CN115969971B - 组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明提供了一种包括抑制剂和PD‑1抗体的组合物；所述抑制剂为抑制T细胞中Rig‑I基因和/或RIG‑I蛋白的表达的试剂。本发明还提供了一种包括PD‑1抗体和Rig‑I表达被抑制的T细胞的组合物。所述应用为任一上述组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明将PD‑1抗体与敲低Rig‑I的CD8⁺T细胞联合治疗对PD‑1抗体抗肿瘤治疗不敏感的恶性实体瘤，发挥协同增效，促进CD8⁺T细胞分泌抗肿瘤因子IFN‑γ，提高CD8⁺T细胞的浸润数量，显著抑制肿瘤生长，为临床上PD‑1抗体治疗肿瘤增敏提供新的药物选择。

Description

组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫领域，具体地，涉及组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术

CD8⁺T细胞是人体一类重要的具有抗肿瘤功能的适应性免疫细胞，在肿瘤微环境和外周血中具有防止肿瘤进展和转移的重要功能。CD8⁺T细胞的高活性明显的负相关于肿瘤发病风险，揭示了CD8⁺T细胞在防止肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色。

程序性死亡受体1(PD-1)在CD8⁺T细胞中上调是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。PD-1单克隆抗体对治疗卵巢癌、乳腺癌、骨肉瘤和非小细胞肺癌等恶性实体瘤具有一定作用。但PD-1单克隆抗体单药或者多药联用对多种恶性实体瘤(如胃癌、肝癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤等)的整体反应率不超过50％。

敲除CD8⁺T细胞中的维甲酸诱导基因-I基因(RIG-I)可增强CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能，但对于PD-1抗体不敏感型的实体瘤(如黑色素瘤)，敲除RIG-I没有明显的抗肿瘤作用。

因此，对于治疗难治性恶性实体瘤，亟需一种对PD-1抗体治疗增敏的方法。

发明内容

为了解决现有技术中PD-1抗体对恶性实体瘤不敏感的问题，本发明提供了组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种组合物。

本发明的第二个目的是提供另一种组合物。

本发明的第三个目的是提供任一上述组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

在小鼠的肿瘤模型中，对于PD-1抗体不敏感的黑色素瘤，用PD-1单克隆抗体没有抗肿瘤疗效；虽然敲低Rig-I可增强CD8⁺T细胞的杀伤功能，但对于PD-1抗体不敏感的黑色素瘤依旧没有抗肿瘤作用。

敲低Rig-I使无免疫原性的肿瘤——“冷肿瘤”变成有免疫原性的肿瘤——“热肿瘤”，即使肿瘤微环境免疫细胞浸润，尤其是具有肿瘤杀伤功能的CD8⁺T细胞增多，但此时炎性的肿瘤微环境中的CD8⁺T细胞仍处于耗竭状态，不能杀伤肿瘤。利用免疫检查点抑制剂PD-1抗体可逆转肿瘤微环境CD8⁺T细胞的耗竭状态，因此敲低Rig-I和PD-1抗体联用对黑色素瘤这种冷肿瘤有较好的治疗效果。

一种组合物，包括抑制剂和PD-1抗体；所述抑制剂为抑制T细胞中Rig-I基因和/或RIG-I蛋白的表达的试剂。

所述抑制剂对Rig-I基因和/或RIG-I蛋白的抑制率为60～80％。

优选地，所述抑制剂为以Rig-I基因和/或RIG-I蛋白作为靶标的sgRNA、基因编辑载体和/或慢病毒中的一种或几种，所述sgRNA、基因编辑载体和慢病毒均以Rig-I基因和/或RIG-I蛋白作为靶标。

更优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示的序列中的任意一个。所述sgRNA以Rig-I基因Gene ID：230073的cDNA的124～143bp、174～193bp和350～369bp作为敲低靶位点。

进一步优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列。

更优选地，所述基因编辑载体为表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体。

进一步优选地，所述基因编辑载体为表达核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列的CRISPR-CAS9载体。

更进一步优选地，所述CRISPR-CAS9载体为pLentiCRISPR V2。

更进一步优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4～6所示的序列中的任意一个。

最优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的序列。

优选地，所述慢病毒为由表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体和慢病毒包装质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。

更优选地，所述包装质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。

更优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比(2～5)：(3～5)：(2～3)共转染。

更进一步优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。

最优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的基因编辑载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。

更优选地，所述共转染的方法为脂质体转染。

更优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞。

优选地，所述T细胞为CD8⁺T细胞。

一种组合物，包括PD-1抗体和Rig-I表达被抑制的T细胞。

优选地，所述Rig-I表达被抑制的T细胞为用抑制剂处理T细胞后制备得到的细胞；所述抑制剂为以Rig-I基因和/或RIG-I蛋白作为靶标的sgRNA、基因编辑载体和/或慢病毒中的一种或几种，所述sgRNA、基因编辑载体和慢病毒均以Rig-I基因和/或RIG-I蛋白作为靶标。

更优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示的序列中的任意一个。所述sgRNA以Rig-I基因Gene ID：230073的cDNA的124～143bp、174～193bp和350～369bp作为敲低靶位点。

进一步优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列。

更优选地，所述基因编辑载体为表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体。

进一步优选地，所述基因编辑载体为表达核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列的CRISPR-CAS9载体。

更进一步优选地，所述CRISPR-CAS9载体为pLentiCRISPR V2。

更进一步优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4～6所示的序列中的任意一个。

最优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的序列。

优选地，所述慢病毒为由表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体和慢病毒包装质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。

更优选地，所述包装质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。

更优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比(2～5)：(3～5)：(2～3)共转染。

更进一步优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。

最优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的基因编辑载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。

更优选地，所述共转染的方法为脂质体转染。

更优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞。

优选地，所述T细胞为CD8⁺T细胞。

上述任一组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为对PD-1抗体抗肿瘤治疗不敏感的肿瘤。

优选地，所述肿瘤为对Rig-I基因和/或RIG-I蛋白的表达被抑制的T细胞抗肿瘤治疗不敏感的肿瘤。

更优选地，所述T细胞为CD8⁺T细胞。

优选地，所述肿瘤为恶性实体瘤。

更优选地，所述肿瘤为黑色素瘤。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将PD-1抗体与敲低Rig-I的CD8⁺T细胞联合治疗对PD-1抗体抗肿瘤治疗不敏感的恶性实体瘤，发挥协同增效，促进CD8⁺T细胞分泌抗肿瘤因子IFN-γ，提高CD8⁺T细胞的浸润数量，显著抑制肿瘤生长，为临床上PD-1抗体治疗肿瘤增敏提供新的药物选择。

附图说明

图1为敲低Rig-I基因的基因编辑载体及敲低效率鉴定；A为CRISPR/CAS9sgRNA质粒的结构示意图；B为Western Blot鉴定CRISPR/CAS9 sgRNA质粒敲低效率的结果。

图2为肿瘤组织RA对CD8⁺T细胞中Rig-I基因的影响；A为结肠癌(MC38)小鼠皮下脂肪及肿瘤组织中RA的含量；B为黑色素瘤(B16F10)小鼠皮下脂肪及肿瘤组织中RA的含量；C为RA诱导培养Rig-I^+/+小鼠脾脏的CD8⁺T细胞3天后分泌IFN-γ的情况；D为RA诱导培养Rig-I^-/-小鼠脾脏的CD8⁺T细胞3天后分泌IFN-γ的情况；****p<0.0001，Student’s t检验。

图3为敲低Rig-I活化PI3K/AKT/糖代谢信号通路而促进抗肿瘤因子IFN-γ的分泌；A为Western blot验证敲低Rig-I后AKT及其磷酸化水平的活化情况；B为PI3K/AKT/糖代谢的抑制剂处理Rig-I^+/+的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的情况；C为B中IFN-γ百分比的统计结果；D为B中IFN-γ平均荧光强度的统计结果；E为PI3K/AKT/糖代谢的抑制剂处理Rig-I^-/-的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的情况；F为E中IFN-γ百分比的统计结果；G为E中IFN-γ平均荧光强度的统计结果；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，Student’s t检验，NS为Nosignificance。

图4为靶向敲低Rig-I的CD8⁺T细胞及PD-1抗体治疗黑色素瘤小鼠模型；A为小鼠的构建及治疗流程示意图；B为肿瘤的生长曲线；C为肿瘤大小直观图；D为肿瘤重量的统计结果；*p<0.05，**p<0.01，B、D用one-way ANOVADunn’s多组检验。

图5为靶向敲低Rig-I的CD8⁺T细胞及PD-1抗体对黑色素瘤小鼠模型的治疗效果；A为肿瘤组织中CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的情况；B为肿瘤中浸润的CD8⁺T细胞的数量；*p<0.05，**p<0.01，B和C用one-way ANOVA Dunn’s多组检验。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1敲低Rig-I基因的慢病毒构建

一、实验方法

1、Rig-I基因敲低靶位点的确定及sgRNA

根据Rig-I基因(Gene ID：230073)的序列，以其cDNA的124～143bp、174～193bp和350～369bp作为敲低靶位点，设计得到多条sgRNA，具体序列如下所示：

sgRNA1：CAGGCTGAGAAGAACAACAA(SEQ ID NO：1)；

sgRNA2：GCAGCTTCAACAGGTACTGG(SEQ ID NO：2)；

sgRNA3：GATATCATTTGGATCAACTG(SEQ ID NO：3)。

2、CRISPR/CAS9 sgRNA质粒的构建

(1)用内切酶BmsBI对pLentiCRISPR V2载体进行酶切。酶切反应体系为：pLentiCRISPR V2，2μg；10×buffer，2μL；BmsBI，1μL；ddH₂O补足至20μL。反应条件为：37℃，30分钟。

(2)使用如表1所示的引物，将sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3分别连接至酶切后的pLentiCRISPR V2载体中。连接反应体系为：F_sgRNA1(F_sgRNA2或F_sgRNA3)，2μL；R_sgRNA1(R_sgRNA2或R_sgRNA3)，2μL，10×连接buffer，2μL；连接酶，1μL；ddH₂O补足至20μL；反应条件为：16℃，30分钟。获得连接产物。

表1连接sgRNA和pLentiCRISPR V2载体的引物

(3)将连接产物转化至感受态细菌DH5α，挑选菌落测序鉴定。测序结果正确的即为CRISPR/CAS9 sgRNA质粒，结构如图1中的A所示，分别命名为LentiCRISPR-CAS9-sgRNA1(SEQ ID NO：4)、LentiCRISPR-CAS9-sgRNA2(SEQ ID NO：5)和LentiCRISPR-CAS9-sgRNA3(SEQ ID NO：6)。

3、敲低Rig-I基因的慢病毒包装

HEK293T细胞于10cm²培养皿中生长至细胞密度达到70～80％，用Lipo3000试剂(ThermoFisher，Lipofectamine^TM3000转染试剂，L3000015)，将psPAX2质粒、pMD2.G质粒和LentiCRISPR-CAS9-sgRNA1(SEQ ID NO：4)(LentiCRISPR-CAS9-sgRNA2(SEQ ID NO：5)或LentiCRISPR-CAS9-sgRNA3(SEQ ID NO：6))按照质量比5μg：3μg：2μg共转染至HEK293T细胞，37℃、5％CO₂培养48小时后，收取细胞上清，即得敲低Rig-I基因的慢病毒，分别命名为V-RIG-I-1、V-RIG-I-2和V-RIG-I-3，于-80℃保存。

4、慢病毒敲低OT1小鼠来源的CD8⁺T细胞中Rig-I基因效果的测定

(1)OT1小鼠来源的CD8⁺T细胞分离

取卵清蛋白(OVA)特异的OT-1小鼠的脾脏，研磨后用70μm的滤器过滤，使用磁珠分选试剂盒(BioLegend，MojoSort^TMMouse CD8 T Cell Isolation Kit，480035)分离纯化脾脏细胞，得到CD8⁺T细胞。

(2)CD8⁺T细胞激活

用10μg/mL anti-CD3抗体(BioLegend，100254)和5μg/ml anti-CD28抗体(BioLegend，102122)处理CD8⁺T细胞，37℃培养18小时后，加入20IU/mL IL-2(PeproTech，200-02-1MG)、2.5ng/mL IL-7(PeproTech，217-17-10UG)和25ng/mL IL-15(PeproTech，210-15-2UG)，继续培养72小时，即得到激活的CD8⁺T细胞。

(3)慢病毒感染

向激活的CD8⁺T细胞中，按照每10⁶个细胞加入1mL滴度为10⁵TCID₅₀/mL的慢病毒(V-RIG-I-1或V-RIG-I-2或V-RIG-I-3)和10μg/mL聚凝胺(polybrene)，在室温下800×g离心感染3小时，弃去上清。

用含有20IU/mL IL-2(PeproTech，200-02-50UG)、2.5ng/mL IL-7(PeproTech，217-17-50UG)和25ng/mL IL-15(PeproTech，210-15-10UG)的1640培养基，重悬细胞，37℃、5％CO₂培养4天，收取细胞，得到感染V-RIG-I-1的CD8⁺T细胞(即sgRNA1)、感染V-RIG-I-2的CD8⁺T细胞(即sgRNA2)和感染V-RIG-I-3的CD8⁺T细胞(即sgRNA3)。

(4)敲低Rig-I基因效果测定

使用RIG-I抗体(Abcam，ab302779)和Actin抗体(Proteintech，23660-1-AP)，通过Western Blot检测感染V-RIG-I-1的CD8⁺T细胞、感染V-RIG-I-2的CD8⁺T细胞和感染V-RIG-I-3的CD8⁺T细胞中RIG-I蛋白的表达量，以未感染慢病毒的CD8⁺T细胞作为空白对照组(即Control)，评定慢病毒敲低CD8⁺T细胞Rig-I基因的效率。

二、实验结果

如图1中的B所示，与Control相比，感染了慢病毒V-RIG-I-1、V-RIG-I-2和V-RIG-I-3的CD8⁺T细胞中RIG-I蛋白的表达量均降低，其中感染V-RIG-I-3RIG-I蛋白表达量最低，表明V-RIG-I-3(即sgRNA3)的敲低效率最高。因此，后续使用含有sgRNA3的V-RIG-I-3构建的Rig-I基因敲低型CD8⁺T细胞(即OT1 CD8⁺T Rig-I KO cells)。

实施例2肿瘤组织维甲酸对CD8⁺T细胞中Rig-I基因的影响

一、实验方法

1、荷瘤小鼠的构建及肿瘤中维甲酸含量的测定

4只6周龄的C57BL/6J小鼠，分别在皮下接种2×10⁵个小鼠结肠癌细胞(MC38)和1×10⁵个黑色素瘤细胞(B16F10)。

待结肠肿瘤和黑色素瘤生长至10mm×10mm左右，解剖肿瘤和瘤周的脂肪组织进行质谱定量检测肿瘤中的维甲酸(RA)含量。

2、维甲酸处理CD8⁺T细胞

取Rig-I^+/+小鼠(DOI:10.1073/pnas.0804895105)和Rig-I^-/-小鼠(DOI:10.1073/pnas.0804895105)的脾脏，研磨后用70μm的滤器过滤，使用磁珠分选试剂盒(BioLegend，MojoSort^TMMouse CD8 T Cell Isolation Kit，480035)分离纯化得到Rig-I^+/+小鼠的CD8⁺T细胞和Rig-I^-/-小鼠的CD8⁺T细胞。

用含5nM RA的1640培养基(Gibco，22400089)诱导培养Rig-I^+/+小鼠的CD8⁺T细胞和Rig-I^-/-小鼠的CD8⁺T细胞。3天后，使用IFN-γ抗体(BD，557649)通过流式细胞仪检测两种CD8⁺T细胞释放IFN-γ的水平。

二、实验结果

如图2中的A和B所示，相较于瘤周的脂肪组织，肠癌MC38和黑色素瘤B16F10荷瘤小鼠的肿瘤组织中维甲酸含量明显增多。

如图2中的C所示，用含5nM的维甲酸的1640培养基刺激Rig-I野生型小鼠(即Rig-I^+/+小鼠)来源的CD8⁺T细胞，其分泌的IFN-γ明显减弱。

如图2中的D所示，用含5nM的维甲酸的1640培养基刺激Rig-I敲除型小鼠(即Rig-I^-/-小鼠)来源的CD8⁺T细胞，其分泌的IFN-γ没有明显。

以上结果表明，肿瘤微环境代谢的维甲酸明显增多，维甲酸可诱导CD8⁺T细胞分泌IFN-γ减少，维甲酸对CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能的负调控作用依赖于RIG-I。

实施例3敲除Rig-I基因促进CD8⁺T细胞分泌抗肿瘤因子

一、实验方法

1、CD8⁺T细胞中蛋白激酶B的表达情况

用1640培养基(Gibco，22400089)培养实施例2中所得Rig-I^+/+小鼠的CD8⁺T细胞和Rig-I^-/-小鼠的CD8⁺T细胞，于37℃、5％ CO₂培养2天。

使用蛋白激酶B(AKT)抗体(Abcam，ab8805)和磷酸化AKT抗体(Abcam，ab38449)，通过Western blot检测Rig-I^+/+小鼠的CD8⁺T细胞和Rig-I^-/-小鼠的CD8⁺T细胞中AKT总蛋白和磷酸化AKT的表达情况。

2、抑制PI3K/AKT/糖代谢对CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的影响

将Rig-I^+/+小鼠的CD8⁺T细胞和Rig-I^-/-小鼠的CD8⁺T细胞分别培养于1640培养基中，分别用10μM DMSO、1μM Wortmannin(Selleck，S2758)、10μM LY294002(Selleck，S1105)、5μM MK-2206 2HCl(Selleck，S1078)、5μM GSK690693(Selleck，S1113)和10μM 2-脱氧葡萄糖(2-DG)(Selleck，S4701)处理Rig-I^+/+小鼠的CD8⁺T细胞和Rig-I^-/-小鼠的CD8⁺T细胞72小时。

使用IFN-γ流式抗体(BD，557649)通过流式细胞仪检测各CD8⁺T细胞释放IFN-γ的情况。

二、实验结果

如图3中的A所示，对Rig-I野生型小鼠(即Rig-I^+/+小鼠)和Rig-I敲除型小鼠(即Rig-I^-/-小鼠)的CD8⁺T细胞的RIG-I、AKT、p-AKT和Actin进行蛋白印迹检测，发现敲除Rig-I可明显激活AKT的磷酸化。

如图3中的B～D所示，分别用PI3K、AKT和糖酵解的抑制剂(Wortmannin、LY294002、MK-2206 2HCl、GSK690693和2-DG)处理Rig-I敲除型小鼠(即Rig-I^-/-小鼠)来源的CD8⁺T细胞72小时。通过流式细胞仪检测各CD8⁺T细胞释放IFN-γ的水平。发现用抑制剂处理后抑制了Rig-I敲除型小鼠(即Rig-I^-/-小鼠)CD8⁺T细胞的IFN-γ释放。

如图3中的E～G所示，分别用PI3K、AKT和糖酵解的抑制剂(Wortmannin、LY294002、MK-2206 2HCl、GSK690693和2-DG)处理Rig-I野生型小鼠(即Rig-I^+/+小鼠)来源的CD8⁺T细胞72小时。通过流式细胞仪检测各CD8⁺T细胞释放IFN-γ的水平。发现用抑制剂处理后不影响Rig-I野生型小鼠(即Rig-I^+/+小鼠)CD8⁺T细胞的IFN-γ释放。

以上结果表明，敲除Rig-I基因明显活化AKT的磷酸化水平；敲除Rig-I活化信号通路PI3K/AKT/糖代谢进而促进抗肿瘤因子IFN-γ的表达；肿瘤微环境代谢的维甲酸通过上调CD8⁺T细胞Rig-I分子负调控PI3K/AKT/糖代谢信号通路，抑制CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能IFN-γ的分泌。

实施例4抗体联合敲低Rig-I基因对恶性实体型肿瘤的抑制效果

一、实验方法

1、黑色素瘤小鼠的构建及治疗

将28只NSG小鼠随机(上海南方模式生物科技股份有限公司，目录号：NM-NSG-001)分为4组(记为第1～4组)，每组7只。

按照如图4中的A所示的流程对第1～4组小鼠进行处理，具体方法如下：

(1)对于全部小鼠，经皮下接种10⁵个/只过表达OVA基因的B16F10小鼠黑色素瘤肿瘤细胞(B16F10-OVA)，记为处理的第0天；

(2)T细胞治疗

在处理的第4天，对于第1组和第2组小鼠，经尾静脉回输5×10⁶个/只对照OVA特异性的CD8⁺T细胞(OT1 CD8⁺T control cells，即实施例1中的未感染慢病毒的CD8⁺T细胞)；对于第3组和第4组小鼠，经尾静脉回输5×10⁶个/只敲低Rig-I的OVA特异性的CD8⁺T细胞(即实施例1中的OT1 CD8⁺T Rig-I KO cells)；

(3)抗体治疗

在T细胞治疗的同时用PD-1抗体(Bioxcell，BE0146)治疗小鼠，以免疫球蛋白IgG2a(CiteAb，BP0089)作为对照抗体(control immunoglobulin，即Clg)。

在处理第4、7和10天，对于第1组和第3组小鼠，经腹腔注射250μg/只的Clg；对于第2组和第4组小鼠，经腹腔注射250μg/只的PD-1抗体。

第1组为对照OVA特异性的CD8⁺T细胞联合Clg抗体治疗组，记为OT1CD8⁺T controlcells+clg；第2组为对照OVA特异性的CD8⁺T细胞联合PD-1抗体治疗组，记为OT1 CD8⁺Tcontrol cells+α-PD-1；第3组为敲低Rig-I的OVA特异性的CD8⁺T细胞联合Clg抗体治疗组，记为OT1 CD8⁺T Rig-I KO cells+clg；第4组为敲低Rig-I的OVA特异性的CD8⁺T细胞联合PD-1抗体治疗组，记为OT1 CD8⁺T Rig-I KO cells+α-PD-1。

第1组为对照组，第2组和第3组为单独用药组，第4组为联合用药组。

2、肿瘤治疗效果测定

从处理的第4天至第12天，每2天用游标卡尺在小鼠体表测量记录小鼠肿瘤的长和宽，绘制肿瘤的生长曲线。第12天测量结束后处死全部小鼠，解剖肿瘤组织并称重，得到质量W(g)。

通过流式细胞仪，使用IFN-γ抗体(BD，557649)检测肿瘤组织中抗肿瘤因子IFN-γ的表达情况；使用CD8抗体(BD，551162)测得肿瘤组织中CD8⁺T细胞的数量A(个)，并在流式管中添加5200个Counting beads，测得通过流式仪的Counting beads的数量B(个)，根据公式：肿瘤中浸润的CD8⁺T细胞数量(个/g)＝5200A÷(BW)，计算得到每克肿瘤中浸润的CD8⁺T细胞数量。

二、实验结果

如图4中的B～D所示，第2组(OT1 CD8⁺T control cells+α-PD-1)和第1组(OT1CD8⁺T control cells+clg)相比，单独使用PD-1抗体并不能减缓黑色素瘤肿瘤的生长；第3组(OT1 CD8⁺T Rig-I KO cells+clg)和第1组相比，回输敲低Rig-I的CD8⁺T细胞也不能减缓黑色素瘤肿瘤的生长；与第1～3组相比，第4组(OT1 CD8⁺T Rig-I KO cells+α-PD-1)回输敲低Rig-I的CD8⁺T细胞联合使用PD-1抗体治疗，黑色素瘤肿瘤的生长明显减慢，肿瘤体积明显缩小，重量明显降低。

如图5中的A和B所示，流式细胞分析肿瘤浸润CD8⁺T细胞的抗肿瘤因子释放水平。OT1 CD8⁺T control cells+α-PD-1组和OT1 CD8⁺T control cells+clg组相比，单独使用PD-1抗体并不能增强肿瘤浸润CD8⁺T细胞的IFN-γ的分泌；OT1CD8⁺T Rig-I KO cells+clg组和OT1 CD8⁺T control cells+clg组相比，回输敲低Rig-I的CD8⁺T细胞也不能增强肿瘤浸润CD8⁺T细胞的IFN-γ的分泌；与前面几组相比，OT1 CD8⁺T Rig-I KO cells+α-PD-1组回输敲低RIG-I的CD8⁺T细胞联合使用PD-1抗体治疗，肿瘤内CD8⁺T细胞分泌的抗肿瘤因子IFN-γ明显增强。

如图5中的C所示，流式细胞技术统计肿瘤内浸润的CD8⁺T细胞的数量，发现在肿瘤组织中，联合用药组的CD8⁺T细胞的浸润数量明显高于两个单独用药组。

以上结果表明，对于PD-1抗体不敏感的小鼠恶性黑色素瘤模型，通过基因编辑技术敲低CD8⁺T细胞中Rig-I基因之后，和PD-1抗体联用增强了CD8⁺T细胞的浸润和抗肿瘤功能。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (11)

1. 一种组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括抑制剂和PD-1抗体；所述抑制剂为抑制CD8⁺T细胞中Rig-I基因和/或RIG-I蛋白的表达的试剂；所述抑制剂包括表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQID NO：1～3所示的序列中的任意一个；所述肿瘤为黑色素瘤。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列。

3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂还包括慢病毒，所述慢病毒由权利要求1中所述表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体和慢病毒包装质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述慢病毒包装质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。

6.一种组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括PD-1抗体和Rig-I表达被抑制的T细胞；所述肿瘤为黑色素瘤。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Rig-I表达被抑制的T细胞为用权利要求1中所述的抑制剂处理T细胞后制备得到的细胞。

8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂中的sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列。

9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂还包括慢病毒，所述慢病毒由权利要求1中所述表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体和慢病毒包装质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。

11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述慢病毒包装质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。