CN111526894B - 将chi3l1抑制剂作为有效成分的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物 - Google Patents

将chi3l1抑制剂作为有效成分的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能够预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物，更具体来讲，涉及增强肺对癌的免疫，而不是诱导已发生的癌的凋亡，因此在发生癌症后能够有效地抑制、防止或治疗癌症的肺转移。

Description

将CHI3L1抑制剂作为有效成分的用于预防或治疗癌症的肺转 移的药物组合物
技术领域
本发明涉及能够预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物，更具体来讲并非诱导杀灭已发生的癌，而是通过强化肺对癌症的免疫，在发生癌症后能够有效地抑制、防止或治疗癌症的肺转移的组合物。
背景技术
现代人的主要疾病中，癌症尽管经过人类数十年的努力而仍然留作不治之症。作为威胁人类健康的最大疾病的癌症是细胞经过一种突变的过程，以无限制且非调节性方式增殖及不死而发生的疾病，通过多种研究开发，开发出了相关机制及基于此的多种治疗剂，但目前还没有根本性的治疗方法。
因癌症死亡的人数中绝大部分情况缘于癌症转移，尤其通过肺转移复发的情况极多。转移(metastasis)是指癌症细胞从一个器官或其部分扩散到其他器官或器官周边部，主要来讲只有恶性癌症细胞具有转移能力。癌症细胞从原发癌症出来渗透到淋巴系统或血管系统并在血管循环，在身体其他部位的正常组织生长。癌症转移为恶性癌症的典型特征，这种癌症的转移占因癌症死亡原因的90％。
根据2014年12月保健福祉部中央癌症登记本部发表资料，乳房癌的情况下，癌症的病灶局限于原发部位的情况下发现并进行治疗时五年相对生存率为97％，扩散到周边的情况下发现并进行治疗时为90％，而从原发部位转移到远处的情况下五年相对生存率为35％，可看出有显著下降。
已发现调节这种转移的多个阶段的一些基因，但因为癌症转移是由多种遗传性或后天遗传性突变而造成的非常复杂的过程，因此在实际应用中，特定基因表达水平的增加或减小并不直接地导致结果。
发明内容
技术问题
本发明旨在解决如上所述的问题，目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物能诱导分化为Th1细胞以有效抑制癌症的肺转移。
技术方案
本发明为了达成上述目的，提供一种用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物，含有作为有效成分的用序列号1表示的Chi3l1 siRNA。
特征在于所述Chi3l1 siRNA增大IFNγ-STAT1信号传导，诱导分化成Th1细胞，减少Twist1基因表达。
所述癌症为黑色素瘤，所述药物组合物抑制黑色素瘤的肺转移。
本发明为了达成上述目的，提供一种用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物，活性成分为包括用序列号1表示的Chi3l1 siRNA的载体、含所述载体的细胞或所述细胞的培养液。
所述Chi3l1 siRNA可增加IFNγ-STAT1信号传导，诱导分化成Th1细胞，减少Twist1基因表达。
所述癌症为黑色素瘤，所述药物组合物可抑制黑色素瘤的肺转移。
所述载体可以是选自由线性DNA、质粒DNA及重组病毒性载体构成的群组的任意一种。
所述重组病毒可以是选自由逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒及慢病毒构成的群组的任意一种。
所述细胞可以是选自由造血干细胞、树突细胞、自体肿瘤细胞(autologous tumorcells)及已建立的肿瘤细胞(established tumor cells)构成的群组的任意一种。
本发明为了达成上述目的，提供一种用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物，活性成分为由下述序列号2构成的细胞透过性肽与由下述序列号1构成的Chi311 siRNA融合的复合体。
所述药物组合物可通过鼻腔途径给药到肺内。
所述药物组合物可以通过喷雾液或粉末型的吸入来给药。
所述药物组合物可以具有鼻粘膜、支气管粘膜或肺上皮细胞透过活性。
本发明为了达成上述目的，提供一种预防或治疗非人动物的癌症的肺转移的方法，通过个体的鼻腔途径给药药物组合物。
技术效果
本发明能够有效预防或治疗癌症的发生或复发，或抗癌治疗过程中癌症的肺转移。即，利用Ch3l1在肺细胞内的新的免疫功能，抑制癌症的肺转移，并且还具有对转移到肺的癌症的有效的治疗效果。
而且，本发明的药物组合物并非基于诱导癌症凋亡，而是提高基于肺细胞的Th1、CTL响应的肺细胞的免疫功能，因此比基于癌细胞的凋亡的现有癌症治疗剂明显更稳定。
并且，本发明通过以往无法达到有效的治疗及预防效果的通过呼吸器的鼻腔给药方式提高现有肺细胞透过、传递效率，达到更有效地防止及抑制癌症的肺转移的效果，因此能够实现迅速、快捷且高效的治疗或预防效果。
附图说明
图1为示出本发明的siChi3l1(左)与dNP2-siChi3l1复合体(右)的结构的示意图。
图2是示出在脾脏免疫细胞增殖过程中，测定几丁质酶(chitinase)与Chi3l1基因、Chi3l3(Ym-1)基因、壳三糖酶(chitotriosidase)与AMCase的基因表达的结果的图表。
图3为测定未成熟CD4 T细胞与激活的CD4 T细胞中几丁质酶样蛋白(Chitinase-like protein)(Chi3l1，Ym-1)与几丁质酶(chitotriosidase，AMCase)的表达的结果的图表。
图4为示出测定未成熟CD8 T细胞与激活的CD8 T细胞中几丁质酶样蛋白(Chitinase-like protein)(Chi3l1，Ym-1)与几丁质酶(chitotriosidase，AMCase)的表达的结果的图表。
图5为分析比较初级及次级淋巴管中存在的WT(野生型)小鼠与Chi3l1 KO小鼠的免疫细胞的增殖的结果。具体来讲图5a是示出通过流式细胞分析法测定胸腺中CD4+CD8+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞的百分比的结果的图表，图5b及图5c示出通过流式细胞分析法测定脾脏中树突细胞(CD11c+MHCII+)及巨噬细胞(CD11b+)的百分比的结果的图表，图5d至图5f是通过流式细胞分析法分析脾脏、周围(鼠蹊)淋巴结、肠系膜淋巴结中免疫细胞并示出的图表，图5g为通过流式细胞分析法测定CD4 T细胞中Foxp3表达的结果的图表。所述数据为至少五次独立实验的平均，标记为±SD。
图6a为通过流式细胞分析法测定通过MACS分选的WT(野生型)及Chi311 KO的未成熟(naive)CD4 T细胞中IFNγ及IL-4表达的结果的示意图，图6b为量化图6a的结果示出的图表。在此，WT(野生型)及Chi311 KO的未成熟(naive)CD4 T细胞是通过三日的TcR刺激活化的。图6c为通过TcR刺激WT(野生型)及Chi311 KO小鼠的脾脏细胞后，通过ELISA测定其培养上清液以测定IFNγ、IL-2、IL-4及IL-17细胞因子表达的图表。数据为三次独立实验的平均±标准偏差。n.d表示未检测到，ns表示非显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图7a为分析在通过CD3及CD28抗体刺激活化的WT(野生型)未成熟CD8 T细胞及Chi311KO未成熟CD8 T细胞中IL-2细胞因子与IFNγ表达并示出的示意图，图7b为示出在WT(野生型)未成熟CD8 T细胞及Chi311 KO未成熟CD8 T细胞中IFNγ的表达程度的图表，图7c为在图7a的培养上清液中IFNγ与TNFα的ELISA测定结果图表。数据为三次独立实验的平均±标准偏差。n.d表示未检测到，ns表示非显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图8a为非激活条件(upper)与抗-CD3和CD28刺激条件(lower)三日后通过CFSE分析来分析分裂的WT(野生型)CD4 T细胞与Chi311 KO CD4 T细胞的含量并示出的示意图。图8b为根据图8a的结果示出分裂的细胞与未分裂的细胞的百分比的图表。数据为三次独立实验的平均±标准偏差。n.d表示未检测到，n.s表示非显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图9a为示出WT(野生型)CD4 T细胞；Chi311 KO未成熟CD4 T细胞；用抗-CD3及抗-CD28刺激的WT(野生型)CD4 T细胞；用抗-CD3及抗-CD28刺激的Chi311 KO未成熟CD4 T细胞的蛋白质印记结果的示意图。图9b为示出图9a用β-肌动蛋白规范化归一化到β-肌动蛋白图9a，并测定关于其的，测定对于其的各靶分子的相对浓度的结果的图表。数据为三次独立实验的平均±标准偏差。n.d表示未检测到，ns表示非显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图10为用于分析Chi3I1 KO CD4 T细胞通过敏感的IFNγ反应分化成Th1和Th2的样态的结果。
具体来讲，图10a为测定在特定细胞因子偏斜(cytokine-skewing)条件下WT(野生型)未成熟CD4 T细胞与Chi311 KO未成熟CD4 T细胞分化成Th1、Th2及Th17细胞的样态的示意图。为了分析血清-特异细胞因子(lineage-specific cytokine)表达而执行了细胞内细胞因子染色。图10b为显示对应图10a的结果的子集的细胞因子的百分比的图表。但位于最上端的图表是关于Th1细胞的图表，位于中间的图表是关于Th2细胞的图表，位于最下端的图表是关于Th17的图表。数据是共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
图10c为通过ELISA分析图10a的培养上清液中IFNγ、TNFα、IL-4及IL-17并示出的图表。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
图10d为通过定量实时PCR分析图10a中分化的T细胞的细胞因子与转录因子的RNA表达水平的图表。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
图10e为通过蛋白质印记测定野生型Th1、Th2细胞与Chi3l1 KO Th1、Th2细胞中STAT磷酸化的示意图(左侧)与通过对于蛋白质印记的相对浓度分析量化的总STAT图表(右侧)。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
图10f为将野生型未成熟CD4 T细胞与Chi3l1 KO未成熟CD4 T细胞用所示浓度的IFNγ中和抗体分化成Th1细胞，经过三日后收获细胞，通过细胞内染色测定IFNγ与IL-4表达的示意图。图10g为相对于无IFNγ中和抗体的野生型Th1细胞中IFNγ表达的IFNγ表达的百分比的图表。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
图11a为通过20ng/ml IFNγ处理用FACS分选的野生型未成熟CD4 T细胞与Chi3l1未成熟CD4 T细胞后，通过经细胞因子处理的细胞溶解适当时间(0、5、10、20分钟)，通过BCA测定法定量蛋白质后，通过蛋白质印记测定pSTAT1的水平的示意图。
图11b通过柱状图示出对于图11a中β-肌动蛋白的pSTAT1的相对强度。数据为共两次独立实验的平均±标准偏差。**p<0.01。
图12a示出通过FACS AriaΙIΙ分选野生型未成熟CD8 T细胞与Chi3l1未成熟CD8 T细胞，用指定浓度(0、5、20μg/ml)IFNγ中和抗体的同时通过平板结合的抗-CD3、CD28、Il-2进行了激活之后，通过基于ICS的流式细胞分析法测定IFNγ与粒酶B(Granzyme B)表达的示意图。
图12b、c为量化图12a中IFNγ(b)与粒酶B(c)的相对％示出的图表。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。*p<0.05，***p<0.001。
图13a比较未成熟细胞(naive)、Th1-偏斜野生型CD4 T细胞、Chi3l1 KO CD4 T细胞中100-b pRNA碱基序列，是量化野生型Th1细胞(WT-Th1)与Chi3l1 KO Th1细胞(KO-Th1)中被上调的基因，比较野生型Th1细胞与相关的Chi3l1 KO Th1细胞中增加的基因，筛选出感兴趣的基因示出的图表。
图13b为与上调(红色)或下调(蓝色)相关的感兴趣的基因的热图(heatmap)分析结果。图13c为关于野生型Th1细胞与相关的Chi3l1 KO Th1中具有最小两倍的下调、上调效果的RNA-测序数据的散布度(scatterplot)。
图13d为通过定量实时PCR分析图13c中与IFNγ作用机制和细胞毒性相关的基因的表达的结果图表。图13e为激活野生型CD8 T细胞与Chi3l1 KO CD8 T细胞，并通过定量实时PCR分析其中感兴趣的基因的结果图表。在各图表上端标记了分析对象基因(作为一例SOCS1，SOC S3...CCR5，T-bet等)。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的。**p<0.01，***p<0.001。
图14a为向野生型模型与Chi3l1 KO模型中作为Ⅳ给药注射5×105B 16F10黑色素瘤细胞，二周后分析的结果。
图14b为测定注射了5×105 B16F10黑色素瘤细胞的野生型模型与Chi3l1 KO模型的肺中胸膜集落的相对大小与数量的图表。
图14c为通过H&E染色分析从注射了5×105 B16F10黑色素瘤细胞的野生型模型与Chi3l1 KO模型摘出的肺组织的结果。
图14d-g为从注射了5×105 B16F10黑色素瘤细胞的野生型模型与Chi3l1 KO模型的肺通过珀可(Percoll)得到肺淋巴球细胞，并通过流式细胞分析法对其进行测定的结果，通过细胞内细胞因子染色测定CD4 T细胞、CD8 T细胞、NK细胞及非淋巴细胞群(non-lymphocytic polulati on)的IFNγ、Foxp3、粒酶B的示意图及图表。在各图表标出了相应的基因与模型。图14e、g记载了IFNγ+、Foxp3+及粒酶B+的MFI的代表性的百分比。
图14h为测定从注射了5×105B16F10黑色素瘤细胞的野生型模型与Chi3l1 KO模型分离的肺淋巴球细胞中分子的表达的图表。
图14i为在多种E:T比例条件下，测定对B16F10靶细胞的野生型CD8 T细胞与Chi3l1 KO CD8 T细胞的细胞毒性的图表，图14j为测定野生型CD8 T细胞、Chi3l1 KO CD8T细胞与N K细胞的细胞毒性的图表。
图15a为dNP2-HA2肽与Chi3l1 siRNA融合形成的dNP2-siChi3l1复合体的结构的示意图。
图15b为对应于N/P比例的dNP2-siChi3l1复合体的琼脂糖凝胶阻滞(retardation)分析结果。
图15c为对HEK293T细胞通过脂质体(Lipofectamine)用Chi3l1 siRNA处理的情况下(Lipo-siChi3l1)，用dNP2-siChi3l1复合体处理的情况下(dNP2-siChi3l1)，从所述HEK293 T细胞测定Chi3l1 mRNA的表达水平并示出的图表。图15d为通过ELISA从所述图15c分析Chi3l1的相对表达水平的图表。在此，使用了通过pDNA(阴性对照组；用pDNA+标记)过表达Chi3l1的所述HEK293T细胞。未用pDNA处理的HEK293T细胞为阳性对照组，标记为pDNA-。
图15e为显示对黑色素瘤肺癌转移动物模型通过鼻腔处理dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1后，分析在肺中Chi3l1 mRNA表达量的图表。以第0日表达的Chi3l1 mRNA为基准，计算各日期测定的Chi3l1 mRNA的相对表达量并做了标记。
图15f显示了对黑色素瘤肺转移动物模型通过鼻腔处理dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1后，通过蛋白质印记分析在肺中Chi3l1蛋白质表达水平的结果。图15g显示了通过对图15f的结果进行密度分析(densitometric analysis)来计算相对于β-肌动蛋白的Chi3l1蛋白质表达水平的图表。相对于β-肌动蛋白带强度量化了Chi3l1带强度。
图15h为用多种浓度(100ng、250ng)的dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1对野生型未成熟CD4T细胞进行处理，培养五日后测定是否分化成Th1细胞并示出的图表(左)、以及各情况下通过流式细胞分析来分析IFNγ及TNFα表达程度并示出的图表(右)。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图15i为用多种浓度(100ng，250ng)的dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1对被抗-CD3、抗-CD28及IL-2激活的野生型未成熟CD8 T细胞进行处理，培养三日后测定是否分化成CD8T细胞并示出的图表(左)、以及通过流式细胞分析来分析各情况下IFNγ及TNFα表达程度的图表(右)。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图16a为简要示出利用黑色素瘤肺转移动物模型制造对照组与实验组的方法的示意图。
图16b为从用dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1处理的黑色素瘤肺转移动物模型摘出的肺的照片。
图16c为测定用dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1处理的黑色素瘤肺转移动物模型的肺上形成的胸膜集落(pleural colonies)的相对大小与数量的图表。
图16d为对用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组用H&E染色肺部分并用光学显微镜拍摄的图像。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图16e为从用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组通过珀可(Percoll)分离的肺淋巴球(lymphocytes)通过流式细胞分析来分析CD4与CD8 T细胞中IF Nγ、粒酶B的结果图表。
图16f为在用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组分离的肺组织，通过细胞内存在的细胞因子染色分析CD4+IFNγ+或CD8+IFNγ+群中T-bet的图表。图16h、g为具体分析图16f中MFI并示出的图表。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图16i为分析从用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组通过珀可(Percoll)分离的肺淋巴球部分靶向基因的表达并示出的图表。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图17是用于确认用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组中NK细胞功能不产生影响的实验，图17a为通过流式细胞分析来分析从用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组通过珀可(Percoll)分离的肺淋巴球中NK细胞(NK1.1+CD4-CD8-)与非淋巴细胞群(NK1.1-CD4-CD8-)的结果图表。
图18为示出实验例8.甲中实验组与对照组的实验条件的示意图。
图19为显示实验例8.甲的实验组与对照组中肺表面上可视化成黑点的黑色素瘤集落的计数的图表。
图20为从实验例8的实验组与对照组摘出的肺的照片。
图21及图22为通过珀可梯度(percoll gradient)在从实验例8.甲中实验组与对照组摘出的肺中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表。
图23为通过珀可梯度在从实验例8.甲中实验组与对照组摘出的脾脏中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表。
图24为通过珀可梯度在从实验例8.甲中实验组与对照组摘出的腹股沟淋巴结中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表。
图25为示出实验例8.乙中实验组与对照组的实验条件的示意图。
图26为显示实验例8.乙的实验组与对照组中肺表面上可视化成黑点的黑色素瘤集落的计数的图表。
图27为从实验例8.乙的实验组与对照组摘出的肺的照片。
图28为通过珀可梯度在从实验例8.乙中实验组与对照组摘出的肺中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表。
图29为通过珀可梯度在从实验例8.乙中实验组与对照组摘出的脾脏中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表。
图30为通过珀可梯度在从实验例8.乙中实验组与对照组摘出的腹股沟淋巴结中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表。
具体实施方式
以下对本发明的各方面及多种实施例进行更具体的说明。
本发明的一个方面涉及含有作为有效成分的用序列号1表示的Chi3l1 siRNA的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物。几丁质酶(chitinase)是在植物分解几丁质，起到针对病原体保护宿主的防御作用的酶，几丁质酶样蛋白(chitinase-like proteins；CLPs)在哺乳动物中也有发现，但这些虽然具有结合到几丁质的蛋白信号，但不具有分解几丁质的活性。哺乳动物中几丁质酶样蛋白已演变成起到调节Th2炎症、免疫反应的作用。
经过确认，所述CLP中被称作几丁质酶3-样3(chitinase 3-like 3,Chi3l3)的Ym-1与被称作几丁质酶3-样4(chitinase3-like4，Chi3l4)的Ym-2在线虫感染模型中增加γδT细胞数与IL-17产生，已知能够调节与过敏相关的Th2炎症。
并且已知被称作几丁质酶3样-1(chitinase3-like1，Chi3l1)的BRP-39具有对肺炎链球菌(strep tococcus pneumoniase)感染与第二型炎症的治疗效果，但对哺乳类的适应免疫过程中Chi311的具体免疫调节功能与治疗靶向性方面没有任何了解。
因此本发明通过体内、外的实验(in vitro，in vivo)确认了在活化的T细胞(例如Th2细胞)中Chi311表达增加，缺少Chi311的T细胞对TcR刺激出现过敏反应，在Th1细胞的分化方面IFNγ-STAT1信号传递增加的情况下变得容易分化为Th1细胞，同时确认了在缺少Chi1l1的Th1细胞中抗肿瘤免疫基因的表达增加，并且Twist1之类的Th1阻碍基因减少，由此发现了Chi311基因影响癌症的肺转移。
并且经过用不存在Chi311的动物模型进行分析，确认了IFNγ、T-bet、粒酶B-产生的CD4及CD8 T细胞增加，黑色素瘤的肺转移减少。
根据上述结果直接给药Chi311基因的情况下，对肿瘤细胞并不特异，存在对正常细胞等造成副作用的问题。因此为了解决这种问题的同时达成优良的预防或治疗效果而通过大量实验完成了本发明。
为此，通过多种实验确认了本发明的序列号1的siChi3l1基因在发生转移性高的癌症时，能够预防或治疗所述癌细胞的肺转移。
所述癌症是指一般的癌，所述癌症可以是包括脑肿瘤、脊髓肿瘤、视网膜细胞肿瘤、口腔癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、咽癌、喉癌、颈部癌在内的头颈部癌，包括黑色素瘤的皮肤癌、包括乳房癌、甲状腺癌、恶性肾上腺肿瘤在内的乳房癌、包括内分泌癌、肺癌、胸膜肿瘤、恶性肾上腺肿瘤的呼吸器官癌、包括食道癌、胃癌、小肠的恶性肿瘤、大肠癌、肛门癌、肝癌、胆道癌或胰腺癌在内的消化器官癌、肾脏癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌或阴茎癌在内的泌尿器癌、包括宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜上皮癌或卵巢癌在内的妇科癌、包括急性或慢性白血病、恶性淋巴瘤或多发性骨髓病在内的血液癌、包括骨肿瘤或软组织肿瘤在内的骨或软组织肿瘤及包括小儿白血病或小儿实体肿瘤在内的小儿癌等，优选地，可以是黑色素瘤。并且在本发明中所谓的癌症的转移是指在特定部位发生的癌或复发癌转移到肺部位。
所述复发癌是指通常的癌治疗后复发的癌。
本发明的用序列号1表示的Chi3l1 siRNA是特异地结合在Chi3l1基因的mRNA以抑制Chi3l1表达的siRNA。所述Chi3l1基因是与癌症的肺转移相关的基因。因此通过SiRNA抑制Chi3l1基因表达的情况下，通过提高在肺中的Th1与CTL功能，增进肺的免疫功能，以抑制肿瘤的生长与发展而不是诱导杀灭肿瘤，从而能够作为预防及治疗在特定部位发生的癌或复发癌的肺转移的用途。
所述Chi3l1 siRNA增加IFNγ-STAT1信号传导，诱导分化为Th1细胞，减少Twist1基因表达，从而能够达到本发明的上述效果。
在此，所述siRNA的碱基序列只要是能够抑制chi3l1的活性便不局限于此，但优选的是使用序列号1，所述siRNA的3'末端可进一步包括dTdT的碱基序列。所述序列号1的siChi3l1序列为靶部位具有小鼠的Chi3l1。
本发明的术语‘siRNA(short interfering RNA，短干扰RNA)’是指能够诱发抑制基因的活性的RNAi的双链RNA。在本发明中siRNA是指能够抑制Chi3l1的活性的siRNA，所述siRNA只要诱发RNAi则无论为何种形态均可，例如，可使用通过化学合成或生化合成或体内合成收获的siRNA，或约40个碱基以上的双链RNA在体内分解的10个碱基对以上的双链RNA等。
所述siRNA可以由相对于Chi3l1的核酸序列的一部分具有约70％以上，优选为75％以上，更优选为80％以上，更更优选为85％以上，更更更优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为100％的相同性的序列构成，也可以使用包括双链部分的RNA或其改变体。具有相同性的序列部分通常为至少15核苷酸以上，优选为约19核苷酸以上，更优选为至少20核苷酸以上，更更优选为21核苷酸以上。并且，优选的是所述siRNA由能够相辅地结合于Chi3l1的碱基序列中与其他RNA的相同性最低的区域的碱基序列构成。
本发明的药物组合物的最大优点在于尽管直接给药siRNA，但不利用载体或承载体也能够预防或治疗癌转移的效果。
本发明的另一方面涉及有效成分为包括用序列号1表示的Chi3l1 siRNA的载体、含所述载体的细胞或细胞培养液的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物。
本发明中所述“含Chi3l1 siRNA的载体”包括含在细胞内能够转印可转换成所述siRNA的shRNA的多核苷酸的载体。
本发明的术语‘shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)’是指单链RNA中部分包括回文碱基序列，从而3'区域具有双链结构且形成为发夹一样的结构，在细胞内表达后被细胞内存在的作为RNase的一种RNA酶(dicer)切断从而能够转换成siRNA的RNA，所述双链结构的长度不受特殊限制，但优选为10核苷酸以上，更优选为20核苷酸以上。在本发明中，所述shRNA可包含于载体，将含所述shRNA的载体导入细胞的情况下，所述shRNA在细胞内表达，表达的所述shRNA被细胞内存在的作为RNase III的一种的dicer切断而转换成siRNA，转换的所述siRNA能够诱发RNAi以抑制Chi3l1的活性。
所述载体并不特别局限于此，但可以是选自由线性DNA、质粒DNA及重组病毒性载体构成的群组的任意一种，所述重组病毒可以是选自由逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒及慢病毒构成的群组的任意一种。
所述细胞可以是选自由造血干细胞、树突细胞、自体肿瘤细胞(autologous tumorcells)及已建立的肿瘤细胞(established tumor cells)构成的群组的任意一种。
如上所述，本发明的药物组合物可以是为了给药而除了包括以上记载的有效成分以外进一步地包括一种以上的制药学上可接受的承载体以制剂化成药物组合物得到的。
作为制剂化成液态溶液的组合物中可接受的制药承载体是灭菌及适于活体的，可以使用食盐水、灭菌水、林格式溶液、缓冲食盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及这些成分中一种以上成分的混合物，可根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、杀菌剂等其他常规的添加剂。
并且，所述用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物可以除了使用所述有效成分外还使用制药学上合适且生理学上可接受的佐剂制成，作为所述佐剂可采用赋形剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、封装剂、膨胀剂、润滑剂、助流剂或香味剂等增溶剂。
并且，本发明的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物可以附加地添加稀释剂、分散剂、界面活性剂、粘合剂及润滑剂以制剂化为水溶液、悬浊液、乳浊液等注射用剂型、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。进一步地，可通过本领域适当的方法利用雷明顿《制药科学》，Mack出版社，宾夕法尼亚州伊斯顿(Remington's Pharmaceutical Science，MackPublishing Compa ny，Easton PA)中公开的方法，根据各疾病或成分优选地制剂化。
并且，本发明的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物可通过静脉内、动脉内、腹腔内、肌肉内、动脉内、腹腔内、胸骨内、经皮、鼻内、鼻腔、吸入、关节、直肠、口服、眼球内或皮内途径以一般方式给药，但最优选的可以是通过鼻腔途径注射。通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、经皮给药等其他给药途径给药的情况下，具有为了得到同等效果而需要以两倍以上的浓度给药药物组合物的缺点，因此为了用少量得到最大效果，优选的是通过鼻腔吸收。
本发明的组合物还可以含有制造药物组合物方面通常使用的适当的承载体，赋形剂及稀释剂。本发明的药物组合物只要是能够通过鼻腔途径给药的剂型则并不特别局限于此，但在本发明中使用的“通过鼻腔途径给药”包括能够与稳定剂或其他赋形剂的添加无关地通过溶液型、粉末型或气雾化或喷雾化溶液型或粉末型的吸入使得能够通过鼻腔给药气道或肺，从而所述药物组合物能够给药到气道、器官、支气管肺泡的所有给药型。
具体来讲，作为鼻腔途径给药方法可使用利用压缩空气/氧气混合物的加压喷雾器、超声波喷雾器、电动微泵喷雾器、定量吸入器(MDI)及干粉吸入装置(DPI)。气雾剂的情况下可通过机械式换气或被插入管的患者的气管内管输送。
本发明的药物组合物中能够包含的承载体、赋形剂及稀释剂可列举乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油。制剂化的情况下用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、界面活性剂等稀释剂或赋形剂调制。
在本发明中使用的术语“给药”是指通过任意适当的方法向个体提供指定的本发明的组合物。
本发明的药物组合物的优选给药量随着个体的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及时长而异，但可以由本领域技术人员适当选择。为了优选效果，本发明的组合物可以以每日0.01ng/kg至1000mg/kg给药。关于给药，可一日给药一次，也可以分数次给药。所述给药量无论从任何角度都不限定本发明的范围。
本发明的又一方面涉及以由下述序列号2构成的细胞透过性肽与由下述序列号1构成的Chi311 siRNA融合的复合体为有效成分的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物。
本发明是根据以上说明的关于Chi311基因的结果，为了用少量也能够达到优良的预防或治疗效果而经过努力完成的，在体外、体内确认了通过细胞渗透肽dNP2-HA2与Chi311的siRNA的复合体(dNP2-siChi3l1)向鼻腔给药的情况下，由于Th1与CTL增加从而有效抑制肺转移。并且所述药物组合物并非诱导癌细胞凋亡，而是增进基于siChi31l的复合体的免疫调节功能提高效果，提高基于肺细胞的Th1、CTL反应的肺细胞的免疫功能，因此相比于以往基于癌细胞杀灭的现有癌治疗剂明显更稳定且有效。
并且本发明的复合体使得以上说明的以Chi3l1基因为靶的siRNA能够靶选择性地透过细胞以发挥最大治疗效果，从而能够有效抑制及防止癌转移。
本发明的dNP2-siChi3l1复合体可通过多种途径给药，但优选的可以是通过鼻腔途径给药，确认了通过鼻腔途径给药的情况下，相比于通过其他途径给药对癌症的肺转移的药理效果明显更优(2～3倍以上)。
本发明的复合体相比于单独使用siChi3l1的情况，容易生成、构成单纯、潜在稳定性更优异。并且无不受控制地复制的危险性，无需利用病毒或非病毒载体，因此无需担心转染的情况下的潜在副作用，从而可以认为非常稳定。并且，相比于利用载体之类的传递体，合成非常低廉且传递效率非常优良(通过给药低浓度的siChi3l1达到最大的预防或治疗效果)，因此在经济方面有极大益处。
最大益处在于本发明的复合体并不为了达到适当的药物分布而依赖于扩散，不同于根据通过注射治疗物质在肺的细胞外空间之间生成的压力梯度分散，因此药物分布不均且通过基于浓度梯度的扩散分布，所述复合体具有细胞透过性，因此用少量也能够使得siChi3l1整体均匀地传递及透过到肺中相当大的部分的细胞内外，以达到最大的预防或治疗效果。
杀灭癌细胞的情况下对特定癌细胞进行局部治疗就能够充分达到其效果，而若想如本发明抑制及防止癌症的肺转移，仅凭局部分布是难以达到其效果的，因此很显然如本发明的复合体整体均匀地分布及传递对抑制及防止癌转移提供极大益处。
对此，通过多种实验确认了本发明的由下述序列号2构成的细胞透过性肽与由下述序列号1构成的Chi311 siRNA融合的复合体在发生了转移性高的癌的情况下，能够预防或治疗所述癌细胞转移到肺。
所述癌症是指一般的癌，所述癌症可以是包括脑肿瘤、脊髓肿瘤、视网膜细胞肿瘤、口腔癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、咽癌、喉癌、颈部癌在内的头颈部癌，包括黑色素瘤的皮肤癌、包括乳房癌、甲状腺癌、恶性肾上腺肿瘤在内的乳房癌、包括内分泌癌、肺癌、胸膜肿瘤、恶性肾上腺肿瘤的呼吸器官癌、包括食道癌、胃癌、小肠的恶性肿瘤、大肠癌、肛门癌、肝癌、胆道癌或胰腺癌在诶的消化器官癌、肾脏癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌或阴茎癌在内的泌尿器癌、包括宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜上皮癌或卵巢癌在内的妇科癌、包括急性或慢性白血病、恶性淋巴瘤或多发性骨髓病在内的血液癌、包括骨肿瘤或软组织肿瘤在内的骨或软组织肿瘤及包括小儿白血病或小儿实体肿瘤在内的小儿癌等，优选地，可以是黑色素瘤。并且在本发明中所谓的癌症的转移是指在特定部位发生的癌或复发癌转移到肺部位。
所述复发癌是指通常的癌治疗后复发的癌。
在本发明中所述的“复合体”包括由下述序列号2构成的细胞透过性肽与由下述序列号1构成的siChi3l1，是指这些通过遗传性融合或化学结合形成的共价键复合体。
并且，所述“遗传性融合”是指通过编码蛋白质的DNA序列的遗传性表达形成的线性、通过共价键构成的连接。
并且，对于所述dNP2-siChi3l1复合体，确认了混合所述序列号2的dNP2-HA2与序列号1的siChi3l1制造的情况下，所述混合比例不足10:1的情况下，无法正常形成复合体，或者即使通过鼻腔途径给药也无法有效传递到肺内，从而具有siChi3l1无法透过及靶向的问题。
因此对于所述dNP2-siChi3l1复合体，混合所述序列号2的dNP2-HA2与序列号1的siChi3l1制造的情况下，所述序列号2的dNP2-HA2与序列号1的siChi3l1的混合比例，即，dNP-HA2肽的氮原子(N)与核酸骨架磷酸盐(P)之比可以为10-40:1，可更优选22-28:1，可最优选25:1。
确认了通过鼻腔途径给药本发明的dNP2-siChi3l1复合体的情况下，相比于以往通过其他途径给药siChi3l1或所述复合体，对癌症的肺转移的药理效果明显更优(2～3倍以上)。
在本发明的实验例中通过注射黑色素瘤细胞诱导的黑色素瘤肺转移动物模型中，给药了dNP2-siChi3l1复合体时，调查免疫调节效果的结果为Th1、CTL功能提高，缘于黑色素瘤的肺转移被显著抑制了2～6倍左右。
将本发明的dNP2-siChi3l1复合体通过鼻腔途径以外的其他途径给药的情况下，可能会发生为了达到本发明的对癌症的肺转移的药理效果而需要给药两倍以上的浓度的缺点。
所述癌症是指一般的癌，所述癌症可以是包括脑肿瘤、脊髓肿瘤、网膜细胞肿瘤、口腔癌、鼻腔癌、鼻窦癌、咽癌、喉头癌、颈部癌在内的头颈部癌，包括黑色素瘤的皮肤癌、包括乳房癌、甲状腺癌、恶性肾上腺肿瘤在内的乳房癌、包括内分泌癌、肺癌、胸膜肿瘤、恶性肾上腺肿瘤的呼吸器官癌、包括食道癌、胃癌、小肠的恶性肿瘤、大肠癌、肛门癌、肝癌、胆道癌或胰腺癌在内的消化器官癌、肾脏癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌或阴茎癌在内的泌尿器癌、包括宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜上皮癌或卵巢癌在内的妇科癌、包括急性或慢性白血病、恶性淋巴瘤或多发性骨髓病在内的血液癌、包括骨肿瘤或软组织肿瘤在内的骨或软组织肿瘤及包括小儿白血病或小儿实体肿瘤在内的小儿癌等，优选地，可以是黑色素瘤。并且在本发明中所谓的癌症的转移是指在特定部位发生的癌或复发癌转移到肺部位。
所述复发癌是指通常的癌治疗后复发的癌。
本发明的药物组合物可以是为了给药而除了包括以上记载的有效成分以外进一步地包括一种以上制药学上可接受的承载体以制剂化成药物组合物得到的。
作为制剂化成液态溶液的组合物中可接受的制药承载体是灭菌及适于活体的，可以使用食盐水、灭菌水、林格式溶液、缓冲食盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及这些成分中一种以上成分的混合物，可根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、杀菌剂等其他常规的添加剂。
并且，所述用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物可以除了使用所述有效成分外还使用制药学上合适且生理学上可接受的佐剂制成，作为所述佐剂可采用赋形剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、封装剂、膨胀剂、润滑剂、助流剂或香味剂等增溶剂。
并且，本发明的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物可以附加地添加稀释剂、分散剂、界面活性剂、粘合剂及润滑剂以制剂化为水溶液、悬浊液、乳浊液等注射用剂型、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。进一步地，可通过本领域适当的方法利用雷明顿《制药科学》，Mack出版社，宾夕法尼亚州伊斯顿(Remington's Pharmaceutical Science，MackPublishing Company，Easton PA)中公开的方法，根据各疾病或成分优选地制剂化。
并且，本发明的用于预防或治疗癌症的肺转移的药物组合物可通过静脉内、动脉内、腹腔内、肌肉内、动脉内、腹腔内、胸骨内、经皮、鼻内、鼻腔、吸入、关节、直肠、口服、眼球内或皮内途径以一般方式给药，但最优选的可以是通过鼻腔途径注射。通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、经皮给药等其他给药途径给药的情况下，具有为了得到同等效果而需要以两倍以上的浓度给药药物组合物的缺点，因此为了用少量得到最大效果，优选的是通过鼻腔吸收。
本发明的组合物还可以含有制造药物组合物方面通常使用的适当的承载体，赋形剂及稀释剂。本发明的药物组合物只要是能够通过鼻腔途径给药的剂型则并不特别局限于此，但在本发明中使用的“通过鼻腔途径给药”包括能够与稳定剂或其他赋形剂的添加无关地通过溶液型、粉末型或气雾化或喷雾化溶液型或粉末型的吸入使得能够通过鼻腔给药气道或肺，从而所述药物组合物能够给药到气道、器官、支气管肺泡的所有给药型。
具体来讲，作为鼻腔途径给药方法可使用利用压缩空气/氧气混合物的加压喷雾器、超声波喷雾器、电动微泵喷雾器、定量吸入器(MDI)及干粉吸入器(DPI)。气雾剂的情况下可通过机械式换气或被插入管的患者的气管内管输送。
本发明的药物组合物中能够包含的承载体、赋形剂及稀释剂可列举乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油。制剂化的情况下用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、界面活性剂等稀释剂或赋形剂调制。
在本发明中使用的术语“给药”是指通过任意适当的方法向个体提供指定的本发明的组合物。
本发明的药物组合物的优选给药量随着个体的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及时长而异，但可以由本领域技术人员适当选择。为了优选效果，本发明的组合物可以以每日0.01ng/kg至1000mg/kg给药。关于给药，可一日给药一次，也可以分数次给药。所述给药量无论从任何角度都不限定本发明的范围。
本发明的又一方面涉及通过个体的鼻腔途径给药所述药物组合物，以实现预防或治疗除人类以外的动物的癌症的肺转移的方法。
可以通过鼻内(nasal)、粘膜内(mucosal)、吸入(inhalation)的途径给药，以将所述药物组合物注射到活体或细胞内。所述传递方法不仅在传递到培养细胞时，而且在传递到一般的体内，即传递到动物细胞、动物组织及动物体时也能够充分扩展适用。
所述药物组合物是无免疫原性、非感染性的并且不受质粒大小的限制，因为DNA不封装进逆转录病毒或腺病毒之类的载体有机体中。因此可以用于任何实用大小的重组基因表达构建体。
发明的实施方式
以下通过实施例等对本发明进行更具体的说明，但不得通过以下实施例等缩小或限制本发明的内容及范围进行解释。并且，基于包括以下的实施例的本发明的公开内容的情况下，显然本领域一般技术人员能够轻易实施未具体给出实验结果的本发明，这种变形及修正理所当然属于所附权利要求范围。
<实验方法>
1)动物模型
使用了6-8周龄的C57BL/6J小鼠。使用的Chi3l1 KO小鼠是由杰克·埃里亚斯(布朗大学)(Jack A Elias(Brown University))提供。所有小鼠都在特定无菌设施(汉阳大学)进行了饲育及保管，保持了21±1℃温度，50±5％湿度及12小时周期的昼夜周期(regular chow，PicoLab Rodent Diet)的设施条件。定期提供了食物及灭菌水(autoclaved water)。
所有动物协议都是经汉阳大学动物实验伦理委员会的批准执行的，实验是根据汉阳大学动物实验伦理委员会的指导方针(guidelines)执行的。
2)在体外T细胞激活及分化(differentiation)
按照小鼠CD4+CD25-CD62L+T细胞分离用试剂盒Ⅱ(美天旎生物(MiltenyiBiotec))的说明书分离了WT与Chi3l1 KO未成熟CD4 T细胞。纯度(purity)为约95％。按照FACS Aria细胞分选机(BD生物科学，富兰克林湖(BD Biosciences，Franklin Lakes)，NJ)分选了用荧光染料(Fluor ochrome)标记的CD4+CD25-CD44-CD62L高CD44低未成熟CD4 T细胞与CD8+CD25-CD44-CD62L高未成熟CD8 T细胞，在此纯度为约98％。纯化的未成熟CD4与CD8 T细胞被2μg/ml板结合抗CD3、抗CD28抗体(BD Biosciences)激活，暴露在以下细胞因子三日或五日以进行了分化；只单独使用关于Th0的培养基；包括用于CTL的IL-2(50U/ml派普泰克(Peprotech))；用于Th1的IL-12(0.2ng/ml，BD Biosciences)、IL-2(50U/ml)，及抗IL-4抗体(5μg/ml，BD Biosciences)；用于Th2的IL-4(30ng/ml，BD Biosciences)、IL-2(50U/ml)及抗IFNγ抗体(5μg/ml，BD Biosciences)；及用于Th17的TGF-β(0.5ng/ml，R&D Systems(R&D体系))、IL-6(30ng/ml，BD Biosciences)、IL-23(20ng/ml，BD Biosciences)、IL-1β(20ng/mlR&DSystems)、抗-IFNγ(5μg/ml)及抗IL-4(5μg/ml)抗体。
为了测定在Th2子集中IL-4的表达，第五日收获Th2细胞并用板结合抗CD3抗体进一步激活了24小时。在部分实验中，在Th1-或CTL偏斜(skewing)条件下添加了指定的量的rmChi3l1蛋白质或IFNγ-中和抗体或指定量的dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1。使用ELISA(eBioscience)从培养上清液测定Il-2、IFNγ、IL-4及Il-17。
3)流式细胞分析(flow cytometry)
为了测定细胞增殖，用CFSE(0.75μM，In vitrogen)在37℃对分选的WT与Chi3l1KO未成熟CD4 T细胞染色十分钟，用完全RPMI培养基进行了清洗。对CFSE标记的细胞用板结合的抗-CD3及抗-CD28抗体一起刺激了共三日。对分裂的细胞(Dividing cells)用抗-小鼠CD4-PerCP-Cy5.5抗体一起染色后，通过流式细胞分析法进行了分析。为了分析细胞内细胞因子表达水平，用eBioscience细胞刺激鸡尾酒(添加蛋白质转运抑制剂)对细胞再刺激了四小时，并用抗-小鼠CD4-PerCP-Cy5.5或CD8-PerCP-Cy5.5染色了15分钟。细胞进一步被固定并浸出，用抗-小鼠IFNγ-FITC、IL4-PE或TNFα-PE及IL-17-APC对CD4 T细胞进行染色，或用IFNγ-APC、TNFα-PE、粒酶B-FITC对CD8 T对细胞进行了染色。通过流式细胞分析法对细胞进行了分析。
在肺黑色素瘤转移模型(pulmonary melanoma metastasis model)中，用eBioscience细胞刺激鸡尾酒(添加蛋白质转运抑制剂)对纯化的淋巴球再刺激了四小时，用抗-小鼠CD4-APC-Cy7、CD8-PerCP-Cy5.5、NK1.1-PE染色了30分钟。之后所述细胞被固定并浸出，用抗-小鼠IFNγ-APC、粒酶B-FITC、T-bet-PE-cy7、Foxp3-PE染色后，通过流式细胞分析法进行了分析。
4)蛋白质印记
使富集的未成熟CD4 T细胞偏斜(skewed to)成Th0、Th1及Th2辅助T细胞3或5天，在冰上在HALT抑制剂(Thermo Fisher Scientific)的存在下用RIPA缓冲液(CellSignaling Technology)溶解30分钟。使用BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo FisherScientific)确定了溶解物中蛋白质的量。SDS-PAGE后将蛋白质移到了PVDF膜(Bio-Rad)。用含0.1％吐温-20(Tween-20)的三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲盐水中的5％脱脂乳(skimmilk)阻断(blocked)了膜。阻断后，将膜和初级抗体(下面列出的)一起在4℃培养过夜。之后将膜和次级抗体(下面列出的)一起在常温培养了一小时。用EZ-Western Lumi Pico或Femto试剂(DoGen)分析了经过清洗的膜。用Fusion-Solo测定了带强度，使用Fusion-captadvance(VilberLourmat)分析了从获得的图像得到的门控带(gated band)强度。小鼠抗Chi3l1抗体购买于R&D体系，小鼠p-Erk、p-Akt、pSTAT1、pSTA T4、pSTAT6、tSTAT1、tSTAT4及tSTAT6抗体及HRP-结合的抗兔购买于Cell Signaling Tech nology。
5)定量实时PCR(Quantitative real-time PCR)
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从在体外分化的CD4 T细胞、CD8 T细胞及分离的肺淋巴球分离了总RNA。用添加了TRIzol(Thermo Fisher Scientific)的均质器破碎肺组织，提取了总RNA。使用ReverTra Aceq PCRRT Master Mix(Toyobo(东洋纺))合成了cDNA。使用iQ SY BR Green Supermix(Bio-Rad)在Bio-Rad CFX Connect实时PCR检测系统执行了实时PCR。在下述表1列举了所使用的引物序列。
[表1]
6)RNA测序
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从WT及Chi310KO未成熟及Th1细胞分离了总RNA。使用RNA 6000纳米芯片(Agilent Technologies，Amstelveen，The Netherlands)通过安捷伦2100生物分析仪(Agilent 2100 bioanalyzer)评价了RNA品质。使用ND-2000分光光度仪(spectrophotometer)(ThermoInc.,DE,USA)执行了RNA定量。对照组(controls)与实验组(test)RNA的情况下，使用SE NSE mRNA-Seq文库制备试剂盒(Lexogen，Inc.，Austria)执行了文库构建。
综上，准备总RNA 2μg并与修饰有寡脱氧胸苷酸(oligo-dT)的磁珠一起培养后，通过清洗去除了除mRNA以外的其他所有RNA。文库制备通过起始子/终止子异二聚体(starter/stopper heterodimers)的随机杂交到仍结合于磁珠的聚(A)RNA开始。这种起始子/终止子异二聚体(starter/stopper heterodimers)包括依诺米那-兼容(Illumina-compatible)连接序列。单管反转录及连接反应将起始子延伸到下个杂交的异二聚体(heterodimers)，将新合成的cDNA插入物连接于终止子(stopper)。第二链合成通过从磁珠分离文库来执行，之后放大文库。条形码在文库放大时导入。使用HiSeq2000仪器(Illumina,Inc.,USA)通过配对末端100测序(paired-end 100sequencing)执行了高通量测序(high-throughput sequencing)。关于TopHat软件工具对mRNA-Seq阅读进行映射以获得比对文件(alignment file)。使用BIOCONDUCTOR 3.0版本(Gentlemanetal.,2004)在R版本3.2.2(Rdevelopment Core Team，2011)使用Edge R基于固有及多比对的计数，确认了差别表达的基因。比对文件用于组装的转录物，或用于估计转录物的丰度(abundances)，使用cuf flink检测基因或异构体(isoform)的差别表达。我们为了确定基因区域的表达水平使用了FPKM(每百万碎片(fragment)外显子(exon)的每千碱基(kilo base)碎片)方法。为了相互比较样本而使用了整体归一化方法(global normalization method)。基于DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行了基因分类。
7)凝胶阻滞分析(gel retardation assay).
为了确定用于形成细胞渗透性肽-siRNA复合体的最佳条件，将1.5μg的Chi311siRNA(Bioneer)与dNP-2-HA肽(Genscript)按1:1、1:10、1:25的N/P比例(ratio)(dNP-HA2肽中氮原子(N)数与核酸骨架磷酸盐(P)基团数之间的比)混合，在暗处、室温条件下培养30分钟制备了复合体。培养后将所述复合体与DNA上样染料(DNA loading dye)混合并在2％琼脂糖胶(agarose gel)执行了20分钟的凝胶电泳。
8)黑色素瘤肺癌症转移动物模型(Pulmonary melanoma metastasis model).
使用的从C57BL6/J小鼠黑色素瘤确立的小鼠黑色素瘤细胞系(B16F10)是由夏相俊(延世大学)提供的。在完全DMEM培养基培养至90％融合(confluence)后收集细胞，使用预热的PBS缓冲液制备成为浓度为106细胞/ml的溶液，并用此通过尾静脉向小鼠注射了5x105细胞。
注入细胞14天后处死小鼠，并数了肺表面的可视化成黑点的黑色素瘤集落的数量。为了执行组织学分析(histological analysis)，对石蜡肺组织块使用苏木精(hematoxylin)与伊红(eosin)进行了脱石蜡化、染色。用Image J软件1.48v测定了肺组织的肿瘤大小。将其他肺叶(lunglobes)机械切碎后，用含胶原酶D(Collagenase D)(1mg/ml，Roche)与Ca2+及Mg2+的DPBS在37℃将其培养了30分钟。用0.5M EDTA溶液中断了酶消化(Enzymatic digestions)反应。用40-μm细胞过滤器过滤消化的细胞，并用Ack缓冲液溶解了红血球(RBC)。按珀可(Percoll)梯度浓缩肺淋巴球细胞，在流式细胞分析法及定量实时PCR使用了全体细胞。
9)在体外(in vitro)，分析细胞毒性
在100μl培养基将B16F10黑色素瘤细胞接种(seeding)到了96-孔板(96-wellplates)。将激活的WT及Chi311 KO NK及CD8 T细胞以不同的密度添加到了含B16F10细胞的孔。8小时(NK细胞的情况下)或24小时(CD8 T细胞的情况下)后，用PBS清洗孔板，添加含CCK-8的培养基。统计了存活的B16F10黑色素瘤细胞。用与阳性对照组的OD值成比例的方式表示了CTL活性的百分比。
10)在体外(in vitro)，siRNA转染.
为了在HEK293T细胞表达Chi311，使用脂质体(Lipofectamine)2000(Invitrogen)通过集落的Chi3l1过表达载体转染进细胞。在部分实验中添加了EGFP或Chi311siRNA。按照制造公司的协议执行了转染。dNP-2-siChi3l1是独立添加的，在6小时后更换了培养基。培养转染细胞两天，分别收集了培养液与细胞。使用ELISA(R&D)确定了培养液中Chi311的水平，通过实时P CR定量转染细胞中Chi311 mRNA。
11)在体内(in vivo)，siRNA转染.
将2.5μg的Chi3l1 siRNA(Bioneer)或EGFP siRNA(Bioneer)与70μg dNP-2-HA2肽一起在暗处、常温条件下培养30分钟。将肽-siRNA复合体鼻腔给药至小鼠，连续三日每隔24小时处死。在T-PER组织蛋白质提取试剂(Thermo Fisher Scientific)中破坏肺组织以得到蛋白质溶解物或者在TRIzol中破坏肺组织以进行RNA提取物。用Chi311ELISA试剂盒(R&DSystems)测定了肺中Chi311蛋白质。在用dNP2-siRNA复合体处理的WT肺癌症转移模型中，向注射了B16F10黑色素瘤的黑色素瘤肺癌症转移模型通过鼻腔每两日给药肽-siRNA复合体。注射黑色素瘤细胞后14日后处死小鼠并进行了分析。
12)统计分析
所有实验都使用Prism5软件(GraphPad)通过Student's T检验法学生T检验(student t-test)(two-tailed)进行了统计学分析。在此，将P数值为<0.05的视为统计学上显著。
本发明中无另外记载的前提下，按本领域的一般规定对细胞进行了标记，例如，CD4+是指CD4 T细胞，CD8+是指细胞毒性T细胞，NK+CD4-CD8-是指自然杀伤细胞，NK-CD4-CD8-是指其他免疫细胞群。
<制造例1>dNP2-HA2肽及Chi3l1 siRNA的合成
合成了具有序列号1的Chi3l1 siRNA序列及序列号2的氨基酸序列的dNP2-HA2肽。
在此，用由用序列号1的序列表示的Chi3l1的siRNA(以下，也称作‘siChi3l1’)、序列号2的氨基酸序列构成的细胞透过性肽(以下也称作‘dNP2’)进行了标记。
设计各序列后，使用的用序列号1的序列表示的Chi3l1 siRNA是委托柏业(Bioneer)合成制造的，用序列号2的序列表示的dNP2-HA2肽是委托金思特(Genscript)合成制造的。
序列号1
CAGGAGUUUAAUCUCUUGCAA
序列号2.
KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRKGLFGAIAGFIENGWEGMIDG
<实施例1>dNP2-siChi3l1复合体的制造.
为了融合具有在制造例1制造的序列号1的siChi3l1与序列号2的氨基酸序列的dNP2-HA肽，在常温、暗条件下使2ug的siChi3l1与70ug的dNP2-HA2肽反应30分钟进行了制备。
<比较例1>dNP2-siEGFP的合成及分离纯化
将从制造例1制造的序列号2的细胞透过性肽与对于绿色荧光蛋白质(EGFP)的siRNA融合的整个过程除了将siRNA改为使用EGFPsiRNA之外其余是按照与实施例1相同地执行的。使用的所述EGFP siRNA为柏业(Bioneer)销售的Accu TargetTM正控制(PositiveControl)siRNAs。
<实验例1>在T细胞激活及增殖中Chi3l1的作用
图2是示出在脾脏免疫细胞增殖过程中，测定几丁质酶(chitinase)与Chi3l1基因、Chi3l3(Ym-1)基因、壳三糖酶(chitotriosidase)与AMCase的基因表达的结果的图表。
通过标记用FACS分选脾脏免疫细胞并标在了图表中，为了分选而使用的标记如下。使用了CD11c+MHCII+:DC；CD11c-CD11b+:巨噬细胞(macrophage)；CD8+CD4-CD62L+CD44-:未成熟CD8 T细胞；CD4+CD8-CD62L+CD44-:未成熟CD4 T细胞；CD19+:B细胞；及CD3-NK1.1+:NK细胞。从免疫细胞群提取六个RNA并进行了测定，从100ng总RNA合成了cDNA。通过RT-PCR(n＝4)测定了靶水平。
如图2所示，经比较分析在脾脏巨噬细胞、DC、T细胞、B细胞及NK细胞中Chi3l1、Chi3l3(Ym-1)、壳三糖酶(chitotriosidase)及AMCase mRNA水平，确认到在脾脏的巨噬细胞中几丁质酶(chitinase)与Chi3l3(Ym-1)基因显著表达。确认到在CD4、CD8 T细胞、B细胞、NK细胞中Chi3l1的基因表达最高。
图3为测定未成熟CD4 T细胞与激活的CD4 T细胞中几丁质酶样蛋白(Chitinase-like protein)(Chi3l1，Ym-1)与几丁质酶(chitotriosidase，AMCase)的表达的结果的图表，图4为示出测定未成熟CD8 T细胞与激活的CD8 T细胞中几丁质酶样蛋白(Chitinase-like protein)(Chi3l1，Ym-1)与几丁质酶(chitotriosidase，AMCase)的表达的结果的图表。
如图3、4所示，确认到非激活的细胞(NA)中Chi3l1相对表达结果。确认到Chi3l1在抗-CD3及CD28抗体被强力诱导。由此可知在T细胞激活过程中Chi3l1起到重要作用。
图5为分析比较初级及次级淋巴管中存在的WT(野生型)小鼠与Chi3l1 KO小鼠的免疫细胞的增殖的结果。具体来讲图5a是示出通过流式细胞分析法测定胸腺中CD4+CD8+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞的百分比的结果的图表，图5b及图5c示出通过流式细胞分析法测定脾脏中树突细胞(CD11c+MHCII+)及巨噬细胞(CD11b+)的百分比的结果的图表，图5d至图5f是通过流式细胞分析法分析脾脏、周围(鼠蹊)淋巴结、肠系膜淋巴结中免疫细胞并示出的图表，图5g为通过流式细胞分析法测定CD4 T细胞中Foxp3表达的结果的图表。所述数据为至少五次独立实验的平均，标记为±SD。
如图5所示，在WT(野生型)小鼠与Chi3l1 KO小鼠之间的免疫细胞增殖方面未确认到有显著差异。
图6a为通过流式细胞分析法测定通过MACS分选的WT(野生型)及Chi311 KO的未成熟(na ive)CD4 T细胞中IFNγ及IL-4表达的结果的示意图，图6b为量化图6a的结果示出的图表。在此，WT(野生型)及Chi311 KO的未成熟(naive)CD4 T细胞是通过三日的TcR刺激活化的。图6c为通过TcR刺激WT(野生型)及Chi311 KO小鼠的脾脏细胞后，通过ELISA测定其培养上清液以测定IFNγ、IL-2、IL-4及IL-17细胞因子表达的图表。数据为三次独立实验的平均±标准偏差。n.d表示未检测到，ns表示非显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6用于调查Chi3l1是否为T细胞激活的阴性调节因子，用抗-CD3及抗-CD28抗体对来自野生型(WT)小鼠与Chi310 KO小鼠的脾脏细胞MACS纯化的未成熟CD4 T细胞和FACS纯化的C D8 T细胞激活了三日。通过细胞因子流式细胞分析法(Cytokine flowcytometric analysis)与EL ISA检测(ELISA assay)法确认到CD4 T细胞中Chi311缺失，显著增加了IFNγ与IL-2产生，减少了IL-4产生，对IL-17的产生不产生影响。
图7a为分析在通过CD3及CD28抗体刺激活化的WT(野生型)未成熟CD8 T细胞及Chi311 KO未成熟CD8 T细胞中IL-2细胞因子与IFNγ表达并示出的示意图，图7b为示出在WT(野生型)未成熟CD8 T细胞及Chi311 KO未成熟CD8 T细胞中IFNγ的表达程度的图表，图7c为在图7a的培养上清液中IFNγ与TNFα的ELISA测定结果图表。数据为三次独立实验的平均±标准偏差。n.d表示未检测到，ns表示非显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图7所示，确认到在Chi3I1 KO CD8 T细胞中IFNγ(图7a)与TNFα(图7c)的表达增加，由此可以启示Chi311与T细胞激活有关联。具体来讲，确认到Chi3l1负调节IFNγ、TNFα、IL-2，但并不负调节IL-4、IL-17。IL-2及IFNγ是对于T细胞增殖非常重要的细胞因子，因此欲通过与野生型比较以确认Chi311 KO T细胞的增殖特性。
图8a为非激活条件(upper)与抗-CD3和CD28刺激条件(lower)三日后通过CFSE分析来分析分裂的WT(野生型)CD4 T细胞与Chi311 KO CD4 T细胞的含量并示出的示意图。图8b为根据图8a的结果示出分裂的细胞与未分裂的细胞的百分比的图表。数据为三次独立实验的平均±标准偏差。n.d表示未检测到，n.s表示非显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图8所示，确认到用CFSE标记的Chi311 KO CD4 T细胞相比于作为对照组的野生型CD4 T细胞对TcR刺激发生反应，从而分裂的细胞的比例更高。
图9a为示出WT(野生型)CD4 T细胞；Chi311 KO未成熟CD4 T细胞；用抗-CD3及抗-CD28刺激的WT(野生型)CD4 T细胞；用抗-CD3及抗-CD28刺激的Chi311 KO未成熟CD4 T细胞的蛋白质印记结果的示意图。图9b为示出图9a用β-肌动蛋白规范化归一化到β-肌动蛋白图9a，并测定关于其的，测定对于其的各靶分子的相对浓度的结果的图表。数据为三次独立实验的平均±标准偏差。n.d表示未检测到，ns表示非显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图9所示，Akt、Erk、STAT1及STAT5的磷酸化在Chi311 KO T细胞增加，由此可知Chi311为调节T细胞增殖的重要因子。
综合上述结果可以确认Chi311在T细胞表达且调节T细胞激活及增殖。
<实验例2>Chi3l1抑制Th1分化
图10为用于分析Chi3I1 KO CD4 T细胞通过敏感的IFNγ反应分化成Th1和Th2的样态的结果。
具体来讲，图10a为测定在特定细胞因子偏斜(cytokine-skewing)条件下WT(野生型)未成熟CD4 T细胞与Chi311 KO未成熟CD4 T细胞分化成Th1、Th2及Th17细胞的样态的示意图。为了分析血清-特异细胞因子(lineage-specific cytokine)表达而执行了细胞内细胞因子染色。图10b为显示对应图10a的结果的子集的细胞因子的百分比的图表。但位于最上端的图表是关于Th1细胞的图表，位于中间的图表是关于Th2细胞的图表，位于最下端的图表是关于Th17的图表。数据是共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
已通过上述实验确认到Chi311缺失会诱导IL-2与IFNγ增加，但导致IL-4减少，因此预想到会调节Th1与Th2的效应(effector)T细胞分化。为了确认Chi311实际是否调节Th1与Th2分化，而分析了以多种分化条件培养被MACS分选的CD4+CD62L高CD44低野生型未成熟CD4 T细胞与CD4+CD62L高CD44低Chi311 KO未成熟CD4 T细胞的情况下，是否分化成Th1、2及Th17细胞的样态。
如图10a、b所示，确认到在Chi3l1的情况下，IFNγ细胞的比例不仅在Th1显著增加，而且在Th2及Th17条件下都显著增加，而在Th2下IL-4减少，Th17无差异。
图10c为通过ELISA分析图10a的培养上清液中IFNγ、TNFα、IL-4及IL-17并示出的图表。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
如图10c所示，确认到蓄积在培养上清液的细胞因子具有与图10a、b相同的样态。
图10d为通过定量实时PCR分析图10a中分化的T细胞的细胞因子与转录因子的RNA表达水平的图表。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
如图10d所示，确认到作为Th1分化的重要转录因子的T-bet、Runx3及Eomes在Chi311缺失的Th1细胞中与IFNγ及GM-CSF一起增加了。另外作为IL-4相关Th2分化方面的重要因子的Jun B显著减少了，但未观察到Th17相关因子有差异。
图10e为通过蛋白质印记测定野生型Th1、Th2细胞与Chi3l1 KO Th1、Th2细胞中STAT磷酸化的示意图(左侧)与通过对于蛋白质印记的相对浓度分析量化的总STAT图表(右侧)。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
如图10e所示，可确认到在Chi311缺失的Th1细胞中磷酸化的STAT1的水平显著增加，磷酸化的STAT4的水平无差异。由此可知Chi311调节IFNγ信号而不是IL-12。
图10f为将野生型未成熟CD4 T细胞与Chi3l1 KO未成熟CD4 T细胞用所示浓度的IFNγ中和抗体分化成Th1细胞，经过三日后收获细胞，通过细胞内染色测定IFNγ与IL-4表达的示意图。图10g为相对于无IFNγ中和抗体的野生型Th1细胞中IFNγ表达的IFNγ表达的百分比的图表。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的，*p<0.05，**p<0.01。
如图10f、g所示，经过将IFNγ中和抗体添加到Th1培养基评价IFNγ的产生，确认到IFNγ产生细胞的比例在无IFNγ中和抗体的Chi311 KO Th1细胞中显著增加。确认到在野生型Th1细胞与Chi311 KO Th1细胞中IFNγ产生随着抗体剂量增加而下降。
<实验例3>分析在未成熟CD4 T细胞中STAT1对IFNγ的磷酸化
通过上述实验能够确认到在Th2细胞中STAT6的磷酸化显著减少，启示Chi311负调节IFNγ信号传导以形成Th2样-T细胞。为了确认这种IFNγ依赖性，用重组IFNγ对野生型未成熟CD4 T细胞和Chi311 KO未成熟CD4 T细胞进行处理并分析了pSTAT1水平。
图11a为通过20ng/ml IFNγ处理用FACS分选的野生型未成熟CD4 T细胞与Chi3l1未成熟CD4 T细胞后，通过经细胞因子处理的细胞溶解适当时间(0、5、10、20分钟)，通过BCA测定法定量蛋白质后，通过蛋白质印记测定pSTAT1的水平的示意图。
图11b通过柱状图示出对于图11a中β-肌动蛋白的pSTAT1的相对强度。数据为共两次独立实验的平均±标准偏差。**p<0.01。
如图11所示，可确认到Chi311 KO T细胞相比于野生型T细胞，pSTAT1有增加。
图12a示出通过FACS Aria ΙIΙ分选野生型未成熟CD8 T细胞与Chi3l1未成熟CD8T细胞，用指定浓度(0、5、20μg/ml)IFNγ中和抗体的同时通过平板结合的抗-CD3、CD28、Il-2进行了激活之后，通过基于ICS的流式细胞分析法测定IFNγ与粒酶B(Granzyme B)表达的示意图。
图12b、c为量化图12a中IFNγ(b)与粒酶B(c)的相对％示出的图表。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。*p<0.05，***p<0.001。
如图12所示，在野生型KOTh1细胞与Chi311 KOTh1细胞，在处理了20μg/ml中和抗体的情况下，IFNγ产生相同。这表明增加的IFNγ产生依赖于IFNγ信号。可确认到在CD8 T细胞中IFNγ依赖性。
并且确认到可通过IFNγ中和抗体处理减少IFNγ与粒酶B的生成被活化的Chi311KO CD8 T细胞。并且可知在20μg/ml IFNγ中和抗体中野生型T细胞为等量(equivalent)。
综合上述结果可以确认Chl3l1能够通过抑制IFNγ-介导的STAT1磷酸化负调节Th1分化。
<实验例4>Chi311对Th1相关及肿瘤基因表达抑制效果
图13a比较未成熟细胞(naive)、Th1-偏斜野生型CD4 T细胞、Chi3l1 KO CD4 T细胞中100-bp RNA碱基序列，是量化野生型Th1细胞(WT-Th1)与Chi3l1 KO Th1细胞(KO-Th1)中被上调的基因，比较野生型Th1细胞与相关的Chi3l1 KO Th1细胞中增加的基因，筛选出感兴趣的基因示出的图表。
图13b为与上调(红色)或下调(蓝色)相关的感兴趣的基因的热图(heatmap)分析结果。图13c为关于野生型Th1细胞与相关的Chi3l1 KO Th1中具有最小两倍的下调、上调效果的RNA-测序数据的散布度(scatterplot)。
图13d为通过定量实时PCR分析图13c中与IFNγ作用机制和细胞毒性相关的基因的表达的结果图表。图13e为激活野生型CD8 T细胞与Chi3l1 KO CD8 T细胞，并通过定量实时PCR分析其中感兴趣的基因的结果图表。在各图表上端标记了分析对象基因(作为一例SOCS1，SOCS3...CCR5，T-bet等)。数据为共三次独立实验的平均±标准偏差。n.s表示非显著的。**p<0.01，***p<0.001。
为了确认Chi311调节IFNγ介导的信号传导路径的方法，从野生型未成熟CD4 T细胞与Chi311 KO未成熟CD4 T细胞及由此分化的Th1细胞分离了RNA。分析了关于野生型细胞(WT)，及Chi311 KO细胞，其未成熟细胞(naive)及由此分化的Th1细胞的转录体(transcriptome)的RNA碱基序列。
为了确认野生型Th1细胞与Chi3l1 KO Th1细胞之间的基因表达差异，分类了相比于未成熟T细胞在Th1细胞中的表达量最高的基因。分类了Chi3l1 KO Th1细胞中与野生型Th1细胞不同地表达的基因(图13a)。由此相比于野生型Th1细胞在Chi3l1 KO Th1细胞确认了31个上调基因与72个下调基因。
通过图13b，确认在Chi3l1 KO Th1细胞中作为IFNγ调节基因的twist1、socs1减少，ifng、ctse、cxcr2、tnfsf10(已知是TRAIL)基因增加。通过图13c简要示出了图13b的图案。
通过图13d执行野生型Th1细胞与Chi3l1 KO Th1细胞的定量实时PCR分析以确认了RNA测序结果。其结果，确认了作为抑制STAT1的磷酸化的磷酸酶的SOCS1的表达相比于野生型Th1细胞减少，SOCS3、SOCS5并无大差异。
通过图13e确认了作为Th1抑制分子的Twist1dl Chi3l1 KO Th1减少。由此能够确认到Chi3l1 KO Th1细胞如何生成CTSE、TRAIL、IFNγ及CXCR2。图13e的分子表达样态与图13d的样态相同。
即，确认到活化的Chi3l1 KO CD8 T细胞的T-bet、IFNγ、穿孔素(Perforin)及粒酶B的表达水平高。由此可知Chi3l1 KO CD8 T细胞诱导与CTL功能相关的效应分子的表达。综合上述实验可知Chi3l1关于Th1抑制CTL反应。
<实验例5>在体内(in vivo)，Chi3l1效果
旨在确认在Chi3l1缺失T细胞中效应(effector)功能分子的增加是否有助于Chi3l1 KO Th1细胞与CTL抗肿瘤免疫。为此利用了B16F10黑色素瘤肺癌症转移模型。黑色素瘤肺癌症转移模型采用了上述实验方法8)，分析方法也参考了实验方法。
图14a为向野生型模型与Chi3l1 KO模型中作为Ⅳ给药注射5×105 B 16F10黑色素瘤细胞，二周后分析的结果。具体来讲，是从被注射黑色素瘤细胞的野生型模型与被注射黑色素瘤细胞的Chi3l1 KO模型摘出的肺的拍摄结果，经过对此查看，14日时在肺表面观察到了转移性黑色素瘤集落，可知Chi3l1 KO模型相比于野生型模型发生黑色素瘤转移更少。
图14b为测定注射了5×105 B16F10黑色素瘤细胞的野生型模型与Chi3l1 KO模型的肺中胸膜集落的相对大小与数量的图表，根据该图表可知在Chi3l1 KO模型黑色素瘤的肺转移相比于野生型模型显著减少了。
图14c为通过H&E染色分析从注射了5×105 B16F10黑色素瘤细胞的野生型模型与Chi3l1 KO模型摘出的肺组织的结果。测定在两个模型中肿瘤浸润(infiltration)的相对大小并示于右侧图表，确认到相比于野生型模型，在Chi3l1 KO模型中血管周围浸润的肿瘤显著减少了。
图14d-g为从注射了5×105 B16F10黑色素瘤细胞的野生型模型与Chi3l1 KO模型的肺通过珀可(Percoll)得到肺淋巴球细胞，并通过流式细胞分析法对其进行测定的结果，通过细胞内细胞因子染色测定CD4 T细胞、CD8 T细胞、NK细胞及非淋巴细胞群(non-lymphocytic polulation)的IFNγ、Foxp3、粒酶B的示意图及图表。在各图表标出了相应的基因与模型。图14e、g记载了IFNγ+、Foxp3+及粒酶B+的MFI的代表性的百分比。
如图14d、e所示，确认关于Chi3l1 KO模型的肺相比于野生型模型的肺中IFNγ产生的CD4 T细胞与CD8 T细胞的渗透显著增高。由此能够确认Chi3l1缺失的情况下肺中CD4T细胞与CD8 T细胞增加，从而IFNγ的产生显著增加。
并且，参见图14f、g确认到被注射黑色素瘤细胞的两个模型中NK细胞与非淋巴细胞群的IFNγ产生上无差异。
图14h为测定从注射了5×105 B16F10黑色素瘤细胞的野生型模型与Chi3l1 KO模型分离的肺淋巴球细胞中分子的表达的图表，由此确认到在被注射黑色素瘤细胞的Chi311KO模型不同于在野生型模型，增加对包括CTSE、TRAL、IFNγ、T-bet、穿孔素(Perforin)及粒酶B的抗肿瘤免疫分子的mRNA，而Th1抑制分子Twist1与SOCS1显著减少。
图14i为在多种E:T比例条件下，测定对B16F10靶细胞的野生型CD8 T细胞与Chi3l1 KO CD8 T细胞的细胞毒性的图表，图14j为测定野生型CD8 T细胞、Chi3l1 KO CD8T细胞与NK细胞的细胞毒性的图表。
如图14i、j所示，为了确认在CD8 T细胞中破坏(tumoricidal)肿瘤细胞的活性在增加，将预先激活的野生型CD9 T细胞或Chi3l1 KO CD8 T细胞与B16F10黑色素瘤(melanoma)细胞一起共-培养(co-culturing)并进行了分析。其结果，确认到在Chi3l1 KOCD8 T细胞中相比于在野生型CD8 T细胞中具有更强烈的肿瘤细胞杀伤活性。
相反，确认到野生型NK细胞与Chi3l1 KO NK细胞在细胞毒性方面并未出现明显差异。综上可知本发明中的Chi3l1为Th1与CTL反应的负调节因子。
<实验例6>利用dNP2肽与siChi3l1的治疗用siRNA复合体对Th1、CTL的调节作用
在本发明中为了将免疫调节蛋白质传递到T细胞，公开一种新细胞透过性肽(cellpenetrati ng peptide；CPP)、dNP2及siChi3l1融合的复合体，旨在确认这种复合体是否具有有效抑制癌症的肺转移的效果。
设计了能够利用融合了dNP2肽(序列号2)与作为抑制Chi3l1的活性的siRNA的siChi3l1(序列号1)的复合体诱导抗肿瘤免疫的新战略。
关于所述复合体，具体合成含HA2的dNP2肽后，将siChi3l1与所述dNP2-HA2肽按照1:1、1:10、1:25比例混合及融合制备了各复合体(依次标记为dNP2-siChi3l1 1:1、1:10、1:25)。图15a为示出dNP2-HA2肽与Chi3l1 siRNA融合形成的dNP2-siChi3l1复合体的结构的示意图。
以下旨在确认所述dNP2-siChi3l1复合体细胞内传递，分析由此引起的对癌症的肺转移的抑制活性。为此通过体内(in vivo)实验分析了是否有效减少Chi3l1，通过体外(in vitro)实验确认了是否提高Th1分化与CD8 T细胞分化。
图15b为对应于N/P比例的dNP2-siChi3l1复合体的琼脂糖凝胶阻滞(retardation)分析结果，可知是dNP2-HA2肽与siChi3l1按10:1混合融合的dNP2-siChi3l1复合体的情况下，dNP2-HA2肽成功地与siChi3l1通过非共价相互作用(noncovalentinteraction)结合。
图15c为对HEK293T细胞通过脂质体(Lipofectamine)用Chi3l1 siRNA处理的情况下(Lipo-siChi3l1)，用dNP2-siChi3l1复合体处理的情况下(dNP2-siChi3l1)，从所述HEK293T细胞测定Chi3l1 mRNA的表达水平并示出的图表。图15d为通过ELISA从所述图15c分析Chi3l1的相对表达水平的图表。在此，使用了通过pDNA(阴性对照组；用pDNA+标记)过表达Chi3l1的所述HEK293T细胞。未用pDNA处理的HEK293T细胞为阳性对照组，标记为pDNA-。
为了确认dNP2-siChi3l1复合体的敲除(knockdown)效果，使用了Chi3l1过表达的HEK293T细胞，通过Chi3l1 mRNA表达量(图15c)与Chi3l1蛋白质表达水平(图15d)比较了dNP2-siChi3l1复合体或Lipo-siChi3l1的敲除(knockdown)效果，其结果为dNP2-siChi3l1复合体显著抑制了Chi3l1表达，抑制水平与阳性对照组近似。
图15e为显示对黑色素瘤肺癌转移动物模型通过鼻腔处理dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1后，分析在肺中Chi3l1 mRNA表达量的图表。以第0日表达的Chi3l1 mRNA为基准，计算各日期测定的Chi3l1 mRNA的相对表达量并做了标记。以第0日表达的Chi3l1 mRNA为基准，计算各日期测定的Chi3l1 mRNA的相对表达量并做了标记。
具体来说，首先，将dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1 siRNA复合体通过鼻腔注射给黑色素瘤肺转移动物模型。杀死动物后，每天用RT-PCR评估体内(in vivo)Chi3l1基因敲除效率，持续3天。结果如图15f和15g所示，用70μg的dNP2-siChi3l1肽与2.5μg的siChi3l1(1:25N/P比)混合制备的dNP2-siChi3l1复合体处理的情况下，在第1天时显示Chi3l1 mRNA在肺中的表达显著降低。并且Chi3l1的表达在第2天达到最大沉默，从第3天开始Chi3l1表达开始恢复。
图15f显示了对黑色素瘤肺转移动物模型通过鼻腔处理dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1后，通过蛋白质印记分析在肺中Chi3l1蛋白质表达水平的结果。图15g显示了通过对图15f的结果进行密度分析(densitometric analysis)来计算相对于β-肌动蛋白的Chi3l1蛋白质表达水平的图表。相对于β-肌动蛋白带强度量化了Chi3l1带强度。
如图15f、g所示，用dNP2-siChi3l1复合体处理后，Chi3l1的表达水平明显降低至第2天，从第3天起Chi3l1表达水平开始恢复。
接着，测定dNP2-siChi3l1在Th1分化中的功能。图15h为用多种浓度(100ng、250ng)的dNP 2-siEGFP或dNP2-siChi3l1对野生型未成熟CD4 T细胞进行处理，培养五日后测定是否分化成Th1细胞并示出的图表(左)、以及各情况下通过流式细胞分析来分析IFNγ及TNFα表达程度并示出的图表(右)。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图15h所示，确认到对通过FACS分选(sorted)的野生型未成熟CD4 T细胞用dNP2-siEGF P或dNP2-siChi3l1复合体处理并经过五日后，分化成了Th1细胞。经过用流式细胞分析来分析产生IFNγ-、TNFα-的细胞，其结果为处理了100ng至250ng dNP2-siChi3l1复合体的群相比于处理了dNP2-siEGFP的群，产生IFNγ-、TNFα-的细胞显著增加。这表明靶向Chi3l1的siRNA可以传递到T细胞中，并加强Th1分化。
图15i为用多种浓度(100ng，250ng)的dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1对被抗-CD3、抗-CD28及IL-2激活的野生型未成熟CD8 T细胞进行处理，培养三日后测定是否分化成CD8T细胞并示出的图表(左)、以及通过流式细胞分析来分析各情况下IFNγ及TNFα表达程度的图表(右)。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图15i所示，使用dNP2-siChi3l1处理的组观察到更多具有产生IFNγ和TNFα能力的活化CD8 T细胞。通过观察，证实了dNP2肽与siChi3l1成功融合形成复合体，所述复合体实现了体内和体外(in vivo、in vitro)siChi3l1的有效传递，肺Chi3l1基因被敲除，Th1和CTL功能得到改善。
因此，证实dNP2-siChi3l1复合体能抑制Chi3l1基因的表达，改善Th1和CTL功能，证明其与单独使用siChi3l1时一样，对癌症的肺转移有预防或抑制作用。
然而，当使用dNP2-siChi3l1复合体时，siChi3l1可以通过鼻内给药到肺组织中进行表达，这与单独使用siChi3l1时不同。因此，dNP2-siChi3l1复合体对癌症转移的预防或抑制效果即使在少量使用时也非常明显。也就是说，与单一使用siChi3l1相比，使用dNP2-siChi3l1复合体具有明显的效果和优势，因为siRNA可以直接通过鼻腔途径给药，以达到对癌症转移的预防或抑制效果。
<实验例7>dNP2-Chi3l1复合体鼻内给药对癌症肺转移的抑制效果
本发明旨在调查dNP2-siChi3l1在调节黑色素瘤肺转移中的体内效率。
首先，将5x105 B16F10黑色素瘤细胞注射到野生型小鼠制造了黑色素瘤肺癌转移动物模型，具体参见实验方法8)黑色素瘤肺癌转移动物模型。经过14日后处死小鼠并确认了癌症是否有效转移到肺表面。接下来，将2.5μg的siEGFP和70μg的dNP2-HA肽混合制备的复合体经鼻内注射给对照组。将2.5μg的siChi3l1和70μg的dNP2-HA肽混合制备的复合体对实验组进行鼻内注射。从第0天到第12天每天注射两次复合体，并在第14天分析是否发生肺转移。从第0天到第14天，每天两次等量注射复合体。
图16a为简要示出利用黑色素瘤肺转移动物模型制造对照组与实验组的方法的示意图，图16b为从用dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1处理的黑色素瘤肺转移动物模型摘出的肺的照片。具体来说，与用dNP2-siEGFP处理的组相比，用dNP2-siChi3l1处理的黑色素瘤肺转移动物模型中黑色素瘤集落的形成被显著抑制。
图16c为测定用dNP2-siEGFP或dNP2-siChi3l1处理的黑色素瘤肺转移动物模型的肺上形成的胸膜集落(pleural colonies)的相对大小与数量的图表，由此可知黑色素瘤转移在处理了dNP2-siChi3l1的黑色素瘤肺转移动物模型中相比于在处理了dNP2-siEGFP的组，黑色素瘤集落的生成被显著抑制。所述数据是至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01。***p<0.001。
图16d为对用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组用H&E染色肺部分并用光学显微镜拍摄的图像。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图16d所示，通过组织学分析观察肺的截面载玻片，确认到在血管周围癌的浸润性相比于在给药了dNP2-siEGFP的对照组，在给药了dNP2-siChi3l1的实验组有显著减少。
图16e为从用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组通过珀可(Percoll)分离的肺淋巴球(lymphocytes)通过流式细胞分析来分析CD4与CD8 T细胞中IFNγ、粒酶B的结果图表。
如图16e所示，用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组中，产生IFNγ的CD4 T细胞和CD8T细胞数量增加。
图16f为在用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组分离的肺组织，通过细胞内存在的细胞因子染色分析CD4+IFNγ+或CD8+IFNγ+群中T-bet的图表。图16h、g为具体分析图16f中MFI并示出的图表。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图16f、h、所示，经dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组中CD5T细胞和CD8 T细胞中T-bet和粒酶B的强度均明显高于对照组。。
图16i为分析从用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组通过珀可(Percoll)分离的肺淋巴球部分靶向基因的表达并示出的图表。所述数据为至少三次独立实验的平均，标记为±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图16i所示，实验组经dNP2-siChi3l1复合体处理后，增加了CTSE、TRAL、IFNγ、T-bet、穿孔素(Perforin)及粒酶B等与抗肿瘤免疫相关的基因表达，降低了Th1 Twist1和SOCS1的表达。综上所述，这些结果表明dNP2-siChi3l1复合体是一种活性成分，具有显著提高Th1和C TL的抗肿瘤免疫反应的预防或治疗效果。
图17是用于确认用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组中NK细胞功能不产生影响的实验，图17a为通过流式细胞分析来分析从用dNP2-siChi3l1复合体处理的实验组与用dNP2-siEGFP复合体处理的对照组通过珀可(Percoll)分离的肺淋巴球中NK细胞(NK1.1+CD4-CD8-)与非淋巴细胞群(NK1.1-CD4-CD8-)的结果图表。
图17b显示了各组IFNγ+细胞的百分比，这是由图17a的实验数据计算出来的。图17c显示了每组中粒酶B的平均荧光强度(MFI)，这是从图17a的实验数据计算出来的。数据为至少五个独立实验的平均，标记为±SD。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
如图17所示，其他细胞或NK细胞在IFNγ+和粒酶B的表达上无显著性差异
<实验例8>dNP2-siChi3l1复合体对黑色素瘤肺部转移的抑制效果取决于给药途径
甲.鼻腔内给药
由C57BL6/J小鼠黑色素瘤建立的小鼠黑色素瘤细胞系(B16F10)由由夏相俊(延世大学)提供。在完全DMEM培养基中培养至90％汇合后，收获细胞，在预热的PBS中调整至106个细胞/mL制造溶液，并通过尾静脉将5×105个细胞注入小鼠体内。
黑色素瘤细胞系注射后2天(细胞转移已经完成后)，隔日鼻内给药2.5μg dNP2-siChi3l1复合体(实验组)或2.5μg dNP2-siEGFP(对照组)，持续12天。在第14天，小鼠被杀死。此后，从动物身上切除肺、脾和腹股沟淋巴结并进行观察。
图18为示出实验例8.甲中实验组与对照组的实验条件的示意图，图19为显示实验例8.甲的实验组与对照组中肺表面上可视化成黑点的黑色素瘤集落的计数的图表，图20为从实验例8的实验组与对照组摘出的肺的照片。
如图19和20所示，鼻内给药dNP2-siChi3l1复合体的情况下黑色素瘤细胞转移到肺的数量减少2-6倍。
图21及图22为通过珀可梯度(percoll gradient)在从实验例8.甲中实验组与对照组摘出的肺中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表，其中图21A、图22A比较了能够抑制癌症的细胞因子蛋白IFNγ(x轴)和TNFα(y轴)从各免疫细胞中表达的程度。第一象限示出IFNγ与TNFα均表达，第二象限示出只表达TNFα，第三象限示出都不表达，第四象限示出表达IFNγaks。图21B、图22B是分析图21A、图22A的结果的图表。
由此可知，接受dNP2-siChi3l1复合体的实验组的肺中，TNFα细胞因子在CD4 T细胞和CD8 T细胞中的表达量增加。
图23为通过珀可梯度在从实验例8.甲中实验组与对照组摘出的脾脏中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表，图23A比较了能够抑制癌症的细胞因子蛋白IFNγ(x轴)和TNFα(y轴)从各免疫细胞中表达的程度。第一象限示出IFNγ与TNFα均表达，第二象限示出仅表达TNFα，第三象限示出都不表达，第四象限示出表达IFNγaks。图23B为分析图23A的结果并示出的图表。
由此可知，接受dNP2-siChi3l1复合体的实验组和接受dNP2-siEGFP的对照组的脾脏中，未从CD4 T细胞和CD8 T细胞观察到显著的细胞因子变化。
图24为通过珀可梯度在从实验例8.甲中实验组与对照组摘出的腹股沟淋巴结中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表，其中图24A比较了能够抑制癌症的细胞因子蛋白IFNγ(x轴)和TNFα(y轴)从各免疫细胞中表达的程度。第一象限示出IFNγ与TNFα均表达，第二象限示出仅表达TNFα，第三象限示出都不表达，第四象限示出表达IFNγaks。图24B为分析图24A的结果并示出的图表。
由此可知，接受dNP2-siChi3l1复合体的实验组和接受dNP2-siEGFP的对照组的腹股沟淋巴结中，未从CD4 T细胞和CD8 T细胞观察到显著细胞因子变化。
乙.通过尾静脉给药
由C57BL6/J小鼠黑色素瘤建立的小鼠黑色素瘤细胞系(B16F10)由夏相俊(延世大学)提供。在完全DMEM培养基中培养至90％汇合后，收获细胞，在预热的PBS中调整至106个细胞/mL制造溶液，并通过尾静脉将5×105个细胞注入小鼠体内。
黑色素瘤细胞系注射后2天(细胞转移已经完成后)，每隔一天经尾静脉注射5μgdNP2-siChi3l1复合体(实验组)或5μg dNP2-siEGFP(对照组)，持续12天。在第14天，小鼠被杀死。此后，从动物身上切除肺、脾和腹股沟淋巴结并观察。复合体的给药量为经鼻腔途径给药量的两倍。
图25为示出实验例8.乙中实验组与对照组的实验条件的示意图，图26为显示实验例8.乙的实验组与对照组中肺表面上可视化成黑点的黑色素瘤集落的计数的图表，图27为从实验例8.乙的实验组与对照组摘出的肺的照片。
如图26、27所示，鼻内给药dNP2-siChi3l1复合体可使黑色素瘤细胞转移到肺的数量减少2-4倍。
图28为通过珀可梯度在从实验例8.乙中实验组与对照组摘出的肺中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表，其中左图比较了能够抑制癌症的细胞因子蛋白IFNγ(x轴)和TNFα(y轴)从各免疫细胞中表达的多少。第一象限示出IFNγ与TNFα均表达，第二象限示出仅表达TNFα，第三象限示出都不表达，第四象限示出表达IFNγaks。左图的分析结果见右图。
由此可知，接受dNP2-siChi3l1复合体的实验组的肺中，TNFα细胞因子在CD4 T细胞和CD8 T细胞中的表达量增加。然而，考虑到给药的dNP2-Chi3l1复合体的浓度为实验例8.A中鼻内给药的浓度的2倍，给药的dNP2-Chi3l1复合体的治疗和预防效果不如鼻内给药。
图29为通过珀可梯度在从实验例8.乙中实验组与对照组摘出的脾脏中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表，其中左图比较了能够抑制癌症的细胞因子蛋白IFNγ(x轴)和TNFα(y轴)从各免疫细胞中表达的多少。第一象限示出IFNγ与TNFα均表达，第二象限示出仅表达TNFα，第三象限示出都不表达，第四象限示出表达IFNγaks。左图的分析结果见右图。
由此可知，接受dNP2-siChi3l1复合体的实验组和接受dNP2-siEGFP的对照组的脾脏中，未从CD4 T细胞和CD8 T细胞观察到显著的细胞因子变化。
图30为通过珀可梯度在从实验例8.乙中实验组与对照组摘出的腹股沟淋巴结中分离免疫细胞后，通过流式细胞分析进行分析的结果图表，其中左图比较了能够抑制癌症的细胞因子蛋白IFNγ(x轴)和TNFα(y轴)从各免疫细胞中表达的多少。第一象限示出IFNγ与TNFα均表达，第二象限仅表达TNFα，第三象限示出都不表达，第四象限示出表达IFNγaks。左图的分析结果见右图。
由此可知，接受dNP2-siChi3l1复合体的实验组和接受dNP2-siEGFP的对照组的腹股沟淋巴结中，未从CD4 T细胞和CD8 T细胞观察到显著的细胞因子变化。

Claims (6)

1.一种用于预防或治疗黑色素瘤的肺转移的药物组合物，其中，活性成分为由序列号2构成的细胞透过性肽与由序列号1构成的Chi3l1 siRNA融合的复合体；其中，所述细胞透过性肽中的氮原子(N)的数量与所述Chi3l1 siRNA的核酸骨架中磷酸基团(P)的数量的比率为10-40∶1。
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗黑色素瘤的肺转移的药物组合物，其特征在于：
所述Chi3l1 siRNA增大IFNγ-STAT1信号传导，诱导分化成Th1细胞，减少Twist1基因表达。
3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗黑色素瘤的肺转移的药物组合物，其特征在于：
所述药物组合物通过鼻腔途径给药到肺内。
4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗黑色素瘤的肺转移的药物组合物，其特征在于：
所述药物组合物通过喷雾液或粉末型的吸入来给药。
5.根据权利要求1所述的用于预防或治疗黑色素瘤的肺转移的药物组合物，其特征在于：
所述药物组合物具有鼻粘膜、支气管粘膜或肺上皮细胞透过活性。
6.一种复合体在制备用于预防或治疗黑色素瘤的肺转移的药物组合物中的用途，其中，所述复合体由序列号2构成的细胞透过性肽与由序列号1构成的Chi3l1 siRNA融合；其中，所述细胞透过性肽中的氮原子(N)的数量与所述Chi3l1 siRNA的核酸骨架中磷酸基团(P)的数量的比率为10-40∶1。
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