TWI588156B - 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白 - Google Patents

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Description

具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
本發明有關類抗體結合蛋白，包含形成四抗原結合位置之四多胜肽鏈，其中形成類抗體結合蛋白的每一對多胜肽係擁有具交叉位向的雙變異區域。本發明亦有關產生此類抗體結合蛋白之方法。
自然存在的IgG抗體係為雙價及單一特異性，具有用於二種不同抗原的結合特異性之雙特異性抗體可使用重組技術來製作，且提出寬廣的臨床應用。眾所周知，完整的IgG抗體分子係為Y型分子，包含四個多胜肽鏈：二個重鏈和二個輕鏈。每一輕鏈由二個區域組成，N端區域已知為變異或VL區域(或區)，且C端區域已知為不變(或CL)區域(不變(C)或是不變λ(Cλ)區域)。每一重鏈由四個或五個區域組成，依據抗體的種類而定，N端為已知的變異(或VH)區域(或區)，依序為第一不變(或CH1)區域、絞鏈區，然後是第二及第三不變(或CH2及CH3)區域。在一組裝抗體中，此VL和VH區域結合在一起，以形成一抗原結合位置。而且，此CL及CH1區域結合在一起，以維持一重鏈結合一輕鏈。這二重-輕鏈異二聚體係利用CH2及CH3區域的相互作用結合在一起，且相互作用介於二個重鏈的絞鏈區之間。
已知一抗體的蛋白酵素分解可以導致抗體片段(Fab 及Fab2)的產生，整個抗體的片段可表現抗原結合能力。抗體片段亦可以重組產生；Fv片段，僅由重鏈及輕鏈之變異區域結合在一起組成，可以獲得。這些Fv片段係為單價，用於抗原結合。較小的片段，例如獨立的變異區域(區域抗體或dABs；Ward等人，1989,Nature 341(6242)：544-46)，以及獨立的互補決定區或CDRs(Williams等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(14)：5537-41)亦已顯示保留母源抗體的連結特徵，雖然大部分自然存在的抗體通常需要VH及VL二者，以保留完整結合能力。
單鏈變異片段(scFv)構成包括一單多胜肽鏈內的抗體的VH及VL區域，其中此些區域係以足夠長的彈性連結子(flexible linker)(超過12個胺基酸殘基)來分隔，以對抗分子內作用，允許二個區域自組裝成功能性抗原決定基結合位置(Bird等人，1988,Science 242(4877)：423-26)。在單一多胜肽中，這些小分子蛋白質(MW~25,000 Da)對於他們的抗原通常保持特異性及親和性，並可提供給較大抗原特異性分子一個方便的建構區塊。
在診斷及治療上使用抗體片段的優點勝於整個抗體在於他們的較小尺寸，它們可能比整個抗體有較少的免疫原性而更可以穿透組織。一個跟此類片段使用有關聯的缺點是，它們只有一個抗原結合位置而導致抗体親抗原性的減少。另外，由於它們小尺寸，它們可以從血清 中快速清除，因此顯示出較短的半衰期。
有興趣的是產生雙特異性抗體(BsAbs)，其係結合位於單一分子內的二抗體的抗原結合位置，因此可同時地結合二個不同的抗體。除了診斷目的之應用之外，此類分子為新的治療應用鋪路，例如，藉由重定向有效能的作用子(effector)體系統至有病區(癌細胞通常的生長機制而抑制由單株抗體觸發的正常免疫反應，像是抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)或是補體依賴性細胞毒殺作用(CDC))，或是藉由增加抗體的中和或刺激活性。此潛力係很早被認可，使得一些方法可得到此雙特異性抗體。剛開始為了治療目的嘗試去連結二個完整抗體的連結特異性對抗不同的目標抗原，係利用化學上融合複共軛分子(Staerz等人，1985,Nature 314(6012)：628-31)。
雙特異性抗體剛開始的做法係藉由融合二個融合瘤細胞，分別具有產生不同免疫球蛋白的能力(Milstein等人，1983,Nature 305(5934)：537-40)，但是由細胞培養產生之種類(直至十個不同種類)的複雜性使得純化困難且昂貴(George等人，1997,THE ANTIBODIES 4：99-141(Capra等人，ed.,Harwood Academic Publishers))。使用這形式，小鼠lgG2a和大鼠lgG2b抗體可以在相同細胞內產生(例如，二個融合瘤細胞的四源融合體(quadroma fusion)，抑或是工程CHO細胞)。由於每一抗體的輕鏈係優先地連結他們同族種類 的重鏈，所以有三個抗體的主要種類組裝：二個親本抗體和此二抗體的異二聚體，每一個抗體包含一個重/輕鏈對，並利用他們的Fc部份結合。此要求的異二聚體可以從這混合物中純化，因其結合至蛋白A(Protein A)的特性與來自親本抗體的那些有所不同：大鼠IgG2b無法結合至蛋白A，反而小鼠IgG2a卻可以。因此，此小鼠-大鼠異二聚體結合至蛋白比小鼠IgG2a同型二聚體在較高pH值中洗提，且此舉使得雙特異性異二聚體選擇性純化變為可能(Lindhofer等人，1995,J.Immunol.155(1)：219-25)，產生的雙特異性異二聚體完全是非人類的，因此具有很高的免疫性，其可能具有有害的副作用(例如“HAMA”或是“HARA”反應)，及/或中和其治療。有需要維持機密策劃具有最高特性的雙特異性，使其可以較高產率自哺乳動物細胞培養中快速的產生。
儘管使用如上面所述之自細胞融合產生的異共軛體(heteroconjugates)或雙特異性抗體可以得到有希望的結果，但數種因素使得他們的較大治療應用變成無用的。這些因素包含：在活體內異共軛體的快速清除，需要實驗室加強技術來產生分子形式，有需要大量的自均共軛物中進行大量的複共軛純化，或是單一特異性抗體，亦即獲得一般較低的產率。
使用增加頻率的遺傳工程來設計、修改和產生抗體或是具有要求的結合特性和作用體功能組合之抗體衍生物。各種的重組方法已經相當成熟，有效率的生產 BsAbs，抗體片段(Carter等人，1995,J.Hematother.4(5)：463-70；Pluckthun等人，1997,Immunotechnology 3(2)：83-105；Todorovska等人，2001,J.Immunol.Methods 248(1-2)：47-66)和全長的IgG格式(Carter,2001,J.Immunol.Methods 248(1-2)：7-15)二者都是。
結合二種不同的scFvs產生出具有最小分子量的BsAb格式，稱為sc-BsAbs或Ta-scFvs(Mack等人，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(15)：7021-25；Mallender等人，1994,J.Biol.Chem.269(1)：199-206)。BsAbs的建構係從基因方面融合二個scFvs至一個二聚體官能性，例如白胺酸鏈區(Kostelny等人，1992,J.Immunol.148(5)：1547-53；de Kruif等人，1996,J.Biol.Chem.271(13)：7630-34)。
雙功能抗體係為小的雙價和雙特異性抗體片段，此片段包含一VH連接至相同多胜肽鏈的VL，由於使用的連結子太短(少於12胺基酸殘基)以允許在相同鏈上的二個區域之間配對。此些區域係強迫與另一鏈上的互補區域分子間地配對，並創造二個抗原結合位置。這些二聚體抗體片段，或“雙功能抗體”係為雙價和雙特異性(Holliger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14)：6444-48)，雙功能抗體在尺寸上係與一Fab片段相似。VH和VL區域的多胜肽鏈藉由一個3和12胺基酸殘基之間的連結子所連結，以形成佔優勢地二聚物 (雙功能抗體(diabodies))，鑑於藉由一個0和2胺基酸殘基的連結子，形成佔優勢的三聚物(三功能抗體(triabodies))和四聚物(四功能抗體(tetrabodies))。除了連結子長度之外，寡聚集作用的確切樣式似乎依賴像變異區域位向的組成(Hudson等人，1999,J.Immunol.Methods 231(1-2)：177-89)。雙功能抗體分子的最終結構的可預測性相當的貧乏。
雖然sc-BsAb和基於雙功能抗體的構築體表現顯示有趣的臨床潛力，其係顯示出此類的非共價組合的分子在生理狀態下沒有足夠的穩定性。一個scFv片段的整體穩定性係依賴VL和VH區域內部的穩定性，就如同區域界面的穩定性。scFv片段的VH-VL界面不足的穩定性常常被認為是不可逆的scFv失活最主要的原因，由於界面的短暫開啟，其係使得胜肽連結子暴露出利於聚集的疏水性區塊，且因此而不穩定和貧乏的生產量(Wörn等人，2001,J.Mol.Biol.305(5)：989-1010)。
一種從VH和VL區域製造雙特異性雙價抗原-結合蛋白的選擇性方法係描述於美國專利號5,989,830。此類的雙頭和雙Fv組態之取得係藉由表現一雙表現載體(bicistronic vector)，其係編碼二個多胜肽鏈。在雙Fv組態中，二個不同抗體之變異區域係表現在二個分離鏈的串列位向(一個重鏈和一個輕鏈)，其中一個多胜肽鏈具有串連二次VH並以一胜肽連結子分離(VH1-連結子-VH2)，以及另一個多胜肽鏈由互補的VL區域串接一胜 肽連結子組成(VL1-連結子-VL2)。在交叉雙頭組態組態中，二個不同抗體的變異區域係表現在二個分離多胜肽鏈的串列位向(一個重鏈和一個輕鏈)，其中一個多胜肽鏈具有串連二次VH並以一胜肽連結子分離(VH1-連結子-VH2)，以及另一個多胜肽鏈係由互補的VL區域以相反位向串接一胜肽連結子組成(VL2-連結子-VL1)。構築體的分子模型建議此連結子有足夠長的尺寸可跨越30-40 Å(15-20個胺基酸殘基)。
有關於增加一抗體的價位，使抗體增加其功能上的親和力，此乃因抗體親抗原性效力。具有增加價位的多價蛋白複合物(Polyvalent protein complexes，PPC)係描述於美國專利申請公開號US 2005/0003403 A1。PPCs包含一般以側向彼此安排之二個多胜肽鏈，每一多胜肽鏈典型地包括三或四個“v-區”，其係包括胺基酸序列，當其與在相對多胜肽鏈上對應的v-區匹配時，具有形成一抗原結合位置的能力。提高至六個“v-區”可以使用於每一個多胜肽，每一多胜肽鏈的v-區係彼此互相線性連接，並可以散置的鏈接區連接。當排列成此PPC的形式時，每一多胜肽鏈上的v-區係形成個別的抗原結合位置。此複合物可能包含一個或數個結合特異性。
一種策略係由Carter等人(Ridgway等人，1996,Protein Eng.9(7)：617-21；Carter,2011,J.Immunol.Methods 248(1-2)：7-15)提出，係使用一套“球形突出物-至-洞(knob-into-hole)”突變於Fc的CH3區域來 產生Fc異二聚體。這些突變導致殘基包裝互補在結構上保護疏水性核心內的CH3區域界面之間產生改變，使得異二聚體的形成係與同型二聚體比較，以自哺乳動物細胞培養完成良好的異二聚體表現。雖然此策略導致較高的異二聚體產量，但其同型二聚體也無法完成抑制(Merchant等人，1998,Nat.Biotechnol.16(7)：677-81。
Gunasekaran等人探究固定疏水性核心完整性的可行性，在CH3區域界面改變電荷互補以驅使Fc異二聚體的形成時(Gunasekaran等人，2010,J.Biol.Chem.285(25)：19637-46)。利用靜電導向機制，這些構築體顯示，透過二對位於外圍的充電殘基突變，使得Fc異二聚體形成係有效的提升，並具有最小量的同型二聚體污染物。與球形突出物-至-洞設計相比，由於靜電相斥機制的本質，此同型二聚體可均勻地被抑制，但無法完全避免。
Davis等人描述一種抗體工程方法，利用叉合人類的IgG和IgA CH3區域的β-股片段，將Fc同型二聚體轉變為異二聚體，毋需額外的雙硫鍵結交換(Davis等人，2010,Protein Eng.Des.Sel.23(4)：195-202)。SEEDbody(Sb)融合蛋白表現哺乳動物細胞產量，高產量的Sb異二聚體容易地被純化，以消除較少的副產品。
美國專利申請公開號US 2010/331527 A1描述一種基於CH3區域之異二聚化的雙特異性抗體，其在一重鏈 上導入位於CH3區域內之突變H95R和Y96F。這些胺基酸取代來自IgG3次型的CH3區域，並將與一IgG1主鏈進行異二聚化。對於CH3區域中基於異二聚化的所有形式，一共同的輕鏈易於與每個重鏈配對係為必要條件。三種形式抗體的總數因此生產：50%具有一純IgG1主鏈，三分之一具有一純H95R和Y96F突變主鏈，以及三分之一具有二不同重鏈(雙特異性)。此所需的異二聚體可以從這混合物中純化，因為其結合至蛋白A的特性與來自親本抗體的不同。IgG3衍生的CH3區域不能結合至蛋白A，反而是IgG1可以。因此，此異二聚體結合至蛋白A，但是相較於純IgG1同型二聚體而言要在較高pH值下洗提，且這使得雙特異性異二聚體的選擇性提純變得可能。
美國專利號7,612,181描述一種雙-變異-區域IgG(DVD-IgG)雙特異性抗體，其係基於描述於美國專利號5,989,830中的雙-Fv形式。一相似的雙特異性形式亦描述於美國專利申請公開號US 2010/0226923 A1。增加不變區域至各自的雙-Fv鏈(CH1-Fc至重鏈以及或λ不變區域至輕鏈)，使得功能性雙特異性抗體毋需任何的額外修改(即，顯著的增加不變區域加強穩定性)。一些抗體表現在DVD-Ig/TBTI形式顯示位置影響第二(或最內部的)抗原結合位置(Fv2)。依據抗原的序列與本質被確認為此Fv2位置，這個抗體區域對其抗原表現出一減少的親和力(即，對照親本抗體而言結合速率減 少)。對此種觀察而言一種可能的解釋為介於VL1和VL2間的連結子突出至Fv2的CDR區，使得Fv2有點難接近較大抗原。
描述於美國專利號5,989,830的一雙特異性抗體片段的第二組態係為交叉雙頭(CODH)，具有表現在二鏈的變異區域的下列位向：對輕鏈而言，VL1-連結子-VL2；以及對重鏈而言，VH2-連結子-VH1。
此'830專利揭露一種雙特異性交叉雙頭抗體片段(構築體GOSA.E)較雙Fv保持較高的結合活性(參見'830專利第20頁第20-50行)，並進一步揭露此形式受使用於變異區域間之連結子較少的影響(參見'830專利第20-21頁)。
本發明提供一種類抗體結合蛋白，包含其係形成四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，其中二個多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
以及二個多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；Fc係為免疫球蛋白絞鏈區和CH2、CH3免疫球蛋白重鏈不變區域；L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此式I的多胜肽和式II的多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
本發明亦提供一種類抗體結合蛋白，包含形成二個抗原結合位置之二多胜肽鏈，其中一第一多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
以及一第二多胜肽鏈具有下式所表示之結構： VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此第一和第二多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
本發明更提供一種製造類抗體結合蛋白的方法，該蛋白包含形成四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，包括識別結合第一目標抗原的第一抗體變異區域以及結合第二目標抗原的第二抗體變異區域，每一變異區域包含一VL和一VH；指定此第一抗體變異區域或第二抗體變異區域的VL作為VL1；根據下列式[I]和[II]，指定VL2、VH1和VH2：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
決定L1、L2、L3和L4的最大和最小長度；產生式I和II的多胜肽結構；選擇式I和II的多胜肽結構，其結合第一目標抗原和第二目標抗原，以合併形成類抗體結合蛋白； 其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；Fc係為免疫球蛋白絞鏈區和CH2、CH3免疫球蛋白重鏈不變區域；以及L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此式I的多胜肽和式II的多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
本發明更提供一種製造類抗體結合蛋白的方法，該蛋白包含形成四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，包括識別結合第一目標抗原的第一抗體變異區域以及結合第二目標抗原的第二抗體變異區域，每一變異區域包含一VL和一VH；指定此第一抗體變異區域或第二抗體變異區域的VL作為VL1；根據下列式[I]和[II]，指定VL2、VH1、和VH2：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
決定L1、L2、L3和L4的最大和最小長度；產生式I和II的多胜肽結構；選擇式I和II的多胜肽結構，其結合第一目標抗原和第二目標抗原，以合併形成類抗體結 合蛋白；其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；以及L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此式I的多胜肽和式II的多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
藉由下面某些實施例與請求項之更為詳細的說明，本發明之特定實施例將變得更為明白。
本發明提供類抗體結合蛋白，包含形成四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，其中每對多胜肽形成一類抗體結合蛋白具有交叉位向的雙變異區域。本發明亦提供製造上述類抗原結合蛋白的方法。
電腦模擬預測美國專利號5,989,830的交叉雙頭(CODH)設計會產生一複合物，在此有二個結合位置面對相對的方向，不用限制提議美國專利號7,612,181的雙-Fv組態。尤其是，電腦模擬指出，對於CODH設計而言，介於變異區域間的胺基酸連結子的長度並不是關鍵的，但對於允許完全進入至雙-Fv設計中的兩抗原結合位置是重要的。和DVD-Ig/TBTI形式相同，類抗體結合 蛋白構築體的製備係在不變區域依附此CODH組態，以形成類抗體結合蛋白包括四個多胜肽鏈，其係形成四個抗原結合位置，其中每對多胜肽形成一類抗體結合蛋白係具有交叉位向的雙變異區域(即，CODH-Ig)。相較於CODH分子而言，CODH-Ig分子預期具有值得注意地改進穩定性(就如同DVD-Ig/TBTI具有改進穩定性勝過雙-Fv分子)。
為了試驗上述之假設，一CODH-Ig分子的製備係使用描述於美國專利申請公開號US 2010/0226923 A1中的抗-IL4和抗-IL13抗體序列。有關胺基酸連結子長度分離在各自的多胜肽鏈之變異區域，此CODH-Ig分子係不同於US 2010/0226923的CODH分子。在短暫轉移之後，CODH-Ig分子表現在細胞，然後以蛋白A色層分析純化。雖然它們的分子篩層析法(SEC)輪廓顯示5-10%的聚集程度，沒有任何CODH-Ig分子有功能，且因此沒有任何CODH-Ig分子可以結合所有目標抗原。抗原結合能力的缺少可能原因是因為重和輕鏈的Fv-區的擾亂二聚化，因為不適當的連結子長度危及正確互補位形成。結果，發展出一個協議來識別合適的胺基酸連結子，用來插入二個變異區域之間，且第二變異區域和不變區域兩者在類抗體結合蛋白的重和輕多胜肽鏈上。這個協議係基於FvIL4和FvIL13區的相似實驗性模型的蛋白-蛋白對接，各別包含Fc1區域模型，在FvIL4和FvIL13區之間以及在Fv和不變Fc1區之間的適當連結子的建構。
標準重組DNA方法係用來建構多核苷酸，其係編碼多胜肽，以形成本發明之類抗體結合蛋白，這些多核苷酸至重組表現載體，並導入此類的載體至宿主細胞，參見，例如，Sambrook等人，2001,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd ed.)。根據製造者說明書，酵素反應和純化技術可以進行，如同一般在此領域所完成者，或是在此描述者。除非有提供特定的定義，命名係利用與在此描述之分析化學、合成有機化學和醫藥化學等有關，以及其實驗室程序與技術係為眾所周知且通常使用於此領域。同樣地，一般常見技術可以用於化學合成、化學分析、製劑、配方、生產和病患治療。
1.一般定義
根據本揭露內容所使用的下列名詞，除非另有不同的指示，否則應當瞭解其係具有下述意義。除非上下文的要求，否則單數的名詞應當包含複數個，且複數的名詞應當包含單數。
在此使用之名詞“多核苷酸”意指單股或雙股具有至少10個核苷酸長度的核酸聚合物。在某些實施例中，含有多核苷酸的核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一種核苷酸形式的修飾型。此修飾包括鹼基修飾，例如溴尿苷(bromuri-dine)；核糖修飾，例如阿拉伯糖苷和2',3'-二去氧核糖；以及核苷酸間連接修飾，例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯 (phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、縮苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺酸磷酸酯(phoshoraniladate)和磷醯胺酯(phosphoroamidate)。此名詞“多核苷酸”特別包含單股或雙股形式的DNA。
一“經分離的多核苷酸”係為一基因組、cDNA或合成來源的多核苷酸，或其一些組合，藉由其來源，經分離的多核苷酸：(1)未與在自然界中在其中發現此經分離之多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分結合；(2)與在自然界中未與其連接之多核苷酸連接；或(3)無以較大序列的一部分出現在自然界中。
一“經分離的多胜肽”係為：(1)至少不含一些正常與其一起被發現的其他多胜肽；(2)基本上不含來自相同來源，例如來自相同物種的其他多胜肽；(3)由來自不同物種的細胞表現；(4)已經從至少大約百分之50在自然界中與其結合之多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質中分離；(5)未與在自然界中與該“經分離的多胜肽”結合的多胜肽的一部分結合(藉由共價或非共價交互作用)；(6)以可操作之方式與在自然界中未與其結合的多胜肽結合(藉由共價或非共價交互作用)；或(7)未出現在自然界中。此一經分離的多胜肽可以藉由合成來源的基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA， 或其任何組合來編碼。較佳者，經分離的多胜肽實質上不含在其自然環境中發現，將會干擾其用途(治療、診斷、預防、研究或其他)的多胜肽或其他污染物。
在此使用之名詞“人類抗體”包含具有實質上與人類生殖系列免疫球蛋白序列一致之變異和不變區的抗體。在某些實施例中，在非-人類哺乳動物中產生人類抗體，包含但不限於嚙齒動物，例如小鼠和大鼠，以及兔類動物，例如兔。在其他實施例中，在融合瘤細胞中產生人類抗體。還有在其他實施例中，以重組方式產生人類抗體。
天然存在之抗體通常包括四聚體。每一四聚體通常均由兩個相同的多胜肽鏈對組成，各對具有一個全長“輕”鏈(通常具有大約25 kDa的分子量)及一個全長“重”鏈(通常具有大約50-70 kDa的分子量)。在此使用之名詞“重鏈”和“輕鏈”意指任何免疫球蛋白多胜肽具有足夠的變異區域序列來給予特定之目標抗原。每一輕和重鏈之胺基末端部分通常包含一通常負責抗原辨識之具有約100至110或更多個胺基酸的變異區域。各鏈之羧基末端部分通常定義一負責效應功能(effector function)之不變區域。因此，在天然存在的抗體中，一全長重鏈免疫球蛋白多胜肽包含一個變異區域(VH)和三個不變區域(CH1、CH2和CH3)，其中，此VH區域係位於多胜肽的胺基終點，且此CH3區域係位於羧基終點；以及一全長輕鏈免疫球蛋白多胜肽包含一個變異區 域(VL)和一個不變區域(CL)，其中，此VL區域係位於多胜肽的胺基終點，且CL區域係位於羧基終點。
人類輕鏈通常分為(kappa)和λ(lambda)輕鏈，且人類重鏈通常分為μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)，且分別對應將抗體之同型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有幾個子類，包含但不限於IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM有幾個子類，包含但不限於IgM1及IgM2。IgA同樣地分成幾個子類，包含但不限於IgA1及IgA2。在全長輕鏈及重鏈中，變異和不變區域通常經由具有約12個或更多胺基酸之“J”區連接，此重鏈亦包含具有約10個或更多胺基酸之“D”區。參見，例如，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul,W.,ed.,Raven Press,2nd ed.,1989)，無論基於何種目的，其整體皆以引用之方式併入本文中。各輕/重鏈對之變異區通常形成一抗原結合位置。自然存在抗體的變異區域通常存在相同的整體結構：經由三個高變異區，亦稱為互補決定區或CDR，連接之相對保守的構架區(FR)。來自各對之兩個鏈的CDR通常利用構架區對準，使其能夠與特異性抗原決定基結合。自胺基終點至羧基終點，輕鏈與重鏈變異區域通常包括區域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
在此使用之名詞“天然Fc”意指一分子包括一非抗原結合片段的序列產生於一抗體的消化作用或是由其他手 段產生，不管是以單體的或多聚體的形式，並包含絞鏈區。天然Fc的原始免疫球蛋白來源較佳者係為人類來源，且可為任何的免疫球蛋白，雖然IgG1和IgG2係較佳。天然Fc分子係由單體多胜肽組成，其係可利用共價(即，雙硫鍵)和非共價結合來連接至二聚體或多聚體的形式。在天然Fc分子的單體子單元間的分子間雙硫鍵的數量範圍依分類(例如，IgG、IgA和IgE)或子類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)從1至4。天然Fc的一實例係為雙硫鍵結二聚物產生一IgG的木瓜蛋白消化作用。在此使用之名詞“天然Fc”係為單體的、二聚體和多聚體的形式。
在此使用之名詞“Fc變異體”意指自天然Fc修飾但較佳仍包含補救受體FcRn(新生的Fc受體)之結合位置的分子或序列。示範的Fc變異體和與補救受體之相互作用係為此係為此領域所熟知者。因此，名詞“Fc變異體”可包含自非人類天然Fc人源化之分子或序列。再者，天然Fc包括可移除之區，其係由於它們提供非本發明之類抗體結合蛋白所需之結構特徵或生物活性。因此，名詞“Fc變異體”包括缺乏或修飾過一或多個影響或涉及以下各者之天然Fc位置或殘基的分子或序列：(1)雙硫鍵形成，(2)與所選擇之宿主細胞不相容，(3)在所選擇之宿主細胞中表現後N末端異質性，(4)糖基化，(5)與補體相互作用，(6)與除補救受體以外之Fc受體結合，或(7)抗體依賴細胞毒性(ADCC)。
在此使用之名詞“Fc區域”包含如上文所定義之天然Fc及Fc變異體和序列。如同Fc變異體及天然Fc分子，名詞“Fc區域”包括呈單體或多聚體形式的分子，無論自完整抗體消化或由其他手段產生。
在此使用之名詞“類抗體結合蛋白”意指非天然存在(或重組)分子係特別結合到至少一目標抗原，且其包含形成四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，其中二個多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
以及二個多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；Fc係為免疫球蛋白絞鏈區和CH2、CH3免疫球蛋白重鏈不變區域；L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此式I的多胜肽和式II的多胜肽係形成一交叉輕鏈-重鏈對。在此使用之名詞“類抗體結合蛋白”意指非天然存在(或重組)分子係特別結合到至少一目標 抗原，且其包含形成二個抗原結合位置之二個多胜肽鏈，其中第一多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
以及第二多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中第一和第二多胜肽係形成一交叉輕鏈-重鏈對。一“重組”分子係為一種利用重組手段來製備、表現、創造或分離。
本發明之一實施例提供類抗體結合蛋白在一個和四個目標抗原之間具有生物學和免疫學的特異性。本發明之另一實施例提供多核苷酸包括核苷酸序列編碼胺基酸序列成為多胜肽鏈，以形成此類抗體結合蛋白。本發明再一實施例提供宿主細胞係表現出此類抗體結合蛋白。
一“經分離的”類抗體結合蛋白是已經從其自然環境之成份中確認並分離及/或回收的抗體。它自然環境之污染成份是將干擾該抗體之診斷或治療用途的物質，且可 包含酵素、荷爾蒙及其他蛋白質的或非-蛋白質的溶質。在較佳實施例中，此類抗體結合蛋白將被純化：(1)至超過95重量%之抗體，係藉著Lowry方法判定，且最好超過99重量%，(2)藉著使用紡織杯定續儀，至足以獲得N-終端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或(3)在還原或非還原條件下，使用考馬斯藍或較佳者為鍍銀染色，利用SDS-PAGE至均一性。經分離的類抗體結合蛋白包含在重組細胞內原地的類抗體結合蛋白，因為此類抗體結合蛋白之自然環境的至少一個成份將不存在。
在此使用之名詞“實質上純的”或“實質上經純化的”，意指優勢物種出現的化合物或物種(即以莫耳濃度為基礎，在組合物中其比任何其他個別的物種更為豐富)。在某些實施例中，實質上經純化的溶離份是組合物，其中該物種包括所有出現之大分子物種的至少大約50%(以莫耳濃度為基礎)。在其他實施例中，實質上純的組合物將包括在該組合物中所有出現之大分子物種的超過大約80%、85%、90%、95%或99%。還是在其他實施例中，將此物種純化至本質上均一性(不能利用傳統的檢測方法在組合物中檢測到污染物種)，其中此組合物基本上由單一大分子物種所組成。
在此使用之名詞“抗原”或“目標抗原”意指一分子或分子的部份，其係具有與類抗體結合蛋白結合的能力，另外並具有使用於動物來產生抗體結合至抗原之抗原決 定基的能力。一目標抗原可具有一個或多個抗原決定基，有關各目標抗原藉由一類抗體結合蛋白來識別，此類抗體結合蛋白係具有與識別此目標抗原之完整抗體競爭的能力。除了一“多特異性”或“多功能性”類抗體結合蛋白，可暸解一“雙價”類抗體結合蛋白係包括具有同一抗原特異性的抗原結合位置。
一雙特異性或雙功能性抗體通常為一人工雜交抗體具有二個不同重鏈/輕鏈對和二個不同結合位置。雙特異性抗體可利用多種方法產生，包含但不限定於雜交瘤的融合或是F(ab')片段的連接。
一個F(ab)片段通常包含一個輕鏈和一個重鏈的VH及CH1區域，其中此F(ab)片段的VH-CH1重鏈部份不能形成一雙硫鍵給另一重鏈多胜肽。如同在此所使用者，一F(ab)片段亦可包含一輕鏈含有二個以一胺基酸連結子分離的變易區域以及一重鏈含有二個以胺基酸連結子和一CH1區域分離的變易區域。
一個F(ab')片段通常包含一個輕鏈和一重鏈的部份，其係含有多個不變區(位於CH1和CH2區域間)，使得一鏈間雙硫鍵可以在二個重鏈間形成，進而形成一F(ab')2分子。
此詞組“生物特性”、“生物特徵”和“活性”一詞對於本發明之類抗體結合蛋白在此可替換地使用，且包含但不限定於抗原決定基親和力和特異性、能夠對抗抗原目標(或目標多胜肽)活性、類抗體結合蛋白的活體穩定性 和類抗體結合蛋白免疫特性。類抗體結合蛋白其他可識別的生物特性或特徵包含，例如，交叉反應(即，一般具抗體目標的非人類同系物或具其他抗原目標組織)，和能夠維持在哺乳動物細胞內蛋白質的高表現量。使用技藝識別技術可以發現或量測到上述之特性或特徵，包含但不限定於ELISA、競爭型ELISA、表面電漿共振分析、體內和體外中和試驗，以及組織切片的免疫組織化學分析，此組織切片來自不同來源，包含人類、靈長類動物或是任何其他有需要的來源。
在此使用之名詞“免疫功能之免疫球蛋白片段”意指多胜肽片段至少含有免疫球蛋白重或輕鏈之CDRs，來自取得的多胜肽片段。免疫功能之免疫球蛋白片段能夠結合一目標抗原。
在此使用之“中和”類抗體結合蛋白意指能夠阻斷或實質上減少與其結合之目標抗原的作用體功能的抗體分子。在此所使用之“實質上減少”表示降低至少大約60%，較佳的是至少大約70%，更佳的是至少大約75%，再更佳的是至少大約80%，再更佳的是至少大約85%，最佳的是至少大約90%之目標抗原的作用體功能。
“抗原決定基”一詞包含任何能夠與免疫球蛋白或T-細胞受體特異性結合的決定因子，較佳者為多胜肽決定因子。在某些實施例中，抗原決定基決定因子包含分子之化學活性表面基團，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或 磺醯基，且在某些實施例中，可以具有特定性三維結構特徵及/或特定性電荷特徵。抗原決定基是抗原中與抗體或類抗體結合蛋白結合的區域。在某些實施例中，當類抗體結合蛋白在蛋白質及/或大分子的複雜混合物中優先認出其目標抗原時，便說類抗體結合蛋白特定地結合抗原。在較佳的實施例中，當平衡解離常數10-8 M時，較佳者是當平衡解離常數10-9 M時，且最佳的是當平衡解離常數10-10 M時，便說類抗體結合蛋白特定地結合抗原。
一類抗體結合蛋白的解離常數(KD)可以決定，例如，利用表面電漿共振。一般而言，表面電漿共振分析係使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor；Piscata-way,NJ)的表面電漿共振(SPR)在配位基(在生物感測器基質上的目標抗原)和分析物(溶液中之類抗體結合蛋白)之間測量即時結合相互作用。表面電漿分析亦可以固定分析物(在生物感測器基質上的類抗體結合蛋白)和出現配位基(目標抗原)。在此使用之名詞“KD”意指在特定類抗體結合蛋白和一目標抗原間之相互作用的解離常數。
在此使用之名詞“連結子”意指一個或多個胺基酸殘基插入免疫球蛋白區域之間，以提供足夠遷移率給輕和重鏈區域來摺疊至交叉雙變異區免疫球蛋白。一連結子係插入至變異區域之間或變異和不變區域之間的轉變，以分別對應其序列級別。在區域間的轉變可被確認，此 乃因免疫球蛋白區域的大約尺寸易於了解。一區域轉變的精確位置可藉由所在位置胜肽延伸來決定，其係無法形成次要結構元素，例如β-薄板或α-螺旋，係藉由實驗資料驗證或是採用模型技術或次要結構預測。在此描述之連結子係稱之為L1，其係位於N-末端VL1和VL2區域間的輕鏈上；稱之為L2，其亦位於VL2和C-末端CL區域間之輕鏈上。重鏈連結子已知為L3，其係位於N-末端VH2和VH1區域間；以及L4，其係位於VH1和CH1-Fc區域間。此連結子L1、L2、L3和L4係各自獨立，但他們可在某些個案內具有相同的序列及/或長度。
在此使用之名詞“載體”意指用來運送編碼資訊給一宿主細胞的任何分子(例如，核酸、質體或病毒)。“載體”一詞包含能夠運送已經與其連接之其他核酸的核酸分子。一種類型的載體為“質體”，意指環狀雙股的DNA分子，可將額外的DNA片段插入到其中。其他類型的載體為病毒載體，其中可將額外的DNA片段插入到病毒基因組內。某些載體能夠在導入其之宿主細胞內自動複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體，以及附加體的哺乳動物載體)。其他的載體(例如非-附加體的哺乳動物載體)，在導入宿主細胞內時，可以整合至宿主細胞的基因組內，並藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指揮以可操作地連接之基因的表現。在此將這類載體稱為“重組表現載體”(或簡稱為“表現載體”)。一般而言，用於重組DNA技術中的表現載體， 通常為質體之形式。在本文中，名詞“質體”和“載體”可交替使用，因為質體是最常使用的載體形式。然而，本發明企圖包含其他形式的表現載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷的逆轉錄病毒、腺病毒和與腺關聯病毒)，其係提供相同的功能。
在此使用之名詞“可操作地連接”意指側翼序列的排列，其中此側翼序列如此描述為配置或組裝，以便完成它們通常的功能。如此，側翼序列可操作地連接編碼序列能夠產生編碼序列的複製、轉錄及/或轉譯。例如，當啟動子能夠指揮一編碼序列的轉錄時，編碼序列可操作地連接至啟動子。一側翼序列毋需鄰接此編碼序列，，只要它功能正確。如此，例如，位於中間的未轉譯且尚未轉錄之序列可以出現在啟動子序列和編碼序列之間，且啟動子序列仍可被認為“可操作地連接”至編碼序列。
在此使用之詞組“重組宿主細胞”(或“宿主細胞”)意指已經在其中導入重組表現載體的細胞。重組宿主細胞或宿主細胞不僅企圖意指特定的個體細胞，還包括這類細胞的子代。因為某些修改可能發生在後續的世代中，其歸因於突變或環境的影響，所以這類子代事實上可能並非與親代細胞相同，但在本文使用時，這類細胞仍包含在“宿主細胞”一詞的範圍內。各種各樣的宿主細胞表現系統可以用來表現本發明之類抗體結合蛋白，包含細菌的、酵母、桿狀病毒和哺乳動物的表現系統(如同噬菌體顯示表現系統)。一適當細菌的表現載體的實 例係為pUC19。為了表現類抗體結合蛋白重組，以攜帶DNA片段的一個或多個重組表現載體編碼類抗體結合蛋白多胜肽鏈來轉形或轉染宿主細胞，如此使此多胜肽鏈係表現在宿主細胞，且較佳者，隱藏於培養宿主細胞培養基裡面，從此培養基中可以重新獲得類抗體結合蛋白。
在此使用之名詞“轉形”意指細胞遺傳特徵方面之變化，且當細胞經修飾而含有新的DNA時，細胞會被轉形。例如，當細胞自其天然狀態被遺傳修飾時，細胞被轉形。經轉形後，可藉由將轉形DNA物理上整合於細胞染色體中而使其與細胞染色體重組，或者可將轉形DNA暫時維持為附加體元素而不複製，或者轉形DNA可作為質體單獨複製。當DNA伴隨細胞分裂複製時，細胞將被視為已經穩定轉形。在此使用之名詞“轉染”意指細胞吸收外來或外源DNA，且當已將外源DNA引入細胞膜內部時，細胞被“轉染”。許多轉染技術為此項技術中所熟知者，所述技術可用於將一個或多個外源DNA分子引入合適的宿主細胞中。
在此使用之名詞並應用在目標上之“天然存在”意指此目標可在自然界中找到的事實，且非為人所操作。例如，出現在生物(包含病毒)中，可從天然來源中分離，但不可被人故意修改的多核苷酸或多胜肽是天然存在的。同樣地，在此使用之名詞“非天然存在”意指此目標在自然界中找不到或是被人進行結構上的修改或合 成。
在此使用之二十個常見的胺基酸及它們的縮寫係沿用常見用法。二十個常見的胺基酸的立體異構物(例如，D-胺基酸)；非自然胺基酸，例如α-、α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非常見的胺基酸，亦可作為本發明類抗體結合蛋白之多胜肽鏈的適合成份。不常見的胺基酸的實例包含：4-羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸、ε-N,N,N-三甲基甘胺酸、ε-N-乙醯賴胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥離胺酸、σ-N-甲基精胺酸和其他類似的胺基酸和亞胺酸(例如，4-羥脯胺酸)。依據標準用法慣例，在此使用之多胜肽標記中，左手方向為胺基末端以及右手方向為羧基末端方向。基於常見側鏈特性，天然存在殘基可以分類為：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；(2)極性親水性：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；(3)脂肪族：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；(4)脂肪族疏水性：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；(5)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(6)酸性：Asp、Glu；(7)鹼性：His、Lys、Arg；(8)影響鏈位向的殘基：Gly、Pro； (9)芳香族：His、Trp、Tyr、Phe；以及(10)芳香族疏水性：Phe、Trp、Tyr。
保守胺基酸取代可能包含這些分類的其中一個的成份與相同分類的另一個成份交換。保守胺基酸取代可能包含了非天然存在的胺基酸殘基，其係典型地以化學胜肽合成方式結合的，而不是以生物系統的合成。這些包含類肽和其他胺基酸殘基的顛倒或轉形形式。非保守胺基酸取代可能包含這些分類的其中一個的成份與另一個分類的成份交換。
熟練的專業人士可以使用熟知的技術來決定本發明之類抗體結合蛋白之多胜肽鏈適當的變異體。例如，熟悉此技術者之人士可識別合適的多胜肽鏈區域，可能毋需透過不相信對活性是重要的目標區域進行破壞活性而改變；或者是，熟悉此技術者之人士可識別殘基和分子的部份，其係被保存在相似的多胜肽中。此外，甚至對生物活性或結構很重要的區域可容易受到保守胺基酸取代而不用破壞生物活性或是不用不利地影響此多胜肽結構。在此使用之名詞“患者”係包含人類和動物個體。
一“異常”係為可藉助本發明之類抗體結合蛋白的使用來治療的任何狀況。“異常”和“狀況”在此可互相使用交換且包含慢性和急性異常或疾病，包含這些病理上的狀況，係易感染一病患至異常問題中。
在此使用之名詞“治療”或“處理”意指治療處理和預 防性或防止的測量兩者。需要治療的那些包含已罹患異常的那些，以及有罹患異常之傾向的那些，或其中欲預防異常的那些。
在此使用之名詞“醫藥組成物”或“治療組成物”意指化合物或組成物能夠引起要求的治療效果，當其正確的提供給一病患時。
在此使用之名詞“藥學上可接受的載體”或“生理上可接受的載體”意指一個或多個合適的配方材料可完成或加強類抗體結合蛋白的傳送。
此名詞“有效量”和“治療上有效量”，當其使用在關於一醫藥組成物，包括一個或多個類抗體結合蛋白，係指一量或劑量足以產生要求的治療效果。更特別地，治療上有效量係為一類抗體結合蛋白的量足以抑制與受治療狀況有關聯的一個或多個臨床定義病理過程一段時間。此有效量可以根據所使用之特定類抗體結合蛋白而不同，且亦根據病患受治療和異常的嚴重性相關的各種因素和狀況而不同。例如，假如類抗體結合蛋白為體內給予，例如病患的年齡、體重和健康等因素，在劑量反應曲線和臨床和臨床前動物實驗所獲致的毒性資料都要考慮這些因素中。決定一給予醫藥組成物的有效量或治療上有效量對於熟悉此項技術者的能力是清楚的。
2.類抗體結合蛋白
在本發明一實施例中，此類抗體結合蛋白包含形成 四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，其中二個多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
以及二個多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；Fc係為免疫球蛋白絞鏈區和CH2、CH3免疫球蛋白重鏈不變區域；L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此式I的多胜肽和式II的多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
在本發明另一實施例中，此類抗體結合蛋白，包含形成二個抗原結合位置之二多胜肽鏈，其中一第一多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
以及一第二多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
其中： VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此第一和第二多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
在本發明之某些類抗體結合蛋白中，L3的長度係至少為二倍的L1長度。在本發明之另一類抗體結合蛋白中，L4的長度係至少為二倍的L2長度。在本發明之某些類抗體結合蛋白中，L1係為1至10個胺基酸殘基長度以及L3係為1至14個胺基酸殘基長度。在本發明之另一類抗體結合蛋白中，L2係為1至15個胺基酸殘基長度以及L4係為1至15個胺基酸殘基長度。在本發明之較佳實施例中，L1係為1至3個胺基酸殘基長度以及L3係為2至6個胺基酸殘基長度。在本發明之另一類抗體結合蛋白中，L2係為1至3個胺基酸殘基長度以及L4係為4至7個胺基酸殘基長度。
合適的連結子實例包含：單一甘胺酸(Gly)殘基；雙甘胺酸胜肽(Gly-Gly)；三胜肽(Gly-Gly-Gly)；具有四個甘胺酸殘基的胜肽(Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：25)；具有五個甘胺酸殘基的胜肽(Gly-Gly-Gly- Gly-Gly；SEQ ID NO：26)；具有六個甘胺酸殘基的胜肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：27)；具有七個甘胺酸殘基的胜肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：28)；具有八個甘胺酸殘基的胜肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：29)。其他胺基酸殘基的結合可以使用例如胜肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：30)和胜肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：31)。
在連結子內胺基酸殘基的識別和序列可能依據對完成連結子為必要的次要結構上元素而變化。例如，甘胺酸、絲胺酸和丙胺酸對連結子而言具有最大的彈性。假如一個更為堅固且擴大的連結子為必要的，甘胺酸、脯胺酸、酥胺酸和絲胺酸的一些結合為有用的。依據要求特性的必要，任何胺基酸殘基可能被視為一連結子，使其與其他胺基酸殘基，以構成較大胜肽連結子。
在本發明之某些類抗體結合蛋白中，VL1包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列；VL2包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列；VH1包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列；以及VH2包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列。
在本發明之某些實施例中，此抗體結合蛋白能夠特定結合一個或多個抗原目標。在本發明之較佳實施例中，此類抗體結合蛋白能夠特定結合至少一抗原目標，其係選自B7.1、B7.2、BAFF、BlyS、C3、C5、CCL11(嗜酸粒細胞趨化蛋白)、CCL15(MIP-1d)、CCL17 (TARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、SLC、CCL24(MPIF-2/嗜酸粒細胞趨化蛋白-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸粒細胞趨化蛋白-3)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CD3、CD19、CD20、CD24、CD40、CD40L、CD80、CD86、CDH1(E-鈣黏蛋白)、幾丁質酶、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CX3CL1(SCYD1)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、FCER1A、FCER2、IL-1、IL-12、IL13、IL15、IL17、IL18、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL22、IL23、IL25、IL27、IL7、IL8、IL9、ITGB4(b 4整合蛋白)、LEP(瘦蛋白)、TLR2、TLR4、TLR5、TNF、TNF-a、TNFSF4(OX40配位基)、TNFSF5(CD40配位基)、類鐸受體、TREM1、TSLP、TWEAK、XCR1(GPR5/CCXCR1)、DNGR-1(CLEC91)和HMGB1所組成之群組。在本發明其他實施例中，此類抗體結合蛋白能夠抑制一個或多個抗原目標的功能。
在本發明之某些實施例中，類抗體結合蛋白係為雙特異性且能夠結合二個不同的抗原目標。在本發明之一較佳實施例中，此類抗體結合蛋白係為雙特異性且每一輕鏈-重鏈對能夠結合二個不同的抗原目標。在某一較佳實施例中，此類抗體結合蛋白能夠結合二個不同抗原目 標，其係選自IL4和IL13、BK和IL13、PDL-1和CTLA-4、IL-12和IL-18、IL-1α和IL-1β、TNFα和IL-12p40、TNFα和IL-1β、TNFα和IL-23以及IL17和IL23所組成之群組。在一更佳的實施例中，此類抗體結合蛋白能夠結合的抗原目標係為IL4和IL13。
在本發明之某些實施例中，此類抗體結合蛋白係以2.97 E+07的結合速率(on-rate)和3.30 E-04的解離速率(off-rate)特異性結合IL4n，以及係以1.39 E+06的結合速率和1.63 E-04的解離速率特異性結合IL13。本發明之其他實施例中，此類抗體結合蛋白係以3.16 E+07的結合速率和2.89 E-04的解離速率特異性結合IL4，以及係以1.20 E+06的結合速率和1.12 E-04的解離速率特異性結合IL13。
在本發明之一實施例中，一類抗體結合蛋白包含形成四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，其製備係藉由識別結合第一目標抗原的第一抗體變異區域以及結合第二目標抗原的第二抗體變異區域，每一變異區域包含一VL和一VH；指定此第一抗體變異區域或第二抗體變異區域的VL作為VL1；根據下列式[I]和[II]，指定VL2、VH1、和VH2：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
決定L1、L2、L3和L4的最大和最小長度；產生式I和II的多胜肽結構；選擇式I和II的多胜肽結構，其結 合第一目標抗原和第二目標抗原，以合併形成類抗體結合蛋白；其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；以及Fc係為免疫球蛋白絞鏈區和CH2、CH3免疫球蛋白重鏈不變區域；以及L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此式I的多胜肽和式II的多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
在本發明之另一實施例中，一類抗體結合蛋白包含形成四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，此製備係藉由識別結合第一目標抗原的第一抗體變異區域以及結合第二目標抗原的第二抗體變異區域，每一變異區域包含一VL和一VH；指定此第一抗體變異區域或第二抗體變異區域的VL作為VL1；根據下列式[I]和[II]，指定VL2、VH1、和VH2：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
決定L1、L2、L3和L4的最大和最小長度；產生式I 和II的多胜肽結構；選擇式I和II的多胜肽結構，其結合第一目標抗原和第二目標抗原，以合併形成類抗體結合蛋白。
其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為一免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；以及L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子；以及其中此式I的多胜肽和式II的多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
在本發明之其他實施例中，一類抗體結合蛋白中的第一抗體變異區域和第二抗體變異區域係以相同方式製備。
3.類抗體結合蛋白的使用
本發明之類抗體結合蛋白可以使用於任何已知試驗方法中，例如，競爭性結合試驗、直接和間接三明治試驗和免疫沈澱試驗，用於一個或多個目標抗原的偵測和量化。此類抗體結合蛋白將以親和力結合一個或多目標抗原，此親和力係適於所使用的試驗方法之用。
對診斷應用而言，在某些實施例中，類抗體結合蛋 白可以被標記具有可偵測的部份。此可偵測的部份可為任何一個能夠直接或間接產生可偵測訊號。舉例來說，此可偵測的部份可為一放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In或67Ga；一螢光或化學發光化合物，例如螢光素異氰硫酸鹽、若丹明或螢光素；或一酵素，例如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或山葵過氧化酶。
本發明之類抗體結合蛋白亦可有利於體內成像。一被標記具有可偵測的部份類抗體結合蛋白可以提供給一動物，更好地進入血流中，並可分析在宿主中之被標記抗體的存在與位置。此類抗體結合蛋白可以被標記在動物內具有任何可偵測的部份，不管核磁共振、放射線或其他此領域中已知偵測手段。
本發明亦有關一套組，包括一類抗體結合蛋白和其他在生物樣品中可用來偵測目標抗原的級別的試劑。這些試劑可以包含可偵測的標記、阻斷血清、正和負控制樣品以及偵測試劑。
4.類抗體結合蛋白治療組成物及其給藥
包含類抗體結合蛋白的治療或醫藥組成物係屬於本發明之範疇內。此類治療或醫藥組成物可以包含治療上有效量之一類抗體結合蛋白、或是類抗體結合蛋白-藥物複合體，係添加有根據給藥方式選擇適當的藥或生理上可接受的調配物。
可接受的調配物材料較佳者為對接受者在所利用的劑量及集中上為無毒者。
此醫藥組成物可包含調配物材料來修改、保持或保存組成物的，例如，pH值、滲透性、黏性、清晰度、色彩、等滲透壓性、氣味、不孕性、穩定性、解離或釋放速率、吸附性或穿透性。合適的配方材料包含但不限定於，胺基酸(例如甘胺酸、榖胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸)、抗菌劑、抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝劑(例如硼酸、碳酸氫鹽、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)、填充劑(例如甘露醇或甘胺酸)、螫合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、錯化劑(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)、充填劑、單醣類、貳醣類或其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或葡聚糖)、蛋白質(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、香料和稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多胜肽、鹽形成相對離子(例如鈉)、防腐劑(例如氯化苄二甲烴銨、安息香酸、水揚酸、乙汞硫柳酸鈉、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥苄酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或溼潤劑(例如共聚合物；PEG；山梨糖醇酐酯；聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；氚 核；氨丁三醇；卵磷脂；膽固醇或四丁酚醛)、穩定增加劑(例如蔗糖或山梨醇)、張力增加劑(例如鹼性金屬鹵化物-較佳者為鈉或氯化鉀-或甘露醇山梨醇)、輸送載體、稀釋液、賦形劑及/或輔藥(參見，例如，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(18th Ed.,A.R.Gen-naro,ed.,Mack Publishing Company 1990)，以及其後續發明之版本，為任何目的於此結合參考)。
最理想的醫藥組成物將受依賴之熟練的專業人士所決定，例如，給藥的預期途徑、輸送形式和要求的劑量。此類組成物可以影響身體狀態、穩定性、類抗體結合蛋白的體內釋放速率和體內清除速率。
醫藥組成物中之主要的運載體或載體可為天然的水性或非水性。例如，一個適合注射的運載體或載體可為水、生理食鹽水溶液或人造腦脊髓液，腸胃外給藥可能需要捕充其他材料至組成物中。中性緩衝鹽水或混合有血清白蛋白的鹽水更可為示範的運載體。其他示範的醫藥組成物包括pH值大約為7.0-8.5之三羥甲基氨基甲烷緩衝液，或是pH值大約為4.0-5.5的乙酸鹽緩衝液，其係更可包含山梨醇或合適的替代物。在本發明之一實施例中，類抗體結合蛋白組成物可以利用混合所選擇之具有要求純度等級組成物和選擇配方劑以形成一凍乾塊狀物或是一水溶液來製備成可供貯存的形式。另外，此類抗體結合蛋白使用適當的賦形劑例如蔗糖可以配製成冷凍產物。
本發明之醫藥組成物可以選擇腸胃外輸送。或者是，此組成物可以選擇吸入法或經由消化道輸送，例如口服。此藥學上可接受的組成物的製備係為熟悉此項技術者所熟知。
此調配物成份會以濃度方式存在，使其為給藥位置可接受的濃度。例如，緩衝液係用來使組成物保持在生理的pH值或微低的pH值，通常係在從大約5至大約8的pH值範圍內。
若考慮腸胃外給藥，在本發明使用之治療組成物可以無熱源的、腸胃外可以接受的、包括要求的類抗體結合蛋白位於在藥學上可接受的運載體的水溶液之形式。一具體適用於腸胃外注射的運載體係為無菌蒸餾水，在此一類抗體結合蛋白係配製成一無菌、等滲透壓溶液，以適當的保存。然而，另一種製備可以包含具有試劑的要求分子之配方，例如，注射微球、生物可蝕性微粒、高分子化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體，其係提供產品受控制或持續的釋放，然後便可透過積存注射輸送。亦可使用玻尿酸，且此係具有促進循環持續期間的效果。引入所要求的分子的其他合適的手段包含植入式藥物輸送裝置。
在一實施例中，一醫藥組成物可以配製成吸入劑。例如，一類抗體結合蛋白可以配製成乾燥粉末作為吸入劑。類抗體結合蛋白吸入劑溶液亦可與推進劑配製成霧劑輸送。在另一實施例中，溶液可以為噴霧狀。
亦可考慮使用某些配方作為口服給藥。在本發明一實施例中，以這種方式給藥的類抗體結合蛋白可以製備成有或沒有那些載體，係通常使用在配合的固體劑量形式，例如錠劑和膠囊。例如，一膠囊可以設計成釋放配方的有效部份在消化道位置，使生物利用率增加至最大，且體循環前下降減到最小。添加的試劑可被包含來使類抗體結合蛋白的吸收更為容易。亦可利用稀釋液、香料、低熔點石蠟、蔬菜油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩散劑和黏結劑。
另一醫藥組成物可包含一有效量的類抗體結合蛋白與無毒賦形劑混合成適合錠劑的製造。藉由錠劑溶解在無菌水中或另一適當的運載體，溶液可以被製備成單位劑量形式。適當的賦形劑包含，但不限於惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鹽、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
本發明額外之醫藥組成物對於熟悉此項技術者所明白的，包括含有在持續的或受控制的輸送配方內的類抗體結合蛋白之配方。配製各種持續的或受控制的輸送手段的技術，例如脂質體載體、生物可蝕性微粒或多孔珠粒和積存注射，此亦為熟悉此項技術者所熟知的。持續釋放配製的更多實例包含半透性聚合物基質以形成某種形狀的物品，例如，薄膜或微膠囊。持續的釋放基質可包含聚酯、水膠、聚丙交酯、L-麩胺酸和γ乙基-L-麩胺 酸的共聚合物、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羥丁酸。持續的釋放組成物亦可包含脂質體，其係可由現有技術的數種已知方法來製備。
本發明之醫藥組成物使用於體內給藥通常必須是無菌的，此可透過無菌過濾薄膜的過濾來完成。此組成物在哪裡凍乾，就可以使用此方法的無菌在之前或之後引導冷凍乾燥法和還原。用於腸胃外給藥的組成物可以貯存在凍乾形式或一溶液中。另外，腸胃外組成物一般放置於具有無菌出入口的容器，例如，一靜脈注射溶液袋或具有一被皮下注射針刺穿之塞子的藥水瓶。
一旦此醫藥組成物已被配製，其可呈溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或是乾燥或凍乾的粉末被貯存於無菌藥水瓶中。此類調配物亦可貯存在一即用形式或是在給藥前需要還原的形式(例如，凍乾)。
本發明亦包含用以產生單劑量給藥單元的套組。每一套組皆係包含一具有乾燥蛋白質的第一容器和一具有水溶液配方的第二容器。包含有單一和多腔室預充式注射器(例如，液體注射器和二室注射器)的套組亦包含在本發明之範疇內。
有療效地利用一類抗體結合蛋白醫藥組成物的有效數量將取決於，例如治療的背景與目的。熟悉此領域之技術者將正確鑑別治療用的適當劑量級別，在某種程度上，將因此基於分子輸送而變化，此指示是為了使用的 類抗體結合蛋白、給藥的途徑，和病患的尺寸(體重、體表或器官尺寸)和狀況(年齡和一般健康)。因此，臨床醫生可以滴定量劑量和修改給藥途徑，以得到最理想的治療效果。一典型之劑量範圍可以取決於上述之因素而從大約0.1 μg/kg提高至大約100 mg/kg或更多。在其他實施例中，此劑量範圍可以從0.1 μg/kg提高至大約100 mg/kg；或1 μg/kg提高至大約100 mg/kg；或5 μg/kg、10 μg/kg、15 μg/kg、20 μg/kg、25 μg/kg、30 μg/kg、35 μg/kg、40 μg/kg、45 μg/kg、50 μg/kg、55 μg/kg、60 μg/kg、65 μg/kg、70 μg/kg、75 μg/kg提高至大約100 mg/kg。
給藥的次數將取決於使用調配物的類抗體結合蛋白的藥物動力學參數。典型地，一臨床醫生將提供此組成物直到可達到要求效果的劑量。此組成物可因此給予單一劑量，反覆給予雙或更多劑量(其係可以或不可包含所要求分子的相同數量)，或是透過一注入裝置或導管的連續注入。適當劑量進一步的改進慣常地由熟悉此領域之技術者所決定，且其屬於他們所執行的工作範圍內。適當劑量反應資料的使用可以確定適合的劑量。
此醫藥組成物的給藥途徑係與已知方法一致，例如，口服；透過靜脈內、腹膜內、大腦內(薄壁組織內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內、門脈內或病灶內的注射等途徑；透過持續釋放系統；或透過注入裝置。需要此此組成物之位置係可以透過彈丸注射或連續 注入，或是注入裝置來給予。
此組成物亦可局部給藥，其係透過薄膜、海綿或其他適當材料注入到已被吸收或封裝的所要求分子。注入裝置在哪裡使用，此裝置即可注入至任何適當的組織或器官，且所要求分子的輸送可以透過擴散、定時釋放彈丸或連續給藥。
5.實例
以下的實例是本發明的具體化說明和其各種應用。他們只提出關於目的說明，但不應以任何方式解釋為限制本發明之範疇。
實例1. 雙特異性交叉雙變異區類抗體結合蛋白的設計與工程
在一Fv形式之交叉雙變異區係描述於美國專利號5,989,830，且其係被稱為交叉雙頭(CODH)組態。分子模型預測此交叉雙頭(CODH)設計產生具有二結合位置面對相對的方向的複合物，沒有限制的建議此雙-Fv組態。檢查此CODH Fv形式，以決定是否可藉由增加CL區域至輕鏈和Fc區至重鏈來轉變為完整的類抗體分子。一類似的轉換係成功的產生對應的雙變異區域(DVD-Ig)和TBTI，如描述於美國專利號7,612,181和國際公開號WO 2009/052081。在CODH形式下的變異 區的排列係表示如下面之結構，其係指出胜肽鏈的胺基至羰基位向：
(a)輕鏈：NH2-VL1-連結子-VL2-COOH
(b)重鏈：NH2-VH2-連結子-VH1-COOH
此變異區的胺基至羰基末端以上述(a)和(b)排列，可以從表示在雙-Fv組態的下面(c)和(d)的排列中辨別：
(c)輕鏈：NH2-VL1-連結子-VL2-COOH
(d)重鏈：NH2-VH1-連結子-VH2-COOH
注意到最主要的差異係為有區別的配置此對應的輕鏈和重鏈變異區(VH1/VL1和VH2/VL2)有關二個別的雙變異區組態。此對應的VL1和VH1區域兩個都在雙變異區組態內輕和重鏈的N-末端。相對地，在此交叉組態，一對抗體變異區的一半係在蛋白質鏈空間內被分離為交叉組態。在此交叉組態，此VL1區域能夠位於蛋白質輕鏈的N-末端，但配對的VH1區域位於交叉組態重鏈的C-終端。在雙變異區組態內發現的VL1和VH1間的空間關係為在天然抗體內發現的排列。
此雙Fv組態的一個潛在的不利條件係為連結子LL分離二變異區突出至此Fv2區域的抗原結合位置(參見圖1)。此突出可能會干擾抗原結合和導致擾亂抗原2至Fv2的可達性。此擾亂可達性或干擾可能會妨礙抗原結合。另外，此干擾可能更明顯的使抗原2所在位置尺寸變大。當然，在美國專利號7,612,181中記錄有一DVD- Ig分子的結合親和力和中和能力，取決於存在於N-終端或C-終端的抗原特異性。參見美國專利號7,612,181，實例2。
因此，為了創造更多穩定的類抗體結合蛋白，相較於親本抗體其較不會遭受抗原親和力的損失，具有CL區域在輕鏈上和一Fc區在重鏈上的交叉雙變異區分子將被設計和建構。形成這些類抗體蛋白的多胜肽係具有下面所示之結構，其係指出多胜肽鏈的胺基至羰基末端位向：
(e)輕鏈：NH2-VL1-連結子-VL2-CL-COOH
(f)重鏈：NH2-VH2-連結子-VH1-CH1-Fc-COOH
為了評估此雙特異性類抗體蛋白設計是否可結合二個不同抗原，二個事先產生且來自IL4(親代人源化抗-IL4)和IL13(親代人源化抗-IL13)的抗體特異性的人源化變異區係用來建構此雙特異性類抗體分子，如表1所示。小鼠抗體序列和人源化過程係描述於國際公開號WO 2009/052081(TBTI)。簡單地說，小鼠抗-IL13選殖體B-B13和小鼠抗-IL4選殖體8D4-8的變異重和輕鏈的胺基酸序列係由胺基酸序列所決定。此小鼠序列係為人源化，然後譯回核苷酸序列，如實例5描述的國際公開號WO 2009/052081，其係結合本文為完整的參考。此親代人源化抗-IL4 VH和VL以及親代人源化抗-IL13 VH和VL序列結合並排列如表1所示。在表1的第一欄簡寫編號設計為這些類抗體結合蛋白簡化討論。此類抗體結 合蛋白係異於插入二變異區間的連結子的尺寸，如表1所示。如表1所示之DNA分子編碼多胜肽係產生自譯回的親代抗-IL4和抗-IL13抗體。自IGHG1(GenBank Accession No.569F4)和IGKC(GenBank Accession No.Q502W4)可以獲得CH1、CL和Fc區域。
蛋白結合體如表2所示，其表現是由暫時轉染和利用蛋白A色層分析純化。在每一實例中，尺寸排除色層分析顯現少於12%的聚集，大部分少於7%的聚集；但是沒有發現可顯示任何能力與IL4或IL13結合的交叉雙頭疫球蛋白。然而，沒有功能性類抗體結合可以被檢測，且此缺乏活 性的理由可能無法確定。
先前已預測有這排列可顯示較高的穩定性在雙變異區區域抗體，係描述於美國專利號7,612,181和國際公開號WO 2009/052081。
實例2. CODV-Ig蛋白分子模型的設計
為了獲得足夠功能的類抗體蛋白，利用此交叉雙頭組態係可修正Fc和CL1區域的合併，一分子模型協議係為了包含和評估在重和輕鏈上位於不變和變異區域間以及在雙變異區域間的連結子。問題是，是否獨特連結子增加於重和輕鏈兩的每一不變/變異區域界面間和二變異/ 變異區域界面間可允許適合的蛋白摺疊，以在交叉雙變異區組態內發生或產生功能性類抗體分子(參見圖2)。換言之，共有四個獨立且獨特的連結子可以估計(參見圖2)。這分子模型協議係基於FvIL4和FvIL13區的同源性模型和實驗模型的蛋白-蛋白對接，分別結合在FvIL4和FvIL13區之間以及Fv和不變或Fc區之間的適當連結子。
此些獨立的連結子各分配有唯一的名字，如下所述：L1係指在輕鏈上N-末端VL和C-末端VL之間的連結子；L2係指在輕鏈上C-末端VL和CL之間的連結子；L3係指在重鏈上N-末端VH和C-末端VH之間的連結子；L4係指在重鏈上C-末端VH和CH1(和Fc)之間的連結子。值得注意的是，名稱VH和VL僅是指在最終形式，在特定蛋白鏈上的區域的位置。例如，VH1和VH2可能來自親本抗體的VL1和VL2區域，且在CODV-Ig內置入VH1和VH2位置。同樣地，VL1和VL2可能來自親本抗體的VH1和VH2區域，且在CODV-Ig內置入VH1和VH2位置。因此，VH和VL名稱係指在親本抗體中的現在位置而不是原始位置。
更詳細地，FvIL4的同源性模型係建構在PDB進入1YLD(輕鏈)和1IQW(重鏈)。此FvIL4二聚物係重構於IL13/抗-IL13 FabIL13複合物的內部晶體結構，且最佳化。為了獲得由IL4連結到FvIL4所需要估計的數量，IL4(1RCB.pdb)的晶體結構對接此FvIL4的同源性模 型。接著，此複合物產生的二十二個假定模型值得進一步考慮。
與此同時，FvIL4的同源性模型對接FvIL13，其係萃取自IL13/FabIL13複合物的內部晶體結構。發現一種對雙變異區免疫球蛋白而言較好的解決方案，可允許相對短連結子建構，以顯現沒有空間干擾的抗原結合和不變區域的配置(參見圖3)。在這排列FvIL4(VL1)係設置於輕鏈的N-終端，跟隨輕鏈C-終端上的FvIL13(VL2)和Fc(CL1)。在此重鏈，FvIL13(VH2)係設置於N-終端，跟隨FvIL4(VH1)和不變區(CH1-CH2-CH3)。
如表3所示，輕鏈模型建議，連結子L1位於VL1和VL2區域之間及連結子L2位於VL2和CL1區域之間應該分別介於一至三個及零至二個甘胺酸殘基長。重鏈模型建議，連結子L3位於VH2和VH1區域之間及連結子L4位於VH1和CH1區域之間應該分別介於二至六個及四至七個甘胺酸殘基長(參見表3和圖2)。在此實例中，使用甘胺酸作為連結子的原型胺基酸，但是其他胺基酸殘基亦可視為連結子。建議模型的結構穩定性以藉由連結子結構的最佳化、最小化和分子動力計算得到驗證。四個輕鏈和六個重鏈間的系統性結合構築體產生24可能的交叉雙變異區雙特異性抗-IL4和抗-IL13類抗體結合蛋白(參見表4)。
表3. 建議的連結子長度
在表4中，不包含此字首“抗”，但其意欲表示IL13係指抗-IL13且IL4係指抗-IL4。
實例3. CODV-Ig表現質體的產生
核酸分子編碼於表4中描述的六個重鏈和四個輕鏈的變異重和輕鏈，係藉由在Geneart(Regensburg,Germany)的基因合成來產生。此變異輕鏈區域會藉由限制內核酸酶ApaLI和BsiWI的消化作用來融合至不變輕鏈(IGKC,GenBank Accession No.Q502W4)，接著接合至附體型表現載體pFF的ApaLI/BsiWI位置，此pTT載體的相似物係描述在Durocher等人(2002,Nucl.Acids Res.30(2)：E9)，創造用來表現輕鏈的哺乳動物表現質體。
變異重鏈區域係融合至人類不變重鏈的“Ted”變異體(IGHG1,GenBank Accession No.569F4)，或是選擇性地融合至一來自人類不變IGHG1的6x His標記的CH1區域，以創造一雙特異性Fab。然後，此VH區域係以限制內核酸酶ApaLI和ApaI消化，然後分別融合至IGHG1或是His標記CH1區域，藉由接合至附體型表現載體pFF的ApaLI/ApaI位置，以創造用來表現重鏈的哺乳動物表現質體(分別是IgG1或Fab)。
實例4. CODV-Ig的表現
表現質體編碼對應構築體的重和輕鏈會在E.coli DH5a細胞內增殖。使用Qiagen的EndoFree Plasmid Mega套組可自E.coli中製備出用於轉染的質體。
如製造商所描述，在Freestyle Medium(Invitrogen 公司)成長的HEK 293-FS細胞使用293fectin(Invitrogen公司)轉染試劑來轉染指示LC和HC質體編碼顯示於表4的重鏈和輕鏈。7天後，利用離心作用來分離細胞，且上層液通過0.22 μm的過濾器來分離微粒。
CODV-IgG1構築體係利用親和力色層分析於蛋白A管柱(HiTrap Protein A HP Columns,GE Life Sciences)上進行純化。以100 mM乙酸鹽緩衝液和100 mM NaCl、pH值為3.5的管柱洗提之後，此CODV-IgG1構築體係使用HiPrep 26/10除鹽管柱(Desalting Columns)來去除鹽分，在濃度1 mg/mL的PBS並使用0.22 μm薄膜過濾。
雙特異性CODV Fab構築體係利用IMAC在HiTrap IMAC HP Columns(GE Life Sciences)上進行純化。以線性梯度的管柱(洗提緩衝液：20 mM磷酸鈉，0.5 M NaCl，50-500 mM咪唑，pH值為7.4)洗提之後，含片段的蛋白聯合，並使用HiPrep 26/10除鹽管柱去除鹽分，在濃度1 mg/mL的PBS中製備並使用0.22 μm薄膜過濾。
在280 nm處測量吸光度以測定蛋白濃度。在還原和無還原狀況下，每一批次皆利用SDS-PAGE進行分析，以測定每一子單元和單體的純度和分子量。
一個Nunc F96-MaxiSorp-Immuno培養盤係被覆有山羊抗-人類IgG(Fc特異性)[NatuTec A80-104A]。此 抗體係以碳酸鹽被覆緩衝液(50 mM碳酸鈉，pH值為9.6)稀釋至10 μg/ml，且每一孔分配有50 μL。此培養盤係以膠帶密封，且在4℃下貯存一整夜。此培養盤係以清洗緩衝液(PBS，pH值為7.4以及0.1% Tween20)清洗三次。150 μL的封閉液(1% BSA/PBS)係分配至每一孔中並覆蓋整個培養盤。在室溫下1小時之後，培養盤係以清洗緩衝液清洗三次。增加100 μL的樣品或標準(在1500 ng/ml至120 ng/ml的範圍中)且於室溫下靜置1小時。此培養盤係以清洗緩衝液清洗三次。加入使用孵育液(0.1% BSA，PBS，pH值為7.4以及0.05% Tween20)以1：10.000稀釋100 μL的山羊抗-人類IgG-FC-HRP共軛[NatuTec A80-104P-60]。在室溫下孵育1小時之後，此培養盤係以清洗緩衝液清洗三次。100 μL的ABTS基質(10 mg ABTS錠劑(Pierce 34026)於0.1 M Na2HPO4，0.05 M檸檬酸溶液，pH值為5.0)。在使用前加入10 μL的30% H2O2/10 ml基質緩衝液，係分配至每一個孔，且允許形成色彩。在色彩形成後(大約10至15分鐘)，加入50 μL的1% SDS溶液來停止反應。此培養盤在A405讀取。
實例5. CODV-Ig變異體的特性分析
為了測定CODV-Ig類抗體蛋白重鏈和輕鏈是否有成對和正確的摺疊，此聚集級別係利用分析分子篩層析法(SEC)測量。分析SEC係在使用ÄKTA explorer 10 (GE Healthcare)裝配對上完成，且其裝配有TSKgel G3000SWXL管柱(7.8 mm x 30 cm)和TSKgel SWXL保護管柱(Tosoh Bioscience)。此分析使用250 mM NaCl、100 mM Na-磷酸鹽，pH值為6.7，且在280 nm處以1 ml/min進行偵測。30 μL的蛋白樣品(在0.5-1 mg/ml)係提供給此管柱。對於分子大小的估計，使用凝膠過濾標準調配(MWGF-1000,SIGMA Aldrich)來校正此管柱。資料估算係使用UNICORN軟體v5.11來完成。
表5顯示使用表4描述之抗-IL4和抗-IL13變異區結合製作的第一組24個不同CODV-Ig分子的結果。在表4分配的編號代表在表4內相鄰的結構。對於輕鏈和重鏈對產生蛋白的位置，可以使用SEC測量其聚集級別，結果顯示於表5，其中LC4(L1=1；L2=2)幾乎與所有六重鏈成功成對。LC4相當於結構IL4 VL-(Gly)-IL13 VL-(Gly2)-CL1具有連結子L1等於1，其中單一胺基酸殘基分離雙變異區輕鏈的二個VL區域。另外，LC4具有L2等於2，其係包含Gly-Gly雙胜肽連結子位於中心VL和C-末端CH1之間。
*ND表示沒有蛋白產生
在CODV-Ig分子產生的地方，在中間物IL13和IL4集中處進行單一集中BIACORE試驗，以證實結合至目標抗原。選擇CODV-Ig類抗體分子相當於表4描述之LC4：HC4和LC4：HC6結合體，作為使用表面電漿共振的完整動力分析的估算。
如表5所描述者，大部分的CODV-Ig分子無法生產，或僅僅聚集而已(高達90%)。在色層分析步驟後，造成可接受的聚集級別(5-10%)的此重鏈/輕鏈結合體係為與輕鏈IL4 VL-(Gly)-IL13 VL-(Gly2)-CL1結合體。輕鏈在這些CODV-Ig變異體係為最挑剔的鏈，並作為平台來接受不同重鏈形成不同連結子組成物。
1.動力分析
選擇二對的重鏈和輕鏈作為完整的動力分析。重組人類IL13和IL4係購買自Chemicon(USA)公司。純化抗體的動力特性分析係在BIACORE 3000(GE Healthcare)上使用表面電漿共振技術來完成。使用一物種特異性抗體(例如，人類-Fc特異性MAB 1302，Chemicon)用來捕捉的捕捉試驗，並使用研究抗體的位向。透過伯胺族群(11000 RU)並使用標準程序使捕捉抗體固定在研究級CM5晶片(GE生命科學)上。此分析抗體係在具有調整RU值的10 μL/min流動率下捕捉， 且此RU值可導致30RU的最大分析結合。對照重組人類IL4和IL13在0至25 nM間之濃度範圍的HBS EP(10 mM HEPES，pH值為7.4，150 mM NaCl，3 mM EDTA和0.005%表面活性劑P20)，於30 μl/min流動率下測量結合動力學。晶片表面係以pH值為2.5的10 mM甘胺酸進行再生。使用流動細胞而毋需捕捉抗體作為參考，以BIAevaluation程式v4.1版分析並計算動力參數。
下表6顯示在CODV-Ig形式(表4，編號LC4：HC4和LC4：HC6)具有各自區域的親本BB13(抗-IL13)和8D4(抗-IL4)抗體(表示為IgGs)的動力比較。如表6所示，當比較親本抗-IL13和抗-IL4抗體時，此CODV-Ig構築體並沒有表現出減少對相應的抗原結合特性。在DVD-Ig/TBTI形式觀察到的結合速率之損失並未發生在使用相同Fv序列的CODV-Ig組態。此相對面的結合位置應該允許結合大抗原或橋接具有雙特異性類抗體組態的不同細胞，也將適用於親本抗體更廣泛的選擇。此CODV-Ig更進一步的優點是無連結子殘基突出至抗原結合位置以及減少抗原的可親性。
2. IL4和IL13的共注射用來證明藉由CODV-Ig的附加抗原結合
為了研究二抗原的附加結合，應用一種驅動精靈(wizard-driven)共注射方法，直接先以一抗原注射，在一延遲時間之後，再接著注射另一抗原(先IL4然後IL13，反之亦然)。產生的結合級別係係用來比較在相同濃度以1：1混合的二抗原所完成者。為了顯示二IL4和IL13抗原藉由CODV-Ig分子的附加結合，一BIACORE實驗係與CODV-Ig結合體[HC4：LC4]以二抗原的的共注射進行三次分離分析循環(參見圖4)。此共注射係以3.125 nM的IL4/25 nMIL13(反之亦然)進行，並以1：1混合的3.125 nM的IL4和25 nM的IL13進行。HBS-EP緩衝液的共注射係作為參考。不管共注射序列，在抗原混合注射後或是抗原共注射後，在800秒的時間點，係達到63 RU的同一級別。當CODV-Ig蛋白已藉由第一抗原(IL4)飽和，注射第二抗原(IL13)，並觀察到第二結合訊號。當抗原注射序列反轉，此觀察係會再次重現。這證明二抗原藉由CODV-Ig的附加的和非抑制的結合。所以，此CODV-Ig構築體可能會同時結合二抗原(即，展現雙特異性)飽和所有結合位置(即，展現四價)。
實例6. CODV-Ig之連結子長度的允差
各種長度的連結子容忍度的計算係利用建構具有不同連結子長度的結合體的CODV-Ig分子，L1、L2位於輕鏈上以及L3和L4位於重鏈上。CODV-Ig構築體之產生係與重鏈連結子L3和L4變化，L3係介於1到8殘基間以及L4係為0或1殘基。在CH1-Fc後，重鏈包含抗-IL4作為N-末端結合區域以及抗-IL13作為C-末端結合區域。此輕鏈連結子L1和L2變化，L1係從3至12殘基間變化以及L2係從3至14殘基間變化。在CL1後，此輕鏈包含抗-IL13作為N-末端結合區域以及抗-IL4作為C-末端結合區域。
1. CODV-Ig變異體的特性分析
聚集級別的測定係藉由分析分子篩層析法(SEC)。分析SEC係使用ÄKTA explorer 10(GE Healthcare)來完成，且其裝配有TSKgel G3000SWXL管柱(7.8 mm x 30 cm)和TSKgel SWXL保護管柱(Tosoh Bioscience)。此分析使用250 mM NaCl、100 mM Na-磷酸鹽，pH值為6.7，且在280 nm處以1 ml/min進行偵測。30 μL的蛋白質樣品(在0.5-1 mg/ml)係提供給此管柱。對於分子大小的估計，使用凝膠過濾標率調配(MWGF-1000,SIGMA Aldrich)來校正此管柱。資料估算係使用UNICORN軟體v5.11來完 成。
重組人類IL13和IL4係購買自Chemicon(USA)。重組人類TNF-α係購買自Sigma Aldrich(H8916-10μg)，重組人類IL-1β(201-LB/CF)、重組人類IL-23(1290-IL/CF)、重組人類EGFR(344 ER)以及重組人類ErbB2-Fc(1129-ER-50)皆購買自R&D Systems。
以Biacore進行動力結合分析如下所述。純化抗體的詳細動力特性分析係在BIACORE 3000(GE Healthcare)上使用表面電漿共振技術來完成。使用一物種特異性抗體(例如，人類-Fc特異性MAB 1302，Chemicon)用來捕捉的捕捉試驗，並使用研究抗體的位向。為了EGFR和ErbB2結合動力的測定，在實例5，表6中對應之CODV Fabs係使用抗-人類Fab捕捉套組(GE Healthcare)來捕捉。透過伯胺群組(11000 RU)並使用標準程序使捕捉抗體固定在研究級CM5晶片(GE生命科學)上。此分析抗體係在具有調整RU值的10 μL/min流動率下捕捉，且此RU值可導致30RU的最大分析結合。對照重組人類IL4和IL13在0至25 nM間之濃度範圍的HBS EP(10 mM HEPES，pH值為7.4，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.005%表面活性劑P20)，於30 μL/min流動率下測量結合動力學。晶片表面係以pH值為2.5的10 mM甘胺酸進行再生。使用流動細胞而毋需捕捉抗體作為參考，以BIAevaluation程式 v4.1版分析並計算動力參數。使用流動細胞而毋需捕捉抗體作為參考，以BIAevaluation程式v4.1版分析並計算動力參數。
表7總結了具有不同尺寸的連結子結合體之CODV-Ig於產量、聚集(以尺寸排除色層分析測量)和結合親和力的結果。這些結果顯露出L2為零者，CODV-Ig分子通常不能產生，或是蛋白產生，而具有較高聚集的級別(參見表7中之批次ID Nos.101、102、106-111和132-137)。所以，相較於來自實例2之分子模型預測，L2等於零者係在可接受範圍內；這些結果指出，此VL2-CL轉變(或L2)需要至少一個殘基的連結子(參見表7)。
另外，可以發現上述之CODV-Ig連結子長度如增加1胺基酸殘基會比增加2胺基酸殘基更加敏感。例如，批次ID Nos.103和104異於L2內的1胺基酸殘基，批次ID No.103顯示6摺疊更多聚集，以及批次ID No.104顯示較少的聚集和二倍的產量。相反地，批次ID Nos.104和105，其係異於在L2內的二殘基，並顯示出有關產量、聚集和結合的類似輪廓。
實例7. 重鏈作為CODV-Ig的樣板鏈
在實例1到5中，輕鏈上最理想的短連結子尺寸建議此輕鏈保持線性排列作為樣板，以及在重鏈上需要較大連結子以便重鏈可正確的摺疊至交叉組態來符合樣板輕鏈(參見圖5，圖A)。的不管短連結子是否特別設置於重鏈來維持線性排列在重鏈上成為重鏈“樣板”鏈，以及不管圖案是否會一再重複，需要較大的連結子來允許非-樣板鏈正確地摺疊，然後接著接著評估能容納現在的樣板重鏈(參見圖5，圖B).
圖6說明這些CODV-Ig設計理論係基於具有輕鏈或重鏈作為“樣板”。為了評估這觀念的一般性質，CODV-Ig構築體之產生係與重鏈連結子L3和L4變化，L3係介於1到8殘基間，以及L4係為0或1殘基。在CH1-Fc後，重鏈包含抗-IL4作為N-末端結合區域以及抗-IL13作為C-末端結合區域。此輕鏈連結子L1和L2變化，L1係從3至12殘基間變化以及L2係從3至14殘基間變化。在CL1後，此輕鏈包含抗-IL13作為N-末端結合區域以及抗-IL4作為C-末端結合區域。
表8總結了具有不同尺寸的連接子結合體之CODV-Ig於產量、聚集(以尺寸排除色層分析)和結合親和力的結果，其中重鏈係抱持線性排列作為樣板鏈，且輕鏈被允許摺疊成一交叉組態。這些結果顯露出L4為零者，CODV-Ig分子通常不能產生，或是蛋白產生，而具有較 高聚集的級別(類似於L2的分子等於零)(參見表8中之批次ID Nos.207-209、211-212、219-224、231-236、243-252和263-266)。有一個例外是批次ID No.210，其中L1為7、L2為5、L3為2以及L4為零。此排列產生足夠數量的蛋白，並具有一可接受的聚集和結合的級別，以提出某個結合體的連結子尺寸可以發現用來補償在某個環境下L4位置的零長度連結子。
從表7和表8之結果清楚顯示，連結子需要位於變異區域和不變區域間，以允許最理想的摺疊。只有在少數的排列為可容忍等於零的連結子(參見批次ID Nos.103-105，其中L1(LC)為零，以及批次No.204，其中L4為零)。然而，在每個實例中，在其他鏈上變異區和不變區間的對應轉變連結子不能為零。
上述結果指出，結合體L1=7、L2=5、L3=1和L4=2係為良好的起始點來最佳化一新的CODV-Ig，其中重鏈係為樣板。表9中的範圍顯示，可從二個親本抗體中成功設計出一新的CODV-Ig的合理範圍。
實例8. CODV-Ig形式的一般適用性
為了評估適合的CODV-Ig形式來設計新的類抗體結合蛋白，來自許多現存人類和人源化抗體的變異區具有特異性提供類胰島素生長因素1受體(IGF1R(1))、第二抗體至類胰島素生長因素1受體(IGF1R(2))、人類表皮生長因素受體2(HER2)、表皮生長因素受體(EGFR)、腫瘤壞疽因素-α(TNFα)、介白素12和23 (IL-12/23)和介白素1β(IL-1β)結合至CODV-Ig形式(參見表10)。
已知人類和人源化抗體的抗體變異區係用來測試在設計之雙特異性類抗體結合蛋白的CODV-Ig形式之一般適用性。另外，關於特定抗體變異區域配置的位置效應的可能性，要檢查N-末端或C-末端位在重鏈或輕鏈上。基於具有L1=7、L2=5、L3=1和L4=2的連結子組成物的CODV-Ig分子設計，抗體的不同序列係導入至CODV-Ig形式。如表11所示，所有構築體顯示出良好到優秀的蛋白產量和可接收的聚集級別(參見，尤其是，表11中的批次ID Nos.301和302)。每一抗體變異區域測量到的親和力係落入已公開或預期的親和力。在評估親和力的任何實例，沒有位置效應被偵測到。
總之，如下表所示，沒有位置效應被視為與任何的抗體變異區域使用，或是與這些抗體變異區域在任一抗體鏈上的使用。
實例9. 保留在CODV-Ig形式的親本抗體親和力
抗-IL4和抗-IL13的同一抗體序列係結合至TBTI/DVD-Ig或CODV-Ig形式，以與這些組態直接比較其連結子所在位置和產生分子的親和力。如圖7所示，每一抗體的親本親和力係保持在CODV形式。如圖7的上圖所示，當變異區設置於TBTI/DVD-Ig形式，定位在內部Fv2位置的IL4抗體的親和力，表明抗體結合至抗原的結合速率的減少。相反地，相較於親本抗體，CODV-Ig形式無親和力的損失(參見圖7，下圖)。
實例10. CODV-Ig至Fab形式的適應性
接著評估形式提供片段，例如Fab片段的能力。可以觀察到直接的優點是，在CODV位向的類Fab分子顯示無聚集的傾向並保留親本抗體的親和力(參見表12)。自批次ID Nos.401-421開始建構的結合蛋白係直接比較於類抗體蛋白，其中，抗體變異區與重鏈排列在CODV-Ig分子，如同樣板(401、402、406和407)、CODV類Fab片段(402、408、413、418和421)、四區域類抗體分子在 TBTI/DVD-Ig形式(404、409、414和419)以及無連結子之CODV-Ig(405、410、415和420)。如表12所示，比較結果指出，當變異區結合至一TBTI或DVD-Ig形式時，相較於親本抗體，可能有更多的親和力損失。相反地。CODV-Ig和CODV-Ig類Fab形式二者較能維持親本的親和力。這些結果更可確認，CODV-Ig分子需要連結子在變異區之間以及在變異區和不變區域之間(參見表12)。
實例11. 在CODV-Ig和CODV-Fab內變異區域的取代
為了特徵化T-細胞接合方法中之CODV形式，具有TCR結合位置(CD3ε)和CD19結合位置的雙特異性CODV類Fab結合蛋白(CODV-Fab)產生，並比較於一來自TBTI/DVD-Ig形式的雙特異性Fab(B-Fab)。為了研究結合位置(TCR x CD19對CD19 x TCR)位向的重要性，每一結合蛋白的二個位向皆要評估。
結合蛋白的特徵化係在細胞毒素試驗中進行，係使用NALM-6(CD19表現)細胞作為目標細胞以及主要人類T-細胞作為作用體細胞。CD3正細胞係自最近製備的人類PBMC's分離。作用體和目標細胞以10：1的比率混合，並與雙特異性結合蛋白的指示濃度培養20小時(參見圖8)。凋亡目標細胞係以使用7-氨基放線菌素染色之基於FACS試驗來決定。
在組態CD3-CD19(1060)中的B-Fab形式係顯示主動引誘T-細胞傳達細胞毒性至NALM-6細胞具有3.7 ng/ml的EC50。一相似的高活性觀察自CD19-CD3 CODV-Fab(1109)具有3.2 ng/ml的EC50(參見圖8)。
B-Fab分子(TBTI/DVD-Ig形式的Fab)至CD19-CD3位向的組態交換產生活性的重大損失(參見圖8)。對於CODV-Ig Fab的位向和B-Fab的另一位向，交換B-Fab分子顯示在濃度最高時無活性。對於CODV-Ig Fabs和 B-Fab的一位向，發現到最大反應(於1和100 ng/ml的範圍內)。對於B-Fab的CD19-CD3位向，甚至是在最大濃度(30 μg/ml)，無法達到最理想的細胞毒素反應。在鮮明的對比下，在CODV-Fab至CD3-CD19(1108)內區域的位向變化，在此試驗中，產生具有顯著活性的分子(參見圖8)。雖然在CODV-Fab CODV-Fab的區域交換亦可減少T-細胞傳達細胞毒性(藉由因素~100增加EC50)的誘導，此效應是遠遠低於在B-Fab形式中所看見者，且分子可能誘導細胞毒性上升至最大級別。這些資料為代表性，且自三個獨立實驗中取得。
實例12. 胺基酸序列本身對CODV-Ig連結子的影響
選擇對應於批次ID 204(參見實例7和表8)的最佳化構築體，以研究連結子組成物對連結子L1至L4的影響。連結子長度上設定在7、5、1和2個殘基長度分別對應L1、L2、L3和L4(參見表13)。測試序列係來自自然抗體VH和CH1區域之間或是或λ輕鏈上的抗體Fv和CL區域之間的自然存在連結子轉變。候選序列係為來自VH和CH1區域轉變的ASTKGPS(SEQ ID NO：48)，分別來自或λ輕鏈上的Fv和CL區域轉變的RTVAAPS(SEQ ID NO：49)和GQPKAAP(SEQ ID NO：50)。再者，一構築體可以與任意連結子組成物產生，以顯示任何序列有可 能使用於連結子L1至L4。這連結子組成物之獲得可藉由任意分配胺基酸纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、榖胺醯胺、甘胺酸和脯胺酸之四連結子的15個位置。芳香族胺基酸苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸，和胺基酸甲硫胺酸和半胱胺酸則故意排除在外，以避免可能的聚集增加。
批次ID No.204的三維模型構築體的產生是為了確保適當的或是提純這些連結子組成物的選擇。如此，為連結子L3選擇絲胺酸，正和負電荷殘基被觀察到在三維模型附近。選擇連結子L4內之殘基可相容於此模型建議這些位置的溶劑接觸。同樣地，預期或預測L1和L2的連結子組成物為沒問題的。選擇建議的連結子組成物之三維模型已建構完成。
如表12所示，連結子組成物可能對產量具有巨大影響。來自L1上的λ鏈的序列(比較批次ID Nos.505-507和批次ID Nos.501-503)係為更多生產性的蛋白產生器(增加至8折疊)。當然，基於任意產生的連結子亦可產生十足的產量，如表13所示，批次ID No.508。因此，連結子組成物在CODV-Ig最佳化過程中應該是要考慮的一個參數。
實例13. 引進半胱胺酸至CODV-Ig連結子
公開文獻建議，抗體和來自抗體蛋白的穩定性可利用引進非自然雙硫架來增加(參見Wozniak-Knopp等人，2012,“Stabilisation of the Fc Fragment of Human IgG1 by Engineered Intradomain Disulfide Bonds,”PLoS ONE 7(1)：e30083)。為了調查相等的Fc片段是否來自人類IgG1抗體，且設計成一CODV-Ig分子可藉由引進中間鏈和內部鏈雙硫架橋來穩定，建構批次ID No.204(來自實例7)的相等的Fc位置係突變至半胱胺酸殘基，且此突變蛋白係被過度生產、純化和特徵化(參見表14)。
如表14所示，每一突變的CODV-Ig分子包含附加的半胱胺酸殘基，其係具有熔解溫度，此與CODV-Ig建構批次ID No.204的熔解溫度相同。
另外，，二個半胱胺酸同時導入至每一變異區域上的輕鏈位置100和重鏈位置44，描述在Brinkmann等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：7538-42。這些位置已顯示結構上的保存在抗體折疊內，且因而可容許半胱胺酸取代而不會干擾個別區域的完整。
如表15所示，CODV和CODV-Ig構築體，其中半胱胺酸殘基係導入至至每一變異區域上的輕鏈位置100和重鏈位置44，係比半胱胺酸殘基無導入至這些位置的CODV和CODV-Ig構築體具有更高的熔解溫度(參見，例 如，批次ID Nos.704和706以及批次ID Nos.713和714)。
1. CODV和TBTI變異體的熱穩定性測量
CODV和TBTI變異體的熔點(Tm)係使用微差掃描螢光分析(DSF)來測定。樣品係在D-PBS緩衝液(Invitrogen)中稀釋至0.2 μg/μl的最終濃度，並加入2μl的40倍SYPRO-橙色染料(Invitrogen)的濃縮溶液在白色半裙邊96孔培養盤內的D-PBS中。所有測量的進行都是完全一樣地使用一MyiQ2即時PCR儀器
(Biorad)。使用iQ5軟體v2.1自熔解曲線的負第一衍生物中取出Tm值。
接著調查直接引進半胱胺酸殘基至連結子或變異區內的影響。在這實例中，使用批次ID No.204(來自實例7和表8)作為模型CODV-Ig結合蛋白，且半胱胺酸係取代在L1、L3或是基於三維模型的變異區上的甘胺酸。如下面表16所示，這些結果指出，半胱胺酸對的引進將會如何影響產量和聚集。所有設想的突變將被模型化，以確定雙硫鍵適當的形成，且對於在模型中連結子和其環境維持正確的幾何形狀。然而，批次ID No.808顯示良好的產量和少量的聚集，因此建議可以形成有適當的半胱胺酸架橋。
本發明所描述之各種實施例，熟習此項技藝之人士當可輕易變化或修飾。因此，凡依本發明所揭示之內容所作之均等變化，仍應涵蓋在本發明請求之範圍內。另外，在此使用之部份標題僅係作為組織上的目的說明，並非用來解釋為所述主題的限制。
在本說明書中所有引用的參考係明確地納入本文參考中。
圖1.圖式代表在雙V區組態內的抗原結合區域Fv1和Fv2以及它們各自的胜肽連結子LL和LH在TBTI形式的排列。
圖2.在CODV組態內的抗原結合區域Fv1(抗-IL4)和Fv2(抗-IL13)以及它們各自的胜肽連結子排列的示意圖(2D)。
圖3.圖式代表在顯示一種可能的空間排列之Fv抗-IL4和Fab抗-IL13，其由抗-IL4的Fv和抗-IL13的Fv的蛋白蛋白對接獲得。
圖4. CODV蛋白的四價的和雙特異性結合能力係於一BIACORE分析中評估，其係利用連續或是同時注射二抗原至一DVD-Ig蛋白覆蓋晶片上。連續注射觀察到的最大訊號可以藉由二抗原的共注射來獲得，證明所有結合位置的飽和。
圖5.在CODV組態內的抗原結合區域以及他們各自的胜肽連結子LL(L1和L2)和LH(L3和L4)排列的示意圖(2D)。在圖A中，此輕鏈係保持在一“線性或樣板”直線上，而重鏈係位於“交叉”組態。在圖B中，此重鏈係保持在一“線性或樣板”直線上，而輕鏈係位於“交叉”組態。
圖6.圖式代表根據不管是輕鏈或重鏈使用作為“樣板”的CODV-Ig設計。
圖7.併入抗-IL4和抗-IL13序列之TBTI/DVD-Ig或CODV-Ig分子的比較。
圖8.在一使用NALM-6細胞的細胞毒性分析中，CODV-Fab和B-Fab形式的比較。
<110> Rao,Ercole Mikol,Vincent Corvey,Carsten Beil,Christian Lange,Christian Steinmetz,Anke Baurin,Nicolas Li,Danxi
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<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自抗-IL4的人源化抗體輕鏈(VL)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自抗-IL4抗體的人源化重鏈V區(VH)
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自抗-IL13抗體的人源化輕鏈V區(VL)
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自抗-IL-13抗體的人源化重鏈V區(VH)
<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 交叉雙頭建構IL13(G4S)IL4CHFc的重鏈
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<223> 交叉雙頭建構IL4(G4S2)IL13CHFc的重鏈
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<223> 交叉雙頭建構IL13(G4S)IL4CL的輕鏈
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<223> 交叉雙頭建構IL13(G4S2)IL4CL的輕鏈
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<213> 人工序列
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<223> 交叉雙頭建構IL4(G4S)IL13CL的輕鏈
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<213> 人工序列
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<223> 交叉雙頭建構IL4(G4S2)IL13CL的輕鏈
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<223> 具有編碼LC4的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
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<223> 具有四甘胺酸殘基的胜肽連結子
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<223> 具有5甘胺酸胺基酸殘基的胜肽連結子
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<223> 具有編碼HC12的交叉雙V-Ig之重鏈序列
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<223> 具有編碼HC16的交叉雙V-Ig之重鏈序列
<400> 38
<210> 39
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼HC17的交叉雙V-Ig之重鏈序列
<400> 39
<210> 40
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼LC10的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
<400> 40
<210> 41
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼LC11的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
<400> 41
<210> 42
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼LC12的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
<400> 42
<210> 43
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼LC13的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
<400> 43
<210> 44
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼LC14的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
<400> 44
<210> 45
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼LC15的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
<400> 45
<210> 46
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼LC16的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
<400> 46
<210> 47
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有編碼LC17的交叉雙V-Ig之輕鏈序列
<400> 47
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連結子
<400> 48
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連結子
<400> 49
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連結子
<400> 50
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連結子
<400> 51
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連結子
<400> 52
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連結子
<400> 53
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連結子
<400> 54
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連結子
<400> 55
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工胜肽連結子
<400> 56
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工胜肽連結子
<400> 57
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工胜肽連結子
<400> 58
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工胜肽連結子
<400> 59

Claims (21)

  1. 一種類抗體結合蛋白，其包含係形成四個抗原結合位置之四個多胜肽鏈，其中二個多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]以及二個多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；Fc係為免疫球蛋白絞鏈區和CH2、CH3免疫球蛋白重鏈不變區域；以及L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子，其中L2為至少1個胺基酸殘基長度，及L4為至少1個胺基酸殘基長度；以及其中該式I的多胜肽和式II的多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
  2. 一種類抗體結合蛋白，包含形成二個抗原結合位置之二個多胜肽鏈，其中第一多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VL1-L1-VL2-L2-CL [I]以及第二多胜肽鏈具有下式所表示之結構：VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]其中：VL1係為第一免疫球蛋白輕鏈變異區域；VL2係為第二免疫球蛋白輕鏈變異區域；VH1係為第一免疫球蛋白重鏈變異區域；VH2係為第二免疫球蛋白重鏈變異區域；CL係為免疫球蛋白輕鏈不變區域；CH1係為免疫球蛋白CH1重鏈不變區域；以及L1、L2、L3和L4係為胺基酸連結子，其中L2為至少1個胺基酸殘基長度，及L4為至少1個胺基酸殘基長度；以及其中該第一和第二多胜肽形成一交叉輕鏈-重鏈對。
  3. 如請求項1或2之類抗體結合蛋白，其中：L1為3至12個胺基酸殘基長度；L2為3至14個胺基酸殘基長度；L3為1至8個胺基酸殘基長度；及L4為1至3個胺基酸殘基長度。
  4. 如請求項1或2之類抗體結合蛋白，其中：L1為5至10個胺基酸殘基長度；L2為5至8個胺基酸殘基長度；L3為1至5個胺基酸殘基長度；及L4為1至2個胺基酸殘基長度。
  5. 如請求項1或2之類抗體結合蛋白，其中：L1為1至3個胺基酸殘基長度；L2為1至4個胺基酸殘基長度；L3為2至15個胺基酸殘基長度；及L4為2至15個胺基酸殘基長度。
  6. 如請求項1或2項之類抗體結合蛋白，其中：L1為7個胺基酸殘基長度；L2為5個胺基酸殘基長度；L3為1個胺基酸殘基長度；及L4為2個胺基酸殘基長度。
  7. 如請求項1或2項之類抗體結合蛋白，其中：L1為1個胺基酸殘基長度；L2為2個胺基酸殘基長度；L3為7個胺基酸殘基長度；及L4為5個胺基酸殘基長度。
  8. 如請求項1或2之類抗體結合蛋白，其中一或多個L1或L3為0個胺基酸殘基長度。
  9. 如請求項1或2項之類抗體結合蛋白，其中該結合蛋白具有可特異性結合一個或多個抗原目標之能力。
  10. 如請求項9之類抗體結合蛋白，其中該一個或多個抗原目標係選自B7.1、B7.2、BAFF、BlyS、C3、C5、CCL11(嗜酸粒細胞趨化蛋白)、CCL15(MIP-1d)、CCL17(TARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、SLC、CCL24(MPIF-2/嗜酸粒細胞趨化蛋白-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸粒細胞趨化蛋白-3)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CD3、CD19、CD20、CD24、CD40、CD40L、CD80、CD86、CDH1(E-鈣黏蛋白)、幾丁質酶、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CX3CL1(SCYD1)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、EGFR、FCER1A、FCER2、HER2、IGF1R、IL-1、IL-12、IL13、IL15、IL17、IL18、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1β、IL2、IL4、IL6、IL7、IL8、IL9、IL12/23、IL22、IL23、IL25、IL27、IL35、ITGB4(b4整合蛋白)、LEP(瘦蛋白)、第II類MHC、TLR2、TLR4、TLR5、TNF、TNFα、TNFSF4(OX40配位基)、TNFSF5(CD40配位基)、類鐸受體、TREM1、TSLP、TWEAK、XCR1 (GPR5/CCXCR1)、DNGR-1(CLEC91)及HMGB1所組成之群組。
  11. 如請求項1或2項之類抗體結合蛋白，其中該結合蛋白係為雙特異性且具有結合二種不同抗原目標之能力。
  12. 如請求項11之類抗體結合蛋白，其中該二種不同抗原目標係選自IL4和IL13、IGF1R和HER2、IGF1R和EGFR、EGFR和HER2、BK和IL13、PDL-1和CTLA-4、CTLA4和第II類MHC、IL-12和IL-18、IL-1α和IL-1β、TNFα和IL12/23、TNFα和IL-12p40、TNFα和IL-1β、TNFα和IL-23以及IL17和IL23所組成之群組。
  13. 如請求項1或2項之類抗體結合蛋白，其中至少一個選自L1、L2、L3及L4所組成的群組之連結子係含有至少一個絲胺酸殘基。
  14. 一種分離之核酸分子，其包含編碼如請求項1至13中任一項之類抗體結合蛋白的核苷酸序列。
  15. 一種表現載體，其包含如請求項14之核酸分子。
  16. 一種分離之宿主細胞，其包含如請求項14之核酸分子或如請求項15之表現載體。
  17. 如請求項16之宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳類動物細胞或昆蟲細胞。
  18. 一種醫藥組成物，其包含醫藥上可接受之載劑及治療有效量之如請求項1至13中任一項之類抗體結合蛋白。
  19. 一種製造如請求項1至13中任一項之類抗體結合蛋白之方法，其包含使請求項14之核酸分子表現於一細胞中。
  20. 如請求項19之方法，其中該類抗體結合蛋白之第一抗體變異區域和第二抗體變異區域係為相同者，其中該第一抗體變異區域為VL1及VH1，且該第二抗體變異區域為VL2及VH2。
  21. 如請求項1或2之類抗體結合蛋白，其中L2與L4兩者為至少一個胺基酸長度，且(a)L2長度為至少二倍之L4長度；或(b)L4長度為至少二倍之L2長度。
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