CN104418947A - 抗her2和抗-igf-ir的双特异性抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开的抗体或其结合片段，特异性结合人HER2和人IGF-IR。还提供了编码本发明的抗体和结合片段的核酸分子及含有这些核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还提供一种使用本文所述抗体用来抑制哺乳动物中癌细胞生长和转移的方法，以及含有该抗体、编码该抗体的核酸分子的组合物，以及含有该核酸分子的宿主细胞和载体。本发明还提供了该多肽在哺乳动物中用于检测HER2和IGF-IR存在的应用，以及能够用于癌症疫苗免疫原的表位。

Description

抗HER2和抗-IGF-IR的双特异性抗体及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年9月11日提交的61/876564号美国临时申请的权利。在此通过引用将2014年9月11日提交的61/876564号申请全部并入本文。

序列表的引用

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技术领域

本发明总体上涉及针对HER2和IGF-IR的有力的双特异性单克隆抗体，及使用其相同的用于癌症治疗的方法。

背景技术

人表皮生长因子受体2(HER2)，由ErbB2的基因编码，是表皮生长因子受体(EGFR/ErbB)家族的成员(Herbst,Int.J.放射肿瘤学生物物理杂志.59:1-6(2004))。HER2结构上类似于其他EGFR家族成员，包括HER1(EGFR，ERBB1)，HER3(ErbB3)，和HER4(ErbB4)，并且还作为一种受体酪氨酸激酶。HER1和HER4的经配体结合的同源二聚化激活固有细胞内蛋白酪氨酸激酶活性，导致受体的自磷酸化和下游信号传导。这些包括信号传导途径，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，该c-Jun的NH(2)-末端激酶(JNK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，其促进DNA合成，细胞增殖，并抑制细胞凋亡。HER3不具有酪氨酸激酶结构域，因此其通过配体结合来传送信号，该配体结合通过与具有激酶活性的其它EGFR家族成员异二聚化。

不像HER1，HER3和HER4，HER2是不能与配体结合并形成同二聚体。然而，HER2具有酪氨酸激酶活性，通过异聚复合物的形成，并显示为表皮生长因子受体家族成员的主要信号伙伴(Olayioye，乳房癌症研究3：385-9(2001))。2个EGFR家族成员之间的异二聚化需要配体结合(Spivak-Kroizman等人，生物化学杂志，267：8056-63(1992)；Ferguson等，分子细胞生物学11：507-17(2003))，但是一个被截断的HER2胞外结构域的晶体结构表明，HER2是组成型的活性构象，并主要容易与HER3和其它EGFR家族成员相互作用((Garrett等人的，分子细胞11：495-505(2003))。HER2过表达促进了HER2/HER3受体复合物配体依赖性的形成，HER2-过表达的乳腺癌细胞中的一个主要的致癌驱动子(Stern，科学译编4：127rv2(2012))。由胞外蛋白酶ADAM10裂解的HER2产生HER2胞外结构域和截短的，显示驱动癌变的组成性激活的HER2受体(p95HER2)(Liu等人，癌症生物学疗法5.648-56(2006))。HER2过表达与增强活性的PI3K途径相关，其中通过激活蛋白激酶Akt和下调细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂p27，来刺激细胞增殖(Lane等人，分子细胞生物学20：3210-23(2000))。HER2还可以通过与SHC和GRB2连接体蛋白相互作用激活MAPK途径(Dankort等人，生物化学杂志，276：38921-8(2001))。HER2过表达被发现在乳腺癌和卵巢癌，以及与癌症转移相关(AbuHejleh等人，科学世界Gastrointest肿瘤学4：103-8(2012)；Geng等人，生物医学Pharmacother.66：419-24(2012)；Nanni等人，公共科学图书馆一7：e39626(2012))，较差的临床结果，并降低存活率(Ravdin和Chamness，基因159：19-27(1995)；Slamon等，科学，235：177-82(1987)；Slamon等人，科学244：707-12(1989))。

胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF-IR)是由两个α亚基和两个β亚基组成的酪氨酸激酶受体。在结合到两个配位体，胰岛素样生长因子I(IGF-I)或IGF-II的α链的胞外结构域诱导细胞质的β链的酪氨酸磷酸化。这激活IGF-IR的激酶活性，并通过PI3K/Akt和Ras/MAPK途径触发下游信号传导，从而导致增加的细胞存活和细胞增殖(Jones和Clemmons，内分泌评论16：3-34(1995)；LeRoith等人，内分泌评论16：143-63(1995))。升高的IGF-IR在许多恶性肿瘤中发现，包括乳腺癌，前列腺癌和肺癌(Warshamana-Greene等人，临床癌症研究11：1563年至1571年(2005年)；Jones等人，Endocr Relat癌症11：793-814(2004))。此外，IGF-IR的过表达已经与疾病发展和癌症转移相关(Krueckl等，癌症研究64：8620-9(2004)；Yao等人，N.新英格兰医学杂志357：39-51(2007))。

HER2是一种广泛使用的诊断标记物和验证的治疗靶向物。人源抗HER2单克隆抗体赫赛汀(赫赛汀单抗)一直有效治疗HER-2过表达乳腺癌(Hudis，N新英格兰医学杂志357：39-51(2007)，Tokunaga等，Int J。临床，肿瘤学11：199-208(2006))。赫赛汀结合至HER2引起SKBR3和MDA453细胞受体的内化和降解(Cuello等人，癌症研究61：4892-900(2001))。赫赛汀结合HER2的细胞外部分的结构域IV，导致HER2/HER3的二聚化和下游的PI3K/Akt信号的消融扰乱(正色科学译编4：127rv2(2012)；Kute等人，细胞计数57：86-93(2004))。赫赛汀还可以抑制HER2胞外结构域在乳腺癌细胞的裂解，从而阻断组成型活性截短受体(p95HER2)的产生(Liu等人，癌症生物学疗法5：648-56(2006)；Albanell等，实验医学生物学进展532：253-68(2003)；Molina等人，癌症研究61：4744-9(2001))。此外，FC-介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)可部分地有助于赫赛汀在体内的抗肿瘤活性(Clynes等人，Nat医学6：443-6(2000))。

仅25-30％的乳腺癌患者过度表达HER2，并且随着病情的发展用赫赛汀治疗的患者可发展为抗药性。多种机制可以解释这种抗药性，这可能涉及PI3K/Akt通路，包括升高的HER2-相关受体与其他受体(当前的药物基因组学人类医学7：263-74(2009)；Nahta等人，Nat.临床肿瘤学PRACT3：269-80(2006))，HER2和其他受体之间的交叉激活(Yarden和Sliwkowski，Nat.Rev.Mol.细胞生物学，2：127-37(2001)；Huang等，癌症研究70：1204-1214(2010)；Nahta等人，癌症研究65：11118-28(2005))，通过膜结合的糖蛋白如粘蛋白-4的赫赛汀堵塞通过赫赛汀抗原表位的分裂，降低HER2的表达，或增加HER2的表达来移除。越来越多的证据表明，HER2和IGF-IR的间串扰，包括受体异二聚体化和转录，和升高的IGF-IR信号传导与赫赛汀抗性有关(Huang等人，癌症研究70：1204-1214(2010)；Jin和Esteva，乳腺生物学瘤杂志13：485-98(2008)，Bender和Nahta，Front.BIOSCI13：3906-12(2008)，Casa等人，Front.BIOSCI13：3273-87(2008))。

IGF-IR在HER2-过表达乳腺癌细胞系的过表达导致赫赛汀在体外的抗药性(Lu等人，J.Natl.癌症研究所93：1852-7(2001))。IGF-IR活性的抑制增强了HER-2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀单抗的响应(Browne等人，Ann肿瘤学22：68-73(2011))。HER2阳性乳腺癌患者的II期临床试验显示，IGF-IR在原发肿瘤的过度表达与赫赛汀的抗性相关(Harris等人，临床癌症研究13：。1198-207(2007))。我们先前描述的人/鼠嵌合单克隆抗体M590特异性的高亲和力结合到IGF-IR和阻断IGF-I和IGF-II的结合。这抑制配体诱导的乳腺癌MCF-7细胞的IGF-IR的磷酸化(Zhang等人，单克隆抗体1：475-80(2009))。

发明概述

如下面所描述的，双特异性抗HER2/抗-IGF-IR抗体，通过改造M590和赫赛汀生成。结果发现，在消融肿瘤细胞体外增殖和在HER2或IGF-IR的过度表达乳腺癌异种移植小鼠模型的体内SKOV-3，联合靶向HER2和IGF-IR与抗HER2/抗-IGF-IR比单独由单特异性抗体靶向HER2-和IGF-IR更有效。

本发明公开了特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)和人类胰岛素样生长因子受体I型(IGF-IR)的双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体同时结合人HER2和IGF-IR的对肿瘤细胞的细胞外结构域。在某些实施方案中，双特异性块的IGF-I和IGF-II结合IGF-IR。在其它实施例中它们结合HER2的细胞外段的结构域IV，扰乱HER2二聚化和HER3，切除(ablat)下游的PI3K/Akt信号，抑制HER2胞外结构域的裂解，并产生组成型活性的截短的HER2(p95HER2)，并降低HER2。因为双特异性抗HER2/抗-IGF-IR抗体结合至HER2和IGF-IR的同一细胞，它可以防止HER2抗体(赫赛汀)抗药性在HER2-和IGF-IR的过量表达的癌症。

在一些实施方案中，所述分离的抗体(抗-HER2/抗-IGF-IR)，或其结合片段，可以包括从赫赛汀HC1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，赫赛汀LC1(SEQ ID NO：2)，M590HC(SEQ ID NO：3)，M590LC(SEQ ID NO：4)，以及它们的组合，其中所述抗体特异性结合HER2的表位和IGF-IR。

本发明还公开了药物组合物，包含所公开的抗体，结合到抗体的表位，以及使用该抗体来治疗哺乳动物的癌症和检测哺乳动物中HER2和IGF-IR的方法。

此外，分离的核酸分子，其编码所公开的抗体或结合片段，其可以包括从赫赛汀HC1的DNA(SEQ ID NO：8)中选择的核酸序列，赫赛汀LC1的DNA(SEQ ID NO：9)，M590HC DNA(SEQ ID NO：10)，M590LC的DNA(SEQ ID NO：11)，以及它们的组合，其中所述核酸分子是任选在载体中的一种形式，其中所述核酸分子或载体任选包含在一个宿主细胞，其中所述抗体或其结合片段特异性地结合至HER2的表位和IGF-IR。本发明还提供了包含所述核酸分子或多肽的药物组合物，以及使用该核酸分子或多肽以抑制哺乳动物癌细胞生长和肿瘤转移的方法。

为了实现前述及相关目的，所述的化合物，组合物和方法可包括在下文中充分描述和权利要求中特别指出的。下面的描述和附图详细陈述某些说明性的方面和本发明的实施方式。这些是本发明原理可以采用的各种方式中的代表性的，或者，一部分的。当结合附图考虑本发明的以下详细描述，本发明的其他目的、优点、以及新特征将变得显而易见。

附图说明

图1显示了与M590和赫赛汀相比而言，结合到重组HER2和IGF-IR胞外结构域和膜结合的HER2和IGF-IR的抗HER2/抗-IGF-IR的双特异性抗体的特征。(A)施用10微克/毫升的M590或赫赛汀染色的MCF-7乳腺癌细胞和SKOV-3卵巢癌细胞的流式细胞数。(B)通过间接ELISA，同时结合抗HER2/抗-IGF-IR到重组IGF-IR(包衣)和HER2胞外结构域。(C)当SKOV-3细胞抗体浓度为2至10微克/毫升，通过流式细胞术，抗HER2/抗-IGF-IR，M590和赫赛汀结合到膜结合的IGF-IR和HER2。(D)SKOV-3细胞在不同浓度的抗体染色的平均荧光强度(MFI)。

图2示出了抑制乳腺癌细胞信号传导的抗-HER2/抗-IGF-IR在单独结合M590和赫赛汀或组合结合之间的比较。(A)IGF-I(1.5纳米)的抑制引起了MCF-7细胞中Akt和ERK在M590(40纳米)下的磷酸化。(B-C)在不存在的IGF-I的情况下，MCF-7(B)和SKOV-3(C)的细胞抗体抑制了ERK磷酸化。(D)IGF-I(1.5纳米)的抑制引起SKOV-3细胞中IGF-IR的磷酸化。(E-F)IGF-I(1.5nm)的抑制引起Akt和ERK在乳腺癌MCF-7(E)和SKOV-3(F)中的磷酸化。所有抗体都在100微克/毫升(B-F)进行试验。

图3示出了通过抗HER2/抗-IGF-IR和其ADCC活性在单独施用赫赛汀和M590或结合(Comb)施用相比较之下，卵巢癌SKOV-3细胞的增殖受到的抑制。(A)在MTT法下，SKOV-3细胞增殖的抑制。(B)在抗体浓度为1和5微克/毫升抗体的ADCC百分比。各抗体稀释物一式三份地在两种测定中测试，每次测定重复进行一次，并且一组数据被显示。

图4示出了抑制卵巢癌细胞的生长受到抑制，通过抗-HER2/抗-IGF-IR在SKOV-3HER2-和IGF-IR-过表达的异种移植小鼠模型中单独施用M590和赫赛汀或组合施用进行比较。(A)小鼠研究图。(B)各组小鼠在不同时间点的平均荧光强度。平均发光强度的对数值被在ANOVA(方差的单向分析)统计分析中，以测试是否有在同一时间点的任何两个基团之间存在显著差异。指示了两个配对组的显著差异(P值<0.001)。(C)各组中具有发光强度高于基准水平2倍的中的小鼠数(无接种)。

序列的简要说明

SEQ ID NO：1是赫赛汀抗体(DrugBank DB00072(BIOD00098，BTD00098的HC1区域的氨基酸序列；赫赛汀的重链)。

SEQ ID NO：2是赫赛汀抗体(DrugBank DB00072(BIOD00098，BTD00098的LC1区域的氨基酸序列；轻链赫赛汀)。

SEQ ID NO：3是M590抗体(张MY等人，单克隆抗体1：475-80，2009)的HC区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是M590抗体(张MY等人，单克隆抗体1：475-80，2009)在LC区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是人类CH3恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是一个抗人HER2抗体的CH3恒定区，其中，所述CH3恒定区包含一个T366Y突变的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是一个抗人IGF-IR抗体的CH3恒定区，其中，所述CH3恒定区包含一个Y407T突变的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是编码赫赛汀抗体的HC1区域(DrugBank DB00072(BIOD00098，BTD00098的核酸序列；赫赛汀的重链)。

SEQ ID NO：9是编码赫赛汀抗体(DrugBank DB00072(BIOD00098，BTD00098的LC1区域的核酸序列；轻链赫赛汀)。

SEQ ID NO：10是编码M590抗体(张MY等人，单克隆抗体1：475-80，2009)的HC区域的核酸序列。

SEQ ID NO：11是编码M590抗体(张MY等人，单克隆抗体1：475-80，2009)在LC区域的核酸序列。

SEQ ID NO：12是编码人CH3恒定区域2的核酸序列。

SEQ ID NO：13是编码抗人HER2抗体，其中所述CH3恒定区包含一个T366Y突变的CH3恒定区的核酸序列。

SEQ ID NO：14是编码抗人IGF-IR的抗体，其特征在于，CH3恒定区包含一个Y407T突变的CH3恒定区的核酸序列。

SEQ ID NO：15是人HER2(GenBank登录号：P04626；GI119533)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16是人IGF-IR的氨基酸序列(GenBank登录号：P08069；GI124240)。

SEQ ID NO：17是用于pDR12-赫赛汀或pDR12-M590的T366Y诱变正向引物。

SEQ ID NO：18是用于pDR12-赫赛汀或pDR12-M590的T366Y诱变的反向引物。

SEQ ID NO：19是用于Y407T诱变pDR12-M590或pDR12-赫赛汀的正向引物。

SEQ ID NO：20是用于Y407T诱变pDR12-M590或pDR12-赫赛汀的反向引物。

序列号21～27是肽连接体。

发明详述

随着病情的发展，使用人源化抗HER2抗体赫赛汀治疗的患者可发展出抗药性。越来越多的证据表明，HER2和IGF-IR的间串扰，包括受体异二聚体化和转录，以及升高的IGF-IR信号传导与赫赛汀抗性有关(Huang等人，Cancer Res70：1204-1214(2010)；Jin及Esteva，乳腺生物学瘤杂志13：485-98(2008)，Bender和Nahta，Front.BIOSCI13：3906-12(2008)，Casa等人，Front.BIOSCI13：3273-87(2008))。

公开了双特异性抗体或其片段结合人表皮生长因子受体2(HER2)的表位和1型胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)的表位。本发明更具体地提供了它们的结合了HER2的细胞外结构域(如人HER2)和IGF-IR的(例如人IGF-IR)的细胞外结构域的抗体或其片段。有利的是，所公开的抗体显著抑制HER2/IGF-IR表达的癌细胞的生长。此外，公开了由本文所述多肽识别(例如抗体或其结合片段)的表位，该表位可以在抗HER2/抗-IGF-IR的用于治疗癌症的双特异性抗体的开发中使用。

抗HER2/抗-IGF-IR的双特异性抗体可用于治疗癌症，以及用于在动物中检测HER2和IGF-IR，包括但不限于人类。所公开的抗HER2/抗-IGF-IR抗体也可用于检测测试样品中的HER2和IGF-IR。测试样品可以是组织样品，活检样品等。

在某些实施方案中，抗HER2/抗-IGF-IR抗体特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)和人类胰岛素样生长因子I受体(也称为人胰岛素样生长因子受体1型(IGF-IR))。在一些实施例中，人HER2具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列：15(GenBank登录号：P04626；GI119533)和人IGF-IR具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列：16(GenBank登录号P08069；GI：124240)。在一些实施例中，所公开的抗HER2/抗-IGF-IR抗体特异性结合表达在肿瘤细胞中的人HER2和人IGF-IR，诸如例如，SKOV-3和MCF-7细胞。在一些实施例中，所公开的抗HER2/抗-IGF-IR抗体特异性结合表达在异种移植小鼠模型的SKOV-3细胞中的人HER2和人IGF-IR。

还公开的是使用“旋钮-成孔”的方法来产生抗HER2/抗-IGF-IR的混合的IgG，描述于Ridgway等，蛋白质工程9：671-21，(1996)，其在此引入作为参考。“把手”突变体可以通过在抗HER2抗体(例如赫赛汀单抗)或抗-IGF-IR抗体(例如M590)的CH3结构域替换苏氨酸和酪氨酸(T366Y)来创建。“孔”突变体可通过用苏氨酸(Y407T)中的抗IGF-IR抗体的CH3结构域(例如，M590)或抗HER2抗体(例如赫赛汀单抗)替换酪氨酸制成。还公开了一种共转染人细胞，例如293F细胞或杂交瘤细胞，用“把手”和“孔”质粒，导致HER2与IGF-IR的双特异性稳定的异二聚体的生产。

术语“结合特异性”，如本文所用的“特异性”，“特异反应”或“特异性相互作用”是指抗体或其它试剂来检测的方式结合呈现于一个抗原表位的能力，如表位HER2和IGF-IR，而具有相对小的可检测的与其它蛋白质或结构的反应性。特异性可通过结合或竞争性测定法进行比较来确定，使用如的Biacore仪器。特别的，特异性结合到抗原与非特异性结合到其他不相关的分子的亲和/亲合力的比可以展示为，例如，约10：1，约20：1，约50：1，约100:1，约10,000：1或更大的比。在所公开的抗体和多肽的上下文中，“双特异性”和类似的术语指的是含每一特异性结合不同的表位或配体的含有至少两个不同的特异性结合分子的抗体或多肽。

还公开了用于产生抗HER2/抗-IGF-IR抗体，或其片段的方法。抗HER2/抗-IGF-IR的双特异性杂交的IgG抗体，可以通过组合(1)和(2)产生,(1)人源化赫赛汀[DrugBank：赫赛汀单抗(DB00072)(BIOD00098，BTD00098)]的重链1(HC1)和轻链1(LC1)，和(2)抗-IGF-IR的鼠/人嵌合抗体(M590)的HC和LC，在美国专利号5804440，和Zhang等人，单克隆抗体I：5，475-480(2009)中所描述，这两者都通过引用的方式并入本文。

在一些实施例中，所公开的分离的多肽(例如，抗体或结合片段)，或所述多肽或其片段结合至HER2和IGF-IR的胞外结构域的表位。在某些实施方案中，所述分离的多肽可以包含选自赫赛汀HC1(SEQ ID NO：1)所选择的氨基酸序列，赫赛汀LC1(SEQ ID NO：2)，M590HC(SEQ ID NO：3)，M590LC(SEQ ID NO：4)，以及它们的片段。在某些实施方案中，抗HER2/抗-IGF-IR抗体的CH3恒定区包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，含有T366Y突变的CH3恒定区包含SEQ ID NO：6。在一些实施例中，含有Y407T突变的CH3恒定区包含SEQ ID NO：7。

本发明还提供了分离的核酸分子，其编码的多肽，或其结合片段。在某些实施方案中，所述核酸分子可以包含赫赛汀HC1的DNA(SEQ ID NO：8)，赫赛汀LC1的DNA(SEQ ID NO：9)，M590HC的DNA(SEQ ID NO：10)，M590LC的DNA(SEQ ID NO：：11)，CH3恒定区的DNA(SEQ ID NO：12)，编码DNA含有T366Y突变(SEQ ID NO CH3结构恒定区：13)，编码DNA含有Y407T突变的CH3恒定区(SEQ ID NO：14)，以及它们的片段。在某些实施方案中，所述核酸分子是任选的载体，其中所述核酸分子或载体任选的形式包含在宿主细胞内。在某些实施方案中，所述抗HER2和抗-IGF-IR的双特异性抗体，以及核酸分子编码所述双特异性抗体，可以使用一个“旋钮孔”的策略来改造CH3为异二聚体。对于双特异性抗体，旋钮(一个或多个)可以通过在一个CH3结构域的界面之间处用较大的氨基酸替换小的氨基酸侧链，而孔(一个或多个)创建可以通过在伴CH3结构域用小氨基酸取代大侧链。

在某些实施方案中，所述抗HER2和抗-IGF-IR的双特异性抗体，以及核酸分子编码所述双特异性抗体，可以包含一个“旋钮”T366Y突变在抗HER2抗体的CH3结构域中，和双特异性抗体可以包含“孔”Y407T突变在抗IGF-IR抗体的CH3结构域中。

在某些实施方案中，所述抗HER2和抗-IGF-IR的双特异性抗体，以及核酸分子编码所述双特异性抗体，可以包含一个“旋钮”T366Y突变在抗IGF-IR抗体的CH3结构域中，和双特异性抗体可以包含“孔”Y407T突变在抗HER2抗体的CH3结构域中。

该多肽可以是任何合适的多肽。例如，在一些实施方案中，所述多肽是抗体。抗体包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子，也包括的是片段或那些免疫球蛋白分子的聚合物，和人或免疫球蛋白分子或片段的人源化版本物，只要该分子维持结合与HER2和IGF-IR的表位的能力。该抗体可用于使用本文描述的体外测定其所需的活性进行测试，或通过类似方法，在这之后其在体内的治疗和/或诊断活性可根据已知的临床测试方法进行确认和定量。

在一些实施方案中，所述多肽是单克隆抗体或其结合片段。单克隆抗体是指一种抗体，其中一种中的个体抗体是相同的。

术语“多肽”包含天然或人工蛋白质，蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。术语“分离的多肽”是由于其起源或衍生来源：(1)不与伴随它在其天然状态下自然地相关联的组件相关联的多肽，(2)基本上不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由一种不同于其蛋白质天然来源的细胞中表达，或(4)自然中不产生。化学合成的多肽或来自不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽，也被认为是从其天然相关成分“分离的”。通过分离，使用本领域公知的纯化技术，多肽也可呈现基本上不含天然结合的组分。类似的定义适用于具有相似含义的抗体。

天然抗体通常是异四聚体糖蛋白，两个相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。典型地，每个轻链与重链通过一个共价二硫键，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(V(H)或V_H)，接着是多个恒定域。每条轻链有一个可变结构域的端(V(L)或V_L)和在其另一端有一个恒定域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域和轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定氨基酸残基被理解为形成轻链和重链可变结构域之间的界面。抗体的来自任何脊椎动物物种的轻链可以分配到两个完全不同的类型之一，称为卡帕(κ)和lambda(λ)，基于其恒定结构域的氨基酸序列。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。有人类免疫球蛋白的五个主要的类别：IgA，IgD的，IgE，IgG和IgM，这些当中的几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG抗体-1的IgG-2，IgG抗体-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员将认识到可比较的小鼠类中。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ。

在抗体，其片段，以及所公开多肽的内容中，术语“可变区”，“可变序列”等，被用来描述该可变结构域的相差在抗体间序列和在被用于某些部分的结合和对其特定抗原的每种特定抗体的特异性。然而，变异性并非均匀通过抗体的可变结构域分布。它通常是集中在三个区段，称为互补决定区(CDR)或高变(HV)区域，其都在轻链和重链可变结构域。可变域中更加高度保守的部分称作框架(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区(FR1，FR2，FR3和FR4)，它们大多采取β-折叠片构象，通过三个CDR(HV1，HV2，HV3)，其形式环路连接相连，和在有些情况中部分形成β-片层结构。每条链中的CDR保持在一起接近通过FR区，并与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat EA等人，“免疫学的蛋白质的序列兴趣，“国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，(1987))。CDR通常是轻链的可变结构域中大约残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和在重链可变区中大约残基27-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质序列，第5版。公共卫生服务，国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达。(1991))。从“高变环”形成的残基通常是在轻链可变结构域中的大约残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)和在重链可变结构域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)，(Chothia和Lesk，1987，分子生物学杂志196：901-917)。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。

众所周知，可变区的抗体，并且，特别是可变区的互补决定区(CDR)，主要负责抗体的结合和结合特异性。众所周知的，抗体的可变区以外的其它(或CDR以外的)部分可以被取代，改变，消除，等等而不消除抗体的结合和特异性结合(或抗体的部分消除情况下的抗体片段)。抗体结构的公知的模块化特性允许广泛的替代，改变，消除等，抗体的可变区以外的其它(或CDR以外的)部分而不消除抗体的结合和特异性结合。所述特性通过生产和使用下述物质得到充分证明，嵌合抗体，重组抗体，人源化抗体，以及多种类型的抗体片段和抗体衍生的多肽，如的F(ab')2，片段的抗原结合(FAB)，半抗体，单链可变片段(scFv的)，V HH结构域，V-NAR结构域，VH结构域，VL结构域，F(ab)3，双-单链抗体，Bi-Ab，三抗体，四抗体，和微抗体(Hollinger和Hudson，自然生物技术23(9)：1126-1136(2005)(及其中引用的参考文献)，Holliger和Winter，国家科学院院报USA90，6444-6448(1993)；Pei等人，Proc Natl。科学院学报美国94，9637-9642(1997)；Iliades等，FEBS快报409，437-441(1997)；De Genst等人，生物化学杂志，280，14114-14121(2005)；De Genst等人，生物化学杂志，279，53593-53601(2004)；Dooley和Flajnik，欧洲免疫学杂志35，936-945(2005)；Streltsov和Nuttall，免疫学快报97，159-160(2005)；Streltsov等，国家科学院院报USA101，12444-12449(2004)；Cortez-Retamozo等人，癌症研究。64，2853-2857(2004)；Dottorini等人，生物化学43，622-628(2004)；Colby等人，分子生物学。342，901-912(2004)；Jespers等人，分子生物学。337，893-903(2004)；Linsley，Nat.免疫学。6，231-232(2005)；37，Casey等人，BR。癌症杂志86，1401-1410(2002)；Weir等人，生物化学反式脂肪。30，512-516(2002)；Dolezal等，蛋白质工程。16，47-56(2003)；功率等，分子生物学。207，335-350(2003)；Arndt等人，FEBS快报578，257-261(2004)；Griffiths等人，核酸研究医学杂志45，30-39(2004)；Olafsen等人，蛋白质工程Des.Sel.17，21-27(2004)；Wittel等人，核酸医学生物学32，157-164(2005)；Le Gall等，蛋白质工程Des.Sel.17，357-366(2004)；Kenanova等人，癌症研究。65，622-631(2005)；Adams等人，癌症研究。64，6200-6206(2004)；Grosse-Hovest等，癌症杂志；2005年7月7日在网上公布(interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/110559371/ABSTRACT120)；Holliger等人，癌症研究59，2909-2916(1999)；Pattersen等人，J.COMPUT化学25，1605-1612(2004)；Olafsen等人，癌症研究65，5907-5916(2005)；Shen等人，核酸研究医学杂志46，642-651(2005)；Nellis等，生物工程PROG 21，221-232(2005)；Ebbinghaus等人，癌症杂志116，304-313(2005)；Wong等人，Clin.癌症研究10，5014-5021(2004)；Hulstein等，血液2005年7月12日网上公布的(bloodjournal.org/cgi/reprint/2005-03-1153v1))。

因此，使用该抗体结合和特异性结合(和不需要的抗体的恒定区的一个特定的生物功能)所公开的抗体和多肽的实施例可以包括特异于HER2和特异于IGF-IR的结合片段。对于所公开的抗体和多肽的抗体形式，其他抗体区可以被取代，改变，或两者均可，或从任何重链和轻链或其部分，以期望的对HER2和IGF-IR的双特异性结合和特异性结合将被保留。对于抗体片段和肽的形式，HER2和IGF-IR的特异性结合片段，可以通过任何的结合片段的形式来实施，并且可以以任何合适的方式被链接，包括任何多价和多特异的具体方式用于抗体结合片段。在所公开的抗体，抗体片段，和多肽的情况下，这种形式将是双特异性的，而不是(或除了)多价的。结合片段形式的实例包括的F(ab')₂，片段的抗原结合(FAB)，半抗体，单链可变区片段(scFv)，V HH结构域，V-NAR结构域，VH结构域，VL结构域，F(ab)₃，双-单链抗体，Bi-Ab，三抗体，四抗体，和微抗体。任何这些形式可以独立使用，以体现为HER2和IGF-IR的特异性结合片段，然后可以组合或使用任何合适的连接体或联接在一起。HER2和IGF-IR的特异性结合片段也可以分别被用作抗体片段的多价和/或多特异性形式的结合片段的部分。例子包括F(ab')₂，F(AB)₃，双-单链抗体，Bi-Ab，三抗体，四抗体，和微抗体。

本文所用的术语“结合片段”，“抗原结合片段”，“抗体结合片段”和类似术语是指一种或多种包含所述抗体的CDR和任选的框架残基的抗体的位点，该残基包括抗体的“可变区”抗原识别位点，并显示出对免疫特异性结合抗原的能力。这样的片段包括Fab'，F(AB')₂，Fv，单链(ScFv)，等，以及其突变体和变异体，天然存在的变体。如本文所使用的，“片段”一词是指一种肽或多肽，其包含至少5个连续氨基酸残基，至少10个连续氨基酸残基，至少15个连续氨基酸残基，至少20个连续氨基酸的氨基酸序列酸残基，至少25个连续氨基酸残基，至少40个连续氨基酸残基，至少50个连续氨基酸残基，至少60个连续氨基酸残基，至少70个连续氨基酸残基，至少80个连续氨基酸残基，至少90个连续氨基酸残基，至少100个连续氨基酸残基，至少125个连续氨基酸残基，至少150个连续氨基酸残基，至少175个连续氨基酸残基，至少200个连续氨基酸残基，或至少250个连续氨基酸残基。

如在本文中详细讨论的，可变区也可以不排除可变区或CDR的结合和特异性结合的方式进行取代和改变。对于所公开的可变区域(除了CDR)之外的抗体部分的抗体和多肽的替换，改变，抵销等，优选的是，所述的可变区序列和CDR序列，或之后被建模，是赫赛汀与M590抗体的可变区或CDR。

本发明包括嵌合抗体和杂合抗体，具有双重或多重抗原或表位的特异性，及片段，如F(ab')₂等，包括混合碎片。这样的抗体和片段可通过本领域已知的技术来制备，并且可以根据用于制备抗体和筛选抗体的特异性和活性的一般方法进行筛选特异性和活性(见，例如，Harlow和Lane，抗体，实验室手册，冷泉港出版社，纽约，(1988)，其在此引入作为参考)。

本发明还包括人抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(例如，那些来自小鼠，大鼠，家兔或衍生的)在人类中是天然抗原的，因此，当对人给药可以引起不期望的免疫应答。因此，在本文描述的方法使用人或人源化抗体的作用是减轻给予人的抗体将引起不期望的免疫应答的机会。

人抗体和本文描述的人源化抗体可通过任何已知的技术来制备。进行人单克隆抗体的生产的技术实例包括描述于Boerner等人，免疫学杂志，147(1)，86-95(1991)的那些，其在此引入作为参考。本文中所描述的人抗体(及其片段)，也可使用噬菌体展示文库产生(见，例如，Marks等，分子生物学杂志，222，581-597(1991))，其在此通过引用的方式并入。本文所描述的人抗体也可以从转基因动物获得。例如，转基因突变小鼠，其能够响应于免疫产生人抗体的所有组成成分已经描述(见，例如，Jakobovits等，美国国家科学院院刊，90，2551-255(1993)；和Jakobovits等，自然，362，255-258(1993))，所有这些都通过引用结合于此。

用于人源化非人抗体的方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以通过将人啮齿动物互补决定区(CDR)或CDR序列取代成抗体的相应序列来生成。详细的过程公开在Jones等人，自然，321，522-525(1986)；Riechmann等人，自然，332，323-327(1988)；Verhoeyen等人，科学，239,1534-1536(1988)，所有这些都通过引用结合于此。

可用于产生人源化抗体的方法还描述于美国专利4,816,567；美国专利5,565,332；美国专利5,721,367；美国专利5,837,243；美国专利5,939,598；美国专利6,130,364；和美国专利6,180,377；所有这些都通过引用结合于此。

抗人HER2和/或IGF-IR抗体的人类的，嵌合的或人源化的衍生物特别优选用于人体内使用，但是，鼠抗体或其它物种的抗体可有利地用于多种用途(例如，在体外或原位的检测测定，急性体内使用，等等)。人源化抗体可包含在一个或多个非人类CDR中取代，缺失或添加的氨基酸残基。与非衍生化抗体的结合相比，人源化抗体衍生物可具有基本上相同的结合，更强的结合或更弱的结合。在具体实施方案中，CDR的一个，两个，三个，四个或五个氨基酸残基被取代，缺失或添加(即，突变的)。完全人抗体是特别适合用于治疗性处理人类受试者。

人类抗体可通过多种本领域已知的方法来制备，包括上述使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库中描述的噬菌体展示方法(参见美国专利号4444887和4716111；和国际公开号WO46645，WO98/50433，WO24893，WO16654，WO34096，WO33735，和WO91/10741)。人抗体可使用转基因小鼠，其不能表达功能性内源免疫球蛋白的产生，但能表达人免疫球蛋白基因。例如，人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机地引入或通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞中。备选地，除了人类重链和轻链基因，人可变区，恒定区和分集区域可以引入到小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以通过同源重组引入人类免疫球蛋白基因座，单独地或同时地非功能性提出。特别是，JH区的纯合性缺失防止内源性抗体的产生。修饰的胚胎干细胞被扩展和显微注射到胚泡中以产生嵌合体小鼠。嵌合体小鼠，然后繁殖，以产生表达人源抗体的纯合后代。转基因小鼠用常规方法免疫，使用经选择的抗原，例如，全部或部分HER2和/或IGF-IR多肽。针对抗原的单克隆抗体可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠来获得(见，例如，美国专利号5,916,771)。人类免疫球蛋白转基因通过转基因小鼠在B细胞分化过程中重新排列来保持(harbored)，并随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这样的技术，有可能产生治疗上有用的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。对于用于制造人抗体这一技术的的综述，参见Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.免疫学杂志13：65-93，其在此通过引用并入其全部内容)。对于这一技术的用于制造人抗体和人单克隆抗体的这种技术和用于生产这种抗体的方法的详细讨论，参见，例如，国际公开号WO24893，WO34096，和WO33735；和美国专利号5413923，5625126，5633425，5569825，5661016，5545806，5814318，和5939598，其通过引用的方式并入本文中。此外，诸如Abgenix公司(弗里蒙特，加州)和Medarex公司(新泽西州普林斯顿)可使用上述类似的技术从事提供所选抗原的人抗体。

“嵌合抗体”是其中抗体的不同部分来自不同的免疫球蛋白分子衍生的分子，该分子例如具有从非人抗体和人免疫球蛋白恒定区的可变区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison，1985，科学229：1202；Oi等人，1986，生物技术：4：214；Gillies等人，1989，免疫学杂志方法125：191-202；和美国专利号6311415，5807715，4816567，和4816397。包含一个或多个CDR的嵌合抗体，可使用多种本领域已知的方法来获得，该CDR来自于从人免疫球蛋白分子得来的非人物种和框架区，上述方法例如CDR移植技术(EP239400，国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539，5,530,101，和5,585,089)，镶饰(veneering)或重铺(resurfacing)(EP592106，EP519596；Padlan，1991，分子免疫学28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994，蛋白质工程7：805；和Roguska等，1994，国家科学院院报USA91：969)，和链改组(美国专利号5,565,332)。

特别令人感兴趣的是“人源化抗体”(见，例如，欧洲专利号EP239400，EP592106和EP519596；国际公开号WO91/09967和WO93/17105；美国专利号5,225,539，5,530,101，5,565,332，5585089，5766886，和6407213，以及Padlan，1991，分子免疫学28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994，蛋白质工程7(6)：805-814；Roguska等人，1994，美国国家科学院院刊91：969-973；Tan等，2002，免疫学杂志169：1119-1125；Caldas等，2000，蛋白质工程13：353-360；Morea等人，2000，方法20：267-79；Baca等1997，生物化学杂志，272：10678-10684；Roguska等人，1996，蛋白质工程9：895-904；Couto等，1995，癌症研究55(23增刊)：5973s-5977s；Couto等人，1995，癌症研究55：171-722；桑德，1994，基因150：409-10；Pedersen等人，1994，分子生物学杂志235：959-973；Jones等人，1986，自然321：522-525；Reichmann等人，1988，自然332：323-329；和Presta，1992，Curr.Op.结构生物学2：593-596)。本文所用的术语“人源化抗体”是指免疫球蛋白，其包含人框架区和一个或多个来自非人(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的CDR。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”和提供所述框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。恒定区不必是现有的，但如果是这样，他们必须是基本相同的人免疫球蛋白恒定区，即，至少约85-90％，优选约95％或更多相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR中的，基本上于相应的天然人免疫球蛋白序列的部分相同。人源化抗体是一种抗体，其包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白。例如，人源化抗体将不包含一个典型的嵌合抗体，因为，例如，嵌合抗体的整个可变区是非人的。可以说，供体抗体已被“人源化”，通过“人性化”的方法，因为所得到的人源化抗体预计结合到相同抗原作为提供了CDR的供体抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠，大鼠，兔或非人类灵长类的高变区残基取代，其具有所需特异性，亲和力和容量。在一些实例中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将基本上包含至少一个，通常为两个的可变域的全部，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白和全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列。人源化抗体任选还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的免疫特异性结合到FcγRIIB多肽，即已经被氨基酸残基的取代，缺失或添加(即突变)的引入改变。

人受体构架序列的优选的DNA序列编码，包括但不限于来自于人类种系VH区段VH1-18的FR片段和JH6和人类种系VL区段VK-A26和JK4。在一个具体实施方式中，一个或多个CDR被使用常规的重组DNA技术插入构架区内。框架区可以是天然存在的或共有的构架区，优选人的框架区(见，例如，Chothia等人，1998，“在免疫球蛋白可变域序列的结构决定因素，”分子生物学杂志278：457-479人的框架区的列表)。

一种人源化的或嵌合的HER2和/或IGF-IR抗体可以基本上包括所有的一个，通常两个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有的对应于非人免疫球蛋白的CDR区(即，供体抗体)和所有的或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的。优选地，HER2和/或IGF-IR抗体还包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，通常是人免疫球蛋白的部分。HER2和/或IGF-IR抗体的恒定结构域可以相对于所述抗体的所提出的功能进行选择，特别是可能需要的效应子功能。在一些实施例中，HER2和/或IGF-IR抗体的恒定结构域是(或包括)人IgA，IgD，IgE，IgG或IgM结构域。在一个具体的实施方案中，当人源化HER2和/或IGF-IR抗体是用于治疗用途和抗体的效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性是必要时，使用人IgG恒定结构域，特别是IgG1和IgG3的同种型。在替代实施例中，当HER2和/或IGF-IR抗体是用于治疗目的和不需要抗体的效应子功能时，使用IgG2和IgG4的同种型。本发明涵盖的包含一个或多个氨基酸修饰的Fc恒定结构域改变了抗体的效应子功能，如那些在美国专利申请公开号2005/0037000和2005/0064514所公开的。

在一些实施例中，HER2和/或IGF-IR抗体包含轻链以及至少可变域的重链。在其他实施例中，HER2和/或IGF-IR抗体还可以包括一个重链的CH1，铰链，CH2，CH3和CH4区的一个或多个。抗体可以从任何类型的免疫球蛋白选择，包括IgM，IgG，IgD，IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。在某些实施方案中，恒定结构域是补体固定恒定域，其中，期望的抗体表现出细胞毒活性，并且类通常是IgG1的。在其他实施例中，在那里这样的细胞毒活性是不希望的，恒定域可以是IgG2类。HER2和/或IGF-IR抗体可包含一个以上的类或同种型的序列，以及选择特定的恒定结构域来优化所需的效应子功能是属于本领域的普通技术范围内的。

人源化抗体的框架和CDR区不需要精确地对应亲本序列，例如，供体CDR或共有框架可以通过取代，插入或缺失至少一个残基进行诱变，使得CDR或框架残基在该位点不对应任何共有或供体抗体。这样的突变，但是，优选是不广泛的。通常，人源化抗体残基中的至少75％将对应于亲本的框架区(FR)和CDR序列，更经常的90％，并且最优选大于95％。人源化抗体可使用多种本领域已知的技术来制备，包括但不限于，CDR移植(欧洲专利号EP239400，国际公开号WO91/09967；和美国专利号5,225,539，5,530,101，和5,585,089)，镶饰或重铺(欧洲专利EP592106和EP519596；Padlan，1991，分子免疫学28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994，蛋白质工程7(6)：805-814；和Roguska等人，1994，国家科学院院报91：969-973)，链改组(美国专利号5,565,332)，和技术，公开于例如，美国专利号6407213，5766886，5585089，国际公开WO9317105；Tan等人，2002年，免疫学杂志169：1119-25；Caldas等，2000，蛋白质工程13：353-60；Morea等人，2000，方法20：267-79；Baca等人，1997，生物化学杂志化学272：10678-84；Roguska等人，1996，蛋白质工程。9：895-904；Couto等人，1995年，癌症研究55(23增刊)：5973s-5977s；Couto等人，1995年，癌症研究55：1717-22；Sandhu，1994，基因150：409-10；Pedersen等人，1994，分子生物学235：959-73；Jones等人，1986，自然321：522-525；Riechmann等人，1988，自然332：323；和Presta，1992，Curr.Op.结构生物学2：593-596。通常，框架残基在框架区将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选改善抗原结合。这些框架取代通过本领域众所周知的方法鉴定，例如，通过对CDR的相互作用和构架残基，以确定框架残基对抗原结合和序列比较以鉴定异常框架残基在特定位置上重要的建模。(参见，例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；美国公开号2004/0049014和2003/0229208；美国专利号6350861；6180370；5693762；5693761；5,585,089；和5,530,101和Riechmann等，1988年，自然332：323)。

单克隆抗体可以使用本领域中已知的任何方法来进行制备。例如，单克隆抗体可通过重组DNA的方法，诸如那些美国专利4,816,567，其在此引入作为参考说明进行。编码公开的单克隆抗体的DNA可以容易地用常规方法分离和测序(例如，通过使用寡核苷酸探针，其能够特异性地结合到基因编码抗体的重链和轻链)。也可以使用噬菌体展示技术产生和筛选抗体或活性抗体片段的文库，例如，如美国专利5804440和美国专利6096441，这两者都通过引用并入本文。单克隆抗体也可以使用所述杂交瘤方法制备，如那些由Kohler等人，自然，256，495-497(1975)所描述的，其在此引入作为参考。

所公开的抗体，片段和多肽通常是多特异性的。令人感兴趣的是双特异性抗体，其片段，以及多肽，三特异性抗体，其片段，以及多肽和抗体，其片段，以及更大的多特异性的多肽，其表现出特异性以区分除了HER2和IGF-IR以外的目标，如免疫系统的其它分子。例如，这样的抗体可以结合HER2与IGF-IR和抗原，该抗原对于抗体靶向到特定的细胞类型或组织是重要的(例如，与肿瘤被治疗的癌抗原相关的抗原)。在一些实施例中，这样的多特异性抗体结合到参与替代或补充免疫途径的分子(受体或配体)，如CTLA4，TIM3，TIM4，OX40，CD40，GITR，4-1-BB，CD27/CD70，ICOS，B7-H4，LIGHT，PD-1或LAG3，为了进一步减少调节免疫调节作用。此外，多特异性抗体可结合到效应器分子，如细胞因子(例如，IL-7，IL-15，IL-12，IL-4的TGF-β，IL-10，IL-17，IFNG，FLT3，溶菌酶)和趋化因子(例如，CCL21)，这可能是特别相关的下行调制急性和慢性免疫应答。

体外方法也适于制备双特异性和/或二价抗体和抗体片段。抗体消化以产生其片段，尤其是F(ab')2片段，可使用本领域已知的常规技术来完成。例如，可以用胃蛋白酶进行消化。胃蛋白酶消化的例子在国际专利申请WO2007035624A1中有所描述，其在此引入作为参考。抗体裂解胃蛋白酶消化铰链区附近的重链。一个或多个的连接于所述铰链区的重链的二硫键被保留下来，所以该抗体的Fab区保持相互结合，产生一个F(ab')2片段。胃蛋白酶完全消化的Fc片段。F(ab')2片段具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。作为F(ab')2片段，保留了完整抗体的特异性结合特性，它的效用类似于完整抗体。Fc片段通常是作为巨噬细胞、淋巴细胞对于识别的激活和抗原-抗体复合物的吞噬的一个标志信号。F(ab')₂片段，它缺乏Fc片段，被接收F(ab')₂抗体片段的接收者识别为外来是不太可能的。

单链可变区片段可以通过使用短肽连接体将重链和轻链的可变结构域融合在一起被创建，从而重构单个分子的抗原结合位点。单链抗体可变区片段(scFv)已经开发了无显著破坏抗原结合或特异性结合，其中一个可变结构域的C-末端通过连接体栓住其他可变结构域的N-末端。连接器被选择，以允许所述重链和轻链以适当的构型取向结合在一起。对于连接体的灵活性，通常是富含甘氨酸的，并且对于其溶解性通常还包括丝氨酸或苏氨酸。连接器可以连接，例如，该V_H的N末端与V_L的C末端的，或者反之亦然。单链抗体也可以直接从杂交瘤衍生的亚克隆的重链和轻链的创建。优选地，所述scFv保留，或提高或增加原始的免疫球蛋白的特异性，同时除去恒定区，并引入连接体。

示例性的抗原结合分子，其包括两个或更多个单链可变片段(scFv)，包括赫赛汀的轻链可变区(V_L)和/或M590，或其变体，和赫赛汀的重链可变区(V_H)和/或M590，或抗体赫赛汀的变体和/或M590，包括但不限于，二价-scFv(二-scFv)，三价scFv(三-scFv)，多价scFv(多-scFv)，scFv的Bi-Ab，三抗体，四抗体等。

二价单链可变区片段可以通过连接两个scFv来改造。这可以通过制造具有两个V_H和两个V_L区的单个多肽链来完成，得到二-scFv，称为串联二-scFv。对于两个可变区的折叠在一起太短，scFv也可以用连接体肽设计(约五个氨基酸)，强迫scFv二聚化，并形成被称为Bi-Ab二价单链可变片段。Bi-Ab已被证明具有解离常数比相应的scFv低40倍，表明它们有比自己的靶向高得多的亲和力。甚至更短的连接基(一个或两个氨基酸)导致三聚体(三重抗体或三抗体)的形成。三重抗体也已经产生并已被证明表现出比Bi-Ab对于其靶向更高的亲和性。

所公开的抗原结合分子包括抗原结合抗体片段和赫赛汀和/或M590和其变体的融合蛋白，典型地结合到单克隆抗体赫赛汀和/或M590的相同表位。在最优选的实施方案中，所述抗原结合分子是二-，三-，或多价scFv。虽然抗原结合抗体片段或抗原结合分子的融合蛋白可以包括另外的抗体结构域(例如，恒定结构域，铰链结构域，等等)，其优选没有包括。赫赛汀和/或M590结合DNA且抑制DNA修复，这对于DNA修复缺陷型细胞是综合致死性的。这个功能独立于任何赫赛汀和/或M590恒定区。相比之下，非穿透抗体，如西妥昔单抗，靶向于细胞外受体，其依赖于Fc-介导的ADCC活化和补充以施加效果于肿瘤。因此，从非穿透的抗体消除Fc可以减少其对肿瘤作用的大小，但Fc不需要赫赛汀和/或M590到对癌细胞的效果。因此，缺乏Fc区的赫赛汀和/或M590的片段或融合体应该是无法激活ADCC和补体，因此具有较低的非特异性副作用风险。

所公开的抗体片段和多肽可以连接在一起，以形成多特异性和/或多价的抗体片段和多肽。例如，单链抗体和其他形式的非特异性结合片段可以被连接在一起以形成二价和多特异性结合的片段。本文所用的术语“连接体”包括，但不限于，肽连接体。肽连接体可以是任何尺寸，所提供的不通过可变区干扰与该表位的的结合。在一些实施方案中，所述连接体包括一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸的氨基酸残基。单价单链抗体可变区片段(scFv)，其中一个可变结构域的C末端通常是经15至25个氨基酸的肽或连接体，系在其他可变结构域的N末端。选择连接器，以允许所述重链和轻链以适当的构型取向结合在一起。在Bi-Ab，三抗体等连接器中，通常比如上面所讨论的一价scFv包括更短的连接器。二，三，和其它多价的scFv通常包括三个或更多个连接体。该连接体在长度和/或氨基酸的组合物方面可以是相同的或不同的。因此，连接体的数量，链接器(一个或多个)的组合物，连接体(一个或多个)的长度，可基于如本领域已知的所期望的scFv化合价来确定。优选地，所述连接体(一个或多个)允许或驱动形成二，三，和其它多价scFv。

例如，连接体可以包含4-8个氨基酸。在特定实施例中，连接体包括氨基酸序列GQSSRSS(SEQ ID NO：21)。在另一个实施方案中，连接体包括15-20个氨基酸，优选18个氨基酸。在特定实施例中，连接体包括氨基酸序列GQSSRSSSGGGSSGGGGS(SEQ ID NO：22)。其它柔性连接基包括，但不限于，氨基酸序列甘氨酸-丝氨酸，甘氨酸，丝氨酸，甘氨酸，丝氨酸(SEQ IDNO：23)，丙氨酸-丝氨酸，甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(SEQ ID NO：24)，(Gly4-丝氨酸)3(SEQ ID NO：25)和(Gly4-丝氨酸)4(SEQ ID NO：26)，和(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)3(SEQ ID NO：27)。

所述scFv可由抗体片段或融合蛋白组成，其包括一个可变的重链和/或可变轻链的氨基酸序列，其是至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％与赫赛汀和/或M590的可变的重链和/或轻链的氨基酸序列相同，和其结合赫赛汀和/或M590的表位，是选择性地致死或选择性地增加放射敏感性和/或DNA修复细胞缺陷的敏感性，或它们的组合。scFv可以由抗体片段或融合蛋白组成，其包含的CDR至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％与赫赛汀和/或M590的可变的重链和/或轻链的CDR的氨基酸序列相同，和其结合赫赛汀和/或M590的表位，是选择性地致死或选择性地增加放射敏感性和/或DNA修复细胞缺陷的敏感性，或它们的组合。两个氨基酸序列的同一性百分比的确定可以通过BLAST蛋白质比较来确定。在优选的实施方案中，单链抗体，包括一个，两个，三个，四个，五个，或更优选地，全部六个上述优选的可变结构域的CDR，和其结合到赫赛汀和/或M590的表位，是选择性地致死或选择性地增加放射敏感性和/或DNA修复细胞缺陷的敏感性，或它们的组合。

赫赛汀和/或M590的重链可变序列的预测互补性决定区(CDR)是本领域已知的，参见，例如，Zack等人，免疫学和细胞生物学，72：513-520(1994)和GenBank登录号AAA65679.1。赫赛汀和/或M590的轻链可变序列的预测的互补性决定区(CDR)是本领域已知的，参见，例如，GenBank登录号：AAA65681.1-免疫球蛋白轻链，部分〔小家鼠〕。

在一些实施方案中，抗体片段或融合蛋白被修饰，以改变其半衰期。在一些实施例中，理想的是增加抗体片段或融合蛋白的半衰期，使得它存在于循环或在治疗部位中有较长的时间。例如，在单独使用抗体片段或融合蛋白用于治疗癌症的那些情况里，例如，具有受损的DNA修复的癌细胞中，可能希望抗体片段或融合蛋白的效价在循环中或在位置中保持延长的治疗时间。在其他实施方案中，所述抗体片段或融合蛋白的半衰期降低，以减少潜在的副作用。例如，抗体片段或融合蛋白正在与放疗或化疗联合使用的情况下，在用射线或抗肿瘤药物的治疗过程中，所述抗体片段或融合蛋白优选以高剂量存在于该循环中，但另外的，要快速地从循环中取出。抗体片段，如赫赛汀和/或M590scFv，预计将比全尺寸抗体有更短的半衰期。改变半衰期的其它方法是已知的，并且可以用于所描述的方法中。例如，抗体片段和融合蛋白可用延长了半衰期的Fc变体改造，例如，使用Xtend^TM抗体半衰期延长技术(Xencor，蒙罗维亚，CA)。

所公开的抗体，片段和多肽可以通过本领域任何已知的可用于生产多肽的方法来制造，例如，体外合成，DNA重组生产等。优选地，所述抗体是由重组DNA技术产生。HER2和/或IGF-IR抗体可以使用重组免疫球蛋白的表达技术来生产。包括人源化抗体的免疫球蛋白分子的重组生产，在美国专利号4816397(Boss等)，美国专利号6331415和4816567(均为Cabilly等)，英国专利GB2188638(Winter等)，和英国专利GB2209757中所描述。对于包括人源化免疫球蛋白的免疫球蛋白重组表达技术，还可以如下中发现：Goeddel等，基因表达技术酶学方法卷185科学出版社(1991)；和Borreback，抗体工程，WH弗里曼(1992)。关于重组抗体的产生，设计和表达的其他信息可以在Mayforth，设计抗体，学术出版社，圣地亚哥(1993)中找到。

用于生产重组嵌合HER2和/或IGF-IR抗体的一个示例性方法可包括以下内容：a)构建，通过常规分子生物学方法，即通过编码和表达抗体重链的表达载体，其中将鼠抗人HER2和/或IGF-IR单克隆抗体的CDR和可变区域融合至衍生自人免疫球蛋白的Fc区，由此产生表达嵌合抗体重链的载体；B)构建，通过常规分子生物学方法，即通过编码和表达抗体轻链的表达载体，其中将鼠抗人HER2和/或IGF-IR单克隆抗体的CDR和可变区域融合至衍生自人免疫球蛋白的Fc区，由此产生表达嵌合抗体轻链的载体；C)通过常规分子生物学方法将所述表达载体转染到宿主细胞，产生表达嵌合抗体的转染宿主细胞；和d)用常规的细胞培养技术培养经转染的细胞，以产生嵌合抗体。

用于生产重组人源化HER2和/或IGF-IR抗体的一个示例性方法可包括以下内容：a)构建，通过常规分子生物学方法，编码和表达抗人HER2和/或IGF-IR重链的载体，其中CDR和所需要的保留供体抗体结合特异性的可变区框架的最小部分是衍生自人免疫球蛋白，如鼠抗人HER2和/或IGF-IR单克隆抗体，以及该抗体的其余部分来源于人免疫球蛋白，由此产生表达人源化抗体重链的载体；B)构建，通过常规分子生物学方法，编码和表达抗人HER2和/或IGF-IR轻链的载体，其中CDR和所需要的保留供体抗体结合特异性的可变区框架的最小部分是衍生自人免疫球蛋白，如鼠抗人HER2和/或IGF-IR单克隆抗体，以及该抗体的其余部分来源于人免疫球蛋白，由此产生表达人源化抗体轻链的载体；C)通过常规分子生物学方法将所述表达载体转染到宿主细胞，产生表达人源化抗体的转染宿主细胞；和d)用常规的细胞培养技术培养经转染的细胞，从而产生人源化抗体。

相对于任一示例性方法，宿主细胞可以被这样的表达载体共转染，其可包含不同的选择标记，但是，除重链和轻链的编码序列，优选是相同的。这个过程提供了重链和轻链多肽的同等表达。可替代的，一个单一的载体均可以用于编码重链和轻链多肽。对于重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA或两者都有。用于表达重组HER2和/或IGF-IR抗体的宿主细胞可以是细菌细胞，如大肠杆菌，或更优选为真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK-293细胞)。表达载体的选择取决于宿主细胞的选择，并且可被选择以具有在选定的宿主细胞所需的表达和调控特性。其它细胞系，可用于包括，但不限于，CHO-K1，NSO和PER.C6(Crucell公司，莱顿，荷兰)。

任何上述抗体可用于使用本领域技术人员公知的技术生成抗独特型抗体(见，例如，Greenspan，N.S.等(1989)“独特型：结构和免疫原性，”FASEBJ.7：437-444；和Nisinoff，A.(1991)“独特型：概念和应用，”免疫学杂志147(8)：2429-2438)。

任何上述抗体的结合性质可以，如果需要的话，可进一步通过筛选表现出这样的期望特性的变体来改进。例如，这样的抗体可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在噬菌体颗粒的表面上，该颗粒携带编码其的多核苷酸序列。在特定实施例中，该噬菌体可以用于展示抗原结合结构域，例如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv，从谱或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达。表达抗原结合结构域的噬菌体，该结构域结合目标抗原，可以使用抗原选择或鉴定，例如使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠的抗原。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括FD和M13。对于两种噬菌体基因III或基因VIII蛋白，抗原结合结构域均表达为重组融合蛋白。可用于制造本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的例子，包括公开在Brinkman，U.等人(1995)“二硫键稳定Fv片段中的噬菌体展示，”免疫学杂志，方法，182：41-50，1995；Ames，R.S.等，(1995)“分离自组合噬菌体展示库的鼠Fabs到全长免疫球蛋白的转换，”免疫学杂志，方法，184：177-186；Kettleborough，C.A.等。(1994)“用噬菌体抗体库从免疫小鼠分离肿瘤细胞特异性单链Fv和从这些抗体片段的完整抗体的重新构建”Eur.免疫学杂志，24：952-958，1994；；Persic，L.等人(1997)“从噬菌体展示文库选择后的抗体或其片段的真核表达的综合载体系统”基因，187：9-18；Burton，D.R等(1994)，“来自组合库的人类抗体”Adv.免疫学，57：191-280；PCT公开WO92/001047；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO95/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。

如在上述参考文献中所述，噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以进行分离并用于产生完整抗体，包括人源化抗体，或任何其他所需的片段，并表达在任何期望的宿主包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌，例如，如下文中详细描述的。例如，重组产生Fab，Fab'和F(ab')2片段的本领域已知方法中使用技术也可以使用(例如在PCT公开WO92/22324；Mullinax，RL等人(1992)“异源二聚体Fab抗体蛋白在一个克隆步骤中的表达”现代生物科技，12(6)：864-869；和Sawai等人(1995)“应用聚合酶链反应和cDNA的表达载体从精子固定化抗体直接生产Fab片段”Am.生殖免疫学杂志34：26-34；和Better，M.等人(1988)”大肠杆菌分泌的活性嵌合抗体片段“，科学240：1041-1043。可用于生产单链Fvs和抗体的技术的实例包括那些描述在美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston，J.S等(1991)“单链抗体类似物和融合蛋白的蛋白质工程，”酶学方法203：46-88；Shu，L.等人，“从骨髓瘤细胞分泌单基因编码免疫球蛋白，”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)90：7995-7999；和Skerra.A.等(1988)“功能性免疫球蛋白的Fv片段在大肠杆菌中的组装，”科学240：1038-1040。

噬菌体展示技术可以用于增加抗体对HER2和/或IGF-IR的亲和力。这种技术将在在所公开的组合方法中使用以获得高亲和力的抗体中是有用的。此技术称为亲和力成熟，采用了诱变或CDR步行和重选，使用这样的受体或配体(或它们的胞外结构域)或其抗原片段，以识别与该抗原更高亲和力结合的抗体，该亲和力与初始或母辈抗体相比，(参见，例如，Glaser，SM等人(1992)“通过以密码子为基础的突变丝状噬菌体载体系统的抗体工程，”免疫学杂志149：3903-3913)。诱变整个密码子而不是单核苷酸，形成氨基酸突变的半随机谱。库可以构建由变体克隆的集合组成，由于单个CDR中单一氨基酸改变使其每一个都不同，并包含表示对应每个CDR残基的每个可能的氨基酸取代的变体。对抗原的结合亲和力增加的突变体可以通过固定的突变体与标记的抗原接触进行筛选。在本领域中已知的任何筛选方法可用于鉴定与抗原具有增加的亲和力的突变体抗体(例如，ELISA)(见，例如，Wu，H.等人(1998)“Vitaxin，Alphav Beta3特定的人源化单克隆抗体，的逐步体外亲和力成熟”，国家科学院院报(USA)95(11)：6037-6042；Yelton，DE等人，(1995)“BR96抗癌抗体通过密码子基于突变的亲和力成熟”免疫学杂志155：1994-2004。随机化轻链的CDR行走可以有使用的可能(参见，Schier等人(1996)“通过抗体结合位点中心的互补决定区的分子进化，对皮摩尔亲和力抗C-erbB-2的单链的隔离”分子生物学杂志263：551-567)。

使用随机诱变以确定改善的CDR是预期的。噬菌体展示技术也可以被用于增加(或减少)CDR的亲和力。此技术称为亲和力成熟，使用诱变或“CDR行走”，并重新选择使用目标抗原或抗原性片段，其识别具有与该抗原更高(或更低)亲和性结合的CDR抗体，与初始或母抗体比较(参见，例如，Glaser，SM等人(1992)“通过以密码子为基础的突变丝状噬菌体载体系统的抗体工程，”免疫学杂志149：3903-3913)。诱变整个密码子而不是单核苷酸，形成氨基酸突变的半随机谱。库可以构建由变体克隆的集合组成，由于单个CDR中单一氨基酸改变使其每一个都不同，并包含表示对应每个CDR残基的每个可能的氨基酸取代的变体。对抗原的结合亲和力增加(或减少)的突变体可以通过固定的突变体与标记的抗原接触进行筛选。在本领域中已知的任何筛选方法可用于鉴定与抗原具有增加(或减少)的亲和力的突变体抗体(例如，ELISA)(见，例如，Wu，H.等人(1998)“Vitaxin，Alphav Beta3特定的人源化单克隆抗体，的逐步体外亲和力成熟”，国家科学院院报(USA)95(11)：6037-6042；Yelton，DE等人，(1995)“BR96抗癌抗体通过密码子基于突变的亲和力成熟”免疫学杂志155：1994-2004。随机化轻链的CDR行走可以有使用的可能(参见，Schier等人(1996)“通过抗体结合位点中心的互补决定区的分子进化，对皮摩尔亲和力抗C-erbB-2的单链的隔离”分子生物学杂志263：551-567)。

用于实现这样亲和力成熟的方法描述于例如在：Krause，JC等人。(2011)“人类抗体的歪曲抗体结合位架构增强功能的插入突变”MBIO.2(1)pii:e00345-10.DOI：10.1128/mBio.00345-10；Kuan，C.T.等(2010)“靶向恶性胶质瘤与黑色素瘤的亲和力成熟的抗糖蛋白NMB重组免疫”Int.癌症杂志10.1002/ijc.25645；Hackel，B.J.等人(2010)，“稳定和CDR组成偏见富集结合功能景观，”分子生物学杂志401(1)：84-96；Montgomery，D.L等(2009)“人单克隆抗体对HIV-1gp41的亲和力成熟和表征”单克隆抗体1(5)：462-474；Gustchina，E.等(2009)“亲和力成熟通过来源于合成的天然人类抗体库的单克隆Fab的CDR-H2环的多样化靶向，以及产生具有改进的HIV-1中和效力和广度的一组Fab的GP41的针对内部三聚体卷曲线圈”病毒学393(1)：112-119；Finlay，W.J等(2009)“人源化鼠抗体抗RAGE的亲和力成熟疗法：全面突变揭示了高水准的突变可塑性内外的互补决定区，”分子生物学杂志388(3)：541-558；Bostrom，J.等人(2009)“为治疗发展，提高抗体的结合亲和力和特异性”方法分子生物学525：353-376；Steidl，S.等(2008)“通过靶向CDR-多样化的人GM-CSF抗体的体外亲和力成熟”分子免疫学46(1)：135-144；和Barderas，R.等(2008)“通过在硅片建模辅助抗体的亲和力成熟，”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)105(26)：9029-9034。

生产和使用任何上述抗体及其抗原结合片段的“衍生物”是特别预期的。

术语“衍生物”是指特异性免疫结合到抗原的抗体或其抗原结合片段，但它包括，相对于“亲代的“(或野生型)分子的一个，两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸替代，添加，缺失或修饰。这样的氨基酸取代或添加可引入天然存在的(即，DNA-编码)或非天然存在的氨基酸残基。术语“衍生物”包括，例如，任何抗体1.3，4.5或7.8的嵌合或人源化变体，以及具有改变CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区的变体，以形成，例如抗体等，具有表现出增强的或受损的效应或结合特性的变体Fc区。术语“衍生物”还包括非氨基酸修饰，例如，可被糖基化的氨基酸(例如，具有改变的甘露糖，2-N-乙酰葡糖胺，半乳糖，岩藻糖，葡萄糖，唾液酸，5-N-乙酰神经氨酸,5-乙二醇神经氨酸等内容)，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团、蛋白水解裂解衍生，连接至细胞配体或其它蛋白质等。在一些实施方案中，改变的糖修饰调制一个或多个以下操作：抗体的溶解，促进细胞内运输和抗体的分泌，促进抗体的组建，构象的完整性，以及抗体介导的效应器功能的便利。在一个具体的实施方案中，改变的糖修饰增强抗体介导的相对缺乏碳水化合物修饰的抗体的效应子功能。这导致改变的抗体介导的效应子功能糖修饰是本领域公知的(例如，参见Shields，RL等人(2002)，“在人IgG的N连接寡糖上岩藻糖的缺乏改善结合人Fc伽玛RIII和抗体依赖细胞的细胞毒性”生物化学杂志，277(30)：26733-26740；Davies J.等人(2001)“GnTIII在重组抗CD20的CHO细胞生产线的表达：改型糖型抗体的表达导致FC伽玛RIII较高的亲和力，进而导致ADCC的增加”生物技术与生物工程74(4)：288-294。改变碳水化合物含量的方法是本领域技术人员已知的，例如，见Wallick，SC等人描述在(1988)，“单克隆抗α抗体(1----6)葡聚糖的VH残留物的糖基化增加其抗原的亲和力，”J.Exp.Med.168(3)：1099-1109；Tao，M.H等(1989)“关于研究中糖基化的嵌合体小鼠人IgG在碳水化合物结构中的角色和由人IgG恒定区介导的效应器功能的研究”免疫学杂志143(8)：2595-2601；Routledge，例如，等(1995)“在人源化治疗CD3单克隆抗体的免疫中糖基化的作用”，移植60(8)：847-53；Elliott，S.等(2003)“通过糖工程，治疗性蛋白体内活性的增强”自然生物工程21：414-21；Shields，RL等人(2002)，“在人IgG的N连接寡糖上岩藻糖的缺乏改善结合人Fc伽玛RIII和抗体依赖细胞的细胞毒性”生物化学杂志，277(30)：26733-26740。

在一些实施例中，人源化抗体是一种衍生物。这样的人源化抗体包含一个或多个非人类CDR的氨基酸残基的取代，缺失或添加。人源化抗体衍生物非衍生化抗体相比时，可具有基本上相同的结合，更好的结合，或者更糟的结合。在具体实施方案中，将CDR的一个，两个，三个，四个或五个氨基酸残基取代，缺失或添加(即，突变)。

衍生的抗体或抗体片段，可以通过使用本领域技术人员已知的化学修饰技术，来修饰，包括在但不限于，特定化学切割，乙酰化，制剂，衣霉素的代谢合成等。在一个实施例中，一个抗体衍生物将具有相似或相同的功能的亲本抗体。在另一个实施方案中，抗体衍生物将相对于亲本抗体的表现出改变的活性。例如，衍生抗体(或其片段)可以更紧密地结合其表位或者是对蛋白水解比亲本抗体更有抵抗力。

在哺乳动物中，优选人，衍生的抗体可用于改变亲本抗体的半衰期(例如，血清半衰期)。优选这样的改变将导致大于15天，优选大于20天，大于25天，大于30天，大于35天，大于40天，大于45天，大于2个月，大于3个月，大于4个月，或大于5个月的半衰期。在哺乳动物，优选人类中，本发明的人源化抗体或其片段的增加的半衰期导致所述的抗体或该的抗体片段在该哺乳动物中更高的血清效价，从而减少了所述抗体或抗体片段给药频率和/或降低了所述抗体或抗体片段来进行给药的浓度。抗体或其片段在体内的半衰期可以通过本领域技术人员已知的技术来增加。例如，具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可以通过修饰氨基酸残基来产生，该氨基酸残基参与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用(例如，取代，缺失或添加)。人源化HER2和/或IGF-IR抗体可改造以增加生物半衰期(见，例如，美国专利号6277375)。例如，人源化HER2和/或IGF-IR抗体可以在Fc-铰链结构域被改造以增加体内或血清半衰期。

具有增加的体内半衰期的所述抗体或其片段可以通过附着在抗体或抗体片段的聚合物分子上产生，该聚合物分子例如高分子量的聚乙二醇(PEG)。PEG可以附着到所述具有或不具有多官能连接子的抗体或抗体片段，其通过PEG的位点特异性结合到所述抗体或抗体片段的N或C末端，或通过存在于赖氨酸残基上的小量-氨基基团。导致生物活性损失最小的直链或支链的聚合物衍生化将被使用。结合程度将通过SDS-PAGE和质谱密切监测，以确保PEG分子与抗体的正确结合。未反应的PEG可以从抗体-PEG偶联物通过，例如，尺寸排阻或离子交换色谱法进行分离。

HER2和/或IGF-IR抗体，也可以通过由Davis等人所描述的方法和偶联剂改性。(参见美国专利号4179337)，以便提供可以注射到哺乳动物循环系统中而基本上无免疫原性应答的组合物。

一个实施方案包括人源化HER2和/或IGF-IR抗体的框架残基修饰。框架残基在框架区可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选改善抗原结合。这些框架取代通过本领域众所周知的方法鉴定，例如，通过将CDR和构架残基的相互作用建模，与在特定位置上鉴定异常框架残基相比，以确定框架残基对抗原结合和序列的重要性。(参见，例如，美国专利号5,585,089；和Riechmann，L.等人(1988)“重塑人类抗体用于治疗，”自然332：323-327)。

又一实施方案包括抗人HER2和/或IGF-IR抗体(和更优选地，人源化抗体)及其抗原结合片段，其是重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)到异源分子(即，一个不相关的分子)。融合不一定需要是直接的，而是通过接头序列发生。

所公开的多肽也可包括与可以提高多肽的抑制效果的其它分子的融合分子和缀合物。融合分子的产生(例如，蛋白质)和偶联物(例如，通过物理或化学缀合)是本领域中的普通技术范围内的，并且可以涉及使用限制性内切酶或重组克隆技术(见，例如的，美国专利5314995，在此通过引用的方式并入)。

该融合分子(例如，蛋白质和核酸分子)或缀合物可以包含SEQ IDNOs:1-14的一个或多个，与任何合适的第二分子结合。例如，融合分子或缀合物可以包含SEQ ID NOs:1-11的一个或多个，与中性scFv抗体片段或Fab片段结合(例如，结合至HER2和/或IGF-IR的表位)。

毒素是有毒物质，通常是由植物，动物或微生物产生的，在足够的剂量下是致命产生。用于本文所描述的融合分子或缀合物的优选的毒素包括假单孢毒素，白喉毒素，破伤风类毒素，蓖麻毒素，霍乱毒素，志贺样毒素(SL TI，SL T-II，SL T-10IIV)，LT毒素，C3的毒素，志贺毒素，百日咳毒素，破伤风毒素，假单胞菌外毒素，alorin，皂草素，蒴莲根，和gelanin。多肽(例如，抗体或结合片段)，和毒素，可通过多种方式相连。如果杂交分子是由一个融合基因表达产生的，肽键将作为毒素和多肽之间的联系。

可选地，毒素和多肽可以单独制造和随后耦合(例如，通过一个非肽共价键的方式)。例如，共价键可以采取二硫键的形式。在这种情况下，核酸分子，其编码的多肽可任选地包含一个额外的半胱氨酸密码子。半胱氨酸的密码子可以被定位，以便不干扰分子的结合活性。该毒素分子可以衍生有巯基的修饰的多肽的半胱氨酸反应性。在肽毒素的情况下，这可以任选地通过插入DNA编码的半胱氨酸的密码子引入编码毒素的核酸分子来完成。在另一个替代方案中，巯基，单独或作为一个半胱氨酸残基的一部分，可以使用固相多肽技术引入到所公开的多肽。

此外，本文描述的多肽可以与其它公知已经在使用的治疗剂组合。本文描述的多肽和一种或多种其它治疗剂的组合可提供比任一单独药剂的更大的治疗效果，与当前的治疗剂相比，优选生成增强的或协同的效应。例如，所公开的多肽可以与其它治疗剂组合，其他治疗剂靶向IGF-IR，HER2或IGF的其它组分，和HER2的信令网络，包括IGF-I，IGF-II，IGF结合蛋白，HER1/HER3/HER4的结合蛋白结合，例如抗HER2单克隆抗体赫赛汀单抗，抗HER1单克隆抗体(罗氏公司)，抗HER3的单克隆抗体(Genentech公司)，抗IGF-IR单克隆抗体CP751,871(辉瑞公司)，神经调节蛋白/调蛋白(Sigma公司)，肝素-结合EFG样生长因子(Sigma公司)，β细胞素(Peprotech公司)，MK-0646(皮埃尔-法布尔/默克公司)，AmG479(安进)，IMC-A12(ImClone公司)，R1507(霍夫曼罗氏公司)，robatumumab(先灵葆雅)，以及细胞因子的免疫增强治疗(白细胞介素(IL)-2，IL-12，CD40L+IL-12，IL-7，干扰素(IFNs))。这样的治疗剂可以在已知的已经使用的治疗方式来施用，该治疗方式提供治疗效果。

所公开的多肽可以用于癌症的治疗有用的针对HER2和IGF-IR的中性抗体。在一些实施例中，所公开的抗体(或结合片段)可以抑制HER2和IGF-IR的功能，并能抑制HER2-和IGF-IR介导的信号传导。所公开的抗体(或结合片段)可具有对HER2和IGF-IR有高亲合性，和对HER2和IGF-IR具有特异性。

在一些实施方式中，所述抗体，或其结合片段，与其它分子(例如，抗-IGF-IR抗体，抗HER1/2/3抗体)物理上相关联，以抑制HER2-和IGF-IR介导的信号传导。换句话说，所述多肽特异性结合，特异地与，或特异性地与其它靶分子(例如IGF-I，-II，IGF结合蛋白，HER1/3/4的结合蛋白)相互作用。在一些替代实施方案中，所述多肽基本上不物理上与其它分子结合。

由本文所描述的多肽识别的表位可以用作癌症疫苗的免疫原，作为癌症疫苗的免疫活性部分，并作为HER2抑制剂和IGF-IR信令网络的靶向。例如，本文所描述的表位(或多肽包含所述表位)可被用作靶以分离抗体，除了本文所述的那些以外，结合本文中所描述的表位。这些抗体可用于治疗和诊断癌症中使用。

虽然可能施用(例如，作为疫苗)的表位(或多肽，其包含的抗原表位)，其被纯的或基本上纯的形式的所公开的抗体所识别，该表位可被配制成药物组合物，配方或制剂。因此，本文公开了包含表位的组合物(或多肽，其包含的抗原表位)，该表位由本文所述的抗体所识别。该组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体(如本文所述)和任选的其它治疗成分。包含这种表位的组合物可以用于治疗或以其他方式产生免疫应答。

例如，疫苗被提供以提高由于肿瘤存在的抗原的患者自身的免疫应答。这样的疫苗，其作为免疫原，任选可以是含有该表位或其类似物的部分或基本上纯化的重组多肽。包含表位的多肽可以与一种或多种脂蛋白缀合，脂质体的形式施用，或与佐剂。本发明还包括的是开发使用本文所述的表位的疫苗或免疫原性组合物的方法。

本发明还涉及在哺乳动物中，下调HER2和IGF-IR和抑制HER2-和IGF-IR介导的信号传导的方法。该方法包括施用有效量的多肽(例如，抗体或其结合片段，其特异性结合人HER2和IGF-IR)编码其多肽的核酸分子，包含核酸分子的载体，含有核酸分子和/或载体的细胞，或包含前述内容的组合物，向哺乳动物，其中癌细胞生长和癌转移被减少或抑制。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。

在一些实施方案中，多肽(例如，抗体或结合片段，其特异性结合人HER2和IGF-IR)，核酸分子，含有编码该多肽的核酸的载体，或细胞(例如，宿主细胞)含有任一上述能被施用于哺乳动物的细胞。

还公开了一种用于治疗肿瘤或癌症的方法，包括给予需要这样的受试者治疗有效量的分离的抗体，或其结合片段施用于受试者的方法。在一些实施例中，所公开的核酸分子，载体和/或宿主细胞可以施用于肿瘤或癌症的治疗。在一些实施例中，所公开的化合物，组合物和方法可用于治疗或改善乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，前列腺癌，睾丸生殖细胞瘤，胶质母细胞瘤，胃癌，食道癌，肺癌，肝癌和结肠癌。

术语“治疗”或其任何语法变化形式(例如，治疗，处理和治疗等)，如本文所用，包括但不限于，减轻或缓解疾病或病症的症状、减少、抑制、抑制，减轻或影响进展、严重程度和/或条件的范围。

如本文所用的术语“受试者”，描述了一种有机体，包括哺乳动物如灵长类动物，其接受所公开的组合物的治疗。哺乳动物物种，可以从所公开的治疗方法中获益，包括但不限于猿，黑猩猩，猩猩，人，猴；和家养动物如狗，猫，马，牛，猪，绵羊，山羊，鸡，小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠。

载体包括，例如，核酸的载体，如裸DNA和质粒和病毒载体，如逆转录病毒载体，细小病毒为基础的载体(如腺病毒为基础的载体和腺相关病毒(AAV)为基础的载体)，慢病毒载体(例如，单纯疱疹病毒(HSV)为基础的载体)，和混合型或嵌合型病毒载体，如腺病毒骨架用慢病毒组分(例如，见Zheng等人，Nat.生物科技，18(2)，176-80(2000)，国际专利申请WO98/22143，国际专利申请WO98/46778；和国际专利申请WO00/17376)和腺病毒骨架与腺相关病毒组件(例如，见Fisher等人，Hum.，基因治疗，7，2079-2087(1996))，所有这些都通过引用并入本文)。载体和载体的构建是本领域已知的(参见，在例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室，纽约(1989)；和Ausubel等人，当前分子生物学方法，绿出版协会和约翰Wiley&Sons，纽约，纽约州(1994)，这两者都通过引用的方式并入)。

该载体可以包含任何合适的启动子和其它调节序列(例如，转录和翻译起始和终止密码子，这特定于宿主的类型)来控制编码多肽的核酸序列的表达。该启动子可以是天然的或非天然的启动子，其可操作地连接到上述核酸分子。启动子的选择，包括各种组成和调节的启动子，在普通技术人员的技能范围内。

调节的启动子的例子包括可诱导的，可抑制的，和组织特异性启动子。具体实例包括四环素调控的启动子，类固醇调控的启动子，茶碱核开关，病毒启动子，如腺病毒启动子，巨细胞病毒启动子和AAV的启动子。此外，结合上述描述的启动子的核酸是本领域技术范围内。

含有上述多肽或编码该多肽的核酸分子的细胞(例如，分离的宿主细胞)，其任选地以载体的形式，也由本发明提供。任何合适的细胞可以被使用。实例包括宿主细胞，如大肠杆菌(如大肠杆菌Tb-1，TG-2，DH5α，XL-蓝MRF'(Stratagene公司)，SA2821，和Y1090)，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌假单胞菌属(例如，P.aerugenosa)，N grassa，昆虫细胞(例如，Sf9，EA4)，酵母(酿酒酵母)细胞，以及衍生自哺乳动物的细胞，包括人细胞系衍生的细胞。合适的真核宿主细胞的具体例子包括SKOV-3，SKBR3，MDA453，MCF-7，VERO，HeLa细胞，3T3，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，W138BHK，COS-7，和MDCK细胞。备选地，细胞来自哺乳动物，如人，根据本文中所描述的，可以用作宿主细胞的方法进行治疗。

导入载体到分离的宿主细胞的方法和转化的宿主细胞的体外培养和选择的方法是本领域已知的，包括使用氯化钙介导的转化，转导，接合，三亲交配，DEAE，葡聚糖介导的转染，感染，膜融合脂质体，用DNA包被的微粒高速轰击，直接显微注射到单个细胞，和电穿孔(参见，例如，Sambrook等，分子生物学：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(1989)；Davis等，分子生物学基本方法(1986)；和Neumann等人，EMBO J.1，841(1982)，所有这些都通过引用并入本文)。在一些实施例中，含有载体或核酸分子的细胞由该细胞转录和有效地翻译。

所公开的抗体可通过注射或在一段时间内逐渐输注来进行肠胃施用。虽然被处理的组织通常可以在体内通过全身给药，以及因此最经常的处理是通过治疗性组合物的静脉给药，但是其它组织和输送装置也被考虑，其中有一种可能性，就是被靶向的组织含有靶分子。因此，抗体以及其的衍生物可以通过静脉内给药、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮、局部、眼内、口服、鼻内，并且可以通过蠕动方式输送。

含有所公开的抗体的治疗组合物通常静脉内给药，例如，通过注射单位剂量。在用于参照所公开的治疗组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为单一剂量用于受试者的物理分散单位，含有预定量的活性物质的单位，计算以产生与所需稀释剂相关联的期望的治疗效果；即，载体或赋形剂。

该组合物以与剂型相容的方式施用，并施用以治疗有效量。给药量和时间取决于所治疗的患者，患者的系统利用该活性成分的能力，以及对治疗效果的期望程度。需要施用的活性成分的精确量取决于医师的判断和每个人所特有的。然而，本文公开了全身施用的合适剂量范围，并且取决于给药途径。用于给药的合适方案也是可变的，但通常由一个初始给药，随后以一个或多个小时的间隔重复给药，通过注射或其它施用方式。可替代地，可以考虑足以维持血液中的浓度的连续静脉输注，特别是在体内的治疗。

核酸分子，载体，细胞，和多肽可施用给哺乳动物单独使用，或与药学上可接受的载体组合施用。药学上可接受的是指一种材料不是生物学或其它方面不期望的(例如，该材料可施用于哺乳动物，随着核酸，载体，细胞，或多肽，而不会引起不希望的生物作用或以有害的方式与药物组合物含有的其他成分相互作用)。该载体被选择以最小化药剂的降解，并尽量减少在哺乳动物的不良副作用。载体的选择对于本领域技术人员是公知的。

合适的载体及其制剂在Remington中描述：药学科学和实践(第19版)编A.R。Gennaro，麦克出版公司，Easton，PA(1995)。药物载体的实例包括无菌水，盐水，林格氏溶液，葡萄糖溶液，和在生理pH值的缓冲溶液。

通常情况下，其药学上可接受的盐的合适用量是用于制剂中，以使制剂等渗。在一些实施例中，该溶液的pH为约5至约8(例如，约5.5，约6，约6.5，约7，约7.5，和包括任何这些量之间的范围)，虽然此范围之外的pH值能够使用。在一些实施方案中，pH为约7至约7.5。

所公开的药物组合物也可以包括缓释制剂，如含有该多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形制品(如薄膜，脂质体或微粒)的形式。这将是本领域技术人员显而易见的，某些载体可能更优选，这取决于，例如，给药的途径和组合物的施用浓度。

含有所述核酸分子，载体，细胞，或多肽的组合物(如药物组合物)例子可以包括载体，增稠剂，稀释剂，缓冲剂，防腐剂，表面活性剂和类似物。该组合物还可以包括一种或多种活性成分，如抗-IGF-I，-II抗体，化疗药物等。本文所述的组合物可以经美国FDA或相当于在其它国家批准使用。含有所述核酸分子，载体，细胞，或多肽的组合物(如药物组合物)可以任何合适的方式来施用，取决于是否期望局部或全身治疗，以及治疗的面积。

如果该组合物是肠胃外给药，给药通常是通过注射。注射剂可以以常规形式制备，既可以液体溶液或悬浮液、适合于注射前制备成溶液或悬浮液的固体的形式，或作为乳液。另外，肠胃外给药可以包括缓释或持续释放系统，使得保持恒定剂量(参见，例如，美国专利3610795，其在此引入作为参考)。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液剂，混悬剂和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水，醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格，或不挥发油。静脉内载体包括流体和营养补充剂，电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖)，和类似物。防腐剂和其他添加剂也可以存在，如，例如，抗菌剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等。

该组合物可以是酸或碱加成盐的形式，通过用无机酸反应制得，如盐酸，氢溴酸，高氯酸，硝酸，硫氰酸，硫酸和磷酸，以及有机酸如甲酸，乙酸，丙酸，羟基乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，马来酸和富马酸，或通过与无机碱反应，例如氢氧化钠，氨氧化钾，氢氧化钾和有机碱如单，二，三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺类。

核酸分子，载体，或多肽可与药学上可接受的载体施用，并可以通过本领域公知机制的技术递送到哺乳动物的细胞在体内和/或离体(例如，裸露的DNA，脂质体融合，通过基因枪的DNA肌肉内注射，内吞作用，等等)。

治疗癌症所需的组合物的确切的量可以不同，取决于哺乳动物物种、年龄、性别、体重、特定所用的多肽、核酸、载体、或细胞，给药的途径，以及是否其他药物是否被包括在治疗方案中。因此，它不可能对每个组合指定精确的量。然而，合适的，合适的量只有通过本领域的普通技术人员使用本文教导的常规试验来确定。组合物给药的剂量范围为大到足以产生所需的效果的那些量；然而，该剂量不应大到引起不良副作用，例如不想要的交叉反应，过敏反应等。剂量可以变化，并且可以在施用一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多，四种或更多，或五种或更多)的日剂量，对一天或多天(或任何合适的时间周期，以推进治疗)。基于癌症的测定，该组合物可以立即给药和连续或间歇地给药。

如本文所用的术语“有效量”是指其量是能够治疗或改善疾病或病症的，或以其他方式能够产生预期的治疗效果的。在一些实施例中，有效量是指可用于治疗或改善肿瘤或癌症是有用的量。在一些实施方案中，有效量能够在受试者中抑制或减少癌细胞生长或转移。施用本文所述的治疗剂和组合物的有效剂量和时间表可以凭经验确定，并作出这样的确定对于本领域的普通技术人员是常规的。

本领域技术人员将理解，该多肽的剂量是变化的，这取决于，例如，所用给药途径，所用的特定多肽，施用其它药物，以及年龄，病情，如上述的患者的性别和严重性。本文描述的多肽的有效剂量在大约1微克/公斤体重和100毫克/公斤体重之间的范围内。这样的剂量范围的例子是，例如，约1微克-100微克/公斤，约100微克-1毫克/千克，约1毫克/公斤-10毫克/千克，或约10毫克-100毫克/公斤，每月一次，一周一次，两周一次，每天一次，每天两到四次。

指导选择合适剂量的抗HER2/抗-IGF-IR抗体，如本文所描述的多肽，在文献中被发现于抗体的治疗用途(见，例如，单克隆抗体手册，Ferrone等人eds.，Noges出版舍，Park Ridge，NJ(1985)；和Smith等人，在人的诊断与治疗中的抗体，哈伯等人编，Raven出版舍，纽约(1977)，所有这些在此引入作为参考。所有多肽通常的日剂量范围从每天约1微克/千克至高达约100毫克/千克体重或更多，这取决于上述因素。例如，该范围可以是从大约100毫克至约1克每份剂量。核酸，载体和宿主细胞应当施用，以致使生成的多肽的水平相当。

本发明还包括试剂盒，包括多肽，核酸分子，载体，细胞，表位，或上述物质的组合物。该试剂盒可以包括一个独立的容器，其包含合适载体，稀释剂或赋形剂。该试剂盒还可以包括佐剂，细胞因子，抗病毒剂，免疫测定试剂，PCR试剂，放射性标记等。此外，该试剂盒可包括用于混合或组合的成分和/或施用的说明。

本发明还提供了一种检测哺乳动物中HER2和IGF-IR的方法，包括从本文所描述的多肽与从哺乳动物获得的样品相接触。如果抗原是存在于哺乳动物中，其多肽可以结合的，在多肽和抗原之间形式复合物。复合物的检测显示哺乳动物中升高的HER2和IGF-IR的存在。

从哺乳动物的样品可以是任何合适的样品，用来检测HER2和IGF-IR的存在。该复合体可以通过任何合适的方式来检测。本文描述的多肽可用为标记分子，应用在，如放射免疫测定(RIA)或酶免疫测定(EIA)，尤其是酶联免疫吸附测定(ELISA)，通过将其引入到放射性物质，如1125，1131，H3(氚)，C14等；各种酶试剂如过氧化物酶(POX)，胰凝乳蛋白酶原，羧肽酶原，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，淀粉酶，磷酸化酶，脱氧核糖核酸酶，P-核苷酸酶，I3-半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，鸟氨酸脱羧酶等。放射性物质可以以常规的方式被引入。例如，引入放射性碘，I125，可以通过使用氯胺T氧化离子化方法进行(见，例如，Hunter等人，自然，194，495-496(1962))或通过使用Bolten-Hunter试剂进行(1125-碘化对羟基苯基丙酸肉桂酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)，其在此引入作为参考。

上述方法中使用的标记物可以是本领域中已知的任何合适的标记物，如生物素化的蛋白质或肽。

除了在操作实施例中，或另有说明，所有数字，数值和/或表达式指的是成分、反应条件等的数量等，用于说明书和权利要求书中在所有情况下应理解为术语“约”。

虽然本发明已就某些实施例进行了说明，但是应当理解的是，通过阅读本说明书，其各种修改对于本领域技术人员是显而易见的。因此，要理解的是，本文所公开的发明旨在覆盖的这些修改落入所附权利要求书的范围内。

所有专利，专利申请，临时申请和出版物提及或本文引用作为参考并入其全文，包括所有的图和表，在某种程度上它们不与本说明书的明确教导是不一致的。

但是应当理解的是，本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并且各种修改或变化，它们的光将被建议给本领域的技术人员，并且被包括在本申请的精神和范围之内的所附权利要求书的范围之内。此外，本文所公开的任何元件或任何本发明的限制或实施例可与任何和/或所有其它元件或限制(单独地或以任何组合)，或者本文公开的任何其它发明或实施方案组合物相组合，以及所有这些组合都设想用本发明的但又不限于此范围。

材料和方法

DNA的制备

编码IGF-IR的细胞外结构域(外功能区)的基因，从pBluescript-IGF-IR构建体P08069中扩增(Zhang等人，单克隆抗体1：475-80(2009))，并且在EcoR I和Not I位点亚克隆到pSecTag2C载体。该编码HER2胞外域的基因是从SKOV-3细胞通过逆转录PCR扩增，随后在XhoⅠ和SFI位点克隆到pSecTag2A载体。两个构建体都通过DNA测序证实。

IGF-IR和HER2胞外结构域的重组通过293T细胞的瞬时转染产生。转染表达通过对编码噬菌体T7RNA聚合酶的牛痘病毒vTF7-3的转导进行增强。转染后72小时，收集培养物上清液和带His标签的胞外结构域通过固定化金属亲和层析纯化。

细胞系，抗体和化学品

乳腺癌MCF-7细胞在DMEM培养基(Invitrogen)中培养，该培养基补充有10％热灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素(P/S)。卵巢癌SKOV-3细胞是在补充有10％热灭活FBS和1％P/S的McCoy的5A培养基(Hyclone公司)中培养。以下主要的mAb从Cell Signal Technology(细胞信号技术)购买：兔抗磷酸化Akt(Thr308)(C31E5E)，兔抗磷酸化p44/42MAPK(ERK1/2)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E)XP，兔抗Akt(pan)(11E7)，兔抗-P44/42MAPK(ERK1/2)(137F5)，和兔抗GAPDH单克隆抗体(14C10)。二级抗体购自Jackson ImmunoResearch(杰克逊免疫研究)。Xenolight D-荧光素从Caliper LifeSciences(Caliper生命科学)购买。

赫赛汀和M590，以及Bi-Ab的表达和纯化

赫赛汀和M590分别由293F细胞(Invitrogen)中与重组质粒pDR12-赫赛汀和pDR12-M590分别瞬时转染来表达。双-ab是由瞬时共转染293F细胞用pDR12-赫赛汀-366和pDR12-m590-407质粒表达。重组抗体通过蛋白A(GEHealthcare)上的亲和纯化从培养物上清液中来纯化。

间接ELISA

IGF-IR或HER2(2微克/在这两种情况下毫升)的重组胞外结构域包被在96孔高结合ELISA板中，4℃过夜。将板用含3％BSA的PBS洗涤并且在37℃保持2小时。两倍系列稀释的单克隆抗体赫赛汀或M590加入到孔中，结合的单克隆抗体通过辣根过氧化物酶偶联的抗人Fc作为二次抗体和TMB底物进行检测。光密度在450nm(OD450nm)，在室温下进行显色30分钟后测定。在Bi-Ab的情况下，重组IGF-IR的胞外结构域涂布在平板上。加入2倍系列稀释的Bi-Ab和孵化保持在室温2小时，洗涤板，和生物素化的HER2胞外结构域(2微克/毫升)加入到各孔中。通过HRP标记的链霉亲和TMB底物检测结合HER2胞外结构域。

Western印迹

MCF-7或SKOV-3细胞在完全培养基中接种于6孔板。当细胞达到70-80％汇合时，它们被培养于无血清的培养基中过夜。细胞用抗体处理30分钟，接着加入1.5纳米的IGF-I，和进一步温育30分钟。然后将细胞裂解和来自每个样品的10μl细胞裂解液用12％SDS-PAGE溶解。一旦蛋白质转移，PVDF膜用含5％脱脂乳的PBS溶液封闭30分钟，孵育一抗，然后二抗。该膜每一步孵育后彻底清洗。Western印迹信号是由Western Bright ECL-HRP底物(Advansta)检测。

流式细胞术

MCF-7或SKOV-3细胞用无酶的细胞解离缓冲液(Invitrogen)的分离，用PBS洗涤两次，并于4℃下，在荧光激活细胞分选(FACS)缓冲液(PBS含1％FBS)用抗体孵育2小时。采用PE在4℃下缀合的抗人Fc孵育1小时，然后用FACS缓冲液清洗两次和用2％多聚甲醛FACS缓冲液固定，对细胞表面结合的抗体进行检测。用BD流式细胞仪和FlowJo软件对染色的细胞进行分析。

ADCC检测

流式细胞仪为基础的ADCC试验以前已经描述(Srivastava等人，病毒学杂志87：5831-40(2013))。这里，我们使用SKOV-3细胞作为靶细胞和健康人志愿者的PBMC作为效应细胞，以25:1的E/T比。简言之，将SKOV-3细胞用PKH-67染色，然后与抗体和PBMC混合。在孵育2小时，7-AAD加入到该混合物中。随后洗涤几次，将样品通过FACS AriaIII流式细胞仪使用BDFACS的Diva软件进行分析。细胞死亡率是由四个可识别的细胞群的软件分析来测定，活效应细胞(无染料)，死的效应细胞(7-AAD阳性)，活的靶细胞(PKH-67阳性)和死亡的靶细胞(PKH-67和测定7-AAD双阳性)。ADCC比率被计算为[(％实验裂解-％自发裂解)/(％最大裂解-％自发裂解)]×100，其中“％自发裂解”是指与效应物在不存在抗体的混合的死亡靶细胞百分比，和“％最大溶解”指的是与效应物在1％TRITONTM X-100的存在下混合的死亡靶细胞百分比，“％实验裂解”是指与抗体的存在效应物混合的死亡靶细胞百分比。一式两份进行，并再一次重复该测定。一位数据代表集一组显示于本报告中。

细胞增殖测定

抗体在含有2％FBS的培养基中进行系列稀释，并与含有3纳米的IGF-I SKOV-3细胞等体积混合。细胞/抗体混合物，然后铺板于96孔细胞培养板中，终浓度为每孔1.5纳米的IGF-I和2000个细胞。平皿于37℃，5％CO₂下孵育72小时，并通过细胞滴定度96含水非放射性细胞增殖检测试剂盒(Promega公司)检测细胞的增殖水平。

“旋钮，进入孔”变种CH3的构建

人源化赫赛汀重链(HC)和轻链(LC)基因[DrugBank：赫赛汀单抗(DB00072)(BIOD00098，BTD00098)]和从M590的HC和LC基因，合成并克隆入哺乳动物表达质粒pDR12，从Dr.Dennis Burton获得，斯克里普斯研究所，加利福尼亚州(参见，美国专利号5804440)，其含有人IgG1重链基因组DNA的恒定区。两个突变采用定点突变试剂盒(Stratagene)引入pDR12-赫赛汀(T366Y)和pDR12-M590(Y407T)的CH3结构域。用于诱变的引物为：T366Y-F：5'-CCAGGTCAGCCTGTACTGCCTGGTCAAAG-3'，(SEQ ID NO：17)和T366Y-R：5'-CTTTGACCAGGCAGTACAGGCTGACCTGG-3'；(SEQ IDNO：18)和Y407T-F：5'-CTCCTTCTTCCTCACCAGCAAGCTCACCG-3'，(SEQID NO：19)和Y407T-R：5'-CGGTGAGCTTGCTGGTGAGGAAGAAGGAG-3'(SEQ ID NO：20)。突变通过DNA测序证实。将所得质粒分别命名为pDR12-赫赛汀-366和pDR12-m590-407。pDR12-m590-366和pDR12-赫赛汀-407还可以创建和用于生产抗HER2/IGF-IR的双特异性抗体。

荧光素酶表达的SKOV-3稳定细胞系的生成

293T细胞与编码HIV-1Gag和聚合酶基因的重组质粒(GAG-POL)，卢克表达质粒，和VSV骨架质粒以2/2/1的比(GAG-POL/卢克/VSV)瞬时共转染。转染后(36-48h)，收集含有Luc-慢病毒培养物上清液，然后用新鲜培养基等量混合，接着加入聚凝胺至8微克/毫升的最终浓度。九毫升的混合物加到SKOV-3细胞，接种于100-mm培养皿中，并在37℃5％CO2下培养6小时。三毫升含8微克/毫升的聚凝胺培养基然后加入到培养皿中。培养过夜后，除去感染培养基，细胞培养在含有1微克/毫升嘌呤霉素的新鲜的McCoy的5A培养基。经过3-5代，进行有限稀释，单细胞克隆通过萤光素酶测定法进行筛选。表达荧光素酶的最高级别的单细胞克隆被扩展和通过在96孔板中成像进行滴定。

建立肿瘤异种移植小鼠模型和小鼠的研究

本研究经香港大学委员会对使用活禽畜于教学与研究进行认可(CULATR#2514-11)。裸体的BALB/c雌性小鼠，4-6周龄，分别从香港大学的动物中心获得。要建立异种移植癌的小鼠模型，试点实验进行了皮下注射不同数量的SKOV3-Luc细胞到裸鼠中，和在不同的时间点分析成像。感兴趣区域(ROI)中的产生了持续增加发光强度的最佳细胞数进行了测定。

小鼠研究如下进行：在第0天，SKOV-3-Luc细胞再悬浮于纯的McCoy的5A培养基中，将3百万细胞通过皮下注射到每只裸鼠。在第1天，氯胺酮/XYCAZINE/PBS以1/1.2/7.8的比例进行混合，以及40微升(2.5μL/g体重)麻醉剂混合物皮下注射到每只小鼠。在DPBS中(5微升/g体重)D-萤光素(100微升)以30毫克/毫升的浓度，接着依次注入到各小鼠腹膜内(腹腔注射)(每只小鼠接受300毫克萤光素/kg体重)。注射后约15分钟，在体内成像系统中使用精诺IVIS100，将小鼠的感兴趣区域(ROI)的发光强度进行成像。小鼠被随机化，然后，使各组小鼠具有大致相同的平均发光强度。每组7只小鼠，共4组分别对应地形成赫赛汀，M590，Bi-Ab，以及Comb的处理条件。在第1，4，6和8天，每个抗体(100微克)或抗体组合(100微克总)由腹腔注射到每只小鼠中。小鼠成像在第4，6，8，11，15，25，和35天重复进行。

所有专利，专利申请，临时申请和出版物提及或本文引用作为参考并入其全文，包括所有的图和表，在某种程度上它们不与本说明书的明确教导是不一致的。

以下是实施例，说明用于实施本发明的程序。这些实施例不应被解释为限制。所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物的比例均为体积比，除非另有说明。

实施例1HER2和IGF-IR通过抗HER2/抗IGF-IR抗体的同时结合

本实施例中使用“旋钮-成孔”方法来产生抗IGF-IR/抗HER2混合的IgG。“旋钮”突变体是于赫赛汀的CH3结构域用酪氨酸(T366Y)替换苏氨酸生成。“孔”的突变体是在M590的CH3结构域由苏氨酸(Y407T)替换酪氨酸生成。具有“旋钮”和“成孔”质粒的293F细胞共转染，导致呈现HER2与IGF-IR的双特异性的稳定的异源二聚体的生成(图1)。

双特异性抗HER2/抗-IGF-IR抗体可以通过间接ELISA同时结合重组IGF-IR(包衣)和HER2胞外结构域。

该双特异性抗体(Bi-Ab)结合到重组IGF-IR和HER2胞外结构域(图1B)，以及过表达，膜相关的IGF-IR和HER2于SKOV-3细胞(图1C)。相比于在我们以前的研究中使用的乳腺癌MCF-7细胞，癌SKOV-3细胞中同时表达高水平的HER2和IGF-IR(图1A)。类似于两种原始的抗体，M590和赫赛汀，以剂量依赖的方式结合到SKOV-3的Bi-Ab(图1D)。此外，流式细胞术分析显示，赫赛汀和Bi-Ab具有相似的结合特性，这表现在直方图中(图1C)的两个峰，这表明细胞表面的HER2蛋白可以具有多个构象或组织状态。

图1B示出了结合到包被于96孔高结合ELISA板的重组IGF-IR的胞外结构域的抗HER2/抗-IGF-IR抗体。在添加抗HER2/抗-IGF-IR抗体到重组IGF-IR的包覆板之后，添加生物素化的重组HER2胞外结构域。通过HRP结合的链霉亲和TMB底物检测结合HER2胞外结构域。

实施例2-BI-AB抑制受体磷酸化和下调下游PI3K/Akt和MAPK信号

本发明人已报道，M590在乳腺癌MCF-7细胞中阻断配体诱导的IGF-IR磷酸化(Zhang等人，单克隆抗体1：475-80(2009))，并抑制MCF-7细胞的增殖和迁移(Fu等人，中国中华实验外科杂志29：824-6(2012))。

本实施例表明，M590在MCF-7细胞中抑制Akt和ERK的配体诱导的磷酸化(图2A)。此外，本实施例对比了Bi-Ab，M590和赫赛汀对MCF-7(图2B)和SKOV-3细胞(图2C)中的ERK磷酸化在不存在配体条件下的作用。

在MCF-7细胞中，无论是M590和Bi-Ab均抑制ERK磷酸化，并且组合治疗稍微降低ERK的磷酸化(图2B)；但在SKOV-3细胞中，只有Bi-Ab弱抑制ERK磷酸化(图2C)。

赫赛汀在两种细胞系(图2B和2C)的ERK磷酸化中没有抑制效果。我们然后在配位体(IGF-I)的存在下，比较Bi-Ab，M590和赫赛汀在SKOV-3细胞(图2D)上的IGF-IR磷酸化作用，和在MCF-7(图2E)和SKOV-3细胞(图2F)中游信号传导的影响。

与非特异性人IgG对照组相比，M590和Bi-AB在SKOV-3细胞中均抑制IGF-IR的磷酸化。用赫赛汀或组合治疗并未导致的IGF-IR磷酸化在SKOV-3细胞中水平的降低(图2D)。

在MCF-7细胞中，M590和Bi-Ab及其组合抑制配体诱导的Akt磷酸化，但仅Bi-Ab抑制配体诱导的ERK磷酸化(图2E)。在MCF-7细胞中用赫赛汀治疗略微增强配体诱导的Akt磷酸化(图2E，道2)。

在测试的抗体浓度下(100微克/毫升)，在SKOV3细胞中，没有抗体显示了Akt和ERK的配体诱导的磷酸化的抑制效果(图2F)。

这些结果表明，在肿瘤细胞中HER2和IGF-IR的两个高水平的共表达提高了抗体干扰受体磷酸化和下游信号传导的基线(bar)，特别是当配位体(IGF-I)存在时。IGF-I的存在或不存在时，赫赛汀在MCF-7和SKOV-3细胞中对于抑制Akt和ERK的磷酸化均是无效的。在MCF-7细胞中，在不存在配体的条件下，Bi-Ab和M590抑制Akt和ERK磷酸化的效果与在MCF-7细胞中抑制Akt磷酸化的效果是相同的，但在SKOV-3细胞中，在不存在配体的情况下，在Bi-Ab比M590更有效抑制ERK磷酸化，和在MCF-7细胞中抑制配体诱导的ERK磷酸化。

实施例3-BI-AB比赫赛汀和M590在体外更有效地抑制癌细胞增殖，并含有ADCC活性

结果表明，Bi-Ab衰减PI3K/Akt和MAPK途径；这促使我们分析Bi-Ab对肿瘤细胞增殖的影响。

Bi-Ab治疗有效抑制SKOV-3细胞的体外增殖(图3A)。值得注意的是，虽然组合治疗显示的SKOV-3细胞增殖与单独赫赛汀治疗相比有增强的抑制，但是二者治疗条件均比Bi-Ab(图3A)的效力较低。此外，M590抑制SKOV-3细胞的增殖，但当M590浓度降低时其效果急剧下降(图3A)。

调查“旋钮”和“孔”的突变是否影的Fc介导的效应子功能，我们基于SKOV-3作为靶细胞和健康人外周血单核细胞(PBMCs)作为效应细胞，使用流式细胞仪测定Bi-Ab对于ADCC的活性。该分析显示，Bi-Ab具有ADCC活性相当或略高于M590，赫赛汀，和M590和赫赛汀(组合)(图3B)。这些结果表明，在体内通过ADCC，Bi-Ab仍然有效地杀死HER2-和/或IGF-IR表达的肿瘤细胞。

实施例4-抗HER2/抗IGF-IR抗体在SKOV-3肿瘤异种移植小鼠模型中生长抑制活性的增强

施用抗HER2/抗-IGF-IR抗体后，小鼠皮下荧光素酶表达SKOV-3肿瘤表现出有效的肿瘤消退。

图4示出了在SKOV-3荷瘤小鼠在肿瘤接种和抗体治疗后不同时间点的发光强度。随后腹腔注射赫赛汀，M590，或抗HER2/抗-IGF-IR抗体，在肿瘤细胞接种后第1、4、6和8天，接收到抗HER2/抗-IGF-IR抗体的组中显示出肿瘤的生长最显着的回归。

为测试体内的Bi-Ab的效果，建立了HER2-和IGF-IR的过表达癌异种移植小鼠模型，我们生成稳定表达荧光素酶的SKOV-3-吕克细胞系。我们按照图4A所示的方案在这个小鼠模型中测试了Bi-AB，M590，赫赛汀，以及组合。总共有四个实验组，并且每个组有7只裸鼠。三百万SKOV-3-Luc细胞经皮下注射到每个裸鼠，和抗体由腹腔注射(每只小鼠100微克)，在接种后第1，4，6和8天。在抗体注射前的第1，4，6，8天，测量小鼠体重和感兴趣区域(ROI)的发光强度，在接种后的第11，15，25和35天重复进行测量。Bi-Ab治疗的小鼠的平均体重在整个研究中也没有减少，其它三个实验组的平均小鼠体重在第4天降低，在对比时间点上，4组平均体重之间没有出现显著的差异。

平均发光强度在所有的实验组(图4B)中变化。值得注意的是，Bi-Ab治疗组的肿瘤生长展现了戏剧性的抑制作用，持续了比其他三组更长的时间。在Bi-Ab组中的平均荧光强度在第6天和其后显著低于M590组(图4B)。

在第6、8和11天，组合治疗组也比表现出较低的平均发光强度，但赫赛汀组仅在第8和11天比M590组表现出更低的平均发光强度(图4B)。M590组的平均发光强度也在第11天下降，并在第15天进一步降低，但在第25和35天复发到高水平。组合治疗组从第25天开始表现出复发(增加的平均发光强度)，而赫赛汀组较早的在第15天就出现复发。Bi-Ab的平均发光强度在第35天略微升高，但是其仍然明显低于M590组(图4B)。

然后我们研究各组小鼠的个体，并计数比基准水平(无接种)高出有2倍以上的发光强度(图4C)的小鼠的数目。Bi-Ab组表现出的发光强度早期的下降。第4天，Bi-Ab组中5/7的小鼠具有低于基线水平的2倍的发光强度，而在第4天组合治疗组和赫赛汀组只有3/7的小鼠具有同样低的发光强度(图4C)。Bi-Ab组另两只小鼠在8和15天显示出发光强度低于基准水平的2倍，并且Bi-Ab组所有小鼠的发光强度直到研究结束仍维持在低水平，除了一只小鼠在第35天复发(图4C)。在第6和8天，组合治疗组中5/7的小鼠显示出的发光强度低于基线水平的2倍，但组合治疗组中的这5只小鼠中的一只在第35天复发。在第8天，赫赛汀组6/7的小鼠显示出发光强度低于基线水平的2倍，但这些小鼠在研究进行中逐个复发。赫赛汀组中只有一只小鼠在第35天具有低于基线水平的2倍的发光强度(图4C)。在整个研究过程中，M590组没有小鼠表现出小于基线水平的2倍的发光强度。这些结果表明，比M590和赫赛汀，以及M590和赫赛汀的组合，Bi-Ab更有效地抑制肿瘤的生长。此外，Bi-Ab有效地推迟HER2-的复发和IGF-IR-过度表达的癌症。

但是应当理解的是，本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并且各种修改或变化，它们的光将被建议给本领域的技术人员，并且被包括在本申请的精神和范围之内的所附权利要求书的范围之内。此外，本文所公开的任何元件或任何本发明的限制或实施例可与任何和/或所有其它元件或限制(单独地或以任何组合)，或者本文公开的任何其它发明或实施方案组合物相组合，以及所有这些组合都设想用本发明的但又不限于此范围。

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Claims (21)

1.一种分离的、双特异性的抗体或其结合片段，其特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)和人类胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)。

2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，包含选自SEQ ID NO：1-4的氨基酸序列或其片段。

3.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其中恒定区的CH3包含SEQ ID NO：5。

4.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其中恒定区的CH3包含SEQ ID NO：6。

5.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其中恒定区的CH3包含SEQ ID NO：7。

6.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其特异性地结合表达在肿瘤或癌细胞上的人HER2和人IGF-IR。

7.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其特异性地结合人HER2和人IGF-IR的胞外结构域。

8.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其包括F(ab')₂。

9.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其是人源化抗体。

10.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，和药学上可接受的载体。

11.一种核酸分子，其编码根据权利要求2所述的分离的抗体或其结合片段。

12.根据权利要求11所述的核酸分子，其包括选自SEQ ID NO：8-14的核酸序列。

13.一种药物组合物，其包含根据权利要求11所述的核酸分子和药学上可接受的载体。

14.一种用于治疗肿瘤或癌症的方法，包括对需要这样治疗的受试者施用有效量的根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体的HC区域包含SEQ IDNO：1。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体的HC区域包含SEQ IDNO：3。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体的LC区域包含SEQ IDNO：2。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体的LC区域包含SEQ IDNO：4。

19.根据权利要求14所述的方法，其中受试者是人。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述肿瘤或癌症是乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、食道癌、肺癌、肝癌和结肠癌。

21.一种测定哺乳动物中HER2和/或IGF-IR存在的方法，包括：

获得来自哺乳动物的测试样品；

使测试样品与根据权利要求1所述的双特异性抗体接触；和

测定所述双特异性抗体是否已结合，其中双特异性抗体的结合表明HER2和/或IGF-IR在哺乳动物中存在。