ES2617211T3 - Ensayos de adrenomedulina y métodos para determinar la adrenomedulina madura - Google Patents
Ensayos de adrenomedulina y métodos para determinar la adrenomedulina madura Download PDFInfo
- Publication number
- ES2617211T3 ES2617211T3 ES12791143.6T ES12791143T ES2617211T3 ES 2617211 T3 ES2617211 T3 ES 2617211T3 ES 12791143 T ES12791143 T ES 12791143T ES 2617211 T3 ES2617211 T3 ES 2617211T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- adm
- adrenomedulin
- gly
- mature
- amide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims abstract description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 46
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 46
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 5
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 4
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 101000690940 Homo sapiens Pro-adrenomedullin Proteins 0.000 claims description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 101800004616 Adrenomedullin Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000004379 Adrenomedullin Human genes 0.000 abstract description 13
- ULCUCJFASIJEOE-NPECTJMMSA-N adrenomedullin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]1C(N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 ULCUCJFASIJEOE-NPECTJMMSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 34
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 20
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000011309 routine diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- -1 umbelliferone Chemical compound 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010006591 Apoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 101100243025 Arabidopsis thaliana PCO2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 101100330193 Homo sapiens CYREN gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100319898 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YAP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000007767 bonding agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000046663 human ADM Human genes 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 208000021822 hypotensive Diseases 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N lichenxanthone Natural products COC1=CC(O)=C2C(=O)C3=C(C)C=C(OC)C=C3OC2=C1 QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000005053 phenanthridines Chemical class 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N rhodamine 110 Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N)=CC2=[O+]C2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
- A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- A61K38/1725—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a or C5a
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7095—Inflammation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Método in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes que se sospecha que presentan sepsis en el que la concentración de adrenomedulina madura (ADM) (1-52-amida) y/o ADM 1-52-Gly madura en una muestra de líquido corporal de dicho paciente séptico se determina utilizando un ensayo que comprende dos agentes de unión que se seleccionan de entre el grupo que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina y un fragmento de anticuerpo anti- ADM que se unen a la ADM y que se unen a dos regiones diferentes dentro de la región de la adrenomedulina (21- 52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras, es decir, aminoácido 21-52-amida (SEC ID nº 1) o aminoácido 21-52- Gly (SEC ID nº 2), respectivamente, en el que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoácidos.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Ensayos de adrenomedulina y metodos para determinar la adrenomedulina madura.
El objeto de la presente invencion es un metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos, en el que se determina la concentracion de ADM 1-52 madura y/o de ADM 1-52-Gly madura en una muestra de lfquido corporal de dicho paciente septico utilizando un ensayo que comprende dos agentes de union que se seleccionan de entre el grupo que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina y un fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a ADM y que se une a dos regiones diferentes dentro de la region de la adrenomedulina madura y/o de la adrenomedulina-Gly que es los aminoacidos 21-52-amida de SEC ID n° 1 o los aminoacidos 21-52-Gly de SEC ID n° 2, en la que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoacidos.
El objeto de la presente invencion son ademas unos ensayos y metodos de calibracion.
El peptido adrenomedulina (ADM) fue descrito por primera vez por Kitamura et al. (ver 1; los datos numericos se basan en la lista de referencias adjunta) como nuevo peptido hipotensor que comprende 52 aminoacidos, que habfa sido aislado a partir de un feocromocitoma humano. En el mismo ano, tambien se describio un ADNc codificante de un peptido precursor que comprendfa 185 aminoacidos y la secuencia de aminoacidos completa de dicho peptido precursor. El peptido precursor, que comprende, entre otros, una secuencia de senal de 21 aminoacidos en el extremo N-terminal, se denomina "preproadrenomedulina" (pre-proADM). La pre-proADM comprende 185 aminoacidos y presenta la secuencia SEC ID n° 3. La ADM madura se muestra en la SEC ID n° 4 y la ADM-Gly madura se muestra en la SEC ID n° 5.
El peptido adrenomedulina (ADM) es un peptido que comprende 52 aminoacidos (SEC ID n° 2) y que comprende los aminoacidos 95 a 146 de pre-proADM, a partir del cual se forma mediante corte proteolftico. Hasta hoy, sustancialmente solo se han caracterizado con mas precision unos cuantos fragmentos de los fragmentos peptfdicos formados en el corte de la pre-proADM, en particular los peptidos fisiologicamente activos adrenomedulina (ADM) y "PAMP", un peptido que comprende 20 aminoacidos (22-41) que sigue a los 21 aminoacidos del peptido de senal en pre-proADM. Para tanto ADM como PAMP, adicionalmente se han descubierto e investigado en mayor detalle subfragmentos fisiologicamente activos. El descubrimiento y caracterizacion de ADN en 1993 ha generado una intensa actividad investigadora y un alud de publicaciones, los resultados de las cuales se han resumido recientemente en diversos artfculos de revision, haciendo referencia en particular en el contexto de la presente descripcion a los artfculos en una publicacion de "Peptides" dedicada a la ADM (Peptides 22, 2001), en particular (2) y (3). Una revision adicional es (4). En las investigaciones cientfficas hasta el momento se ha descubierto, entre otras cosas, que la ADM puede considerarse un peptido regulador polifuncional. Resulta liberado a la circulacion en una forma inactiva extendida por glicina (5). Tambien existe una protefna de union (6) que es especffica para ADM y que de manera similar probablemente modula el efecto de la ADM.
Dichos efectos fisiologicos de la ADM, asf como de PAMP, que son de importancia principal en las investigaciones hasta el momento, fueron los efectos que influfan sobre la presion sangufnea. De esta manera, la ADM es un vasodilatador eficaz, siendo posible asociar el efecto hipotensor con segmentos peptfdicos particulares en la parte C-terminal de la ADM.
Se ha descubierto ademas que el peptido PAMP fisiologicamente activo adicional anteriormente indicado formado a partir de pre-proADM muestra de manera similar un efecto hipotensor, aunque aparentemente presenta un mecanismo de accion que difiere del de la ADM (ver, ademas de los artfculos de revision anteriormente indicados (3) y (4), tambien (7), (8) o (9) y (10)).
Se ha descubierto ademas que las concentraciones de ADM que pueden medirse en la circulacion y en otros lfquidos biologicos se encuentran, en varios estados patologicos, significativamente elevados respecto a las concentraciones observadas en las personas sanas de control. De esta manera, el nivel de ADM de los pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva, infarto de miocardio, enfermedades renales, trastornos hipertensores, diabetes mellitus, en etapa aguda de choque y en la sepsis y el choque septico se encuentran significativamente incrementadas, aunque en diferentes grados. Las concentraciones de PAMP tambien se encuentran incrementadas en algunos de dichos estados patologicos, aunque los niveles plasmaticos se encuentran reducidos respecto a la ADM ((3), pagina 1.702).
Es conocido ademas que las concentraciones inusualmente elevadas de ADM se observan en la sepsis o en el choque septico (ver (3) y (11), (12), (13), (14) y (15)). Los resultados se relacionan con los cambios hemodinamicos tfpicos que se conocen como fenomenos tfpicos del curso de la enfermedad en pacientes con sepsis y otros sfndromes severos, tales como, por ejemplo, SIRS.
Aunque se supone que la ADM y PAMP se forman a partir del mismo peptido precursor, pre-proADM (SEC ID n° 3), en el que las secuencias de aminoacidos correspondientes a dichos peptidos se encuentran presentes como peptidos parciales en cantidades equimolares, las concentraciones de aDm o PAMP medibles en los lfquidos biologicos aparentemente son diferentes. Lo anterior no resulta inusual.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
De esta manera, las concentraciones medibles de los diferentes productos de degradacion del mismo peptido precursor pueden ser diferentes, por ejemplo porque son el resultado de diferentes rutas de degradacion que compiten entre si y que, por ejemplo en el caso de diferentes estados patologicos, conducen a una fragmentacion diferente de un peptido precursor y, por lo tanto, a diferentes productos de degradacion. Determinados peptidos parciales contenidos en el peptido precursor pueden formarse como peptidos libres o pueden no formarse, y/o se forman peptidos diferentes de maneras diferentes y en cantidades diferentes. Aunque se siga una unica ruta de degradacion para el procesamiento de un peptido precursor y por lo tanto todos los productos de degradacion se originen de un unico peptido precursor y seguramente se hayan formado ellos mismos principalmente en cantidades equimolares, las concentraciones de estado estacionario de diferentes peptidos parciales y fragmentos medibles en lfquidos biologicos pueden ser muy diferentes, es decir, por ejemplo, en el caso de que se formen fragmentos individuales a una tasa diferentes y/o presentan estabilidades (tiempos de vida) individuales en el lfquido biologico respectivo, o en el caso de que resulten eliminados de la circulacion basandose en diferentes mecanismos de eliminacion y/o diferentes tasas de eliminacion.
La adrenomedulina desempena papeles cruciales durante el desarrollo de sepsis ((16), (17)) y en numerosas enfermedades agudas y cronicas ((18), (4)).
La ADM se encuentra elevada en la sepsis y es pronostico del resultado de la sepsis ((19), (14), (11)). El seguimiento del tratamiento de la sepsis para la monitorizacion temprana del exito o fracaso del tratamiento sigue siendo una necesidad clfnica no satisfecha sustancial.
Actualmente no existen ensayos de ADM adecuados para el diagnostico rutinario. La sensibilidad de los ensayos actualmente disponibles para determinar la ADM madura es excesivamente reducida. Por lo tanto, se requiere un volumen de plasma elevado para el analisis. Ademas, los ensayos actualmente disponibles muestran limitaciones preanalfticas relacionadas con la estabilidad, por ejemplo las muestras necesitan estabilizarse con aprotinina ((20), (21)). Ademas, algunos ensayos de ADM requieren una preparacion extensiva de las muestras antes de las mediciones (11).
Lynley K. Lewis et al. comentan las dificultades asociadas a la medicion de la ADM en el plasma humano en una publicacion titulada "Adrenomedullin (1-52) measured in human plasma by radioimmunoassay: plasma concentration, adsorption, and storage", Clinical Chemistry 44(3):571-577, 1998.
Kazuo Kitamura et al. ensenan que la forma molecular principal de la ADM inmunorreactiva en el plasma humana es la ADM extendida con glicina (ADM-gly) y que la concentracion de la ADM madura en el plasma humano es baja, en una publicacion titulada "The Intermediate Form of Glycine-Extended Adrenomedullin is the Major Circulating Molecular Form in Human Plasma", Biochemical and Biophysical Research Communications 244:551-555, 1998.
El documento n° WO2004/090546A1 da a conocer un metodo para identificar la inmunorreactividad de la ADM en lfquidos biologicos con fines diagnosticos mediante la medicion de un peptido parcial de la region intermedia de la proadrenomedulina que comprende los aminoacidos 45 a 92 de la preproadrenomedulina completa.
El objetivo de la presente invencion es proporcionar un ensayo que resulta adecuado como metodo rutinario para la medicion directa de la ADM madura adecuada para las tecnologfas estandares automatizadas de laboratorio y de punto de atencion.
Inesperadamente ha resultado que dicho ensayo puede utilizarse para el seguimiento del tratamiento en pacientes septicos.
Es un objeto de la presente invencion un metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos, en el que la concentracion de ADM 1-52 madura y/o ADM 1-52-Gly madura en una muestra de lfquido corporal de dicho paciente septico se determina utilizando un ensayo que comprende dos agentes de union que se unen a dos regiones diferentes dentro de la region de la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly que es aminoacidos 21-52-amida SEC ID n° 1 o aminoacidos 21-52-Gly SEC ID n° 2, en el que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoacidos.
En una forma de realizacion de la invencion, un objeto es un metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos en el que uno de dichos agentes de union se une a una region comprendida dentro de la secuencia siguiente de la ADM madura y/o la ADM 1-52-Gly madura:
ADM 21-32: CTVQKLAHQIYQ (SEC ID n° 6)
y en la que dicho segundo agente de union de dichos agentes de union se une a una region comprendida dentro de la secuencia siguiente de la ADM madura y/o la ADM 1-52-Gly madura:
ADM 42-52: APRSKISPQGY (SEC ID n° 7)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En una forma de realizacion de la invencion, la sensibilidad de ensayo de dicho ensayo es capaz de cuantificar la ADN de los sujetos sanos y es <10 pg/ml, preferentemente <40 pg/ml y mas preferentemente <70 pg/ml.
En una forma de realizacion de la invencion, dicho agente de union muestra una afinidad de union para la ADM madura y/o la ADM 1-52-Gly madura de por lo menos 107 M-1, preferentemente 108 M-1, la afinidad preferente es superior a 109 M"1, mas preferentemente superior a 1010 M"1. El experto en la materia conocera que puede considerarse compensar la afinidad mas baja mediante la aplicacion de una dosis mas elevada de compuestos y dicha medida no conducirfa a salirse del alcance de la invencion.
Con el fin de determinar la afinidad de los anticuerpos para la adrenomedulina, se determino la cinetica de union de la adrenomedulina a anticuerpo inmovilizado mediante resonancia de plasmon superficial libre de marcaje utilizando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania). Se llevo a cabo la inmovilizacion reversible de los anticuerpos utilizando un anticuerpo anti-Fc de raton acoplado covalentemente con alta densidad con una superficie de sensor CM5 siguiendo las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpo de raton; GE Healthcare) (22).
En una forma de realizacion de la invencion dicho agente de union se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina o un fragmento de anticuerpo anti-ADM de union a ADN.
La expresion seguimiento de la terapia se refiere a que se determina en una muestra por lo menos una vez la concentracion de la ADM madura 1-52 (SEC ID n° 4) y/o de la ADM 1-52-Gly madura (SEC ID n° 5), preferentemente mas de una vez, preferentemente dos veces o una vez al dfa despues del inicio de la terapia.
En una forma de realizacion de la invencion puede ser un denominado ensayo POC (punto de atencion), que es una tecnologfa de ensayo que permite realizar el ensayo en menos de 1 hora en proximidad al paciente sin necesidad de un sistema de ensayo totalmente automatico. Un ejemplo de esta tecnologfa es la tecnologfa de ensayo inmunocromatografica.
En una forma de realizacion de la invencion, dicho ensayo es un inmunoensayo de tipo sandwich utilizando cualquier tipo de tecnologfa de deteccion, que incluye de manera no limitativa, marcador enzimatico, marcador quimioluminiscente, marcador electroquimioluminiscente, preferentemente un ensayo totalmente automatizado. En una forma de realizacion de la invencion, dicho ensayo es un ensayo de tipo sandwich marcado con enzima. Los ejemplos de ensayo automatizado o totalmente automatizado comprenden ensayos que pueden utilizarse para uno de los sistemas siguientes: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas® o Alere Triage®.
Se conoce una diversidad de ensayos inmunologicos y pueden utilizarse para los ensayos y metodos de la presente invencion, entre ellos se incluyen: radioinmunoensayos ("RIA"), ensayos inmunologicos multiplicados por enzimas ("EMIT") homogeneos, ensayos de inmunoadsorcion ligados a enzima ("ELISA"), inmunoensayos de reactivacion de apoenzimas ("ARIS"), ensayos inmunologicos de tira reactiva y ensayos inmunocromatograficos.
En una forma de realizacion de la invencion por lo menos uno de dichos agentes de union se marca con el fin de ser detectado.
Los metodos de deteccion preferidos comprenden ensayos inmunologicos en diversos formatos, tales como, por ejemplo, el radioinmunoensayo (RIA), los ensayos inmunologicos de quimioluminiscencia y de fluorescencia, los ensayos inmunologicos ligados a enzima (ELISA), matrices de perlas basadas en Luminex, ensayos de micromatrices de protefnas y formatos de ensayo rapido, tales como, por ejemplo, las tiras reactivas inmunocromatograficas.
En una forma de realizacion preferida, dicho marcador se selecciona de entre el grupo que comprende un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimatico, un marcador fluorescente y un marcador de yodo radioactivo.
Los ensayos pueden ser ensayos homogeneos o heterogeneos, competitivos y no competitivos. En una forma de realizacion, el ensayo se encuentra en forma de un ensayo de tipo sandwich, que es un ensayo inmunologico no competitivo, en el que la molecula que debe detectarse y/o cuantificarse se une a un primer anticuerpo o a un segundo anticuerpo. El primer anticuerpo puede unirse a una fase solida, por ejemplo una perla, una superficie de un pocillo u otro recipiente, un chip o una tira, y el segundo anticuerpo es un anticuerpo que se encuentra marcado, por ejemplo con un pigmento, con un isotopo radioactivo o una fraccion reactiva o catalfticamente activa. A continuacion, se midio la cantidad de anticuerpo marcado unido al analito mediante un metodo apropiado. La composicion general y procedimientos que incluyen los "ensayos de tipo sandwich" estan bien establecidos y son conocidos por el experto en la materia (23).
En otra forma de realizacion, el ensayo comprende dos moleculas de captura, preferentemente anticuerpos, los cuales se encuentran ambos presentes como dispersiones en una mezcla de reaccion lfquida, en la que un primer
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
componente de marcaje se encuentra unido a la primera molecula de captura, en el que dicho componente de marcaje es parte de un sistema de marcaje basado en la inhibicion o amplificacion de la fluorescencia o de la quimioluminiscencia, y un segundo componente de marcaje de dicho sistema de marcaje se une a la segunda molecula de captura, de manera que con la union de ambas moleculas de captura al analito se genera una senal medible que permite la deteccion de los complejos de tipo sandwich formados en la solucion que comprende la muestra.
En otra forma de realizacion, dicho sistema de marcaje comprende criptatos de tierra rara o quelatos de tierra rara en combinacion con pigmento fluorescente o pigmento quimioluminiscente, en particular un pigmento del tipo cianina.
En el contexto de la presente invencion, los ensayos basados en la fluorescencia comprenden la utilizacion de pigmentos, que pueden seleccionarse, por ejemplo, de entre el grupo que comprende FAM (5- o 6- carboxifluorescefna), VIC, NED, fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna (FITC), IRD-700/800, pigmentos cianina, tales como CY3, Cy5, CY3.5, CY5.5, Cy7, xanteno, 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluorescefna (HEX), TET, 6- carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluorescefna (JOE), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), 6-carboxi-X- rodamina (ROX), 5-carboxirodamina-6G (R6G5), 6-carboxirodamina-6G (RG6), rodamina, verde rodamina, rojo rodamina, rodamina 110, pigmentos BODIPY, tales como BODIPY TIMR, verde Oregon, coumarinas tales como umbeliferona, bencimidas tales como Hoechst 33258, fenantridinas tales como rojo Texas, amarillo Yakima, Alexa fluor, PET, bromuro de etidio, pigmentos de acridinio, pigmentos de carbazol, pigmentos de fenoxazina, pigmentos de porfirina, pigmentos de polimetina y similares.
En el contexto de la presente invencion, los ensayos basados en quimioluminiscencia comprenden la utilizacion de pigmentos, basandose en los principios ffsicos descritos para los materiales quimioluminiscentes en (24). Los pigmentos quimioluminiscentes preferidos son los esteres de acridinio.
Tal como se menciona en la presente memoria, un "ensayo" o "ensayo diagnostico" puede ser cualquier tipo aplicado en el campo de los diagnosticos. Dicho ensayo puede basarse en la union de un analito que debe detectarse a una o mas sondas de captura con una determinada afinidad. Respecto a la interaccion entre las moleculas de captura y las moleculas diana o moleculas de interes, la constante de afinidad preferentemente es superior a 108 M.
En el contexto de la presente exposicion, las "moleculas de union" son moleculas que pueden utilizarse para la union a moleculas diana o moleculas de interes, es decir, analitos (es decir, en el contexto de la presente exposicion PCT y fragmentos de la misma) de una muestra. De esta manera, las moleculas de union deben conformarse adecuadamente, tanto espacialmente como en terminos de caracterfsticas superficiales, tales como la carga superficial, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la presencia o ausencia de donantes y/o aceptores de Lewis, para unirse especfficamente a las moleculas diana o moleculas de interes. En la presente memoria la union puede estar mediada, por ejemplo, por interacciones ionicas, de van der Waals, pi-pi, Sigma-pi, hidrofobas o de enlace hidrogeno o una combinacion de dos o mas de las interacciones anteriormente indicadas entre las moleculas de captura y las moleculas diana o moleculas de interes. En el contexto de la presente exposicion las moleculas de union pueden seleccionarse, por ejemplo, de entre el grupo que comprende una molecula de acidos nucleicos, una molecula de carbohidrato, una molecula de APN, una protefna, un anticuerpo, un peptido o una glucoprotefna. Preferentemente, las moleculas de union son anticuerpos, incluyendo fragmentos de los mismos con suficiente afinidad para una diana o molecula de interes, e incluyendo anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo recombinante, asf como derivados modificados qufmica y/o bioqufmicamente de dichos anticuerpos o fragmentos derivados de la cadena variante con una longitud de por lo menos 12 aminoacidos de la misma.
El marcador quimioluminiscente puede ser un marcador de ester de acridinio, marcadores esteroides que implican marcadores de isoluminol y similares.
Los marcadores enzimaticos pueden ser lactato deshidrogenasa (LDH), creatincinasa (CPK), fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ATL), fosfatasa acida, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, etc.
En una forma de realizacion de la invencion por lo menos uno de los dos agentes de union segun las reivindicaciones se une a una fase solida como partfculas magneticas y superficies de poliestireno.
En una forma de realizacion de la invencion, la concentracion de la ADM 1-52 madura y/o la ADM 1-52-Gly madura medida en la muestra se encuentra comprendida en el intervalo de entre 10 y 500 pg/ml en plasma o suero.
Los niveles de ADM de la presente invencion se determinaron con el ensayo de ADM descrito. Los valores anteriormente indicados podrfan ser diferentes en otros ensayos de ADM, dependiendo de su modo de calibracion. Los valores anteriormente indicados podrfan aplicarse a dichos ensayos de ADM calibrados de manera diferente de acuerdo con lo anteriormente indicado, considerando las diferencias de calibracion. Los ensayos de ADM podrfan calibrarse mediante correlacion y ajuste mediante sus intervalos normales (poblacion sana). Alternativamente,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
podrfan utilizarse muestras de control disponibles comercialmente para el ajuste de diferentes calibraciones (ICI Diagnostics, Berlin, Alemania). Con el ensayo de ADM anteriormente indicado, se ha determinado que la mediana de una poblacion normal es de 24,7 pg/ml.
En una forma de realizacion de la invencion resulta de aplicacion un umbral por el que un valor superior al umbral es indicativo de que un paciente que no responde o responde mal a la terapia, mientras que un valor inferior a dicho umbral es indicativo de que un paciente responde a la terapia.
En una forma de realizacion de la invencion resulta de aplicacion un umbral de entre 60 y 80 pg/ml, preferentemente de 70 pg/ml.
En una forma de realizacion de la invencion, dicha muestra se selecciona de entre el grupo que comprende plasma citrato, plasma heparina, plasma EDTA y sangre completa humanos.
En una forma de realizacion de la invencion dicha muestra extrafda se mide directamente sin ninguna preparacion adicional de la muestra.
En una forma de realizacion de la invencion, dicho metodo se lleva a cabo en un dispositivo totalmente automatizado Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas® o Alere Triage®.
En una forma de realizacion de la invencion, se determina la ADM 1-52 madura y/o la ADM 1-52-Gly madura en por lo menos dos muestras, en la que dichas muestras se extraen en puntos temporales diferentes de dichos pacientes septicos. Dichas muestras pueden extraerse una vez al dfa durante los dfas de terapia. Puede aplicarse un regimen diagnostico tal como se ha descrito para otros marcadores biologicos, por ejemplo (25) y tambien (26). En una forma de realizacion de la invencion el volumen de muestra medido es inferior o igual a 50 pl.
El metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun la presente invencion puede combinarse con otros parametros clfnicos y/o de laboratorio adicionales o puntuaciones clfnicas, tales como, por ejemplo, la puntuacion Apache 2, la puntuacion SOFA, u otras, o uno o mas parametros contenidos en la puntuacion. Pueden combinarse los parametros variables continua o discontinuamente utilizando herramientas estadfsticas estandares.
La materia objeto de la invencion es adicionalmente un ensayo para determinar la adrenomedulina y/o adrenomedulina-Gly madura en una muestra que comprende dos agentes de union segun las reivindicaciones que se unen a dos regiones diferentes dentro de la region de la adrenomedulina madura y/o de la adrenomedulina-Gly que son los aminoacidos 21-52-amida SEC ID n° 1 o los aminoacidos 21-52-Gly SEC ID n° 2 de la adrenomedulina madura, en la que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoacidos y en la que dicho ensayo no es un ensayo manual de tipo sandwich de tubo recubierto-ester de acridinio.
La materia objeto de la invencion es ademas un ensayo para determinar la adrenomedulina madura y/o adrenomedulina-Gly y/o adrenomedulina-Gly en una muestra que comprende unos agentes de union segun las reivindicaciones que se unen a dos regiones diferentes dentro de la region de la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly que son los aminoacidos 21-52-amida SEC ID n° 1 o los aminoacidos 21-52-Gly de la adrenomedulina madura SEC ID n° 2, en la que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoacidos y en la que dicho ensayo es un ensayo manual de tipo sandwich de tubo recubierto-ester de acridinio y en la que uno de dichos agentes de union es un anticuerpo que se une a la SEC ID n° 4 y en la que el segundo de dichos agentes de union es un anticuerpo que se une a la SEC ID n° 7 (APRSKISPQGY-CO-NH2).
En una forma de realizacion de los ensayos para determinar la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly en una muestra segun la presente invencion uno de dichos agentes de union se une a una region comprendida dentro de la secuencia siguiente de la ADM madura:
CTVQKLAHQIYQ (SEC ID n° 6)
y en la que el segundo de dichos agentes de union se une a una region comprendida dentro de la secuencia siguiente de la ADM madura:
APRSKISPQGY (SEC ID n° 7)
En una forma de realizacion de los ensayos para determinar la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly en una muestra segun la presente invencion, la sensibilidad de ensayo de dicho ensayo permite cuantificar la ADM de los sujetos sanos y es <10 pg/ml, preferentemente <40 pg/ml y mas preferentemente <70 pg/ml.
En una forma de realizacion de los ensayos para determinar la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly en una muestra segun la presente invencion, dicho agente de union muestra una afinidad de union para la adrenomedulina de por lo menos 107 M-1, preferentemente 108 M-1; la constante de afinidad preferentemente es
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
9 1 10 1
superior a 10 M' , mas preferentemente es superior a 10 M' . El experto en la materia conoce que puede considerarse compensar la menor afinidad mediante la aplicacion de una dosis mas alta de compuestos y que esta medida no conducirfa a salirse del alcance de la invencion. La afinidad de union puede determinarse tal como se ha indicado anteriormente.
En los ensayos para determinar la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly en una muestra segun la presente invencion, dicho agente de union se selecciona de entre el grupo que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina o un fragmento de anticuerpo anti-ADM de union a ADM segun las reivindicaciones.
En una forma de realizacion de los ensayos para determinar la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly en una muestra segun la presente invencion, dicho ensayo es un ensayo de tipo sandwich, preferentemente un ensayo totalmente automatizado. Puede ser un ELISA totalmente automatizado o manual. Puede ser un denominado ensayo PCT (punto de atencion). Los ejemplos de ensayos automatizados o totalmente automatizados comprenden ensayos que pueden utilizarse para uno de los sistemas a continuacion: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas® o Alere Triage®. Se han proporcionado anteriormente ejemplos de formatos de ensayo.
En una forma de realizacion de los ensayos para determinar la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly en una muestra segun la presente invencion, por lo menos uno de dichos dos agentes de union se marca con el fin de ser detectado. Se han proporcionado anteriormente ejemplos de marcadores.
En una forma de realizacion de los ensayos para determinar la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly en una muestra segun la presente invencion, por lo menos uno de dichos dos agentes de union se une a una fase solida. Se han proporcionado anteriormente ejemplos de fases solidas.
En una forma de realizacion de los ensayos para determinar la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly en una muestra segun la presente invencion, dicho marcador se selecciona de entre el grupo que comprende un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimatico, un marcador fluorescente y un marcador de yodo radioactivo.
Un objeto adicional de la presente invencion es un kit que comprende un ensayo segun la presente invencion en el que los componentes de dicho ensayo pueden encontrarse comprendidos en uno o mas recipientes.
Un objeto adicional de la presente invencion es un metodo de calibracion de un ensayo segun la presente invencion en el que el agente de union, un anticuerpo, se utiliza para la union a una region de por lo menos 5 aminoacidos dentro de la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly aminoacidos 1-16 (SEC ID n° 8). Dicho agente de union es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una region de por lo menos 5 aminoacidos dentro de la adrenomedulina madura y/o la adrenomedulina-Gly aminoacidos 1-16 (SEC ID n° 8).
En una forma de realizacion del metodo de calibracion de un ensayo segun la invencion, dicho anticuerpo o fragmento N-terminal reconoce y se une al extremo N-terminal (aal) de la adrenomedulina madura y/o de la adrenomedulina-Gly. Lo anterior significa en otra forma de realizacion preferente que dicho anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina se une unicamente a una region dentro de la secuencia de la ADM madura en el caso de que el extremo N-terminal de la ADM se encuentre libre. En dicha forma de realizacion, el anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina no se unirfa a una region dentro de la secuencia de la ADM madura en el caso de que dicha secuencia se encontrase comprendida dentro de la pro-ADM.
Los anticuerpos adecuados para calibrar un ensayo segun la invencion son agentes de union que reducen las propiedades de adsorcion de la ADM. Ademas, dicho agente de union debe ser compatible con los agentes de union utilizados en el ensayo de deteccion, por ejemplo, dicho agente de union no deberfa interferir con la union del agente de union marcado y el agente de union de fase solida en el caso de un ELISA.
Los presentes metodos y ensayos resultan adecuados para las aplicaciones rutinarias. Las aplicaciones rutinarias requieren en la mayorfa de casos que el volumen de muestra necesario no exceda de 50 pl. La aplicacion rutinaria requiere ademas que los tratamientos preanalfticos se mantengan en un mfnimo o que sean cero (utilizacion de muestras rutinarias como plasma-EDTA o plasma-citrato). Los requisitos preanalfticos deben adaptarse a la rutina clfnica: minima estabilidad del analito (>90% de recuperacion) a temperatura ambiente debe ser de por lo menos 2 horas.
Un anticuerpo segun la presente invencion es una protefna que incluye uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina que se unen especfficamente a un antfgeno. Entre los genes de inmunoglobulina reconocidos se incluyen los genes de region constante kappa, lambda, alfa (IgA), gamma (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), delta (IgD), epsilon (IgE) y mu (IgM), asf como la multitud de genes de region variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de longitud completa generalmente son de aproximadamente 25 Kd o 214 aminoacidos de longitud. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud completa generalmente son de aproximadamente 50 Kd o 446 aminoacidos de longitud. Las cadenas ligeras estan
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
codificadas por un gen de region variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoacidos de longitud) y un gen de region constante kappa o lambda en el extremo COOH-terminal. Las cadenas pesadas de manera similar estan codificadas por un gen de region variable (aproximadamente 116 aminoacidos de longitud) y uno de los otros genes de region constante.
La unidad estructural basica de un anticuerpo generalmente es un tetramero que consiste de dos parejas identicas de cadenas de inmunoglobulina, presentando cada pareja una cadena ligera y una cadena pesada. En cada pareja, las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada se unen a un antfgeno y las regiones constantes median en funciones efectoras. Las inmunoglobulinas tambien existen en una diversidad de otras formas, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y (Fab')2, asf como anticuerpos hfbridos bifuncionales y cadenas sencillas ((27), (28), (29), (30) y (31)). Una region variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina incluye una region marco interrumpida por tres regiones hipervariables, tambien denominadas regiones determinantes de complementariedad (RDC), ver (32). Tal como se ha indicado anteriormente, las RDC son responsables principalmente de la union a un epftopo de un antfgeno. Un complejo inmunologico es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano, o un fragmento de anticuerpo funcional, que se une especfficamente a un antfgeno.
Los anticuerpos quimericos son anticuerpos los genes de cadena ligera y pesada de los cuales han sido construidos, tfpicamente mediante ingenierfa genetica, a partir de genes de region variable y de region constante de inmunoglobulina pertenecientes a especies diferentes. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de raton pueden unirse a segmentos constantes humanos, tales como kappa y gamma 1 o gamma 3. En un ejemplo, de esta manera, un anticuerpo quimerico terapeutico es una protefna hfbrida compuesta del dominio variable o de union a antfgeno de un anticuerpo de raton y el dominio constante o efector de un anticuerpo humano, aunque pueden utilizarse otras especies de mamffero, o la region variable puede producirse mediante tecnicas moleculares. Los metodos de preparacion de anticuerpos quimericos son bien conocidos de la tecnica, por ejemplo ver (33). Una inmunoglobulina "humanizada" es una inmunoglobulina que incluye una region marco humana y una o mas RDC de una inmunoglobulina no humana (tal como de raton, de rata o sintetica). La inmunoglobulina no humana que proporciona las RDC se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptora". En una forma de realizacion, la totalidad de las RDC proceden de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. Las regiones constantes no es necesario que se encuentren presentes pero, en caso de encontrarse presentes, deben ser sustancialmente identicas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, identicas por lo menos al aproximadamente 85%-90%, tal como identicas aproximadamente al 95% o mas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las RDC, son sustancialmente identicas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana naturales. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y una inmunoglobulina de cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antfgeno que el anticuerpo donante que proporciona las RDC. El marco aceptor de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado puede presentar un numero limitado de sustituciones por aminoacidos obtenidos del marco donante. Los anticuerpos monoclonales humanizados o de otro tipo pueden presentar sustituciones adicionales de aminoacidos conservadores que no presentan sustancialmente ningun efecto sobre la union de los antfgenos u otras funciones de la inmunoglobulina. Las sustituciones conservadoras ejemplares son sustituciones tales como gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden construirse mediante ingenierfa genetica por ejemplo ver (34)). Un anticuerpo humano es un anticuerpo en el que los genes de cadena ligera y de cadena pesada son de origen humano. Pueden generarse anticuerpos humanos utilizando metodos conocidos de la tecnica. Pueden producirse anticuerpos humanos mediante la inmortalizacion de una celula B humana secretora del anticuerpo de interes. La inmortalizacion puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, la infeccion por VEB o mediante la fusion de una celula B humana con una celula de mieloma o de hibridoma, produciendo una celula de trioma. Tambien pueden producirse anticuerpos humanos mediante metodos de expresion fagica (ver, por ejemplo, (35), (36) y (37)) o seleccionarse de una biblioteca combinatorial humana de anticuerpos monoclonales (ver el sitio de internet de Morphosys). Tambien pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la utilizacion de animales transgenicos portadores de un gen de inmunoglobulina humana (por ejemplo ver (38) y (39)).
De esta manera, el anticuerpo de ADM puede presentar los formatos conocidos de la tecnica. Son ejemplos los anticuerpos humanos, los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quimericos y los anticuerpos injertados con RDC. En una forma de realizacion preferida, los anticuerpos segun la presente invencion son anticuerpos producidos recombinantemente, tales como, por ejemplo, IgG, una inmunoglobulina de longitud completa tfpica, o fragmentos de anticuerpo que contienen por lo menos el dominio F-variable de cadena pesada y/o ligera, tal como, por ejemplo, anticuerpos acoplados qufmicamente (fragmento de union a antfgeno), incluyendo de manera no limitativa fragmentos Fab tales como minicuerpos Fab, anticuerpo Fab de cadena sencilla, anticuerpo Fab monovalente con etfquetas epftopo, por ejemplo Fab-V5Sx2, Fab bivalente (minianticuerpo) dimerizado con el dominio CH3, Fab bivalente o Fab multivalente, por ejemplo formado mediante multimerizacion con ayuda de un dominio heterologo, por ejemplo mediante la dimerizacion de dominios dHLX, por ejemplo Fab-dHLX-FSx2, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos scFv multivalente y/o multiespecfficos multimerizados, diacuerpos bivalentes y/o biespecfficos, BITE® (acoplador biespecffico de celulas T), anticuerpos trifuncionales, anticuerpos polivalentes, por ejemplo de una clase diferente de G, anticuerpos de dominio unico, por ejemplo nanocuerpos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
derivados de camelido o inmunoglobulinas de pescado y numerosos otros.
Ademas de los anticuerpos anti-ADM, son bien conocidos en la tecnica otros andamiajes de biopolfmero para el acomplejamiento de una molecula diana, que han sido utilizados para la generacion de biopolfmeros altamente especfficos de la diana. Son ejemplos los aptameros, los espiegelmeros, las anticalinas y las conotoxinas.
En una forma de realizacion preferida, el formato de anticuerpo de ADM se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y protefna de fusion scFv-Fc. En otra forma realizacion preferente, el formato de anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento scFab, fragmento Fab, fragmento scFv y conjugados de biodisponibilidad optimizada de los mismos, tales como fragmentos PEGilados. Uno de los formatos mas preferentes es el formato scFab.
En otra forma de realizacion preferida, el anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo de union a ADM es un anticuerpo monoespecffico. Los anticuerpos monoespecfficos son anticuerpos que presentan afinidad para el mismo antfgeno. Los anticuerpos monoclonales son monoespecificos, aunque tambien pueden producirse anticuerpos monoespecfficos por medios diferentes de la produccion a partir de una celula germinal comun.
En una forma de realizacion preferida de la invencion pueden producirse anticuerpos segun la presente invencion de la manera siguiente:
se inmunizo un raton Balb/c con 100 pg de conjugado de peptido ADM-BSA los dfas 0 y 14 (emulsionado en 100 pl de adyuvante completo de Freund) y 50 pg los dfas 21 y 28 (en 100 pl de adyuvante incompleto de Freund). Tres dfas antes de llevar a cabo el experimento de fusion, los animales recibieron 50 pg del conjugado disueltos en 100 pl de solucion salina, administrados en forma de una inyeccion intraperitoneal y una inyeccion intravenosa.
Los esplenocitos del raton inmunizado y celulas de la lfnea celular de mieloma SP2/0 se fusionaron con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 s a 37°C. Tras el lavado, las celulas se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Se seleccionaron clones hfbridos mediante crecimiento en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 complementado con suero de feto bovino al 20% y complemento HAT]. Tras dos semanas, se sustituyo el medio HAT por medio HT durante tres pases, seguido del retorno al medio de cultivo celular normal.
Los sobrenadantes de cultivo celular se sometieron a un cribado primario para anticuerpos de IgG especfficos de antfgeno tres semanas despues de la fusion. Se transfirieron los microcultivos con resultado positivos en el ensayo a placas de 24 pocillos para la propagacion. Tras someter a ensayo nuevamente, los cultivos seleccionados se clonaron y reclonaron utilizando la tecnica de dilucion limitante y se determinaron los isotipos (ver tambien (51) y (52)).
Pueden producirse anticuerpos mediante expresion fagica siguiendo el procedimiento siguiente:
se utilizaron las bibliotecas genicas de anticuerpos no expuestos humanos HAL7/8 para el aislamiento de dominios F variables de cadena sencilla (scFv) contra el peptido adrenomedulina. Las bibliotecas genicas de anticuerpo se cribaron con una estrategia selectiva que comprendfa la utilizacion de peptidos que contenfan una etiqueta de biotina unida mediante dos espaciadores diferentes a la secuencia del peptido adrenomedulina. Se utilizo una mezcla de rondas de seleccion utilizando antfgeno unido no especfficamente y antfgeno unido a la estreptavidina, con el fin de minimizar el fondo de agentes de union no especfficos. Los fagos eluidos de la tercera ronda de seleccion se utilizaron para la generacion de cepas de E. coli expresantes de scFv monoclonal. El sobrenadante del cultivo de dichas cepas clonales se utilizo directamente para un ensayo ELISA de antfgeno ((53) y (54)).
La humanizacion de los anticuerpos murinos puede llevarse a cabo siguiendo el procedimiento siguiente:
para la humanizacion de un anticuerpo de origen murino, se analiza la secuencia de anticuerpo para la interaccion estructural de las regiones marco (RM) con las regiones determinantes de complementariedad (RDC) y el antfgeno. Basandose en el modelaje estructural, se selecciona un RM apropiado de origen humano y las secuencias de RDC murinas se trasplantan en el RM humano. Pueden introducirse variaciones en la secuencia de aminoacidos de las RDC o de las RM para recuperar interacciones estructurales que resultaron anuladas por el cambio de especie para las secuencias de RM. Esta recuperacion de las interacciones estructurales puede conseguirse mediante un enfoque aleatorio utilizando bibliotecas de expresion fagica o mediante un enfoque dirigido guiado por el modelaje molecular (55).
Desarrollo de anticuerpos
Los presentes inventores desarrollaron anticuerpos monoclonales de raton de union a la parte N-terminal, de region intermedia y C-terminal de la ADM_h y se determinaron las constantes de afinidad de los mismos (Tabla 1).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Peptidos para la inmunizacion
Los peptidos fueron suministrados por JPT Peptide Technologies GmbH (Berlin, Alemania). Los peptidos se acoplaron a BSA utilizando el metodo de entrecruzamiento de Sulfo-SMCC. El procedimiento de entrecruzamiento se llevo a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher/Pierce).
Ejemplo 1
Generacion de anticuerpos y determinacion de las constantes de afinidad de los mismos
Se generaron los anticuerpos murinos con el metodo siguiente:
se inmunizo un raton Balb/c con 100 pg de conjugado de peptido-BSA los dfas 0 y 14 (emulsionados en 100 pl de adyuvante completo de Freund) y 50 pg los dfas 21 y 28 (en 100 pl de adyuvante incompleto de Freund). Tres dfas antes de llevar a cabo el experimento de fusion, el animal recibio 50 pg del conjugado disueltos en 100 pl de solucion salina, administrados en forma de una inyeccion intraperitoneal y una inyeccion intravenosa.
Los esplenocitos del raton inmunizado y de las celulas de la lfnea celular de mieloma SP2/0 se fusionaron con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 s a 37°C. Tras el lavado, las celulas se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Se seleccionaron clones hfbridos mediante cultivo en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 complementado con suero de feto bovino al 20% y complemento HAT]. Tras dos semanas, se sustituyo el medio HAT por medio HT durante tres pases, seguido del retorno a medio de cultivo celular normal.
Los sobrenadantes de cultivo celular se sometieron a cribado primario para los anticuerpos IgG especfficos de antfgeno tres semanas despues de la fusion. Los microcultivos con resultado positivo en el ensayo se transfirieron a placas de 24 pocillos para la propagacion. Tras someter a ensayo nuevamente, los cultivos seleccionados se clonaron y se reclonaron utilizando la tecnica de dilucion limitante y se determinaron los isotipos ((51) y (52)).
Tabla 1:
- Antfgeno/inmunogeno
- Region de la ADM Denominacion Constantes de afinidad, Kd (M'1)
- YRQSMNNFQGLRSFGC
- 1-16 NT-ADM 1,6 x 109
- CTVQKLAHQIYQ
- 21-32 MR-ADM 2 x 109
- CAPRSKISPQGY-NH2
- C-42-52 CT-ADM 1,1 x 109
Produccion de anticuerpos monoclonales
Se produjeron anticuerpos mediante metodos estandares de produccion de anticuerpos (56) y se purificaron mediante protefna A. Las purezas de los anticuerpos eran >95% segun el analisis de electroforesis en gel SDS.
Constantes de afinidad
Con el fin de determinar la afinidad de los anticuerpos para la adrenomedulina, se determino la cinetica de la union de la adrenomedulina a anticuerpos inmovilizados, mediante resonancia de plasmon superficial libre de marcaje utilizando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcore Europe GmbH, Freiburg, Alemania). Se llevo a cabo la inmovilizacion reversible de los anticuerpos utilizando un anticuerpo anti-Fc de raton acoplado covalentemente a alta densidad con la superficie de un sensor CM5 siguiendo las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpos de raton; GE Healthcare) (22).
Procedimiento de marcaje (marcador): se mezclaron 100 pg (100 pl) de anticuerpo (1 mg/ml en PBS, pH 7,4) con 10 pl de ester NHS de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) (57) y se incubaron durante 20 min. a temperatura ambiente. El CT-H marcado se purifico mediante HPLC de filtracion en gel en Bio-Sil® SEC 400-5 (BioRad Laboratories, Inc., USA). El anticuerpo marcado purificado se diluyo en 300 mmoles/l de fosfato de potasio, 100 mmoles/l de NaCl, 10 mmoles/l de Na-EDTA y 5 g/l de albumina de suero bovino, pH 7,0. La concentracion final era de aprox. 800.000 unidades relativas de luz (URL) de compuesto marcado (aprox. 20 ng de anticuerpo marcado) por cada 200 pl. Se midio la quimioluminiscencia del ester de acridinio mediante la utilizacion de un aparato AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Fase solida: se recubrieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 h a temperatura ambiente) con anticuerpo ((1,5 pg de anticuerpo/0,3 ml de NaCl 100 mmoles/l, TRIS/HCl 50 mmoles/l, pH 7,8). Tras el bloqueo con albumina de suero bovino al 5%, los tubos se lavaron con PBS, pH 7,4, y se secaron bajo vacfo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Calibradores:
Se diluyo linealmente ADM humana sintetica (Bachem, Suiza) utilizando Tris/HCl 50 mM, NaCI 250 mM, Triton X- 100 al 0,2%, BSA al 0,5%, 20 tab./l de proteasa (comprimidos de coctel inhibidor de proteasas completo (Roche AG)), pH 7,8. Los calibradores se almacenaron a -20°C hasta que fueron utilizados.
Ejemplo 2
Determinacion de la combinacion de anticuerpos que proporciona unas elevadas proporciones de senal/ruido Ensayo inmunologico de ADM h:
Se introdujeron mediante pipeteado 50 pl de muestra (o calibrador) en tubos recubiertos, y tras anadir anticuerpo secundario marcado (200 pl), los tubos se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. El marcador no unido se elimino mediante lavado 5 veces (1 ml cada lavado) con solucion de lavado (PBS 20 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1%).
Se midio la quimioluminiscencia unida a los tubos mediante la utilizacion de LB 953.
Todos los anticuerpos se utilizaron en un ensayo inmunologico de tipo sandwich, tubo recubierto y anticuerpo marcado, y se combinaron en las variaciones mostradas en la Tabla 2, posteriormente:
La incubacion se llevo a cabo tal como se ha indicado para el ensayo inmunologico de ADM_h. Los resultados se proporcionan como proporciones de senal especffica (con 10 ng/ml de ADM) / senal de fondo (muestra sin ADM).
Tabla 2:
- Proporcion senal/ruido
- Marcador NT-ADM Marcador MR-ADM Marcador CT-ADM
- NT-ADM
- / 195 241
- MR-ADM
- 204 / 904
- CT-ADM
- 260 871 /
Inesperadamente, se descubre que la combinacion de MR-ADM y CT-ADM como combinacion presenta la proporcion senal/ruido mas alta.
A continuacion, se utiliza dicha combinacion de anticuerpos para investigaciones posteriores. Se utiliza MR-ADM como anticuerpo de la fase solida y CT-ADM como el anticuerpo con marcaje. En la figura 1 se muestra la curva tfpica de dosis/senal. La sensibilidad analftica (media de 10 analisis, muestra sin ADM + 2SD) del ensayo fue de 2 pg de ADM/ml.
Ejemplo 3
Estabilidad de la adrenomedulina humana:
Se diluyo ADM en plasma-citrato humano (n=5, concentracion final: 10 ng de ADM/ml) y se incubo a 24°C. En los puntos temporales seleccionados se congelaron alfcuotas a -20°C. Inmediatamente despues de descongelar las muestras, se cuantifico la ADM_h mediante la utilizacion del ensayo inmunologico de ADM_h indicado anteriormente.
Tabla 3: estabilidad de la ADM_h en plasma humano a 24°C
- Tiempo (h)
- Recuperacion media de ADM (n=5) Perdida relativa de reactividad inmunitaria % de perdida de reactividad inmunitaria/h
- 0
- 100 / /
- 2
- 99,2 0,8 0,4
- 4
- 96,4 3,6 0,8
- 8
- 88,2 11,8 1,5
- Media: 0,9%h
Inesperadamente, utilizando las combinaciones de anticuerpo MR-ADM y CT-ADM en un ensayo inmunologico de tipo sandwich, la estabilidad preanalftica del analito resulto ser elevada (perdida media de reactividad inmunitaria de solo 0,9%/h). En contraste, utilizando otros metodos de ensayo, se informo de una semivida en plasma de solo 22 min. (Hinson, 2000). Debido a que el tiempo entre la extraccion de la muestra y el analisis hospitalario rutinario fue inferior a 2 h, el metodo de deteccion de ADM utilizado resulto adecuado para el diagnostico rutinario. Notablemente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
no resultaron necesarios aditivos no rutinarios para que las muestras (como aprotinina, (20)) alcanzasen estabilidades de reactividad inmunitaria con ADM aceptables.
Ejemplo 4
Reproducibilidad de las preparaciones de calibrador
Se descubrio una elevada variabilidad de los resultados en la preparacion de los calibradores para los ensayos de ADM (CV media de 8,5%; ver la Tabla 4). Esto podrfa deberse a una elevada adsorcion de la ADM_h a las superficies plasticas y de vidrio (ver tambien (58)). Dicho efecto solo se encontraba ligeramente reducido mediante la adicion de detergentes (Triton X-100 al 1% como maximo o Tween-20 al 1% como maximo), protefna (BSA al 5% como maximo) y fuerza ionica elevada (NaCl 1 M como maximo) o combinaciones de los mismos. Inesperadamente, en el caso de que se anada un exceso de anticuerpo anti-ADM (10 pg/ml) al tampon de dilucion del calibrador, la recuperacion y reproducibilidad de las preparaciones de calibrador de ensayo de aDm mejoro sustancialmente hasta <1% del CV entre preparaciones (Tabla 4).
Afortunadamente la presencia de anticuerpos N-terminales no afecto a la senal de ADM generada mediante la combinacion de los anticuerpos MR- y C-terminales (fig. 11).
Tabla 4:
- En presencia de anticuerpo de NT- ADM (10 pg/ml) CV entre preparaciones (%) Sin anticuerpo CV entre preparaciones (%)
- Calibrador
- 100 ng/ml
- 3.453 s/n-r 0,9 2.842 s/n-r 2,8
- 10 ng/ml
- 1.946 s/n-r 0,8 1.050 s/n-r 7,9
- 1 ng/ml
- 179 s/n-r 1,1 77 s/n-r 14,8
- Media: 0,93 Media: 8,5
- Variacion entre preparaciones de los calibradores.
Se prepararon calibradores del ensayo de ADM tal como se ha mencionado anteriormente con y sin 10 pg/ml de anticuerpo de NT-ADM. Se proporcionan los coeficientes de variacion de 5 preparaciones independientes. Se midieron los calibradores utilizando el ensayo de ADM indicado anteriormente. s/n-r=proporcion de senal a ruido.
Para todos los estudios siguientes, se utiliza un ensayo de ADM, basado en calibradores, preparado en presencia de 10 pg/ml de anticuerpo de NT-ADM y 10 pg/ml de anticuerpo de NT-ADM como complemento en el tampon del marcador.
Ejemplo 5
Sensibilidad
El objetivo de la sensibilidad del ensayo era cubrir por completo las concentraciones de ADM de los sujetos sanos. Concentracion de ADM en sujetos sanos:
Se midieron sujetos sanos (n=100, edad media: 56 anos) utilizando el ensayo de ADM. El valor de la mediana era de 24,7 pg/ml; el valor mfnimo era de 11 pg/ml y el percentil 99 era de 43 pg/ml. Debido a que la sensibilidad del ensayo era de 2 pg/ml, el 100% de los sujetos sanos eran detectables utilizando el ensayo de ADN descrito (ver la fig. 2).
Ejemplo 6
Estudio clinico
Un total de 101 pacientes de urgencias que satisfacfan la definicion de sepsis (59) fueron posteriormente hospitalizados (media de 5 dfas de hospitalizacion) y recibieron el tratamiento estandar de cuidados. Se genero plasma-EDTA desde el dfa 1 (presentacion en el servicio de urgencias) y una muestra cada dfa durante la estancia hospitalaria. El tiempo hasta la congelacion de las muestras para la posterior medicion de la ADM fue inferior a 4 h.
En la Tabla 5 se resumen las caracterfsticas de los pacientes.
Tabla 5:
Variable
Demoarafia Sexo - masculino
Edad - mediana [RIC]
Variables del examen
PS sistolica (mmHa) - mediana [RIC]
PS diastolica (mmHa) - mediana [RIC]
FC - mediana [RIC]
RR - mediana [RIC]
PAM (mmHa) - mediana [RIC]
Enfermedades concomitantes Cardiovascular - si Hipertension - si Diabetes - si Cancer - si
Variables de laboratorio rutinarias Cultivo sangufneo - si neaativo positivo
Eliminacion de la creatinina (ml/min) - mediana
[RIC]
Creatinina - mediana [RIC]
UREA - mediana [RIC]
GCS - mediana [RIC]
Pcr - mediana [RIC]
Gluco - mediana [RIC]
biliru - mediana [RIC]
GR - mediana [RIC]
GB - mediana [RIC]
PLT - mediana [RIC]
HCT - mediana [RIC]
Leuco/Neutr (%) - mediana [RIC]
HB - mediana [RIC]
Na - mediana [RIC]
K - mediana [RIC]
INR - mediana [RIC]
TC - mediana [RIC]
SAO2 - mediana [RIC]
todos (n=101)
60 (60) 78
[72-72]
115
[100-100]
65
[60-60]
100
[94-94]
24
[22-22]
83,3
[74-74]
26 (25,7) 47 (46,5) 35 (34,7) 13 (12,9)
31 (31) 15(16,3) 16(17,4)
48
[23,25-23,25]
1,3
[0,9-0,9]
36
[21-21]
15
[10-10]
16
[6,6-6,6]
113,5
[94,5-94,5]
0,9
[0,71-0,71]
3,8
[3,3-3,3] 12700 [67746774]
213
[150-150]
32
[28-28]
87
[80-80]
10.4
[9,47-9,47]
137 [134-134]
3,9 [3,5-3,5] 1,19 [1,1-1,1]
38.4 [36-36]
94
[90-90]
muertes
hospitalarias
(n=27)
13 (48)
77
[71,25-83]
120
[106,25-138,75]
65
[60-85]
100
[94-114,75]
24
[22-28]
83,3
[77,62-100,75]
9 (33,3)
13 (48,1)
9 (33,3)
3 (11,1)
5(19)
2(8)
3(12)
56
[29,25-80]
1,25
[0,9-2,08]
31.5
[20-53,25]
15
[12,5-15]
14.5
[6,7-23,7]
110
[95,5-144]
0,9
[0,7-1,03]
3,8
[3,2-4,3]
13100
[8115-17565]
217
[154,75-301]
31.5 [28-37]
86
[78,25-89,95]
10,15
[9,3-12,4]
137 [133-141]
3,9 [3,6-4,3] 1,19 [1,1-1,4]
38.5
[38,12-38,7]
95
[90,25-97]
Datos de alta (n=74)
47 (64)
80
[75-84,5]
105
[80-120]
60
[50-70]
100
[93,5-107,5]
26
[24-28]
81,6
[63,5-89]
17 (23)
34 (45,9)
26 (35,1)
10 (13,5)
26 (35)
13 (19,4)
13 (19,4)
31,5
[14,75-66]
1,8
[1-3,15]
51
[42-87]
8
[8-11]
17,35
[6,6-28,05]
128
[94-160,5]
0,91
[0,77-1,18]
3,7
[3,4-4,2]
11920
[25,55-18790]
185
[130-236,5]
34
[31,25-39,5]
91
[87-93,05] 10,85 [9,9-12,67] 139 [134144,5]
3,9[3,3-5,1] 1,18
[1,04-1,36]
36
[35,55-38,5]
93
[88,5-95,5]
Valor de p
0,163
0,142
0,001
0,002
0,407
0,069
0,026
0,311
1,000
1,000
1,000
0,246
0,043
0,080
0,004
<0,001
0,846
0,400
0,534
0,684
0,343
0,113
0,149
0,001
0,220
0,204
0,982
0,731
<0,001
0,119
5
10
15
20
25
30
35
pH - mediana [RIC]
PO2 - mediana [RIC]
PCO2 - mediana [RIC]
Lact - mediana [RIC]
Bic - mediana [RIC]
FiO2 (%) - mediana [RIC] otros
Disfuncion organica aguda - si
Puntuacion Apache (%) - mediana [RIC]
Dias hospitalizado - mediana [RIC] Tratamiento en la lfnea base
Diuresis (cc) - mediana [RIC]
Esteroides - si Vasopresores - si Antibioticos - si Terapia de fluidos - si Nuevo biomarcador
ADM (pg/mL) - mediana [RIC]
- 7,45
- 7,46 7,4 <0,001
- [7,38-7,38]
- [7,4-7,5] [7,24-7,4]
- 67 [56-56]
- 66,5 [56-78] 67 [56,5-79,5] 0,806
- 36 [32-32]
- 37,5 [33-43,75] 34 [30-41] 0,245
- 1,5 [1-1]
- 1,3 [0,83-1,9] 2,5 [1,4-4,15] <0,001
- 23,5
- 24,25 21 0,001
- [21-21]
- [21,43-28] [17,35-23,25]
- 21 [21-21]
- 21 [21-23,25] 24 [21-45] <0,001
- 39 (43,3)
- 16 (64) 23(35,4) 0,021
- 19
- 14,65 32 <0,001
- [12,5-12,5]
- [12,12-20,38] [20-39]
- 5 [2-2]
- 6 [4-7] 2 [1-6] 0,003
- 900
- 1000 450 <0,001
- [600-600]
- [700-1200] [200-1025]
- 16(15,8)
- 4(14,8) 12(16,2) 1,000
- 18(17,8)
- 13 (48,1) 5 (6,8) <0,001
- 101(100)
- 27 (100) 74 (100) 1,000
- 101(100)
- 27 (100) 74 (100) 1,000
- 53,8
- 93,9 50,1 <0,001
- [37,4-94,0]
- [48,7-241] [32,2-77,8]
El 26,7% de todos los pacientes murieron durante la estancia hospitalaria y se contaron como no respondedores al tratamiento. El 73,3% de todos los pacientes sobrevivieron a la sepsis y se contaron como respondedores al tratamiento.
El 66% de todos los pacientes que presentaron con sepsis presentaban un valor de ADN no normal >43 pg/ml (percentil 99), indicando que ADM no es un marcador de la infeccion.
Resultados del estudio clfnico
La ADM inicial es altamente pronostica.
Se correlaciono el valor inicial de ADM con la mortalidad hospitalaria y compararon la ADM con la puntuacion de sepsis APACHE 2 (ver (60)). La ADM es altamente pronostica del resultado de la sepsis (ver la fig. 3) y comparable a la puntuacion APACHE 2. Se anade informacion significativa en el caso de que se combine ADM y APACHE 2 (fig. 4).
ADN en el seguimiento del tratamiento.
Los pacientes se trataron basandose en el tratamiento estandar de cuidados (Tabla 5). El tiempo medio de hospitalizacion fue de 5 dfas. Se midio la ADM cada dfa en el hospital (dfa 1=admision) y se correlaciono con la mortalidad hospitalaria (Tabla 6). La ADM cambio durante la estancia hospitalaria y el cambio durante el tiempo mejoro el valor pronostico en 52% desde una Chi2 inicial de 19,2 a 29,2 el dfa 5.
Utilizando un modelo simple de corte en 70 pg/ml de ADM se observo un riesgo de muerte de 68% para los pacientes con concentraciones iniciales de ADM >70 pg/ml y que permanecieron durante toda la estancia hospitalaria con concentraciones >70 pg/ml (no respondedores al tratamiento). Los pacientes que presentaron todo el tiempo un valor de ADM <70 pg/ml o que se desarrollo de >70 pg/ml a <70 pg/ml presentaron una mortalidad de solo 11% (bien tratados/respondedor al tratamiento) y los pacientes que presentaban valores de ADM >70 pg/ml y que redujeron su concentracion de ADN durante el tratamiento hospitalario a valores <70 pg/ml presentaron una mortalidad de 0%. Ningun paciente cambio de concentraciones <70 pg/ml a >70 pg/ml durante el tratamiento hospitalario. El tiempo medio necesario para generar informacion de respondedor/no respondedor para todos los pacientes fue de aproximadamente 1 dfa. Los pacientes de >70 pg/ml que respondieron al tratamiento durante la estancia hospitalaria necesitaron aproximadamente 2 dfas para indicar el exito del tratamiento a traves de la ADM.
Tabla 6
- Pacientes con todos los dfas >70 pg/ml Pacientes con todos los dfas <70 pg/ml Pacientes que cambiaron de >70 pg/ml a <70 pg/ml
- n
- 28/101 (27,7%) 73/101 (72,3%) 15/73 (20,5%)
- Mortalidad
- 68% 11% 0%
- Promedio de dfas tras la
- 1 dfa 1,2 dfas 2,2 dfas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
- hospitalizacion de ADM>70 pg/ml a aDm<70 pg/ml o ningun cambio
Literatura
(1) Kitamura, K., et al., "Adrenomedullin: A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma", Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 192 (2), pp. 553-560 (1993).
(2) Editorial, Takahashi, K., "Adrenomedullin: from a pheochromocytoma to the eyes", Peptides, Vol. 22, p. 1691 (2001).
(3) Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol. 22, pp. 1693-1711 (2001).
(4) Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, Vol. 21(2), pp. 138167 (2000).
(5) Kitamura, K., et al., "The intermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma", Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 244(2), pp. 551-555 (1998). Abstract Only.
(6) Pio, R., et al., "Complement Factor H is a Serum-binding Protein for Adrenomedulli, and the Resulting Complex Modulates the Bioactivities of Both Partners", The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276(15), pp. 12292-12300 (2001).
(7) Kuwasako, K., et al., "Purification and characterization of PAMP-12 (PAMP-20) in porcine adrenal medulla as a major endogenous biologically active peptide", FEBS Lett, Vol. 414(1), pp. 105-110 (1997). Abstract Only.
(8) Kuwasaki, K., et al., "Increased plasma proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in patients with essential hypertension", Ann. Clin. Biochem., Vol. 36 (Pt. 5), pp. 622-628 (1999). Abstract Only.
(9) Tsuruda, T., et al., "Secretion of proadrenomedullin N-terminal20 peptide from cultured neonatal rat cardiac cells", Life Sci., Vol. 69(2), pp. 239-245 (2001). Abstract Only.
(10) EP 0 622 458 A2
(11) Hirata, et al., "Increased Circulating Adrenomedullin, a Novel Vasodilatory Peptide, in Sepsis", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 81(4), pp. 1449-1453 (1996).
(12) Ehlenz, K., et al., "High levels of circulating adrenomedullin in severe illness: Correlation with C-reactive protein and evidence against the adrenal medulla as site of origin", Exp Clin Endocrinol Diabetes, Vol. 105, pp. 156-162 (1997).
(13) Tomoda, Y., et al., "regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells", Peptides, Vol. 22, pp. 1783-1794 (2001).
(14) Ueda, S., et al, "Increased Plasma Levels of Adrenomedullin in Patients with Systemic Inflammatory Response Syndrome", Am. J. Respir. Crit. Care Med., Vol. 160, pp. 132-136(1999).
(15) Wang, P., "Andrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, Vol. 22, pp. 1835-1840 (2001).
(16) Wang 1998
(17) Wang 1998 Arch Surg, Itoh, 2007
(18) Parlapiano, C., et al.; "Adrenomedulin assay and its clinical significance", European Review for Medical and Pharmacological Sciences, 1999; 3:53-61
(19) Hirata 2007
(20) Ohta 1999
(21) Kitamura 1994
(22) Lorenz et al.," Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy"; Antimicrob Agents Chemother. 2011 January; 55(1): 165173.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(23) The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005), ISBN-13: 9780080445267; Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb;10(1):4-10. PMID: 16376134
(24) Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe- Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol.15, p. 518-562.
(25) Schuetz P, et al. PCT follow up measurement for monitoring antibiotic treatment success; 8Cochrane Database Syst Rev. 2012 Sep 12;9:CD007498. Procalcitonin to initiate or discontinue antibiotics in acute respiratory tract infections.
(26) Christ-Crain M, et al. "Procalcitonin guidance of antibiotic therapy in community-acquired pneumonia: a randomized trial" Am J Respir Crit Care Med. 2006 Jul 1; 174(1 ):84-93. Epub 2006 Apr 7.
(27) Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105,1987;
(28) Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988;
(29) Bird et al., Science 242:423-426, 1988;
(30) Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed., 1984;
(31) Hunkapiller and Hood, Nature 323:15-16,1986)
(32) E. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983
(33) Patente U.S. n°. 5.807.715.
(34) Patente U.S. n° 5.585.089.
(35) Dower et al., publicacion de patente PCT n° WO91/17271;
(36) McCafferty et al., publicacion de patente PCT n° WO921001047;
(37) Winter, publicacion de patente PCT n° WO92/20791
(38) Lonberg et al., publicacion de patente PCT n° WO93/12227; and
(39) Kucherlapati, publicacion de patente PCT n° WO91/10741,
(40) US 2010/0028995
(41) EP 1266 025;
(42) WO 2011/154420
(43) WO 2011/073214
(44) US 2004/0023334
(45) EP 2231860
(46) WO 2010/060748
(47) EP 2314308
(48) WO 2011/023685
(49) WO 2005/040229
(50) EP 1941867
(51) Lane, R.D. (1985). A short-duration polyethylene glycol fiasion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol. Meth. 81: 223-228;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(52) Ziegler, B. et al. (1996) Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies, Horm. Metab. Res. 28: 11-15).
(53) Hust, M., et al 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170;
(54) Schutte, M., et al. 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625)
(55) Almagro JC, Fransson J., 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-33.
(56) Marx et al., Monoclonal Antibody Prodcution, ATLA 25, 121, 1997
(57) EP 0 353 971
(58) Lewis, L., et al., "Adrenomedullin (I-52) measured in human plasma by radioimmunoassay: plasma concentration, adsorption, and storage", Clinical Chemistry, Vol. 44(3), pp. 571-577 (1998).
(59) Crit Care Med. 2008 Jan; 36(1):296-327.
(60) Knaus et al., 1985, 2001.
Descripcion de las figuras
Figura 1: representa una curva tfpica de dosis-respuesta de ADM_h utilizando MR-ADM como anticuerpo de fase solida y CT-ADM como anticuerpo marcado.
Figura 2: se midieron sujetos sanos (n=100, edad media: 56 anos) utilizando el ensayo de ADM. El valor de la mediana era de 24,7 pg/ml, el valor mfnimo era de 11 pg/ml y el percentil 99 era de 43 pg/ml. Debido a que la sensibilidad del ensayo era de 2 pg/ml, el 100% de todos los sujetos sanos era detectable utilizando el ensayo de ADM descrito.
Figura 3: prediccion de la mortalidad hospitalaria. Resultados de la regresion logfstica.
Figura 4: prediccion de la mortalidad hospitalaria. ADM era independiente de Apache y proporciona informacion pronostica adicional.
Figuras 5 y 10: cinetica de la ADM de pacientes individuales.
Figuras 5 y 6: supervivientes, la ADM era <70 pg/ml en la presentacion en urgencias (dfa 1) y durante la estancia hospitalaria. La ADM indicaba un buen tratamiento del paciente.
Figuras 7 y 8: supervivientes, la ADM era superior a 70 pg/ml en la presentacion en urgencias (dfa 1) y se redujo durante el tratamiento hospitalario hasta valores inferiores a 70 pg/ml (respondedores al tratamiento).
Figuras 9 y 10: pacientes fallecidos, la ADM era superior a 70 pg/ml en la presentacion en urgencias (dfa 1) y no se redujo a valores inferiores a 70 pg/ml durante el tratamiento hospitalario (no respondedores al tratamiento).
Figura 11: ensayo de ADM en presencia y en ausencia de anticuerpos N-terminales
Se llevo a cabo el ensayo de ADM tal como se ha indicado anteriormente. A) Curva de referencia, B) en presencia de anticuerpo NT-ADM (10 pg/ml, 3,33 pg/ensayo). La adicion de anticuerpo NT-ADM no influyo sobre el ensayo de ADM.
Secuencias
SEC ID n° 1: ADM 21-52
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-CONH2 SEC ID n° 2: ADM 21-52-Gly CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYG SEC ID n° 3: PreProADM
MKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTGLA
DVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCT
VQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPA
PPSGSAPHFL
SEC ID n° 4: ADM 1-52 5
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-CONH2 SEC ID n° 5: ADM 1-52-Gly
10 YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYG
SEC ID n° 6: ADM 21-32
CTVQKLAHQIYQ
15
SEC ID n° 7: ADM 42-52 APRSKISPQGY
20 SEC ID n° 8: ADM 1-16-Gly (aminoacido)
YRQSMNNFQGLRSFGC
Claims (28)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes que se sospecha que presentan sepsis en el que la concentracion de adrenomedulina madura (ADM) (1-52-amida) y/o ADM 1-52-Gly madura en una muestra de lfquido corporal de dicho paciente septico se determina utilizando un ensayo que comprende dos agentes de union que se seleccionan de entre el grupo que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina y un fragmento de anticuerpo anti- ADM que se unen a la ADM y que se unen a dos regiones diferentes dentro de la region de la adrenomedulina (21- 52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras, es decir, aminoacido 21-52-amida (SEC ID n° 1) o aminoacido 21-52- Gly (SEC ID n° 2), respectivamente, en el que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoacidos.
- 2. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun la reivindicacion 1, en el que unode dichos agentes de union se une a una region comprendida dentro de la secuencia siguiente de la ADM (1-52-amida) madura y/o la ADM 1-52-Gly madura (SEC ID n° 4) y en el que dicho segundo de estos agentes de union seune a una region comprendida dentro de la secuencia siguiente de la ADM (1-52-amida) madura y/o la ADM 1-52- Gly madura (SEC ID n° 5).
- 3. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun la reivindicacion 1 o 2, en el que lasensibilidad de ensayo de dicho ensayo puede cuantificar la ADM de los sujetos sanos y es <10 pg/ml,preferentemente <40 pg/ml y mas preferentemente <70 pg/ml.
- 4. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho agente de union presenta una afinidad de union a la ADM (1-52-amida) madura y/o la ADM 1-52- Gly madura de por lo menos 107 M-1.
- 5. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho ensayo es un ensayo de tipo sandwich, preferentemente un ensayo automatizado completamente.
- 6. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que se marca por lo menos uno de dichos dos agentes de union con el fin de ser detectado.
- 7. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que por lo menos uno de dichos dos agentes de union se une a una fase solida.
- 8. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun la reivindicacion 6 en el que dicho marcador se selecciona de entre el grupo que comprende un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimatico, un marcador fluorescente y un marcador de yodo radioactivo.
- 9. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la concentracion de la ADM (1-52-amida) madura y/o ADM 1-52-Gly madura medida en la muestra se encuentra en el intervalo entre 10 y 500 pg/ml.
- 10. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que se aplica un umbral por el que un valor un valor superior al umbral es indicativo de un paciente que no responde o responde mal a la terapia y mientras que un valor inferior a dicho umbral es indicativo de un paciente que responde a la terapia.
- 11. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que se aplica un umbral de 60 a 80 pg/ml, preferentemente 70 pg/ml.
- 12. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que dicha muestra se selecciona de entre el grupo que comprende plasma citrato, plasma heparina, plasma EDTA y sangre completa humanos.
- 13. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun la reivindicacion 12 en el que dicha muestra tomada se mide directamente sin ninguna preparacion de la muestra adicional.
- 14. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que dicho metodo se lleva a cabo en un dispositivo automatizado completamente.
- 15. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en el que se determina la ADM (1-52-amida) madura y/o la ADM 1-52-Gly madura en por lo menos dos muestras, en el que dichas muestras se toman en diferentes puntos temporales de dichos pacientes septicos.
- 16. Metodo in vitro para el seguimiento de la terapia en pacientes septicos segun cualquiera de las reivindicaciones 15101520253035404550556065a 15 en el que el volumen de muestra medido es inferior o igual a 50 pi.
- 17. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra que comprende dos agentes de union que se seleccionan de entre el grupo que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina y un fragmento de anticuerpo anti-ADM que se unen a ADM y que se unen a dos regiones diferentes dentro de la region de la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras, es decir aminoacido 21-52-amida SEC ID n° 1 o aminoacido 21-52-Gly de la adrenomedulina madura SEC ID n° 2, respectivamente, en el que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoacidos y en el que dicho ensayo no es un ensayo manual de tipo sandwich de tubo recubierto-ester de acridinio.
- 18. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra que comprende dos agentes de union que se seleccionan de entre el grupo que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina y un fragmento de anticuerpo anti-ADM que se unen a aDm y que se unen a dos regiones diferentes dentro de la region de la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras, es decir aminoacido 21-52-amida (SEC ID n° 1) o aminoacido 21-52-Gly de la adrenomedulina madura (SEC ID n° 2), respectivamente, en el que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoacidos y en el que dicho ensayo es un ensayo manual de tipo sandwich de tubo recubierto-ester de acridinio y en el que uno de dichos agentes de union es un anticuerpo que se une a la SEC ID n° 6 CTVQKLAHQIYQ, y en el que el segundo de dichos agentes de union es un anticuerpo que se une a la SEC ID n° 7 APRSKISPQGY en la que el acido carboxflico es sustituido por un grupo amida (APRSKISPQGY-CO-NH2).
- 19. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra segun la reivindicacion 17, en el que uno de dichos agentes de union se une a una region comprendida dentro de la secuencia siguiente de la ADM 1-52-Gly madura (SEC ID n° 4) y en el que dicho segundo de estos agentes de union se une a una region comprendida dentro de la secuencia siguiente de la ADM (1-52-amida) madura y/o la ADM 1-52-Gly madura (SEC ID n° 5).
- 20. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la sensibilidad de ensayo de dicho ensayo puede cuantificar la ADM de los sujetos sanos y es <10 pg/ml, preferentemente <40 pg/ml y mas preferentemente <70 pg/ml.
- 21. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que dicho agente de union presenta una afinidad de union para la adrenomedulina de por lo menos 107 M-1.
- 22. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que dicho ensayo es un ensayo de tipo sandwich, preferentemente un ensayo automatizado completamente.
- 23. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que por lo menos uno de dichos agentes de union se marca con el fin de ser detectado.
- 24. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que por lo menos uno de dichos dos agentes de union se une a una fase solida.
- 25. Ensayo para determinar la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras en una muestra segun la reivindicacion 23, en el que dicho marcador se selecciona de entre el grupo que comprende marcador quimioluminiscente, marcador enzimatico, marcador fluorescente, marcador de yodo radioactivo.
- 26. Kit que comprende un ensayo segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, en el que los componentes de dicho ensayo pueden estar comprendidos en uno o mas recipientes.
- 27. Metodo de calibracion de un ensayo segun la reivindicacion 17, en el que se utiliza un agente de union que se une a una region de por lo menos 5 aminoacidos dentro de los aminoacidos 1-16 (SEC ID n° 8) de la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras, en el que dicho agente de union se selecciona de entre el grupo que comprende un anticuerpo anti-ADM y un fragmento de anticuerpo anti-ADM.
- 28. Metodo de calibracion de un ensayo segun la reivindicacion 27, en el que el agente de union reconoce y se une al extremo N-terminal de la adrenomedulina (1-52-amida) y/o la adrenomedulina-Gly maduras, en el que dicho agente de union se selecciona de entre el grupo que comprende un anticuerpo anti-ADM y un fragmento de anticuerpo anti-ADM.
Applications Claiming Priority (23)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP11189452 | 2011-11-16 | ||
| EP11189452 | 2011-11-16 | ||
| EP11189450 | 2011-11-16 | ||
| EP11189447 | 2011-11-16 | ||
| EP11189450 | 2011-11-16 | ||
| EP11189448 | 2011-11-16 | ||
| EP11189449 | 2011-11-16 | ||
| EP11189448 | 2011-11-16 | ||
| EP11189449 | 2011-11-16 | ||
| EP11189447 | 2011-11-16 | ||
| EP12160017 | 2012-03-16 | ||
| EP12160017 | 2012-03-16 | ||
| EP12160018 | 2012-03-16 | ||
| EP12160016 | 2012-03-16 | ||
| EP12160014 | 2012-03-16 | ||
| EP12160016 | 2012-03-16 | ||
| EP12160015 | 2012-03-16 | ||
| EP12160018 | 2012-03-16 | ||
| EP12160014 | 2012-03-16 | ||
| EP12160015 | 2012-03-16 | ||
| EP12186449 | 2012-09-27 | ||
| EP12186449 | 2012-09-27 | ||
| PCT/EP2012/072928 WO2013072509A1 (en) | 2011-11-16 | 2012-11-16 | Adrenomedullin assays and methods for determining mature adrenomedullin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2617211T3 true ES2617211T3 (es) | 2017-06-15 |
Family
ID=47148677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES12791143.6T Active ES2617211T3 (es) | 2011-11-16 | 2012-11-16 | Ensayos de adrenomedulina y métodos para determinar la adrenomedulina madura |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9304127B2 (es) |
| EP (1) | EP2780717B1 (es) |
| JP (1) | JP6336911B2 (es) |
| CN (1) | CN104067130B (es) |
| DK (1) | DK2780717T3 (es) |
| ES (1) | ES2617211T3 (es) |
| HK (1) | HK1202624A1 (es) |
| HR (1) | HRP20170427T1 (es) |
| HU (1) | HUE032648T2 (es) |
| MY (5) | MY174877A (es) |
| PL (1) | PL2780717T3 (es) |
| PT (1) | PT2780717T (es) |
| RS (1) | RS55804B1 (es) |
| RU (1) | RU2657517C2 (es) |
| SI (1) | SI2780717T1 (es) |
| WO (1) | WO2013072509A1 (es) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110470771A (zh) * | 2019-09-05 | 2019-11-19 | 清华大学 | 一种评价转基因植物食用安全性的方法 |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT2780371T (pt) | 2011-11-16 | 2019-01-30 | Adrenomed Ag | Anticorpo anti-adrenomedulina (adm) ou fragmento de anticorpo anti-adm ou uma estrutura não ig anti-adm para a regulação do equilíbrio de fluidos num doente com uma doença aguda ou crónica |
| NZ624873A (en) | 2011-11-16 | 2016-07-29 | Adrenomed Ag | Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for prevention or reduction of organ dysfunction or organ failure in a patient having a chronic or acute disease or acute condition |
| JP6224608B2 (ja) | 2011-11-16 | 2017-11-01 | アドレノメト アクチェンゲゼルシャフト | 血液循環を安定化させるための、患者の急性疾患又は急性病態の治療法における使用に向けた、抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体、抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇ足場 |
| KR101548284B1 (ko) * | 2014-05-23 | 2015-08-28 | 주식회사 나노엔텍 | 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출키트 |
| EP3380845A1 (en) * | 2015-11-27 | 2018-10-03 | B.R.A.H.M.S GmbH | MR-proADM AS MARKER FOR THE EXTRACELLULAR VOLUME STATUS OF A SUBJECT |
| WO2018029213A1 (en) * | 2016-08-09 | 2018-02-15 | B.R.A.H.M.S Gmbh | Histones and/or proadm as markers indicating organ dysfunction |
| EP3309550A1 (en) * | 2016-10-12 | 2018-04-18 | sphingotec GmbH | Method for the detection of apolipoprotein e4 |
| WO2018109228A1 (en) * | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Adrenomed Ag | Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for use in intervention and therapy of congestion in a patient in need thereof |
| JP6862963B2 (ja) * | 2017-03-17 | 2021-04-21 | 東ソー株式会社 | ペプチドの吸着抑制剤 |
| JP7270912B2 (ja) * | 2017-05-22 | 2023-05-11 | 東ソー株式会社 | アドレノメデュリン濃度変動による予後予測の情報提供方法及びその試薬 |
| CN111065922A (zh) * | 2017-09-13 | 2020-04-24 | B.R.A.H.M.S有限公司 | 肾上腺髓质素原作为危重病患者的肾脏替代治疗的指标 |
| WO2019057992A2 (en) * | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Adrenomed Ag | ANTI-ADRENOMEDULIN (ADM) BINDER FOR USE IN TREATING OR PREVENTING THE SYMPTOMS OF A DISEASE |
| WO2019077082A1 (en) | 2017-10-18 | 2019-04-25 | Adrenomed Ag | SURVEILLANCE OF THERAPY UNDER TREATMENT WITH ANTI-ADRENOMEDULIN BINDER (ADM) |
| KR20200135947A (ko) * | 2018-02-08 | 2020-12-04 | 스핑고텍 게엠베하 | 치매의 진단 및/또는 예측을 위한 아드레노메둘린 (adm) 및 치매의 요법 또는 예방에 사용하기 위한 항-아드레노메둘린 결합제 |
| CN111770935A (zh) * | 2018-02-27 | 2020-10-13 | 株式会社岛津制作所 | 特异性识别APP669-x的N末端的抗体及免疫测定法 |
| WO2019167128A1 (ja) * | 2018-02-27 | 2019-09-06 | 株式会社 島津製作所 | サンドイッチ型免疫測定法 |
| EP3608673A1 (en) * | 2018-08-08 | 2020-02-12 | B.R.A.H.M.S GmbH | Pro-adm for prognosing the risk of a medical condition requiring hospitalization in patients with symptoms of infectious disease |
| CN113597429A (zh) * | 2019-03-01 | 2021-11-02 | 株式会社岛津制作所 | App669-711测定方法及测定用试剂盒 |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
| AU634716B2 (en) | 1988-08-01 | 1993-03-04 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Method for detection of an analyte using acridinium esters and liposomes |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| EP0463151B1 (en) | 1990-01-12 | 1996-06-12 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
| AU665190B2 (en) | 1990-07-10 | 1995-12-21 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| AU3328493A (en) | 1991-12-17 | 1993-07-19 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| JP2774769B2 (ja) * | 1993-04-26 | 1998-07-09 | 賢治 寒川 | アドレノメデュリン |
| CA2229741C (en) | 1995-08-18 | 2012-05-08 | The Government Of The United States Of America | Functional role of adrenomedullin (am) and the gene-related product (pamp) in human pathology and physiology |
| CA2242308A1 (en) | 1997-12-08 | 1999-06-08 | Smithkline Beecham Laboratoires Pharmaceutiques | Novel compounds |
| DE19847690A1 (de) | 1998-10-15 | 2000-04-20 | Brahms Diagnostica Gmbh | Verfahren und Substanzen für die Diagnose und Therapie von Sepsis und sepsisähnlichen systemischen Infektionen |
| US6818418B1 (en) | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
| PT1214600E (pt) | 1999-09-10 | 2006-05-31 | Us Gov Health & Human Serv | Determinacao de proteinas de ligacao a adrenomedulina |
| ATE458199T1 (de) | 2001-05-04 | 2010-03-15 | Biosite Inc | Diagnostische marker der akuten koronaren syndrome und ihre verwendungen |
| RU2209071C2 (ru) * | 2001-08-08 | 2003-07-27 | Ростовский НИИ акушерства и педиатрии | Способ лечения сепсиса у детей |
| BR0212256A (pt) | 2001-08-30 | 2004-08-31 | Biorexis Pharmaceutical Corp | Proteìnas de fusão de transferrina modificadas |
| US6864237B2 (en) | 2002-05-17 | 2005-03-08 | Ping Wang | Treatment of shock using adrenomedullin and adrenomedullin binding protein-1 |
| CA2488558C (en) | 2002-06-07 | 2013-08-20 | Dyax Corp. | Prevention and reduction of blood loss |
| DE10316583A1 (de) * | 2003-04-10 | 2004-10-28 | B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft | Bestimmung eines midregionalen Proadrenomedullin-Teilpeptids in biologischen Flüssigkeiten zu diagnostischen Zwecken, sowie Immunoassays für die Durchführung einer solchen Bestimmung |
| US20070082363A1 (en) | 2003-04-25 | 2007-04-12 | Lydie Bougueleret | Secreted polypeptide species reduced cardiovascular disorders |
| US6884781B2 (en) | 2003-05-16 | 2005-04-26 | Ping Wang | Treatment of shock using adrenomedullin binding protein-1 |
| WO2005033327A2 (en) * | 2003-09-29 | 2005-04-14 | Biosite Incorporated | Methods and compositions for the diagnosis of sepsis |
| EP1675878A2 (en) | 2003-10-24 | 2006-07-05 | Avidia, Inc. | Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers |
| US20100028995A1 (en) | 2004-02-23 | 2010-02-04 | Anaphore, Inc. | Tetranectin Trimerizing Polypeptides |
| WO2006027147A2 (en) | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with adrenomedullin receptor (amdr) |
| CA2580881A1 (en) | 2004-09-21 | 2006-03-30 | Nascacell Technologies Ag | Use of microproteins as tryptase inhibitors |
| JP4976412B2 (ja) | 2005-12-01 | 2012-07-18 | ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・ゲーエムベーハー | エンドセリン、エンドセリンアゴニスト及びアドレノメジュリンアンタゴニストによる危篤患者の診断及び治療のための方法 |
| US7993832B2 (en) * | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| ES2373832T3 (es) | 2007-12-19 | 2012-02-09 | Affibody Ab | Polipéptido derivado de proteína a y capaz de unirse a pdgf. |
| KR101698362B1 (ko) | 2008-11-03 | 2017-01-20 | 몰리큘라 파트너스 아게 | Ｖｅｇｆ－ａ 수용체 상호작용을 억제하는 결합 단백질 |
| NZ598351A (en) | 2009-08-27 | 2014-08-29 | Covagen Ag | Il-17 binding compounds and medical uses thereof |
| BR112012014194A2 (pt) | 2009-12-14 | 2017-01-10 | Scil Proteins Gmbh | um método para identificar proteínas ubiquitinas modificadas hetero-multiméricas com capacidade de ligação a ligandos |
| DE102010040035A1 (de) | 2010-03-04 | 2011-09-08 | Robert Bosch Gmbh | Verbesserungen der Rückwärts-Analyse zur Bestimmung von Fehlermaskierungsfaktoren |
| PL2580236T3 (pl) | 2010-06-08 | 2019-09-30 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Muteiny lipokaliny łez wiążące IL-4 R alfa |
| FR2964103B1 (fr) * | 2010-08-30 | 2018-11-23 | Universite D'aix-Marseille | Anticorps se liant a l'adrenomedulline et aux recepteurs de l'adrenomedulline et leurs utilisations comme medicament |
-
2012
- 2012-11-16 SI SI201230877A patent/SI2780717T1/sl unknown
- 2012-11-16 EP EP12791143.6A patent/EP2780717B1/en active Active
- 2012-11-16 MY MYPI2014001420A patent/MY174877A/en unknown
- 2012-11-16 PL PL12791143T patent/PL2780717T3/pl unknown
- 2012-11-16 JP JP2014541693A patent/JP6336911B2/ja active Active
- 2012-11-16 ES ES12791143.6T patent/ES2617211T3/es active Active
- 2012-11-16 DK DK12791143.6T patent/DK2780717T3/en active
- 2012-11-16 MY MYPI2014001418A patent/MY178654A/en unknown
- 2012-11-16 MY MYPI2014001421A patent/MY175997A/en unknown
- 2012-11-16 HU HUE12791143A patent/HUE032648T2/en unknown
- 2012-11-16 US US13/679,294 patent/US9304127B2/en active Active
- 2012-11-16 RS RS20170258A patent/RS55804B1/sr unknown
- 2012-11-16 CN CN201280066354.5A patent/CN104067130B/zh active Active
- 2012-11-16 MY MYPI2014001422A patent/MY192113A/en unknown
- 2012-11-16 RU RU2014123987A patent/RU2657517C2/ru active
- 2012-11-16 WO PCT/EP2012/072928 patent/WO2013072509A1/en active Application Filing
- 2012-11-16 PT PT127911436T patent/PT2780717T/pt unknown
- 2012-11-16 US US13/679,281 patent/US9140696B2/en active Active
- 2012-11-16 MY MYPI2014001423A patent/MY174894A/en unknown
- 2012-11-16 US US14/358,147 patent/US9535060B2/en active Active
-
2015
- 2015-03-24 HK HK15102988.3A patent/HK1202624A1/xx unknown
-
2017
- 2017-03-16 HR HRP20170427TT patent/HRP20170427T1/hr unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110470771A (zh) * | 2019-09-05 | 2019-11-19 | 清华大学 | 一种评价转基因植物食用安全性的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104067130B (zh) | 2017-02-22 |
| EP2780717A1 (en) | 2014-09-24 |
| RU2014123987A (ru) | 2015-12-27 |
| PL2780717T3 (pl) | 2017-06-30 |
| MY174877A (en) | 2020-05-20 |
| US20130195874A1 (en) | 2013-08-01 |
| MY192113A (en) | 2022-07-28 |
| RS55804B1 (sr) | 2017-08-31 |
| JP6336911B2 (ja) | 2018-06-06 |
| HK1202624A1 (en) | 2015-10-02 |
| HRP20170427T1 (hr) | 2017-06-16 |
| JP2014533827A (ja) | 2014-12-15 |
| EP2780717B1 (en) | 2016-12-21 |
| US20140322824A1 (en) | 2014-10-30 |
| MY178654A (en) | 2020-10-20 |
| DK2780717T3 (en) | 2017-02-13 |
| US9535060B2 (en) | 2017-01-03 |
| PT2780717T (pt) | 2017-02-16 |
| MY175997A (en) | 2020-07-20 |
| WO2013072509A1 (en) | 2013-05-23 |
| SI2780717T1 (sl) | 2017-05-31 |
| CN104067130A (zh) | 2014-09-24 |
| US20130195875A1 (en) | 2013-08-01 |
| RU2657517C2 (ru) | 2018-06-14 |
| US9140696B2 (en) | 2015-09-22 |
| HUE032648T2 (en) | 2017-10-30 |
| MY174894A (en) | 2020-05-20 |
| US9304127B2 (en) | 2016-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2617211T3 (es) | Ensayos de adrenomedulina y métodos para determinar la adrenomedulina madura | |
| US20200249246A1 (en) | Adrenomedullin to guide therapy of blood pressure decline | |
| US20240085438A1 (en) | Adrenomedullin assays and methods for determining mature andrendomedullin | |
| US20220268761A1 (en) | Therapy monitoring under treatment with an anti-adrenomedullin (adm) binder | |
| ES2948446T3 (es) | Adrenomedulina para la valoración de la congestión en un sujeto con insuficiencia cardiaca aguda | |
| JP2020510841A (ja) | ヒトエリスロフェロン抗体及びその使用 | |
| IL295728A (en) | Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm backbone without ig for use in the treatment of cure or prevention of shock | |
| RU2776811C2 (ru) | Мониторинг терапии при лечении связывающим веществом против адреномедуллина (adm) | |
| JPWO2012077643A1 (ja) | ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の免疫学的測定方法 |