간 C5 단백질을 코딩하는 mRNA에 결합하여 이의 분해를 촉진하는 siRNA를 함유할 수 있고, 여기서 항체 및 siRNA는 각각 조합시에 치료상 효과적인 농도로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 조성물이 전체로서 치료상 효과적이도록 억제제 및 하나 이상의 제2 활성제를 함유한다. 예를 들어, 조성물은 인간 C5 단백질에 결합하는 항체 및 aHUS의 치료 또는 예방에 유용한 또 다른 작용제를 함유할 수 있다.
그러한 조성물의 독성 및 치료 효과는 세포 배양 또는 실험 동물 (aHUS의 동물 모델)에서 알려진 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 상기 절차는 예를 들어 LD50 (집단의 50%에 치사적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료상 효과적인 용량)을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이것은 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 조성물, 또는 조성물의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)가 바람직하다. 독성 부작용을 보이는 조성물이 사용될 수 있지만, 상기 화합물을 이환된 조직의 부위로 표적화하는 전달 시스템을 설계하고 정상 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키도록 유의하여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간에 사용하기 위한 다양한 투여량을 제제화할 때 사용될 수 있다. aHUS의 적절한 동물 모델은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Atkinson et al. (2007) Journal of Experimental Medicine 204(6):1245-1248]에 기재되어 있다. 상기 억제제의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 을 포함하는 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 다양한 순환 농도 내에 해당한다. 투여량은상기 범위 내에서 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상이할 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이 사용되는 (예를 들어, aHUS의 치료 또는 예방을 위해) 인간 보체 성분 C5의 억제제 (예를 들어, 항-C5 항체)에 대해, 치료 유효 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정되는 IC50 (즉, 증상의 50%의 최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 상기 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 인간 보체 성분 C5의 억제제의 요구되는 용량은 대상체의 혈액 내의 인간 C5 단백질의 농도를 기초로 하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 순환하는 인간 C5 단백질 수준의 보다 높은 농도를 갖는 대상체는 순환하는 인간 C5의 보다 낮은 수준을 갖는 대상체보다 더 높은 용량의 인간 C5 억제제를 필요로 할 수 있다. 대상체로부터의 혈액-유래 유체 샘플 내의 인간 보체 성분 C5의 농도를 결정하는 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Rawal et al. (1998) J Biol Chem 273(27):16828-16835]에 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 방법은 aHUS에 대한 다른 요법과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 신장절제술 (예를 들어, 양측 신장절제술), 투석, 혈장 교환, 또는 혈장 주입과 동시에, 또는 그 전에 또는 그 후에 대상체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Noris et al. (2005) "Non-shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome." In: Zipfel P (ed). Complement and Kidney Disease. Basel: Birkhauser-Verlag, 65-83] 참조).
"대상체"는 본원에서 사용되는 바와 같이 임의의 포유동물일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 원숭이, 개코원숭이, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 겔르빌루스, 햄스터, 래트, 및 마우스일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 유아 (예를 들어, 인간 유아)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "예방을 필요로 하는", "치료를 필요로 하는", 또는 "그를 필요로 하는" 대상체는 적절한 의료진 (예를 들어, 인간의 경우 의사, 간호사 또는 임상 간호사; 비-인간 포유동물의 경우 수의사)의 판단에 의해, 제시된 치료 (예컨대, 인간 보체 성분 C5의 억제제를 포함하는 조성물을 사용하는 치료)로부터 합리적인 이점을 얻을 대상체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "aHUS가 발생할 위험이 있는" 대상체는 장애 발생을 위한 1개 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 또는 그 초과의) 위험 인자를 갖는 대상체이다. aHUS의 위험 인자는 의학 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 병태가 발생할 소인, 즉, 병태에 대한 가족력 또는 병태가 발생할 유전전 소인, 예컨대 보체 인자 H (CFH), 막 보조인자 단백질 (MCP; CD46), C4b-결합 단백질, 보체 인자 B (CFB), 또는 보체 인자 I (CFI) 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Warwicker et al. (1998) Kidney Int 53:836-844]; [Richards et al. (2001) Am J HumGenet 68:485-490]; [Caprioli et al. (2001) Am Soc Nephrol 12:297-307]; [Neuman et al. (2003) J Med Genet 40:676-681]; [Richards et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 100:12966-12971]; [Fremeaux-Bacchi et al. (2005) J Am Soc Nephrol 17:2017-2025]; [Esparza-Gordillo et al. (2005) HumMol Genet 14:703-712]; [Goicoechea de Jorge et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(1):240-245]; [Blom et al. (2008) J Immunol 180(9):6385-91]; 및 [Fremeaux-Bacchi et al. (2004) J Medical Genet 41:e84)을 참고한다. 또한, 문헌 [Kavanagh et al. (2006), 상기 문헌]을 참고한다. 위험 인자는 또한 예를 들어 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 감염, 임신, 암, 항암제 (예를 들어, 퀴닌, 미토마이신 C, 시스플라틴, 또는 블레오마이신)에 대한 노출, 면역치료제 (예를 들어, 시클로스포린, OKT3, 또는 인터페론)에 대한 노출, 항-혈소판제 (예를 들어, 티클로피딘 또는 클로피도그렐)에 대한 노출, HIV 감염, 이식, 자가면역 질환, 및 조합된 메틸말론산뇨증 및 호모시스틴뇨증 (cblC)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Constantinescu et al. (2004) Am J Kidney Dis 43:976-982]; [George (2003) CurrOpin Hematol 10:339-344]; [Gottschall et al. (1994) Am J Hematol 47:283-289]; [Valavaara et al. (1985) Cancer 55:47-50]; [Miralbell et al. (1996) J Clin Oncol 14:579-585]; [Dragon-Durey et al. (2005) J Am Soc Nephrol 16:555-63]; 및 [Becker et al. (2004) Clin Infect Dis 39:S267-S275]을 참조한다. 따라서, aHUS가 발생할 위험이 있는 인간은 예를 들어 aHUS의 가족력이 있는 인간 및/또는 HIV 감염 인간일 수 있다. 이로부터, "aHUS가 발생할 위험이 있는" 대상체가 관심 있는 종 내의 모든 대상체인 것은 아님이 분명할 것이다.
"aHUS가 존재하는 것으로 의심되는" 대상체는 병태의 하나 이상의 증상을 갖는 대상체이다. 상기 병태의 증상은 의학 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 중증 고혈압, 단백뇨, 요독증, 기면/피로, 과민성, 혈소판 감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈, 및 신장 기능 손상 (예를 들어, 급성 신부전)을 포함한다. 상기 구절로부터, "aHUS가 존재하는 것으로 의심되는" 대상체가 관심 있는 종 내의 모든 대상체인 것은 아님이 분명할 것이다.
aHUS는 유전적, 후천적, 또는 특발성일 수 있다. aHUS는 동일한 가족의 2명 또는 그 초과의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6명 또는 그 초과의) 구성원이 적어도 6개월의 간격으로 질환에 걸리고 공통적인 촉발제에 대한 노출이 배제될 때, 또는 하나 이상의 aHUS-연관 유전자 돌연변이 (예를 들어, CFH, MCP/CD46, CFB, 또는 CFI의 하나 이상의 돌연변이)가 대상체에서 확인될 때 유전적인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 CFH-연관 aHUS, CFB-연관 aHUS, CFI-연관 aHUS, 또는 MCP-연관 aHUS를 가질 수 있다. 유전적 aHUS의 30% 이하는 CFH의 돌연변이와, 12%는 MCP의 돌연변이와, 5-10%는 CFI의 돌연변이와, 2% 미만은 CFB의 돌연변이와 연관된다. 유전적 aHUS는 다중적 (multiplex) (즉, 가족성; 2명 이상의 가족 구성원에서 발생) 또는 단일성 (즉, 가족에서 단일 발생)일 수 있다. aHUS는 내재하는 환경 인자 (예를 들어, 약물, 전신 질환, 또는 시가-유사 외독소를 생성하지 않는 바이러스 또는 박테리아제)가 확인될 수 있을 때 후천적인 것으로 간주될 수 있다. aHUS는 어떠한 촉발제 (유전적 또는 환경적)도 분명하지 않을 때, 특발성인 것으로 간주될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 방법은 대상체를 aHUS가 존재하거나 존재할 것으로 의심되거나 또는 발생할 위험이 있는 것으로 확인하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 설명되는 aHUS 바이오마커 프로파일링에 추가로, 인간 대상체에게 혈소판 감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈, 또는 급성 신장 부전이 존재하는지 결정하기 위해 실험실 시험을 수행할 수 있다. 혈소판 감소증은 의료 전문가에 의해 다음 중 하나 이상으로서 진단될 수 있다: (i) 150,000/mm3 미만 (예를 들어, 60,000/mm3 미만)의 혈소판 계수; (ii) 순환혈 내의 혈소판 붕괴의 증가를 반영하는 혈소판 생존 시간의 감소; 및 (iii) 혈소판신생의 2차 활성화와 일치하는, 말초혈 도말 (peripheral smear)에서 관찰되는 거대 혈소판. 미세혈관병성 용혈성 빈혈은 의료 전문가에 의해 다음 중 하나 이상으로서 진단될 수 있다: (i) 10 mg/dL 미만 (예를 들어, 6.5 mg/dL 미만)의 헤모글로빈 농도; (ii) 혈청 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 농도의 증가 (>460 U/L); (iii) 과빌리루빈혈증, 망상적혈구 증가증, 순환 자유 헤모글로빈, 및 낮은 또는 비검출가능한 합토글로빈 농도; 및 (iv) 음성 쿰스 시험 (negative Coombs test)과 함께 말초혈 도말에서 유극 적혈구 (burr) 또는 모자상 (helmet) 혈구의 정형적 측면을 갖는 조각 적혈구 (분열적혈구)의 검출. 예를 들어, 문헌 [Kaplan et al. (1992) "Hemolytic Uremic Syndrome and Thrombotic Thrombocytopenic Purpura",Informa Health Care (ISBN 0824786637)] 및 [Zipfel (2005) "Complement and Kidney Disease", Springer (ISBN 3764371668)]을 참조한다.
C3 및 C4의 혈액 농도도 보체 활성화 또는 탈조절의 척도로서 사용될 수 있다. 또한, 대상체의 병태는 대상체를 aHUS와 연관된 유전자, 예컨대 CFI, CFB, CFH, 또는 MCP의 하나 이상의 돌연변이 (상기 참조)를 보유하는 것으로 확인함으로써 추가로 특성화될 수 있다. 유전자에서 돌연변이를 검출하기 위한 적합한 방법은 예를 들어, DNA 서열결정 및 핵산 어레이 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Breslin et al. (2006) Clin Am Soc Nephrol 1:88-99] 및 [Goicoechea de Jorge et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:240-245]을 참고한다.
몇몇 실시양태에서, 인간 보체 성분 C5 (예를 들어, 항-C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 억제제는 대상체에게 단제요법(monotherapy)으로서 투여될 수 있다. 별법으로, 상기한 바와 같이, 억제제는 대상체에게 또 다른 치료, 예를 들어, aHUS에 대한 또 다른 치료와 조합 요법으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에게 aHUS에 걸리거나 발생할 위험이 있는 대상체에게 치료 이익을 제공하는 하나 이상의 추가의 작용제 (예를 들어, 항-고혈압제)를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 인간 보체 성분 C5의 억제제 및 하나 이상의 추가의 활성제는 동시에 투여된다. 다른 실시양태에서, 억제제가 먼저 적시에 투여되고, 하나 이상의 추가의 활성제는 2차로 적시에 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 활성제가 먼저 적시에 투여되고, 억제제는 2차로 적시에 투여된다.
인간 보체 성분 C5의 억제제는 이전에 또는 현재 투여되는 요법을 대체하거나 보강할 수 있다. 예를 들어, 항-C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 치료시에, 하나 이상의 추가의 활성제의 투여는 중단되거나 또는 예를 들어 보다 낮은 수준으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이전 요법의 투여는 유지될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이전 요법은 인간 C5 억제제의 수준이 치료 효과를 제공하기에 충분한 수준에 도달할 때까지 유지될 것이다. 두 요법은 조합하여 투여될 수 있다.
본원에서 규정되는 바와 같은 aHUS의 개선에 대해 대상체 (예를 들어, 인간 환자)를 모니터링하는 것은 대상체를 질환 파라미터의 변화, 예를 들어 질환의 하나 이상의 증상의 개선에 대해 평가하는 것을 의미한다. 상기 증상은 본원에서 설명되는 aHUS의 임의의 증상을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 평가는 치료를 개시한 지 적어도 1시간, 예를 들어, 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 24, 또는 48시간, 또는 적어도 1일, 2일, 4일, 10일, 13일, 20일 또는 그 초과, 또는 적어도 1주, 2주, 4주, 10주, 13주, 20주 또는 그 초과 후에 수행된다. 대상체는 다음 중 하나 이상의 기간에 평가될 수 있다: 치료 개시 전; 치료 동안; 또는 하나 이상의 치료 성분이 투여된 후. 평가는 추가의 치료 필요성을 평가하는 것을, 예를 들어, 투여량, 투여 빈도, 또는 치료 기간을 변경하여야 하는지 평가하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 또한 선택된 치료 방식을 추가하거나 감소시킬 필요성, 예를 들어 본원에서 설명되는 aHUS에 대한 임의의 치료제의 추가 또는 감소를 평가하는 것을 포함할 수 있다.
키트
또한, 본원에서 설명되는 방법의 수행에 유용한 다양한 시약 및 물질을 포함하는 키트가 제공된다. 본원에서 설명되는 측정, 진단, 평가 및/또는 평가 절차는 진단 실험실, 실험 실습실, 또는 개별 의사에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 임의의 또는 모든 상기 설정에서 사용될 수 있는 키트를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 키트는 특히 본원에 제공되는 방법에 따라 생물학적 샘플 (예를 들어, 생물학적 유체)을 특성화 또는 처리하거나, 바이오마커 수준 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 수준)을 측정하거나, 대상체에서 aHUS를 진단하거나, 또는 대상체에서 치료 반응을 모니터링하기 위한 물질 및 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 키트는 하나 이상의 aHUS 바이오마커 단백질 (예를 들어, 표 1로부터 선택되는 것)의 수준을 특이적으로 검출하는 적어도 하나 이상의 시약 및 임의로 키트 사용 설명서를 포함한다. 키트 는 예를 들어 본원에서 설명되는 임의의 어레이를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 키트는 적절한 대조군 샘플 (예를 들어, 정상의 건강한 개체로부터의 생물학적 유체 또는 알려진 대조량의 관심있는 특정 분석물을 포함하는 용액)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 키트는 본원에서 설명되는 하나 이상의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있고, 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 (예를 들어, 생물학적 유체)을 처리하기 위한 설명서 및/또는 시험을 수행하거나 결과를 해석하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
aHUS의 병리학을 보다 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 aHUS가 존재하거나 존재하는 것으로 의심되는 환자로부터 사전에 및 보체 억제제 (항-C5 항체 에쿨리주맙)를 사용하는 치료 개시 후의 여러 시점에서 생물학적 유체 (전체 혈액, 혈청, 혈장, 및 소변)의 샘플을 수집하였다. 본 연구의 목적 중의 하나는 보체 억제제를 사용한 치료에 대한 환자의 반응성뿐만 아니라 질환의 마커 및 그의 진행 또는 완화를 모니터링하기 위해 사용될 수 있는 일련의 임상적으로 규정가능한 파라미터를 규정하기 위한 것이었다. 본 발명자들은 그의 발현 및/또는 활성이 aHUS 질환 상태 및/또는 보체 억제제를 사용하는 치료에 대한 aHUS 환자의 반응성과 밀접하게 관련된 여러 단백질을 확인하였다. 단백질은 보체 및/또는 내피 세포 활성화, 염증, 신장 손상, 및 응고에 관여하거나 연관된 것들이다 (표 1 참조).
연구를 위해, aHUS로 진단이 확인된 총 41명의 성인 대상체 (27명의 여성 및 12명의 남성)를 정상의 건강한 성인 지원자처럼 선발하였다. 모든 환자는 하나 이상의 다음 특징을 기초로 하여 스크리닝할 때 aHUS로 확인되었다: 150 x 109/L 미만의 혈소판 계수; 정상의 하한 미만의 헤모글로빈 수준; 정상의 상한의 1.5배 이상인 LDH 수준; 정상의 상한 이상인 혈청 크레아티닌 수준; 및 5% 초과의 ADAMTS13 활성 수준. 모든 환자는 시가 독소에 대해 음성으로 시험되었다.
포함된 환자의 평균 연령은 40.3세이었다. 68%의 환자 여성이었고; 2명 (4.8%)은 흑인 또는 하프리카계 미국인이었고; 1명의 환자 (2.4%)는 아시아계 미국인이었다. 6명의 환자 (14.6%)는 aHUS의 가족력을 보고하였다. 20명 (48.7%)은 적어도 하나의 확인된 보체 조절 단백질 돌연변이를 갖거나 또는 보체 조절 단백질에 결합하는 자가항체에 대해 양성으로 시험되었다. 30명의 환자 (73.2%)는 aHUS의 최초 임상 징후를 제시하였다. 6명의 환자 (14%)는 혈장 교환/주입 (PE/PI)을 사용하지 않고 즉시 에쿨리주맙 치료를 개시하였다. 24명의 환자 (58.5%)는 기준선에서 (에쿨리주맙 치료 이전에) 투석을 시행하고 있었다. 9명의 환자 (22%)는 이전에 신장 이식을 받았다. 27명 (66%)의 혈소판 계수는 150x109/L 미만이었다. 32명 (78%)의 환자의 혈청 LDH 수준은 정상의 상한을 초과하였다. 상기 코호트 (cohort)에서 환자에 대한 평균 합토글로빈 (Hp) 수준은 0.6 ± 0.4 g/L인 반면; 상기 환자 코호트에서 평균 혈청 크레아티닌 수준은 411 ± 264.6 ㎛ol/L (N=40)이었다.
생물학적 유체는 연구 등록 시에 (치료 전), 및 각각의 약물 투여 후에 수집하였다. 에쿨리주맙은 대상체에게 다음 일정 하에 투여하였다: 900 mg, 4주 동안 주당 1회; 제5 용량으로서 1200 mg; 및 1200 mg, 2상 임상 시험의 일부로서 55주까지 2주마다 1회.
실시예 1. 물질 및 방법
소변 샘플
신선하게 수집한 소변을 프로테아제 억제제와 즉시 혼합하였다. 대상체로부터 수집한 소변 내의 NGAL, 시스타틴 C, 클러스테린, TIMP-1, β2-마이크로글로불린, C5b9, C5a, 및 크레아티닌을 포함한 여러 분석물의 농도를 아래에 간단히 설명한 바와 같이 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 측정하였다.
NGAL 수준은 상업적으로 이용가능한 키트 (알앤디 시스템즈 (R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스); 카탈로그 번호: DLCN20)를 사용하여 소변 내에서 측정하였다. 간단히 설명하면, 소변 샘플을 키트에 공급된 검정 희석제 (calibrator diluent) RD5-24를 사용하여 1:3으로 희석하였다. 50 ㎕의 각각의 샘플 또는 키트 표준물 대조물 (NS0-발현된 재조합 인간 리포칼린-2)을 검정 플레이트의 웰에 이중으로 첨가하였고, 여기서 각각의 웰은 100 ㎕의 키트에 공급된 검정 희석제 RD1-52를 함유하였다. 냉장고 내에서 4℃에서 2시간 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 4회 세척하였다. 효소 (호스래디시 퍼옥시다제)로 표지된 항-NGAL 접합체를 200 ㎕/웰로 첨가하고, 냉장고 내에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 4회 세척하고, 200 ㎕/웰의 키트에 공급된 TMB 기질 용액 (항-NGAL 접합체의 효소에 대한 기질)을 첨가함으로서 발생시키고, 실온에서 암소에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. TMB는 ELISA에 종종 사용되는 호스래디시 퍼옥시다제에 대한 기질이다. ELISA 웰 내에서 기질 및 항체에 접합된 고정된 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP) 사이의 반응은 청색 색상의 용액을 생성한킨다. 목적하는 색 강도에 도달한 후에, 중지 용액 (산성)을 첨가하여 반응을 종결시켰고, 이것은 용액 색상을 청색에서 황색으로 변화시켰다. 따라서, 50 ㎕/웰의 키트에 공급된 중지 용액을 각각의 웰에 첨가함으로써 인큐베이션 후에 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
시스타틴 C 수준은 상업적으로 이용가능한 키트 (알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스); 카탈로그 번호: DSCTC0)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 소변 샘플을 키트에 공급된 검정 희석제 RD5-24를 사용하여 1:3으로 희석하였다. 50 ㎕의 각각의 샘플 또는 키트 표준물 대조물 (재조합 인간 CysC)을 검정 플레이트의 웰에 이중으로 첨가하였고, 여기서 각각의 웰은 100 ㎕의 키트에 공급된 검정 희석제 RD1-52를 함유하였다. 냉장고 내에서 4℃에서 2시간 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 4회 세척하였다. 효소로 표지된 항-CysC 접합체를 200 ㎕/웰로 첨가하고, 냉장고 내에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 4회 세척하고, 200 ㎕/웰의 키트에 공급된 TMB 기질 용액 (항-CysC 접합체의 효소에 대한 기질)을 첨가함으로써 발색시키고, 실온에서 암소에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 50 ㎕/웰의 키트에 공급된 중지 용액을 각각의 웰에 첨가함으로써 인큐베이션 후에 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
클러스테린 수준은 상업적으로 이용가능한 키트 (알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스); 카탈로그 번호: DCLU00)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 소변 샘플을 키트에 공급된 검정 희석제 RD5T를 사용하여 1:3으로 희석하였다. 50 ㎕의 각각의 샘플 또는 키트 표준물 대조물 (재조합 인간 클러스테린)을 검정 플레이트의 웰에 이중으로 첨가하였고, 여기서 각각의 웰은 100 ㎕의 키트에 공급된 검정 희석제 RD1-19를 함유하였다. 500 rpm으로 설정된 회전 진탕기 (orbital shaker) 상에서 실온에서 2시간 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 4회 세척하였다. 효소로 표지된 항-클러스테린 접합체를 200 ㎕/웰로 첨가하고, 500 rpm으로 설정된 회전 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 4회 세척하고, 200 ㎕/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하여 발색시키고, 실온에서 암소에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 50 ㎕/웰의 중지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 인큐베이션 후에 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
TIMP-1 수준은 상업적으로 이용가능한 키트 (알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스); 카탈로그 번호: DTM100)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 소변 샘플을 키트에 공급된 검정 희석제 RD5P를 사용하여 1:2로 희석하였다. 50 ㎕의 각각의 샘플 또는 키트 표준물 대조물 (재조합 인간 TIMP-1)을 검정 플레이트의 웰에 이중으로 첨가하였고, 여기서 각각의 웰은 100 ㎕의 키트에 공급된 검정 희석제 RD1X를 함유하였다. 500 rpm으로 설정된 회전 진탕기 상에서 실온에서 2시간 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 효소로 표지된 항-TIMP-1 접합체를 200 ㎕/웰로 첨가하고, 500 rpm으로 설정된 회전 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 4회 세척하고, 200 ㎕/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하여 발색시키고, 실온에서 암소에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 50 ㎕/웰의 중지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 인큐베이션 후에 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
β2M 수준은 상업적으로 이용가능한 키트 (알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스); 카탈로그 번호: DBM200)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 소변 샘플을 키트에 공급된 샘플 희석제를 사용하여 1:10 희석하였다. 20 ㎕의 각각의 샘플, 키트 대조물 또는 키트 표준물을, 효소로 표지된 항-β2M 접합체를 함유하는 용액 100 ㎕을 함유하는 웰에 이중으로 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 6회 세척하였다. 웰을 100 ㎕/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하여 발색시키고, 실온에서 암소에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 100 ㎕/웰의 중지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 인큐베이션 후에 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
크레아티닌 수준은 상업적으로 이용가능한 키트 (알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스); 카탈로그 번호: KGE005)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 소변 샘플을 물을 사용하여 1:20으로 희석하고, 50 ㎕의 샘플, 키트 대조물 또는 키트 표준물을 100 ㎕의 키트에 공급된 알칼리성 피크레이트 용액을 함유하는 웰에 이중으로 첨가하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 후에, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
C5b-9 수준은 상업적으로 이용가능한 키트 (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산 호세)); 카탈로그 번호: 558315) 및 optEIA 시약 세트 B (비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세; 카탈로그 번호: 550534)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 항-C5b-9 포획 항체를 코팅 완충제 내에 1:250으로 희석하고, 그 중 100 ㎕을 96 웰 맥시소프 (maxisorp) 플레이트 (넝크 (Nunc); 카탈로그 번호: 439454)의 각각의 웰에 첨가하고, 냉장고 내에서 4℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 3회 세척하고, 1시간 동안 실온에서 200 ㎕/웰의 키트에 공급된 검정 희석제를 첨가하여 차단시켰다. 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 3회 세척하고, 100 ㎕의 소변 샘플 또는 키트 표준물을 웰에 이중으로 첨가하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 100 ㎕의 키트에 공급된 C5b-9 작업 검출기 항체 (Working Detector Antibody) 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 7회 세척하고, 100 ㎕/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하여 발색시키고, 실온에서 암소에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 50 ㎕/웰의 중지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 인큐베이션 후에 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
C5a 수준을 상업적으로 이용가능한 키트 (비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세; 카탈로그 번호: 557965)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 100 ㎕의 소변 샘플 또는 키트 표준물을, 50 ㎕의 키트에 공급된 ELISA 희석제를 함유하는 웰에 이중으로 첨가하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 5회 세척하였다. 100 ㎕의 키트에 공급된 C5a 작업 검출기 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 7회 세척하고, 100 ㎕/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하여 발색시키고, 실온에서 암소에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 50 ㎕/웰의 중지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 인큐베이션 후에 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
혈장
혈장 샘플을 다음과 같이 제조하였다. 혈액을 EDTA를 함유하는 10 mL BD™ P100 튜브 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson)) 내에 수집하였다. 전체 혈액을 늦어도 수집 후 60분까지 냉장 원심분리기 (4-8℃를 유지하도록 설정된) 내에서 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, 원심분리 후 샘플로부터 혈장을 얻었다. 용혈된 샘플은 폐기하였다.
대상체로부터 수집한 혈액의 혈장 분획 내의 Ba, 프로트롬빈 단편 1+2, 트롬보모듈린, vWF, sC5b-9, 및 C5a를 포함한 여러 분석물의 농도를 아래에 간단히 설명한 바와 같이 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 측정하였다.
Ba 수준은 상업적으로 이용가능한 키트 (퀴델 (Quidel, 미국 캘리포니아주 샌디에고); 카탈로그 번호: A033)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 검정 플레이트의 웰을 세척 용액으로 3회 세척하였다. 혈장 샘플을 키트에 공급된 검체 희석제로 1:1000으로 희석하고, 100 ㎕의 희석한 혈장 샘플, 키트 대조물 및 표준물을 웰에 이중으로 첨가하였다. 실온에서 60분 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 5회 세척하였다. 100 ㎕의 효소로 표지된 항-Ba 항체 접합체를 각각의 웰에 첨가하고, 60분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 세척 용액으로 5회 세척한 후, 100 ㎕의 TMB 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 15분 동안 차광한 실온에서 인큐베이팅하였다. 100 ㎕/웰의 중지 용액을 첨가하여 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
EDTA 혈장 내의 프로트롬빈 단편 1+2 수준은 엔자이그노스트 (Enzygnost) F1+2 키트 (지멘스 헬쓰케어 (Siemens Healthcare); 카탈로그 번호: OPBD03)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 혈장 샘플을 샘플 완충제로 1:2 희석하고, 50 ㎕의 희석한 샘플, 또는 표준물 (공지의 농도의 재조합 인간 프로트롬빈 단편 1+2를 함유하는)을 웰에 첨가하였다. 37℃에서 30분 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 100 ㎕의 효소로 표지된 항-프로트롬빈 단편 1+2 항체 접합체를 각각의 웰에 첨가하고, 15분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 추가의 3회 세척 후에, 100 ㎕의 크로마겐 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 15분 동안 차광한 실온에서 인큐베이팅하였다. 100 ㎕의 중지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
EDTA 혈장 내의 트롬보모듈린 (TM)의 수준은 TM ELISA 키트 (아메리칸 다이아그노스티카 (American Diagnostica, 미국 코네티컷주 스탬포드); 카탈로그 번호: 837)를 사용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 혈장 샘플을 샘플 완충제로 1:4 희석하고, 200 ㎕의 희석한 샘플 또는 표준물 (공지의 농도의 재조합 TM을 함유하는)을 웰에 첨가하였다. 실온에서 60분 인큐베이션 후에, 검정 플레이트의 웰을 200 ㎕/웰의 세척 용액으로 4회 세척하였다. 효소로 표지된 항-TM 항체의 용액을 첨가하고 (200 ㎕/웰), 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 4회 세척한 후에, 200 ㎕의 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 웰을 20분 동안 차광한 실온에서 인큐베이팅하였다. 100 ㎕의 0.5 M H2SO4로 반응을 중지시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다,
폰 빌레브란트 인자 (vWF) 활성의 수준은 EDTA 혈장 내에서, vWF 콜라겐 결합 부위에 특이적인 포획 항체를 이용하는 ELISA 키트에 의해 결정하였다 (아메리칸 다이아그노스티카; 카탈로그 번호: 885). 혈장 샘플 및 키트 대조물을 검정 희석제로 1:20으로 희석하고, 100 ㎕의 희석한 샘플 및 대조물을 웰에 이중으로 첨가하였다. 실온에서 60분 인큐베이션 후에, 웰을 세척 용액으로 5회 세척하고, 100 ㎕의 효소로 표지된 항-vWF 접합체를 각각의 웰에 첨가하였다. 웰을 15분 동안 실온에서 인큐베이팅하고, 세척 용액으로 5회 세척하였다. 100 ㎕의 TMB 기질 (이것은 효소에 의한 절단 시에, 검출가능한 신호를 생성한다)을 각각의 웰에 첨가하였다. 웰을 15분 동안 차광한 실온에서 인큐베이팅한 후, 100 ㎕의 키트에 공급된 중지 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 흡광도를 중지 용액의 첨가 30분 이내에 450 nm에서 측정하였다.
sC5b-9의 순환 수준은 인간 C5b-9 ELISA 세트 (비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 샌디에고; 카탈로그 번호: 558315) 및 BD optEIA 시약 세트 B (비디 바이오사이언시즈; 카탈로그 번호: 550534)를 사용하여 결정하였다. 간단히 설명하면, 항-C5b-9 포획 항체를 키트에 공급된 코팅 완충제로 1:250으로 희석하고, 그 중 100 ㎕을 96 웰 맥시소프 플레이트 (넝크)의 웰에 첨가하고 4℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 세척 용액 내에서 3회 세척한 후, 1시간 동안 실온에서 200 ㎕의 키트에 공급된 검정 희석제로 웰을 처단하였다. 세척 용액으로 3회 더 세척한 후에, 100 ㎕의 혈장 샘플 (검정 희석제 내에 1:100으로 희석한) 또는 표준물 (공지의 농도의 정제된 sC5b-9를 함유하는)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 웰을 세척 용액으로 3회 세척하고, 100 ㎕의 작업 검출기 (이것은 검정 희석제 내에 1:250으로 희석한 비오틴-표지된 항-C5b-9 검출 항체 및 스트렙타비딘-표지된 호스래디시 퍼옥시다제를 함유한다)를 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션 이후, 웰을 세척 용액으로 7회 세척하고, 100 ㎕의 기질 TMB 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 30분 동안 차광한 실온에서 반응액을 발색시켰다. 50 ㎕의 중지 용액을 각각의 웰에 첨가한 후에, 흡광도를 450 nm에서 결정하였다.
C5a의 순환 수준은 BD optEIA 시약 세트 B (비디 바이오사이언시즈; 카탈로그 번호: 550534)를 이용하는 샌드위치 (sandwich) ELISA로 결정하였다. 모든 인큐베이션은 후탄 (비디 바이오사이언시즈; 카탈로그 번호: 550236)의 존재 하에 수행하였다. 간단히 설명하면, 항-C5a 포획 항체를 키트에 공급된 코팅 완충제 내에 2 ㎍/mL로 희석하고, 그 중 100 ㎕을 96 웰 맥시소프 플레이트 (넝크)의 웰에 첨가한 후, 4℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 세척 용액 내에 3회 세척한 후, 1시간 동안 실온에서 200 ㎕ 검정 희석제로 웰을 차단시켰다. 세척 용액으로 3회 더 세척한 후, 50 ㎕의 혈장 샘플 (검정 희석제 내에 1:5 희석한) 또는 표준물 (공지의 농도의 C5a를 함유하는)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 웰을 세척 용액으로 4회 세척하고, 100 ㎕의 작업 검출기를 각각의 웰에 첨가하였다 (이것은 검정 희석제 내에 1:250으로 희석한 비오틴-표지된 항-C5a 검출 항체 및 스트렙타비딘-표지된 호스래디시 퍼옥시다제를 함유한다). 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 이후, 웰을 세척 용액으로 7회 세척하고, 100 ㎕의 기질 TMB 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 30분 동안 차광한 실온에서 반응액을 발색시켰다. 50 ㎕의 중지 용액을 각각의 웰에 첨가한 후에, 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
혈청
혈청 샘플을 다음과 같이 처리하였다. 혈액을 10 mL 진공채혈관 (vacutainer) 혈청 분리 (SST) 튜브 내에 수집하였다. 튜브를 5회 뒤집고, 혈액을 실온에서 적어도 30분, 그러나 2시간 미만 동안 응고시켰다. 튜브를 브레이크를 걸고 1800 rcf에서 원심분리시켰다. 용혈된 샘플은 폐기하였다.
혈청 내의 다양한 분석물의 정량적 결정은 인간 세포측정 비드 어레이 (CBA) 플렉스 세트 (Flex Set) 키트 (CBA Flex Set; 벡톤 디킨슨 바이오사이언시즈 (Becton Dickinson Biosciences, 미국 캘리포니아주 샌디에고))를 사용하여 수행하고, 제조자의 지시에 따라 유동 세포측정기 (FACS LSR II, 벡톤 디킨슨)에 의해 획득하였다. 플렉스 세트 포획 비드는 구별되는 형광 강도를 갖는 단일 비드 집단이고, 가용성 단백질에 특이적인 포획 항체로 코팅된다. 각각의 비드 집단은 BD CBA 플렉스 세트 시스템 내에서 다른 비드에 비한 그의 위치를 지시하는 영문숫자 위치 지정이 주어진다. 다중 검정을 생성하기 위해 상이한 위치를 갖는 비드들을 검정에서 조합할 수 있다. 플렉스 세트 검정에서, 포획 비드, PE 접합된 검출 시약, 및 표준물 또는 시험 샘플을 함께 인큐베이팅하여 샌드위치 복합체를 형성하였다.
간단히 설명하면, 각각의 분석물에 대한 표준물을 혼합하고, 검정 희석제를 사용하여 연속 희석을 수행하였다. 각각의 분석물에 대한 포획 비드를 제조하고, 혈청/혈장에 대한 포획 비드 희석제를 사용하여 모았다. 혈청 샘플을 적절하게 희석하고, 표준물과 함께, 실온에서 1시간 동안 100 ㎕의 총 부피 내에서 혼합된 포획 비드와 함께 인큐베이팅하였다. 검출 피코에리트린 (PE) 시약을 모든 분석물에 대해 혼합하고, 튜브 (50 ㎕)에 첨가하였다. 실온에서 암소에서 2시간 인큐베이팅한 후 샘플을 세척 완충제로 세척하고, 세척 완충제 내에 펠렛을 재구성한 후 유동 세포측정기에 의해 획득하였다.
다음 비드 세트를 키트에 공급된 검정 희석제 내에 1:4 희석시킨 혈청 샘플과 함께 인큐베이팅하였다 (여기서, 명시된 바이오마커 단백질은 비드에 접합된 포획 항체를 지시한다): IFN-γ (비드 E7; 카탈로그 번호: 558283); IL-12 p70 (비드 E5; 카탈로그 번호: 558283); IL-1β (비드 B4; 카탈로그 번호: 558279); IL-6 (비드 A7; 카탈로그 번호: 558276); IL-8 (비드 A9; 카탈로그 번호: 558277); CXCL-9 (비드 E8; 카탈로그 번호: 558286); CXCL-10 (비드 B5; 카탈로그 번호: 558280); MCP-1 (비드 D8; 카탈로그 번호: 558287); VEGF (비드 B8; 카탈로그 번호: 558336); 및 sCD40L (비드 C7; 카탈로그 번호 560305). 다음 비드 세트를 키트에 공급된 검정 희석제 내에 1:50으로 희석시킨 혈청 샘플과 함께 인큐베이팅하였다: ICAM-1 (비드 A4; 카탈로그 번호: 560269); VCAM-1 (비드 D6; 카탈로그 번호: 560427); TNFR1 (비드 C4; 카탈로그 번호: 560156); E-셀렉틴 (비드 D9; 카탈로그 번호: 560419); P-셀렉틴 (비드 D7; 카탈로그 번호: 560426); 및 CCL5 (비드 D4; 카탈로그 번호: 558324).
실시예 2: 결과
진행중인 보체 활성화의 마커
아래 표 2에 요약된 바와 같이, 건강한 지원자로부터 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해, 보체 성분 Ba 및 sC5b9의 혈장 농도 및 C5a 및 sC5b-9의 소변 농도는 대다수의 aHUS 환자에서 상승하였다. 또한 도 1을 참조한다.
<표 2>
Figure 112020055722894-pat00004
* "N"은 주어진 바이오마커에 대해 평가된 환자의 총수를 나타내고, "n"은 상승된 수준의 바이오마커 단백질을 갖는 "N" 환자의 수를 나타낸다.
이들 결과는 aHUS 환자에서 유의한 전신 대체 경로 보체 활성화가 진행중임을 나타낸다.
에쿨리주맙을 사용한 치료 이후, 이들 aHUS 바이오마커의 평균 수준 (농도)은 감소하였다 (도 1a-c). 소변 C5a 및 sC5b-9의 평균 수준은 치료 개시 후 1주 내지 2.5주에 유의하게 감소하고, 이렇게 유지되었다. 소변 C5a 수준의 평균 감소 백분율은 치료 후 제3주에 40% 초과 및 제6주에 70% 초과였다 (도 1d). 소변 sC5b-9 수준은 제3주에 60% 초과로 감소하였다 (도 1e). 이들 마커는 궁극적으로 정상화된다. 혈장 Ba 수준는 또한 에쿨리주맙을 사용한 치료의 약 4 내지 6주 후에 유의하게 감소하였고 (p = 0.0053), 이것은 시간 경과에 따라 에쿨리주맙이 고전적 보체 경로의 개시 또는 증폭을 감소시키는 것을 제안한다 (도 1c). 그러나, 혈장 Ba 수준의 평균 감소 백분율은 제6주에 약 10% 및 제12주에 30% 초과였다 (도 1f).
시간 경과에 따라 정상화된 보체 바이오마커 단백질 수준을 경험하는 치료받은 aHUS 환자의 백분율을 도 2a-c에 도시한다. 예를 들어, 도 2b에 도시된 바와 같이, 치료받은 aHUS 환자의 50%는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후 제2.5주에 정상화된 수준의 소변 sC5b-9를 보였다. 치료 개시 후 17주에, 치료받은 aHUS 환자의 79%는 정상화된 sC5b-9 수준을 보였다. 그러나, Ba 수준은 대부분의 환자에서 정상화되지 않았다 (도 1c 및 2c). 이들 데이타는 에쿨리주맙 요법을 사용하더라도, 몇몇 환자에서 낮은 수준의 진행중인 보체 활성화가 존재할 수 있음을 나타낸다.
혈소판 및 지혈 활성화의 마커
아래 표 3에 요약된 바와 같이, 건강한 지원자로부터 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해, sCD40L의 혈청 농도 및 프로트롬빈 단편 1+2 및 D-이량체의 혈장 수준은 대다수의 aHUS 환자에서 유의하게 상승하였다. 또한 도 3a-b를 참조한다.
<표 3>
Figure 112020055722894-pat00005
* "N"은 주어진 바이오마커에 대해 평가된 환자의 총수를 나타내고, "n"은 상승된 수준의 바이오마커 단백질을 갖는 "N" 환자의 수를 나타낸다.
sCD40L의 방출은 일반적으로 혈소판 대사 및 활성과 연관된다. 프로트롬빈 단편 F1+2는 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환 동안 생성되는 반면, D-이량체는 섬유소용해를 나타내는 피브린 분해 산물이다.
에쿨리주맙을 사용한 치료 이후, 이들 aHUS 바이오마커의 평균 수준 (농도)은 감소하였다. F1+2 및 D-이량체의 혈장 수준의 평균 수준은 치료 개시 후 1주 내지 2.5주에 유의하게 감소하고 (각각 p= 0.0078 및 0.0083), 이렇게 유지되었다. 도 3c에 도시된 바와 같이, F1+2의 평균 감소 백분율은 제3주에 약 15% 및 제12주에 50% 초과였다. d-이량체 수준의 평균 감소 백분율은 제6주에 약 40%이지만, 제12주에 60%를 초과하였다. 이들 데이타는 에쿨리주맙 요법이 응고 및 섬유소용해 경로에 대해 즉각적인 효과를 가짐을 나타낸다. 도 4a-b에 도시된 바와 같이, 치료받은 aHUS 환자의 32%는 치료 개시 후 26주에 F1+2 수준의 정상화를 보이고, 환자의 46%는 정상화된 수준의 D-이량체를 가졌다. 이와 반대로, sCD40L 수준은 연구 내내 상승한 상태로 유지되었다.
내피 세포 손상 및/또는 활성화의 마커
아래 표 4에 요약된 바와 같이, 건강한 지원자로부터 생물학적 유체의 샘플 내의 농도에 비해, 트롬보모듈린 및 vWF의 혈장 농도 및 VCAM-1의 혈청 농도는 aHUS 환자에서 유의하게 상승하였다. 또한, 도 5a-c를 참조한다.
<표 4>
Figure 112020055722894-pat00006
* "N"은 주어진 바이오마커에 대해 평가된 환자의 총수를 나타내고, "n"은 상승된 수준의 바이오마커 단백질을 갖는 "N" 환자의 수를 나타낸다. n.s.는 유의하지 않음을 나타낸다.
aHUS 환자의 생물학적 유체 내의 고농도의 트롬보모듈린 및 VCAM-1는 유의한 내피 세포 활성화를 나타낸다. 트롬보모듈린은 C3a에 반응하여 방출되고, 이것은 추가로 aHUS 환자에서 진행중인 보체 활성화를 강조한다. vWF 농도가 또한 유의하게 상승하였다. vWF는 혈소판 부착 및 응고를 포함한 많은 생리학적 역할을 갖고, 또한 내피 손상 및 활성화의 마커이다.
에쿨리주맙을 사용한 치료 이후, 이들 aHUS 바이오마커의 평균 수준 (농도)은 감소하였다 (도 5a-c). 트롬보모듈린 및 VCAM-1의 평균 수준은 치료 개시 후 제17주 (각각 p=0.0007 및 <0.0001)에 기준선으로부터 유의하게 감소하였다 (도 6c 및 6d 참조). 제26주에, VCAM-1 및 vWF의 수준이 또한 감소하였다. 그러나, vWF는 치료 개시 후 제17주에 치료된 aHUS 환자의 ~70%에서 정상화된 한편 (도 6b), 트롬보모듈린 및 VCAM-1 수준은 상승한 상태로 유지되었다. 흥미롭게도, 트롬보모듈린 수준이 정상화된 환자의 10% 중에서 (도 6a), 단지 1명의 환자가 정상화된 트롬보모듈린 및 vWF 수준을 모두 가졌다. 이들 데이타는 에쿨리주맙 요법이 내피 세포 손상 및 활성화를 교정하기 위해 신속하고 강건한 긍정적 효과를 갖는 것을 나타낸다.
염증의 마커
표 5 (아래)는 혈장 및/또는 혈청 내에서 검출된 일련의 분석물을 기재하고, 각각의 분석물이 보체 억제제 요법을 사용하는 치료 이전에 상승한 aHUS 환자의 백분율을 나타낸다.
<표 5>
Figure 112020055722894-pat00007
* "N"은 주어진 바이오마커에 대해 평가된 환자의 총수를 나타내고, "n"은 상승된 수준의 바이오마커 단백질을 갖는 "N" 환자의 수를 나타낸다.
** "혈청"으로 표지된 2개의 분석물의 농도는 혈청 내에서 측정되었다. 표 내의 다른 모든 분석물의 농도는 혈장 내에서 측정되었다. n.s.는 유의하지 않음을 나타낸다.
에쿨리주맙을 사용한 요법에 앞서, aHUS의 환자는 예를 들어, CXCL-10, CXCL-9, IL-18, TNFR1, MCP-1, VEGF, IL-6, 및 IL-8을 포함한, 상승된 수준의 순환 염증성 시토킨 및 케모킨을 가졌다. 그러나, 치료 개시 이후, TNFR1은 유의하게 감소한 가장 빠른 염증 마커이었다 (제6주에, p=0.0012) (도 7a). TNFR1의 평균 농도는 모든 후속 방문에서 기준선보다 유의하게 더 낮게 유지되었지만 (P<0.0001), 단지 aHUS 환자의 6%에서 정상화되었다 (도 7b). 이와 유사하게, CXCL10의 평균 수준은 제26주에 유의하게 감소하였지만 (p=0.0055), 모든 aHUS 환자에서 정상화되지 않았다 (환자의 31%는 정상화되지 않았다). 제26주에, IFN-γ의 평균 수준은 환자의 약 50%에서 정상화되었지만; 혈청 IL-8 (p=0.01), CXCL-9 (p=0.01), IL-18 (p<0.0001) 및 VEGF (p<0.0001)의 평균 수준은 정상 대조군에 비해 대부분의 aHUS 환자에서 상승된 상태로 유지되었고, 기준선으로부터 유의하게 상이하지 않았다. 혈청 IL-6은 제26주에 기준선으로부터 유의하게 감소하였고 (p=0.04), 정상 대조군에 비해 제26주에 상승된 상태로 유지되었다.
이와 반대로, CCL-5의 평균 수준은 치료 개시 후 17주에, 및 그 후 (제12-17주 및 제26주에 각각 p= 0.0072 및 0.0021) 유의하게 상승하였다. 마우스에서 혈관 손상에 반응하여, CCL5는 상향조절되고, 이것은 혈관 상처-치유 반응의 일부로서 선택적 T 세포 침윤을 촉진한다 (예를 들어, 문헌 [Rookmaaker et al. (2007) Am J Physiol Renal Physiol 293(2): F624-630] 참조). 이들 데이타는 에쿨리주맙 요법이 많은 aHUS 환자에서 염증에 대해 신속하고 강건한 긍정적 효과를 갖지만, 심지어 치료 동안에도 이들 환자에서 낮은 수준의 염증이 존재할 수 있음을 나타낸다.
신장 세뇨관 및 사구체 손상의 마커
표 6a (아래)는 환자로부터 수집한 소변 내에서 검출된 일련의 분석물을 기재하고, 각각의 분석물이 보체 억제제 요법을 사용하는 치료 이전에 상승한 aHUS 환자의 백분율을 나타낸다.
<표 6a>
Figure 112020055722894-pat00008
* "N"은 주어진 바이오마커에 대해 평가된 환자의 총수를 나타내고, "n"은 상승된 수준의 바이오마커 단백질을 갖는 "N" 환자의 수를 나타낸다. n.s.는 유의하지 않음을 나타낸다.
에쿨리주맙을 사용한 치료 이전에, β2M, 클러스테린, 시스타틴 C, 및 NAG를 포함한, 정상적으로 신장에 의해 여과되는 저분자량 분자는 aHUS의 환자의 소변 내에서 상승하였다. 손상에 반응하여 신장 세뇨관 상피 세포에 의해 생산된 분자, 예컨대 TIMP-1, NGAL 및 L-FABP가 또한 상승하였다. 그러나, 에쿨리주맙을 사용한 치료 이후, CysC (p=0.0012) (도 8a), 클러스테린 (p=0.0446), 및 TIMP-1 (p=0.0353)은 치료 개시 후 1-2.5주에 유의하게 감소하였고, 연구 과정 내내 유의하게 감소한 상태로 유지되었다. NGAL (p=0.0003) (도 8c), L-FABP (p=0.0366), 및 NAG (p=0.0369)는 치료 개시 후 4-6주에 기준선으로부터 유의하게 감소하였고, 이후 이렇게 유지되었다. β2M은 12-17주에 (p=0.0008) 및 이후 (도 8b) 유의하게 감소하였다. 제26주에, 모든 분석물의 평균 소변 수준은 치료된 aHUS 환자에서 정상화되었다.
이들 데이타는 에쿨리주맙 요법이 많은 aHUS 환자가 경험하는 신장 세뇨관 및 사구체 손상을 바로잡는 신속하고, 강건하고, 지속가능한 긍정적 효과를 갖는 것을 나타낸다.
요약
다음 표는 에쿨리주맙을 사용한 치료 이전에 aHUS 환자에서 상승하였지만, 에쿨리주맙을 사용한 치료 이후 유의하게 감소한 예시적인 aHUS 바이오마커의 요약 (완전한 목록은 아니지만)을 제공한다. 또한 aHUS 바이오마커의 유의한 감소가 일어난, 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후 평균 시간을 표 (표 6b)에 제공한다.
<표 6b>
Figure 112020055722894-pat00009
투석을 받고/받거나 신장 이식을 받은 aHUS 환자에서 기준선 aHUS 마커 수준
또한, 에쿨리주맙을 사용한 요법 전에 투석을 받은 aHUS 환자에서 혈장 및 소변 보체, 염증, 및 신장 손상 마커의 농도를 평가하였다. 표 7 (아래)에 제시된 바와 같이, 혈청 TNFR1, 혈장 Ba, C5b9, 프로트롬빈 단편 1+2, β2M, 클러스테린, sC5b9, TIMP-1, NGAL, CysC, 및 C5a의 평균 농도는 연구 등록 전에 (치료 전에) 반복된 투석을 받지 않은 aHUS 환자에 비해 반복된 투석 (예를 들어, 치료 전 6개월 내에 2회 이상)을 받은 aHUS 환자에서 유의하게 상승하였다. 또한, 도 9a-e를 참조한다.
<표 7>
Figure 112020055722894-pat00010
** "혈청" 표시된 한 분석물의 농도는 혈청 내에서 측정하였다. "소변"으로 지정된 분석물의 농도는 소변 내에서 측정하였고, "혈장"으로 표지된 분석물의 농도는 환자로부터 얻은 혈장 내에서 측정하였다.
또한, 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 신장 이식을 받은 aHUS 환자는 신장 이식을 받지 않은 환자에 비해 기준선에서의 보다 낮은 소변 C5b-9 및 소변 FABP-1을 가졌다.
TMA 마커와 비교한 기준선 aHUS 마커 수준
몇몇의 aHUS 환자에서 몇몇의 aHUS-연관 바이오마커의 수준은 비정상적인 혈전성 미세혈관병증 (TMA) 마커, 예컨대 감소된 혈소판 계수, 상승된 LDH, 및 증가된 합토글로빈 수준과 밀접하게 관련되었다. 예를 들어, 기준선에서 감소된 혈소판 계수 (<150,000/㎕ 혈액)를 갖는 aHUS 환자는 소변 시스타틴 C (P=0.0276) 및 소변 클러스테린 (P=0.0401)의 상승된 수준을 보였다. 도 14a-b를 참조한다. 상승된 LDH 수준을 갖는 aHUS 환자는 VCAM-1 (P=0.0226) (도 14c), d-이량체 (P=0.0369) (도 14d), IL-18, 트롬보모듈린, 및 TNFR1의 증가된 수준을 보였다 (하기 참조). 상승된 합토글로빈 수준은 종종 IL-18 수준이 상승된 aHUS 환자에서 존재하였다.
혈장 요법을 받고 있는 aHUS 환자에서 기준선 aHUS 마커 수준
에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 반복 혈장 요법을 받은 aHUS 환자는 기준선에서 보다 높은 평균 수준의 소변 시스타틴 C를 보였다 (도 15 참조).
바이오마커 수준과 임상 파라미터 사이의 상관성
혈소판
상승된 수준의 CCL5는 기준선에서의 보다 높은 혈소판 계수와 분명한 상관성을 가졌다 (p=<0.0001; cc (상관 계수) = 0.8106). 상승된 수준의 sCD40L은 또한 기준선에서의 보다 높은 혈소판 계수와 상관성을 가졌다 (p=<0.001; cc=0.6313).
또한, 에쿨리주맙 치료 후에 정상화된 Ba 수준을 갖는 환자는 그의 Ba 수준이 치료 후에 상승된 상태로 유지되는 환자보다 유의하게 더 높은 혈소판 증가를 보인다. 도 13을 참조한다.
추정된 사구체 여과율 (eGFR), LDH, 및 소변 보체
상관성은 또한 상승된 혈장 Ba 수준과 감소된 eGFR 사이에서 관찰되었다 (p<0.0001; cc= -0.7219). 치료 전에 aHUS 환자의 혈청 내의 TNFR1의 상승한 농도는 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준과 상관성을 갖지만 (p=0.027; cc=0.3586), 보다 낮은 eGFR과 보다 유의한 상관성을 보였다 (p<0.0001; cc= -0.6134). 또한, 보다 높은 수준의 소변 보체 성분 C5a 및 sC5b-9 및 신장 손상 마커 (β2M, 클러스테린, 시스타틴 C, NGAL, 및 TIMP-1)는 보다 낮은 eGFR과 중간 정도의 상관성을 보였다 (p=0.0002 내지 0.0242; cc= -0.4286 내지 -0.6714).
상승된 수준의 소변 sC5b-9, 클러스테린, 및 TIMP-1은 단백뇨와 약한 상관성을 보였고 (p=0.0086 내지 0.0284; cc = 0.40 내지 0.4788), 상승된 수준의 혈장 Ba (p=0.0017; cc = 0.517), β2M, 클러스테린, 소변 sC5b-9, 및 시스타틴 C는 에쿨리주맙을 사용한 치료 전에 환자의 소변 내의 증가된 크레아티닌과 상관성을 보였다 (p=0.0440-0.0018; cc = 0.3982-0.6457).
aHUS의 최초 임상 제시
또한, 최초의 aHUS 징후를 경험하는 환자와 기준선에서 유의하게 상승된 혈장 D-이량체 수준 또는 소변 FABP-1 (에쿨리주맙 치료 전에) 사이에 상관성이 관찰되었다 (표 8 참조).
<표 8>
Figure 112020055722894-pat00011
무증상성 (Smoldering) 질환
연구에 포함된 aHUS 환자 중 6명은 정상화된 혈액학적 파라미터 (합토글로빈, LDH, 및 혈소판 수준 포함)를 제시하였다. 그러나, 상기 환자들은 안정한 임상 상황에도 불구하고 여전히 만성 염증 및 보체 활성화의 증거를 보였다. 환자들은 유의하게 상승된 수준의 혈청 TNFR1뿐만 아니라 (도 10a), 유의하게 상승된 수준의 트롬보모듈린, Ba (도 10b), 프로트롬빈 단편 1+2 (도 10e), VCAM-1 (도 10c), 및 d-이량체 (도 10d)를 보유하였다. 이와 유사하게, 기준선에서 정상 (>150 x 109 혈소판/㎕) 혈소판 수준을 갖는 환자는 대부분의 바이오마커 (예를 들어, Ba (도 10f), VCAM-1 (도 10g), D-이량체 (도 10h), 및 F1+2 (도 10i)의 상승된 수준을 계속 보인다. 종합적으로, 상기 발견은 심지어 치료 후에 임상 관해 상태로 여겨지는 aHUS 환자의 하위세트에 대해서도, 진행중인 낮은 수준의 보체 활성, 응고병증, 및 염증이 존재할 가능성 나타낸다.
바이오마커 수준과 임상 결과 사이의 상관성
혈액학적 반응
완전한 혈액학적 반응을 갖는 환자는 TNFR1, 소변 클러스테린, 및 소변 보체 수준 (C5a 및 C5b-9)의 보다 극적인 감소를 제시한다 (도 11). 예를 들어, 상기 aHUS 바이오마커 단백질의 농도 감소를 보인 환자의 86%는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 후 제12-17주까지 완전한 혈액학적 반응 (혈소판 및 LDH의 정상화)을 달성하였다. 또한, 상기 환자는 완전한 혈액학적 반응을 달성하지 않은 환자보다 더 큰 혈청 TNFR1, 소변 클러스테린, 소변 C5a, 및 소변 C5b-9의 평균 감소 백분율을 보였다.
또한, TNFR1 감소의 신속성 (예를 들어, 제17주 또는 그 초과에 비해 제12주만의)은 완전한 혈액학적 반응과 상관성이 있음이 관찰되었다 (p=0.0008). D-이량체의 정상화 비율은 완전한 혈액학적 반응 (p= 0.0109; cc= 6.26)과 유의하게 연관되었다.
또한, 데이타는 제12-17주 (p=0.0022) 및 제26주 (p=0.0110)에서 혈소판 계수의 유의하게 더 큰 증가가 (각각 제12-17주 및 제26주에서) 정상화된 혈장 Ba 농도를 갖는 에쿨리주맙-치료된 aHUS 환자에서 달성되었음을 보여준다. 혈소판의 개선은 또한 제4-6주 (P=0.0148; cc= -0.4087) 및 제12-17주 (P=0.0073; cc = -0.4396)에서 평균 F1+2 수준의 유의한 감소와 상관성이 있고, 제12-17주에 d-이량체 수준의 감소 (P=0.0470; cc = -0.3381)와는 보다 약한 상관성이 있었다. 그럼에도 불구하고, 환자의 하위세트는 제4주 내지 26주에 혈소판 계수의 더 큰 증가를 보이지만, 유의하게 상승된 수준의 프로트롬빈 단편 1+2, 트롬보모듈린, 소변 β2M, 클러스테린, TIMP-1, 및 시스타틴 C를 계속 보였고, 이것은 진행중인 기저 질환 활성을 시사한다.
연구로부터 수집된 데이타의 분석은 또한 다른 바이오마커 단백질 농도의 변화와 혈소판 회복 사이의 상관성을 보여주었다. 예를 들어, CCL5, MCP-1, 및 sCD40L의 농도는 하기 표 9에 제시된 바와 같이 에쿨리주맙-치료된 환자에서 혈소판 계수의 증가와 분명한 상관성을 보여주었다.
<표 9>
Figure 112020055722894-pat00012
혈전성 미세혈관 병증 (TMA)
혈장 Ba 수준이 보다 크게 감소한 에쿨리주맙-치료된 aHUS 환자는 보다 빈번하게 완전 TMA 반응 (예를 들어, 혈액학적 파라미터 (예를 들어, 혈소판 계수 및 LDH 수준)의 정상화 및 신장 기능의 보존)을 달성하였다. 예를 들어, 72.7%의 환자는 제12-17주까지 완전 TMA 반응을 달성하였고, 85.29%의 환자는 제26주까지 완전 TMA 반응을 달성하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, 상기 환자들은 완전 TMA 반응을 달성하지 않은 환자보다 더 큰 혈장 Ba 농도의 평균 감소 백분율을 보였다 (각각 p=0.0018 및 p=0.006).
치료 후 eGFR
또한, 특정 바이오마커의 감소 및/또는 정상화와 eGFR 사이에 관련성이 관찰되었다. 예를 들어, eGFR의 유의하게 더 큰 개선 (표 10) (예를 들어, 적어도 4주 간격으로 실시된 적어도 2개의 연속적인 측정치에 대해 eGFR ≥ 15 mL/min/1.73 ㎡가 지속됨)은 정상화된 MCP-1, IL-6, 및 IFN-γ (제4-6주); 정상화된 VCAM-1, CXCL10, CXCL9, 및 Ba (제12-17주), 및 정상화된 Ba, 소변 β2M, 소변 CysC, vWF, D-이량체, 클러스테린, CXCL10, CXCL9, 소변 FABP-1 등을 갖는 환자 (제26주) 사이에서 관찰되었다 (표 10). 또한, 도 16을 참고한다.
<표 10>
Figure 112020055722894-pat00013
실시예 3. aHUS 환자에서 선택된 aHUS 바이오마커 단백질의 기준선 수준
기준선에서, 에쿨리주맙 치료 전에, 유의한 보체 활성화, 혈관 염증/손상, 및 장기 손상의 실질적인 증거가 혈장 교환/혈장 주입의 사용 또는 혈소판 계수, Hp 또는 LDH에 대한 정상 실험실 값과 상관없이 aHUS 환자에서 관찰되었다. 표 11에 제시된 데이타에 의해 입증되는 바와 같이, 보체 활성, 혈관 염증, 내피 활성화 및 손상, 응고, 및 신장 손상의 aHUS 바이오마커의 농도는 건강한 대상체에 비해 aHUS 환자에서 유의하게 상승하였다.
<표 11>
Figure 112020055722894-pat00014
NHV는 표에 열거된 제시된 aHUS 바이오마커 단백질에 대한 정상 인간 값 또는 농도를 의미한다.
"creat"는 그의 농도가 표에 열거된 특정 바이오마커 농도를 표준화하기 위해 사용되는 크레아티닌을 의미한다.
CAP는 보체의 대체 경로 (상기 참조)를 나타낸다.
"BL"은 "기준선", 즉, 에쿨리주맙을 사용한 치료 이전을 나타낸다.
"N"은 제시된 질환 과정 및 바이오마커에 대해 분석된 환자의 총수이다. "n"은 제시된 바이오마커가 상승한 "N" 환자의 수이다.
"U"는 분석물이 소변 내에서 측정되었음을 나타낸다.
*P 값은 군 사이의 차이에 대해 시험하는 윌콕슨 순위 합 검정을 이용하여 계산하였다.
또한, 본 발명자들은 혈장 교환 (PE) 또는 혈장 주입 (PI) 요법을 받지 않은 환자에서 aHUS 바이오마커의 상승 수준에 비해 PE 또는 PI 요법을 받았거나 받고 있는 환자에서 관찰된 특정 aHUS 바이오마커의 기준선 상승 수준 사이에 통계상 유의성이 존재하지 않음을 관찰하였다. 예를 들어, Ba, sTNFR1, sVCAM-1, 및 D-이량체의 농도는 PE/PI 요법을 받은 환자에서 감소 또는 정상화되지 않았다 (도 17a-d). 도 17a-d에 제시된 데이타에서 분석된 26명의 환자 중 단지 3명만이 PE/PI를 받지 않았음에 유의한다. 대다수의 환자 (n=23)는 정상의 건강한 지원자에 비해 상승된 수준의 시스타틴 C를 보였다. 시스타틴 C는 신장 손상 마커 (사구체 손상)이기 때문에, PE/PI를 받지 않은 환자는 그의 신장에 대한 손상이 보다 작고, 따라서 그의 소변 내의 신장 손상-관련 바이오마커 단백질의 수준이 감소되었을 가능성이 존재한다.
유사하게, 에쿨리주맙 요법 전에, 기준선에서 보체 활성화 (예를 들어, Ba), 염증 (예를 들어, sTNFR1), 내피 세포 활성화 (sVCAM-1), 응고 (D-이량체), 및 신장 손상 (시스타틴-C)의 단백질 마커의 농도는 정상 혈소판 계수를 갖는 aHUS 환자에서 상승하였다 (도 18a-e 참조). 정상 Hp 및 LDH 수준을 갖는 환자는 진행중인 보체 활성화, 염증, 내피 세포 활성화, 응고 및 신장 손상의 증거를 보였다 (도 19a-e 참조).
상기 내용을 살펴보면, 보체 활성, 혈관 염증, 내피 활성화 및 손상, 응고 및 신장 손상을 반영하는 바이오마커의 농도는 정상의 건강한 대상체에 비해 aHUS 환자에서 장기적으로 상승되었다. PE/PI를 받는 aHUS 환자는 유의한 진행중인 보체 활성화, 혈관 염증, 내피 활성화, 응고 및 신장 손상의 강력한 증거를 보였다. PE/PI는 몇몇 환자에서 정상 혈소판 계수 및 LDH를 일시적으로 유지할 수 있지만, 상기 결과는 근원적인 보체 탈조절 및 TMA 과정이 지속됨을 입증한다. 혈소판 계수, LDH, 및 Hp에 대한 정상 실험실 값에도 불구하고, 상기 연구는 유의한 진행중인 보체 활성화, 혈관 염증, 내피 활성화, 응고 및 신장 손상이 aHUS 환자에 존재함을 나타낸다.
실시예 4. aHUS 바이오마커 농도에 대한 에쿨리주맙을 사용한 지속적인 치료의 효과
본 발명자들은 지속적인 에쿨리주맙 치료가 장기적으로 상승된 보체 활성화 및 말단 보체 매개 신장 손상을 억제하고, aHUS 환자에서 염증, 내피 손상 및 혈전증 위험을 감소시킴을 관찰하였다. 예를 들어, 지속적인 에쿨리주맙 치료는 C5a 및 sC5b-9 (예를 들어, 소변 C5a 및 sC5b-9) 둘 모두의 농도 감소에 의해 표시되는 바와 같이 신속하고 완전하게 말단 보체 활성화를 억제하였다. 도 20a-b를 참조한다. 기준선에서, aHUS 환자는 몇몇 환자에서 PE/PI의 사용 또는 정상 혈소판 계수에도 불구하고 NHV에 비해 유의한 말단 보체 활성화를 나타내었다. 실제로, aHUS 환자는 NHV보다 45배 더 높은 소변 C5a 및 305배 더 높은 소변 sC5b-9 수준을 보였다. 그러나, 지속적인 에쿨리주맙 치료 동안, 모든 aHUS 환자는 병원성 말단 보체 활성화 생성물의 완전한 정상화와 함께 신속하고 강력한 말단 보체 차단을 보였고, NHV에 비해 수준의 차이는 나타나지 않았다.
추가로, 지속적인 에쿨리주맙 치료는 신장 손상의 바이오마커 단백질의 농도를 정상화시켰다 (도 21a-c). 에쿨리주맙 요법 개시 전에, 대다수의 환자는 다음 바이오마커의 상승된 수준을 나타내었다: 세뇨 간질성 손상 및 신장 기능의 저하 (예를 들어, L-FABP-1, NHV보다 ~48배 더 높음), 사구체 여과 (예를 들어, 시스타틴 C, NHV보다 ~24배 더 높음), 근위 세뇨관 손상 (예를 들어, 클러스테린, NHV보다 8.6배 더 높음). 그러나, 에쿨리주맙을 사용한 지속적인 치료는 소변 FABP-1 (100%까지), 시스타틴 C (99%까지), 및 클러스테린 (98%까지)의 농도를 극적으로 감소시켰다. 상기 감소는 모든 시점에 걸쳐 유의하고 (모두 P<0.0001), 모든 신장 손상 마커의 감소한 농도는 NHV의 수준보다 상이하지 않았다. 추가의 신장 손상 마커 (예를 들어, TIMP-1 및 β2-마이크로글로불린)도 또한 정상화되었다 (상기 실시예 2 참조). 상기 결과는 장기 허혈 및 손상이 완전히 말단 보체 의존성일 수 있음을 시사하고, 보체-매개 TMA의 지속적인 억제가 임상적으로 유의한 eGFR 개선 및 투석 중단을 유도함을 제시하는 임상 데이타를 확인해준다.
에쿨리주맙을 사용한 지속적인 치료는 또한 보체 대체 경로 활성화를 유의하게 감소시킨다 (도 22 참조). 모든 aHUS 환자는 C5 상류의 유의한 전신 CAP 활성화와 함께, 에쿨리주맙 치료 전에 NHV에 비해 5.5배 더 높은 수준의 Ba를 보였다. 그러나, 에쿨리주맙 요법의 개시 이후, CAP 활성화의 상류 바이오마커의 농도 (예를 들어, Ba 수준)는 30% 감소하였고, 제4-6주 후의 감소는 NHV의 마커의 농도에 비해 모든 시점에서 유의하였다 (p<0.005). 그러나, Ba 수준은 에쿨리주맙으로 치료된 aHUS 환자에서 정상화되지 않았고, 이것은 CAP 활성화가 지속됨을 시사하고 이것은 aHUS 환자에서 근원적인 보체 탈조절을 반영한다. 하지만, 명확하게 하면, 에쿨리주맙을 사용한 말단 보체 차단은 진행중인 CAP 활성화의 임상 결과로부터 환자를 보호하였다.
추가로, 에쿨리주맙을 사용한 aHUS 환자의 장기적인 치료는 염증, 내피 활성화, 및 조직 손상과 연관된 바이오마커의 농도를 유의하게 감소시켰다 (도 23a-c). 혈청 sTNFR1 수준은 기준선에서 100%의 aHUS 환자에서 상승하였다 (NHV 수준보다 18.7배 더 높음). 에쿨리주맙을 사용한 지속적인 치료는 sTNFR1을 94%까지 유의하게 감소시켰다. 제4-6주에서 상기 바이오마커의 농도의 감소는 모든 시점에서 유의하였다 (P<0.0001). 가용성 VCAM-1 및 TM 수준은 NHV에 비해 기준선에서 >95%의 aHUS 환자에서 각각 2배 및 3.6배 상승하였고, 이것은 에쿨리주맙 요법 전에 유의한 내피 세포 활성화 및 손상을 입증한다. TM 및 sVCAM-1 농도는 또한 에쿨리주맙 치료 동안 유의하게 감소하였다. 제12-17주 후에, 내피 손상의 바이오마커의 농도 감소는 모든 추후 시점에서 유의하였지만 (TM; P<0.0001), NHV에 비해 여전히 약간 상승하였다. 극적으로 감소된 가용성 TM 수준은 혈전증 위험에 대해 보호 작용을 하는 막 결합 TM의 회복을 반영할 수 있다.
마지막으로, 에쿨리주맙을 사용한 장기적인 치료는 혈전증 위험 및 응고와 연관된 바이오마커의 농도를 신속하고 유의하게 감소시켰다 (도 24a-b). 응고 바이오마커 F1+2 및 D-이량체의 농도는 94%의 aHUS 환자보다 기준선에서 유의하게 상승하였다 (NHV보다 5.5배 및 9.8배 더 높음) (각각 P<0.0001 및 P=0.0002). 그러나, F1+2 및 D-이량체는 에쿨리주맙을 사용한 치료 개시 2.5주 후에 유의하게 감소하였다. 지속적 에쿨리주맙 치료에 의해, F1+2의 농도는 88%까지 감소하고 (모든 시점에 대해 P<0.05), D-이량체 농도는 99%까지 감소하였다 (모든 시점에 대해 P<0.0001). 그러나, 상기 2개의 마커는 정상의 건강한 대상체의 각각의 농도에 비해 약간 상승한 상태로 유지되었다.
결론
상기 데이타를 살펴보면, 본 발명자들은 많은 결론을 도출할 수 있었다. 먼저, 기준선에서, 정상의 건강한 지원자 (NHV)로부터의 샘플 내의 수준에 비해 상승된 수준의 모든 혈전성 미세혈관병증 (TMA) 바이오마커가 aHUS 환자에서 명백하였다. 모든 환자군 - PE/PI를 받는 환자 또는 정상 혈소판, Hp 또는 LDH를 갖는 환자 포함 -에서 aHUS의 환자는 다음의 측정치에서 NHV에 비해 유의한 상승을 나타냈다: 말단 보체 활성화 (NHV 수준보다 45-305배 더 높음); 중요 장기 손상; 대체 경로의 보체 활성화 (예를 들어, Ba 수준에 의해 나타나는 바와 같이; NHV 수준보다 5.5배 더 높음); 혈관 염증; 내피 활성화 및 손상; 및 응고.
aHUS 환자의 지속적 에쿨리주맙 치료는 말단 보체 활성화의 고도로 상승된 마커를 유의하게 감소시키고 정상화시켰다. 에쿨리주맙을 사용한 말단 보체 활성화의 억제는 또한 장기 손상의 마커를 극적으로 감소시키고 정상화시켰다. 대체 경로 활성화의 상류 바이오마커가 또한 유의하게 감소하였지만, 정상화되지는 않았다. 낮은 수준의 대체 경로 활성화가 치료된 환자에서 지속하였고, 이것은 aHUS의 환자에서 근원적인 보체 탈조절을 반영한다. 즉, 데이타는 에쿨리주맙을 사용한 말단 보체 차단이 진행중인 대체 경로 활성화의 임상 결과로부터 aHUS 환자를 보호함을 명백하게 나타낸다.
추가로, 지속적 에쿨리주맙 치료는 또한 다음을 일으켰다: (i) 혈관 염증의 마커의 유의하고 지속적인 감소 (94%까지); (ii) 내피 활성화의 마커의 유의한 억제 (60%까지); (iii) 거의 정상 수준까지 내피 손상의 마커의 유의하고 지속적인 감소 (77%까지) (이것은 말단 보체 활성화 및 내피 손상 사이의 명백한 관계를 입증한다); 및 (iv) 아마도 혈전 형성에 대한 가능성을 감소시키고 따라서 상기 환자에서 TMA의 발생을 감소시키는, 혈전증 위험의 바이오마커의 농도의 현저한 감소 (99%까지). 본 발명자들은 임의의 이론 또는 작용 기전에 매이지는 않지만, 에쿨리주맙을 사용한 말단 보체 활성화의 억제가 지속적이어야 한다고 결론지었고, 이는 aHUS에서 말단 보체 억제의 상실은 심하게 증폭된 말단 보체 활성화의 신속한 증가를 일으킬 것이고, 이것이 후속적으로 근원적인 준임상적 내피 활성화의 증가, 내피 손상의 유의한 가속화, 혈전증 위험의 현저한 증가, 및 파멸적인 혈관 허혈 및 중요 장기 손상의 조기 및 진행하는 위험을 일으키기 때문이다. 또한, 이들 데이타는 신장 손상, 혈관 염증, 및 내피 손상 및 활성화가 전적으로 또는 부분적으로 말단 보체 활성에 의존성임을 나타내고, 상기 말단 보체 활성은 에쿨리주맙을 사용하여 효과적이고 안전하게 억제된다.
본 개시내용은 그의 구체적인 실시양태를 참고로 하여 설명하였지만, 개시내용의 진정한 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 가능하고, 균등물로 대체될 수 있음이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 특정 상황, 물질, 물질의 조성물, 공정 또는 공정 단계(들)을 본 개시내용의 목적, 취지 및 범위에 맞도록 하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 상기 변형은 본 개시내용의 범위 내에 포함되는 것이 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> MCKNIGHT, Susan Faas COFIELL, Roxanne KUKREJA, Anjli BEDARD, Krystin A. YAN, Yan <120> ATYPICAL HEMOLYTIC UREMIC SYNDROME BIOMARKER PROTEINS <130> AXJ-176PC <140> New Application <141> Concurrently Herewith <150> US 61/913,180 <151> 2013-12-06 <150> US 61/863,299 <151> 2013-08-07 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(244) <223> Human Factor B fragment Ba <400> 1 Leu Gly Leu Leu Ser Gly Gly Val Thr Thr Thr Pro Trp Ser Leu Ala 1 5 10 15 Arg Pro Gln Gly Ser Cys Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Lys Gly Gly 20 25 30 Ser Phe Arg Leu Leu Gln Glu Gly Gln Ala Leu Glu Tyr Val Cys Pro 35 40 45 Ser Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Val Gln Thr Arg Thr Cys Arg Ser Thr 50 55 60 Gly Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gln Asp Gln Lys Thr Val Arg Lys 65 70 75 80 Ala Glu Cys Arg Ala Ile His Cys Pro Arg Pro His Asp Phe Glu Asn 85 90 95 Gly Glu Tyr Trp Pro Arg Ser Pro Tyr Tyr Asn Val Ser Asp Glu Ile 100 105 110 Ser Phe His Cys Tyr Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg 115 120 125 Thr Cys Gln Val Asn Gly Arg Trp 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Claims (29)

  1. 비정형적 용혈성 요독 증후군 (aHUS)을 앓는 환자를 치료하기 위한, 보체 C5 억제제를 포함하는 제약 조성물이며,
    상기 환자의 생물학적 유체는 상승된 농도의 적어도 2종의 aHUS-연관 바이오마커를 갖는 것으로 결정된 바 있고,
    상기 환자에게는, 상기 적어도 2종의 aHUS-연관 바이오마커의 농도를, 보체 C5 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일 종류의 생물학적 유체 샘플에서 측정된 농도에 비해 감소시키기에 충분한 양과 빈도로 보체 C5 억제제가 투여되며,
    상기 적어도 2종의 aHUS-연관 바이오마커는
    (1) 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 및 가용성 C5b9 (sC5b9),
    (2) TNFR1 및 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편, 또는
    (3) TNFR1 및 가용성 C5b9 (sC5b9)
    인 제약 조성물.
  2. 비정형적 용혈성 요독 증후군 (aHUS)을 앓는 환자를 치료하기 위한, 보체 C5 억제제를 포함하는 제약 조성물이며,
    상기 환자의 소변은 상승된 농도의 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 및 가용성 C5b9 (sC5b9)를 함유하는 것으로 결정된 바 있고,
    상기 환자에게는, 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 및 가용성 C5b9 (sC5b9)의 농도를, 보체 C5 억제제를 사용한 치료 전에 환자의 소변에서 측정된 농도에 비해 감소시키기에 충분한 양과 빈도로 보체 C5 억제제가 투여되는 것인 제약 조성물.
  3. 비정형적 용혈성 요독 증후군 (aHUS)을 앓는 환자를 치료하기 위한, 보체 C5 억제제를 포함하는 제약 조성물이며,
    상기 환자의 혈액은 상승된 농도의 TNFR1을 함유하는 것으로 결정된 바 있고,
    상기 환자의 소변은 상승된 농도의 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 또는 가용성 C5b9 (sC5b9)를 함유하는 것으로 결정된 바 있고,
    상기 환자에게는, TNFR1 및 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 또는 가용성 C5b9 (sC5b9)의 농도를, 보체 C5 억제제를 사용한 치료 전에 상기 환자에서 측정된 농도에 비해 감소시키기에 충분한 양과 빈도로 보체 C5 억제제가 투여되는 것인 제약 조성물.
  4. 제2항의 제약 조성물을 사용하는 보체 C5 억제제를 사용한 치료에 대한 환자의 반응성을 모니터링하는 방법이며,
    치료 전 및 그 후에 환자의 소변 내 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 및 가용성 C5b9 (sC5b9)의 농도를 결정하는 단계
    를 포함하고,
    치료 전 측정된 농도에 비해, 치료 후 측정된 보체 성분 인자 B 및 가용성 C5b9 (sC5b9)의 감소된 농도는 환자가 상기 치료에 반응성임을 나타내는 것인 방법.
  5. 제3항의 제약 조성물을 사용하는 보체 C5 억제제를 사용한 치료에 대한 환자의 반응성을 모니터링하는 방법이며,
    (1) 치료 전 및 그 후에 환자의 혈액 내 TNFR1 및
    (2) 치료 전 및 그 후에 환자의 소변 내 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 또는 가용성 C5b9 (sC5b9)
    의 농도를 결정하는 단계
    를 포함하고,
    치료 전 측정된 농도에 비해, 치료 후 측정된 TNFR1 및 보체 성분 인자 B 또는 가용성 C5b9 (sC5b9)의 감소된 농도는 환자가 상기 치료에 반응성임을 나타내는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 생물학적 유체가 소변인 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 생물학적 유체가 혈액인 제약 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 성분 인자 B가 Ba인 제약 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, MCP-1, IFN-γ, IL-6, 프로트롬빈 단편 F1+2, d-이량체, 트롬보모듈린, VCAM-1, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 보체 성분 C5a, β2 마이크로글로불린 (β2M), 클러스테린, 시스타틴 C, NAG, TIMP-1, NGAL, 지방산 결합 단백질 1 (FABP-1), 알부민, CXCL9, KIM-1 및 CCL5, 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), ICAM-1, IL-1 베타, IL-12 p70, IL-8, 및 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가 aHUS-연관 바이오마커 단백질의 농도가 환자에서 결정되는 것인 제약 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가
    (a) 보체 C5 억제제를 사용한 치료 직전 3개월 이내에 투석을 적어도 1회 받았거나, 또는
    (b) 최초 급성 aHUS 징후를 경험하고 있는 것인
    제약 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 농도가 보체 C5 억제제의 최초 투여 후 2주 또는 2개월 내에 발생하는 것인 제약 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 보체 C5 억제제로 장기적으로 치료되는 것인 제약 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 C5 억제제가 소분자, 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 펩티드 모방체, 또는 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 C5 억제제가 MB12/22, MB12/22-RGD, ARC187, ARC1905, SSL7, 및 OmCI로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 C5 억제제가 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간화 항체, 재조합 항체, 디아바디, 키메라화 또는 키메라 항체, 모노클로날 항체, 탈면역화 항체, 완전 인간 항체, 단일쇄 항체, Fv 단편, Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 보체 성분 C5에 결합하고, 단편 C5a 및 C5b로의 C5의 절단을 억제하는 것인 제약 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 항체가 에쿨리주맙 또는 에쿨리주맙의 변이체인 제약 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 항원-결합 단편이 펙셀리주맙인 제약 조성물.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 농도가 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사성 면역검정 (RIA)을 사용하여 측정되는 것인 제약 조성물.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, sC5b9의 정상 농도가 소변 크레아티닌 1 mg당 0 내지 0.6 ng인 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 환자의 sC5b9 농도는, 이 농도가 sC5b9의 정상 농도보다 적어도 10배 더 높은 경우 상승한 것으로 간주되는 것인 제약 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 환자의 sC5b9 농도는, 이 농도가 소변 크레아티닌 1 mg당 적어도 20 ng인 경우 상승한 것으로 간주되는 것인 제약 조성물.
  24. 제8항에 있어서, Ba의 정상 농도가 1000 ng/mL 미만인 제약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 환자의 Ba 농도는, 이 농도가 Ba의 정상 농도보다 적어도 2배 더 높은 경우 상승한 것으로 간주되는 것인 제약 조성물.
  26. 제1항 또는 제3항에 있어서, TNFR1의 정상 농도가 2000 pg/mL 미만인 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 환자의 TNFR1 농도는, 이 농도가
    (i) sTNFR1의 정상 농도보다 적어도 2배 더 높은 경우, 또는
    (ii) 적어도 10,000 pg/mL인 경우
    상승한 것으로 간주되는 것인 제약 조성물.
  28. 제1항에 있어서, aHUS-연관 바이오마커가 바이오마커/크레아티닌 [Cr] 비 [UPCR]를 통해 측정되는 것인 제약 조성물.
  29. 비정형적 용혈성 요독 증후군 (aHUS)을 앓는 환자를 치료하기 위한, 보체 C5 억제제를 포함하는 제약 조성물이며,
    상기 환자의 생물학적 유체는 상승된 농도의 보체 성분 인자 B의 단백질 분해 단편 Bb 및 가용성 C5b9 (sC5b9)를 갖는 것으로 결정된 바 있고,
    상기 환자에게는, Bb 및 sC5b9의 농도를, 보체 C5 억제제를 사용한 치료 전에 환자로부터 얻은 동일 종류의 생물학적 유체 샘플에서 측정된 농도에 비해 감소시키기에 충분한 양과 빈도로 보체 C5 억제제가 투여되는 것인 제약 조성물.
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