CN107001476A - 用于增强的免疫应答和癌症治疗的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗体组合物，包括，例如，结合肿瘤坏死因子受体超家族成员(即，18)的抗体、工程化抗体和抗体片段。所提供的组合物可以用于增强CD4+和CD8+T细胞应答，以及用于治疗、改善和预防可以通过增强的免疫应答而对抗的疾病(例如，癌症)。本发明中还提供，编码所述分子的多核苷酸和载体以及带有所述多核苷酸或载体的宿主细胞；以及包含所述分子的药物组合物及其使用方法。

Description

用于增强的免疫应答和癌症治疗的组合物和方法
相关申请
本申请要求2014年10月8日提交的美国临时申请No.62/061,644、2015年7月29日提交的美国临时申请No.62/198,673和2015年9月18日提交的美国临时申请No.62/220,764的优先权和权益，在此将每篇的全部内容按引用并入。
发明领域
本发明涉及结合肿瘤坏死因子受体超家族成员18/糖皮质激素诱导的TNFR-相关蛋白(“GITR”)的抗体、抗体片段和抗原结合分子，并且更特别地，刺激通过该受体的信号传输和/或调节免疫应答的激动剂。
发明背景
糖皮质激素诱导的TNFR-相关蛋白(“GITR”)是肿瘤坏死因子超家族(TNFRSF)的成员，其包括超过20种的I型跨膜蛋白、几个剪接变体和几个病毒蛋白，所有都具有富含半胱氨酸的结构域作为共同的结构特征。GITR的胞外结构域(ECD)由3个富含半胱氨酸的结构域(CRD)组成，接着是跨膜结构域(TM)和胞内结构域(ICD)。
在小鼠和人CD4+CD25+调节性T细胞上组成型地检测到GITR表达，其在激活时被进一步提高。相反，效应CD4+CD25- T细胞和CD8+CD25- T细胞表达低至不可检测水平的GITR，在T细胞受体激活后快速上调。在激活的NK细胞、树突细胞和巨噬细胞上也已经检测到GITR的表达。已经表明GITR下游的信号传导通路涉及MAPK和标准NFκB通路。多种TRAF家族成员已经被提示是GITR下游的信号传导中间分子(Nocentini等(2005)Eur.J.Immunol.，35:1016-1022)。
据认为，取决于细胞类型和微环境，通过GITR的细胞激活可以起到几个作用，包括，但不限于，共同刺激以提高增殖和效应子功能、抑制调节性T细胞的遏制作用、和提供保护作用以对抗激活诱导的细胞死亡(Shevach和Stephens(2006)Nat.Rev.Immunol.,6:613-618)。Ko等((2005)J.Exp.Med.，202:885-891)首次证明了抗小鼠GITR的激动剂单克隆抗体在小鼠同基因肿瘤模型中有效地诱导了肿瘤特异性免疫并根除了已建立的肿瘤。另外地和/或备选地，在一些临床前模型中已经证实，具有功能性Fc效应子活性的抗-mGITR可以在选择的肿瘤环境中耗竭调节T细胞，以及增强T效应细胞增殖和细胞因子分泌。这些发明表明，mGITR的激动剂抗体可以破坏免疫耐受平衡，其转而允许T细胞对抗肿瘤和持续的病毒感染。然而，迄今为止的研究很大程度上聚焦于在啮齿动物系统中使用替代物抗体。由于小鼠和人GITR在结构上的差异，小鼠中使用替代物研究获得的发现是否可以翻译成人GITR功能的改变是未知的。
发明概述
我们已经鉴定特异性结合人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体超家族成员18(“GITR”)的抗体，其中所述抗体在体外交联时具有体外hGITR激动剂活性，并且其中所述抗体赋予体内hGITR活性并在肿瘤部位诱导升高的Teff:Treg比例，导致肿瘤进展的抑制。因此，本发明提供了特异性结合人GITR并通过靶向表达人GITR的细胞促进胞内信号传输和/或调节免疫应答的激动剂抗体、抗体片段和抗原结合分子。在一个方面中，本发明提供了特异性结合人GITR的分离抗体、抗体片段和抗原结合分子，其中所述抗体、抗体片段或抗原结合分子结合表位，所述表位包含富含半胱氨酸的结构域1(“CRD1”，SEQ ID NO:4：CGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDC)和富含半胱氨酸的结构域2(“CRD2”，SEQ IDNO:5：MCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQC)，并且其中所述抗体、抗体片段或抗原结合分子是GITR的激动剂，并且其中所述抗体、抗体片段或抗原结合分子任选具有完整或提高的FcR效应子功能。
在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子与人GITR的SEQ ID NO:88中包含的表位结合。在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子与结合人GITR的SEQ ID NO:88中的表位的抗体或抗体片段竞争。在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子结合人GITR的SEQ ID NO:88中的至少一个氨基酸残基，例如，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子结合与人GITR的SEQ ID NO:88重叠的表位。
在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子结合人GITR的CRD1(残基34-72，SEQ ID NO:4)和残基78中包含的表位。在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子与结合人GITR的CRD1(残基34-72，SEQ ID NO:4)和残基78中的表位的抗体或抗体片段竞争。在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子结合人GITR的CRD1(残基34-72，SEQ ID NO:4)和残基78内的至少一个氨基酸残基，例如，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子结合与人GITR的CRD1(残基34-72，SEQ ID NO:4)和残基78重叠的表位。
在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子结合SEQ ID NO:1并包含：(a)包含重链可变区的人重链，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22，和ii)重链CDR2包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27任一个的序列，和iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:109；和(b)轻链可变区，其中i)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31，和ii)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和iii)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子结合SEQ ID NO:88并包含：(a)包含重链可变区的人重链，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22，和ii)重链CDR2包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27任一个的序列，和iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:109；和(b)轻链可变区，其中i)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31，和ii)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和iii)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
关于所述抗体、抗体片段或抗原结合分子的进一步实施方案，在一些实施方案中，所述重链可变区与SEQ ID NO:16的可变区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，而轻链可变区与SEQ ID NO:17具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在特定实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子包括包含SEQ ID NO:16的重链和包含SEQ ID NO:17的轻链。在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子与包括包含SEQ ID NO:16的重链和包含SEQ ID NO:17的轻链的抗体竞争。
在一些实施方案中，重链FR4是人种系FR4。在特定实施方案中，重链FR4是SEQ IDNO:42。
在一些实施方案中，轻链FR4是人种系FR4。在特定实施方案中，轻链FR4是SEQ IDNO:50。
在一些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:84；ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:80；iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:109；iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:85；v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:82，和vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:83。
在一些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:23；iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:24；iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:31；v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:25；iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:26；iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:27；iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:25；iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:109；iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
在进一步的方面中，本发明提供特异性结合GITR的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：i)重链的CDR1包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:84的氨基酸序列；ii)重链的CDR2包含选自SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:80的氨基酸序列；iii)重链的CDR3包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:109；iv)轻链的CDR1包含选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:85和SEQ ID NO:86的氨基酸序列；v)轻链的CDR2包含选自SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:82的氨基酸序列；和轻链的CDR3包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:83。
在抗体、抗体片段或抗原结合分子的其他实施方案中，重链可变区与选自SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:105的序列的可变区具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，且轻链可变区与选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:7的序列的可变区具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在特定实施方案中，分离的抗体、抗体片段或抗原结合分子包括包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:105的序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的轻链可变结构域。在一些实施方案中，分离的抗体、抗体片段或抗原结合分子包含SEQ ID NO:6的重链可变结构域和SEQ ID NO:7的轻链可变结构域。在一些实施方案中，分离的抗体或抗体片段包括包含SEQ ID NO:8的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域。在其他实施方案中，分离的抗体或抗体片段包括包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域。在其他实施方案中，分离的抗体或抗体片段包括包含SEQ ID NO:12的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域。在其他实施方案中，分离的抗体或抗体片段包括包含SEQ ID NO:14的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域。
关于抗体、抗体片段或抗原结合分子的进一步实施方案，在一些实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:99的可变区具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，且轻链可变区与SEQ ID NO:7的可变区具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，分离的抗体或抗体片段包括包含SEQ ID NO:99的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域。
关于抗体、抗体片段或抗原结合分子的进一步实施方案，在一些实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:105的可变区具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，而轻链可变区与SEQ ID NO:7的可变区具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，分离的抗体或抗体片段包括包含SEQ ID NO:105的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述结合GITR的抗体、抗体片段或抗原结合分子是人源化的。在某些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含人恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体片段是Fab’片段。在一些实施方案中，抗体片段是单链抗体(scFv)。在一些实施方案中，所述抗体片段是单域抗体或纳米抗体(nanobody)。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段与第二抗体或抗体片段交联。在一些实施方案中，所述抗体是糖基化的。
在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子是IgG。在某些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子包含IgG同种型抗体Fc区。在特定实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子包含IgG1或IgG2同种型抗体Fc区。在某些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子是IgG1或IgG2抗体。在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子含有至少一个调节(即，提高或降低)抗体或抗体片段与Fc受体的结合的突变。在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子含有至少一个调节(即，提高或降低)抗体、抗体片段或抗原结合分子激活Fc受体的突变。在特定实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子含有至少一个提高抗体或抗体片段与Fc受体结合的突变。在某些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子含有至少一个提高抗体、抗体片段或抗原结合分子激活Fc受体的突变。
在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子与人和非人灵长类GITR交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子不与啮齿动物GITR(例如，大鼠GITR或小鼠GITR)交叉反应。
在相关方面中，本发明进一步提供了编码本文中所述的本发明的抗体、抗体片段或抗原结合分子的多核苷酸。在一些实施方案中，编码轻链可变区的多核苷酸与选自SEQID NO:52、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:102的核酸序列具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码重链可变区的多核苷酸与选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:101和SEQ ID NO:107的核酸序列具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链可变区的多核苷酸具有选自SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:102的核酸序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的多核苷酸具有选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:107的核酸序列。
在相关方面中，本发明进一步提供了包含本发明的抗体、抗体片段或抗原结合分子和药物学上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了用于向个体施用的包含本发明的抗体、抗体片段或抗原结合分子的药物组合物。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含靶抗原，例如，癌症相关抗原或肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，靶抗原是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生物抗原。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含CTLA4的拮抗剂。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含LAG3的拮抗剂。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含TIM3的拮抗剂。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含PD-1/PD-L1(例如，B7-H1或其类似物，PD-1抗体)相互作用的抑制剂。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含PD-1的拮抗剂。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含PD-L1的拮抗剂。
在再一方面中，本发明还提供了包含如本文中所述的本发明的抗体或抗体片段的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于与抗体共施用的第二药剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是靶抗原，例如，癌症相关的抗原或肿瘤相关的抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生物抗原。
在一些实施方案中，所述第二药剂是CTLA4的拮抗剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是TIM3的拮抗剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是LAG3的拮抗剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是PD-1/PD-L1(例如，B7-H1或其类似物，PD-1抗体)相互作用的抑制剂。在某些实施方案中，所述第二药剂是PD-1的拮抗剂。在某些实施方案中，所述第二药剂是PD-L1的拮抗剂。
任选，以混合物形式提供所述抗体或抗体片段和第二药剂。任选，在分开制剂中提供所述抗抗体或抗体片段和第二药剂。
在另一个方面中，本发明提供了在有需要的个体中增强T细胞应答的方法，包括将治疗有效量的如本文中所述的本发明的抗-GITR激动剂抗体或抗体片段施用于个体。在再一方面中，本发明提供了用于个体中增强T细胞应答的本发明的抗-GITR激动剂抗体或抗体片段。在进一步的方面中，本发明提供了用于增强个体中的T细胞应答的包含本发明的抗体或抗体片段的组合物。
在进一步的方面中，本发明提供了在有需要的个体中治疗表达肿瘤相关抗原的癌症的肿瘤生长的方法，包括将治疗有效量的如本文中所述的本发明的抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子施用于个体。本发明进一步提供了用于个体中治疗癌症的肿瘤生长的本发明的抗-GITR激动剂抗体或抗体片段。本发明进一步提供了用于降低、抑制或防止个体中表达肿瘤相关抗原的癌症的肿瘤生长的、包含本发明的抗体或抗体片段的组合物。
关于方法和医药用途的实施方案，在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子与抗原共施用。在一些实施方案中，所述抗原是癌症相关抗原或肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体或抗体片段与来自患者的癌细胞(即，自体癌细胞)共施用。
在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子与CTLA4的拮抗剂共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子与LAG3的拮抗剂共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子与TIM3的拮抗剂共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子与PD-1/PD-L1(例如，B7-H1)相互作用的抑制剂共施用。在某些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子与PD-1的拮抗剂共施用。在某些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子与PD-L1的拮抗剂共施用。
在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子与化疗剂或细胞毒素共施用。
在一些实施方案中，T细胞应答是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)T细胞应答。在一些实施方案中，T细胞应答是CD4+辅助T细胞(Th)应答。
在一些实施方案中，患者患有表达肿瘤相关抗原的癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和乳癌。在一个实施方案中，癌症类型选自：胰腺癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽喉的癌症、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤和血液组织的癌症。
在一些实施方案中，患者患有感染性疾病，例如，病毒感染、细菌感染、真菌抗原或寄生物抗原。在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体与病毒抗原(例如，来自HCV、HSV或HIV)共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体与细菌抗原共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体与真菌抗原共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR激动剂抗体与寄生物抗原(例如，丝虫病)共施用。
再在其他实施方案中，提供了用于治疗中的分离抗体、抗体片段或抗原结合分子。在某些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，用于在有需要的个体中增强T细胞应答。在某些实施方案中，提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，用于有需要的个体中治疗肿瘤生长。
定义
“抗体”是指能够非共价地、可逆地和特异性地结合相应抗原的免疫球蛋白家族的多肽。示例性抗体结构单位包括四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)，通过二硫键连接。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链归类为κ或λ。重链归类为γ、μ、α、δ或ε，其转而分别限定免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。本发明的抗体可以是任何同种型/类(例如，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)，或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。每条链的N-端定义约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指轻链和重链的这些区域。除了V区，重链和轻链都含有恒定(C)区或结构域。分泌形式的免疫球蛋白C区由三个C结构域CH1、CH2、CH3，任选CH4(Cμ)和铰链区构成。膜结合形式的免疫球蛋白C区还具有膜结构域和胞内结构域。每条轻链在N-端具有VL，接着在其另一端是恒定结构域(C)。VL与VH对齐，CL与重链的第一个恒定结构域对齐。VH和VL配对在一起形成单个抗原结合位点。如本文中使用的“常规抗体”IgG免疫球蛋白是指具有天然构象的抗体。通常，常规抗体IgG具有四条链，两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接在一起。如本文中使用的，“抗体”还包括具有特定结合特异性(即，对于GITR)的抗体和常规抗体结构的变化形式。因此，对GITR具有特定结合特异性的全长抗体、嵌合抗体和人源化抗体都在这个概念的范围内。
抗体可以作为完整的免疫球蛋白存在，或可以作为通过各种肽酶消化产生的充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下方消化抗体，产生F(ab’)2，即Fab’的二聚体，其自身是通过二硫键连接的VH-CH1和轻链。F(ab’)2可以在温和条件下还原，以断开铰链区中的二硫键，由此将F(ab’)2二聚体转化成Fab’单体。Fab’单体实质上是具有部分铰链区的Fab。Paul，Fundamental Immunology，第3版(1993)。尽管根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但本领域技术人员将明了这些片段可以通过化学方法或使用重组DNA方法重头合成。如本文中使用的，“抗体片段”是指抗体的一个或多个部分，可以通过完整抗体的修饰来产生，或使用重组DNA方法重头合成，其保留对GITR的结合特异性和激动剂活性。抗体片段的实例包括Fv片段、单链抗体(ScFv)、Fab、Fab’、Fd(Vh和CH1结构域)、dAb(Vh和分离的CDR)；和这些片段的具有相同结合特异性的多聚体形式(例如，F(ab’)2)。还可以将抗体片段并入单域抗体、maxibodies、微抗体、二抗体(diabodies)、三抗体(tribodies)、四抗体(tetrabodies)、vNAR、双-scFv和其他抗体样化合物变化形式中，以获得本发明中提供的结合特异性和活性。
本发明中使用的“Fab”结构域包含重链可变结构域、恒定区CH1结构域、轻链可变结构域和轻链恒定区CL结构域。这些结构域的相互作用可以通过CH1和CL结构域之间的二硫键稳定。在一些实施方案中，Fab的重链结构域按顺序从N-末端至C-末端为VH-CH，Fab的轻链结构域按顺序从N-末端至C-末端为VL-CL。在一些实施方案中，Fab的重链结构域按顺序从N-末端至C-末端为CH-VH，Fab的轻链结构域按顺序为CL-VL。尽管Fab在历史上通过完整免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化而获得鉴定，但在本发明中，典型地可以通过任何方法重组地产生“Fab”。就抗原结合而言，每个Fab片段是单价的，即，其具有单个抗原结合位点。
免疫球蛋白重链的C-端部分，包含CH2和CH3结构域，是“Fc”结构域。如本文中使用的“Fc区”是指抗体的恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域。Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及在这些结构域的N-端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ之间的铰链。在本领域中，将理解Fc区的边界可以变化，然而，使用根据Kabat等(1991，NIH Publication 91-3242，National TechnicalInformation Service，Springfield，Va.)中的EU索引进行编号，通常人IgG重链Fc区被定义为包含残基C226或P230至其羧基-末端。“Fc区”可以指分离的该区域或存在于抗体或抗体片段中的该区域。“Fc区”包括Fc区的天然等位基因变体(例如，在CH2和CH3区域中)、以及调节效应子功能的修饰。Fc区还包括不导致生物功能改变的变体。例如，可以从免疫球蛋白的Fc区的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸，而基本上不丧失生物功能。例如，在某些实施方案中，C-末端赖氨酸可以被修饰而替代或去除。在特定实施方案中，改变或去除Fc区中的一个或多个C-末端残基。在某些实施方案中，缺失Fc中的一个或多个C-末端残基(例如，末端赖氨酸)。在某些其他实施方案中，Fc中的一个或多个C-末端残基被替换为其它氨基酸(例如，末端赖氨酸被置换)。可以根据本领域已知的一般规则来选择这样的变体，以对活性具有最小的影响(参见，例如，Bowie等，Science 247:306-1310，1990)。Fc结构域是细胞受体(例如，FcR)所识别的Ig的部分，并且补体激活蛋白C1q与其结合。在CH2外显子的5’部分中编码的下铰链区提供了抗体内用于结合FcR受体的灵活性。
“互补性决定结构域”或“互补决定区(“CDR”)可互换来指VL和VH的超变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合部位，包含针对该靶蛋白的特异性。在每个人VL或VH中各有三个CDR(CDR1-3，从N-末端按序编号)，占可变区的约15-20％。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并且因此直接负责结合特异性。VL或VH的剩余链，称为框架区，在氨基酸序列中呈现较少变化(Kuby，Immunology，第4版，第4章，W.H.Freeman&Co.，New York，2000)。
可以使用本领域各种公知的定义来确定CDR和框架区的位置，例如，Kabat，Chothia，国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(在万维网imgt.cines.fr/上)和AbM(参见，例如，Johnson等，Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196:901-917(1987)；Chothia等，Nature,342:877-883(1989)；Chothia等，J.Mol.Biol.，227:799-817(1992)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.，273:927-748(1997))。以下也描述了抗原结合位点的定义：Ruiz等，Nucleic Acids Res.,28:219–221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等，J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)；Martin等，MethodsEnzymol.，203:121-153(1991)；和Rees等，见Sternberg M.J.E.(编辑)，ProteinStructure Prediction(蛋白结构预测)，牛津大学出版社，Oxford，141-172(1996)。
根据Kabat，VH中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸残基编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，人VH中CDR由氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)组成，人VL中CDR由氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。
术语“结合特异性决定簇”或“BSD”可互换来表示，确定抗体结合特异性所必需的、互补性决定结构域中的最小连续或非连续氨基酸序列。最小结合特异性决定簇可以在一个或多个CDR序列内。在一些实施方案中，最小结合特异性决定簇位于抗体重链和轻链的CDR3序列的一部分或全长中(即，仅由其决定)。
如本文中使用的“抗体轻链”或“抗体重链”是指分别包含VL或VH的多肽。内源性VL由基因区段V(可变)和J(连接)编码，而内源性VH由V、D(多样性)和J编码。每个VL或VH各包括CDR以及框架区。在本申请中，抗体轻链和/或抗体重链有时可以统称为“抗体链”。如本领域技术人员将容易认识到的，这些术语涵盖含有不破坏VL或VH基础结构的突变的抗体链。
本文中使用的术语“价”是指多肽中的潜在靶结合位点的数量。每个靶结合位点特异性地结合一个靶分子或靶分子上的一个特定位点。多肽包含一个以上靶结合位点时，每个靶结合位点可以特异性地结合相同或不同的分子(例如，可以结合不同的分子，例如，不同的抗原，或同一分子上的不同表位)。例如，常规抗体具有两个结合位点，因此是二价的。抗体、抗原结合分子及其片段，可以是单价(即，结合一个靶分子)、二价或多价(即，结合一个以上靶分子)。
对于单克隆或多克隆抗体的制备，可以使用本领域已知的任何技术(参见，例如，Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,pp.77-96.Alan R.Liss,Inc.1985)。用于生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)可以经调整以适用于生产本发明抗体和多肽。此外，转基因小鼠，或其他生物体，如其他哺乳动物，可以用于表达灵长类化或人源化抗体。或者，噬菌体展示技术可以用于鉴定特异性结合选定抗原的抗体和异聚Fab片段(参见，例如，McCafferty等，上文；Marks等，Biotechnology,10:779-783，(1992))。
用于灵长类化或人源化非人抗体的方法是本领域公知的。通常，灵长类化或人源化抗体在其中引入来自非灵长类或非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非灵长类或非人氨基酸残基常常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。人源化基本上可以按照Winter和同事的方法来进行(参见，例如，Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))，其中用啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中来自非人物种的相应序列已经替代了实质性少于完整的人可变结构域。在实践中，灵长类化或人源化抗体通常是灵长类或人抗体，其中一些互补性决定区(“CDR”)残基和可能地一些框架(“FR”)残基被来自来源物种(例如，啮齿动物抗体)中的类似位点的残基替代，以赋予结合特异性。
“嵌合抗体”是这样的抗体：其中(a)恒定区，或其部分，被改变、替换、或交换，从而使抗原结合位点(可变区)连接至类别、效应子功能和/或物种不同或改变的恒定区、或连接至可以赋予嵌合抗体新特性的完全不同分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子和药物；或(b)可变区，或其部分，被改变、替换或交换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。
本发明的抗体或抗原结合分子还可以包括在化学上与其他蛋白缀合、或作为与其他蛋白的融合蛋白表达的一个或多个免疫球蛋白链。其还包括双特异性抗体。双特异或双功能抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。本发明的其他抗原结合片段或抗体片段包括二价scFv(二抗体)、双特异性scFv抗体(其中抗体分子识别两个不同表位)、单结合结构域(dAb)和微抗体。
可以通过完整抗体的酶或化学修饰来产生本文中所述的各种抗体或抗原结合片段，或使用重组DNA方法重头合成(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库来鉴定(参见，例如，McCafferty等，Nature 348:552-554，1990)。例如，可以使用本领域中所述的方法来产生微抗体，例如，Vaughan和Sollazzo，Comb Chem High Throughput Screen.4:417-302001。可以通过各种方法，包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接，来产生双特异性抗体。参见，例如，Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。可以使用噬菌体展示文库或核糖体展示文库、基因改组文库来鉴定单链抗体。可以从合成的、半合成的、或天然的、具有免疫活性(immunocompetent)的来源，构建这样的文库。
术语“抗原结合分子”或“非抗体配体”是指使用非免疫球蛋白蛋白支架的抗体模拟物，包括但不限于，adnectins、avimers、单链多肽结合分子和抗体样结合肽模拟物。
术语“可变区”或“V-区”可互换地表示包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重链或轻链。内源性可变区由免疫球蛋白重链V-D-J基因或轻链V-J基因编码。V-区可以是天然的、重组或合成的。
如本文中使用的，术语“可变区段”或“V-区段”可互换表示包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的可变区的子序列。内源性V-区段由免疫球蛋白V-基因编码。V-区段可以是天然的、重组或合成的。
如本文中使用的，术语“J-区段”是指包含CDR3的C-末端部分和FR4的编码的可变区的子序列。内源性J-区段由免疫球蛋白J基因编码。J-区段可以是天然、重组或合成的。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性(例如，结合特异性、活性)同时在人体中具有较低免疫原性的抗体。例如，这可以通过保留非人CDR区并用人对应物替代剩余的抗体部分来实现。参见，例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44:65-92(1988)；Verhoeyen等，Science，239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。
术语“相应的人种系序列”是指这样的核酸序列，所述核酸序列编码的人可变区氨基酸序列或子序列，与人种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其他已知可变区氨基酸序列相比，与参照可变区氨基酸序列或子序列具有最高的确定氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以指，与所有其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参照可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以是仅仅框架区、仅仅互补决定区、框架和互补性决定区、可变区段(如上定义的)，或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文中描述的方法来确定序列同一性，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域已知的其他比对算法来比对两个序列。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参照可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。可以通过公众可利用的国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(在万维网imgt.cines.fr/上)和V-数据库(在万维网vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk上)，确定相应的人种系序列。
短语“特异性结合”或“选择性结合”，用于描述抗原(如，蛋白)与抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂之间的相互作用时，是指决定异质蛋白群体和其他生物制剂中抗原存在的结合反应，所述其他生物制剂例如为生物样品，例如，血液、血清、血浆或组织样品。因此，在一定的指定免疫试验条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂，与特定抗原的结合至少两倍于背景，并且基本上不以显著量结合样品中存在的其他抗原。在一个实施方案中，在指定的免疫试验条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂，与特定抗原的结合至少十(10)倍于背景，并且基本上不以显著量结合样品中存在的其他抗原。在如此条件下与抗体或结合剂的特异性结合可能需要抗体或结合剂已经针对其对特定蛋白(例如，人GITR)的特异性进行过选择。如本文中使用的，特异性结合包括选择性结合人GITR的抗体片段和结合分子，并且不包括与例如鼠GITR分子或其他TNF受体超家族成员交叉反应的抗体。在一些实施方案中，选择与非人灵长类GITR(例如，猕猴GITR)交叉反应的抗体或抗体片段。
各种免疫试验形式可以用于选择与特定蛋白具有特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫试验常规用于选择与蛋白具有特异性免疫反应的抗体(对于可以用于确定特定的免疫反应性的免疫试验形式和条件的描述，参见，例如，Harlow&Lane,UsingAntibodies,A Laboratory Manual(1998))。通常，特异性或选择性结合反应将产生超过背景信号至少两倍的信号，并且更常见地，超过背景至少10至100倍。
术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1，M-1)。可以使用本领域任何已知方法来测量平衡解离常数。本发明的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M的平衡解离常数，例如，小于约10-9M或10-10M，在一些实施方案中，小于约10-11M、10-12M或10-13M。在一些实施方案中，分离的抗体或抗体片段以约1nM或更小的平衡解离常数(KD)结合人GITR。在一些实施方案中，抗体或抗体片段以小于1nM的KD结合人GITR。在一些实施方案中，抗体或抗体片段以约0.5nM至约1.0nM范围的KD结合人GITR。
如本文中使用的，术语“抗原结合区”是指，本发明的GITR-结合分子中负责分子和GITR之间的特异性结合的结构域。抗原结合区包括至少一个抗体重链可变区和至少一个抗体轻链可变区。在本发明的每个GITR-结合分子中存在至少一个这样的抗原结合区，并且每个抗原结合区可以彼此相同或不同。在一些实施方案中，本发明GITR-结合分子的抗原结合区中的至少一个作为GITR的激动剂起作用。
术语“抗体激动剂”或“激动剂”可互换表示，能够激活受体以诱导全部或部分受体介导的应答的抗体。例如，GITR的激动剂结合GITR并且诱导GITR介导的胞内信号传输(例如，提高的NF-κB表达激活)。抗体激动剂，与天然配体GITR-L相似，刺激通过GITR的信号传输。通过IκB的降解，GITR-L与GITR的结合诱导NFκB激活。在一些实施方案中，GITR抗体激动剂可以通过其结合GITR并诱导T细胞(例如，CD8+CTL或CD4+Th细胞)增殖、存活、细胞溶解活性和/或细胞因子产生(IFNγ、IL-10、IL-13、TNFα)的能力，或按照本文中另外描述的，来鉴定。
术语“GITR”或“糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体”或“肿瘤坏死因子受体超家族成员18”或“TNFRSF18”)可互换表示，作为TNF-受体超家族成员的I型跨膜蛋白。GITR以高水平在CD4+CD25+上以及在激活的效应CD4+和CD8+T细胞上表达。GITR的核酸和氨基酸序列是已知的，并且已经公开于GenBank Accession Nos.NM_004195.2→NP_004186.1(同种型1前体)，SEQ ID NO:1：
NM_148901.1→NP_683699.1(同种型2前体)，SEQ ID NO:2:
和NM_148902.1→NP_683700.1(同种型3前体)，SEQ ID NO:3:
还可以参见，GenBank Accession No.NM_005092→NP_005083.2。结构上，GITR氨基酸序列是TNF-受体超家族成员的I型跨膜蛋白，其具有信号肽、包含三个富半胱氨酸结构域(CRD)的胞外结构域(ECD)，并且在其全长上与GenBank登录号NP_004186.1(SEQ ID NO:1)、NP_683699.1(SEQ ID NO:2)、NP_683700.1(SEQ ID NO:3)或NP_005083.2的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在结构上，GITR核酸序列在其全长上与GenBank登录号NM_004195.2,NM_148901.1、NM_148902.1、NM_005092或SEQ ID NOs:1-4的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在功能上，啮齿动物GITR的激动可以至少暂时地抑制CD25+调节T细胞(Treg)的遏制剂活性。GITR的激动还可以增强免疫活性，例如，激活的效应CD4+和CD8+T细胞的增殖、存活、细胞因子产生和细胞溶解活性。参见，例如，Nocentini等，Eur J Immunol(2007)37:1165-1169；Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-757；Shevach和Stephens，Nature Reviews Immunology(2006)6:613-618。
本发明多肽的“活性”是指，多肽在其天然细胞或组织中的结构的、调控的或生物化学的功能。多肽活性的实例包括直接活性和间接活性。GITR激动的示例性活性包括胞内信号传输，其导致提高的NF-κB激活，增加的激活的效应CD4+和CD8+T细胞的增殖、存活、细胞因子产生(例如，IFNγ、IL-10、IL-13、TNFα)和细胞溶解活性。在治疗上，GITR的激活可以增强体内抗肿瘤和抗病毒T-细胞应答。
应用于核酸或蛋白时，术语“分离的”表示，核酸或蛋白基本上不含天然状态下与其结合的其他细胞组分。优选是均质状态的。其可以是干的或水溶液。通常使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱，来测定纯度和均质性。作为制备物中的主要物质存在的蛋白是基本上纯化的。特别地，分离的基因与位于该基因两侧并且编码目标基因以外的其他蛋白的开放阅读框分开。术语“纯化的”表示，核酸或蛋白在电泳凝胶上基本上只产生一个条带。特别地，其表示核酸或蛋白为至少85％纯，更优选至少95％纯和最优选至少99％纯。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单-或双-链形式的聚合物。除非另外指出，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其与参照核酸具有相似的结合特性并且以类似于天然核苷酸的方式代谢。除非另外指出，否则一个具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体地，可以通过产生其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，来实现简并密码子置换(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换表示氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然的氨基酸聚合物和非天然的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指，天然的和合成的氨基酸，以及以天然氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸、以及之后修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基础化学结构的化合物，即，结合氢、羧基基团、氨基基团和R基团的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指，结构不同于氨基酸的一般化学结构但以天然氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。
“保守修饰的变体”对氨基酸和核酸序列都适用。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指，编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上相同的序列。由于遗传密码子的简并性，任何给定的蛋白都可以由多个功能上相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个被密码子规定为丙氨酸的位置，可以将该密码子改变成所述任何相应密码子，而不改变编码的多肽。这样的核酸变体是“沉默变体”，其是保守修饰变体的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述核酸的每个可能的沉默变体。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是编码甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是编码色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，在描述的每个序列中都隐含了编码多肽的核酸的每个沉默变体。
关于氨基酸序列，本领域技术人员将意识到，“保守修饰变体”是对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的置换、删除或添加，从而在编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小比例的氨基酸，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域公知的。这样的保守性修饰变体是本发明的多态变体、种间同源物和等位基因以外的变体，并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
以下八组各自含有互为保守性置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。
通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中为了两个序列的最佳比对，与不包含添加或删除的参照序列(例如，本发明的多肽)相比，比较窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加或删除(即，缺口)。该百分比通过如下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量来产生匹配位置的数量，以匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100来产生序列同一性百分比。
与两个或更多个核酸或多肽序列相关的术语“相同”或百分比“同一性”是指，两个或更多个序列或子序列是相同序列。当使用以下序列比较算法之一或通过人工比对和目视观察测量、在比较窗口或指定区域中为最大对应性而进行比较和比对时，如果两个序列具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定的区域中，或在没有指定时，在参照序列的整个序列上，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。本发明提供，分别与本文中示例的多肽或多核苷酸(例如，SEQ ID NO:6-10、12、14、59和61任一个中示例的可变区；SEQ ID NO:16-17任一个中示例的可变区段；SEQ ID NO:22-34任一个中示例的CDR；SEQ ID NO:35-50任一个中示例的FR；和SEQ ID NO:51-58和60任一个中示例的核酸序列)基本上相同的多肽或多核苷酸。任选，同一性存在于至少约15、25或50个核苷酸长的区域上，或更优选存在于100至500或1000个或更多个核苷酸长的区域上，或全长参照序列上。关于氨基酸序列，同一性或实质上的同一性可以存在于至少5、10、15或20个氨基酸长，任选至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸长，任选至少约150、200或250个氨基酸长的区域上，或全长参照序列上。对于较短的氨基酸序列，例如，20或更少氨基酸的氨基酸序列，当一个或两个氨基酸残基根据本文中定义的保守性置换被保守性置换时，存在实质上的同一性。
对于序列比较，通常一个序列作为参照序列，测试序列与其进行比较。使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机中，如果需要，随后指定子序列的坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定替换的参数。基于程序参数，序列比较算法随后计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。
如本文中使用的，“比较窗口”包括，具有选自20至600，通常约50至约200，更常见约100至约150的任何连续位置数的区段，在所述窗口中序列可以与具有相同连续位置数的参照序列在两个序列最佳比对后进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。例如，可以通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI)，或通过人工比对和目视观察(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995年增补)，进行用于比较的序列的最佳比对。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的两个算法实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1977)，Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)，J.Mol.Biol.215:403-410。用于进行BLAST分析的软件可以通过National Centerfor Biotechnology Information公开获得。该算法涉及：首先通过鉴定查询序列中字长W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，其中所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一定的正值阈值分数T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等，上引文)。这些初始的相邻字命中物作为种子用于启动搜索，以发现含有它们的较长HSP。字命中物沿着每个序列在两个方向延伸，只要累积比对得分可以增加即可。对于核苷酸序列，使用参数M(给予一对匹配残基的奖励分；总是>0)和N(给予错配残基的罚分；总是<0)，计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当：累积比对得分从其最大获得值下降数量X；由于累积一个或多个负评分残基比对，累积得分变为零或低于零；或达到任一个序列的末端时，停止字命中物在各方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)以11的字长(W)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4和双链比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP参数使用3的字长和10的期望值(E)以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)，50的比对(B)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4和双链比较，作为缺省值。
BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。一种由BLAST算法提供的相似性量度是最小和概率(P(N))，其指示两个核苷酸或氨基酸序列之间碰巧发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参照核酸比较中的最小和概率为小于约0.2，更优选小于约0.01和最优选小于约0.001，则认为核酸与参照序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的一个指示是，由第一个核酸编码的多肽与针对第二个核酸编码的多肽产生的抗体具有免疫上的交叉反应，如下文所述。因此，例如，当多肽与第二多肽的差异仅在于保守性置换时，两个肽通常基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子或其互补物在严格条件下彼此杂交，如下文所述。两个核苷酸序列基本上相同的再一个指示是，可以使用相同引物来扩增该序列。
在描述抗原结合区如何在本发明的GITR-结合分子中连接的上下文中使用的术语“连接”，涵盖用于物理连接这些区域的所有可能方式。多个抗原结合区常常可以通过化学键连接，如共价键(例如，肽键或二硫键)或非共价键，其可以是直接的键(即，在两个抗原结合区之间没有衔接物)或间接的键(即，在两个或更多个抗原结合区之间借助至少一个衔接物分子的连接)。
术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换表示哺乳动物，例如，人或非人灵长类哺乳动物。哺乳动物也可以是实验室哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠。在一些实施方案中，哺乳动物可以是农业哺乳动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼)或家养哺乳动物(例如，犬、猫)。
如本文中使用的，在一个实施方案中，对于任何疾病或病症，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指减轻疾病或病症(即，减缓或停止或减少疾病的发展或其至少一个临床症状)。在另一个实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指缓解或减轻至少一个身体参数，包括患者不可辨别的那些参数。在再另一个实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)，或两者上调节疾病或病症。在再另一个实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指防止或延迟疾病或病症的发作或发展或进展。
术语“治疗上可接受的量”或“治疗有效剂量”可互换表示足以实现所需结果(即，减小肿瘤的大小，抑制肿瘤生长，防止转移，抑制或防止病毒、细菌、真菌或寄生物感染)的量。在一些实施方案中，治疗上可接受的量不诱导或导致不想要的副作用。可以通过首先施用低剂量，并且随后逐渐递增剂量直至实现所需效果，来确定治疗上可接受的量。本发明的GITR激动抗体的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别防止疾病症状的发作或导致疾病症状严重性的降低，所述疾病症状包括与癌症或感染性疾病相关的症状。
术语“共施用”是指两种活性剂同时存在于个体的血液中。共施用的活性剂可以同时或相继递送。
如本文中使用的，短语“基本上由……组成”是指，包括在方法或组合物中的上位或下位概念的活性药剂、以及用于方法或组合物的预期目的的任何无活性载体或赋形剂。在一些实施方案中，短语“基本上由……组成”明确排除包含除本发明激动剂抗-GITR抗体以外的一种或多种其他的活性剂。在一些实施方案中，短语“基本上由……组成”明确排除包含除本发明激动剂抗-GITR抗体和第二共施用药剂之外的一种或多种其他活性剂。
术语“癌相关抗原”或“肿瘤相关抗原”或“肿瘤特异性标志物”或“肿瘤标志物”可互换表示，与正常细胞相比，优先在癌细胞表面上表达的分子(典型地蛋白质、碳水化合物或脂质)，其可用于将药剂优先靶向癌细胞。一些方案中，癌相关抗原是与正常细胞相比在癌细胞中超表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍超表达、2倍超表达、3倍超表达或更高。一些方案中，癌相关抗原是在癌细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。一些方案中，癌相关抗原仅在癌细胞的细胞表面上表达并且不在正常细胞的表面上合成或表达。示例的细胞表面肿瘤标志物包括，乳癌的蛋白c-erbB2和人表皮生长因子受体(HER)，前列腺癌的PSMA，和各种癌症(包括乳癌、卵巢癌和结直肠癌)中的碳水化合物粘蛋白。
如本文中使用的，关于抗原结合部分(例如，Fab)，当一个部分存在超过一个时，为了方便区分，使用术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”。除非另外指出，否则使用这些术语不旨在赋予抗体特定的顺序或方向。
术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非文中明确另外指出。
激动剂抗-GITR抗体
本发明提供了结合GITR并刺激通过GITR的信号传输和/或诱导增强的体内免疫应答的抗体、抗体片段和抗原结合分子。该抗体、抗体片段和抗原结合分子可以用于增强对抗靶抗原的CD4+ T辅助细胞(Th)和/或CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。它们还可以用于治疗其增殖可以通过有效的免疫应答逆转或抑制的疾病状况(包括癌症和感染性疾病)。
本发明的抗体、抗体片段和抗原结合分子显示出用于人患者中的合适特性，例如，它们具有与人用免疫原性问题相关的低风险(除了结合特异性决定区(BSD)，特别是至少CDR3外，它们由人种系核酸序列编码)；对GITR具有高亲和性(例如，KD至少小于5nM)；与TNFR超家族的其他成员没有交叉反应；与人和非人灵长类GITR交叉反应；以及在低剂量下(例如，在体外试验中，在低于5nM的浓度)激活GITR信号传输。在整个说明书中还阐明了其他活性和特征。
因此，本发明提供了作为GITR激动剂的抗体、抗体片段和抗原结合分子。提供的抗体-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子含有源自来源或参照单克隆抗体(例如，以下表1和2中所述的抗体)的重链和轻链的CDR3中的最小结合序列决定簇(BSD)。重链和轻链可变区(VDR和FR)的剩余序列，例如，V-区段和J-区段，来自相应的人种系和亲和力成熟的氨基酸序列。V-区段可以选自人V-区段文库。可以通过亲和力成熟或本领域已知的其他方法，进行进一步的序列精化，以优化本发明的抗体、抗体片段或抗原结合分子的结合活性或活性。
在另一个实施方案中，抗-GITR抗体或抗体片段的重链和轻链含有来自相应的人种系序列的人V-区段(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)，例如，选自人V-区段文库，和来自来源单克隆抗体(例如，表1和表2中所述的抗体)的CDR3-FR4序列区段。CDR3-FR4序列区段可以通过用相应的人种系序列替代序列区段和/或通过亲和力成熟来进一步精化。例如，围绕BSD的FR4和/或CDR3序列可以用相应的人种系序列替代，而保留来自来源单克隆抗体的CDR3的BSD。
在一些实施方案中，用于重链V-区段的相应人种系序列是VH33-13/30：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(SEQ ID NO：89).
在一个实施方案中，SEQ ID NO：89中的最后一个氨基酸，赖氨酸(“K”)，用精氨酸(“R”)替代。在一些实施方案中，用于重链J-区段的相应人种系序列是JH4。在一些实施方案中，重链J-区段包含人种系JH4部分序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：90)。来自人种系JH4的全长J-区段是YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：91)。对于免疫球蛋白可变区基因，根据标准命名来提及可变区基因。目前的免疫球蛋白基因信息可以通过万维网获得，例如，ImMunoGeneTics(IMGT)、V-数据库和PubMed数据库。还可以参见，Lefranc，Exp ClinImmunogenet.2001；18(2)：100-16；Lefranc，Exp Clin Immunogenet.2001；18(3)：161-74；Exp Clin Immunogenet.2001；18(4)：242-54；和Giudicelli等，Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(数据库专辑)：D256-61
在一些实施方案中，用于轻链V-区段的相应人种系序列为VKIII L16/A27：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP(SEQ ID NO：92).
在一些实施方案中，用于轻链J-区段的相应人种系序列为JK2。在一些实施方案中，轻链J-区段包含人种系Jk2部分序列FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：93)。来自人种系Jk2的全长J区段为YTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：94)。
在一些实施方案中，重链V-区段与氨基酸序列
(E/Q)VQLVESGGGLVQ(P/S)GGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEW(L/V)GVIWGGGGTYY(A/T)(A/S)S(L/V)M(A/G)RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA(K/R)(H/N)AYGHDGGFAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16).
具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，轻链V-区段与氨基酸序列
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRAS(E/Q)SVSSN(L/V)AWYQQ(K/R)PGQAPRLLIYGASNRATGIP(D/A)RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKLEIK(SEQID NO：17).
具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，i)重链CDR3包含氨基酸序列HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：109)；和ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列GQSYSYPFT(SEQID NO:34)或SYSYPF(SEQ ID NO:83)。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含重链可变区，其包括：包含氨基酸序列SYGVD(SEQ ID NO:22)或GFSLSSY(SEQ ID NO:84)的CDR1；包含氨基酸序列VIWGGGGTYY(A/T)(A/S)S(L/V)M(A/G)(SEQ ID NO:28)或WGGGG(SEQ ID NO:80)的CDR2；和包含氨基酸序列HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO:29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO:109)的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含轻链可变区，其包括：包含氨基酸序列RAS(E/Q)SVSSN(L/V)A(SEQ ID NO:32)或S(E/Q)SVSSN(SEQ ID NO:87)的CDR1；包含氨基酸序列GASNRAT(SEQ ID NO:33)或GAS(SEQ ID NO:82)的CDR2；和包含氨基酸序列GQSYSYPFT(SEQ ID NO:34)或SYSYPF(SEQ ID NO:83)的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含重链可变区，其包括：包含氨基酸序列SYGVD(SEQ ID NO:22)或GFSLSSY(SEQ ID NO:84)的CDR1；包含氨基酸序列VIWGGGGTYY(A/T)(A/S)S(L/V)M(A/G)(SEQ ID NO:28)或WGGGG(SEQ ID NO:80)的CDR2；和包含氨基酸序列HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO:29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO:109)的CDR3。该抗体或抗体片段可以进一步包含轻链可变区，其包括：包含氨基酸序列RAS(E/Q)SVSSN(L/V)A(SEQ ID NO:32)或S(E/Q)SVSSN(SEQ ID NO:87)的CDR1；包含氨基酸序列GASNRAT(SEQ ID NO:33)或GAS(SEQ ID NO:82)的CDR2；和包含氨基酸序列GQSYSYPFT(SEQID NO:34)或SYSYPF(SEQ ID NO:83)的CDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含重链可变区，其包括：包含氨基酸序列SYGVD(SEQ ID NO:22)或GFSLRSY(SEQ ID NO:79)的CDR1；包含氨基酸序列VIWGGGGTNYNSALMA(SEQ ID NO:62)或WGGGG(SEQ ID NO:80)的CDR2；和包含氨基酸序列HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO:29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO:109)的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是人源化的。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含轻链可变区，其包括：包含氨基酸序列KASENVDTFVS(SEQ ID NO:63)或SENVDTF(SEQ ID NO:81)的CDR1；包含氨基酸序列GASNRYT(SEQ ID NO:64)或GAS(SEQ ID NO:82)的CDR2；和包含氨基酸序列GQSYSYPFT(SEQID NO:34)或SYSYPF(SEQ ID NO:83)的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是人源化的。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含重链可变区，其包括：包含氨基酸序列SYGVD(SEQ ID NO:22)或GFSLRSY(SEQ ID NO:79)的CDR1；包含氨基酸序列VIWGGGGTNYNSALMA(SEQ ID NO:62)或WGGGG(SEQ ID NO:80)的CDR2；和包含氨基酸序列HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO:29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO:109)的CDR3。这样的抗体或抗体片段可以进一步包含轻链可变区，其包括：包含氨基酸序列KASENVDTFVS(SEQ ID NO:63)或SENVDTF(SEQ ID NO:81)的CDR1；包含氨基酸序列GASNRYT(SEQ ID NO:64)或GAS(SEQID NO:82)的CDR2；和包含氨基酸序列GQSYSYPFT(SEQ ID NO:34)或SYSYPF(SEQ ID NO:83)的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是人源化的。
在一些实施方案中，重链可变区包括包含氨基酸序列(E/Q)VQLVESGGGLVQ(P/S)GGSLRLSCAASGFSLS(SEQ ID NO:37)的FR1；包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEW(L/V)G(SEQ IDNO:40)的FR2；包含氨基酸序列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA(K/R)(SEQ ID NO:41)的FR3；和包含氨基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:42)的FR4。在一些实施方案中，重链可变区包括：包含选自QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF SLS(SEQ ID NO:35)和QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLS(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的FR1；包含选自WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO:38)和WVRQAPGKGLEWLG(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列的FR2；包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的FR3；和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的FR4。这些鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个置换的氨基酸(例如，来自亲和力成熟)或一个或两个保守置换的氨基酸。
在一些实施方案中，轻链可变区包括：包含氨基酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC(SEQ ID NO：43)的FR1；包含氨基酸序列WYQQ(K/R)PGQAPRLL IY(SEQ ID NO：46)的FR2；包含氨基酸序列GIP(A/D)RFSGSGSGTDFTLTISR LEPEDFAVYYC(SEQ ID NO：49)的FR3；和包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的FR4。在一些实施方案中，轻链可变区包括：包含SEQID NO：43的氨基酸序列的FR1；包含选自WYQQRPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：44)和WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：45)的氨基酸序列的FR2；包含选自GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO：47)和GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO：48)的氨基酸序列的FR3；和包含氨基酸序列FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：50)的FR4。这些鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个置换的氨基酸(例如，来自亲和力成熟)或一个或两个保守置换的氨基酸。
本发明的抗-GITR抗体的可变区，在其全长上，通常将具有与相应的人种系可变区氨基酸序列至少约85％(例如，至少约85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的总体可变区(例如，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)氨基酸序列同一性。例如，抗GITR抗体的重链可以与人种系可变区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK-YFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO：89和91)(VH3 3-13/30+CDR3+JH4，连字符表示CDR3，其长度是可变的)具有至少约85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，SEQ ID NO：89中的最后一个氨基酸赖氨酸(K)，用精氨酸(R)置换。抗-GITR抗体的轻链可以与人种系可变区
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC-YTFGQGTKLEIK(SEQ ID NOS：98和94)
(VKIII L16/A27+CDR3+JK2；连字符表示CDR3，其长度是可变的)具有至少约85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，只添加、缺失或置换框架区内的氨基酸。在一些实施方案中，序列同一性比较排除CDR3。
表1.本发明的抗-GITR激动剂抗体的实例
可以通过本领域公知的编号系统，包括本文中所述的那些，来确定表1中所列抗体的CDR。表2列出了通过(1)使用Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(“Kabat”编号方案)，NIH出版号No.91-3242；和(2)Chothia，参见Al-Lazikani等，(1997)“Standard conformations for the canonical structures ofimmunoglobulins”，J.Mol.Biol.273:927-948中描述的编号系统限定的CDR。
表2：Kabat和Chothia CDR比较
在一些实施方案中，结合GITR(例如，SEQ ID NO:1，细胞加工的SEQ ID NO:1)的本发明的抗-GITR抗体或抗体片段选自以下的任一个：i)抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：重链CDR1包含SEQ ID NO:22，重链CDR2包含SEQ ID NO:23，重链CDR3包含SEQ ID NO:29，轻链CDR1包含SEQ ID NO:30，轻链CDR2包含SEQ ID NO:33和轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；ii)抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：重链CDR1包含SEQ ID NO:22，重链CDR2包含SEQ ID NO:24，重链CDR3包含SEQ ID NO:29，轻链CDR1包含SEQ ID NO:31，轻链CDR2包含SEQ ID NO:33和轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；iii)抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：重链CDR1包含SEQ ID NO:22，重链CDR2包含SEQ ID NO:25，重链CDR3包含SEQ ID NO:29，轻链CDR1包含SEQ ID NO:30，轻链CDR2包含SEQ ID NO:33和轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；iv)抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：重链CDR1包含SEQ ID NO:22，重链CDR2包含SEQ IDNO:26，重链CDR3包含SEQ ID NO:29，轻链CDR1包含SEQ ID NO:30，轻链CDR2包含SEQ IDNO:33和轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；v)抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：重链CDR1包含SEQ ID NO:22，重链CDR2包含SEQ ID NO:27，重链CDR3包含SEQ ID NO:29，轻链CDR1包含SEQ ID NO:30，轻链CDR2包含SEQ ID NO:33和轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；和vi)抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：重链CDR1包含SEQ ID NO:22，重链CDR2包含SEQ ID NO:25，重链CDR3包含SEQ ID NO:109，轻链CDR1包含SEQ ID NO:30，轻链CDR2包含SEQ ID NO:33和轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是人源化的。在特定的实施方案中，抗体或抗体片段包含人恒定区。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含IgG Fc区。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是糖基化的。在一些实施方案中，抗体或抗体片段在修饰的细胞中修饰或表达，其中所述修饰导致抗体或抗体片段提高的FcR效应子功能。在某些实施方案中，抗体或抗原片段在体内诱导升高的Teff:Treg比率。在一些实施方案中，抗体或抗体片段在体内诱导增强的免疫应答。在一些实施方案中，抗体或抗体片段与第二抗体或抗体片段交联时，其是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的激动剂。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:16的重链可变区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，并包含与SEQ ID NO:17的轻链可变区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:6的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，包含与SEQ ID NO:7的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:8的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，包含与SEQ ID NO:9的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:10的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，包含与SEQ ID NO:7的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:12的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，包含与SEQ ID NO:7的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:14的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链多肽，包含与SEQ ID NO:7的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链多肽。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:99的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，包含与SEQ ID NO：7的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO：105的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，包含与SEQ ID NO：7的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO：61的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，包含与SEQ ID NO：59的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
本发明的抗-GITR抗体，在其全长上，通常与人IgG1/κ恒定区氨基酸序列具有至少约85％，例如，至少约85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的整体恒定区(例如，IgG1)氨基酸序列同一性。例如，抗-GITR抗体的重链可以与人IgG1恒定区
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：20).
具有至少约85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，粗体亮氨酸/亮氨酸残基被丙氨酸/丙氨酸置换。在一个实施方案中，最后一个氨基酸赖氨酸(K)被精氨酸(R)置换。抗-GITR抗体的轻链可以与人κ轻链恒定区
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：21).
具有至少约85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，添加、删除或置换恒定区内的氨基酸。
在一些实施方案中，抗体是人或人源化抗体。VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列)可以“混合匹配”，以形成本发明的其他GITR-结合抗体。使用本领域已知的结合试验(例如，ELISA，和实施例部分中描述的其他试验)，可以测试这样的“混合匹配的”GITR-结合抗体，以证实活性。链混合和匹配时，应当用结构上相似的VH序列替代来自特定的VH/VL对的VH序列。同样，应当用结构上相似的全长重链序列替代来自特定的全长重链/全长轻链对的全长重链序列。同样，应当用结构上相似的VL序列替代来自特定的VH/VL对的VL序列。同样，应当用结构上相似的全长轻链序列替代来自特定的全长重链/全长轻链对的全长轻链序列。因此，在一个方面中，本发明提供了分离的单克隆抗体或抗体片段，其具有：包含选自SEQ ID NO：6、8、10、12、14、99和105的氨基酸序列的重链可变区；和包含选自SEQ ID NO：7和9的氨基酸序列的轻链可变区；其中抗体特异性地结合GITR。
在一些实施方案中，本发明的抗-GITR抗体或抗体片段包含与选自SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：106之任一的重链序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链多肽；并包含与SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70的轻链具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链多肽。在某些实施方案中，本发明的抗GITR-抗体或抗体片段包含选自SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：100和SEQ IDNO：106之任一的重链多肽；并包含SEQ ID NO：66或SEQ ID NO:70的轻链多肽。
对于鉴定的低于20个氨基酸长度的氨基酸序列，可以容许一个或多个保守性氨基酸残基置换，同时仍然保留期望的特定结合和/或激动剂活性。
本发明的抗-GITR抗体和抗体片段通常将结合GITR，包括同种型1(SEQ ID NO:1)、同种型2(SEQ ID NO:2)和同种型3(SEQ ID NO:3)，平衡解离常数(KD)值小于约10-8M或10- 9M，例如，或小于约10-10M或10-11M，并且在一些实施方案中，小于约10-12M或10-13M。
结合相同表位的抗体
本发明提供抗体、抗体片段或抗原结合分子，其结合人GITR的富半胱氨酸结构域1(“CRD1”，SEQ ID NO:4：CGPGRLLLGTGTDARCCRV HTTRCCRDY PGEECC SEWDC)和富半胱氨酸结构域2(“CDR2”，SEQ ID NO:5：MCVQPEFHCGDPCCTTCRHH PCPPGQ GVQSQGK FSFGF QC)中包含的表位，并且其中抗体、抗体片段或抗原结合分子是hGITR的激动剂，并且其中抗体、抗体片段或抗原结合分子任选具有完整或提高的FcR效应子功能。在一些实施方案中，抗体、抗体片段或抗原结合分子结合人GITR(包含SEQ ID NO:88)的表位。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:88中的残基。在一些实施方案中，表位包含人GITR的残基34-72和78中的氨基酸残基，其中该抗体和抗体片段是hGITR的激动剂。
本发明还提供了与表1中所述的GITR-结合性抗体结合相同表位的抗体和抗体片段。因此，可以基于其在GITR结合试验中与本发明的其他抗体交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式，竞争性地抑制其他抗体的结合)的能力来鉴定另外的抗体和抗体片段。试验抗体抑制本发明的抗体和抗体片段与GITR蛋白(例如，人GITR)结合的能力表明，试验抗体可以与所述抗体或抗体片段竞争对hGITR的结合；根据非限制性理论，这样的抗体可以与其竞争性抗体或抗体片段结合GITR蛋白上相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的表位。在特定实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段结合hGITR上相同表位的抗体是人或人源化单克隆抗体。可以按照本文中所述的制备和分离这样的人或人源化单克隆抗体。
工程化和修饰的抗体
可以使用具有本文中(例如，表1)所示的一个或多个CDR和/或VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，工程化构建修饰的抗体或抗体片段，从而制备本发明的抗体或抗体片段，所述修饰抗体可以具有从起始抗体改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内)的残基，来工程化构建抗体或抗体片段。另外地或可替换地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化构建抗体或抗体片段，例如，以改变抗体的(一种或多种)效应子功能。
可以进行的一类可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，CDR内的氨基酸序列在抗体之间比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，故通过构建包括来自特定抗体的CDR序列(移植在来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上)的表达载体，可以表达模拟该特定抗体的特性的重组抗体(参见，例如，Riechmann,L.等，1998Nature332:323-327；Jones,P.等，1986Nature 321:522-525；Queen,C.等，1989Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86:10029-10033；Winter的美国专利No.5,225,539，以及Queen等的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括：包含具有选自SEQ ID NO:22、79和84的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO:23、24、25、26、27、62和80的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQ ID NO:29、34和109的氨基酸序列的CDR3序列的重链可变区；和包含具有选自SEQ ID NO:30、31、63、81、85和86的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO:33、64和82的氨基酸序列的CDR2序列；和选自SEQ ID NO:34和83的氨基酸序列的CDR3序列的轻链可变区。因此，这样的抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，还可以含有来自这些抗体的不同框架区。在某些实施方案中，分离的抗体或抗体片段包含与该段落中的相应序列具有至少约85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。
框架序列可以获自包括种系抗体基因序列的公众DNA数据库或公开的参考文献。例如，可以在“VBase”人种系序列数据库(可在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)，以及Kabat,E.A.等，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.等，1992 J.fol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等，1994 Eur.JImmunol.24:827-836中，找到人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列。
用于本发明抗体中的框架序列的实例是，与选定的本发明抗体使用的框架序列(例如，本发明的单克隆抗体使用的共有序列和/或框架序列)在结构上相似的那些框架序列。VH CDR1、2和3序列，以及VL CDR1、2和3序列，可以移植至框架区上，所述框架区具有与该框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中的序列相同的序列；或CDR序列可以移植至与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在某些情况中，突变框架区内的残基来维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见，例如，Queen等的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，由此提高目标抗体的一种或多种结合性质(例如，亲和力)，称为“亲和力成熟”。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入突变，并可以在本文中所述的和实施例中提供的体外或体内试验中和/或本领域已知的可替换或其他试验中，评价对抗体结合或其他的目标功能特性的影响。可以引入保守性修饰。突变可以是氨基酸置换、添加或删除。此外，通常改变CDR区内的至多一个、两个、三个、四个或五个残基。
本发明的工程化抗体或抗体片段包括，已经对VH和/或VL内的框架残基进行了修饰的那些，例如，以提高抗体的特性。通常，进行这样的框架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”至相应种系序列。更特别地，已经经历体细胞突变的抗体可以含有不同于抗体所源自的种系序列的框架残基。可以通过将抗体框架序列与抗体所来源的种系序列比较，鉴定这样的残基。为了将框架区序列返回至其种系构造，可以通过例如定点诱变，将体细胞突变“回复突变”至种系序列。这样的“回复突变”抗体也旨在包括在本发明中。
另一种类型的框架修饰涉及突变框架区内的一个或多个残基，或甚至一个或多个CDR区内的残基，以除去T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也称为“去免疫化”并且更多详细内容描述于Carr等的美国专利公开No.20030153043中。
如果存在抗-GITR抗体或抗体片段的恒定区，则其可以根据情况是任何类型或亚型的，并可以选择来自通过本发明的方法待治疗的受试者的物种(例如，人、非人灵长类或其他哺乳动物，例如，农业动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼)、家养哺乳动物(例如，犬、猫)或啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、兔子)。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体工程化，以产生人源化或抗体。在一些实施方案中，恒定区同种型为IgG，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在某些实施方案中，恒定区同种型为IgG1。
除了框架区或CDR区内进行的修饰，或作为替代，可以工程化本发明的抗体或抗体片段，以在Fc内包括修饰，通常用来改变抗体的一个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体或抗体片段可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分连接至抗体)，或修饰以改变其糖基化，从而改变抗体或抗体片段的一个或多个功能特性。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数量改变，例如，增加或减少。该方法进一步描述于Bodmer等的美国专利No.5,677,425中。例如，改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数量来促进轻链和重链的装配或提高或降低抗体或抗体片段的稳定性。
在另一个实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变，以改变抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域的SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法进一步详细地描述于Ward等的美国专利No.6,165,745中。
在另一个实施方案中，对抗体进行修饰以增加生物半衰期。各种方法都是可以的。例如，如Ward的美国专利No.6,277,375所述，可以引入以下突变中的一个或多个：T252L、T254S、T256F。或者，为增大生物半衰期，抗体可以在CH1或CL区内改变，以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的挽救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等的美国专利No.5,869,046和6,121,022中所述。
再在其他实施方案中，可以通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以将一个或多个氨基酸替代为不同的氨基酸残基，使得抗体对于效应子配体具有改变的亲和性，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变的亲和性所针对的效应子配体可以是例如，Fc受体(FcR)或补体的C1组分。这种方法更详细地描述于Winter等的美国专利No.5,624,821和5,648,260中。
在另一个实施方案中，可以用不同氨基酸残基替代一个或多个选自氨基酸残基的氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法更详细地描述于Idusogie等的美国专利No.6,194,551中。
含有此类突变的抗体介导降低的抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性(CDC)，或无抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被置换成Ala234和Ala235。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基N267被置换成Ala267。
在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基被改变，以由此改变抗体结合补体的能力。这种方法进一步描述于Bodmer等的PCT公开WO 94/19351中。
在再另一个实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区，以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法进一步描述于Presta的PCT公开WO 00/42072中。此外，人IgG1上针对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经作图，并且已经描述了具有提高的结合性的变体(参见，Shields,R.L.等，2001J.Biol.Chen.276:6591-6604)。
再在另一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化(aglycoslated)抗体(即，抗体缺少糖基化)。例如，可以改变糖基化，以提高抗体对“抗原”的亲和性。这样的碳水化合物修饰，例如，可以通过改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，以由此消除该位点的糖基化。这样的无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和性。这样的方法更详细地描述于Co等的美国专利No.5,714,350和6,350,861中。
另外地或替换地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，如具有降低含量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体，或具有增加的平分型(bisecting)GlcNac结构的抗体。已证实这种改变的糖基化模式可以提高抗体的ADCC能力。这类糖修饰例如可以在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来实现。本领域中已经描述了具有改变的糖基化机器的细胞，并可被用作表达本发明的重组抗体的宿主细胞，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hanai等的EP 1,176,195描述了一种带有功能上破坏的FUT8基因(编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，在这种细胞系中表达的抗体呈现出低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了一种变体CHO细胞系，Lecl3细胞，该细胞系将岩藻糖附着至Asn(297)连接的碳水化合物上的能力降低，这也导致在该宿主细胞系中表达的抗体的低岩藻糖化(还可参见Shields，R.L.等，2002，J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公开WO 99/54342描述了经过工程化以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(l,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，在这种工程化细胞系中表达的抗体呈现增加的平分型GlcNac结构，导致抗体的ADCC活性提高(还可参见Umana等，1999，Nat.Biotech.12:176-180)。
将抗原结合结构域移植至替代性的框架或支架中
可以使用各种抗体/免疫球蛋白框架或支架，只要所得到的多肽包括至少一个特异性结合GITR的结合区。这样的框架或支架包括5种主要独特型的人免疫球蛋白，或其片段，并且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化特征。在这个方面中，单重链抗体，如驼科动物中鉴定的那些，是特别令人感兴趣的。新的框架、支架和片段持续被本领域技术人员发现和研发。
在一个方面中，本发明涉及，使用在其上可以移植本发明CDR的非免疫球蛋白支架，产生基于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知或将来的非免疫球蛋白框架和支架，只要它们包含对于靶GITR蛋白(例如，人和/或猕猴GITR)具有特异性的结合区。已知的非免疫球蛋白框架或支架包括，但不限于，纤连蛋白(Compound Therapeutics,Inc.，Waltham,MA)、锚蛋白(Molecular Partners AG，苏黎世，瑞士)、结构域抗体(Domantis,Ltd.，剑桥，MA和Ablynx nv,Zwijnaarde，比利时)、脂笼蛋白(Pieris Proteolab AG，Freising，德国)、小分子免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)、maxybodies(Avidia,Inc.，Mountain View，CA)、蛋白A(Affibody AG，瑞典)和affilin(γ-晶状体蛋白或泛素)(ScilProteins GmbH，Halle，德国)。
纤连蛋白支架基于III型纤连蛋白结构域(例如，III型纤连蛋白的第十个模块(10Fn3结构域))。III型纤连蛋白结构域具有7或8个β链，其分布在两个β片之间，它们自身彼此挤靠形成蛋白质的核心，并且进一步含有环(与CDR类似)，这些环将β链彼此连接并且是溶剂暴露的。在β片夹层的每个边缘存在至少三个这样的环，其中所述边缘是与β链的方向垂直的蛋白边界(参见US 6,818,418)。这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，但整体折叠与最小的功能性抗体片段(重链可变区，在骆驼和美洲鸵IgG中其包含完整的抗原识别单位)密切相关。由于这个结构，该非免疫球蛋白抗体可以模拟抗原结合特性，在性质和亲和性上与抗体的相似。这些支架可以用于体外环随机化和改组策略中，该策略与体内的抗体亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可以用作支架，其中使用标准克隆技术，用本发明的CDR替代分子的环区域。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白衍生的重复模块的蛋白作为支架用于携带可变区，所述可变区可以用于结合不同的靶标。锚蛋白重复模块是由两个反平行的α-螺旋和β-转角组成的33个氨基酸的多肽。可变区的结合大多数可以通过使用核糖体展示来优化。
Avimer源自含有天然A-结构域的蛋白，如LRP-1。这些结构域本质上用于蛋白-蛋白相互作用，并且在人体中，超过250种蛋白在结构上是基于A-结构域的。Avimer由多个不同“A-结构域”单体(2-10个)经由氨基酸衔接物连接而成。可以使用例如美国专利申请公开No.20040175756；20050053973；20050048512；和20060008844中所述的方法，形成可以结合靶抗原的avimer。
Affibody亲和配体是小的简单蛋白，由基于蛋白A的一个IgG-结合结构域的支架的三螺旋束组成。蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌的表面蛋白。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个可以经随机化而产生具有大量配体变体的affibody文库(参见，US 5,831,012)。Affibody分子模拟抗体，与150kDa的抗体分子量相比，它们具有6kDa的分子量。尽管其尺寸小，但affibody分子的结合位点与抗体的相似。
Anticalin是由Pieris ProteoLab AG公司研发的产物。它们源自脂笼蛋白(一组广泛分布的、通常涉及化学敏感性或不溶性化合物的生理运输或存储的、小而稳健的蛋白质)。人组织或体液中存在几种天然脂笼蛋白。该蛋白的构造类似于免疫球蛋白的，在刚性框架顶部具有超变环。然而，与抗体或其重组片段不同，脂笼蛋白由具有160至180个氨基酸残基的单个多肽链组成，只略大于单个免疫球蛋白结构域。构成结合袋的四环组显示出显著的结构可塑性并容许各种侧链。该结合位点因此可以在专有方法中重塑，以高亲和性和特异性识别规定的不同形状的靶分子。通过诱变四环组，脂笼蛋白家族的一个蛋白，PierisBrassicae的后胆色素结合蛋白(BBP)，已经用于研发anticalin。
Affilin分子是设计用来针对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋白蛋白质。可从两个文库中非常快速地选择新的Affilin分子，每一所述文库基于不同的人衍生支架蛋白。Affilin分子与免疫球蛋白蛋白质不显示任何结构同源性。目前，使用两个Affilin支架，其中一个是γ晶状体蛋白——人结构性眼晶状体蛋白质，另一个是“泛素”超家族蛋白质。两个人支架均非常小，显示高的温度稳定性，并几乎抵抗pH改变和变性剂。该高稳定性主要是因为蛋白质的扩展的β折叠结构。γ晶状体蛋白来源的蛋白质的实例描述于WO2001004144中，并且“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004106368中。
蛋白质表位模拟物(PEM)是中等大小的环状、肽样分子(MW 1-2kDa)，模拟蛋白质β发夹二级结构(参与蛋白质-蛋白质相互作用的主要二级结构)。
人或人源化抗体
本发明提供特异性结合GITR蛋白(例如，人GITR)的工程化人抗体。与嵌合、灵长类化或人源化抗体相比，施用于人时，本发明的人GITR-结合抗体具有进一步降低的抗原性。
可以使用本领域已知的方法来产生人GITR-结合抗体。例如，技术平台(KaloBios，Sout San Francisco，CA)用于将非人抗体转化成工程化人抗体。美国专利公开No.20050008625描述了一种体内方法，其中在抗体中以人可变区替换非人抗体可变区，同时相对于该非人抗体保持相同或提供更好的结合特征。所述方法依赖于表位引导的完全人抗体对非人参照抗体的可变区替换。所得到的人抗体通常在结构上与参照非人抗体不相关，但与参照抗体结合相同抗原上的相同表位。
本发明的抗-GITR抗体可以基于具有V-区序列的工程化人抗体，所述V-区序列与人种系V区序列具有实质性的氨基酸序列同一性，同时保留参照抗体的特异性和亲和性。参见，美国专利公开No.2005/0255552和美国专利公开No.2006/0134098，两篇专利文献都按引用并入本文中。该改进的方法可以鉴定用于确定参照抗体可变区的抗原结合特异性所需要的最小序列信息，并将信息转移至人部分V-区基因序列的文库，以产生人抗体V区的表位聚焦文库。基于微生物的分泌系统可以用于表达文库成员为抗体Fab片段，并且可以例如使用菌落转移结合试验，针对抗原结合性Fab筛选文库。参见，例如，美国专利公开No.2007/0020685。可以进一步表征阳性克隆，鉴定具有最高亲和性的克隆。所得到的工程化人Fab保留亲本参照抗-GITR抗体的结合特异性，与亲本抗体相比，通常对抗原具有相等或更高的亲和性，并且具有与人种系抗体V-区高度序列同一的V-区。
产生表位聚焦文库所需要的最小结合特异性决定簇(BSD)通常表现为重链CDR3内的序列(“CDRH3”)和轻链CDR3内的序列(“CDRL3”)。BSD可以包含CDR3的一部分或整个长度。BSD可以由连续或非连续氨基酸残基组成。在一些情况中，表位聚焦文库从人V-区段序列构建，所述V-区段序列与含有BSD的参照抗体的独特CDR3-FR4区及人种系J区段序列连接(参见，美国专利公开No.2005/0255552)。或者，可以通过相继盒替换来产生人V-区段文库，其中最初仅有部分参照抗体V区段被人序列文库替换。随后，鉴定的在剩余的参照抗体氨基酸序列中支持结合的人“序列盒”，在第二文库筛选中重组以产生完全人的V区段(参见，美国专利申请No.2006/0134098)。
在每种情况中，含有来自参照抗体的特异性决定簇的、配对的重链和轻链CDR3区段、CDR3-FR4区段或J区段，用于约束该结合特异性，以使得获自该文库的抗原结合物保留参照抗体的表位特异性。在文库构建过程中，在每条链的CDR3区域中，都可以引入另外的成熟改变，以鉴定具有最佳结合动力学的抗体。所得到的工程化人抗体具有源自人种系文库的V-区段序列，保留来自CDR3区的短BSD序列，并具有人种系框架4(FR4)区。
骆驼(Camelid)抗体
从骆驼和单峰驼(双峰驼(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)家族的成员，包括新世界成员，如骆马物种(例如，Lama paccos、Lama glama和Lama vicugna)中，获得的抗体蛋白质已经在大小、结构复杂性和对人受试者的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来自该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并因此在结构上不同于来自其他动物的抗体的两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参见PCT/EP93/02214(WO 94/04678，1994年3月3日公开)。
可通过遗传改造获得鉴定为VHH的骆驼抗体区域(小的单可变结构域)，以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，得到低分子量的抗体来源蛋白质，称为“骆驼纳米抗体”。参见1998年6月2日授权的美国专利号5,759,808；还可以参见Stijlemans,B.等，2004J BiolChem 279:1256-1261；Dumoulin,M.等，2003 Nature 424:783-788；Pleschberger,M.等，2003 Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等，2002Int J Cancer 89:456-62；和Lauwereys,M.等，1998EMBO J 17:3512-3520。例如从Ablynx，Ghent，Belgium，通过商业途径可以获得工程化的骆驼抗体和抗体片段库。如同非人来源的其他抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列，获得与人序列更类似的序列，即，纳米抗体可以进行“人源化”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
骆驼纳米抗体的分子量是人IgG分子的大概十分之一，并且所述蛋白质的物理直径仅几纳米。小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体能够结合更大抗体蛋白质在功能上看不见的抗原位点，即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的检测试剂，并可能用作治疗剂。因此，小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体由于结合靶蛋白质的沟或窄缝中特异位点而因此可抑制靶蛋白，并因而可具有这样的能力，其比经典抗体具有更类似于经典低分子量药物的功能。
低分子量和紧凑的尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，并且抗原性弱。另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统转移到组织，甚至穿过血脑屏障，可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步利于药物运输穿过血脑屏障。参见2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。这些特征与对人的低抗原性结合表明巨大的治疗潜能。另外，这些分子可在原核细胞，如大肠杆菌(E.coli)中表达，并用噬菌体表达为融合蛋白，且是有功能的。
因此，本发明的一个方面是对GITR具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方案中，所述骆驼抗体或纳米抗体在骆驼动物中天然产生，即，使用本文就其他抗体所描述的技术，用GITR或其肽片段免疫骆驼来产生。或者，可以工程化构建，即如本文实施例中所述，使用GITR作为靶标，通过淘选方法，从例如展示适当诱变的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库中，选择产生GITR结合性骆驼纳米抗体。还可以通过遗传工程化，定制工程化纳米抗体，以在受体受试者中具有从45分钟到两周的半衰期。在特定实施方案中，如PCT/EP93/02214所述，通过将本发明人抗体的重链或轻链的CDR序列移植到纳米抗体或单域抗体框架序列中来获得骆驼抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，根据以下所述的方法，本发明提供了多价骆驼抗体或纳米抗体。
多价抗体
在另一个方面中，提供了包含本发明的GITR-结合抗体或其片段的多价抗体(单特异性、双特异性或多特异性)。本发明的抗体，或其抗原结合区，可以衍生或连接另一个功能性分子，例如，另一个肽或蛋白(例如，另一个抗体或受体的配体)，以产生结合至少两个不同结合位点(其可以是相同或不同靶位点或分子)的多价分子。在一些实施方案中，本发明的抗体可以被衍生或功能上连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他)超过一个的其他功能性分子，以产生结合两个或更多个不同结合位点(其可以是相同靶标分子上的相同或不同的结合位点)的多价分子。在某些实施方案中，多价结合位点是相同的。在一些实施方案中，本发明的抗体被衍生或连接超过一个的其他功能性分子，以产生结合至少两个靶标分子上的两个或更多个不同结合位点的多特异性分子；如多特异性分子也旨在包括在本文中使用的术语“双特异性分子”或“多特异”中。为了形成本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以在功能上连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他)一个或多个其他结合分子，如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以获得多价分子。本发明包括双特异性分子，其包含至少一个针对GITR的第一结合特异性和针对第二靶标表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位是不同于第一个靶表位的另一个GITR表位。另外，对于分子是多特异性分子的本发明，在一些实施方案中，除了第一和第二靶表位以外，分子还可以包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括，例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等的美国专利No.4,946,778中所述的。
二抗体(diabody)是二价、双特异性分子，其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上，通过太短以至于不允许同一条链上的两个结构域配对的衔接物连接。VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对，由此形成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等，1994 Structure 2:1121-1123)。可以通过在同一细胞内表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)、或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的两个多肽链来产生二抗体。大部分的二抗体可以以可溶形式在细菌中表达。通过用大约15个氨基酸残基的衔接物连接两个二抗体形成性多肽链，可以产生单链二抗体(scDb)(参见Holliger和Winter，1997 Cancer Immunol.Immunother.，45(3-4):128-30；Wu等，1996 Immunotechnology，2(1):21-36)。scDb可以在细菌中以可溶、活性单体形式表达(参见，Holliger和Winter，1997 Cancer Immunol.Immunother.，45(34):128-30；Wu等，1996 Immunotechnology，2(1):21-36；Pluckthun和Pack，1997 Immunotechnology,3(2):83-105；Ridgway等，1996 Protein Eng.,9(7):617-21)。二抗体可以与Fc融合，来产生“二-二抗体”(di-diabody)(参见，2004 J.Biol.Chem.,279(4):2856-65)。
可以用于本发明双特异性分子中的其他抗体是鼠、嵌合和人源化的单克隆抗体。
可以使用本领域已知的方法，通过缀合结合特异性组成部分，制备本发明的双特异性和/或多价分子。例如，可以分开产生双特异性和/或多价分子的每个结合特异性，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白或肽时，可以将各种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、o-苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见，例如，Karpovsky等，1984 J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其他方法包括Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等，1985 Science 229:81-83和Glennie等，1987 J.Immunol.139:2367-2375中所述的那些。缀合剂可以是SATA和磺基-SMCC，两者都可获自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的恒定结构域铰链区的巯基键合来缀合。在特定的实施方案中，在缀合前修饰铰链区，以含有奇数个巯基残基，例如，一个。
或者，结合特异性可以在相同载体中编码，并且在相同宿主细胞中表达和装配。在双特异性和/或多价分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白的情况中，该方法特别有用。本发明的双特异性和/或多价分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号No.5,260,203；美国专利号No.5,455,030；美国专利号No.4,881,175；美国专利号No.5,132,405；美国专利号No.5,091,513；美国专利号No.5,476,786；美国专利号No.5,013,653；美国专利号No.5,258,498和美国专利号No.5,482,858中。
双特异性和/或多价分子与其特异性靶标的结合，例如，可以通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫试验(REA)、FACS分析、生物试验(例如，生长抑制)或Western印迹试验，来证实。在这些试验的每一个中，通常使用对于目标复合物特异的标记试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。
具有延长半衰期的抗体
本发明提供，具有延长的体内半衰期的、特异性地结合GITR蛋白的抗体和抗体片段。
许多因素可以影响蛋白的体内半衰期。例如，肾过滤、肝脏中的代谢、蛋白水解酶(蛋白酶)的降解和免疫原性应答(例如，被抗体蛋白中和以及被巨噬细胞和树状细胞摄取)。各种策略可以用于延长本发明抗体的半衰期。例如，通过化学连接聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白-结合性配体和碳水化合物壳；通过与结合血清蛋白的蛋白(如白蛋白、IgG、FcRn和转铁蛋白)进行基因融合；通过与结合血清蛋白的其他结合性部分(如纳米抗体、Fab、DARPins、avimers、affibodies和anticalins)(遗传或化学)偶联；通过与rPEG、白蛋白、白蛋白的结构域、白蛋白结合性蛋白和Fc进行基因融合；或通过掺入nancarriers、缓释制剂或医学装置中。
为了延长抗体在体内的血清循环，可以使用或不使用多官能接头，通过PEG与抗体的N-或C-端的位点特异性缀合、或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基基团，将惰性聚合物分子(如高分子量PEG)连接至抗体或其片段。为了使抗体PEG化，通常可以在引起一个或多个PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应，来进行PEG化。如本文中使用的，术语“聚乙二醇”旨在包括已经用于衍生其他蛋白的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待PEG化的抗体是无糖基化抗体。可以使用导致生物活性最小丢失的线性或分支聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱密切监控缀合程度，以确保PEG分子与抗体的正确缀合。未反应的PEG可以通过大小排阻或通过离子交换色谱与抗体-PEG缀合物分离。可以使用本领域技术人员公知的方法，例如，通过本文中所述的免疫试验，测定PEG衍生抗体的结合活性以及体内功效。用于将蛋白PEG化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的抗体。参见，例如，Nishimura等的EP 0154316和Ishikawa等的EP0401384。
其他改进的PEG化技术包括ReCODE PEG(化学重构正交定向工程化技术，reconstituting chemically orthogonal directed engineering technology)，其经由包括tRNA合成酶和tRNA的重构系统将化学上特定的侧链并入生物合成的蛋白中。这种技术能够在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中将超过30个的新氨基酸并入生物合成蛋白中。tRNA可以在放置琥珀密码子的任何位置掺入非天然氨基酸，将琥珀密码子从终止密码子转变成发出并入化学上特定氨基酸的信号的密码子。
重组PEG化技术(rPEG)也可以用于血清半衰期延长。这种技术涉及在遗传上将300-600个氨基酸的非结构蛋白尾融合至已有的药物蛋白上。因为非结构蛋白链的表观分子量比其实际的分子量大约15-倍，因此蛋白的血清半衰期得到很大程度的提高。与需要化学缀合和再纯化的传统PEG化相反，生产过程得到了很大程度的简化并且产物是同质的。
聚唾液酸化是另一种技术，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长有效寿命并提高治疗性肽和蛋白的稳定性。PSA是唾液酸的聚合物(糖)。用于蛋白和治疗性肽药物递送时，聚唾液酸在缀合物上提供保护性微环境。这提高了治疗蛋白在循环中的有效寿命并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体中。其被某些细菌采用，所述细菌经过数百万年进化，用PSA聚合物覆盖它们的壁。这些天然聚唾液酸化的细菌随后能够借助分子拟态来挫败身体的防御系统。可以容易地从这样的细菌大量产生具有预定的物理特征的PSA(自然界的终极隐身技术)。细菌PSA因为其在化学上与人体内的PSA相同，而是完全非免疫原性的，即使与蛋白偶联时也是如此。
另一种技术包括利用与抗体连接的羟乙基淀粉(“HES”)。HES是源自蜡质玉米淀粉的修饰的天然聚合物，可以被体内的酶代谢。通常可以施用HES溶液来替代不足的血液体积和提高血液的流变学特性。抗体的HES化能够通过提高分子的稳定性以及通过降低肾清除来延长循环半衰期，导致提高的生物活性。通过改变不同的参数，如HES的分子量，可以定制各种HES抗体缀合物。
将一个或多个氨基酸修饰(即，置换、插入或删除)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc结构域片段)中，也可以产生具有提高的体内半衰期的抗体。参见，例如，国际公开No.WO 98/23289；国际公开No.WO 97/34631；和美国专利No.6,277,375。
此外，抗体可以与白蛋白缀合，使得抗体或抗体片段在体内更稳定或具有更长的体内半衰期。技术是本领域公知的，参见，例如，国际公开No.WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利No.EP 413,622。
用于提高半衰期的策略在纳米抗体、基于纤连蛋白的结合剂和需要提高体内半衰期的其他抗体或蛋白中尤为有用。
抗体缀合物
本发明提供，与异源蛋白或多肽(或其片段，优选至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)以产生融合蛋白的、特异性结合GITR蛋白的抗体或其片段。特别地，本发明提供包含本文中所述抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白、多肽或肽的融合蛋白。用于将蛋白、多肽或肽与抗体或抗体片段融合或缀合的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利No.5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利No.EP 307,434和EP 367,166；国际公开WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539；Zheng等，1995,J.Immunol.154:5590-5600；和Vil等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341。
通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总称为“DNA改组”)技术，可以产生其他融合蛋白。DNA改组可以用于改变本发明的抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和性和较低离解速率的抗体或其片段)。一般参见，美国专利No.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等，1999,J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-313(这些专利和出版物各自全部按引用并入)。可以在重组前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变抗体或其片段，或编码的抗体或其片段。编码特异性结合GITR蛋白的抗体或其片段的多核苷酸可以与一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
此外，抗体或其片段可以与标记序列融合，如促进纯化的肽。在优选实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸(HHHHHH SEQ ID NO:11)肽，如pQE载体中提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，许多标记氨基酸序列是商业上可购得的。如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所述的，例如，六组氨酸(SEQ IDNO:11)可以用于方便地纯化融合蛋白。用于纯化的其他肽标签包括，但不限于，血凝素(“HA”)标签——其对应于从流感血凝素蛋白衍生的表位(Wilson等，1984,Cell 37:767)和“flag”标签。
在其他实施方案中，本发明的抗体或其片段与诊断剂或检测剂缀合。这样的抗体可用于监控或预后疾病或病症的发作、发展、进展和/或严重性，作为临床检查程序的一部分，如确定特定治疗的功效。可以通过将抗体与可检测物质偶联来实现这样的诊断和检测，所述物质包括，但不限于，各种酶，如，但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如，但不限于，链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光材料如，但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，如，但不限于，鲁米诺；生物发光材料，如但不限于，萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白(aequorin)；放射性材料，如，但不限于，碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；以及使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属，和非放射性顺磁性金属离子。
本发明进一步包括与改变给定的生物作用或应答的治疗性部分或药物部分缀合的抗体或其片段，以及与治疗性部分缀合的抗体或其片段的用途。治疗性部分或药物部分不应理解为限于传统的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白、肽或多肽。这样的蛋白可以包括，例如，毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活剂、凋亡剂、抗血管生成剂；或，生物应答调节剂，例如，淋巴因子。抗体或其片段可以与治疗性部分缀合，如细胞毒素，例如，细胞生长抑制剂或细胞杀伤剂、治疗剂或放射性金属离子，例如，α-发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何物质。
例如，抗体可以与治疗性部分缀合，所述治疗性部分如放射性金属离子，如α-发射体，如213Bi，或用于将放射性金属离子缀合至多肽的大环螯合剂，所述金属离子包括但不限于，131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm。在某些实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可以经由衔接物分子连接抗体。这样的衔接物分子包括例如，甘氨酸衔接物，例如，GGGGS(SEQ ID NO:15)，其可以任选是重复的，例如，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18)，或其他衔接物是本领域通常已知的并且描述于Denardo等，1998，Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Peterson等，1999，Bioconjug.Chem.10(4):553-7和Zimmerman等，1999,Nucl.Med.Biol.26(8):943-50，所述文献均按引用全部并入。
用于将治疗性部分与抗体缀合的技术是公知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，见Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，见Controlled DrugDelivery(第2版)，Robinson等(编辑)，pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，见Monoclonal Antibodies 84:Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，见MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)；pp.303-16(Academic Press 1985)；和Thorpe等，1982,Immunol.Rev.62:119-58。
抗体也可以连接固体支持物，其对于靶抗原的免疫测定试验或纯化特别有用。这样的固体支持物包括，但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
编码激动剂抗GITR抗体的多核苷酸
可以通过本领域已知的任何方式，包括但不限于，重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶消化，产生抗-GITR抗体、抗原结合分子及其片段，而全长单克隆抗体可以通过例如杂交瘤或重组生产来获得。重组表达可以来自本领域已知的任何合适的宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本发明进一步提供了编码本文中所述抗体的多核苷酸，例如，编码重链或轻链可变区或包含本文中所述的互补决定区的区段的多核苷酸。在一些实施方案中，编码重链可变区的多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:107的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:102的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的序列。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:67的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:68的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:72的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:73的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:74的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:68的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:76的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:68的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:78的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:68的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:103的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:104的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:108的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:104的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:60的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:58的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本发明的多核苷酸可以只编码抗-GITR抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含示例的小鼠抗-GITR抗体之一的重链和轻链的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码分别与小鼠抗体之一的重链和轻链可变区基本上相同的两个多肽区段。
通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码抗-GITR抗体或其结合片段的现有序列(例如，本文中所述的序列)，可以产生多核苷酸序列。可以通过本领域已知的方法来完成核酸的直接化学合成，如Narang等，Meth.Enzymol.68:90,1979的磷酸三酯方法；Brown等，Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯方法；Beaucage等，Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利No.4,458,066的固体支持物方法。可以按照例如PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编辑)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Innis等(编辑)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等，NucleicAcids Res.19:967,1991；和Eckert等，PCR Methods and Applications 1:17,1991中所述的，通过PCR将突变引入多核苷酸序列中。
本发明还提供用于生产上述抗-GITR抗体的表达载体和宿主细胞。各种表达载体可以用于表达编码抗-GITR抗体链、片段或结合片段的多核苷酸。基于病毒的和非病毒的表达载体都可以用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体，通常具有用于表达蛋白或RNA的表达盒，以及人的人工染色体(参见，例如Harrington等，Nat Genet 15:345，1997)。例如，用于在哺乳动物(例如，人)细胞中表达抗-GITR多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B&C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A、B&C(Invitrogen，San Diego，CA)，MPSV载体和各种本领域已知的用于表达其他蛋白的载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头状瘤病毒、HBPEB病毒的载体，痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)载体。参见，Brent等，上引文；Smith，Annu.Rev.Microbiol.49:807，1995和Rosenfeld等，Cell 68:143，1992。
表达载体的选择取决于打算在其中表达载体的宿主细胞。通常，表达载体含有可操作地连接编码抗-GITR抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其他调控序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，使用诱导型启动子来防止插入序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括，例如，阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。转化的生物体可以在非诱导条件下扩大培养，不偏向编码序列的表达产物被宿主细胞更耐受的群体。除了启动子，对于有效表达抗-GITR抗体链或片段，还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近的核糖体结合位点或其他序列。此外，可以通过包含适用于所使用的细胞系统的增强子来增强表达效率(参见，例如，Scharf等，ResultsProbl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等，Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以与插入的抗-GITR抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更常见的，包含在载体中之前，插入的抗-GITR抗体序列与信号序列连接。用于接收编码抗-GITR抗体轻链和重链可变结构域的载体有时候也可以编码恒定区或其部分。这样的载体允许表达可变区与恒定区的融合蛋白，由此导致完整抗体或其片段的产生。通常，这样的恒定区是人的。
用于携带和表达抗-GITR抗体链的宿主细胞可以是原核的或真核的。大肠杆菌是用于克隆和表达本发明多核苷酸的一种原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，可以存在任何数量的各种公知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统、或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选具有操作子序列，并且具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物，如酵母，也可以用于表达本发明的抗-GITR多肽。还可以使用昆虫细胞结合杆状病毒载体。
在一些优选实施方案中，将哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗-GITR多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，实施例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，以下示例的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常的非永生化的或正常或异常的永生化的动物或人细胞。例如，已经研发了各种能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽，一般性地讨论于例如Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.，1987。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等，Immunol.Rev.89:49-68，1986)，和必需的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有源自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调节或可调控的。有用的启动子包括，但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松-诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目标多核苷酸序列的表达载体的方法可以根据细胞宿主的类型而改变。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其他细胞宿主(总地参见Sambrook等，上引文)。其他方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和微注射、生物导弹法、病毒颗粒、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合(Elliot and O'Hare，Cell88:223，1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。对于长期、高产量的重组蛋白生产，常常将需要稳定的表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因的本发明表达载体，制备稳定表达抗-GITR抗体链或结合片段的细胞系。引入载体后，可以在转换至选择培养基之前，允许细胞在富集培养基中生长1-2天。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，其存在允许成功表达引入的序列的细胞在选择培养基中生长。使用适于细胞类型的组织培养技术，可以使抗性、稳定转染的细胞增殖。
鉴定激动剂抗-GITR抗体的试验
用于鉴定激动剂抗-GITR抗体的试验是本领域已知的并且描述于本文中。激动剂抗-GITR抗体结合GITR并促进、诱导、刺激通过GITR的胞内信号传输。
可以使用本领域已知的任何方法测定抗-GITR抗体与GITR的结合。例如，可以使用已知技术，包括但不限于ELISA、Western印迹、表面等离子体共振(例如，BIAcore)和流式细胞术，测定与GITR的结合。
可以使用本领域已知的任何方法来测量通过GITR的胞内信号传输。例如，通过GITR的激活促进NFκB和MAPK信号传输。用于测量NFκB和MAPK激活的方法是本领域中标准的(例如，使用报告基因试验、NFκB蛋白的核易位、MAPK蛋白的磷酸化状态)。通过GITR的激活是共刺激信号，其在通过T-细胞受体的激活存在下(例如，在主要或靶抗原的存在下)促进激活的CD4+和CD8+T细胞增殖。用于测量细胞增殖的方法是本领域中标准的(例如，3H-胸苷掺入试验、CFSE标记)。在存在通过T-细胞受体的激活的情况下，通过GITR的信号传输也共刺激激活的CD4+和CD8+T细胞，以产生细胞因子。通过GITR的信号传输还共刺激激活的NK细胞以产生细胞因子。细胞因子可以是Th1-型细胞因子(例如，干扰素-γ、IL-2和TNF)和Th2-型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)中的一者或两者。用于测量细胞因子产生的方法是本领域公知的(例如，ELISA试验、ELISpot试验)。通过GITR的激活还可以诱导凋亡。用于测量细胞凋亡的方法是本领域中标准的(例如，膜联蛋白V染色)。在进行体外试验时，可以将接触激动剂抗-GITR抗体的试验细胞或来自试验细胞的培养物上清液，与没有接触过激动剂抗-GITR抗体的对照细胞或来自对照细胞的培养物上清液，进行比较。
还可以在体内测量本发明抗体的GITR激动剂功能。优选的激动剂抗-GITR抗体具有激活和扩增CD4+和CD8+T细胞的能力。可以以使用本领域已知的任何方法，例如，通过流式细胞术，来测量CD4+和CD8+T细胞的体内激活和扩增。优选的激动剂抗-GITR抗体可以在治疗上用于抑制肿瘤生长或促进肿瘤缩小。可以使用本领域已知的任何方法(例如，视觉观察、卡尺、重量、成像技术，包括MRI)来测量肿瘤生长，或其抑制。优选的激动剂抗-GITR抗体可以在治疗上用于预防、降低、抑制或消除感染性疾病的致病因素，例如细菌、真菌、病毒或寄生物感染。可以通过将治疗有效量的抗体施用于受试者并比较施用抗体前后的受试者来确定激动剂抗-GITR抗体在提升T-细胞应答或降低疾病严重性中的功效。还可以通过将治疗有效量的抗体施用于试验受试者并将试验受试者与没有施用抗体的对照受试者比较来确定激动剂抗-GITR抗体在提升T-细胞应答或降低疾病严重性中的功效。
包含激动剂抗-GITR抗体的组合物
本发明提供包含与药物学上可接受的载体配制在一起的本发明抗-GITR抗体或抗原结合分子的药物组合物。任选，药物组合物另外含有适用于治疗或预防给定疾病的一种或多种其他治疗剂。
药物学上可接受的载体增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。药物学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的各种方法来施用。施用途径和/或方式可以根据所需结果来改变。优选施用是静脉内、肌内、腹膜内或皮下，或接近靶位点施用。药物学上可接受的载体应当适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、鼻内、吸入、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物，例如，本发明的抗体或抗原结合片段或多价分子(例如，单特异性、双特异性或多特异性分子)，可以包裹在材料中，以保护化合物免受酸和其他可能使化合物失活的自然条件的作用。
抗体或其片段，单独或结合其他合适的组分，可以制成气溶胶制剂(即，它们可以被“喷雾”)，以通过吸入施用。气溶胶制剂可以放入加压的可接受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
在一些实施方案中，组合物是无菌的且是流体。例如，通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况中通过维持所需的颗粒大小、或通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇，以及氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝或明胶，来实现可注射组合物的长期吸收。在某些实施方案中，可以使用合适的赋形剂(例如，蔗糖)，将组合物制成冻干形式用于储存。
可以根据本领域公知的和常规实践的方法，制备本发明的药物组合物。药物学上可接受的载体部分决定于所施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法。因此，存在各种合适的本发明的药物组合物的制剂。适用于配制抗体以及确定合适的剂量和时间表的方法可以见于，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，University of the Sciences in Philadelphia，编辑，Lippincott Williams&Wilkins(2005)；和Martindale:The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press；以及Martindale,Martindale:The Extra Pharmacopoeia，第31版，1996，Amer Pharmaceutical Assn；以及Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978，将每篇文献按引用并入本文中。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，在本发明的药物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的抗-GITR抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法，将抗-GITR抗体配制成药物学上可接受的剂型。调节剂量方案，以提供所需的应答(例如，治疗应答)。在确定治疗或预防有效剂量中，可以施用低剂量，然后逐渐递增，直至获得所需应答和最小或没有不合需要的副作用。例如，可以施用单个大丸剂(bolus)，可以在一段时间内施用几个分剂量，或可以按照治疗情况的紧急性所指示的，按比例地降低或增加剂量。尤为有利的是，为了易于施用和剂量的均一性，配制单位剂型的肠胃外组合物。本文中所用的单位剂型是指，适宜作为单元剂量用于待治疗受试者的物理上分开的单位；每个单位含有经计算可以产生所需治疗效果的预定量的活性化合物和所需的药物载体。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以获得对于特定患者、组合物和施用方式而言可以有效实现所需治疗应答的活性成分量，而对患者没有毒性。选定的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括使用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，待使用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质，待治疗患者的年龄、性别、重量、状况、整体健康和之前的医疗史，以及类似因素。
与第二药剂的共配制
在一些实施方案中，药物组合物包含抗-GITR抗体或抗原结合分子与第二药剂的混合物。与本发明的抗-GITR激动剂抗体或抗原结合分子一起包括在混合物中的示例性第二药剂包括但不限于，主要或靶抗原、提高肿瘤细胞的免疫原性的药剂、抑制或遏制共抑制信号的药剂。
本发明的抗-GITR抗体或抗原结合分子可以与主要或靶抗原共同配制(即，作为混合物来提供或制备在混合物中)。靶抗原，或疫苗，将取决于待治疗的疾病状况。例如，靶抗原可以来自肿瘤细胞、细菌细胞、真菌、病毒或寄生物。根据情况，靶抗原可以是肽、多肽、细胞或多核苷酸的形式。
在一个实施方案中，靶抗原来自病毒，例如，选自：甲肝、乙肝、丙肝、流感、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹病毒(HSV I)、II型单纯疱疹(HSV II)、牛痘病毒、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、echinovirus、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV I)和II型人免疫缺陷病毒(HIV II)、任何小核糖核酸病毒科病毒、肠病毒、杯状病毒科、诺沃克病毒组中的任何一种病毒、披膜病毒，如甲病毒、黄病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、布尼亚病毒(Bunyavirus)、沙粒病毒、呼肠弧病毒、轮状病毒、环状病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒、猴免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、细小病毒、EB病毒、人疱疹病毒6、猿猴疱疹病毒1(B病毒)和痘病毒。
在一个实施方案中，靶抗原来自细菌，例如，选自：奈瑟氏菌属(Neisseria spp)、链球菌属(Streptococcus spp)、变形链球菌(S.mutans)、嗜血杆菌属(Haemophilusspp.)、莫拉氏菌属(Moraxella spp)、博德特氏菌属(Bordetella spp)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp)、军团菌属(Legionella spp)、埃希氏菌属(Escherichia spp)、弧菌属(Vibriospp)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp)、弯曲菌属(Campylobacter spp)、沙门氏菌属(Salmonella spp)、李斯特氏菌属(Listeria spp.)、螺杆菌属(Helicobacter spp)、假单胞菌属(Pseudomonas spp)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp)、梭菌属(Clostridium spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、疏螺旋体属(Borrelia spp.)、埃里希氏体属(Ehrlichiaspp)、立克次氏体属(Rickettsia spp)、衣原体属(Chlamydia spp.)、钩端螺旋体属(Leptospira spp.)、密螺旋体属(Treponema spp)。
在一些实施方案中，将抗-GITR抗体或抗原结合分子与肿瘤相关抗原(TAA)共同配制在混合物中。TAA可以是分离的多肽或肽，可以是完整细胞的一部分或肿瘤细胞裂解物的一部分。TAA可以是多核苷酸，例如，包含编码一个或多个TAA的多核苷酸的裸露质粒或病毒载体。已知的TAA实例包括，不限于，黑素瘤相关抗原(MAGE-1、MAGE-3、TRP-2、黑素瘤膜糖蛋白gp100、gp75以及与黑素瘤相关的MUC-1(粘液素-1))；CEA(癌胚抗原)，其可以例如与卵巢、黑素瘤或结肠癌相关；由卵巢癌表达的叶酸受体α；由许多不同肿瘤，包括但不限于骨髓瘤，表达的游离人绒毛膜促性腺激素β(hCGβ)亚基；与乳腺癌相关的HER-2/neu；与小细胞肺癌相关的脑脊髓炎抗原HuD；与神经母细胞瘤相关的酪氨酸羟化酶；与前列腺癌相关的前列腺特异性抗原(PSA)；与卵巢癌相关的CA125；并且B细胞淋巴瘤的独特型决定簇可以产生肿瘤特异性免疫性(归因于独特型-特异性体液免疫应答)。此外，人1型T细胞白血病病毒的抗原已经显示出诱导对抗病毒诱导的人成年T细胞白血病(ATL)的特异性CTL应答和抗肿瘤免疫性。参见，例如，Haupt等，Experimental Biology and Medicine(2002)227:227-237；Ohashi等，Journal of Virology(2000)74(20):9610-9616。其他TAA是已知的并且可以用于与抗-GITR抗体共同配制。
在一些实施方案中，将抗-GITR抗体或抗原结合分子，与来自患者的自体肿瘤细胞或来自另一位患者的相同组织类型的同种异体肿瘤细胞，共同配制。肿瘤细胞可以是完整细胞、肿瘤细胞裂解物、凋亡的肿瘤细胞或肿瘤总mRNA的形式。可以转染肿瘤细胞，以表达增强或提高肿瘤细胞在患者中的免疫原性的多肽，例如，转染以表达粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)。肿瘤细胞可以来自任何癌组织，包括不限于，上皮癌或癌瘤，以及肉瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、卵巢癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌、神经胶质瘤、纤维肉瘤、血液癌症、或头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。参见，例如，Pardee等，Immunotherapy(2009)1(2):249-264，以及其中讨论的参考文献。在一些实施方案中，肿瘤细胞来自例如胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽喉的癌症、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、和血液组织的癌症。
在一些实施方案中，抗-GITR抗体或抗原结合分子与细胞毒性剂共同配制。例如，抗-GITR抗体或抗原结合分子与结合并减少或耗尽CD4+CD25+调节T细胞(Treg)的激动剂抗体或抗原结合分子共同配制。示例性Treg细胞耗竭性抗体或抗原结合分子结合CD25或CCR4。参见Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575，以及其中讨论的参考文献。
在一些实施方案中，将抗-GITR抗体或抗原结合分子与共抑制信号的抑制剂共同配制。示例性抑制剂包括CTLA-4的抑制剂和PD-1/PD-L1(例如，B7-B1)相互作用的抑制剂。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制CTLA-4的抗体共同配制。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制TIM3的抗体共同配制。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制LAG3的抗体共同配制。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制PD-1的抗体共同配制。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制B7-H1的抗体共同配制。参见，例如，Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575；和Melero等，Clin CancerRes(2009)15(5):1507-1509，和其中讨论的参考文献。在某些实施方案中，制剂包含包括抗-GITR抗体或抗原结合分子和共抑制信号的抑制剂的双特异性分子。在一些实施方案中，制剂包含包括抗-GITR抗体或抗原结合分子和CTLA4的抑制剂的双特异性分子。在一些实施方案中，制剂包含包括抗-GITR抗体或抗原结合分子和TIM3的抑制剂的双特异性分子。在一些实施方案中，制剂包含包括抗-GITR抗体或抗原结合分子和LAG3的抑制剂的双特异性分子。在一些实施方案中，制剂包含包括抗-GITR抗体或抗原结合分子和PD-1/PD-L1的抑制剂的双特异性分子。在一些实施方案中，制剂包含包括抗-GITR抗体或抗原结合分子和抑制剂B7H1的双特异性分子。
PD-1抑制剂
在一些实施方案中，将GITR激动剂与PD-1抑制剂组合使用，例如，如WO2015/026684中描述的PD-1抑制剂。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是选自Nivolumab、Pembrolizumab或Pidilizumab的抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是Nivolumab。Nivolumab的替代名包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是Nivolumab(CAS注册号：946414-94-4)。Nivolumab是完全人IgG4单克隆抗体，其特异性阻断PD1。Nivolumab(克隆5C4)和特异性结合PD1的其他人单克隆抗体公开于US 8,008,449和WO2006/121168。在一个实施方案中，PD-1的抑制剂是Nivolumab，并且具有其中公开的序列(或与该具体序列基本上相同或相似的序列，例如，至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是Pembrolizumab。Pembrolizumab(也称为Lambrolizumab、MK-3475、MK03475、SCH-900475或Merck)是结合PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。Pembrolizumab和其他人源化抗PD-1抗体公开于Hamid，O.等，(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134–44，US 8,354,509和WO2009/114335。
在一个实施方案中，PD-1的抑制剂是公开于例如US 8,354,509和WO 2009/114335中的Pembrolizumab，并具有其中公开的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如，与该指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是Pidilizumab。Pidilizumab(CT-011；CureTech)是结合PD1的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD-1单克隆抗体公开于WO2009/101611。其他抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)，以及例如，US 8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，公开于WO2010/027827和WO2011/066342中)，其是阻断PD-1和B7-H1之间的相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。
在一个实施方案中，组合包括抗-GITR抗体分子，例如，本文中所述的，和抗PD-1抗体，例如WO 2015/112900中公开的并且具有其中公开的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如，与指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)的抗PD-1抗体。
PD-L1或PD-L2抑制剂
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是抗体分子。在一些实施方案中，抗PD-L1抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是MSB0010718C。MSB0010718C(也称为A09-246-2；Merck Serono)是结合PD-L1的单克隆抗体。Pembrolizumab和其他人源化抗PD-L1抗体公开于WO2013/079174，并且具有其中公开的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如，与指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是YW243.55.S70。YW243.55.S70抗体是WO 2010/077634中公开的抗PD-L1(重链和轻链可变区分别显示在SEQ ID NO.20和21中)，并且具有其中公开的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如，与指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是MDX-1105。MDX-1105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中描述的抗PD-L1抗体，并且具有其中公开的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如，与指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是MDPL3280A(Genentech/Roche)。MDPL3280A是结合PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和其他的人单克隆PD-L1抗体公开于美国专利No.:7,943,743和美国公开No.:20120039906中。
在其他实施方案中，PD-L2抑制剂是AMP-224。AMP-224是阻断PD1和B7-H1之间的相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体(B7-DCIg；Amplimmune；例如，公开于WO2010/027827和WO2011/066342)。
LAG-3抑制剂
在一个实施方案中，本文中所述的组合包括LAG-3抑制剂。在一些实施方案中，将组合用于治疗癌症，例如，本文中所述的癌症，例如，实体肿瘤或血液学恶性疾病。在一些实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。BMS-986016(也称为BMS986016；Bristol-MyersSquibb)是结合LAG-3的单克隆抗体。BMS-986016和其他人源化抗LAG-3抗体公开于US2011/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218。在一些实施方案中，抗LAG-3抗体是WO2015/138920中公开的人源化抗LAG3抗体。
TIM-3抑制剂
在一个实施方案中，本文中所述的组合包括TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，将组合用于治疗癌症，例如，本文中所述的癌症，例如，实体肿瘤或血液学恶性疾病。示例性抗TIM-3抗体公开于美国专利No.:8,552,156、WO 2011/155607、EP 2581113和U.S公开No.:2014/044728中。在一些实施方案中，抗-TIM3是WO2015/117002中公开的人源化ABTIM3mAb。
CTLA-4抑制剂
在一个实施方案中，本文中描述的组合包括CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，将组合用于治疗癌症，例如，本文中所述的癌症，例如，实体肿瘤或血液学恶性疾病。
示例性抗-CTLA4抗体包括Tremelimumab(获自Pfizer的IgG2单克隆抗体，之前称为ticilimumab，CP-675,206)；和Ipilimumab(CTLA-4抗体，也称为MDX-010，CASNo.477202-00-9)。其他示例性抗CTLA-4抗体公开于例如美国专利No.5,811,097。
抗-GITR抗体或抗原结合分子也可以与一种或多种免疫刺激剂共同配制。例如，在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与免疫刺激性细胞因子共同配制，例如，IL-7、IL-12或IL-15。或者，抗-GITR抗体或抗原结合分子可以与第二免疫刺激性抗体共同配制。例如，抗-GITR抗体或抗原结合分子也可以与另一肿瘤坏死因子受体超家族成员的激动剂抗体或抗原结合分子共同配制。示例性的第二免疫刺激性靶包括不限于TNFRSF4肿瘤坏死因子受体超家族成员4(也称为OX40)或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(也称为TNFRSF9、4-1BB或CD137)。参见，例如，Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575；Pardee等，Immunotherapy(2009)1(2):249-264；和Melero等，Clin Cancer Res(2009)15(5):1507-1509，和其中讨论的参考文献。
抗-GITR抗体或抗原结合分子也可以与化疗剂共同配制。选择的药剂将取决于待治疗的病症，例如，癌症或感染性疾病，如细菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生物感染。抗-GITR抗体或抗原结合分子可以与本领域技术人员已知用于治疗待治疗病症的化学治疗剂共同配制。化学治疗剂，如，用于治疗癌症和感染性疾病的化学治疗剂，是本领域已知的，并且描述于例如Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第11版，Brunton,Lazo和d Parker编辑，McGraw-Hill(2006)；2010Physicians’DeskReference(PDR)，第64版，Thomson PDR。
在一些实施方案中，抗-GITR抗体或抗原结合分子可以与抗肿瘤剂共同配制。可以用于与抗-GITR抗体混合在组合物中的示例性抗肿瘤剂包括烷化剂(例如，氮芥、乙撑亚胺和甲基蜜胺、甲肼衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯(triazene)和铂配位复合物)；抗代谢物(例如，叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物)；天然产物(例如，长春花生物碱、紫杉烷、表鬼臼毒素、喜树碱、抗生素和蒽二酮)。在一些实施方案中，抗-GITR抗体或抗原结合分子与抗代谢物抗肿瘤剂共同配制，例如，叶酸类似物(例如，氨甲喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、曲美沙特(trimetrexate))、嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、阿胞糖苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤类似物(例如，巯基嘌呤(mercaptopurine)、喷司他丁(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、氟达拉滨(fludarabine))，或其混合物。在一些实施方案中，抗-GITR抗体或抗原结合分子与烷化剂抗肿瘤剂共同配制，例如，氮芥(nitrogenmustards)(例如，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil))、乙撑亚胺(ethyleneimines)(例如，六甲蜜胺(altretamine))和甲基蜜胺(methylmelamines)(例如，噻替派(thiotepa))、甲肼衍生物(methylhydrazine derivatives)(例如，甲基苄肼(procarbazine))、烷基磺酸盐(例如，白消安(busulfan))、亚硝基脲(例如，卡氮芥(carmustine)、链脲佐菌素(streptozocin))、三氮烯(例如，达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide))和铂配位复合物(例如，顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin))。
在一些实施方案中，抗-GITR抗体或抗原结合分子可以与抗病毒剂共同配制。示例性抗病毒剂包括不限于抗疱疹病毒剂(例如，无环鸟苷(acyclovir)、西多福韦(cidofovir)、泛昔洛韦(famciclovir)、佛斯卡耐特(foscarnet)、thiovir、福米韦生(fomivirsen)、更昔洛韦(ganciclovir)、idoxuridine、喷昔洛韦(penciclovir)、三氟胸苷(trifluridine)、伐昔洛韦(valacyclovir)、valgenciclovir、瑞喹莫德(resiquimod))；抗流感剂(例如，金刚烷胺(amantadine)、奥司他韦(oseltamivir)、金刚乙胺(rimantadine)、扎那米韦(zanamivir)、帕拉米韦(peramivir)、E-118958)；抗肝炎剂(例如，阿德福韦酯(adeforvir dipivoxil)、干扰素-α、拉米夫定(lamivudine)、恩替卡韦(entecavir)、克莱夫定(clevudine)、恩曲他滨(emtricitabine)、替比夫定(telbivudine)、替诺福韦(tenofovir)、塔利韦林(viramidine)、BILN 2061、NM283)，和其他抗病毒剂(例如，病毒唑、咪喹莫特、马立巴韦、sICAM-1、pleconaril)。抗病毒剂可以是抗逆转录病毒剂。示例性抗逆转录病毒剂包括不限于齐多夫定(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、司他夫定(stavudine)、扎西他滨(zalcitabine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、tenofavir、恩去他滨(emtricitabine)、奈韦拉平(nevirapine)、依法韦仑(efavirenz)、地拉夫定(delavirdine)、沙奎那韦(saquinavir)、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、那非那韦(nelfinavir)、安泼那韦(amprenavir)、洛匹那韦(lopinavir)、阿扎那韦(atazanavir)、福沙那韦(fosamprenavir)和恩夫韦地(enfuvirtide)。
在一些实施方案中，抗-GITR抗体或抗原结合分子可以与抗细菌剂共同配制。示例性抗细菌剂包括不限于磺酰胺类(例如，氨苯磺胺(sulfanilamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲基异唑(sulfamethoxazole)、磺胺异唑(sulfisoxazole)、磺胺醋酰(sulfacetamide))、三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)、喹诺酮(quinolones)(例如，萘啶酮酸(nalidixic acid)、西诺沙星(cinoxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟罗沙星(fleroxacin)、perloxacin、左氧氟沙星(levofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)和吉米沙星(gemifloxacin))、六亚甲基四胺(methenamine)、硝基呋喃妥英(nitrofurantoin)、青霉素类(penicillins)(例如，青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicilin)、苯唑西林(oxacillin)、邻氯青霉素(cloxacillin)、双氯青霉素(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcilin)、氨苄青霉素(ampicillin)、羟氨苄青霉素(amoxicillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)和哌拉西林(piperacillin))、头孢菌素类(cephalosporins)(例如，头孢唑林(cefazolin)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢罗奇(cefprozil)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢呋辛酯(cefuroxime acetil)、洛拉卡比(loracarbef)、头孢替坦(cefotetan)、头孢雷特(ceforanide)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil)、头孢布烯(cefibuten)、头孢地尼(cefdinir)、头孢妥仑匹酯(cefditoren pivorxil)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢三嗪(ceftriaxone)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻甲羧肟(ceftazidime)和头孢吡肟(cefepine))、碳青霉烯类(carbapenems)(例如，亚胺培南(imipenem)、噻肟单胺菌素(aztreonam))，和氨基糖苷类(例如，新霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、toramycin、奈替米星(netilmicin)和阿米卡星(amikacin))。
在一些实施方案中，抗-GITR抗体或抗原结合分子可以与抗寄生物剂共同配制。示例性抗寄生物剂包括不限于抗疟疾剂(例如，喹啉类，包括氯喹(chloroquine)、甲氟喹(mefloquine)、奎宁(quinine)、奎尼丁(quinidine)和伯氨喹(primaquine)；二氨基嘧啶类，包括乙胺嘧啶(pyrimethamine)、磺胺多辛(sulfadoxine)，四环素类(tetracyclines)、阿托伐醌(atovaquone)和氯胍(proguanil))；抗原生动物剂，包括两性霉素(amphotericin)、氯喹(chloroquine)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、依米丁(emetine)、烟曲霉素(fumagillin)、8-羟基喹啉类(8-hydroxyquinolines)、硫肿蜜胺(melarsoprol)、灭滴灵(metronidazole)、米特福辛(miltefosine)、硝呋莫司(nifurtimox)、硝唑尼特(nitazoxanide)、巴龙霉素(paromomycin)、喷他脒(pentamidine)、葡萄糖酸锑钠(sodiumstibogluconate)和苏拉明(suramin)。
在一些实施方案中，抗-GITR抗体或抗原结合分子可以与抗真菌剂共同配制。示例性抗真菌剂包括不限于多烯类(polyenes)(例如，游霉素(natamycin)、龟裂霉素(rimocidin)、菲律宾菌素(filipin)、制霉菌素(nystatin)、两性霉素B(amphotericin B)、坎底辛(candicin)和哈霉素(hamycin))、咪唑类(例如，咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、联苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)、噻康唑(tioconazole))、三唑类(例如，氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、里氟康唑(ravuconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、伏立康唑(voriconazole)、特康唑(terconazole))、噻唑类(例如，阿巴芬净(abafungin))、烯丙胺类(allylamines)(例如，特比萘芬(terbinafine)、阿莫罗芬(amorolfine)、萘替芬(naftifine)、布替萘芬(butenafine))、棘白菌素类(echinocandins)(例如，阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin))、苯甲酸(benzoicacid)、环匹罗司(ciclopirox)、托萘酯(tolnaftate)、十一碳烯酸(undecylenicacid)、氟胞嘧啶(flucytosine)或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素(griseofulvin)、和卤丙炔氧苯(haloprogin)。
药盒
本发明的抗-GITR组合物可以提供于药盒中。抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子通常在小瓶或容器中。根据情况，抗体可以是液体或干燥(例如，冻干)形式。如本文中所述的，药盒可以包含本发明的抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子，并且任选还可以含有第二或第三药剂。在一些实施方案中，药盒含有本发明的抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子和药物学上可接受的稀释剂。抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子可以与第二或第三药剂在相同或分开制剂中(例如，作为混合物或在分开的容器中)提供于药盒中。药盒可以含有等份的抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子，以提供一个或多个剂量。如果提供用于多次施用的等份，剂量可以是均一的或不同的。根据情况，不同的剂量施用方案可以递增或递减。抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子的剂量和第二药剂可以独立地是均一或不同的。
在一些实施方案中，药盒进一步含有靶抗原。靶抗原，或疫苗，将取决于待治疗的病况。例如，靶抗原可以来自肿瘤细胞、细菌细胞、真菌、寄生物或病毒。根据情况，靶抗原可以是肽、多肽、细胞、多核苷酸(例如，裸露的质粒或病毒载体)的形式。在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤相关抗原。本文中讨论了示例性靶抗原；也可以使用本领域中已知的其他靶抗原。
在一些实施方案中，药盒进一步含有细胞毒性剂。例如，药盒可以含有结合并减少或耗尽CD4+CD25+调节T细胞(Treg)的激动剂抗体或抗原结合分子。示例性Treg细胞耗竭性抗体或抗原结合分子结合CD25或CCR4。参见，Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575，以及其中讨论的参考文献。
在一些实施方案中，药盒进一步含有共抑制信号的抑制剂。示例性抑制剂包括CTLA-4、LAG3、TIM3的抑制剂，和/或PD-1/PD-L1(例如，B7-H1)相互作用的抑制剂。在一些实施方案中，药盒进一步含有结合并抑制CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，药盒进一步含有结合并抑制LAG3的抗体。在一些实施方案中，药盒进一步含有结合并抑制TIM3的抗体。在一些实施方案中，药盒进一步含有结合并抑制PD-1的抗体。在一些实施方案中，药盒进一步含有结合并抑制B7-H1的抗体。参见，例如，Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575；and Melero,et al.,Clin Cancer Res(2009)15(5):1507-1509，以及其中讨论的参考文献。
在一些实施方案中，药盒进一步含有一种或多种免疫刺激剂。例如，在一些实施方案中，药盒含有免疫刺激性细胞因子，例如，IL-7、IL-12或IL-15。或者，药盒可以含有第二免疫刺激性抗体。例如，药盒可以含有另一肿瘤坏死因子受体超家族成员的激动剂抗体或抗原结合分子。示例性第二免疫刺激靶包括不限于TNFRSF4肿瘤坏死因子受体超家族成员4(也称为OX40)或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(也称为TNFRSF9，4-1BB或CD137)。参见，例如，Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575；Pardee,et al,Immunotherapy(2009)1(2):249-264；和Melero等，Clin Cancer Res(2009)15(5):1507-1509，以及其中讨论的参考文献。
在一些实施方案中，药盒进一步含有化学治疗剂。选定的药剂将取决于待治疗的病症，例如，癌症或感染性疾病，如细菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生物感染。示例性化学治疗剂包括本领域已知和本文中描述的任何抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗寄生物和抗真菌剂。
增强T细胞应答的方法
接受治疗或预防的病症
本发明的抗-GITR激动剂抗体和抗体片段可以用于在有需要的患者中提高CD4+T辅助细胞应答和CD8+细胞溶解性T细胞应答。因此，抗体可以用于增强或提高患者的T细胞应答，例如，以实现对可通过增强或提升免疫应答而抵抗的疾病的减轻、逆转、抑制或预防。在一个方面中，本发明提供了在有需要的个体中增强T细胞应答的方法，包括将治疗有效量的本发明的抗-GITR激动剂抗体或抗体片段施用于个体。在一个方面中，本发明还提供了用于增强个体中的T细胞应答的抗-GITR激动剂抗体或抗体片段。在进一步的方面中，本发明提供了包含这样的抗体或抗体片段的组合物，用于增强个体中的T细胞应答。
接受治疗的病症包括癌症和感染性疾病。对于治疗目的，患者可以患有癌症或肿瘤或感染性疾病，例如，细菌、病毒、真菌或寄生物感染。对于预防目的，患者可以处于癌症缓解中或可能预期会暴露于细菌、病毒、真菌或寄生物感染。抗体还可以用作佐剂来增强或促进或加强对抗主要抗原或靶抗原(例如，疫苗)的免疫应答。
在一些实施方案中，患者患有癌症、怀疑患有癌症或处于癌症缓解中。如本文中所述的，接受用抗-GITR抗体治疗的癌症通常表达肿瘤相关抗原(TAA)。接受治疗的癌症包括，不限于，上皮癌或癌瘤，以及肉瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、卵巢癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌、神经胶质瘤、纤维肉瘤。参见，例如，Pardee等，Immunotherapy(2009)1(2):249-264，以及其中讨论的参考文献。在一些实施方案中，肿瘤类型选自：胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽喉的癌症、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织的癌症、和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
在一个方面中，本发明提供了治疗有需要的个体中表达肿瘤相关抗原的癌症的肿瘤生长的方法，包括将治疗有效量的本发明的抗-GITR激动剂抗体或抗体片段施用于个体，如本文中所述的。本发明还提供了本发明的抗-GITR激动剂抗体或抗体片段，用于治疗个体中表达肿瘤相关抗原的癌症的肿瘤生长。本发明进一步提供了包含本发明的抗体或抗体片段的组合物，用于减轻、抑制或预防个体中表达肿瘤相关抗原的癌症的肿瘤生长。
在一些实施方案中，用于促进个体中的癌症的诊断或预后的方法，包括使用本发明的抗-GITR激动剂抗体或抗体片段，用于检测个体中肿瘤中或周围的GITR的表达。
在一些实施方案中，患者患有感染性疾病，例如，细菌、病毒、真菌或寄生物感染。抗-GITR激动剂抗体可以用于减少、抑制和/或预防寄生物例如丝虫病和利什曼病。
在一些实施方案中，抗-GITR激动剂抗体可以用于治疗病毒感染，所述病毒感染包括不限于肝炎病毒感染，例如，慢性丙肝(HCV)感染、单纯疱疹病毒(HSV)感染或人免疫缺陷病毒(HIV)感染。在一些实施方案中，抗-GITR激动剂抗体可以用于治疗病毒感染，所述病毒感染选自：甲肝、乙肝、丙肝、流感、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹病毒(HSV I)、II型单纯疱疹(HSV II)、牛痘、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、echinovirus、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV I)和II型人免疫缺陷病毒(HIV II)、任何小核糖核酸病毒科病毒、肠病毒、诺沃克病毒组中的任何一种病毒、披膜病毒，如甲病毒、黄病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠弧病毒、轮状病毒、环状病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒、猴免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、细小病毒、EB病毒、人疱疹病毒6、猿猴疱疹病毒1(B病毒)和痘病毒。
在一些实施方案中，抗-GITR激动剂抗体可以用于治疗细菌感染，包括但不限于如下细菌感染：奈瑟氏菌属(Neisseria spp)、链球菌属(Streptococcus spp)、变形链球菌(S.mutans)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、莫拉氏菌属(Moraxella spp)、博德特氏菌属(Bordetella spp)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp)、军团菌属(Legionella spp)、埃希氏菌属(Escherichia spp)、弧菌属(Vibrio spp)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp)、弯曲菌属(Campylobacter spp)、沙门氏菌属(Salmonella spp)、李斯特氏菌属(Listeriaspp.)、螺杆菌属(Helicobacter spp)、假单胞菌属(Pseudomonas spp)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp)、梭菌属(Clostridium spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、疏螺旋体属(Borreliaspp.)、埃里希氏体属(Ehrlichia spp)、立克次氏体属(Rickettsia spp)、衣原体属(Chlamydia spp.)、钩端螺旋体属(Leptospira spp.)、密螺旋体属(Treponema spp)。
抗-GITR抗体的施用
医生或兽医可以以低于实现所需治疗效果所要求的水平施用药物组合物中的本发明抗体或抗体片段的开始剂量，并且逐渐提高剂量，直至实现所需效果。通常，本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而改变，所述因素包括待治疗的特定疾病或病症、施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人或动物、施用的其他药物、和治疗是预防性的或是治疗性的。治疗剂量需要滴定，以优化安全性和功效。对于抗体施用，剂量范围为约0.0001至100mg/kg宿主体重，并且更常见地为0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。按照需要或期望的，剂量施用可以以每天、每周、每两周、每月、或更高或更低的频率进行。一个示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次或每月一次、或每3至6个月一次施用。
在一些实施方案中，施用编码本发明的抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子的多核苷酸。在药剂是核酸的实施方案中，典型的剂量范围可以为约0.1mg/kg体重至高达并包括约100mg/kg体重，例如，约1mg/kg体重至约50mg/kg体重。在一些实施方案中，约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50mg/kg体重。
抗体或抗体片段可以单剂或分剂量施用。抗体或抗体片段通常多次施用。按照需要或期望的，单次剂量之间的间隔可以为每周、每两周、每月或每年。如通过测量患者的抗-GITR抗体或抗体片段的血液水平所指示的，间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调节剂量来实现1-1000μg/ml的血浆抗体或抗体片段浓度，并且在一些方法中，为25-300μg/ml。或者，抗体或抗体片段可以作为持续释放制剂来施用，在该情况中，需要较少频率的施用。剂量和频率可以根据抗体或抗体片段在患者中的半衰期来改变。通常，人源化抗体显示出比嵌合抗体和非人抗体长的半衰期。剂量和施用频率可以根据治疗是预防性的或是治疗性的来改变。在预防性应用中，在长时间段中，以相对不太频繁的间隔，施用相对低的剂量。一些患者在剩余的生命中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直至疾病进展得到减慢或终止，并且优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以给予患者预防性方案。
与第二药剂的共施用
在一些实施方案中，将抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子与第二或第三药剂共施用。抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子和第二或第三药剂可以作为混合物或在分开的制剂中施用。抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子和第二或第三药剂可以同时或相继施用。根据需要，抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子和第二或第三药剂可以经由相同的施用途径或经由不同的施用途径来施用。用于与本发明的抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子共施用的示例性第二药剂和第三药剂包括，不限于，主要或靶抗原、提高肿瘤细胞的免疫原性的药剂、抑制或遏制共抑制信号的药剂。抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子也可以与能用于治疗待治疗疾病状况的化学治疗剂共施用，例如，以增强化学治疗剂的功效或进一步增强对抗靶抗原的免疫应答。抗-GITR激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子还可以，与已建立的用于治疗该指定的疾病状况的疗法例如放疗或手术，组合用于治疗中。
本发明的抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子可以与主要或靶抗原共施用。靶原抗或疫苗将取决于待治疗的疾病状况。例如，靶抗原可以来自肿瘤细胞、细菌细胞、真菌、病毒或寄生物。根据需要，靶抗原可以是肽、多肽、细胞或多核苷酸的形式。
在一些实施方案中，将抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子与来自病毒的靶抗原共施用，所述病毒例如选自：甲肝、乙肝、丙肝、流感、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹病毒(HSVI)、II型单纯疱疹病毒(HSV II)、牛痘、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、echinovirus、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV I)和II型人免疫缺陷病毒(HIV II)、任何小核糖核酸病毒科病毒、肠病毒、杯状病毒科、诺沃克病毒组中的任何一种病毒、披膜病毒，如甲病毒、黄病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠弧病毒、轮状病毒、环状病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒、猴免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、细小病毒、EB病毒、人疱疹病毒6、猿猴疱疹病毒1(B病毒)和痘病毒。
在一些实施方案中，抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子与来自细菌的靶抗原共施用，所述细菌例如选自：奈瑟氏菌属(Neisseria spp)、链球菌属(Streptococcusspp)、变形链球菌(S.mutans)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、莫拉氏菌属(Moraxellaspp)、博德特氏菌属(Bordetella spp)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp)、军团菌属(Legionella spp)、埃希氏菌属(Escherichia spp)、弧菌属(Vibrio spp)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp)、弯曲菌属(Campylobacter spp)、沙门氏菌属(Salmonella spp)、李斯特氏菌属(Listeria spp.)、螺杆菌属(Helicobacter spp)、假单胞菌属(Pseudomonas spp)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp)、梭菌属(Clostridiumspp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、疏螺旋体属(Borrelia spp.)、埃里希氏体属(Ehrlichia spp)、立克次氏体属(Rickettsia spp)、衣原体属(Chlamydia spp.)、钩端螺旋体属(Leptospira spp.)、密螺旋体属(Treponema spp)。
在一些实施方案中，抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子与肿瘤相关抗原(TAA)共施用。TAA可以是分离的多肽或肽，可以是完整细胞的一部分或肿瘤细胞裂解物的一部分。示例性TAA如以上所讨论的；也可以使用本领域已知的其他TAA。
在一些实施方案中，将抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子与来自患者的自体肿瘤细胞、或与来自另一位患者的相同组织类型的同种异体肿瘤细胞，共施用。肿瘤细胞可以是完整细胞、肿瘤细胞裂解物、凋亡的肿瘤细胞或肿瘤总mRNA的形式。可以转染肿瘤细胞以表达增强或提高肿瘤细胞在患者中的免疫原性的多肽，例如，转染以表达粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)。肿瘤细胞可以来自任何癌组织，包括不限于，上皮癌或癌瘤，以及肉瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、卵巢癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌、神经胶质瘤或纤维肉瘤。参见，例如，Pardee等，Immunotherapy(2009)1(2):249-264，以及其中讨论的参考文献。在一个实施方案中，肿瘤细胞来自例如胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽喉的癌症、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织的癌症、和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
在一些实施方案中，将抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子与细胞毒性剂共施用。例如，将抗-GITR抗体或抗原结合分子与结合并减少或耗竭CD4+CD25+调节T细胞(Treg)的激动剂抗体或抗原结合分子共施用。示例性Treg细胞耗竭性抗体或抗原结合分子结合CD25或CCR4。参见Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575，以及其中讨论的参考文献。
在一些实施方案中，将抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子与共抑制信号的抑制剂共施用。示例性抑制剂包括CTLA-4、LAG3、TIM3的抑制剂和/或PD-1/PD-L1(例如，B7-H1)相互作用的抑制剂。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制CTLA-4的抗体共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制TIM3的抗体共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制LAG3的抗体共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制PD-1的抗体共施用。在一些实施方案中，将抗-GITR抗体与结合并抑制B7-H1的抗体共施用。参见，例如，Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575；和Melero等，Clin Cancer Res(2009)15(5):1507-1509，和其中讨论的参考文献。
抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子还可以与一种或多种免疫刺激剂共施用。例如，在一些实施方案中，将抗-GITR抗体或抗体片段与免疫刺激性细胞因子共施用，例如IL-7、IL-12或IL-15。或者，抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子可以与第二免疫刺激性抗体共施用。例如，抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子也可以与另一肿瘤坏死因子受体超家族成员的激动剂抗体、抗体片段或抗原结合分子共施用。示例性的第二免疫刺激靶包括不限于TNFRSF4肿瘤坏死因子受体超家族成员4(也称为OX40)或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(也称为TNFRSF9、4-1BB或CD137)。参见，例如，Expert Opin Ther Patents(2007)17(5):567-575；Pardee等，Immunotherapy(2009)1(2):249-264；和Melero等，ClinCancer Res(2009)15(5):1507-1509，和其中讨论的参考文献。
抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子还可以与化学治疗剂共施用。选择的药剂将取决于待治疗的病症，例如，癌症或感染性疾病，如细菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生物感染。抗-GITR抗体、抗体片段或抗原结合分子可以与本领域技术人员已知的用于治疗待治疗病症的化学治疗剂共施用。示例性化学治疗剂在上面进行了讨论；也可以使用本领域已知的其他化学治疗剂。
附图简述
图1A-D举例说明，本发明的GITR mAb的表位作图。图1A描绘了，使用Fc-GITR融合物(上面和中间的迹线)和HIS-GITR(下面的迹线)融合蛋白和MAB1亲本Ab，氢/氘交换偶联质谱(HDXMS)的结果。编号反映天然GITR信号肽(AA 1-26)序列的去除。图1B描绘，使用人GITR的胞外结构域(hGITR ECD)制备的N-末端缺失构建体的示意图。图1C描绘，MAB4和MAB5与hGITR ECD构建体结合的结果。来自人GITR(hGITR)胞外结构域(ECD)的富半胱氨酸结构域1(CRD1)的N-端缺失，可以消除MAB4和MAB5与hGITR的结合。对于MAB7，获得了相似的结果(数据未显示)。图1D描绘了丙氨酸扫描诱变的结果。除了GITR突变体E78A外，MAB7结合所有其它突变蛋白。进行了ForteBioTM结合分析，并且结果也证实了MAB7丧失与hGITRE78A突变蛋白的结合(数据未显示)。结果说明，GITR中包括CRD1和包括E78的ECD的区域(SEQ ID NO:88：RPTGGPGCGPGRL LGTGTDAR CCRVHTTRCCRDYPG EECCSEWDCM CVQPEFHCGD)是涉及结合MAB1和MAB7(亲本mAb)的区域和潜在表位。
图2A-2E描绘了抗-GITR MAB抗体的结合实验的结果。图2A和2B说明了，如通过ELISA试验测定的，MAB4和MAB5与来自人和猕猴(2A)的GITR特异性结合，但不与来自啮齿动物(2B)的GITR结合。图2C说明，通过ELISA试验，MAB7具有结合人和猕猴GITR但不结合小鼠GITR的相似结合谱。图2D说明，通过FACS竞争分析测定，MAB7竞争GITR-配体结合。图2E说明了ELISA试验的结果，显示出本发明的抗-GITR抗体(例如，MAB4、MAB5)不结合TNF受体超家族(TNFRSF)的其他成员。ProtagenTM芯片试验还证实了这些抗体不结合其他脱靶蛋白(未显示)。
图3A-3D描绘了经工程化表达GITR的293细胞中的胞内信号传输。图3A说明，重组人GITR配体(GITR-L)激活经稳定转染而超表达人GITR的293细胞中的胞内信号传输。图3B说明，抗体交联时，单克隆抗体MAB4和MAB5激活经转染而超表达人GITR的293细胞中的胞内信号传输，激活程度与GITR-L相当(GITRL的EC50为约65nM，相对地在交联剂存在下激动剂抗体的EC50为约2.5nM)。图3C说明，交联的MAB抗体激活细胞中的胞内信号传输，因为MAB7和MAB8也以相似于交联MAB4的方式促进稳定转染了人GITR和NFκB-萤光素酶报告基因的293细胞中的NFκB激活。图3D说明，交联的MAB4和MAB5促进已经稳定转染了猕猴GITR和NFκB-萤光素酶报告基因的293细胞中的NFκB激活。用交联的MAB7看到了相似的激活(数据未显示)。
图4A-4C描绘了MAB7对T细胞的体外共刺激活性依赖于T细胞的激活。将抗-CD3(OKT3)、抗-CD28(CD28.2)和抗-GITR mAb在珠子上交联(以1:1:3的比例)，随后与PBMC孵育。图4A说明，MAB7是CD4+ T细胞的共激活剂，并刺激CD4+ T细胞中的T细胞增殖。图4B说明，MAB7是CD8+ T细胞的共激活剂，并且刺激CD8+ T细胞中的T细胞增殖。图4C说明细胞因子的产生，例如，与MAB7协同，TCR结合后IFNγ的产生被提高。对于MAB4和5，看到了相似的结果(数据未显示)。
图5A-D说明，在以不同水平表达GITR的细胞中MAB7的体外ADCC活性。图5A、图5B、图5C和图5D各自描绘了在不同GITR表达水平下使用对照或MAB7抗体的ADCC活性结果。MAB7能够诱导通过FcgRIIIa的信号传输，在GITR信号传输水平提高时活性提高。
图6A-6D说明，GITR在hGITR-hGITRL敲入(knock-in)小鼠中是功能性的。从hGITR-hGITRL敲入小鼠分离脾细胞并在未刺激或用aCD3和aCD8抗体刺激下培养48小时，然后用不同浓度的对照或MAB7脉冲30分钟，然后固定并用荧光团缀合的抗体染色，并通过流式细胞术分析。图6A描绘的结果显示,hGITR的表达在受刺激的CD8+ T细胞上被上调。图6B描绘了通过hFc染色获得的抗hGITR抗体结合T细胞的结果，表明MAB7可以结合小鼠CD8+ T细胞上表达的hGITR。图6C和6D描绘了，如通过胞内pIKK染色(6C)和T细胞激活(6D)所示的，MAB7和受刺激的CD8+ T细胞的结合与提高的T细胞激活相关。＊p<0.05，＊p<0.005。
图7A-7C说明，MAB7在体内是功能性的。用单剂运载体(vehicle)(n＝8/时间点)或MAB7(n＝10/时间点)抗体，处理带有建立的Colon26肿瘤的hGITR-hGITRL双敲入小鼠。图7A描绘每周两次的肿瘤测量结果和使用公式(LxW2)/2计算的肿瘤体积。所示的数据来自十五(15)日时间点组。图7B和7C描绘了来自全血的结果，而图7C和7D描绘了，在施用后3天，针对免疫细胞上细胞表面的hGITR表达，通过流式细胞术收集和分析的来自肿瘤的结果。(＊p<0.05，＊＊＊＊p<0.00005)。
图8A-8E说明，MAB7在体内引发对Colon26肿瘤的抗肿瘤免疫应答。用单剂量的运载体(n＝8/时间点)或MAB7(n＝10/时间点)处理带有建立的Colon26肿瘤的hGITR-hGITRL双敲入小鼠。图8A描绘了施用后3天T调节细胞的结果。图8B-8C描绘，施用后15天，在肿瘤中给予治疗水平后，肿瘤部位中存在的淋巴细胞(8B)和激活的CD8+ T细胞(8C)的结果。细胞的绝对数量相对于肿瘤大小进行标化，以说明运载体和MAB7处理组之间在肿瘤大小上的显著差异。图8D描绘，如通过肿瘤内总的激活CD8+ T细胞与CD4+ FOXP3+ Tregs相比而产生Teff/Treg比例来确定的，在处理动物中获得的Teff/Treg比例。图8E描绘离体脾细胞试验的结果，其中将纯化的CD8+ T细胞与Colon26肿瘤细胞离体孵育，并使用IFNg ELISPOT试验测量CTL。(＊p<0.05，＊＊＊p<0.0005)。
图9A-9C说明，用小鼠替代物GITR抗体DTA-1处理后，在Colon26肿瘤以及脾中在CD8+ T细胞上PD-1表达上调。2剂DTA-1后，通过流式细胞术分析整个肿瘤或整个脾的单细胞悬浮液。图9A描绘了PD-1阳性细胞的结果，评价为总的CD19-CD3+CD8+ T细胞的百分比。图9B通过每mm3体积肿瘤的PD-1+CD19-CD3+CD8+ T细胞的绝对数量，描绘了相对于肿瘤大小进行标化后的PD-1阳性细胞结果。图9C描绘，用DTA-1处理后，在带有Colon26肿瘤的小鼠脾中CD8+ T细胞上PD-1表达上调的结果。以总的CD19-CD3+CD8+ T细胞的百分比来评价PD-1阳性细胞。(＊p<0.05，＊＊＊＊p<0.00005)。
图10说明了与同种型对照相比，抗-GITR和抗PD-1组合赋予存活优势。描绘了与同种型对照相比，用抗GITR(IgG2a-DTA-1)和抗PD-1(RMPI-14)单独或组合处理的Colon26小鼠模型中的结果。
图11说明了，与同种型对照Ab处理相比，在带有建立的Colon26肿瘤的小鼠中，用抗-GITR、抗PD-1和抗-GITR/抗PD-1组合处理后，LAG3(第一栏)、TIM3(中间栏)和PD1(右栏)的表达。描绘了与同种型对照相比，用抗-GITR(IgG2a-DTA-1)和抗PD-1(RMP1-14)单独或组合处理的Colon26小鼠模型中的结果。上排显示了肿瘤样品中的结果，而下排描绘了脾样品中的结果。用a-GITR和a-PD1处理后，Colon26肿瘤中CD8+ T细胞上的LAG3、TIM3和PD1表达上调。用抗-GITR/抗PD-1组合处理后，Colon26肿瘤中CD8+ T细胞上的PD-1表达上调。
实施例
GITR激动剂抗体MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7和MAB8的形成
通过工程化小鼠单克隆GITR激动剂抗体MAB1，以与人种系抗体具有更高的序列同源性，产生了人抗体MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7和MAB8。MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7和MAB8保留了亲本小鼠抗体MAB1的表位特异性、亲和性和猕猴GITR交叉反应性。与初始的小鼠抗体相比，MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7和MAB8与人种系序列的同源性高得多，并且因此应当被人免疫系统更好地耐受。
使用通过KaloBios(South San Francisco,CA(在万维网kalobios.com上))可获得的技术平台，将小鼠单克隆MAB1工程化，使其蛋白质序列更接近于人种系序列并降低其免疫原性。抗体非常接近于具有V-区序列的人抗体，其与人种系序列具有高同源性，同时仍然保留了亲本或参照抗体的特异性和亲和性(美国专利公开2005/0255552和2006/0134098)。该方法首先鉴定参照Fab的重链和轻链可变区中的最小抗原结合特异性决定簇(BSD)(通常是重链CDR3和轻链CDR3内的序列)。因为这些重链和轻链BSD被保留在该过程中构建的所有文库中，因此每个文库都是表位聚焦的，并且所得到的抗体保留初始小鼠抗体的表位特异性。
接着，产生全链文库(其中用人序列文库替代完整的轻链或重链可变区)和/或盒文库(其中用人序列文库替代小鼠Fab的重链或轻链可变区的一部分)。细菌分泌系统用于将文库成员表达为抗体Fab片段，并且使用菌落转移结合试验(colony lift bindingassay,CLBA)，针对结合抗原的Fab来筛选文库。进一步表征阳性克隆来鉴定具有最高亲和性的那些。鉴定的在剩余小鼠序列中支持结合的人盒，在最终文库筛选中组合以产生完全的人V-区。
所得到的抗体Fab具有源自人文库的V-区段序列，保留了CDR3区域内鉴定的短BSD序列，并且具有人种系框架4区域。通过将重链和轻链的可变区克隆至IgG表达载体中，将这些Fab转化成完整IgG。在此方法中产生的抗体保留了亲本小鼠抗体的结合特异性，通常对抗原具有与亲本抗体相等或更高的亲和性，并且具有在蛋白水平上与人种系抗体基因相比具有高度序列同一性的V-区。
方法
小鼠抗GITR mAb MAB1的产生
使用称作多位点重复免疫(RIMMS)(McIntyre GD.Hybridoma 1997)的程序，用人GITR的N-端区(aa 26-161)免疫Bcl-2转基因小鼠(C57BL/6-Tgn(bc1-2)22wehi株)，接着从高滴定小鼠产生杂交瘤。使用抗hGITR的夹心ELISA鉴定和选择分泌MAB1的杂交瘤，并使用NKκB报告基因试验以证实hGITR结合和激动剂活性。
小鼠V-区的克隆
使用标准方法，从获自杂交瘤细胞系的RNA，通过RT-PCR扩增小鼠单克隆MAB1的可变区DNA。使用HV3(5’-GGGTCTAGACACCATGGCTGTCTTGG GGCTGCTCTTC-3’(SEQ ID NO:95))和HC恒定(5’-GCGTCTAGAAY CTCCACA CACAGGRRCC AGTGGAT AGAC-3’(SEQ ID NO:96))，从MAB1cDNA扩增重链可变区。使用LV3(5’-GGGTCTAGACACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA-3’(SEQ ID NO:97))和LC恒定(5’-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’(SEQ ID NO:19))，从相同cDNA扩增轻链可变区。将可变重链和轻链产物插入pcDNA3.1载体中，并验证序列。将重链和轻链载体用作PCR的模板，将用于克隆的限制酶位点并入KaloBios载体中：在NcoI(5’)和NheI(3’)将Vh克隆至KB1292-His中(KB1292修饰形式，编码在CH1上具有氨基酸序列AAGASHHHHHH(SEQ ID NO:13)的C-末端柔性衔接物和6-His标签(SEQ ID NO:11))；在NcoI(5’)和BsiWI(3’)将Vk克隆至KB1296中。随后通过用BssHII和ClaI限制消化并连接，将这些分开的重链和轻链载体组合至单个双顺反子KaloBiosFab表达载体中。在大肠杆菌中从这个载体表达Fab片段。针对hGITR-抗原结合，测试了该Fab，并且称为MAB1rFab。
Fab纯化
使用KaloBios表达载体，通过从大肠杆菌分泌，表达Fab片段。将细胞生长于2×YT培养基中，至～0.6的OD500。通过添加IPTG至100μM来诱导表达并在33℃振荡4小时。根据标准方法，通过渗透压裂解，从周质级分获得装配的Fab，并使用Ni-NTA柱(HisTrap HP柱；GEHealthcare目录号#17-5247-01)，通过亲和性色谱纯化。将Fab在含有500mM咪唑的缓冲液中洗脱并相对不含钙和镁的PBS pH7.4彻底透析。
文库构建
为了限制复杂性以鉴定在人GITR结合中支持BSD-FR4的互补人CDR，采取了盒文库方法，其中只有部分亲本小鼠V-区段由人序列文库替代。初始小鼠MAB1Vk最接近人种系VkIII，因此在制备Vk盒文库中使用了含有VkIII种系的两个KaloBios文库(KB1423和KB1424)的混合物。将含有VH3种系的KaloBios文库(KB1413，KB1414)用于构建Vh盒文库。通过重叠PCR构建了两个类型的盒：在FR1、CDR1和FR2中含有人序列的前端盒(8C1VK3FE-01和MAB1VH3FE-01)，和在FR3中含有人序列的FR3盒(MAB1VK3FR3-01和MAB1VH3FR3-01)，使用上述种系限制的KaloBios文库，进行扩增。每个Vh盒文库在NcoI(5’)和KpnI(3’)处克隆至载体KB1292-His中；每个Vk盒文库在NcoI(5’)和HindIII(3’)处克隆至载体KB1296-B(KaloBios载体KB1296的修饰形式，其具有在FR4中添加的沉默HindIII位点)。然后通过用BssHII和ClaI消化并随后连接以形成表达完整Fab的双顺反子载体文库，将得到的Vh或Vk质粒文库与来自优化的参照Fab的互补链组合(MAB1opVK或MAB1opVH(例如，将Vh前端文库与优化的参照Vk载体组合))。
没有以高亲和性结合人GITR的VH3前端克隆，因此，构建了第二个VH3前端文库(MAB1VH3FE-02)。文库在FR1和FR2中含有人序列，并含有在全部位置编码亲本小鼠残基或选定的人种系残基的一系列CDR2。该文库的FR3区序列来自选自VH3FR3文库(MAB1VH3FR3-01)的六个克隆。
通过组合来自VK前端文库和VKFR3盒文库的克隆与在全部位置编码亲本小鼠残基或选定的人种系残基的突变VK CDR2，构建了最终的Vk全长链文库(MAB1VK3FCL-01)。将得到的Vk全长链文库在NcoI和HindIII位点克隆至KB1296b中。将此VK全长链文库与选定的多个VH3FR3文库克隆配对，以允许CLBS表达并分泌功能性Fab。通过人GITR特异性ELISA，证实了抗原特异性克隆，并通过抗原亲和性滴定ELISA来排序。使用来自第二个VH3前端文库(MAB1VH3FE-02)的选定克隆，产生了VH3全长链文库(MAB1VH3FcL-01)，所述前端文库具有在所有位置含有亲本小鼠残基或人残基的一系列CDR2序列。将此VH全长链文库在NcoI和KpnI位点克隆至KB1292-his中。为了产生最终完整链人Fab表达文库，将选定的VK全长链克隆在BssHII和ClaI位点与VH全长链文库组合。
通用ELISA
将重组人GITR和人Fc融合蛋白(hGITR-hFc)用于全部的ELISA试验。通常，通过在4℃下过夜孵育，将PBS pH7.4中稀释的hGITR-hFc抗原以200ng/孔结合至96-孔微滴定平板。用PBST冲洗三次后，用PBS中的1％BSA溶液在37℃下封闭平板一小时，并随后用PBST冲洗一次。然后将含有Fab的细胞培养基、或稀释的纯化的Fab(50μL)加入各孔中。在37℃下孵育一小时或在4℃下过夜孵育后，用PBST冲洗平板三次。将PBST(50μL)中1:5000稀释的抗人κ链HRP缀合物(Sigma#A7164)加入各孔中，并且将平板在室温下孵育45min。用PBST将平板洗涤三次，然后将100μL SureBlue TMB底物(KPL#52-00-03)加入各孔中，并将平板在室温下孵育约10min。在分光光度计中在650nm下读取平板。
亲和性滴定ELISA
为了评价选定的Fab产生性克隆的抗原结合，开发了亲和性滴定ELISA。此试验结合了两个连续的ELISA步骤：第一个，使用山羊抗人Fab(Jackson ImmunoResearch Lab#109-005-097)捕获和山羊抗人κ(Sigma#A7164)检测，测量细胞培养基中的Fab浓度，以标准化第二个抗原滴定ELISA中使用的Fab的量；第二个ELISA(正常的抗原特异性ELISA)，使用相同量的起始Fab，产生抗原结合稀释曲线。通过比较不同克隆的稀释曲线，鉴定高亲和性克隆。
菌落转移结合ELISA(CLBA)
基本上按照所述的(美国专利公开2005/0255552和2006/0134098)，使用PBSpH7.4中以2.0μg/mL的hGITR-hFC包被的硝基纤维素滤膜，进行了Fab片段的抗体文库筛选。使用PBST中1:5000稀释的山羊抗人κ链HRP缀合物(Sigma#A7164)，检测了与抗原包被的滤膜结合的Fab，并且用ECL plus Western印迹检测系统(GE Healthcare#RPN2132)来产生印迹。
MAB4中的糖化位点的去除
通过用精氨酸替代赖氨酸，或通过用精氨酸替代赖氨酸并用天冬酰胺替代组氨酸，去除了MAB4重链的FR3与CDR3连接中的糖化位点“KH”。使用p50H质粒作为DNA模板，通过基于PCR的诱变，完成KH至RH和KH至RN的转换。反向引物(TCTGGCGCAGTAATACACGGCC，SEQ IDNO:110)并入精氨酸以替代赖氨酸；正向引物(NNKGCCTATGGCCATGATGGCG，SEQ ID NO:111)在组氨酸位点具有简并NNK三核苷酸。50μl反应体积中以100ng模板、每种引物各0.2μM、200μM dNTP和2.5U pfuUltraII DNA聚合酶(Strategene)，进行PCR反应。PCR条件为94℃，3分钟，1个循环；94℃15秒，52℃20秒，以及65℃5分钟，30个循环；最终，72℃5分钟，1个循环。将DpnI(2U)加入PCR反应中，并在37℃下孵育30分钟，以除去模板p50H。通过1％SYBR凝胶分离扩增的MAB4重链变体，并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。用T4DNA多核苷酸激酶处理凝胶纯化的PCR产物，连接并转化至DH5α化学感受态细胞(Invitrogen)中，置于氨苄青霉素选择下。
按照GoTaqClear实验方案(Promega)，使用正向引物(GCCTTTCTCTCCACAGG，SEQ IDNO:112)和反向引物(GGCAAACAACAGATGGCTGG，SEQ ID NO:113)，通过菌落PCR，选择了带有MAB7和MAB8重链的克隆。PCR条件为94℃3分钟，1个循环；94℃10秒，55℃30秒，72℃45秒，25次；以及最后，72℃5分钟，一个循环。通过用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶将样品在37℃孵育30分钟和80℃孵育15分钟，来清理PCR反应，用于测序。将PCR样品测序并使用CloneManager软件分析结果。
抗体生产和纯化
使用293fectin转染试剂(Invitrogen#51-0031)，根据制造商的实验方案，将如下载体共同转染至293Freestyle细胞中，生产了抗体MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7和MAB8(IgG1κ)。
MAB2–p35H+p35κ
MAB3–p38H+p38κ
MAB4–p50H+p35κ
MAB5–p51H+p35κ
MAB6–p56H+p35κ
MAB7–pMAB7H+p35κ
MAB8–pMAB8H+p35κ
使用5-mL HiTrap蛋白A HP柱(GE Healthcare#17-0403-03)，从293 Freestyle细胞上清液纯化抗体。使用IgG洗脱缓冲液(Pierce#21004)洗脱抗体，并通过透析将缓冲液交换为PBS。在AKTA-FPLC液相色谱系统(GE Healthcare)上进行了蛋白A亲和性色谱。
特异性ELISA
为了进行特异性ELISA，从表达TNFRSF家族成员的细菌制得粗制细胞裂解物。为了防止与平板的非特异性结合，每mL细菌裂解物加入50μL5％BSA。以每孔100μL裂解产物/BSA，用含有TNFRSF的细菌裂解物包被HisGrab镍96-孔板(Pierce#15142)，并在室温下孵育1小时。然后用PBST冲洗平板三次，然后将MAB在PBS中的10％FBS中稀释至0.5μg/mL，并将100μL加入每个孔中。将平板在室温下孵育1小时，并随后用PBST冲洗三次。将缀合HRP的抗人κ抗体(Sigma#A7164)在PBS中的1:1PBST:10％FBS中1:5000稀释，并将100μL加入每个孔中。将平板在室温下孵育1小时，并随后用PBST洗涤三次。将100μL SureBlue TMB底物加入每个孔中，并将平板在室温下孵育约10min，接着用100μL/孔的2N H2SO4停止反应。在分光光度计中在450nm下读取平板。
ELISA(GITR结合、物种交叉反应性、丙氨酸扫描)
用大鼠、小鼠、人或猕猴GITR胞外结构域(ECD)以每孔50ng包被384-孔平板，并在4℃孵育过夜；使用该平板评价MAB与来自不同物种、各种丙氨酸突变构建体的GITR或与GITR胞外结构域的结合。用PBS中的1％BSA溶液在室温下封闭平板一小时，并随后用PBST冲洗三次。然后将MAB在PBS中稀释至0.5μg/mL或1μg/mL，并将20μL加入每个孔中。将平板在室温下孵育1小时，并随后用PBST洗涤三次。将缀合HRP的抗人κ抗体(Sigma#A7164)、抗人γ抗体(Jackson Immunoresearch109-036-098)、山羊抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch115-035-071)在封闭缓冲液(25μL)中1:5000稀释，并加入每个孔中，或加入在封闭缓冲液中1:1000稀释的hrp缀合的HIS抗体(QIAGEN 1014992)。将平板在室温下孵育1小时，然后用PBST洗涤六次。将25μL SureBlue TMB(KPL 52-00-02)底物加入每个孔中，并将平板在室温下孵育约10min。在分光光度计中在650nm下读取平板。
细胞系，细胞
细胞系
为了产生293-hGITR-NFκB报告基因细胞系，用NFκB-萤光素酶报告基因和人GITR(或猕猴GITR)稳定地转染293细胞。通过与GITR-L或激动剂抗体孵育24小时后测量细胞内诱导的萤光素酶的水平，测定了这些细胞中GITR信号传输途径的激活。为了评价交联Ab的作用，在用于报告基因试验前，将其与过量的F(ab’)2山羊抗-人Fcγ片段特异性抗体或蛋白A一起孵育。
产生了表达在人免疫细胞上所见水平的GITR的Clonal Daudi细胞系。
制备了猕猴PBMC，并使用MAB测定了GITR结合。简而言之，将猕猴血液转移至50mL锥形管(Falcon，#352098)中，然后在PBS中1:2稀释(HyClone，#SH30256.01)并混合。将稀释的血液小心地层放在18mL 90％Ficoll Paque PLUS(PBS中稀释的GE Healthcare#17-1440-03)的顶部，并且将试管在台式离心机中在室温下在2,000×g下离心30分钟，不带刹车。小心移出血浆层，不扰动Ficoll顶部的弥散PBMC层。然后小心收集PBMC，并将PBS加入分离的PBMC中，直至锥形管中的体积为45mL，混合，并随后在台式离心机中在室温下在300×g下离心15分钟。小心吸出上清液，加入4mL 1×BD裂解溶液(BD#555899)，将样品温和地涡旋。在黑暗中在室温下孵育3分钟后，将40mL PBS加入每个样品中，并且在台式离心机中在室温下在200×g下离心10分钟。小心吸出上清液，在台式离心机中在室温下在200×g离心10分钟，之后在45mL PBS中洗涤沉淀两次。将得到的沉淀物过滤，并以1×106细胞/mL重悬浮于补充了青霉素/链霉素/谷氨酰胺(Hyclone#SV30082.01)的CTL试验培养基中(CTLT-005)。将100μL纯化的猕猴PBMC放入96孔圆底平板(Corning，#3799)中。为了激活PBMC，将100μL缀合SP34-2/CD28.2抗体的M-280对甲苯磺酰基激活的dynabeads(LifeTechnologies#142.04)加入每个孔中。使用3:1比例的CD3/CD28珠子与PBMC，并在37℃的组织培养箱中孵育平板48小时。对于第0天染色，将200μL PBMC放入96孔圆底平板中(Corning，#3799)。对于刺激48小时的样品，小心取出100μL上清液，并将孔的剩余内含物小心重悬浮，并将200μL转移至FACS染色平板中。
FACS
用200μL冷PBS中重悬浮的细胞来准备平板。在50μL DMSO中重构LIVE/DEAD固定染色(Life Technologies#L23105)，每mL冷PBS添加1μL重构染料，将细胞沉淀物立即重悬浮于100μL LIVE/DEAD PBS溶液中，在冰上避光孵育30分钟，然后洗涤，之后重悬浮于100μL含有2μg/mL MAB7或同种型人IgG1对照抗体的冷FACS缓冲液中，将平板在冰上避光孵育30分钟。接着洗涤并重悬浮在100μL抗体混合物中(FACS缓冲液(Jackson Immuno#109-116-098)中PerCP Cy5.5抗人CD3(BD#552852)、Alexa Fluor 700抗人CD4(BD#560836)、V450抗人CD8(BD#561426)、PE-Cy7抗人CD25(BD#561405)和PE抗人)，随后将平板在冰上避光孵育30分钟，然后在台式离心机中3,200RPM在4℃离心1分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤，随后悬浮于100μL BD CytoFix(BD#554655)中，并将平板在室温下避光孵育15分钟，随后洗涤两次，并重悬浮于100μL FACS缓冲液中。以箔覆盖平板(Beckman Coulter，#538619)并储存于4℃，直至准备读取。在FACS读取当天，将平板在台式离心机中在3,200RPM离心1分钟，并将50μL CML乳胶珠子(Life Technologies#C37259)(FACS缓冲液中4×105/mL)加入每个孔中。在BD Fortessa流式细胞仪上读取平板，并使用FlowJo分析数据。
转基因小鼠
通过用人GITR cDNA序列置换小鼠GITR的完整编码序列(外显子和内含子)，产生了hGITR敲入小鼠。起始密码子上游和终止密码子下游的非翻译序列来自小鼠基因组。使用带有BALB/c衍生的同源臂的靶向载体，在BALB/c ES细胞中，通过标准技术进行了基因打靶。通过PCR鉴定了几个ES细胞克隆，并通过Southern印迹证实含有确切的人cDNA敲入。按照标准小鼠胚胎学技术，将阳性ES细胞克隆注入胚泡中，将其转移至假孕受体代孕母体中，以产生嵌合后代。将雄性嵌合小鼠与在其生殖系中表达Cre重组酶的BALB/c雌性杂交，以切除侧接loxP的新霉素抗性盒。一个克隆形成了白色后代，表明靶ES细胞的种系传递。通过PCR基因型分型，证实切除了侧接loxP的盒。随后通过与BALB/c wt小鼠的育种步骤，除去Cre重组酶。
通过用后接牛生长激素poly-A信号的人GITRL cDNA序列置换小鼠的外显子1的编码部分，产生了hGITRL敲入小鼠。所有ES细胞工作以及小鼠胚胎学按与上述程序相似的方式进行。通过将两个建立者(founder)系杂交2代来产生纯合的双敲入小鼠，从而产生了hGITR-hGITRL双敲入小鼠。
功能试验
针对激动剂活性，在NFκB报告基因试验中测定了MAB的功能活性。将MAB在PBS中稀释至6μg/mL，并在3倍过量的F(ab’)2片段山羊抗-人Fcγ特异性交联剂的存在/不存在下，在室温下孵育30分钟。或者，将MAB在PBS中稀释至6μg/mL，并在2倍过量的蛋白A的存在/不存在下，在室温下孵育30分钟。然后将10μL孵育的MAB加入384孔白色透明圆底试验平板中。将用hGITR和NFκB报告基因稳定转染的HEK-293细胞系稀释至5×105细胞/mL并将20μL细胞上清液加入每个孔中。将平板在37℃组织培养箱中孵育24小时。将30μL Cell Bright Glo加入每个孔中，并在Acquest上读取平板的发光。
使用HEK-293NFκB报告亲本细胞评价了MAB阻断配体结合的能力，并将hGITR稳定细胞用于竞争结合试验和FACS分析中。简而言之，将收集的细胞以1×106细胞/mL和100μL/孔接种于96孔圆底FACS平板(Corning)中，然后重悬浮于每孔200μL冷FACS缓冲液(1X PBS+1％FBS-HI+0.1％叠氮化钠)中。以100μL/孔，在FACS缓冲液中，准备人GITR配体滴定(从270nM至1.52pM)。将平板在冰上避光孵育1小时，洗涤细胞，然后制备4nM同种型对照或制备MAB溶液，并以100μL/孔加入合适的孔中，平板在冰上避光孵育1小时，洗涤细胞，以100μL/孔加入在FACS缓冲液中以1:100稀释制备的PE缀合的山羊抗人检测抗体(JacksonImmunoResearch)，将平板在冰上避光孵育30分钟。在FACS缓冲液中洗涤细胞，随后用100μL/孔的BD CytoFix(BD Biosciences)固定细胞，并在冰上避光再孵育15分钟。将固定的细胞洗涤两次，以150μL/孔FACS缓冲液的终体积重悬浮，并在1周内在BD Fortessa流式细胞计(BD Bioscience)上分析样品。
在表达内源性水平的GITR的主要T细胞上，通过主要T细胞的增殖和细胞因子分泌，也可以看到MAB的激动剂活性。按照制造商的说明，将MAB缀合在M-280甲苯磺酰基激活的珠子(Invitrogen#142.04)上。在一些实验中，将激动剂CD3(OKT3)和CD28(CD28.2)抗体也缀合在珠子上。将1×105个新鲜纯化的CFSE-标记的人PBMC接种于96孔圆底组织培养平板的10uL CTL试验培养基(CTL#CTLW-010)中。然后以1个T细胞:1个珠子的比例，添加100uLMAB缀合的珠子。然后将平板在37℃组织培养箱中孵育3天。根据制造商的说明，使用MSD多重试验，测量了培养基中分泌的细胞因子的水平。用抗-CD4、-CD8a、-CD25、-GITR抗体和LIVE/DEAD染色将细胞染色，染色后，将细胞固定，并在流式细胞仪上阅读。通过CFSE染色评价CD4和CD8细胞的增殖，并且在FACS阅读前添加计数珠子，以允许样品的标准化。
还使用ELISpot方法检测IFNg，测量了T细胞上的MAB的共刺激活性。简而言之，用70％乙醇包被ELISPOT板2分钟，接着PBS洗涤，并用PBS中的50ug IFNg单克隆抗体(Mabtech3321-3)孵育过夜，准备ELISPOT板(Millipore MSIPS4510)。给药后15天，从运载体或MAB7处理的小鼠的脾分离纯化的CD8+ T细胞。在CTL培养基(CTL试验培养基(CTL CTLT-005)、1mM Hepes(Mediatech MT25-060-Cl)、2mM L-谷氨酰胺(Mediatech MT25-005-Cl)、1mM丙酮酸钠(Mediatech MT25-000-Cl)、100uM MEM非必需氨基酸(Mediatech MT25-025-Cl)、66uM 2-巯基乙醇(Gibco 21985-023)、100U/ml Pten/Strep(Gibco 10378016))中，将T细胞以0.25×106细胞接种在包被的ELISPOT平板中。用10％ConA sup(BD Biosciences354115)在37℃下处理Colon26细胞48小时，以上调II类MHC表达，用CTL培养基洗涤后添加至T-细胞。将Colon26肿瘤细胞(200,000/孔)加入CTL中，并在37℃下孵育24-48小时。然后用0.05％Tween-20/PBS洗涤平板并将10ug生物素化抗-IFNg Mab(Mabtech R4-6A2-生物素)加入每个孔中，并在37℃下孵育2小时。然后用0.05％Tween-20/PBS洗涤平板，并将Vectastain ABC溶液(Vector Labs PK6100)加入每个孔中，并且室温下孵育1小时。然后用0.05％Tween-20/PBS洗涤细胞，并将根据制造商的实验方案(Sigma A6926)制备的AEC底物加入每个孔中，并在室温下孵育4分钟。然后用自来水冲洗平板、干燥并在读数前在黑暗中储存24小时。
使用报告试验来测量MAB诱导ADCC的能力。在96孔白色平板(Perkin ElmerF6178)中，以1个Daudi细胞比20个Jurkat细胞的比率，在50uL RPMI+10％FBS中孵育2×103个hGITR-Daudi细胞和4×104个Jurkat-V158细胞(稳定表达人FcgRIIIa的V158变体和NFAT报告基因)。将等体积的MAB加入孔中，并将平板在37℃组织培养箱中孵育3小时。孵育后，将60uL Bright-Glo加入每个孔中，并在光度计上读取平板。
使用从小鼠分离的脾进行了体外脾细胞试验。简而言之，在gentleMACS Octo离解器(Miltenyi Biotech 130-095-937)上，使用gentleMACS C试管(Miltenyi Biotech 130-096-334)，在5mL含有5％BSA(Miltenyi Biotech 130-091-376)的AutoMACS漂洗溶液(Miltenyi Biotech130-091-222)中，通过自动化均质，解离来自小鼠的脾。匀浆物通过0.70uM孔径细胞滤过器(Fisher Scientific 22363548)过滤，并用10mL AutoMACS缓冲液洗涤。将脾细胞重悬浮并以100,000细胞/孔接种在96孔组织培养平板(Costar 3799)中的RPMI(HyClone SH30027.02)+10％人血清(Cellgro 35-060.C1)+1×pen/Strep/L-Glut(Gibco 15 140-112)中。对于T-细胞刺激，将0.4ug/mL的抗-小鼠CD3(eBioscience 16-0031-86)和0.8ug/mL的抗小鼠CD28(eBioscience 13-0281-86)抗体添加至合适的孔中。48小时后，立即分析细胞，或用对照或治疗性抗体脉冲30分钟至96小时，用缀合荧光团的抗体染色并通过流式细胞术分析。
流式细胞术：对于表面标志物，用抗-CD19(BD Biosciences 562291)、抗-CD8(Biolegend 100725)、抗-CD4(eBioscience 25-0041)、抗-CD69(BD Biosciences561238)、抗-hGITR(Miltenyi Biotech 130-092-895)和抗-hIgG(Life Sciences A-10631)抗体，将细胞在4℃下染色30分钟。对于胞内染色，与细胞表面抗体孵育后，洗涤细胞，根据制造商的实验方案，固定并用FOXP3Fix/Perm缓冲液(Biolegend 421403)透化，与抗-磷酸-IKKa/b抗体(Cell Signaling 2697)或抗-FOXP3抗体(eBioscience 50-4774-42)在4℃下孵育30分钟。使用BD FACSDiva软件(BD Biosciences)在BD LSRFortessa细胞计数器上读取细胞，并使用FlowJo软件(TreeStar Inc.)分析了流动数据。
从肿瘤和脾产生单细胞悬浮液，染色，通过流式细胞术分析。例如，使用以下抗体来评价细胞标志物：a-CD8-BUV395(克隆53-6.7，BD Biosciences 563786)、a-CD19-APC-Cy7(克隆6D5，BioLegend 115530)、a-CD3-PerCp(克隆145-2C11，BD Bioscience 553067)、a-PD-1-PE-Cy7(克隆RMP1-30，Biolegend 109110)。使用BD FACSDiva软件(BDBiosciences)，在BD LSRFortessa细胞计数器上，实施流式细胞术。使用FlowJo软件(FlowJo LLC)，分析了流式细胞术数据。产生了图表，并使用Prism软件(GraphPadSoftware)进行统计学分析。所有数据显示为平均值±标准偏差(SD)。使用95％置信区间，使用双侧student’s T-检验，进行了组比较。对于所有统计学评价，显著性水平设定为p<0.05。除非另外指出，报道与运载体对照组相比的显著性。
体内肿瘤模型。Colon26小鼠结肠癌细胞系获自国立癌症研究所(NationalCancer Institute)的癌症治疗和诊断部(Division of Cancer Treatment andDiagnosis)(小瓶：0507238)。将小鼠Colon26癌细胞在补充了10％FBS(Gibco 10099-141)、10mM HEPES(Gibco 15630-080)和1mM丙酮酸钠(Gibco 11360-070)的RPMI 1640培养基(HyClone SH30027.02)中培养。给8-10周龄的雌性hGITR-hGITRL敲入小鼠在胁腹皮下注射100uL RPMI中的0.5×106个Colon26细胞。使用数字卡尺测量了肿瘤，使用公式(L x W2)/2计算了肿瘤体积。当肿瘤达到180mm3的平均大小时，将小鼠随机化分组，单次腹膜内注射200uL PBS中的运载体(PBS)或治疗性抗体(15mg/kg)。给予治疗抗体后7天，处死小鼠，收集肿瘤，通过流式细胞术分析。所有动物实验在AAALAC认证机构进行，使用IACUC批准的实验方案。使用双侧95％置信区间的student’s T-检验，或使用单向ANOVA和Turkey校正，在Prism软件中进行了统计学分析。
替代物小鼠GITR Colon26模型试验。将Charles River Labs雌性6-8周龄BALB/c小鼠用作实验动物。为了植入，将细胞重悬浮于Hank’s 1×平衡盐溶液(Hyclone Cat#SH30030.02)中，并使用28g针(100ml注射体积)通过皮下注射在右下肋腹植入。植入后，根据肿瘤体积，将小鼠随机化分组。通过皮下注射，给予小鼠5mg/kg IgG2a-DTA-1或小鼠IgG2a同种型对照。通过将DTA-1可变区序列与小鼠IgG2a Fc区融合以形成IgG2a-DTA-1，从而修饰克隆DTA-1(大鼠抗小鼠GITR抗体(S.Sakaguchi，京都大学，日本京都))以形成小鼠嵌合IgG2a。
联合治疗。为了评价替代物抗-GITR抗体(小鼠IgG2a-DTA-1)组合替代物抗PD-1抗体(大鼠，IgG2a RMPI-14，Biolegend)的体内活性，在来自Jackson Laboratories(BarHarbor，Maine)的雌性6-8周龄BALB/c小鼠的右腋上区中皮下植入100uL体积中的5×105Colon26细胞。为了植入，将Colon26细胞悬浮于来自Lonza的无钙和镁的Dulbecco’sPBS(17-512F)中。植入后十天，具有115mm3±7的平均±SEM肿瘤体积的小鼠入选该研究。随机指定至4组中的一组后(n＝10-16/组)，按照表6中所述的，同时给予小鼠同种型(组1)、RMP1-14(10mg/kg，组2)、IgG2a-DTA-1(5mg/kg，组3)或RMP1-14和IgG2a-DTA的组合(分别为10mg/kg和5mg/kg，组4)，每周一次，持续2周。将第0天定为随机化分组日。同种型对照组含有5mg/kg的mIgG2a(Biolegend)和10mg/kg的大鼠IgG2a(Biolegend)。经由皮下注射给予5mg/kg的IgG2a-DTA及其同种型对照(mIgG2a)。经由腹膜内注射给予RMP1-14及其同种型对照(rIgG2a)。对于所有处理，剂量体积为10mg/mL。每周收集体重和肿瘤体积两到三次。当肿瘤体积等于或超过1200mm3时，动物个体评为达到终点。通过Kaplan-Meier存活分析评价，基于到终点的中值时间(TTE)的变化，报道抗肿瘤活性。
联合治疗。为了评价施用抗-GITR或抗-GITR联合抗PD-1后共刺激分子的表达，在1剂GITR(克隆IgG2a-DTA-1)或抗-PD1(克隆RMP1-14)或抗-GITR+PD1组合后，通过流式细胞术测定整个肿瘤和脾的单细胞悬浮液。将mIgG2a用作对照。作为肿瘤和脾中总的CD3+CD8+T细胞的百分数，评价LAG3、TIM3和PD-1阳性细胞。使用t-检验计算了P值。＊p<0.05和＊＊p<0.005。
结果
小鼠和参照V-区氨基酸序列
将来自表达MAB1的杂交瘤细胞的RT-PCR产物测序，并使用ThermoElectron LTQ-Orbitrap质谱仪在蛋白质水平大范围地(95％或更高)验证了这个序列。然后MAB1的重链和轻链可变区克隆在KaloBios载体中，以形成参照Fab MAB1rFab。MAB1中的第一个氨基酸必须从天冬酰胺(N)变成谷氨酸(E)残基，以便能够克隆至KaloBios载体中，用于产生参照Fab；因此，MAB1rFab在第一个VK位置具有谷氨酸。Fab MAB1rFab具有与人恒定区融合的来自MAB1的完整小鼠V-区。除了MAB1rFab，构建了优化的Fab，MAB1opFab。在MAB1opFab中，MAB1rFab中的几个框架氨基酸残基被改变成人种系残基。
参照和优化的参照Fab的亲和性分析
并入优化参照MAB1opFab的FR1和FR3中的人种系残基，由用于扩增人V-区段库的PCR引物规定，并且因此存在于抗体V-区文库的所有成员中。构建优化的参照Fab，以评价任何向人种系的改变是否改变Fab结合的特性。使用ForteBio Octed QK系统和包被了生物素化的hGITR-hFc的链霉亲和素高结合性生物传感器，测试了MAB1rFab、MAB1opFab的亲和性常数(Ka(1/Ms)、Kd(1/s)和KD(M))。与MAB1rFab相比，MAB1opFab具有非常相似的Kd，但Ka提高五倍，表明MAB1rFabz中的氨基酸变化被耐受。
抗体Fab的文库构建和选择
通过CLBA产生并筛选了重链和轻链前端和FR3盒文库，种系家族限制于VH3和VKIII。对于VK，从VK前端(MAB1VK3FE-01)和FR3(MAB1VK3FR3-01)盒文库鉴定出支持人GITR结合的克隆。对于VH，从FR3盒文库(MAB1VH3FR3-01)鉴定出支持人GITR结合的克隆，但从VH3前端文库(MAB1VK3FE-01)未鉴定出这样的克隆。由于Vk前端和FR3盒文库中的大部分成员在CLBA中是阳性的，通过重叠PCR，使用在所有位置编码亲本小鼠残基或选定的人种系(VKIII L-16)残基的突变VK CDR2，将这两个文库的全部成员用于构建Vk全长链文库(MAB1VK3FcL-01)。通过CLBA从VH3FR3文库(MAB1VH3FR3-01)鉴定出许多hGITR阳性克隆，并通过人GITR特异性ELISA证实。将其中六个用于与VK全长链文库(MAB1Vk3FcL-01)配对，使得能够进行功能性Fab表达和该文库的筛选。
由于从VH前端文库(MAB1VH3FE-01)没有鉴定出以高亲和性结合hGITR的克隆，随后，构建了第二个VH3前端文库(MAB1VH3FE-02)。该文库具有来自六个选定的VHFR3克隆的FR3序列并在CDR1的每个位置具有亲本小鼠或人种系(VH3 3-30)残基。从VK全长链文库(MAB1Vk3FcL-01)和第二个VH前端文库(MAB1VH3FE-02)鉴定出许多hGITR结合剂。通过对含Fab的细胞上清液进行人GITR特异性ELISA试验，证实了这些克隆，并通过hGITR亲和性滴定ELISA进行等级排序。
基于hGITR亲和性滴定ELISA，从VK全长链文库(MAB1VK3FcL01)选择了四个VK全长链克隆，并且从MAB1VH3FE-02文库选择了六个克隆。将六个VH克隆用作主链，构建在CDR2中的每个位置具有MAB1小鼠残基或最接近的人种系(VH3 3-30)残基的VH全长链文库。将该VH全长链库与四个VK全长链克隆配对，形成最终的人全长链Fab文库。CLBA鉴定出许多hGITR结合克隆，使用相应的培养物上清液作为Fab来源，通过ELISA证实了这些克隆。基于DNA序列分析和hGITR亲和性滴定ELISA结果，选择了五个人全长链Fab克隆(MAB2、MAB3、MAB4、MAB5和MAB6)。
使用ForteBio Octet分析测定抗体Fab对GITR抗原的亲和性
表达并纯化五个人全长链Fab(MAB2、MAB3、MAB4、MAB5和MAB6)。然后使用ForteBioOctet系统，比较了这些人Fab的结合动力学与优化的参照Fab(MAB1opFab)的结合动力学(数字数据总结于表3中)。
表3.Fab对人GITR的亲和性
Fab KD[M]
MAB1opFab(a)* 1.25E-8
MAB2(a) 6.84E-9
MAB3(a) 2.98E-9
MAB1opFab(b)* 6.59E-9
MAB4(b) 2.43E-9
MAB5(b) 3.74E-9
MAB1opFab(c)* 1.47E-8
MAB6(c) 5.94E-9
＊a、b、c表示三个分开的Forte实验。结果是两个样品重复的全局拟合。
抗体MAB2、MAB3、MAB4、MAB5和MAB6的氨基酸序列以及与人种系序列百分比同一性
表1中显示了五个Fab(MAB2、MAB3、MAB4、MAB5和MAB6)的可变区氨基酸序列。通过与单个种系序列(分别为VKIII L16/A27和VH33-30；表4)比对Vh和Vk氨基酸序列，确定五个Fab与人种系序列的百分比同一性。对于每条链，在计算中省略了CDRH3和CDRL3中的残基。
表4.五个Fab与人种系序列的百分比同一性
Fab VKIII L15/A27 VH3 3-30 Fv
MAB2 95％ 86％ 90％
MAB3 98％ 85％ 91％
MAB4 95％ 85％ 89％
MAB5 95％ 83％ 89％
MAB6 95％ 82％ 88％
MAB7 95％ 85％ 89％
MAB8 95％ 85％ 89％
人GITR抗原表位的保留
通过间接竞争ELISA，评价了抗原表位保留。所有五个Fab都阻断了亲本小鼠抗体MAB1与人GITR的结合，表明这些人Fab保留了初始小鼠抗体的表位特异性。
通过ELISA分析MAB4和MAB5的抗原特异性
为了测定在这些IgG(MAB2、MAB3、MAB4和MAB5)中是否保留了亲本小鼠抗体MAB1的抗原特异性，在ELISA试验中测定了抗体与一组人TNFR的结合。使用MAB4和MAB5(图2C)的一个这样的试验的结果表明，MAB4和MAB5保留了对GITR的高特异性，与小鼠抗体MAB1相似。使用MAB2、MAB3和MAB6获得了相似的结果。
抗体在ELISA中结合人和猕猴GITR蛋白，但不结合啮齿动物GITR蛋白
亲本小鼠抗体MAB1结合人和猕猴GITR蛋白，但不结合啮齿动物GITR蛋白。图2A-B显示出，与MAB1相似，抗体MAB4和MAB5能够以相似方式结合人和猕猴GITR，但不结合啮齿动物GITR。用MAB6、7和8发现了相似结果。
通过Biacore分析测定了GITR激动剂抗体MAB4和MAB5对人(hGITR)和猕猴(cGITR)GITR的结合亲和性。参见表5。单克隆抗体MAB4和MAB5以亚纳米摩尔的结合亲和性(KD)结合人GITR。抗体MAB4和MAB5以纳米摩尔的结合亲和性结合猕猴GITR，比对人GITR的结合亲和性低了约2-3倍。本发明的抗-GITR激动剂抗体在各种生物化学试验(包括流式细胞术、ELISA、Biacore和ProtagenTM芯片试验)中选择性地结合人和猕猴GITR。
表5.MAb对人-和猕猴-GITR的结合亲和性
抗原 mAb KD(nM)
hGITR MAB4 0.684(±0.331)
hGITR MAB5 0.973(±0.167)
hGITR MAB7 4.29(±0.14)
cGITR MAB4 1.78(±0.543)
cGITR MAB5 1.87(±0.520)
cGITR MAB7 3.67(±0.09)
单克隆抗体MAB7结合人以及猕猴CD4+ T细胞。分离的猕猴或人PBMC的FACS分析证明，MAB7结合分离的CD4+ T细胞。另外，FACS实验证明，在PBMC(CD4+ T细胞)的CD3/CD28激活后GITR(通过结合MAB7)和CD25上调。(数据未显示)
报告基因试验和细胞试验中的抗体功能活性
在报告基因试验中测定了抗体的功能活性(图3)。MAB4、MAB5、MAB7和MAB8IgG之每一个，在交联时，以与GITR配体(GITR-L)相似的水平诱导NFκB活性。参见图3A-D。用MAB2、MAB3和MAB6获得了相似的结果(数据未显示)。
MAB7与人GITR配体竞争结合表达人GITR的稳定细胞系。竞争试验一式三份重复进行，FACS竞争分析证明配体结合的抑制。参见图2D。
为了证实在猕猴GITR上的功能活性，将抗体与珠子缀合，与纯化的CFSE标记的人PBMC孵育。与同种型对照抗体相比，MAB7诱导了CD4+ T细胞(图4A)和CD8+ T细胞(图4B)的增殖增加。这种增殖的提高还伴随着几种细胞因子分泌的增加，所述细胞因子包括IFNγ(图4C)、TNFα、IL-10和IL-13(未显示)。用MAB4、MAB5发现了相似的结果(未显示)。我们能够证实，由MAB7诱导的增殖和IFNγ产生的增加依赖于珠子上抗-CD3和抗-CD28激动剂抗体的存在。如果省略这些共刺激抗体，MAB对CD4+或CD8+T细胞都没有激动剂作用。用MAB2、MAB3、MAB4；MAB5和MAB6获得了相似结果。
还发现，存在高水平的GITR时，MAB7表现出能够在体外试验中诱导FcgRIIIa信号传输(显示出与ADCC活性相关)。Daudi-hGITR细胞与MAB7或对照Ab及Jurkat-V158细胞系的孵育，显示出MAB7能够在体外试验中诱导FcgRIIIa信号传输，并且MAB7诱导FcgRIIIa信号传输的能力与Daudi细胞表面上表达的受体水平相关(即，越高的受体水平等于越高的FcgRIIIa信号传输诱导)。参见图5.
hGITR在T-细胞上表达，并且在hGITR-hGITRL敲入小鼠中是功能性的。从野生型或hGITR-hGITRL敲入小鼠分离脾细胞，并在没有刺激或用a-CD3和a-CD28抗体刺激的情况下培养24、48、72或96小时。然后用荧光团缀合的抗体染色细胞，通过流式细胞术分析，证明人GITR表达，并且共刺激导致野生型或转基因小鼠中提高的GITR表达谱。从hGITR-hGITRL敲入小鼠分离的脾细胞证明，在培养物中应答共同刺激而诱导了GITR表达(图6A)。MAB7有效结合CD8+细胞上表达的hGITR(图6B)；MAB7和受刺激的T细胞的结合与提高的T细胞激活相关，如通过pIKK染色(图6C)和T细胞激活标志物CD25+(图6D)所测量的。
MAB7在体内是功能性的。如上所述，用单剂运载体(n＝8/时间点)或MAB7(n＝10/时间点)抗体处理具有建立的Colon26肿瘤的hGITR-hGITRL双敲入小鼠。每周测量肿瘤两次，并使用公式(LxW2)/2计算肿瘤体积。MAB处理的动物表现出Colon26肿瘤的延迟生长。处理后三天时，收集全血(图7B-7C)和肿瘤(图7D-7E)，并通过流式细胞术分析免疫细胞上细胞表面的hGITR表达。结果表明，对于血液和肿瘤中的T调节细胞和T辅助细胞，hGITR占据和脱落导致处理组的hGITR降低(＊p<0.05，＊＊＊＊p<0.00005)。
MAB7在体内引发对Colon26肿瘤的抗肿瘤免疫应答。用单剂运载体(n＝8/时间点)或MAB7(n＝10/时间点)抗体处理具有建立的Colon26肿瘤的hGITR-hGITRL双敲入小鼠。图8A描绘了施用后3天的结果，证明了Treg在处理过的动物中降低。图8B-8C描绘了施用后15天的结果，证明了处理后肿瘤部位存在增加的淋巴细胞(8B)和增加的激活的CD8+ T细胞(8C)。细胞的绝对数量相对于肿瘤大小进行了标化，以说明运载体和MAB7处理组之间在肿瘤大小上的显著差异。MAB7结果表明，将总的肿瘤内激活的CD8+ T细胞与CD4+FOXP3+Treg相比，处理导致在处理的动物中提高的Teff/Treg比率。参见图8D。另外，来自脾细胞试验的结果(其中纯化CD8+ T细胞与Colon26肿瘤细胞离体孵育，并使用IFNg ELISPOT试验测量CTL应答)，表明来自MAB7处理的动物的CD8+ T细胞中提高的肿瘤特异性IFNg应答。(＊p<0.05,＊＊＊p<0.0005)。参见图8E。
用抗-mGITR Ab处理小鼠可以上调肿瘤和脾中的PD-1表达。用两剂的对照或小鼠抗mGITR抗体处理带有建立的Colon26肿瘤的小鼠。图9A9C描绘的结果表明，用替代物GITR抗体IgG2a-DTA-1处理后，在Colon26肿瘤以及脾中在CD8+ T细胞上PD-1表达上调。
GITR和PD-1组合，与同种型对照相比，赋予存活优势。在带有建立的Colon26肿瘤的小鼠中，单独和组合地施用抗-GITR(DTA-1)和抗PD-1(RMP1-14)。参见图10。与同种型对照相比，组合施用显示出明显的存活优势(＊＊＊p<0.0005配对比较，使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验)。与同种型对照相比，抗-mGITR(IgG2a-DTA-1)单药剂显示出明显的存活优势(＊p<0.05配对比较，使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验)。数据表明，IgG2a-DTA-1和RMP1-14的组合相对于同种型对照处理，赋予统计上显著的存活优势，中值TTE大于42天(未达中值TTE)而同种型处理组为22天(P<0.0005)。尤其是，3/10动物获得了完全消退(CR)，2/10动物获得了疾病的稳定(SD)。IgG2a-DTA-1单一治疗导致了30.5天的中值TTE(P<0.05)，3/10动物获得了疾病的稳定(SD)。RMP1-14处理组的中值存活为24天，其与同种型对照组没有统计学显著差异。产生了Kaplan Meier图并使用Prism软件(GraphPad Software)进行了统计学分析。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验，以配对比较进行了组比较。对于所有统计学评价，将显著性水平设定在p<0.05。报道与运载体对照组比较的显著性。疾病的稳定被定义为，在3次连续肿瘤体积测量中，肿瘤体积具有10％或更小的变化。
抗-GITR或抗-GITR组合抗PD-1施用后，评价了肿瘤中共刺激分子的表达。参见图11。1剂抗-GITR或抗-PD1或抗-GITR+PD1组合后，通过流式细胞术测定了整个肿瘤和脾的单细胞悬浮液，结果表明，用GITR、PD-1和组合处理后，Colon26肿瘤中CD8+ T细胞上提高的LAG3、TIM3和PD-1表达。单剂组合显示出，在脾CD8+细胞中PD-1表达的上调。
按引用并入
本文中所有提及的出版物、专利和登录号全部按引用并入，如同单独地特意指明每篇出版物或专利按引用并入。
等同物
尽管已经讨论了本发明的特定实施方案，但以上的说明书是举例说明性的，而非限制性的。在阅读说明书和以下权利要求时，本发明的许多变化将是本领域技术人员显然易见的。本发明的完整范围应当参照权利要求连同其等同物的完整范围以及说明书连同这些变化，予以确定。

Claims (58)

1.一种结合SEQ ID NO:1的分离抗体或抗体片段、或其抗原结合分子，其中所述抗体、抗体片段或抗原结合分子包含
(a)重链可变区，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22，和
ii)重链CDR2包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27任一个的序列，和
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:109；
(b)轻链可变区，其中
i)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31，和
ii)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
iii)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
2.权利要求1的抗体、其抗体片段或抗原结合分子，其中重链可变区与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性，其中轻链可变区与SEQ ID NO:17具有至少95％序列同一性。
3.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中重链FR4是人种系FR4。
4.权利要求3的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中重链FR4是SEQ ID NO:42。
5.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中轻链FR4是人种系FR4。
6.权利要求5的抗体或抗体片段，其中轻链FR4是SEQ ID NO:50。
7.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:23；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
8.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:24；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:31；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
9.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:25；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
10.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:26；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
11.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:27；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
12.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:25；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:109；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
13.权利要求2的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体或抗体片段包含重链和轻链，重链包含SEQ ID NO:16，轻链包含SEQ ID NO:17。
14.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体或抗体片段与包含重链和轻链的分离抗体或其抗原结合片段竞争，其中所述重链包含SEQ ID NO:16，所述轻链包含SEQ ID NO:17。
15.权利要求1的分离抗体，其中分离的抗体、抗体片段或抗原结合分子包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:105任一的序列；所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9。
16.权利要求15的分离抗体，其中分离抗体、抗体片段或抗原结合分子包含以下之任一：
i)包含SEQ ID NO:6的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:8的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:12的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:14的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域；
vi)包含SEQ ID NO:99的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域；和
vii)包含SEQ ID NO:105的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:7的轻链可变结构域。
17.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中所述抗体或抗体片段或抗原结合分子是人源化的。
18.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，包含Fab’片段。
19.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体或抗体片段包含IgG Fc。
20.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，包含单链抗体(scFv)。
21.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，包含人恒定区。
22.权利要求21的分离抗体，其中分离抗体、抗体片段或抗原结合分子包含重链和轻链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106任一的序列；所述轻链包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:70。
23.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中所述抗体或抗体片段与第二抗体或抗体片段交联，其中所述抗体、抗体片段或抗原结合分子是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的激动剂。
24.结合SEQ ID NO:1的分离抗体或抗体片段、或其抗原结合分子，选自以下之任一：
A.抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:23；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；
B.抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:24；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:31；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；
C.抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:25；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；
D.抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:26；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；
E.抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:27；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:29；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34；和
F.抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中：
i)重链CDR1包含SEQ ID NO:22；
ii)重链CDR2包含SEQ ID NO:25；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO:109；
iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO:30；
v)轻链CDR2包含SEQ ID NO:33，和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:34。
25.权利要求24的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中所述抗体或抗体片段或抗原结合分子是人源化的。
26.权利要求24的抗体、抗体片段或抗原结合分子，包含Fab’片段。
27.权利要求24的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体或抗体片段包含IgG Fc。
28.权利要求24的抗体、抗体片段或抗原结合分子，包含单链抗体(scFv)。
29.权利要求24的抗体、抗体片段或抗原结合分子，包含人恒定区。
30.权利要求29的分离抗体，其中分离抗体、抗体片段或抗原结合分子包含重链和轻链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106任一的序列；所述轻链包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:70。
31.权利要求24的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中所述抗体或抗体片段与第二抗体或抗体片段交联，所述抗体、抗体片段或抗原结合分子是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的激动剂。
32.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体或抗体片段是糖基化的。
33.权利要求1的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体是修饰的或在修饰的细胞中表达，其中该修饰导致所述抗体、抗体片段或抗原结合分子提高的FcR效应子功能。
34.权利要求24的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体或抗体片段是糖基化的。
35.权利要求24的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体是修饰的或在修饰的细胞中表达，其中该修饰导致所述抗体、抗体片段或抗原结合分子提高的FcR效应子功能。
36.权利要求1-35任一项的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体或抗体片段在体内诱导升高的Teff:Treg比率。
37.权利要求1-35任一项的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体或抗体片段在体内诱导增强的免疫应答。
38.权利要求1-31任一项的抗体、抗体片段或抗原结合分子，其中抗体与非人灵长类GITR交叉反应，并且不与啮齿动物GITR交叉反应。
39.编码权利要求1-35任一项的抗体、抗体片段或抗原结合分子的多核苷酸。
40.包含权利要求1-35任一项的抗体、抗体片段或抗原结合分子和药物学上可接受载体的组合物。
41.权利要求40的组合物，进一步包含靶向肿瘤相关抗原的结合分子、CTLA4、LAG3或TIM3的拮抗剂、或PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂。
42.包含权利要求1-35任一项的抗体、抗体片段或抗原结合分子的药盒。
43.一种增强有需要的个体中的T细胞应答的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-35任一项的抗体、抗体片段或抗原结合分子施用于个体。
44.权利要求43的方法，其中将抗体、抗体片段或抗原结合分子与抗原、CTLA4、LAG3或TIM3的拮抗剂、或PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂共施用。
45.权利要求43的方法，其中将抗体、抗体片段或抗原结合分子与化学治疗剂或细胞毒素共施用。
46.权利要求43的方法，其中T细胞应答是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)T细胞应答。
47.权利要求43的方法，其中个体患有表达肿瘤相关抗原的癌症。
48.权利要求47的方法，其中将抗体、抗体片段或抗原结合分子与来自个体的癌细胞共施用。
49.权利要求47的方法，其中癌症选自黑素瘤、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
50.权利要求43的方法，其中T细胞应答是CD4+辅助T细胞(Th)应答。
51.一种治疗有需要的个体中表达肿瘤相关抗原的癌症的肿瘤生长的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-35任一项的分离的抗体、抗体片段或抗原结合分子施用于个体。
52.权利要求51的方法，其中将抗体、抗体片段或抗原结合分子与肿瘤相关抗原共施用。
53.权利要求51的方法，其中将抗体、抗体片段或抗原结合分子与CTLA4、LAG3或TIM3的拮抗剂、或PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂共施用。
54.权利要求51的方法，其中将抗体或抗体片段与化学治疗剂或细胞毒素共施用。
55.权利要求51的方法，其中将抗体或抗体片段与来自个体的癌细胞共施用。
56.权利要求51的方法，其中癌症选自黑素瘤、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、乳腺癌、和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
57.权利要求1-35任一项的分离抗体、抗体片段或抗原结合分子用于增强有需要的个体中的T细胞应答。
58.权利要求1-35任一项的分离抗体、抗体片段或抗原结合分子用于治疗有需要的个体中的肿瘤生长。
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