ES2848206T3 - Un método de cuantificar C5 sin unir en una muestra - Google Patents

Abstract

Un método para cuantificar la proteína del complemento C5 humana libre (sin unir) (C5) de una muestra que comprende: a. unir el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a una placa de ensayo de 96 pocillos recubierta con estrepavidina; b. capturar el C5 libre (sin unir) en la muestra añadiendo la muestra a la placa; c. detectar el C5 libre capturado añadiendo un anticuerpo de detección anti-C5 marcado con azufre a la placa; y d. cuantificar el C5 libre capturado usando electroquimioluminiscencia; en donde la muestra se diluye aproximadamente 1: 2; en donde la muestra se mantiene en hielo; en donde las etapas b. y c. son aproximadamente de 15 a 30 minutos, y en donde el anticuerpo anti-C5 de captura biotinilado se añade a una concentración de aproximadamente 5 μg/ml.

Description

DESCRIPCIÓN

Un método de cuantificar C5 sin unir en una muestra

Incorporación de listado de secuencias

La solicitud en este instante contiene un Listado de secuencias, que se ha enviado electrónicamente en ASCII. Dicha copia de ASCII, creada el 18 de Octubre 2017, se llama 1900-426PCT_SL.txt y tiene 54.331 bytes de tamaño.

Campo técnico

Esta invención se refiere al campo de las enfermedades y ensayos relacionados inmunológicamente para cuantificar la diana de un fármaco libre (sin unir).

Antecedentes

proteína del complemento C5 es un componente importante de la cascada del complemento y una diana de fármacos, como eculizumab y ALXN1210. La cuantificación adecuada de esta diana es esencial para controlar el estado de la enfermedad, el modelado, la selección de dosis, las reivindicaciones de la etiqueta, etc. Muchos formatos de ensayos de unión a ligando que usan dianas como un reactivo de captura para dianas libres son inherentemente defectuosos en la duración de la incubación de muestra, el reactivo de captura puede establecer un equilibrio dinámico con la diana que ya está unido al fármaco en la matriz. Debido a este equilibrio, es posible que el ensayo sobreestime la cantidad de diana libre en la matriz, conduciendo así a un modelado, una selección de dosis, datos de archivo y reivindicaciones de etiqueta.

Una estrategia común para superar esta sobreestimación en los ensayos de unión de ligandos es abreviar el tiempo de incubación de la muestra, reduciendo así la oportunidad de que el reactivo de captura extraiga la diana unida del fármaco en la matriz. Para lograr esto, a menudo es necesario aumentar la concentración del reactivo de recubrimiento hasta 5 veces, lo que en esencia puede minimizar los efectos de la incubación de la muestra más corta. Además, las muestras de pretratamiento tienden a tener niveles mucho más altos de diana libre que las muestras de postratamiento, lo que a menudo requiere diferentes diluciones de muestra para cada situación.

Sumario

Esta descripción proporciona un método para cuantificar la proteína del complemento C5 humana libre (sin unir) (C5) de una muestra que comprende:

a. unir el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a partículas recubiertas de estrepavidina; en donde dicho anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado se añade mediante acción capilar a un Gros Bioaffy 200 CD que comprende columnas con las partículas recubiertas de estrepavidina; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un instrumento Gyrolab xPlore o Gyrolab XP, conduciendo así el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

b. capturar el C5 libre (sin unir) en la muestra; en donde la muestra se añade al CD mediante acción capilar; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del instrumento Gyrolab xPlore o Gyrolab XP, conduciendo así la muestra al anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

c. detectar el C5 libre capturado; en donde un anticuerpo de detección anti-C5 marcado con AlexaFluor se añade a la CD mediante acción capilar, en donde dicho anticuerpo de detección anti-C5 se une a C5 en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo de captura; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, conduciendo así el anticuerpo de detección al C5 libre unido al anticuerpo de captura unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; y

d. cuantificar el C5 libre capturado mediante detección de fluorescencia inducida por láser.

Sin limitar la descripción, a continuación se describen varias realizaciones de la descripción con fines ilustrativos.

Ítem 1. Un método para cuantificar la proteína del complemento C5 humana libre (sin unir) (C5) de una muestra que comprende: a. unir el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a una placa de ensayo de 96 pocillos Meso Scale Discovery® (MSD®) recubierta con estrepavidina; b. capturar el C5 libre (no unido) en la muestra añadiendo la muestra a la placa; c. detectar el C5 libre capturado añadiendo un anticuerpo de detección anti-C5 marcado con sulfo a la placa; y d. cuantificar el C5 libre capturado usando electroquimioluminiscencia; en donde la muestra se diluye aproximadamente 1:2; en donde la muestra se mantiene en hielo; donde las etapas b.-c. son de aproximadamente 15 a 30 minutos, y en donde el anticuerpo anti-C5 de captura biotinilado se añade a una concentración de aproximadamente 5 pg/ml.

Ítem 2. Un método para cuantificar la proteína del complemento C5 humana libre (sin unir) (C5) de una muestra que comprende: a. unir el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a partículas recubiertas de estrepavidina; en donde dicho anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado se añade por acción capilar a un Gyros Bioaffy 200 CD que comprende columnas con las partículas recubiertas de estrepavidina; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un instrumento Gyrolab xPlore o Gyrolab XP, conduciendo así el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; b. capturar el C5 libre (sin unir) en la muestra; en donde la muestra se añade al CD por acción capilar; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del instrumento Gyrolab xPlore o Gyrolab XP, conduciendo así la muestra al anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; c. detectar el C5 libre capturado; en donde un anticuerpo de detección anti-C5 marcado con AlexaFluor se añade a la CD por acción capilar, en donde dicho anticuerpo de detección anti-C5 se une a C5 en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo de captura; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, conduciendo así el anticuerpo de detección al C5 libre unido al anticuerpo de captura unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; y d. cuantificar el C5 libre capturado mediante detección de fluorescencia inducida por láser.

Ítem 3. El método del ítem 1, que comprende además calcular la concentración o cantidad de anticuerpo C5 libre comparando los datos obtenidos en la etapa d. a una curva estándar preparada a partir de cantidades conocidas de C5 añadidas a una muestra empobrecida en C5 utilizando el método del ítem 1.

Ítem 4. El método del ítem 2, que comprende además calcular la concentración o cantidad de anticuerpo C5 libre comparando los datos obtenidos en la etapa d. a una curva estándar preparada a partir de cantidades conocidas de C5 añadidas a una muestra empobrecida en C5 utilizando el método del ítem 2.

Ítem 5. El método del ítem 3, que comprende además calcular la concentración de anticuerpo C5 libre con el software Gyros Evaluator.

Ítem 6. El método de cualquiera de los ítems anteriores, en donde la muestra se obtiene de un paciente humano. Ítem 7. El método del ítem 6, en donde dicha muestra es una muestra de suero o una muestra de plasma.

Ítem 8. El método de cualquiera de los ítems anteriores, en donde el paciente ha sido tratado con un anticuerpo anti-C5.

Ítem 9. El método del ítem 8, en donde el paciente ha sido tratado con eculizumab.

Ítem 10. El método del punto 8, en donde el paciente ha sido tratado con ALXN1210.

Ítem 11. El método de cualquiera de los ítems precedentes, en donde el anticuerpo de captura biotinilado es eculizumab o ALXN1210.

Ítem 12. El método de cualquiera de los ítems precedentes, en donde el anticuerpo anti-C5 de detección es N19-8 (anticuerpo C5 anti-humano de ratón).

Ítem 13. El método del ítem 2, en el que se usa tampón Rexxip A para diluir muestras y tampón Rexxip F para diluir el anticuerpo de detección.

Ítem 14. El método del ítem 2, que comprende además cebar el instrumento Gyros dos veces por separado con tampón de lavado Bioaffy 1 y pH 11.

Ítem 15. El método del ítem 2, en donde la muestra es una muestra de suero humano de un paciente, en donde se cuantifica el C5 libre de las muestras de suero de pretratamiento y postratamiento del paciente con un anticuerpo anti-C5, y en donde tanto el pretratamiento y la muestra de postratamiento se diluye a la misma dilución.

Ítem 16. El método del ítem 15, en donde tanto la muestra de pretratamiento como la de postratamiento se diluyen en una dilución de 1:20 a 1:30.

Se proporcionan numerosos otros aspectos de acuerdo con estos y otros aspectos de la invención. Otras características y aspectos de la presente invención serán más evidentes a partir de las siguientes descripciones detalladas y las reivindicaciones adjuntas. La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1 es un gráfico que muestra el paralelismo.

FIG. 2 es un gráfico que muestra el paralelismo de 7 sueros de donantes individuos.

FIG. 3 muestra el paralelismo de 7 sueros de donantes individuos.

Los resultados de transferencia del ensayo de la Organización de investigación por contrato temprano (CRO) se muestran en la FIG. 4A y FIG.4B. FIG.4C muestra selectividad en los primeros resultados de transferencia de CRO.

FIG. 5 muestra que MRD (dilución mínima requerida) de 30 es óptima.

FIG. 6 muestra que no hay transferencia en una evaluación de transferencia.

FIG. 7 muestra una comparación resumida.

Descripción detallada

Como se usa en este documento, la palabra "a" o "pluralidad" antes de un sustantivo representa uno o más de los sustantivos en particular. Por ejemplo, la frase "una célula de mamífero" representa "una o más células de mamífero".

El término "célula de mamífero" es conocido en la técnica y se puede referir a cualquier célula de o derivada de cualquier mamífero incluyendo, por ejemplo, un ser humano, un hámster, un ratón, un mono verde, una rata, un cerdo, una vaca, un hámster o un conejo. En algunas realizaciones, la célula de mamífero puede ser una célula inmortalizada, una célula diferenciada, una célula indiferenciada, una célula madre, etc.

Tal como se usan en este documento, los términos "sujeto" y "paciente" se usan de manera intercambiable. Un paciente o un sujeto puede ser un paciente humano o un sujeto humano.

El término "proteína recombinante" es conocido en la técnica. Brevemente, el término "proteína recombinante" se puede referir a una proteína que se puede fabricar usando un sistema de cultivo celular. Las células en el sistema de cultivo celular pueden derivar de, por ejemplo, una célula de mamífero, que incluye una célula humana, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana. En general, las células del cultivo celular contienen un ácido nucleico introducido que codifica la proteína recombinante de interés (ácido nucleico que puede estar presente en un vector, tal como un vector plásmido). El ácido nucleico que codifica la proteína recombinante también puede contener un promotor heterólogo unido operativamente a un ácido nucleico que codifica la proteína.

El término "inmunoglobulina" se conoce en la técnica. Brevemente, el término "inmunoglobulina" se puede referir a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 15 aminoácidos (p. ej., al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos, o más de 100 aminoácidos) de una proteína de inmunoglobulina (p. ej., una secuencia de dominio variable, una secuencia marco o una secuencia de dominio constante). La inmunoglobulina puede, por ejemplo, incluir al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena ligera, p. ej., al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena pesada, tal como una CDRH3. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo aislado (p. ej., una IgG, IgE, IgD, IgA o IgM). La inmunoglobulina puede ser una subclase de IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). La inmunoglobulina puede ser un fragmento de anticuerpo, p. ej., un fragmento Fab, un fragmento F (ab^')2 o un scFv. La inmunoglobulina también puede ser una proteína modificada que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina (p. ej., una proteína de fusión). La proteína modificada o proteína similar a inmunoglobulina también puede ser un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo dímero, trímero o multímero, o un di acuerpo, un DVD-Ig, un CODV-Ig, un Affibody® o un Nanobody®. Se describen en este documento ejemplos no limitantes de inmunoglobulinas y en la técnica se conocen ejemplos adicionales de inmunoglobulinas.

El término "proteína modificada" se conoce en la técnica. Brevemente, el término "proteína modificada" se puede referir a un polipéptido que no está codificado naturalmente por un ácido nucleico endógeno presente dentro de un organismo (p. ej., un mamífero). Los ejemplos de proteínas modificadas incluyen enzimas modificadas con una o más sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de aminoácidos que dan como resultado un aumento en la estabilidad y/o actividad catalítica de la enzima modificada, proteínas de fusión, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos divalentes, anticuerpos trivalentes, anticuerpos de cuatro dominios de unión, un diacuerpo y proteínas de unión a antígeno que contienen al menos una secuencia de matriz recombinante.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente y son conocidos en la técnica y pueden significar cualquier cadena de aminoácidos unida por enlace peptídico, independientemente de su longitud o -modificación traduccional.

El término "anticuerpo" se conoce en la técnica. El término "anticuerpo" se puede usar de manera intercambiable con el término "inmunoglobulina". Brevemente, se puede referir a un anticuerpo completo que comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada. Los anticuerpos completos incluyen diferentes isotipos de anticuerpos, incluidos los anticuerpos IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo primatizado, un anticuerpo desinmunizado y un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo se puede fabricar o derivar de cualquiera de una variedad de especies, p. ej., mamíferos tales como humanos, primates no humanos (p. ej., orangután, babuinos o chimpancés), caballos, vacas, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, conejos, cobayas, jerbos, hámsteres, ratas y ratones. El anticuerpo puede ser un anticuerpo purificado o recombinante. El anticuerpo también puede ser una proteína modificada o una proteína similar a un anticuerpo que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina (p. ej., una proteína de fusión). La proteína modificada o proteína similar a un anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo dímero, trímero o multímero, o un diacuerpo, un DVD-Ig, un CODV-Ig, un Affibody® o un Nanobody®.

El término "fragmento de anticuerpo", "fragmento de unión a antígeno" o términos similares son conocidos en la técnica y se pueden, por ejemplo, referir a un fragmento de un anticuerpo que conserva la capacidad de unirse a un antígeno diana (p. ej., C5 humano) e inhiben la actividad del antígeno diana. Tales fragmentos incluyen, p. ej., un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fv monocatenario (scFv), un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')2. Un fragmento scFv es una cadena polipeptídica única que incluye las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo del que se deriva el scFv. Además, los intracuerpos, minicuerpos, triacuerpos y diacuerpos también se incluyen en la definición de anticuerpo y son compatibles para su uso en los métodos descritos en este documento. Véase, p. ej., Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248 (1): 47-66; Hudson y Kortt (1999) J Immunol Methods 231 (1): 177-189; Poljak (1994) Structure 2 (12): 1121-1123; Rondon y Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51: 257-283. Un fragmento de unión a antígeno también puede incluir la región variable de un polipéptido de cadena pesada y la región variable de un polipéptido de cadena ligera. Por tanto, un fragmento de unión a antígeno puede comprender las CDR del polipéptido de cadena ligera y de cadena pesada de un anticuerpo.

El término "fragmento de anticuerpo" también puede incluir, por ejemplo, anticuerpos de dominio único, tales como anticuerpos de dominio único camelizados. Véase, p. ej., Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235; Nuttall et al. (2000) Curr Pharm Biotech 1:253-263; Reichmann et al. (1999) J Immunol Meth 231:25-38; publicaciones de Solicitudes Pc T nos. WO 94/04678 y WO 94/25591; y patente de EE.UU. no. 6,005,079. El término "fragmento de anticuerpo" también incluye anticuerpos de dominio único que comprenden dos dominios VH con modificaciones tales que se forman anticuerpos de dominio único.

El término "anticuerpo" también incluye "fragmento de unión a antígeno" y "fragmento de anticuerpo".

Para los términos "por ejemplo" y "tal como", y equivalentes gramaticales del mismo, se entiende que sigue la frase "de modo no taxativo", a menos que se establezca explícitamente lo contrario. Tal como se usa en este documento, la expresión "aproximadamente" pretende representar las variaciones debido a los errores en los experimentos. Se entiende que todas las mediciones informadas en este documento son modificadas por la expresión "aproximadamente", ya sea que esta expresión se use explícitamente o no, a menos que se establezca lo contrario de forma explícita. Como se usa en este documento, las formas singulares de "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en este documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Se describen en este documento métodos y materiales para su uso en la presente invención; también se pueden utilizar otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, secuencias, entradas de bases de datos y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan mediante esta referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.

El sistema de complemento

Como es bien sabido, el sistema de complemento actúa junto con otros sistemas inmunológicos del cuerpo para defenderse de la intrusión de patógenos celulares y virales. Hay al menos 25 proteínas de complemento. Los componentes de complemento logran sus funciones defensivas inmunes al interactuar en una serie de intrincados pero precisos eventos de escisión enzimática y unión a la membrana. La cascada del complemento resultante conduce a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunorreguladoras y líticas.

La cascada de complemento puede progresar a través de la ruta clásica ("CP"), la ruta de la lectina ("LP") o la ruta alternativa ("AP"). La ruta de la lectina se inicia típicamente con la unión de lectina de unión a manosa ("MBL") a sustratos con alto contenido de manosa. El AP puede ser independiente de los anticuerpos y puede ser iniciado por ciertas moléculas en las superficies de los patógenos. La CP se inicia típicamente por el reconocimiento de anticuerpos y la unión a un sitio antigénico en una célula diana. Estas vías convergen en la C3 convertasa, el punto donde el componente del complemento C3 es escindido por una proteasa activa para producir C3a y C3b.

El AP C3 convertasa se inicia por la hidrólisis espontánea del C3 componente del complemento, que es abundante en el plasma en la sangre. Este proceso, también conocido como "tickover", se produce mediante la escisión espontánea de un enlace tioéster en C3 para formar C3i o C3 (H²O). El tickover se ve facilitado por la presencia de superficies que apoyan la unión de C3 activado y/o tienen características de carga neutra o positiva (p. ej., superficies de células bacterianas). Esta formación de C3 (H²O) permite la unión del Factor B de proteína plasmática, que a su vez permite que el Factor D escinda el Factor B en Ba y Bb. Los restos de fragmentos Bb unidos a C3 para formar un complejo que contiene C3(H²O)Bb - la C3 convertasa en "fase fluida" o "iniciación". Aunque solo se produce en pequeñas cantidades, la C3 convertasa en fase fluida puede escindir múltiples proteínas C3 en C3a y C3b y da como resultado la generación de C3b y su posterior unión covalente a una superficie (p. ej., una superficie bacteriana). El factor B unido al C3b unido a la superficie es escindido por el factor D para formar así el complejo AP C3 convertasa unido a la superficie que contiene C3b, Bb. Véase, p. ej., Müller-Eberhard (1988) Ann Rev Biochem 57: 321-347.

El AP C5 convertasa -(C3b)^2,Bb - se forma tras la adición de un segundo monómero de C3b a la AP C3 convertasa. Véase, p. ej., Medicus et al. (1976) J Exp Med 144: 1076-1093 y Fearon et al. (1975) J Exp Med 142: 856-863. El papel de la segunda molécula de C3b es unirse a C5 y presentarlo para su escisión por Bb. Véase, p. ej., Isenman et al. (1980) J Immunol 124:326-331. Las AP C3 y C5 convertasas se estabilizan mediante la adición de la proteína trimérica apropiadadina como se describe en, p. ej., Medicus et al. (1976), supra. Sin embargo, la unión de la propidina no es necesaria para formar una ruta alternativa funcional C3 o C5 convertasa. Véase, p. ej., Schreiber et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3948-3952 y Sissons et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:559-562.

La CP C3 convertasa se forma tras la interacción del componente del complemento C1, que es un complejo de C1q, C1r y C1s, con un anticuerpo que se une a un antígeno diana (p. ej., un antígeno microbiano). La unión de la parte C1q de C1 al complejo anticuerpo-antígeno provoca un cambio conformacional en C1 que activa Clr. El C1r activo después escinde los C1 asociados a C1s para generar de ese modo una serina proteasa activa. El activo C1s escinde el componente del complemento C4 en C4b y C4a. Al igual que C3b, el fragmento C4b recién generado contiene un tiol altamente reactivo que forma fácilmente enlaces amida o éster con moléculas adecuadas en una superficie diana (p. ej., una superficie celular microbiana). C1s también escinde el componente del complemento C2 en C2b y C2a. El complejo formado por C4b y C2a es la CP C3 convertasa, que es capaz de procesar C3 en C3a y C3b. La CP C5 convertasa- C4b, C2a, C3b - se forma al añadir un monómero C3b a la CP C3 convertasa. Véase, p. ej., Müller-Eberhard (1988), supra y Cooper et al. (1970) J Exp Med 132: 775-793.

Además de su papel en C3 y C5 convertasas, C3b también funciona como una opsonina a través de su interacción con los receptores del complemento presente en las superficies de células presentadoras de antígeno tales como macrófagos y células dendríticas. La función opsónica de C3b generalmente se considera una de las funciones antiinfecciosas más importantes del sistema del complemento. Los pacientes con lesiones genéticas que bloquean la función de C3b son propensos a la infección por una amplia variedad de organismos patógenos, mientras que los pacientes con lesiones posteriores en la secuencia de la cascada del complemento, es decir, los pacientes con lesiones que bloquean las funciones de C5, son más propensos solo a la infección por Neisseria, y después solo algo más propenso.

Las convertasas AP y CP C5 escinden C5, que es una beta globulina de 190 kDa que se encuentra en el suero humano normal a aproximadamente 75 pg/ml (0,4 pM). El C5 está glicosilado, con aproximadamente un 1,5-3 por ciento de su masa atribuida a carbohidratos. El C5 maduro es un heterodímero de una cadena alfa de 115 kDa de 999 aminoácidos que está unida por disulfuro a una cadena beta de 75 kDa de 655 aminoácidos. C5 se sintetiza como un producto de proteína precursora de cadena única de un gen de copia única (Haviland et al. (1991) J Immunol. 146: 362-368). La secuencia de ADNc de la transcripción de este gen humano predice un precursor de pro-C5 secretado de 1658 aminoácidos junto con una secuencia líder de 18 aminoácidos. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. No. 6,355,245.

El precursor pro-C5 se escinde después de los aminoácidos 655 y 659, para producir la cadena beta como un fragmento amino terminal (residuos de aminoácidos 1 a 655 de la secuencia anterior) y la cadena alfa como un fragmento carboxilo terminal (residuos de aminoácidos 660 a 1658 de la secuencia anterior), con cuatro aminoácidos (residuos de aminoácidos 656-659 de la secuencia anterior) suprimidos entre los dos.

C5a se escinde de la cadena alfa de C5 por convertasa C5 clásica o alternativa como un fragmento amino terminal que comprende los primeros 74 aminoácidos de la cadena alfa (es decir, los residuos de aminoácidos 660-733 de la secuencia anterior). Aproximadamente el 20 por ciento de la masa de 11 kDa de C5a se atribuye a los carbohidratos. El sitio de escisión para la acción de convertasa está en el residuo de aminoácido 733 o inmediatamente adyacente al mismo. Un compuesto que se uniera a, o adyacente a, este sitio de escisión tendría el potencial de bloquear el acceso de las enzimas convertasa C5 al sitio de escisión y, por tanto, actuaría como un inhibidor del complemento. Un compuesto que se une a C5 en un sitio distal al sitio de escisión también podría tener el potencial de bloquear la escisión de C5, por ejemplo, mediante inhibición mediada por impedimento estérico de la interacción entre C5 y la C5 convertasa. Un compuesto, en un mecanismo de acción consistente con el del inhibidor del complemento de saliva de garrapatas, el inhibidor de Ornithodoros moubata C ('OmCI'), también puede prevenir la escisión de C5 al reducir la flexibilidad del dominio C345C de la cadena alfa de C5, lo que reduce el acceso de la C5 convertasa al sitio de escisión de C5. Véase, p. ej., Fredslund et al. (2008) Nat Immunol 9 (7): 753-760.

C5 también se puede activar por medios distintos de la actividad C5 convertasa. Digestión limitada de tripsina (véase, por ejemplo, Minta y Man (1997) J Immunol 119: 1597-1602 y Wetsel y Kolb (1982) J Immunol 128: 2209-2216) y tratamiento con ácido (Yamamoto y Gewurz (1978) J Immunol 120: 2008 y Damerau et al. (1989) Molec Immunol 26: 1133-1142) también pueden escindir C5 y producir C5b activo.

La escisión de C5 libera C5a, una potente anafilatoxina y factor quimiotáctico, y conduce a la formación del complejo del complemento lítico terminal, C5b-9. C5a y C5b-9 también tienen propiedades activadoras de células pleiotrópicas, al amplificar la liberación de factores inflamatorios posteriores, como enzimas hidrolíticas, especies reactivas de oxígeno, metabolitos del ácido araquidónico y diversas citocinas.

La primera etapa en la formación del complejo del complemento terminal implica la combinación de C5b con C6, C7 y C8 para formar el complejo C5b-8 en la superficie de la célula diana. Tras la unión del complejo C5b-8 con varias moléculas C9, se forma el complejo de ataque a la membrana ("MAC", C5b-9, complejo de complemento terminal -"TCC"). Cuando un número suficiente de mAc se inserta en las membranas de las células diana, las aberturas que crean (poros MAC) median la rápida lisis osmótica de las células diana, tales como los glóbulos rojos. Las concentraciones no líticas más bajas de MAC pueden producir otros efectos. En particular, la inserción en la membrana de un pequeño número de complejos C5b-9 en las células endoteliales y las plaquetas puede provocar una activación celular perjudicial. En algunos casos, la activación puede preceder a la lisis celular.

C3a y C5a son anafilatoxinas. Estos componentes activados del complemento pueden desencadenar la desgranulación de los mastocitos, que libera histamina de los basófilos y mastocitos, y otros mediadores de la inflamación, lo que da como resultado la contracción del músculo liso, aumento de la permeabilidad vascular, activación de leucocitos y otros fenómenos inflamatorios, incluida la proliferación celular, que resulta en hipercelularidad. C5a también funciona como un péptido quimiotáctico que sirve para atraer granulocitos proinflamatorios al sitio de activación del complemento.

receptores de C5a se encuentran en las superficies de las células epiteliales bronquiales y alveolares y células de músculo liso bronquiales. También se han encontrado receptores de C5a en eosinófilos, mastocitos, monocitos, neutrófilos y linfocitos activados.

Aunque un sistema de complemento que funcione correctamente proporciona una defensa sólida contra microbios infecciosos, se ha implicado una regulación o activación inapropiada del complemento en la patogénesis de una variedad de trastornos, que incluyen, p. ej., artritis reumatoide; nefritis lúpica; asma; lesión por isquemia-reperfusión; síndrome urémico hemolítico atípico ("SHUa"); enfermedad de depósitos densos; hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN); degeneración macular (p. ej., degeneración macular relacionada con la edad; síndrome de hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y plaquetas bajas (HELLP); púrpura trombocitopénica trombótica (PTT); pérdida fetal espontánea; vasculitis pauci-inmune; epidermólisis ampollosa; pérdida fetal recurrente; esclerosis múltiple (EM), lesión cerebral traumática y lesión resultante de infarto de miocardio, derivación cardiopulmonar y hemodiálisis. Véase, p. ej., Holers et al. (2008) Immunological Reviews 223: 300-316.

Anticuerpo anti-C5

Un anticuerpo anti-C5 para usar en los métodos de esta divulgación para tratar pacientes, para usar como anticuerpo de captura y/o para usar como anticuerpo de detección, es cualquier anticuerpo C5 anti-humano.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es eculizumab, un fragmento de unión a antígeno del mismo, un polipéptido que comprende el fragmento de unión a antígeno de eculizumab, una proteína de fusión que comprende el fragmento de unión a antígeno de eculizumab, o una versión de anticuerpo monocatenario de eculizumab.

En algunas realizaciones, la proteína C5 del complemento es una proteína C5 del complemento humano (la proproteína humana se representa en SEQ ID NO:4).

El anticuerpo anti-C5 es uno que se une a una proteína C5 del complemento y también es capaz de inhibir la generación de C5a. Un anticuerpo anti-C5 también puede ser capaz de inhibir, p. ej., la escisión de C5 en los fragmentos C5a y C5b, y así prevenir la formación del complejo del complemento terminal.

Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 bloquea la generación o actividad del fragmento activo C5a de una proteína C5 (p. ej., una proteína C5 humana). Mediante este efecto de bloqueo, el anticuerpo inhibe, p. ej., los efectos proinflamatorios de C5a. Un anticuerpo anti-C5 puede tener además actividad bloqueando la generación o actividad de C5b. Mediante este efecto de bloqueo, el anticuerpo puede inhibir aún más, p. ej., la generación del complejo de ataque de membrana C5b-9 en la superficie de una célula.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es eculizumab. La SEQ ID NO: 5 representa la cadena pesada completa de eculizumab; la SEQ ID NO: 6 representa la cadena ligera completa de eculizumab; las SEQ ID NOs: 9­ 11 representan, respectivamente, CDR1-3 de la cadena pesada de eculizumab; las SEQ ID NO: 12-14 representan, respectivamente, CDR1-3 de la cadena ligera de eculizumab; la SEQ ID NO: 15 representa la región variable de la cadena pesada de eculizumab; y la SEQ ID NO: 16 representa la región variable de la cadena ligera de Eculizumab.

Eculizumab es un anticuerpo monoclonal anti-C5 humano humanizado (Alexion Pharmaceuticals, Inc.), con una región constante híbrida IgG2/IgG4 humana, para reducir el potencial para provocar respuestas proinflamatorias. Eculizumab tiene el nombre comercial Soliris® y actualmente está aprobado para tratar la hemoglobinuria paroxística nocturna ("HPN") y el síndrome urémico hemolítico atípico ("SHUa"). La hemoglobinuria paroxística nocturna es una forma de anemia hemolítica, siendo la hemólisis intravascular una característica destacada debido a la ausencia de la proteína reguladora del complemento CD59 y CD55. CD59, por ejemplo, funciona para bloquear la formación del complejo del complemento terminal. El AHUS implica la activación crónica incontrolada del complemento, que da como resultado, entre otras cosas, inhibir la microangiopatía trombolítica, la formación de coágulos de sangre en los vasos sanguíneos pequeños de todo el cuerpo y la insuficiencia renal aguda. Eculizumab se une específicamente a la proteína C5 humana y bloquea la formación de la generación de la potente proteína C5a proinflamatoria. Eculizumab bloquea aún más la formación del complejo del complemento terminal. El tratamiento con eculizumab reduce la hemólisis intravascular en pacientes con HPN y disminuye los niveles de complemento en el SHUa. Véase, p. ej., Hillmen et al., N Engl J Med 2004; 350:552-9; Rother et al., Nature Biotechnology 2007; 25(11): 1256-1264; Hillmen et al., N Engl J Med 2006, 355;12, 1233-1243; Zuber et al., Nature Reviews Nephrology 8, 643-657 (2012) | doi:10.1038/nrneph.2012.214; publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. número 2012/0237515, y la patente de EE.UU. número 6,355,245.

En otras realizaciones más, el anticuerpo anti-C5 es una versión monocatenaria de eculizumab, que incluye pexelizumab (SEQ ID NO: 1), una versión monocatenaria específica del anticuerpo completo eculizumab. Véase, p. ej., Whiss (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(6):870-7; Patel et al. (2005) Drugs Today (Barc) 41(3):165-70; Thomas et al. (1996) Mol Immunol 33(17-18):1389-401; y patente de EE.UU. no. 6,355,245. En aún otras realizaciones, el inhibidor para usar en los métodos de esta invención es una variante monocatenaria de pexelizumab, con la arginina (R) en la posición 38 (de acuerdo con la numeración de Kabat y el número de secuencia de aminoácidos establecido en SEQ ID NO: 2) de la cadena ligera de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo pexelizumab cambió a glutamina (Q). El anticuerpo monocatenario que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 es una variante del anticuerpo monocatenario pexelizumab (SEQ ID NO: 1), en la que la arginina (R) en la posición 38 se ha sustituido por una glutamina (Q). En la SEQ ID NO: 3 se muestra una secuencia de aminoácidos del enlazador ilustrativo presente en un anticuerpo de pexelizumab variante.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es una variante derivada de eculizumab, que tiene una o más propiedades mejoradas (p. ej., propiedades farmacocinéticas mejoradas) en relación con eculizumab. El anticuerpo variante de eculizumab (también denominado en este documento como variante de eculizumab, una variante de eculizumab, o similar) o fragmento de unión a C5 del mismo es uno que: (a) se une al componente C5 del complemento; (b) inhibe la generación de C5a; y puede inhibir además la escisión de C5 en fragmentos C5a y C5b. La variante de anticuerpo eculizumab puede tener una vida media en suero en un ser humano que es mayor que, o al menos, 10 (p. ej., mayor que, o al menos, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34) días. Tales anticuerpos eculizumab variantes se describen en el documento PCT/US2015/019225 y patente de EE. UU. Número 9,079,949.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo variante de eculizumab es un anticuerpo definido por las secuencias representadas en SEQ ID NO:7 (cadena pesada) y SEQ ID NO: 8 (cadena ligera), o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Este anticuerpo también se conoce como ALXN1210. Este anticuerpo se une al C5 humano e inhibe la formación de C5a, así como la escisión de C5 en los fragmentos C5a y C5b, y por lo tanto previene la formación del complejo del complemento terminal.

En ciertas realizaciones, la variante de eculizumab es BNJ441 (un anticuerpo que comprende las secuencias representadas en SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:16; véase también las secuencias representadas en las SEQ ID NOs:6-8). En ciertas realizaciones, la variante de eculizumab se define por las secuencias representadas en las SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:8.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es un inhibidor del polipéptido C5 que comprende o consiste de una o más secuencias representadas por las SEQ ID NOs: 1-3, 5-16 y 23-29, y 33, de manera que el polipéptido resultante se una a la proteína del complemento C5 ("C5").

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 para uso en los métodos de esta descripción no es un anticuerpo completo. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 es un anticuerpo monocatenario. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 para usar en los métodos de esta descripción es un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 para usar en los métodos de esta divulgación es un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal quimérico o un anticuerpo monoclonal humano, o un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de ellos.

El anticuerpo anti-C5 para su uso en los métodos de esta descripción puede comprender, o puede consistir en, la secuencia de aminoácidos representada en las SEQ ID NO:1, Se Q ID n O:2, SEQ iD NO:5 y SEQ ID NO:6, o SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, o un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores. El polipéptido puede comprender una o más de las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID NOs: 9-16.

En aún otras realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es LFG316 (Novartis, Basilea, Suiza y MorphoSys, Planegg, Alemania) u otro anticuerpo definido por las secuencias de la Tabla 1 en US 8, 241,628 y US 8,883,158, Mubodina® (Adienne Pharma & Biotech, Bergamo, Italia) (véase, por ejemplo, US7,999,081), rEV576 (coversin) (Volution Immuno-Pharmaceuticals, Ginebra, Suiza) (véase,p. ej., Penabad et al., Lupus, 2014 Oct; 23 (12): 1324-6. Doi: 10.1177/0961203314546022.), ARC1005 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca), SOMAmers (SomaLogic, Boulder, CO), SOB1002 (Swedish Orphan Biovitrum, Estocolmo, Suecia), RA101348 (Ra Pharmaceuticals, Cambridge, MA).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 puede ser un anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-C5 comprende la región variable, o un fragmento de la misma, de un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es una inmunoglobulina que se une específicamente a una proteína del complemento C5. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es una proteína modificada o una proteína recombinante. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 no es un anticuerpo completo, pero comprende partes de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 es un anticuerpo monocatenario. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal quimérico o un anticuerpo monoclonal humano, o un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de ellos. Los métodos para preparar un anticuerpo anti-C5 se conocen en la técnica.

Como se indicó anteriormente, el anticuerpo anti-C5 anticuerpo inhibe la proteína C5 del componente del complemento. En particular, el anticuerpo anti-C5 inhibe la generación de la anafilatoxina C5a, o la generación de los fragmentos activos c5a y C5b de una proteína C5 del componente del complemento (p. ej., una proteína C5 humana). Por consiguiente, el anticuerpo anti-C5 inhibe, p. ej., los efectos proinflamatorios de C5a; y puede inhibir la generación del complejo de ataque de membrana C5b-9 ("MAC") en la superficie de una célula y la subsiguiente lisis celular. Véase, p. ej., Moongkarndi et al. (1982) Immunobiol 162: 397 y Moongkarndi et al. (1983) Immunobiol 165: 323.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-C5 son anticuerpos variantes de un anticuerpo anti-C5 (tal como eculizumab) que aún se unen al antígeno, incluyendo variantes de deleción, variantes de inserción y/o variantes de sustitución. Véanse, p. ej., los polipéptidos representados en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. Los métodos para preparar tales variantes, mediante, por ejemplo, tecnología de ADN recombinante, son bien conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 es una proteína de fusión. La proteína de fusión se puede construir de forma recombinante tal que la proteína de fusión se exprese a partir de un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. La proteína de fusión puede comprender uno o más segmentos polipeptídicos de unión a C5 (p. ej., segmentos de unión a C5 representados en s Eq ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o Se Q iD NO: 5 y/o SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8, o una cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 9-16) y uno o más segmentos que son heterólogos al segmento o segmentos de unión a C5. La secuencia heteróloga puede ser cualquier secuencia adecuada, tal como, por ejemplo, una etiqueta antigénica (p. ej., FLAG, polihistidina, hemaglutinina ("HA"), glutatión-S-transferasa ("GST") o proteína de unión a maltosa ("MBP")). Las secuencias heterólogas también pueden ser proteínas útiles como marcadores de diagnóstico o detectables, por ejemplo, luciferasa, proteína verde fluorescente ("GFP") o cloranfenicol acetil transferasa ("CAT"). En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga puede ser un resto de direccionamiento que dirige el segmento de unión de C5 a una célula, tejido o microambiente de interés. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento es una forma soluble de un receptor del complemento humano (p. ej., el receptor 2 del complemento humano) o un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de cadena sencilla) que se une a C3b o C3d. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento es un anticuerpo que se une a un antígeno específico de tejido, tal como un antígeno específico de riñón. Los métodos para construir tales proteínas de fusión, tales como la tecnología de ADN recombinante, son bien conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-C5 se fusionan con un resto de direccionamiento. Por ejemplo, una construcción puede contener un polipéptido de unión a C5 y un resto de dirección que dirige el polipéptido a un sitio de activación del complemento. Tales restos de direccionamiento pueden incluir, p. ej., una forma soluble del receptor del complemento 1 (CR1), una forma soluble del receptor del complemento 2 (CR2) o un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a C3b y/o C3d.

Los métodos para generar proteínas de fusión (p. ej., proteínas de fusión que contienen un polipéptido de unión a C5 y una forma soluble de CR1 humano o CR2 humano), incluyendo la tecnología de ADN recombinante, se conocen en la técnica y se describen en, p. ej., la patente de EE.UU. no. 6,897,290; la publicación de solicitud de patente de EE.UU. no. 2005265995; y Song et al. (2003) J Clin Invest 11 (12): 1875-1885.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 es un anticuerpo biespecífico. También se conocen en la técnica métodos para producir un anticuerpo biespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-C5 y un anticuerpo que se une a C3b y/o C3d). Se contempla un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo de unión a C5 y cualquier otro anticuerpo.

Una amplia variedad de formatos de anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica de la modificación de anticuerpos y métodos para fabricar los anticuerpos biespecíficos (p. ej., un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-C5 [es decir, un anticuerpo unido a C5] y un anticuerpo que se une a C3b, C3d o un antígeno específico de tejido) están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121: 210; Publicación PCT No. WO 96/27011; Brennan et al. (1985) Science 229: 81; Shalaby et al., J. Exp. Med. (1992) 175: 217-225; Kostelny et al. (1992) J Immunol 148 (5): 1547-1553; Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448; Gruber et al. (1994) J Immunol 152: 5368; yTutt et al. (1991) J Immunol 147: 60.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar mediante el uso de cualquier método de reticulación conveniente. Son bien conocidos en la técnica agentes de reticulación adecuados y se describen en la patente de EE.UU. 4,676,980, junto con una serie de técnicas de reticulación. La Patente No. 5.534.254 describe varios tipos diferentes de anticuerpos biespecíficos que incluyen, p. ej., fragmentos Fv monocatenarios unidos entre sí mediante acopladores de péptidos, agentes quelantes o acoplamientos químicos o de disulfuro. En otro ejemplo, Segal y Bast [(1995) Curr Protocols Immunol Suppl. 14: 2.13.1­ 2.13.16] describe métodos para reticular químicamente dos anticuerpos monoespecíficos para formar así un anticuerpo biespecífico. Se puede formar un anticuerpo biespecífico, p. ej., conjugando dos anticuerpos monocatenarios que se seleccionan entre, p. ej., un anticuerpo de unión a c 5 y un anticuerpo que se une a, p. ej., C3b, C3d, o un antígeno específico de pulmón, antígeno específico de ojo, un antígeno específico de riñón, etc.

El anticuerpo biespecífico puede ser un fragmento (sc) Fv monocatenario en tándem, que contiene juntos dos fragmentos scFv diferentes covalentemente atados por un enlazador (p. ej., un enlazador de polipéptido). Véase, p. ej., Ren-Heidenreich et al. (2004) Cancer 100: 1095-1103 y Korn et al. (2004) J Gene Med 6: 642-651. Los ejemplos de enlazadores pueden incluir, pero no se limitan a, (Gly⁴Ser)²[GGGGSGGGGS, SEQ ID n O: 17], (Gly⁴Ser)^a[GGGGSGGGGSGGGGS, SEQ ID NO: 18], (Gly^aSer^GGGSGGGSGGGSGGGS, SEQ ID NO: 19], (G³S) [GGGS, SEQ ID NO: 20], SerGly⁴[SGGGG, SEQ ID NO: 21] y SerGly⁴SerGly⁴[SGGGGSGGGG, SEQ ID NO: 22].

En algunas realizaciones, el enlazador puede contener, o ser, la totalidad o parte de una región constante de polipéptido de cadena pesada tal como un dominio CH1 como se describe en, p. ej., Grosse-Hovest et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101: 6858-6863. En alguna parte, los dos fragmentos de anticuerpo se pueden unir covalentemente por medio de un enlazador de poliglicina-serina o poliserina-glicina como se describe en, p. ej., las patentes de EE.UU. nos 7,112,324 y 5,525,491, respectivamente. Véase también la patente de EE.UU. no. 5,258,498. Los métodos para generar anticuerpos scFv en tándem biespecíficos se describen en, p. ej., Maletz et al. (2001) Int J Cancer 93: 409­ 416; Hayden et al. (1994) Ther Immunol 1: 3-15; y Honemann et al. (2004) Leukemia 18: 636-644. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" como se describe, p. ej., enZapata et al. (1995) Protein Eng. 8 (10): 1057-1062. En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd (V^h-C^h1-V^h-C^h1) en tándem, que forman un par de regiones de unión al antígeno.

Un anticuerpo biespecífico también puede ser un diacuerpo. La tecnología de diacuerpos descrita por, p. ej., Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448 ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V^h) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V^l) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V^h y V^l de un fragmento se obligan a emparejarse con los dominios V^l y V^h complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión al antígeno. Véase también Zhu et al. (1996) Biotechnology 14: 192-196 y Helfrich et al. (1998) Int J Cancer 76: 232-239. Los diacuerpos monocatenarios biespecíficos ("scDb") así como los métodos para generar scDb se describen en, p. ej., Brüsselbach et al. (1999) Tumor Targeting 4: 115-123; Kipriyanov et al. (1999) J Mol Biol 293: 41-56; y Nettlebeck et al. (2001) Mol Ther 3: 882-891.

Las formas variantes de anticuerpos biespecíficos tales como las moléculas de inmunoglobulina tetravalente de dominio variable dual (DVD-Ig) descritas enWu et al. (2007) Nat Biotechnol 25 (11 ):1290-1297 también se puede usar en los métodos de esta invención. Las moléculas de DVD-Ig están diseñadas de manera que dos dominios variables de cadena ligera (V^l) diferentes de dos anticuerpos parentales diferentes se unen en tándem directamente o mediante un enlazador corto mediante técnicas de ADN recombinante, seguidos del dominio constante de cadena ligera. Los métodos para generar moléculas de DVD-Ig a partir de dos anticuerpos parentales se describen adicionalmente en, p. ej., publicaciones de PCT Nos. WO 08/024188 y WO 07/024715. También se incluye el formato biespecífico descrito en, p. ej., publicación de solicitud de patente de EE.UU. no. 20070004909. Otro formato biespecífico que se puede utilizar es la Región V dual cruzada (CODV-Ig), que es un formato para modificar moléculas similares a anticuerpos de cuatro dominios descritas en WO2012/135345. Se demostró que CODV-Ig es útil en la modificación de moléculas similares a anticuerpos biespecíficos donde el impedimento estérico en los dominios V C-terminales (internos) puede prevenir la construcción de un DVD-Ig.

Los anticuerpos de unión a C5 y/o los restos de direccionamiento que se utilizan para formar las moléculas de anticuerpos biespecíficos pueden ser, p. ej., quiméricos, humanizados, rehumanizados, desinmunizados o completamente humanos, todos los cuales son bien conocido en la técnica.

Se puede producir un anticuerpo anti-C5 mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión a C5 (p. ej., un polipéptido de unión a C5 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2) se puede insertar en un vector de expresión que contiene secuencias reguladoras de la transcripción y traducción, que incluyen, p. ej., secuencias promotoras, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y detención de la transcripción, secuencias de inicio y detención de la traducción, señales de terminación de la transcripción, señales de poliadenilación y secuencias potenciadoras o activadoras. Las secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada de la transcripción. Además, el vector de expresión puede tener uno o dos sistemas de replicación, tal que se puede mantener en dos organismos diferentes, por ejemplo, en células de mamífero o insecto para la expresión y en un hospedador procariota para la clonación y amplificación. Varios posibles sistemas de vectores (tales como sistemas de vectores plásmidos) bien conocidos en la técnica están disponibles para la expresión de un anticuerpo anti-C5 a partir de ácidos nucleicos en varias células, incluyendo las células de mamíferos.

Los vectores de expresión se pueden introducir mediante métodos bien conocidos en la técnica en las células de una manera adecuada para la expresión posterior del ácido nucleico.

Un anticuerpo anti-C5 se puede expresar en cualquier célula huésped apropiada. Las células hospedadoras apropiadas incluyen, por ejemplo, levaduras, bacterias, insectos, plantas y células de mamíferos, incluyendo bacterias tales como E. coli, hongos como Saccharomyces cerevisiaey Pichia pastoris, células de insectos como SF9, líneas celulares de mamíferos (p. ej. líneas celulares), líneas celulares primarias (p. ej., células de mamífero primarias), células de ovario de hámster chino ("CHO") y una línea celular de mieloma adecuada tal como NSO.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 se puede expresar y purificar a partir de animales transgénicos (p. ej., mamíferos transgénicos). Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo anti-C5 en mamíferos no humanos transgénicos (p. ej., roedores, ovejas o cabras) y aislar de la leche como se describe en, p. ej., Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13 (6): 625-629; van Kuik-Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9 (2): 155-159; y Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231 (1-2): 147-157.

El anticuerpo anti-C5 se puede producir a partir de células cultivando una célula huésped transformada con el vector de expresión que contiene el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de las proteínas. Tales condiciones para la expresión de proteínas variarán con la elección del vector de expresión y la célula huésped, y un experto en la técnica podrá determinarlas fácilmente mediante experimentación rutinaria. Véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons y Molecular Cloning - A Laboratory Manual --3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001), que ha divulgación completa de la tecnología del ADN recombinante.

Después de la expresión, el anticuerpo anti-C5 se puede aislar o purificar de diversas formas conocidas por los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 descrito en este documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGH

TEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS

;SEQ ID N O : 24 ) .

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 comprende una región variable de cadena ligera que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSG

TDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID N0;16).

Un anticuerpo anti-C5 puede, en algunas realizaciones, comprender una región constante de Fc humana variante que se une al receptor de Fc neonatal humano (FcRn) con mayor afinidad que la de la región constante de Fc humana nativa de la cual se derivó la región constante de Fc humana variante. Por ejemplo, la región constante de Fc puede comprender una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho o más) sustituciones de aminoácidos con respecto a la región constante de Fc humana nativa a partir de la cual la constante de Fc humana variante se derivó la región. Las sustituciones pueden aumentar la afinidad de unión de un anticuerpo IgG que contiene la región constante de Fc variante a FcRn a pH 6,0, mientras se mantiene la dependencia del pH de la interacción. Véase, p. ej., Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279: 6213-6216 y Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metab Dispos 35: 1-9. Los métodos para probar si una o más sustituciones en la región constante Fc de un anticuerpo aumentan la afinidad de la región constante Fc por FcRn a pH 6,0 (mientras se mantiene la dependencia del pH de la interacción) se conocen en la técnica y se ejemplifican en los ejemplos de trabajo. Véase, p. ej., Datta-Mannan et al. (2007) J Biol Chem 282(3):1709-1717; Publicación Internacional No. WO 98/23289; Publicación Internacional No. WO 97/34631; y Patente de EE.UU. No. 6,277,375.

Las sustituciones que mejoran la afinidad de unión de una región constante Fc de anticuerpo por FcRn son conocidas en la técnica e incluyen, p. ej., (1) la triple sustitución M252Y/S254T/T256E descrita por Dall'Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281: 23514-23524; (2) las sustituciones M428L o T250Q/M428L descritas en Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279: 6213-6216 y Hinton et al. (2006) J Immunol 176: 346-356; y (3) las sustituciones N434A o T307/E380A/N434A descritas en Petkova et al. (2006) Int Immunol 18 (12): 1759-69. Los emparejamientos de sustitución adicionales: P257I/Q3111, P257I/N434H y D376V/N434H se describen, p. ej., en Datta-Mannan et al. (2007) J Biol Chem 282 (3): 1709-1717.

En algunas realizaciones, la región constante variante tiene una sustitución en el residuo de aminoácido 255 de EU por valina. En algunas realizaciones, la región constante variante tiene una sustitución en el residuo de aminoácido 309 de EU por asparagina. En algunas realizaciones, la región constante variante tiene una sustitución en el residuo de aminoácido 312 de EU por isoleucina. En algunas realizaciones, la región constante variante tiene una sustitución en el residuo de aminoácido 386 de la UE.

En algunas realizaciones, la región constante Fc variante comprende no más de 30 (p. ej., no más de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres o dos) sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en relación con la región constante nativa del cual se derivó. En algunas realizaciones, la región constante Fc variante comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: M252Y, S254T, T256E, N434S, M428L, V259I, T250I y V308F. En algunas realizaciones, la región constante de Fc humana variante comprende una metionina en la posición 428 y una asparagina en la posición 434, cada una en numeración EU. En algunas realizaciones, la región constante de Fc variante comprende una doble sustitución 428L/434S como se describe en, p. ej., la Patente de EE.UU. No. 8,088,376. En algunas realizaciones, la región constante variante comprende una sustitución en la posición del aminoácido 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 o 436 (numeración de la UE) en relación con la región constante de Fc humana nativa. En alguna parte, la sustitución se selecciona del grupo que consiste en: metionina por glicina en la posición 237; alanina por prolina en la posición 238; lisina por serina en la posición 239; isoleucina por lisina en la posición 248; alanina, fenilalanina, isoleucina, metionina, glutamina, serina, valina, triptófano o tirosina para treonina en la posición 250; fenilalanina, triptófano o tirosina por metionina en la posición 252; treonina por serina en la posición 254; ácido glutámico para arginina en la posición 255; ácido aspártico, ácido glutámico o glutamina para treonina en la posición 256; alanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, serina, treonina o valina para prolina en la posición 257; histidina para ácido glutámico en la posición 258; alanina por ácido aspártico en la posición 265; fenilalanina por ácido aspártico en la posición 270; alanina o ácido glutámico para asparagina en la posición 286; histidina por treonina en la posición 289; alanina por asparagina en la posición 297; glicina por serina en la posición 298; alanina por valina en la posición 303; alanina por valina en la posición 305; alanina, ácido aspártico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptófano o tirosina para treonina en la posición 307; alanina, fenilalanina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, glutamina o treonina para valina en la posición 308; alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, prolina o arginina para leucina o valina en la posición 309; alanina, histidina o isoleucina para glutamina en la posición 311; alanina o histidina para ácido aspártico en la posición 312; lisina o arginina por leucina en la posición 314; alanina o histidina para asparagina en la posición 315; alanina por lisina en la posición 317; glicina por asparagina en la posición 325; valina por isoleucina en la posición 332; leucina por lisina en la posición 334; histidina por lisina en la posición 360; alanina por ácido aspártico en la posición 376; alanina por ácido glutámico en la posición 380; alanina por ácido glutámico en la posición 382; alanina por asparagina o serina en la posición 384; ácido aspártico o histidina por glicina en la posición 385; prolina por glutamina en la posición 386; ácido glutámico para prolina en la posición 387; alanina o serina por asparagina en la posición 389; alanina por serina en la posición 424; alanina, ácido aspártico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina para metionina en la posición 428; lisina por histidina en la posición 433; alanina, fenilalanina, histidina, serina, triptófano o tirosina para asparagina en la posición 434; e histidina para tirosina o fenilalanina en la posición 436, todos en numeración de la UE.

Un anticuerpo anti-C5 se puede usar como agente terapéutico y se administra a un paciente que lo necesite como cualquier formulación/composición adecuada y por cualquier vía adecuada (tal como por inyección IV). También se puede usar un anticuerpo anti-C5 como anticuerpo de captura o anticuerpo de detección en los métodos descritos en este documento. El documento US 2016/263126 describe, por ejemplo, un ensayo ELISA para detectar el péptido C5.

Modelado del ensayo ELISA de disociación posterior

Cuando se cuantifican los biomarcadores de eficacia/diana, los ensayos de unión de ligandos basados en placas tradicionales tienen el potencial de sobrestimar el analito libre. La sobreestimación del analito libre en tales situaciones sugiere una falta de eficacia menor que la que es verdadera in vivo. Eculizumab es un mAb terapéutico aprobado para 2 indicaciones de enfermedades ultrararas y se dirige al factor C5 del complemento (190 kD). La cuantificación adecuada de C5 libre en presencia de fármaco es crucial.

Según los resultados de Biacore, aproximadamente el 15% de los complejos de eculizumab-C5 se disocian en 60 minutos, con una k^a = —1,1e⁶ (1/M s) y una k^d = 4,6e^-5 (1/s) a 25 °C, en ensayos de unión de ligandos basados en placas tradicionales.

La Tabla 1 muestra la cantidad (en %) de anticuerpo que permanece unido a su antígeno como una función (Kd -porcentaje que se disocia por segundo) del tiempo.

Tabla 1

La evidencia experimental muestra que la unión del antígeno a la placa ELISA requiere al menos 30 horas para que la solución y la placa lleguen al equilibrio.

Los parámetros críticos son el tiempo de incubación, el tiempo de dilución, la temperatura de dilución y la muestra frente al intervalo de ensayo. Un tiempo de incubación de la placa más corto puede reducir la disociación. El enfriamiento durante dos etapas de dilución puede ralentizar la velocidad kdy evitar que el antígeno-mAb y el antígenomAb-antígeno se disocien. Un tiempo de dilución más corto puede disminuir la disociación. Diluir menos puede disminuir la disociación. Medir muestras limpias si es posible.

El desajuste de los datos de concentración de antígeno y concentración de mAb (PK) se debe a: diferentes diluciones y tiempos de ensayo; La concentración de antígeno medida está sobreestimando el antígeno libre; y el mAb (PK) medido está sobreestimando el mAb libre verdadero debido a la disociación de la dilución y subestimando el mAb total debido al antígeno en solución.

El modelo de hemólisis (usando un ensayo hemolítico para muestras de suero humano que contienen C5) sugiere que el desajuste de los datos de antígeno, PK y hemólisis (PD) se debe a: diferentes diluciones y tiempos de ensayo; concentración de antígeno medida sobreestima el antígeno libre en el ensayo de hemólisis; mAb medido - Eculizumab -(PK) sobreestima el mAb libre verdadero debido a la disociación de la dilución y subestima el mAb total debido al antígeno en solución; y la hemólisis medida sobreestima el antígeno libre verdadero debido a la disociación de la dilución.

Ecuación de equilibrio

kon

mAb L = mñb * L

koff

Kd = 1 /ka = [mAb]libre X [L]libre / [mAb * L] libre

K^d = constante de disociación, K^a= constante de asociación

K^off = tasa de disociación, k^on= tasa de asociación

Después de la dosificación, la unión de mAb a L soluble (ligando) in vivo supone que sigue la ley de acción de masas. Las condiciones ex vivo, tal como la recolección, el almacenamiento, etc. de muestras, pueden cambiar el equilibrio a condiciones diferentes de las in vivo.

Los valores de k^off suelen ser muy sensibles a la temperatura y al tampón. El tiempo de equilibrio aumenta aproximadamente 30 veces a 0 °C en comparación con 30 °C. La constante de velocidad de disociación siempre se debe determinar en las condiciones del ensayo.

Medidas de Llibre

Se utiliza cada vez más en el desarrollo de fármacos para orientar las decisiones; útil en la selección de dosis y horarios. Comprender la cinética de L puede ayudar a definir niveles de mAblibres eficaces.

Ensayos para medir el ligando diana C5 libre

Formato de ensayo ELISA modificado

Eliminar las formas unidas antes de realizar ELISA. Medir la cantidad de disociación usando biacore o ELISA y sustrato de lo que se mide. Medir la concentración total de eculizumab mediante LC/MS u otros métodos y determine el C5 total. Calcular el C5 libre usando la ecuación de equilibrio. El cálculo se basa en la ecuación de equilibrio, que requiere una buena estimación de Kd in vivo.

Ensayo C5 libre de MSD modificado

La incubación de la muestra disminuyó de 60 minutos a la incubación propuesta de 15 minutos. La dilución de la muestra disminuyó de 1:1000 a 1:2 (50% de suero). Las muestras se incubaron en hielo en lugar de a TA para reducir posiblemente la disociación.

Eliminar formas enlazadas antes de ELISA:

Tamiz molecular

Extracción en fase sólida

Separación por afinidad, es decir, columna de proteína G, proteína A o FC antihumana

Los procesos adicionales pueden introducir errores debido a la adsorción a la columna o al filtro

La disociación también puede ocurrir y los procesos son intensivos en mano de obra

Ciertos métodos de realización de cuantificación de C5 libre

El sistema Gyros (Gyros AB, Uppsala, Suecia; www.gyros.com) se usa en los métodos descritos en este documento. Dado que un ensayo Gyros pasa muestras a lo largo de las microestructuras en cuestión de segundos, es posible que no haya oportunidad de que se produzca una disociación inversa. El sistema Gyros utiliza un formato de flujo continuo de afinidad y elimina las incubaciones y acorta los tiempos de serie. La plataforma Gyros utiliza la tecnología de CD patentada de Gyros modificada con microfluidos de nanolitros altamente reproducibles integrados con plataformas Gyrolab, que automatizan inmunoensayos con procesamiento paralelo utilizando detección de fluorescencia inducida por láser. Esto es posible mediante un control preciso y automatizado de las fuerzas centrífugas y capilares que dirigen el flujo de líquido a través de estructuras de microfluidos a escala nanolitros contenidas dentro del Cd .

utiliza un disco compacto (CD) circular Bioaffy. Las placas de PCR se pueden utilizar para muestras y reactivos. Se pueden utilizar muchas placas de PCR disponibles. Las placas están selladas con papel de aluminio para evitar la evaporación. El reactivo de captura (tal como un anticuerpo anti-C5 biotinilado) ingresa al CD por acción capilar. Las roturas hidrofóbicas detienen el flujo de líquido. El CD se somete a una fuerza centrífuga dentro de un instrumento dedicado al ensayo, tal como un Gyrolab xPlore o Gyrolab XP. La fuerza centrífuga impulsa los reactivos hacia las columnas dentro del CD. El reactivo de captura se une a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas. Entonces, la muestra ingresa al CD por acción capilar y la muestra se aplica a las columnas activadas. El reactivo de detección (p. ej., anticuerpo anti-C5 marcado con AlexaFluor; uno que se une a un epítopo diferente al del anticuerpo anti-C5 utilizado como reactivo de captura) entra después por acción capilar y se aplica a las columnas. Después, las columnas se escanean con láser (112 columnas en 90 segundos). Rexxip A se puede utilizar para estándares, controles de calidad, muestras y Rexxip F para la detección de Ab. Después, se utiliza la fluorescencia inducida por láser para medir la concentración o cantidad de la muestra (p. ej., C5).

El ensayo Gyros utiliza muy poco volumen de muestra (tal como 4 j L) y lleva muy poco tiempo (tal como 1,5 horas). Tiene un intervalo de calibración de 0,78 pM - 300 pM.

Esta divulgación proporciona un método para cuantificar la proteína del complemento C5 humana libre (sin unir) (C5) de una muestra que comprende:

a. unir el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a partículas recubiertas de estrepavidina; en donde dicho anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado se añade mediante acción capilar a un Gyros Bioaffy 200 CD que comprende columnas con las partículas recubiertas de estrepavidina; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un instrumento Gyrolab xPlore o Gyrolab XP, conduciendo así el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

b. capturar el C5 libre (sin unir) en la muestra; en donde la muestra se añade al CD por acción capilar; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del instrumento Gyrolab xPlore o Gyrolab XP, conduciendo así la muestra hacia el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

c. detectar el C5 libre capturado; en donde se añade una detección de anticuerpo anti-C5 marcado con AlexaFluor a la CD por acción capilar, en donde dicho anticuerpo de detección anti-C5 se une a C5 en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo de captura; en donde dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del instrumento Gyrolab xPlore o Gyrolab XP, dirigiendo así el anticuerpo de detección al C5 libre unido al anticuerpo de captura unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; y

d. cuantificar el C5 libre capturado mediante detección de fluorescencia inducida por láser.

Se puede utilizar cualquier instrumento adecuado para el uso de un ensayo Gyro, como Gyrolab xPlore o Gyrolab XP. En ciertas realizaciones, se usa tampón Rexxip A para muestras y tampón Rexxip F se usa para diluir el anticuerpo de detección. Se puede usarse cualquier tampón adecuado.

En determinadas realizaciones, el instrumento Gyros se ceba dos veces por separado con tampón de lavado Bioaffy 1 y pH 11. Se puede usar cualquier tampón adecuado y se puede omitir el cebado y se puede realizar cualquier número adecuado de veces.

En otro aspecto, se proporciona un método para cuantificar la proteína del complemento C5 humana libre (sin unir) (C5) de una muestra que comprende: a. unir el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a Meso Scale Discovery® (MSD®) recubierto de estrepavidina (Meso Scale Diagnostic, Rockville, MD; https://www.mesoscale.com/en placa de ensayo de 96 pocillos; b. capturar C5 libre (sin unir) en la muestra añadiendo la muestra a la placa; c. detectar del C5 libre capturado añadiendo anticuerpo de detección anti-C5 marcado con sulfo (en ciertas realizaciones, anti-C5 marcado con sulfo con rutenilo) a la placa; y d. cuantificar el C5 libre capturado mediante electroquimioluminiscencia; en donde la muestra se diluye aproximadamente 1:2; en donde la muestra se mantiene en hielo; en donde las tapas b-c son aproximadamente de 15 a 30 minutos, y en donde el anticuerpo anti-C5 se añade a una concentración de aproximadamente 5 pg/ml.

C5 en una muestra, tal como una muestra de suero de un paciente tratado con eculizumab, puede estar libre (no unido) o puede estar unido a eculizumab.

En determinadas realizaciones, el método comprende además calcular la concentración o cantidad de anticuerpo C5 libre en la muestra comparando los datos obtenidos en la etapa d. a una curva estándar preparada a partir de cantidades conocidas de C5 añadidas a una muestra empobrecida en C5. La muestra con los controles se procesa de la misma forma que la muestra del paciente.

En determinadas realizaciones, el método comprende además calcular la concentración de anticuerpo C5 libre con el software Gyros Evaluator u otro software adecuado.

En determinadas realizaciones, la muestra se obtiene de un paciente humano. En ciertas realizaciones adicionales, la muestra es una muestra de suero. En aún otras realizaciones, la muestra es de un paciente que se somete a tratamiento con un anticuerpo anti-C5, como eculizumab o ALXN1210. En ciertas realizaciones, la muestra se toma antes del tratamiento con eculizumab o ALXN1210. En otras realizaciones, la muestra se toma después del tratamiento con eculizumab o ALXN1210. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada que pueda contener C5 y puede ser suero, plasma, sangre, orina, muestra sólida, etc. Las muestras se pueden obtener y preparar para su uso de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura biotinilado es eculizumab o ALXN1210. El anticuerpo de captura biotinilado puede ser cualquier anticuerpo anti-C5.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 de detección es N19-8 (anticuerpo C5 anti-humano de ratón). El anticuerpo anti-C5 de detección puede ser cualquier anticuerpo anti-C5. El anticuerpo anti-C5 de detección en cualquier ensayo dado es uno que reconoce un epítopo diferente en C5 en comparación con el anticuerpo de captura usado en ese ensayo; y por tanto no compite por la unión a C5 con el anticuerpo de captura.

Los métodos para conjugar un anticuerpo con biotina o AlexaFluor son conocidos en la técnica.

En ciertas realizaciones, la muestra es una muestra de suero humano de un paciente; se cuantifica el C5 libre del pretratamiento y postratamiento del paciente con muestras de suero de anticuerpo anti-C5, y tanto el pretratamiento como la muestra postratamiento se diluyen a la misma dilución. En realizaciones adicionales, la dilución utilizada es 1:30.

Utilidad ilustrativa

Los métodos descritos en este documento se pueden usar para cualquier propósito que requiera cuantificar la concentración o cantidad de C5 libre (sin unir) en una muestra. Los métodos, por ejemplo, se pueden usar para detectar la concentración o cantidad de C5 libre (sin unir) en una muestra de suero humano de un paciente que está siendo tratado con terapia con eculizumab. La concentración o cantidad de C5 libre (sin unir) en dicha muestra permitiría controlar el estado de enfermedad del paciente. En este ejemplo, este ensayo tiene la ventaja de cuantificar las moléculas de C5 libre (sin unir) y no las de C5 unidas al eculizumab utilizado como terapia.

La cuantificación adecuada de C5 libre es esencial por una serie de razones, tales como la monitorización del estado de la enfermedad, el modelado, la selección de dosis y las afirmaciones de la etiqueta.

Ejemplos

Para que esta invención se comprenda mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos tienen el único propósito de ilustrar y no se debe interpretar que limiten el alcance de la presente invención de cualquier manera. Ejemplo 1. Plataforma Gyrolab para cuantificar C5 libre

proteína del complemento C5 es un componente importante de la cascada del complemento y un objetivo de los medicamentos Alexion eculizumab y ALXN1210. La cuantificación adecuada de este objetivo es esencial tanto para el modelado como para las reivindicaciones de etiquetas. Muchos formatos de ensayo de unión de ligandos que usan fármaco como reactivo de captura para la diana libre son intrínsecamente defectuosos porque durante la incubación de la muestra, el reactivo de captura puede establecer un equilibrio dinámico con la diana que ya está unida al fármaco en la matriz. Debido a este equilibrio, es posible que el ensayo sobreestime la cantidad de diana libre en la matriz, conduciendo así a un modelado potencialmente inexacto, una selección de dosis, datos de archivo y reivindicaciones de etiqueta.

Una estrategia común para superar esta sobreestimación en los ensayos de unión de ligando es abreviar el tiempo de incubación de la muestra, reduciendo así la oportunidad de que el reactivo de captura extraiga el objetivo unido del fármaco en la matriz. Para lograr esto, a menudo es necesario aumentar la concentración de reactivo de revestimiento hasta 5 veces, lo que en esencia puede minimizar los efectos de la incubación de la muestra más corta. Además, las muestras de pretratamiento tienden a tener niveles mucho más altos de diana libre que las muestras de postratamiento, lo que a menudo requiere diferentes diluciones de muestra para cada situación.

La tecnología Gyrolab se basa en lavados de ensayo, reactivos y muestras que giran a través de microestructuras en un disco a intervalos prescritos. El tiempo necesario para que una muestra se centrifugue a través de una microestructura inmovilizada con reactivo de captura es de aproximadamente seis segundos, por lo que, en teoría, casi no hay tiempo para que ninguna diana unida en la matriz se disocie y se una al fármaco utilizado como anticuerpo de captura. Además, el amplio intervalo dinámico de los ensayos Gyros es más adecuado para tener una dilución de muestra universal en una variedad de muestras de estudio, en lugar de una para las muestras de pretratamiento y otra para el postratamiento.

Materiales y métodos:

Materiales:

Discos Bioaffy 200, tampón Rexxip A, tampón Rexxip F, tampón pH 11, lámina de placa (Gyros US, Inc., Warren NJ) C5 humano purificado, suero empobrecido en C5 (CompTech, Tyler TX)

Eculizumab biotinilado, ALXN1210 biotinilado, anticuerpo N19/8 marcado con AlexaFluor (Alexion Pharmaceuticals, New Haven CT)

Placas de PCR de 96 pocillos, lavado Bioaffy 1 (PBS con Tween 20 al 0,1%, azida sódica al 0,02%) (Todos los ingredientes de lavado de ThermoFisher, Waltham, MA)

Equipo:

Gyros xPlore o instrumento XP Workstation (Gyros US, Inc., Warren NJ)

Método:

El instrumento Gyros se ceba dos veces por separado con el lavado Bioaffy 1 y el tampón pH 11, cada tampón con su propia estación. Durante estas series de cebado (aproximadamente veinte minutos cada uno), los reactivos de ensayo, lavados y muestras se preparan como se describe a continuación. La cantidad de discos Bioaffy 200 necesarios para la serie (uno para Gyros xPlore, hasta cinco para Gyros XP Workstation) se extraen del almacenamiento refrigerado y se dejan que alcancen la temperatura ambiente.

La curva estándar del ensayo se prepara a partir de proteína C5 humana purificada que se enriquece en suero humano empobrecido en C5 a 300 pg/mL y luego se diluye 3 veces como sigue: 300 (pico inicial), 100, 33,3, 11,1, 3,70, 1,23, 0,41,0,14, 0,045, 0,015 y 0,005 pg/ml. La muestra estándar de 0,005 pg/mL es un punto de anclaje. Una vez formulada en suero empobrecido en C5, la curva se diluye 1:5 en tampón Rexxip A, se mezcla y después se diluye una vez más en tampón Rexxip A a 1: 6 con mezcla para una dilución final de 1:30. Los estándares diluidos se colocan en la placa de PCR en sus respectivas posiciones y en sus volúmenes requeridos.

Las muestras de control de calidad (QC) se formulan de la misma manera que las muestras estándar. Se añade C5 humano enriquecido en suero humano empobrecido en C5 a 240, 10,0 y 0,045 pg/ml. Estas muestras se diluyen después dos veces (1:5 y después 1:6 en tampón Rexxip A) como se describe para las muestras de curva estándar para una dilución final de 1:30. Cuando sea necesario, las muestras en los límites de detección (300 pg/mL para el límite superior de detección (ULOQ) y 0.015 pg/mL para el límite inferior de detección (LLOQ)) se formulan de la misma manera. Los QC diluidos se colocan en la placa de PCR en sus respectivas posiciones y en sus volúmenes requeridos. Las muestras de suero humano desconocidas se diluyen dos veces (1:5 y después 1:6 en tampón Rexxip A) para una dilución final de 1:30. Las muestras de suero desconocido diluido se colocan en la placa de PCR en sus respectivas posiciones y en sus volúmenes requeridos.

reactivo de captura biotinilado (eculizumab o ALXN1210) se formula a una concentración de trabajo de 100 pg/mL en el lavado 1 de Bioaffy, y el N19/8 marcado con AlexaFluor se formula para un concentración de 1 pg/mL en Rexxip F. Ambos reactivos se colocan en sus respectivas ubicaciones predeterminadas en la placa de PCR en sus volúmenes requeridos. El lavado 1 de Bioaffy se utiliza como tampón de ensayo y se carga en ubicaciones predeterminadas respectivas en la placa de PCR.

La placa de PCR cargada con estándares, QC, muestras de suero desconocidas, reactivos de ensayo y lavados de ensayo se sella con papel de aluminio y después se carga en el instrumento Gyros. El número necesario de discos Bioaffy 200 también se carga en el instrumento.

Los ensayos se ejecutan en el sistema Gyros utilizando el software Gyros Client. Este es un ensayo de tres etapas (captura, analito, detección) en donde el anticuerpo de captura, la muestra y el anticuerpo de detección se añaden a intervalos programados y entre las etapas de lavado intermitentes. El tiempo de serie del ensayo es de aproximadamente una hora por disco. Los datos son procesados por el software Gyros Evaluator, o se pueden exportar para importarlos a un sistema de información de laboratorio (LIMS) tal como Watson. Este ensayo utiliza un ajuste de curva 5PL con ponderación de respuesta.

Resultados

El ensayo Gyros para la cuantificación de C5 libre en suero humano tiene un intervalo dinámico de 0,039 - 18,75 pg/mL o 0,015 - 300 pg/ml, independientemente del reactivo de captura utilizado (eculizumab o ALXN1210). Este intervalo dinámico y la dilución de la muestra (en ciertas realizaciones, 1:20 a 1:30 para las muestras de pretratamiento inicial y luego 2 veces para todas las muestras después del tratamiento inicial) cubren todas las concentraciones anticipadas de, ya sea el pretratamiento que podría tener niveles tan altos como 240 pg/mL (aunque rara vez superan los 200 pg/mL), o después del tratamiento que podrían tener niveles muy por debajo de 0,5 pg/mL. Véase la tabla 2 para obtener detalles sobre el rendimiento del ensayo en este intervalo con ALXN1210 como reactivo de captura.

Tabla 2 Rendimiento del G ros QC en el intervalo de la medición de C5 libre en suero humano 2 días 4 ciclos series

La selectividad de un ensayo de biomarcadores diana es un parámetro de ensayo importante. La Tabla 3 muestra los datos de diez sueros de donantes enriquecidos con 50 pg/mL de material de referencia C5 purificado, que tiene un efecto aditivo en la medición de los niveles de C5 endógeno que ya se encuentran en cada muestra. El ensayo Gyros midió con precisión el C5 enriquecido purificado en muestras que contenían la contraparte endógena.

T l l ivi r i z m r n r r li r n r h m n r ALXN121

El paralelismo es un elemento importante para determinar en un ensayo de biomarcadores, ya que puede ser una determinación de la bondad de ajuste de una curva estándar de matriz sustituta (aquí, suero humano empobrecido en C5) y su material de referencia purificado (aquí, C5 humano purificado). Pretratando las muestras de matriz con diluciones adicionales antes de la dilución prohibida de 1:30, el paralelismo puede mostrar diferencias en la respuesta del ensayo entre la curva sustituta y las muestras desconocidas medidas a partir de ella. La Figura 1 muestra los resultados del paralelismo para tres sueros de donantes individuos y tres concentraciones de muestras de QC que se preparan de manera similar a las muestras de QC descritas anteriormente. Estos datos sugieren que el ensayo tiene paralelismo y que la curva sustituta es apropiada. FIG. I . Las muestras de suero individuos y las muestras de QC enriquecidas en suero empobrecido en C5 y después diluidas en el mismo suero antes de que la ERM pase la prueba de paralelismo.

Se enriqueció una mezcla de suero humano a varias concentraciones de eculizumab. Esto se repitió con otra alícuota del mismo conjunto con varias concentraciones de ALXN1210. Ambos conjuntos de muestras enriquecidas se analizaron tanto en el ensayo C5 libre basado en placa como en el ensayo C5 libre Gyros. Las muestras enriquecidas con eculizumab se analizaron utilizando eculizumab como reactivo de captura en ambas plataformas de análisis, y las muestras de ALXN1210 se analizaron utilizando ALXN1210 como captura en ambas. Las Tablas 4 y 5 muestran los resultados para el ensayo basado en placa y Gyros, respectivamente. Los resultados del ensayo de giroscopio para cada conjunto de muestras enriquecidas son más bajos, lo que indica que, a diferencia del ensayo basado en placa, hay poco o ningún C5 unido que se extrae del fármaco en suero y se une al reactivo de captura.

Tabla 4 resultados de análisis basados en paletas para C5 libre en suero humano, ALXN1210 y pico de eculizumab

T l R l l n r r li r n r h m n i ALXN121 liz m

Discusión

El ensayo Gyros para la cuantificación de C5 libre en suero humano tiene un amplio intervalo dinámico (0.015 - 300 |jg/mL para eculizumab o reactivo de captura ALXN1210). Este intervalo dinámico en la dilución de la muestra de 1:30 permite la medición de muestras de pretratamiento y postratamiento, eliminando así el requisito de diluciones diferentes para cada escenario respectivo. Esta dilución común también elimina los errores de procesamiento de muestras, por lo que las muestras se pueden analizar con diluciones incorrectas.

La selectividad y el paralelismo del ensayo muestran que la matriz sustituta y el material de referencia son apropiados para la contraparte endógena que se mide en suero humano.

Los datos de series de muestras enriquecidas tanto en el ensayo Gyros como en un ensayo en placa, ambos con fármacos terapéuticos como reactivo de captura, sugieren que el ensayo Gyros reduce enormemente el potencial del fármaco se utiliza como reactivo de captura para alcanzar cualquier equilibrio con C5 que ya está unido al fármaco en una muestra de suero. Esta reducción en el equilibrio y su potencial asociado para cuantificar en exceso C5 que realmente está libre, junto con el intervalo dinámico extendido que permite una dilución de muestra común, permiten al usuario final tener mediciones más precisas.

Ejemplo 2. Ensayo Gyro C5 libre

Parámetros de ensayo

Captura Ab @ 100 pg/mL

Detectar Ab @ 1 pg/mL

C5 humano purificado como material de referencia

Suero empobrecido en C5 para la formulación de estándares y QC

Discos Bioaffy 200 nL

Rexxip A para estándares, controles de calidad, muestras (dilución de muestra 30)

Rexxip F para detección de Ab

Lavado 1: Lavado Bioaffy 1

Lavado 2: tampón pH 11

Ensayo de 3 etapas (C-A-D)

PMT 1%

El formato actual de ensayo ECL basado en placa tiene un intervalo dinámico de 0,0274 a 20,0 pg/mL Esquema de dilución de la muestra: 20 para pretratamiento, 2 para tratamiento

Las concentraciones endógenas típicas de C5 libre varía de 50,0 a 150,0 pg/mL

Intervalo de curva propuesto 0,005-300,0 pg/mL, preferiblemente dilución común para todas las muestras El paralelismo de 7 sueros de donantes individuos se muestra en la FIG. 2 y FIG. 3. Esta es una mejora con respecto a los ensayos ECL anteriores, donde las diluciones más allá de la MRD producían rendimientos decrecientes.

Los primeros resultados de transferencia del ensayo CRO se muestran en la FIG. 4A y FIG. 4B (resumen de datos de dos días; N = 6 para cada nivel de QC (2 series, cada uno de N = 3) (Confirmación de MRD (30)). Los límites de cuantificación cubren el intervalo deseado de ensayo; una dilución cubre todas las eventualidades previstas. La FIG.

4C muestra selectividad en los primeros resultados de transferencia de CRO.

La FIG. 5 muestra que MRD (dilución mínima requerida) de 30 es óptimo. Pasar de 25 a 30 perdió un poco de sensibilidad en el extremo inferior (5 ng/mL frente a 15 ng/mL); 15 ng/mL siguen siendo 2 veces más sensibles que el ensayo ECL (electroquimioluminiscencia).

La FIG. 6 muestra que no hay arrastre en una evaluación de arrastre, lo que confirma la concentración de reactivos y parámetros.

La FIG. 7 muestra una comparación resumida.

Ejemplo 3. Ensayo C5 libre de la técnica anterior utilizando tecnología de electroquimioluminiscencia Meso Scale Discovery®

Los ensayos de C5 libres de la técnica anterior han demostrado tener limitaciones. Un ejemplo se muestra a continuación:

Este ensayo de C5 libre de la técnica anterior está diseñado para cuantificar la proteína del complemento C5 libre en muestras de suero humano usando la tecnología de electroquimioluminiscencia Meso Scale Discovery®. El eculizumab se conjuga con biotina y se inmoviliza en una placa de ensayo de 96 pocillos MSD® recubierta con estreptavidina. Las muestras de la curva estándar de ensayo se preparan mediante dilución en serie de C5 humano purificado en suero empobrecido en C5 y se añaden a la placa junto con las muestras de prueba y control de calidad. El C5 capturado en el eculizumab inmovilizado se detecta usando N19-8 conjugado con un MSD® SulfoTag, que se une a un epítopo diferente en C5 que el unido por eculizumab. El N19-8-Tag emite luz como una señal ECL tras la estimulación electroquímica iniciada en la superficie del electrodo de la placa de ensayo. La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de C5 capturada. La señal ECL del complejo capturado se mide utilizando el MSD® Sector Imager 2400. Se genera una curva estándar de ajuste de curva ponderada de 4 parámetros trazando la señal ECL de las muestras estándar en el eje y contra la concentración de C5 correspondiente en el eje x. La concentración de C5 en cada muestra de suero se puede determinar interpolando las señales ECL de muestras con lecturas en el intervalo lineal de la curva estándar a la curva estándar de concentraciones conocidas de C5. Se calcula y se informa la media de pocillos por triplicado para cada dilución de curva estándar, muestras de QC y muestras de pacientes.

Se ha descubierto que este ensayo tiene ciertas limitaciones para medir el C5 libre en presencia de eculizumab. Se observó un sesgo constante entre la concentración de C5 libre medida en comparación con el cálculo teórico basado en la relación molar de unión de eculizumab a C5 (1:2,53). Este sesgo conduce a una sobreestimación del C5 libre incluso a concentraciones elevadas de eculizumab (35-2000 pg/ml). Por lo tanto, se realizó un experimento para evaluar las limitaciones del ensayo añadiendo 35 pg/mL de eculizumab contra varias concentraciones de C5. Los resultados demostraron claramente un sesgo entre la concentración de C5 libre medida y la concentración de C5 libre teórica. Este sesgo se puede introducir por disociación entre eculizumab y C5 en la muestra de prueba durante los procedimientos de ensayo. Se determinan ciertas condiciones de ensayo para cambiar el equilibrio de unión hacia la disociación según el principio de Le Chatelier.

Modificación y justificación del ensayo

Utilizando la misma plataforma de ensayo, se implementaron cuatro modificaciones principales en el nuevo ensayo C5 como se resume en la siguiente tabla:

T l : m ifi i n l n li r vi

Resultados

Con las cuatro modificaciones, se realizaron experimentos adicionales para comparar el ensayo C5 libre antiguo y nuevo en términos de precisión del ensayo. Se produjeron concentraciones de C5 libre calculadas teóricamente para ilustrar la concentración objetivo que esperábamos ver en un cuerpo humano. Se enriquecieron varias concentraciones de eculizumab al suero humano normal combinado y se midieron tanto en el ensayo C5 libre antiguo como en el nuevo. Los resultados sugieren fuertemente que el nuevo ensayo C5 libre proporcionó resultados mucho más precisos en comparación con los valores teóricos. Además, los resultados, confirmados por varios analistas diferentes, demostraron la exactitud, precisión y solidez del ensayo. Todos los resultados están dentro del intervalo del ensayo (0,0016 a 20 pg/ml) con una precisión de <25% CV.

Tabla 7: Viejo vs. Comparación de los resultados del nuevo ensayo C5

Concentración de C5 libre medida

% Parcialidad Eculizumab en NHS

enriquecido Concentración teórica

Ensayo de C5

ibre de C5 libre * (pg/mL)

(pg/mL) Ensayo C5 l . Nuevo viejo(pg/mL) libre nuevo Viejo vs (pg/mL) Teórico Teórico 2000 0,56 0,002 0,001 55900 100 1000 1,16 0,003 0,001 115900 200 500 2,37 0,005 0,003 78900 67 250 4,77 0,009 0,005 95300 80 125 8,62 0,013 0,011 78264 18 62,5 16,4 0,028 0,027 60641 4

31,3 35,1 0,19 0,19 18374 0 Concentración de C5 libre medida % Parcialidad Eculizumab en NHS

enriquecido Concentración teórica

de C5

(Mg/mL) Ensayo C5 libre Ensayo de C5 libre * (Mg/mL) Viejo vs. Nuevo viejo(pg/mL) libre nuevo

(Mg/mL) Teórico Teórico 15,6 74,9 30,4 30,4 146 0

9,4 96,4 42,6 46,2 109 -8

5 101,4 58,2 57,3 77 2

1 119,3 68,5 67,5 77 1

0 113,2 77,5 70 62 11 Concentración teórica calculada en base a la estequiometría de unión utilizando una concentración media de C5 humana de 70 pg/mL en tampón fisiológico.

Conclusión

Las modificaciones del antiguo ensayo de C5 libre han dado como resultado mejoras en la precisión del ensayo al minimizar los efectos de la disociación de eculizumab-C5. El % de sesgo aumenta al aumentar la concentración de eculizumab, en comparación con el% teórico de C5 libre, a concentraciones > 250 pg/mL. Por lo tanto, los resultados de C5 libre en suero a concentraciones de eculizumab > 250 pg/ml, con el nuevo ensayo, se deben interpretar con precaución. Sin embargo, no se espera que estos niveles muy bajos de concentraciones de C5 libre inicien la hemólisis en las muestras clínicas.

Debido al rendimiento mejorado del nuevo ensayo de C5 libre de suero en comparación con el ensayo anterior, el cambio de placa recubierta de eculizumab a placa recubierta de ALXN1210 se adapta para garantizar que el ensayo refleje mejor la medición de C5 libre en Muestras de suero ALXN1210.

Ejemplo 4. Ensayo para la cuantificación de C5a en plasma humano utilizando la plataforma GyroLab Este estudio validó un ensayo Gyros para medir C5a libre en plasma humano. Este ensayo empleó la plataforma GyroLab y utilizó un anticuerpo biotinilado (ALXN1007) para capturar C5a libre y un anticuerpo anti C5a marcado con Alexa 647 para detectar C5a en plasma humano. El estudio demostró que el método es adecuado para el propósito previsto de cuantificar C5a en plasma humano.

Abreviaturas

BPM: Gerente de Proyectos Bioanalíticos

CV: Coeficiente de variación

C5a: factor de complemento 5a

VS bajo: Muestra de validación baja

VS medio: Muestra de validación media

VS alto: Muestra de validación alta

LLOQ: Límite inferior de cuantificación

ULOQ: Límite superior de cuantificación

BLQ: Por debajo del límite de cuantificación

ALQ: Por encima del límite de cuantificación

MRD: Dilución mínima requerida

PBST: Solución salina tamponada de fosfato, Tween al 0,01%

La proteína del complemento humano purificada C5a DesArg a 0,51 mg/mL se utiliza como patrón de referencia. Una curva estándar de cuantificación recién preparada que consta de 11 estándares distintos de cero se enriqueció con C5a, se diluyó en tampón Rexxip AN y se incluyó en todos los CD probados. También se probó un blanco y se incluyó en todos los CD. Las concentraciones de C5a fueron 60, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,88, 0,938, 0,469, 0,234, 0,117, and 0,059 ng/mL. Los puntos de datos de 0,059 ng/mL y 0,117 ng/mL se evaluaron como puntos de anclaje. Todos los estándares de calibración se diluyeron 2 veces en diluyente de ensayo antes de la prueba y se probaron por duplicado en cada CD probado. El Gyrolab XP realizó los duplicados añadiendo dos veces la muestra del mismo pozo. Los datos se ajustaron a un modelo de regresión de curva logística de cinco parámetros dentro del software de análisis de datos Gyros.

Las muestras de control de validación que representan un límite superior (ULOQ), alto (VS alto), medio (VS medio), bajo (VS bajo) y 2 concentraciones de límites inferiores (LLOQ-1 y LLOQ-2) del biomarcador C5a se prepararon enriqueciendo C5a con Rexxip AN a niveles para evaluar el intervalo de cuantificación. Para todos los ensayos se utilizó un blanco, que consistía en Rexxip AN. Durante la validación, se incluyó un juego de cada ULOQ, VS alto, VS medio, VS bajo, l Lo Q-1 y LLOQ-2, y un espacio en blanco en cada CD durante la validación. Todos los controles se prepararon frescos y se diluyeron 2 veces en diluyente de ensayo. Se enriqueció C5a a las siguientes concentraciones.

• ULOQ = 40 ng/ml

• VS alto = 20 ng/mL

• VS medio = 2,5 ng/mL

• VS bajo = 0,625 ng/mL

• LLOQ-1 = 0,200 ng/mL

• LLOQ-2 = 0,156 ng/mL

Para eliminar C5, las muestras endógenas (Individuos 2 y 11) se sometieron a tratamiento con Dynabead, se incluyeron en todos los CD y se probaron por duplicado para acceder a la utilidad de usar las muestras con fines de tendencia.

Procedimiento general de ensayo

La curva de cuantificación de C5a y las muestras de control de validación se prepararon y diluyeron en una placa de PCR que contenía tampón de AN de Rexxip y después se diluyeron a un MRD de 2 en el diluyente de ensayo (NaCl 1 M Tween al 0,5%).

Las muestras utilizadas para la evaluación de validación se pueden someter a incubación con anticuerpo anti-C5 acoplado a perlas magnéticas durante un mínimo de 1 hora con agitación rápida para eliminar el C5. Para esas muestras, se añadieron 10 uL de muestra a 20 uL de perlas acopladas anti C5 y se incubaron con agitación vigorosa durante 1 hora. Después de la incubación con agitación, la placa se sometió a un imán de placa durante un mínimo de 2 minutos para separar las perlas de la solución. Se extrajeron cuidadosamente 10 uL de muestra sin alterar el sedimento de perlas y se añadieron a una placa de PCR de acuerdo con la lista de carga de Gyros. El MRD final para las muestras es 3 y el factor de dilución en la lista de carga de Gyros es 1,5.

Se preparó ALXN1007 biotinilado (anticuerpo de captura) a 100 ug/ml en PBST y se añadió a la placa de PCR de acuerdo con la lista de carga de Gyro Lab. Se preparó anti-C5a (anticuerpo de detección) marcado con Alexa 647 a 4 ug/ml en tampón Rexxip F y se añadió a la placa de PCR de acuerdo con la lista de carga de Gyro Lab.

La proteína del complemento humano purificada anti-C5a/C5a des-Arg marcada con Alexa 647 es una IgG²a mAb de ratón, marcada con 4,2 moles de colorante Alexa Fluor® 647 por mol de anticuerpo.

Validación del método

validación del método del ensayo incluyó precisión y exactitud intra e interensayo, respuesta y intervalo de la curva de calibración, linealidad de dilución, selectividad, paralelismo, estabilidad a corto plazo, estabilidad a largo plazo, estabilidad del proceso de congelación y descongelación. Durante la validación, las series se aceptaron según los criterios de aceptación establecidos para la curva de calibración. En la Tabla 8 se muestra un resumen de todas las series realizadas durante la validación.

Tabla 8. Resumen de serie

Intervalo de la curva de calibración

Para evaluar la precisión y exactitud de la curva estándar, cada serie para la validación contenía una curva estándar que constaba de nueve estándares distintos de cero y dos puntos de anclaje, definidos en la sección 15. La inclusión o exclusión de puntos de anclaje se basó en el ajuste de la curva dentro del intervalo cuantificable de la curva. Se incluyó un blanco cero (sin analito) en cada ensayo, pero no se incluyó en el ajuste de la curva. Todos los puntos fueron probados por duplicado en siete series separados por dos analistas y la curva estándar se calculó usando un ajuste de curva logística de 5 parámetros dentro del software Gyro Lab Evaluator.

La precisión, representada por el coeficiente de variación (CV) expresado como porcentaje, se calculó mediante la siguiente expresión:

Desviación estándar de la media de mediciones individuales

CV (%) x 100

Media de mediciones individuales

% de error relativo (% RE), se calculó utilizando la siguiente expresión, donde la concentración nominal es igual a la concentración del estándar de referencia enriquecido en la matriz:

Concentración medida — Concentración nominal

% RE = x 100

Concentración nominal

El error total del ensayo se evaluó mediante la siguiente ecuación:

%TE = %RE absoluto % CV

Criterios de aceptación del objetivo: Un mínimo del 75% de los estándares distintos de cero debe tener una concentración media calculada (BCC) igual o dentro de ±20% del nominal valor, excepto en los estándares más bajo y más alto donde el BCC medio puede ser igual o dentro de ±25%. El CV para cada estándar debe ser igual o menor al 20%, excepto en los estándares más bajo y más alto donde el CV puede ser <25%.

Los nueve estándares de calibración distintos de cero cumplieron con los criterios de aceptación en todos los niveles probados, con recuperaciones que varian entre el 99,2% y el 109,2% y una precisión que varía entre el 1,5% y el 13,1% CV. El error relativo estuvo entre 0,4 - 9,2% RE con un error total que varió entre 2,1 - 22,3% TE. Las dos concentraciones de calibrador más bajas de 0,117 ng/mL y 0,059 ng/mL se utilizan como puntos de anclaje durante el análisis de la muestra y se incluirán o excluirán del análisis según el ajuste de la curva. El intervalo de la curva de calibración para el ensayo fue de 0,234 a 60 ng/mL. Los datos se muestran en la Tabla 9.

Intervalo cuantificable (intervalo de ensayo), exactitud y precisión

Para evaluar el intervalo cuantificable y la exactitud y precisión del ensayo, cada serie contenía controles.

Para la precisión intraensayo, cada control se probó una vez en réplicas de seis por un analista durante 1 serie. La serie de precisión intraensayo cumplió con los criterios de aceptación para todos los controles probados. Las recuperaciones variaron de 96,3 a 111,7% con una precisión que varió de 2,3 a 20,2% CV. El error relativo osciló entre 0,0 y 10,5% y el error total osciló entre 6,6 y 25,3%. Los datos se muestran en la Tabla 10.

Criterios de aceptación del objetivo: Para mayor precisión, la concentración media calculada para cada control debe ser igual o dentro de ±25% del valor nominal, excepto en el LLOQ y ULOQ, donde la concentración media calculada puede ser igual o dentro de ±30% del valor nominal. Para precisión, el CV para cada control debe ser <25%, excepto en el LLOQ y ULOQ, donde el CV es <30%. El LLOQ del ensayo es el control más bajo con precisión y exactitud aceptables, y el ULOQ del ensayo es el control más alto con precisión y exactitud aceptables. El error total debe ser <40%.

Para la precisión interensayo, cada control se probó en siete series por duplicado por dos analistas. Las dos primeras réplicas de la evaluación intraensayo (Serie 7) se incluyeron como una evaluación interensayo. Se cumplieron los criterios de precisión intraensayo para todos los controles probados. Las recuperaciones variaron del 96,4 al 116,6% con una precisión que varió del 2,0 al 20,5% CV. El error relativo varó entre 1,4 y 16,6% y el error total varió entre 3,4 y 34,0%. Los datos se muestran en la Tabla 11.

Criterios de aceptación del objetivo: Para mayor precisión, la concentración media calculada para cada control debe ser igual o dentro de ±25% del valor nominal, excepto en el LLOQ y ULOQ, donde la concentración media calculada puede ser igual o dentro de ±30% del valor nominal. Para precisión, el CV para cada control debe ser <25%, excepto en el LLOQ y ULOQ, donde el CV es <30%. El LLOQ del ensayo es el control más bajo con precisión y exactitud aceptables, y el ULOQ del ensayo es el control más alto con precisión y exactitud aceptables. El error total debe ser <40%.

linealidad de dilución y la dilución mínima requerida (MRD) se evaluaron en cuatro lotes individuos de matriz. Las matrices se enriquecieron con estándar de referencia por encima del ULOQ a 100 ng/ml y se diluyeron 4 veces 3 veces en diluyente de ensayo y después se trataron con perlas magnéticas acopladas con anti C5 para eliminar cualquier C5 contaminante. Las muestras de linealidad por dilución se evaluaron una vez en dos series y un analista las analizó por duplicado. El individuo 13 de la serie 5 se reevaluó en la serie 9 debido al alto CV asociado con la dilución de 64 veces. El ensayo demuestra la linealidad de la dilución con los cuatro lotes de matriz enriquecida y todas las diluciones de todos los lotes cumplen los criterios de aceptación. La dilución máxima es 64 veces. La recuperación de cada dilución cuando se corrigió por dilución varió de 94,0 a 117% con CV que variaron de 0,8 a 11,1 %. La dilución mínima requerida para las muestras de plasma según lo requerido por el tratamiento con perlas es tres. Las muestras que son ALQ con el tratamiento estándar de microesferas MRD se pueden diluir hasta 64 veces para obtener resultados que estén dentro del intervalo cuantificable del ensayo. Los datos se muestran en la T abla 11.

Criterios de aceptación del objetivo: Para la linealidad de dilución, las concentraciones medias de diluciones que se encuentran dentro del intervalo cuantificable, cuando se corrigen por dilución, deben ser iguales o dentro del 25% del valor nominal y tienen CV <25%. La mayor dilución en cualquiera de las muestras que cumple con los criterios de aceptación es la dilución máxima permitida de la muestra.

La prozona (efecto Hock) se evaluó en una matriz enriquecida con 500 ng/ml. La prozona fue evaluada una vez por duplicado por un analista. La muestra se trató con perlas magnéticas acopladas anti C5. La respuesta calculada fue mayor que el intervalo cuantificable del ensayo y demostró que no se observó prozona (efecto hook). Los datos se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12. Prozone efecto hook

El efecto prozona se demuestra si la respuesta observada está dentro o por debajo del intervalo cuantificable del ensayo para una muestra cuya concentración nominal está por encima del ULOQ.

La selectividad del ensayo se evaluó añadiendo diez lotes individuales de matriz con C5a a 5, 1 y 0,3 ng/ml y posteriormente tratando con perlas magnéticas acopladas con anticuerpo anti C5. También se evaluó una muestra no enriquecida de cada individuo. Se seleccionaron los lotes que demostraron contener niveles bajos de C5a durante la precualificación. Las muestras de selectividad se evaluaron una vez por duplicado en 2 series por un analista. El ensayo cumplió los criterios de aceptación del objetivo para la selectividad. Ocho de cada diez individuos enriquecidos cuando se corrigió por C5a endógeno se recuperaron dentro del 25% del valor nominal. Los datos se muestran en la Tabla 13.

Criterios de aceptación del objetivo: Un mínimo del 80% de las matrices enriquecidas debe ser igual o dentro de ± 25% del valor nominal.

Tabla 13. Selectividad

0 0,578 1,3 0,000 N/A

IND-18 BRH1240232 5 6,00 2,0 5,47 109,4

(hembra)

1 1,67 0,0 1,136 113,6

0,3 0,791 0,5 0,256 85,5

0 0,535 3,9 0,000 N/A

IND-19 BRH1240233 5 6,37 5,1 6,05 121,1

(hembra)

1 1,44 2,6 1,119 111,9

0,3 0,658 2,3 0,339 113,0

0 0,319 4,6 0,000 N/A

IND-3 BRH1240217 5 6,46 3,4 5,82 116,4

(hembra)

1 1,76 0,8 1,110 111,0

0,3 0,875 8,5 0,230 76,5

0 0,646 5,7 0,000 N/A

IND-8 BRH1240222 5 5,61 0,2 5,10 102,0

(hembra)

1 1,55 7,1 1,042 104,2

0,3 0,808 3,2 0,295 98,4

0

0,513

4,4 0,000

N/A

N/A = no se pudo calcular un valor

Paralelismo

Se seleccionaron seis individuos (3 machos y 3 hembras) que mostraron tener niveles endógenos detectables de C5a durante la precualificación para evaluar el paralelismo. Las muestras se sometieron a 3 diluciones seriadas dobles en diluyente de ensayo y después se sometieron a tratamiento de perlas con perlas magnéticas acopladas anti C5. Las muestras de paralelismo fueron evaluadas en 2 series por 2 analistas. Cuatro de los seis individuos que se probaron en la Serie 4 se repitieron en la Serie 9 debido a los altos CV de la muestra. El ensayo demostró una falta de paralelismo y subraya la naturaleza cuantitativa relativa del ensayo, pero no excluye su uso. Los CV de las muestras variaron entre el 0,1% y el 27,1%. Los datos se muestran en la Tabla 14.

Estabilidad

Se investigó la estabilidad de las muestras sujetas a almacenamiento a corto plazo a aproximadamente 4 °C y a temperatura ambiente, almacenamiento a largo plazo a la temperatura de almacenamiento prevista y varias series de congelación y descongelación. La matriz enriquecida con una concentración alta (5 ng/mL) y baja (1 ng/mL) de C5a se utilizó para la evaluación de la estabilidad. Se prepararon múltiples alícuotas de las muestras de estabilidad para su almacenamiento a la temperatura de almacenamiento deseada (-80 °C), temperatura ambiente, aproximadamente 4 °C, y para experimentos de congelación/descongelación. Se analizó inmediatamente una alícuota de cada nivel como muestra de control fresca (condición de referencia). Las muestras restantes se analizaron después del período y condición de almacenamiento especificados. Todas las evaluaciones de estabilidad incluyeron una curva estándar recién preparada y muestras de validación para evaluar la aceptabilidad del ensayo. Todas las muestras de estabilidad se trataron con perlas magnéticas acopladas con anticuerpo anti C5. También se evaluó la estabilidad del proceso.

Estabilidad a corto plazo

Se descongelaron alícuotas de las muestras de alta y baja estabilidad y se almacenaron a temperatura ambiente durante 2 horas y 20 minutos, y aproximadamente a 4 °C durante un máximo de 23 horas y 29 minutos. Todas las muestras de estabilidad a corto plazo se procesaron en repeticiones de seis. Las muestras de estabilidad cumplieron con los criterios de aceptación de estabilidad a corto plazo. Las muestras para cada condición estuvieron dentro del 30% del estándar de referencia y los CV variaron de 4.6 a 11.6%. Los datos se muestran en la Tabla 15.

Criterios de aceptación del objetivo: La concentración media calculada para cada muestra de estabilidad a corto plazo debe ser igual o dentro de ±30% del valor de la muestra de control fresca y tener un CV <30%.

La estabilidad a largo plazo se evaluará a los 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 meses. Se prepararon alícuotas de las muestras de estabilidad de concentración alta y baja y se almacenaron a la temperatura adecuada (-80 °C). Todas las muestras de estabilidad a largo plazo se analizarán, como mínimo, en repeticiones de seis. El informe de validación se modificará para incluir los datos de estabilidad a largo plazo.

Criterios de aceptación del objetivo: La concentración media calculada para cada muestra de estabilidad a largo plazo debe ser igual o dentro de ±30% del valor de la muestra de control fresca y tener un CV <30%.

Estabilidad de congelación y descongelación

Se sometieron alícuotas de las muestras de estabilidad de concentración alta y baja a 6 series de congelación y descongelación a aproximadamente - 80 °C. Las muestras de estabilidad se descongelaron a temperatura ambiente durante al menos una hora y después se volvieron a congelar durante un mínimo de 12 horas antes de someterlas a un nuevo serie. La evaluación de la estabilidad de congelación y descongelación se realizó en muestras que completaron tres y seis series de congelación/descongelación. Todas las muestras de estabilidad de congelación y descongelación se analizaron en repeticiones de seis. Las muestras de estabilidad cumplieron los criterios de aceptación para la estabilidad de congelación y descongelación. Las muestras para cada condición estuvieron dentro del 30% del estándar de referencia y los CV variaron de 1,4 a 8,1%. Los datos se muestran en la Tabla 16.

Tabla 16. Estabilidad de con elación descon elación

Estabilidad del proceso (robustez)

La estabilidad del proceso se evaluó mediante la preparación de una curva estándar, controles de calidad y reactivos de captura y detección que después se dividieron en dos placas de PCR listas para el ensayo. También se incluyeron las muestras endógenas para cada momento. Las placas se sellaron y colocaron en la plataforma del Gyros Instrument. Cada placa se evaluó en el tiempo 0 horas y 2 horas usando un disco por placa. Las curvas estándar cumplieron con los criterios de aceptación para ambos puntos de tiempo probados. La gran media de recuperación porcentual para nueve estándares cero varió entre el 96,8 y el 104,4% con CV que varió entre el 0,4 y el 8,3%. La gran recuperación media de los QC varió entre el 98,3% y el 118,3% con CV que varió entre el 1,5 y el 18%. Los datos para las curvas estándar y los controles de calidad probados para cada punto de tiempo se muestran en la Tabla 17. Los datos de las muestras endógenas se muestran en la Tabla 18. El ensayo demuestra la estabilidad del proceso hasta por 2 horas.

Tabla 18. Estabilidad del roceso ara muestras endó enas

placas de ensayo se leyeron en una estación de trabajo Gyrolab XP y se analizaron utilizando el software evaluador GyroLab y se importaron a Microsoft Excel 2007 o una versión posterior. Se determinaron estadísticas descriptivas, como medias aritméticas, desviaciones estándar, precisión (% CV) utilizando Microsoft Excel 2007 o una versión posterior.

Había una enmienda al plan que permitía enmascarar un máximo de dos de los nueve puntos estándar distintos de cero si el CV era superior al 25%.

Se observaron dos desviaciones durante el estudio.

Desviación #226

El reloj y el termómetro no se documentaron en las hojas de trabajo bioanalíticas complementarias para las pruebas 1 a 8. La desviación no tuvo ningún impacto en los datos del estudio, ya que todas las pruebas se realizaron como se esperaba y el tiempo y la temperatura fueron registrados por utilizando el reloj calibrado y el termómetro en el laboratorio.

Desviación #237

0192

• Requisito: Se prepara biotina ALXN1007 (anticuerpo de captura) a 100 ug/mL en PBST y se añade a la placa de PCR de acuerdo con la lista de carga de Gyro Lab.

• Desviación: Se preparó biotina ALXN1007 (anticuerpo de captura) a 89 ug/mL en PBST y se añadió a la placa de PCR de acuerdo con la lista de carga de Gyro Lab.

La desviación se produjo en la Serie 1. La desviación fue que la Biotina ALXN se preparó a 89 ug/mL y no a 100 ug/mL como se especifica en la sección del procedimiento de ensayo general. El analista descubrió un error tipográfico en la hoja de trabajo complementaria durante el análisis de la serie 1, donde se anotó una concentración de stock anterior de ALXN1007 en la hoja de trabajo y se utilizó para el cálculo. El analista hizo la corrección a la hoja de trabajo y documentó la corrección. Tras la revisión por pares de la serie, se descubrió y documentó que la corrección se calculó incorrectamente.

La desviación no tuvo ningún impacto en el estudio, ya que la serie se anotó como fallida y los datos no se utilizaron para el análisis en el estudio. La serie no cumplió con los criterios del objetivo debido a los altos CV asociados con la curva estándar.

Tabla 19 Procedimiento de ensa o

T l 2 Pr imi n n r r i n rl

Tabla 21 REACTIVOS CRÍTICOS

Tabla 22 REACTIVOS ADICIONALES

Otras realizaciones

La descripción anterior describe sólo realizaciones ilustrativas de la invención.

Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están comprendidos dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por tanto, aunque sólo se han ilustrado y descrito determinadas características de la invención, a los expertos en la técnica se les ocurrirán muchas modificaciones y cambios. Por lo tanto, se debe entender que las reivindicaciones adjuntas están destinadas a cubrir todas estas modificaciones y cambios de la invención.

Tabla 23: Algunas secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos

g g t t c t g g t g g c g g t g ga t c t g g t g g t g g c g g t t c t c a a g t c c a a c t g 384 G ly S e r G ly G ly G ly G ly S e r G ly G ly G ly G ly S e r G ln V a l G ln Leu

115 120 125

g t g c a a t c c g g c g c c gag g t c a a g a a g c e a ggg g c c t e a g t c a a a g t g 432 V al Gln S e r G ly A la Glu V al Lys Lys P ro G ly A la S e r V a l Lys V a l

130 135 140

t c c t g t a a a g c t a g e g gc t a t a t t t t t t c t a a t t a t t g g a t t c a a t g g 480 S e r Cys Lys A la S e r Gly T yr l i e Phe S e r Asn T y r T rp l i e G ln T rp

145 150 155 160

g t g c g t c a g g c c c c c ggg cag g g c c t g g a a t g g a t g g g t g a g a t e t t a 52B

V al A rg G ln A la P ro G ly Gln G ly Leu Glu T rp Met G ly G lu l i e Leu

165 170 175 ccg g gc t c t g g t a g e a c c gaa t a t a c c g a a a a t t t t a a a g a c c g t g t t

Pro G ly S e r G ly S e r T hr Glu T y r T h r Glu Asn Phe Lys Asp A rg V a l

180 185 190

a c t a t g a c g c g t g a c a c t t e g a c t a g t a c a g t a t a c a t g g ag e t c t c c

T hr Met T h r A rg Asp T hr S e r T h r S e r T hr V a l T y r Met G lu Leu S e r

195 200 205

a g e c t g c g a t e g g ag g a c acg g c c g t c t a t t a t t g c g cg c g t t a t t t t 672 S e r Leu A rg S e r Glu Asp T hr A la V a l T yr T y r Cys A la A rg T y r Phe

210 215 220

t t t g g t t c t a g e ccg a a t t g g t a t t t t g a t g t t t g g g g t c a a g ga a c c 720 Phe G ly S e r S e r P ro Asn Trp T y r Phe Asp V a l T rp G ly G ln G ly T hr

225 230 235 240

741

245

S E Q I D N O : 2

Asp l i e G ln Met T h r G ln S e r P ro S e r S e r Leu S e r A la S e r V a l G ly

G ly Pro A rg Cys l i e Lys A la Phe T hr Glu Cys Cys V a l V al A la S e r 725 730 735

Gln Leu A rg A la Asn l i e S e r H is Lys Asp Met Gln Leu G ly A rg Leu 740 745 750

H is Met Lys T h r Leu Leu Pro V al S e r Lys P ro Glu l i e A rg S e r T yr 755 760 765

Phe Pro Glu S e r T rp Leu Trp Glu V a l H is Leu V a l P ro A rg A rg Lys 770 775 780

Gln Leu Gln Phe A la Leu Pro Asp S e r Leu T hr T hr T rp G lu l i e Gln 785 790 795 800 G ly l i e G ly l i e S e r Asn Thr Gly l i e Cys V al A la Asp T hr V al Lys 805 810 815

A la Lys V a l Phe Lys Asp V al Phe Leu Glu Met Asn l i e P ro T yr S e r 820 825 830

V al V a l A rg G ly Glu Gln l i e Gln Leu Lys G ly T hr V a l T yr Asn T yr 835 840 845

A rg T h r S e r G ly Met Gln Phe Cys V a l Lys Met S e r A la V al Glu Gly 850 855 860

l i e Cys T h r S e r Glu S e r Pro V al l i e Asp H is G ln G ly T hr Lys S e r 865 870 875 880 S e r Lys Cys V a l A rg Gln Lys V al Glu G ly S e r S e r S e r H is Leu V al 885 890 895

T hr Phe T h r V a l Leu P ro Leu Glu l i e G ly Leu H ís Asn l i e Asn Phe 900 905 910

S e r Leu Glu T h r T rp Phe Gly Lys Glu l i e Leu V al Lys T hr Leu A rg 915 920 925

V al V al Pro Glu Gly V al Lys A rg Glu S e r T yr S e r G ly V al T hr Leu 930 935 940

Asp Pro A rg G ly l i e T y r Gly T hr l i e S e r A rg A rg Lys G lu Phe P ro 945 950 955 960 T yr A rg l i e Pro Leu Asp Leu V al P ro Lys T hr Glu l i e Lys A rg l i e 965 970 975 Leu S e r V a l Lys G ly Leu Leu V a l G ly G lu l i e Leu S e r A la V a l Leu 980 985 990

S e r G ln G lu G ly l i e A sn l i e Leu T h r H is Leu P ro Lys G ly S e r A la 995 1000 1005

G lu A la G lu Leu Met S e r V a l V a l P ro V a l Phe T y r V a l Phe H is

1010 1015 1020

Tyr Leu G lu T h r G ly Asn H is T rp A sn l i e Phe H is S e r Asp P ro 1025 1030 1035

Leu l i e G lu Lys G ln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys G lu G ly Met 1040 1045 1050

Leu S e r l i e Met S e r T y r A rg A sn A la A sp T y r S e r T y r S e r V al 1055 1060 1065

Trp Lys G ly G ly S e r A la S e r T h r T rp Leu T h r A la Phe A la Leu 1070 1075 1080

A rg V a l Leu G ly G ln V a l Asn Lys T y r V a l G lu G ln Asn G ln Asn 1085 1090 1095

S e r l i e Cys Asn S e r Leu Leu T rp Leu V a l G lu A sn T y r G ln Leu

1100 1105 1110

Asp A sn G ly S e r Phe Lys G lu A sn S e r G ln T y r G ln P ro l i e Lys 1115 1120 1125

Leu G ln G ly T h r Leu P ro V a l G lu A la A rg G lu A sn S e r Leu T y r 1130 1135 1140

Leu T h r A la Phe T h r V a l l i e G ly l i e A rg Lys A la Phe Asp l i e 1145 1150 1155

Cys P ro Leu V a l Lys l i e Asp T h r A la Leu l i e Lys A la Asp Asn 1160 1165 1170

Phe Leu Leu G lu Asn T h r Leu P ro A la G ln S e r T h r Phe T h r Leu 1175 1180 1185

A la l i e S e r A la T y r A la Leu S e r Leu G ly Asp Lys T h r H is P ro 1190 1195 1200

G ln Phe A rg S e r l i e V a l S e r A la Leu Lys A rg G lu A la Leu V al 1205 1210 1215

Lys G ly A sn P ro P ro l i e T y r A rg Phe T rp Lys Asp A sn Leu Gln

1220 1225 1230

H is Lys A sp S e r S e r V a l Pro A sn T h r G ly T h r A la A rg Met V al 1235 1240 1245

G lu T h r T h r A la T y r A la Leu Leu T h r S e r Leu A sn Leu Lys Asp 1250 1255 1260

l i e A sn T y r V a l Asn P ro V al l i e Lys T rp Leu S e r G lu G lu Gln 1265 1270 1275

A rg T y r G ly G ly G ly Phe T yr S e r T h r G ln Asp T h r l i e A sn A la 1260 1285 1290

l i e G lu G ly Leu T h r G lu T yr S e r Leu Leu V a l Lys Gln Leu A rg 1295 1300 1305

Leu S e r Met Asp l i e Asp V al S e r T y r Lys H is Lys G ly A la Leu 1310 1315 1320

H is A sn T y r Lys Met T h r Asp Lys Asn Phe Leu G ly A rg P ro V al 1325 1330 1335

G lu V a l Leu Leu Asn Asp Asp Leu l i e V a l S e r T h r G ly Phe Gly 1340 1345 1350

S e r G ly Leu A la T h r V a l H is V a l T h r T h r V a l V a l H is Lys T hr 1355 1360 1365

S e r T h r S e r G lu G lu V a l Cvs S e r Phe T y r Leu Lys l i e Asp T hr 1370 1375 1360

G ln Asp l i e G lu A la S e r H is T y r A rg G ly T y r G ly A sn S e r Asp 1385 1390 1395

T y r Lys A rg l i e V a l A la Cys A l a S e r T y r Lys P ro S e r A rg Glu 1400 1405 1410

G lu S e r S e r S e r G ly S e r S e r H is A la V a l Met Asp l i e S e r Leu 1415 1420 1425

P ro T h r G ly l i e S e r A la Asn G lu G lu Asp Leu Lys A la Leu V al 1430 1435 1440

G lu G ly V a l Asp G ln Leu Phe T h r Asp T y r G ln l i e Lys Asp Gly 1445 1450 1455

H is V a l l i e Leu G ln Leu Asn S e r l i e P ro S e r S e r Asp Phe Leu 1460 1465 1470

Cys V a l A rg Phe A rg l i e Phe G lu Leu Phe G lu V a l Gly Phe Leu 1475 1480 1485

S e r P ro A l a T h r Phe T h r V a l T y r G lu T y r H is A rg P ro Asp Lys 1490 1495 1500

G ln Cys T h r ^{M e t} Phe T y r S e r T h r S e r Asn l i e Lys l i e Gln Lys 1505 1510 1515

V a l Cys G lu G ly A la A la Cys Lys Cys V a l G lu A la Asp Cys Gly 1520 1525 1530

G ln Met G ln G lu G lu Leu Asp Leu T h r l i e S e r A la Glu T h r A rg 1535 1540 1545

Lys G ln T h r A la Cys Lys Pro G lu l i e A la T y r A la T yr Lys V al 1550 1555 1560

S e r l i e T h r S e r l i e T h r V al G lu Asn V a l Phe V a l Lys T y r Lys 1565 1570 1575

A la T h r Leu Leu Asp l i e T y r Lys T h r G ly G lu A la V al A la Glu 1580 1585 1590

Lys Asp S e r G lu l i e T h r Phe l i e Lys Lys V a l T h r Cys T h r Asn 1595 1600 1605

A la G lu Leu V a l Lys G ly A rg G ln T y r Leu l i e Met Gly Lys Glu 1610 1615 162 0

A la Leu G ln l i e Lys T y r Asn Phe S e r Phe A rg T y r l i e T y r P ro 1625 1630 1635

Leu Asp S e r Leu T h r T rp l i e G lu T y r T rp P ro A rg Asp T h r T hr 1640 1645 1650

Cys S e r S e r Cys G ln A la Phe Leu A la Asn Leu Asp Glu Phe A la 1655 1660 1665

G lu Asp l i e Phe Leu A sn Gly Cys

1670 1675

S E Q I D N O : 5

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYI FSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTEYTENFKDRVTMTRDTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP3QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENMYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

S E Q I D N O : 6

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

^{S E Q I D N O : 7} c a d e n a p e s a d a ^{; g 2 / 4 )} (448 a m in o á c id o s ) )

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFSNYWIQKVRQAPGQGLEWMGEILPGSGHTEYTENFKDRVTMTRDTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS5GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSLGK

^{S E Q I D N O : 8} C a d e n a lig e ra ^{( K a p p a )} (214 a m in o á c id o s )

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

^{S E Q I D N O : 9} GYIFSNYWIQ

^{S E Q I D N O : 1 0} EILPGSGSTEYTENFKD

^{S E Q I D N O : 1 1} YFFGSSPNWYFDV

^{S E Q I D N O : 1 2} GASENIYGALN

^{S E Q I D N O : 1 3} GATNLAD

^{S E Q I D N O : 1 4} QNVLNTPLT

S E Q I D N O : 1 5

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTEYTENFKDRVTMTRDTSTS TVYMELS S LRS EDTAVYYCARYFFGS S PNWYFDVWGQGT LVTVS S

S E Q I D N O : 1 6

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK

^{s e q I D N O .}23 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la re g ió n c o n s ta n te d e c a d e n a p e s a d a d e e c u liz u m a b ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALISGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGFQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDYLMI SRTPEVTCWVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYFLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

^{s e q I D N O :} 24 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la re g ió n v a r ia b le de l a n tic u e rp o B N J441

QVQLVQ S GAEVKKP GA3VKVS C KAS GHIF S N YVÍIQWVRQAP GQ G L EW MGEILPGSGHTEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC ARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS

^{S E Q I D N O :} 25 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la re g ió n c o n s ta n te de l a n tic u e rp o B N J441

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSLGK

^{S E Q I D N O :} 26 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e Ig G 2 d e la v a r ia n te d e la re g ió n c o n s ta te d e c a d e n a p e s a d a q u e c o m p re n d e s u s titu c io n e s Y T E ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVTSSNFG'FQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDFLYITREPEVTCWVDVSHEDPEVQF NWYVD GMEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYFLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

^{s e q I D N O :} 27 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e c a d e n a p e s a d a e n te ra d e v a r ia n te d e e c u liz u m a b q u e

c o m p re n d e u n a re g ió n c o n s ta n te d e c a d e n a p e s a d a m o s tra d a e n S E Q ID N O :26 (a n te r io r)

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para cuantificar la proteína del complemento C5 humana libre (sin unir) (C5) de una muestra que comprende:

a. unir el anticuerpo de captura anti-C5 biotinilado a una placa de ensayo de 96 pocillos recubierta con estrepavidina; b. capturar el C5 libre (sin unir) en la muestra añadiendo la muestra a la placa;

c. detectar el C5 libre capturado añadiendo un anticuerpo de detección anti-C5 marcado con azufre a la placa; y d. cuantificar el C5 libre capturado usando electroquimioluminiscencia;

en donde la muestra se diluye aproximadamente 1: 2; en donde la muestra se mantiene en hielo; en donde las etapas b. y c. son aproximadamente de 15 a 30 minutos, y en donde el anticuerpo anti-C5 de captura biotinilado se añade a una concentración de aproximadamente 5 pg/ml.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además calcular la concentración o cantidad de anticuerpo C5 libre comparando los datos obtenidos en la etapa d. a una curva estándar preparada a partir de cantidades conocidas de C5 añadidas a una muestra empobreciada en C5 usando el método de la reivindicación 1.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende además calcular la concentración de anticuerpo C5 libre con el software Gyros Evaluator.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra se obtiene de un paciente humano.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dicha muestra es una muestra de suero o una muestra de plasma.

6. El método de la reivindicación 4 o 5, en donde el paciente ha sido tratado con un anticuerpo anti-C5.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el paciente ha sido tratado con eculizumab.

8. El método de la reivindicación 6, en donde el paciente ha sido tratado con ALXN1210.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo de captura biotinilado es eculizumab o ALXN1210.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo anti-C5 de detección es N19-8 (anticuerpo C5 anti-humano de ratón).