KR102083478B1 - Chi3l1 억제제를 유효성분으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암의 폐 전이를 예방하거나 치료할 수 있는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발생한 암을 사멸을 유도하는 것이 아닌, 암에 대한 폐의 면역을 강화하여, 암이 발생된 후, 효과적으로 암이 폐로 전이되는 것을 억제, 방지 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

CHI3L1 억제제를 유효성분으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical compositions for preventing and treating of metastatic cancer comprising CHI3L1 inhibitor}
본 발명은 암의 폐 전이를 예방하거나 치료할 수 있는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발생한 암을 사멸을 유도하는 것이 아닌, 암에 대한 폐의 면역을 강화하여, 암이 발생된 후, 효과적으로 암이 폐로 전이되는 것을 억제, 방지 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
현대인의 주요 질환 중에서, 암은 인류의 지난 수십년의 노력에도 불구하고, 여전히 난치병으로 남아 있다. 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병인 암은 세포가 일종의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고 비 조절적 방식으로 증식 및 불사화되어 발생하는 질환으로, 다양한 연구개발을 통해 관련된 기전들과 이를 기반으로 하는 다양한 치료제들이 개발되었으나, 아직까지 근본적인 치료방법은 없다.
암에 의한 사망은, 암의 전이에 기인하는 경우가 대다수이며, 특히 폐의 전이를 통하여 재발하게 되는 경우가 많다. 전이(metastasis)란 암세포가 하나의 장기 혹은 그 부분에서 다른 장기나 장기 주변부로 퍼지는 것을 말하며, 주로 악성 암세포들만이 전이하는 능력을 갖는다. 암세포들은 1차 암으로부터 빠져 나와 임파계 혹은 혈관계로 침투해 들어가서 혈관을 순환하여 신체의 다른 부위의 정상 조직에서 성장한다. 암 전이는 악성 암의 전형적인 특징으로 이런 암의 정이는 암에 의한 사망 원인의 90%를 차지하고 있다.
2014년 12월 보건복지부 중앙암등록본부 발표자료에 따르면, 유방암의 경우, 암의 병소가 원발 부위에 국한된 경우에 발견하여 치료한 경우 5년 상대 생존율은 97%였고, 주변으로 퍼진 경우에 발견하여 치료한 경우에는 90% 였으나, 원발 부위로부터 먼 곳으로 전이된 경우 5 년 상대 생존율은 35%로 현저히 저하되었음을 보고한 바 있다.
이러한 전이와 연관되어, 각각의 단계를 조절하는 유전자들은 일부 밝혀진 바 있으나. 암 전이는 다양한 유전적 또는 후생유전적인 변이가 결집된 결과로 발생하는 매우 복잡한 과정을 거치기 때문에 특정 유전자의 발현 증가 또는 감소가 실제 적용시 직접적인 결과로 이어지지 않는 문제점이 있다(특허문헌 1).
특허문헌 1 : 대한민국 등록특허공보 제10-1238196호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, Th1 세포로의 분화를 유도하여, 암이 폐로 전이되는 것을 효과적으로 억제할 수 있는 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 Chi3l1 siRNA를 유효성분으로 함유하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 Chi3l1 siRNA는 IFNγ-STAT1 신호전달을 증가시키고, Th1 세포로의 분화를 유도하며, Twist1 유전자 발현은 감소하는 것을 특징으로 한다.
상기 암은 흑색종이고, 이의 폐 전이를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 Chi3l1 siRNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 Chi3l1 siRNA는 IFNγ-STAT1 신호전달을 증가시키고, Th1 세포로의 분화를 유도하며, Twist1 유전자 발현은 감소하는 것일 수 있다.
상기 암은 흑색종이고, 이의 폐 전이를 억제하는 것일 수 있다.
상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 세포는 조혈 줄기세포, 수지상 세포, 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 서열번호 2로 이루어진 세포투과성 펩타이드와 하기 서열번호 1로 이루어진 Chi311 siRNA가 융합된 복합체를 유효성분으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 비강 경로를 통해 폐 내에 투여되는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 분무액 또는 분말형을 흡입함으로써 투여되는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 코 점막 또는 기관지 점막 또는 폐 상피세포 투과활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 약학 조성물을 개체의 비강 경로를 통해 투여하여, 인간을 제외한 동물의 암의 폐 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 암이 발생하거나, 재발하거나, 또는 항암치료 과정 중, 암이 폐로 전이되는 것을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 즉, Ch3l1의 새로운 폐 세포 내에 면역 기능을 이용함으로써, 암이 폐로 전이되는 것을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 폐로 전이된 암에 대한 효과적인 치료 효과도 나타낸다.
나아가 본 발명의 약학 조성물은 암의 세포사멸을 유도하는 것이 아닌 폐 세포의 Th1, CTL 반응을 기반으로 하는 폐 세포의 면역 기능을 향상시키는 것이기 때문에, 종래 암의 세포사멸을 기반으로 하는 종래 암 치료제에 비해 훨씬 안정적이다.
또한, 본 발명은 종래에는 효과적인 치료 및 예방 효과를 달성할 수 없었던 호흡기를 통한 비강 투여 방식을 통해서, 종래 폐 세포 투과, 전달효율을 높임으로써 훨씬 효과적으로 암이 폐로 전이되는 것을 방지 및 억제하는 효과를 달성하므로, 신속하고 빠르며 효율적인 치료 또는 예방 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 siChi3l1(좌)과 dNP2-siChi3l1 복합체(우)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 비장 면역 세포 증식에 있어서, 키티나제(chitinase)와 Chi3l1 유전자, Chi3l3(Ym-1) 유전자, chitotriosidase와 AMCase의 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 미성숙된 CD4 T 세포와 활성화된 CD4 T 세포에서 Chitinase-like protein(Chi3l1, Ym-1)과 Chitinase(Chitotriosidase, AMCase)의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 미성숙된 CD8 T 세포와 활성화된 CD8 T 세포에서 Chitinase-like protein(Chi3l1, Ym-1)과 Chitinase(Chitotriosidase, AMCase)의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 일차 및 이차 림프관에 존재하는 WT(야생형) 마우스와 Chi3l1 KO 마우스의 면역 세포의 증식을 분석하여 비교한 결과이다. 구체적으로 도 5a는 흉선에서 CD4+CD8+ 세포, CD4+ 세포, CD8+ 세포의 퍼센트를 유세포 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 5b 및 도 5c는 비장에서 수상 세포(CD11c+ MHCII+) 및 대식 세포(CD11b+)의 퍼센트를 유세포 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 5d 내지 도 5f는 비장, 말초 (鼠蹊) 림프절, 장간막 림프절에서의 면역 세포를 유세포 분석법으로 분석하여 나타낸 그래프이며, 도 5g는 CD4 T 세포에서의 Foxp3 발현을 유세포 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 상기 데이터들은 적어도 5 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다.
도 6a는 MACS로 분류된 WT(야생형) 및 Chi311 KO의 미성숙(naive) CD4 T 세포에서, IFNγ 및 IL-4 발현을 유세포 분석법으로 측정하여 나타낸 도면이고, 도 6b는 도 6a의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이때, WT(야생형) 및 Chi311 KO의 미성숙(naive) CD4 T 세포는 3 일 동안 TcR 자극에 의해 활성화된 것이다. 도 6c는 WT(야생형) 및 Chi311 KO 마우스의 비장 세포를 TcR로 자극한 후, 이의 배양 상등액을 ELISA로 측정하여 발현된 IFNγ, IL-2, IL-4 및 IL-17 사이토카인을 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.d는 감지되지 않은 것이고, ns는 유의하지 않은 것을 나타낸다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 7a는 CD3 및 CD28 항체 자극으로 활성화된 WT(야생형) 미성숙 CD8 T 세포 및 Chi311 KO naive CD8 T 세포에서 IL-2 사이토카인과 IFNγ 발현을 분석하여 나타낸 도면이고, 도 7b는 WT(야생형) 미성숙 CD8 T 세포 및 Chi311 KO naive CD8 T 세포에서 IFNγ의 발현 정도를 나타낸 그래프이고, 도 7c는 도 7a의 배양 상등액에서 IFNγ와 TNFα를 측정한 ELISA 결과 그래프이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.d는 감지되지 않은 것이고, ns는 유의하지 않은 것을 나타낸다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 8a는 비활성화 조건(upper)과 항-CD3과 CD28 자극 조건(lower)으로 3일 후에, CFSE 분석을 통해, 분할된 WT(야생형) CD4 T 세포와 Chi311 KO CD4 T 세포의 함량을 분석하여 나타낸 도면이다. 도 8b는 도 8a의 결과로부터 분할된 세포와 비분할된 세포의 퍼센트를 나타낸 그래프이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.d는 감지되지 않은 것이고, ns는 유의하지 않은 것을 나타낸다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 9a는 WT(야생형) CD4 T 세포;와 Chi311 KO naive CD4 T 세포;와 항-CD3 및 항-CD28으로 자극된 WT(야생형) CD4 T 세포;와 항-CD3 및 항-CD28으로 자극된 Chi311 KO naive CD4 T 세포;의 웨스턴블롯 결과를 도시한 도면이다. 도 9b는 도 9a를 β-액틴으로 정규화하고, 이에 대한 각 표적 분자들의 상대적 농도 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.d는 감지되지 않은 것이고, ns는 유의하지 않은 것을 나타낸다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 10은 Chi3I1 KO CD4 T 세포는 민감한 IFNγ 반응을 통해 Th1와 Th2로의 분화 양상을 분석하기 위한 결과이다.
구체적으로 도 10a는 특정 cytokine-skewing 조건하에서 WT(야생형) naive CD4 T 세포와 Chi311 KO naive CD4 T 세포의 Th1, Th2 및 Th17 세포로 분화되는 양상을 측정하여 나타낸 도면이다. 혈청-특이적 사이토카인 발현을 분석하기 위하여 세포 내 사이토카인 염색을 수행하였다. 도 10b는 도 10a의 결과 중에서 부분 집합에 해당하는 사이토카인의 퍼센트를 분석하여 나타낸 그래프이다. 다만 맨 상단에 위치한 그래프는 Th1 세포에 대한 것이고, 중간에 위치한 그래프는 Th2 세포에 대한 것이며, 맨 하단에 위치한 그래프는 Th17에 대한 그래프이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 10c는 도 10a의 배양상등액에서 IFNγ, TNFα, IL-4 및 IL-17을 ELISA로 분석하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 10d는 도 10a에서 분화된 T 세포의 사이토카인과 전사인자들의 RNA 발현 수준을 정량화 실시간 PCR을 통해 분석한 그래프이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 10e는 야생형 Th1, Th2 세포와 Chi3l1 KO Th1, Th2 세포에서 STAT 인산화를 웨스턴블롯으로 측정하여 나타낸 도면(좌측)과 웨스턴블롯에 대한 상대적인 농도 분석으로 정량화한 총 STAT 그래프(우측)이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 10f는 야생형 naive CD4 T 세포와 Chi3l1 KO naive CD4 T 세포는 표시된 농도의 IFNγ 중화 항체로 Th1 세포로 분화시키고, 3일이 지난 후, 세포를 수확하고, 세포 내 염색을 통해 IFNγ과 IL-4 발현을 측정하여 나타낸 도면이다. 도 10g는 IFNγ 중화 항체가 없는 야생형 Th1 세포에서 IFNγ 발현에 대한 IFNγ 발현의 퍼센트를 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 11a는 FACS로 정제한 야생형 미성숙 CD4 T 세포와 Chi3l1 미성숙 CD4 T 세포를 20 ng/㎖ IFNγ로 처리한 후, 사이토카인 처리한 세포로 적정한 시간동안(0, 5, 10, 20 min) 용해하고, BCA 측정법으로 단백질을 정량화한 다음, pSTAT1의 수준을 웨스턴블롯으로 측정하여 나타낸 도면이다.
도 11b는 도 11a에서의 β-actin에 대한 pSTAT1의 상대적인 세기를 바 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 총 두 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. ** p <0.01.
도 12a는 야생형 미성숙 CD8 T 세포와 Chi3l1 미성숙 CD8 T 세포를 FACS Aria ΙΙΙ로 분류하고, IFNγ neutralizing 항체의 정해진 농도(0, 5, 20 ㎍/㎖)와 함께 플레이트에 결합한 항-CD3, CD28, Il-2로 활성화하였다. 이를 ICS에 따른 유세포 분석법을 통해 IFNγ과 Granzyme B 발현을 측정하여 나타낸 도면이다.
도 12b, c는 도 12a에서의 IFNγ(b)과 Granzyme B(c) 의 상대적인 %를 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. * p<0.05. *** p <0.001.
도 13a는 미성숙 세포(naive), Th1-skewed 야생형 CD4 T 세포, Chi3l1 KO CD4 T 세포에서 100-bp RNA 염기서열을 비교한 것으로, 야생형 Th1 세포(WT-Th1)와 Chi3l1 KO Th1 세포(KO-Th1)에서 상향조절된 유전자를 정향화하고, 야생형 Th1 세포와 관련된 Chi3l1 KO Th1 세포에서 증가한 유전자와 비교하여, 흥미로운 유전자들을 선별하여 나타낸 다이아그램이다.
도 13b는 상향 조절(적색) 또는 하향 조절(청색)과 관련된 흥미로운 유전자들의 heatmap 분석 결과이다. 도 13c는 야생형 Th1 세포와 관련된 Chi3l1 KO Th1에서, 최소 두 배의 하향, 상향 조절효과를 갖는 RNA-시퀀싱 데이터에 대한 산포도(scatterplot)이다.
도 13d는 도 13c에서 IFNγ 작용기작과 세포독성과 관련된 유전자의 발현을 정량화 실시간 PCR으로 분석한 결과 그래프이다. 도 13e는 야생형 CD8 T 세포와 Chi3l1 KO CD8 T 세포를 활성화시키고, 이들의 흥미로운 유전자를 정량화 실시간 PCR로 분석한 결과 그래프이다. 각 그래프 상단에 분석 대상 유전자를 표기하였다(일예로 SOCS1, SOCS3 ... CCR5, T-bet 등). 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않다는 것을 의미한다. ** p<0.01. *** p <0.001.
도 14a는 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델에 Ⅳ 투여로 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입하고, 2 주 후에 분석한 결과이다.
도 14b는 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입한 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델의 폐에서의 흉막 콜로니의 상대적 크기와 수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 14c는 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입한 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델로부터 적출된 폐 조직을 H&E 염색으로 분석한 결과이다.
도 14d-g는 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입한 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델의 폐로부터 Percoll을 통해 폐 림프구 세포를 얻고, 이를 유세포 분석법으로 측정한 결과로, 세포 내 사이토카인 염색을 통해 CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포 및 non-lymphocytic polulation에서 IFNγ, Foxp3, Granzyme B를 측정하여 나타낸 도면 및 그래프이다. 각 그래프에는 해당되는 유전자와 모델을 표기하였다. 도 14 e, g에는 IFNγ+, Foxp3+ 및 Granzyme B+의 MFI의 대표적인 퍼센트를 기재하였다.
도 14h는 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입한 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델로부터 분리한 폐 림프구 세포에서 분자의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 14i는 다양한 E:T 비율 조건 하에서, B16F10 표적 세포에 대한 야생형 CD8 T 세포와 Chi3l1 KO CD8 T 세포의 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 14j는 야생형 CD8 T 세포와 Chi3l1 KO CD8 T 세포와 NK 세포의 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 15a는 dNP2-HA2 펩타이드와 Chi3l1 siRNA가 융합하여 형성된 dNP2-siChi3l1 복합체의 구조를 도시한 도면이다.
도 15b는 N/P 비율에 따른 dNP2-siChi3l1 복합체의 아가로스 겔 지연(retardation) 분석 결과이다.
도 15c는 HEK293T 세포에 Lipofectamine에 의해 Chi3l1 siRNA를 처리한 경우(Lipo-siChi3l1), dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 경우(dNP2-siChi3l1), 상기 HEK293 T 세포로부터 Chi3l1 mRNA의 발현정도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 15d는 ELISA를 통해 상기 도 15c로부터 Chi3l1의 상대적인 발현량을 분석한 그래프이다. 이때, 상기 HEK293T 세포는 pDNA를 통해 Chi3l1를 과발현한 것(음성 대조군;pDNA+로 표기)으로 사용하였다. pDNA를 처리하지 않은 HEK293T 세포는 양성 대조군으로 pDNA-로 표기하였다.
도 15e는 흑색종 폐암 전이 동물모델에 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1을 비강을 통해 처리한 후, 폐에서 Chi3l1 mRNA 발현량을 분석하여 나타낸 그래프이다. 0 일째에 발현된 Chi3l1 mRNA를 기준으로 하여, 각 날짜별로 측정된 Chi3l1 mRNA의 상대적인 발현양을 계산하여 표기하였다.
도 15f는 흑색종 폐암 전이 동물모델에 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1을 비강을 통해 처리한 후, 폐에서 Chi3l1 단백질 발현수준을 웨스턴 블롯으로 분석 결과이다. 도 15g는 도 15f의 결과에 대한 밀도 분석(densitometric analysis)으로, β-actin 대비 Chi3l1 단백질 발현수준을 계산하여 나타낸 그래프이다. Chi3l1 밴드강도를 β-actin 밴드 강도에 대해 정량화하였다.
도 15h는 다양한 농도(100 ng, 250 ng)의 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1를 야생형 naive CD4 T 세포에 처리하고, 5일 동안 배양한 후, Th1 세포로의 분화여부를 측정하여 나타낸 그래프(좌)와, 각각의 경우에서 IFNγ 및 TNFα 발현정도를 유세포 분석으로 분석하여 나타낸 그래프(우)이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 15i는 다양한 농도(100 ng, 250 ng)의 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1를 항-CD3, 항-CD28 및 IL-2로 활성화된 야생형 naive CD8 T 세포에 처리하고, 3일 동안 배양한 후, CD8 T 세포로의 분화여부를 측정하여 나타낸 그래프(좌)와, 각각의 경우에서 IFNγ 및 TNFα 발현정도를 유세포 분석으로 분석하여 나타낸 그래프(우)이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 16a는 흑색종 폐 전이 동물모델을 이용한 대조군과 실험군의 제조방법을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 16b는 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1를 처리한 흑색종 폐 전이 동물모델로부터 적출한 폐의 사진이다.
도 16c는 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1를 처리한 흑색종 폐 전이 동물모델의 폐에 형성된 흉막 콜로니(pleural colonies)들의 상대적인 크기와 수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 16d는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 폐의 부분을 H&E로 염색하고 광학 현미경으로 촬영한 이미지이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 16e는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 percoll을 통해 분리한 폐 림프구(lymphocytes)에서 유세포 분석으로 CD4와 CD8 T 세포에서 IFNγ, Granzyme B을 분석한 결과 그래프이다.
도 16f는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 분리한 폐 조직에서, 세포 내에 존재하는 사이토카인 염색을 통해 CD4+IFNγ+ 또는 CD8+IFNγ+ 집단에서 T-bet을 분석하여 나타낸 그래프이다. 도 16h, g는 도 16f에서 MFI를 구체적으로 분석하여 나타낸 그래프이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 16i는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 Percoll을 통해 분리한 폐 림프구 파편에서 표적하는 유전자의 발현을 분석하여 나타낸 그래프이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 17은 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군에서 NK 세포 기능이 영향을 미치지 않음을 확인하기 위한 실험으로, 도 17a는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 Percoll로 분리한 폐 림프구에서 NK 세포(NK1.1+CD4-CD8-)와 비 림프구 집단(NK1.1-CD4-CD8-)를 유세포 분석으로 분석한 결과 그래프이다.
도 18은 실험예 8. 가에서의 실험군과 대조군의 실험 조건을 도시화한 도면이다.
도 19는 실험예 8. 가의 실험군과 대조군에서의 폐 표면에 흑색 점으로 가시화된 흑색종 콜로니의 개수를 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 20은 실험예 8의 실험군과 대조군에서 적출한 폐의 사진이다.
도 21 및 도 22는 실험예 8. 가에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 폐에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 실험예 8. 가에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 비장에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24는 실험예 8. 가에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 서혜부 림프절에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 실험예 8. 나에서의 실험군과 대조군의 실험 조건을 도시화한 도면이다.
도 26은 실험예 8. 나의 실험군과 대조군에서의 폐 표면에 흑색 점으로 가시화된 흑색종 콜로니의 개수를 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 27은 실험예 8. 나의 실험군과 대조군에서 적출한 폐의 사진이다.
도 28은 실험예 8. 나에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 폐에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 실험예 8. 나에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 비장에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 실험예 8. 나에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 서혜부 림프절에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1로 표시되는 Chi3l1 siRNA를 유효성분으로 함유하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
키티나아제(chitinase)는 식물에서 키틴을 분해하고, 병원체로부터 숙주를 보호하기 위한 방어적 역할을 담당하는 효소로, 키티나아제 유사 단백질(chitinase-like proteins;CLPs)는 포유동물에서도 발견되나, 이들은 키틴에 결합하는 단백질 신호는 가지지만 키틴을 분해하는 활성을 갖지 못한다. 포유동물에서의 키티나아제 유사 단백질은 Th2 염증, 면역 반응 조절 역할을 수행하는 역할로 진화하였다.
상기 CLP 중에서 chitinase 3-like 3(Chi3l3)이라 불리는 Ym-1과 chitinase 3-like 4(Chi3l4)라 불리는 Ym-2는 선충 감염 모델에서 γδT 세포의 수와 IL-17 생산을 증가시키는 것을 확인한 바, 알레르기와 관련있는 Th2 염증을 조절할 수 있다고 알려져있다.
또한 chitinase 3-like 1(Chi3l1)이라 불리는 BRP-39은, streptococcus pneumoniase 감염과 제2형 염증에 대한 치료효과를 가지고 있다고 알려져 있으나, 포유류의 적응 면역과정에서 Chi311의 구체적인 면역 조절기능과 치료학적으로 표적성에 대해서 전혀 알려진 바 없다.
따라서 본 발명은 생체 내, 외의 실험(in vitro, in vivo)을 통해 활성화된 T 세포(예를 들어 Th2 세포)에서 Chi311 발현이 증가함을 확인하였고, Chi311 결핍 T 세포에서 TcR 자극에 과민 반응을 보이고 있음을 확인하였으며, Th1 세포의 분화에 있어서 IFNγ-STAT1 신호전달이 증가하면 Th1 세포로 분화되기 쉬워지는 것을 확인함과 동시에, Chi1l1이 결핍된 Th1 세포에서 항종양 면역 유전자의 발현을 증가되고, Twist1과 같은 Th1 저해유전자는 감소되는 것을 확인함으로써, Chi311 유전자가 암이 폐로 전이되는 것에 영향을 미치고 있음을 발견하였다.
또한 Chi311이 존재하지 않는 동물모델을 통해 분석한 결과 IFNγ, T-bet, Granzyme B- 생산 CD4 및 CD8 T 세포가 증가하게 되고, 흑색 종 폐전이가 감소하는 것을 확인하였다.
상술한 결과를 근거로 하여 Chi311 유전자를 직접 투여해줄 경우에는, 종양세포에 특이적이지 못하고, 정상세포 등에 부작용을 야기하는 문제가 존재하였다. 따라서 이러한 문제를 해결하면서 우수한 예방 또는 치료효과를 달성하도록 하기 위하여 수많은 실험을 통해 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명의 서열번호 1의 siChi3l1 유전자는 전이성이 높은 암이 발생하였을 때, 상기 암세포가 폐로 전이되는 것을 예방 또는 치료할 수 있음을 다양한 실험을 통해 확인하였다.
상기 암은 통상의 암을 의미하며, 상기 암은 뇌종양, 척수종양, 망막 세포종, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암, 후두암, 경부암을 포함하는 두경부암, 흑색종을 포함하는 피부암, 유방암, 갑상선암, 악성부신종양을 포함하는 유방암, 내분비암, 폐암, 흉막종양, 악성부신종양을 포함하는 호흡기암, 식도암, 위암, 소장의 악성종양, 대장암, 항문암, 간암, 담도암 또는 췌장암을 포함하는 소화기암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암 또는 음경암을 포함하는 비뇨기암, 자궁경부암, 자궁체부암, 융모상피암 또는 난소암을 포함하는 부인암, 급성 또는 만성 백혈병, 악성림프종 또는 다발성 골수증을 포함하는 혈액암, 골종양 또는 연부종양을 포함하는 골 또는 연부 종양, 및 소아 백혈병 또는 소아 고형종양을 포함하는 소아암 등일 수 있고, 바람직하게는 흑색종일 수 있다. 또한 본 발명에서 암 전이란 특정 부위에서 발생한 암 또는 재발암이 폐 부위로 전이되는 것을 일컫는다.
상기 재발암은 통상의 암 치료 후, 재발생한 암을 의미한다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 Chi3l1 siRNA는 Chi3l1 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 Chi3l1 발현을 억제하는 siRNA이다. 상기 Chi3l1 유전자는 암이 폐로 전이되는 것과 관련된 유전자이다. 따라서 SiRNA에 의해 Chi3l1 유전자 발현을 억제하면, 폐에서의 Th1과 CTL 기능을 향상시키게 되고, 폐의 면역 기능을 증진시켜, 종양의 사멸을 유도하는 것이 아닌 종양의 성장과 진행을 억제함으로써, 특정 부위에서 발생한 암 또는 재발암이 폐로 전이되는 것을 예방하고 치료하는 용도로 사용할 수 있다.
상기 Chi3l1 siRNA는 IFNγ-STAT1 신호전달을 증가시키고, Th1 세포로의 분화를 유도하며, Twist1 유전자 발현은 감소함으로써, 본 발명의 상기 효과를 달성할 수 있게 된다.
이때, 상기 siRNA의 염기서열은 chi3l1의 활성을 억제할 수 있는 것이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1을 사용함이 바람직하고, 상기 siRNA의 3' 말단에는 dTdT의 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 서열번호 1의 siChi3l1 서열은 표적부위로 마우스의 Chi3l1를 갖는다.
본 발명의 용어 'siRNA(short interfering RNA)'란 유전자의 활성을 억제하는 RNAi를 유발시킬 수 있는 이중가닥 RNA를 의미한다. 본 발명에서 siRNA는 Chi3l1의 활성을 억제할 수 있는 siRNA를 의미하는데, 상기 siRNA는 RNAi를 유발시키기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능한데, 예를 들면, 화학합성 또는 생화학적 합성 또는 생체내 합성에 의해 수득되는 siRNA, 혹은 약 40개 염기 이상의 이중가닥 RNA가 체내에서 분해된 10개 염기대 이상의 이중가닥 RNA 등을 사용할 수 있다.
상기 siRNA는 Chi3l1의 핵산서열의 일부에 대하여 약 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 가지는 서열로 구성될 수 있고, 이중가닥 부분을 포함하는 RNA 또는 그의 개변체를 사용할 수도 있다. 상동성을 가지는 서열부분은, 통상적으로 적어도 15 뉴클레오티드 이상이고, 바람직하게는 약 19 뉴클레오티드 이상이며, 보다 바람직하게는 적어도 20 뉴클레오티드 이상이고, 더욱 바람직하게는 21 뉴클레오티드 이상이다. 아울러, 상기 siRNA는 Chi3l1의 염기서열 중에서 다른 RNA와 상동성이 가장 낮은 영역에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열로 구성됨이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 siRNA를 직접적으로 투여함에도 불구하고, 벡터 혹은 담체를 이용하지 않아도 암의 전이를 예방 또는 치료할 수 있다는 효과를 갖는다는 큰 장점이 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 1로 표시되는 Chi3l1 siRNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "Chi3l1 siRNA를 포함하는 벡터"에는 세포내에서 상기 siRNA로 변환될 수 있는 shRNA를 전사할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명의 용어 'shRNA(short hairpin RNA)'란, 단일가닥 RNA에서 부분적으로 회문상(回文狀)의 염기서열을 포함함으로써, 3' 영역에 이중가닥 구조를 가지고 헤어핀과 같은 구조를 형성하고, 세포내에서 발현된 후에 세포내에 존재하는 RNase의 일종인 dicer에 의하여 절단되어 siRNA로 변환될 수 있는 RNA를 의미하는데, 상기 이중가닥 구조의 길이는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는 10뉴클레오티드 이상이고, 보다 바람직하게는 20 뉴클레오티드 이상이다. 본 발명에 있어서, 상기 shRNA는 벡터에 포함될 수 있는데, 상기 shRNA를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면, 상기 shRNA가 세포내에서 발현되고, 상기 발현된 shRNA는 세포내에 존재하는 RNase III의 일종인 dicer에 의하여 절단되어 siRNA로 변환되며, 상기 변환된 siRNA는 RNAi를 유발시켜서 Chi3l1의 활성을 억제할 수 있다.
상기 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 세포는 조혈 줄기세포, 수지상 세포, 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 제제화한 것일 수 있다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한, 상기 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 비강, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으나, 가장 바람직하게는 비강 경로를 통해서 주입되는 것일 수 있다. 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여와 같은 다른 투여경로로 투여될 경우 동등한 효과를 얻기 위해서는 약학 조성물의 농도를 2 배 이상 투여해주어야 한다는 단점이 존재하므로, 소량으로 최대의 효과를 얻기 위해서는 비강을 통해 흡수하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 비강 경로로 투여할 수 있는 제형이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명에 사용된 "비강 경로를 통한 투여"는 안정제 또는 기타 부형제의 첨가 여부에 관계없이 용액형, 분말형 또는 에어로졸화 또는 분무화 용액형 또는 분말형의 흡입에 의하여 비강을 통해 기도 또는 폐에 투여할 수 있도록 함으로써, 상기 약학적 조성물이 기도, 기관, 기관지 폐포에 투여될 수 있는 모든 투여형을 포함한다.
구체적으로 비강 경로 투여 방법으로는 압축 공기/산소 혼합물을 이용한 가압 분무기, 초음파 분무기, 전기 미세 펌프 분무기, 계량 흡입기(MDI) 및 건조 분말 흡입장치(DPI)를 사용할 수 있다. 에어로졸의 경우 기계식 환기 또는 관이 삽입된 환자의 기관내 튜브를 경유하여 전달 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1 일 0.01 ng/kg 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 서열번호 2로 이루어진 세포투과성 펩타이드와 하기 서열번호 1로 이루어진 Chi311 siRNA가 융합된 복합체를 유효성분으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 앞서 설명한 Chi311 유전자에 대한 결과를 기반으로 하여, 소량으로도 우수한 예방 또는 치료효과를 달성하도록 하기 위하여 예의 노력한 결과 완성한 것으로써, 세포 침투 펩타이드 dNP2-HA2와 Chi311의 siRNA와의 복합체(dNP2-siChi3l1)를 통해 비강으로 투여할 경우, Th1과 CTL의 증가로 폐 전이를 효과적으로 억제 하고 있음을 생체 외, 내에서 확인하였다. 또한 상기 약학 조성물은 암의 세포사멸을 유도하는 것이 아닌 siChi31l에 기반한 복합체의 면역 조절 기능 향상 효과를 증진시키고, 폐 세포의 Th1, CTL 반응을 기반으로 하는 폐 세포의 면역 기능을 향상시키는 것이기 때문에, 종래 암의 세포사멸을 기반으로 하는 종래 암 치료제에 비해 훨씬 안정적이고 효과적이라 할 수 있다.
게다가 본 발명의 복합체는 앞서 설명한 Chi3l1 유전자를 타겟으로 하는 siRNA를 표적 선택적으로 세포를 투과할 수 있어 최대의 치료효과를 발휘하게 함으로써, 암의 전이를 효과적으로 억제 및 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 dNP2-siChi3l1 복합체는 다양한 경로를 통해 투여가 가능하나, 바람직하게는 비강 경로를 통해 투여하는 것일 수 있는데, 비강 경로를 통해 투여할 경우, 다른 경로를 통해 투여하는 것보다 암이 폐로 전이되는 것에 대한 약리효과가 현저히(2~3 배 이상) 우수하였음을 확인하였다.
본 발명의 복합체는 siChi3l1을 단독으로 사용하는 경우에 비해서, 생성이 용이하고, 구성이 단순하며, 잠재적 안정성이 더욱 우수하다. 게다가 통제되지 않는 복제의 위험성이 없고, 바이러스 혹은 비 바이러스 벡터를 이용하지 않아도 되기 때문에 형질주입에 따른 간섭과 잠재적인 부작용에 의한 염려를하지 않아도 되어 매우 안정적이라 할 수 있다. 게다가, 벡터와 같은 전달체를 이용하는 것에 비해 합성이 매우 저렴하고, 전달효울도 매우 우수하여(낮은 농도의 siChi3l1을 투여하여 최대의 예방 또는 치료효과를 달성함) 경제적 측면에서 큰 이점을 갖는다.
본 발명에 따른 복합체는 적당한 약물 분포를 달성하기 위하여, 확산에 의존하지 않는다는 점에 최대의 이점으로, 치료물질을 주사를 통해 폐의 세포 밖 공간 사이에 생성되는 압력경도에 따라 분산하여, 불균질하게 약물이 분포되고 농도구배에 따른 확산을 통해 분포되는 것과는 달리, 상기 복합체는 세포투과성을 가지므로, 적은 양으로도 폐의 상당한 용량에 걸쳐 세포 내외에 siChi3l1가 전체적으로 균일하게 전달 및 투과되어, 최대의 예방 또는 치료 효과를 달성하게 된다는 것이다.
암세포를 사멸시키는 경우에는 특정 암세포에 국소적인 치료만으로 그 효과를 충분히 달성할 수 있으나, 본 발명에서와 같이 암이 폐로 전이되는 것을 억제 및 방지하기 위해서는 국소적인 분포만으로는 그 효과를 달성하기 어렵기 때문에, 본 발명의 복합체와 같이 폐 전체적인 균일한 분포와 전달이 암의 전이를 억제 및 방지하는데 엄청난 이점을 제공하는 것이 명확하다.
이에 본 발명의 하기 서열번호 2로 이루어진 세포투과성 펩타이드와 하기 서열번호 1로 이루어진 Chi311 siRNA가 융합된 복합체가 전이성 높은 암이 발생하였을 때, 상기 암세포가 폐로 전이되는 것을 예방 또는 치료할 수 있음을 다양한 실험을 통해 확인하였다.
상기 암은 통상의 암을 의미하며, 상기 암은 뇌종양, 척수종양, 망막 세포종, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암, 후두암, 경부암을 포함하는 두경부암, 흑색종을 포함하는 피부암, 유방암, 갑상선암, 악성부신종양을 포함하는 유방암, 내분비암, 폐암, 흉막종양, 악성부신종양을 포함하는 호흡기암, 식도암, 위암, 소장의 악성종양, 대장암, 항문암, 간암, 담도암 또는 췌장암을 포함하는 소화기암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암 또는 음경암을 포함하는 비뇨기암, 자궁경부암, 자궁체부암, 융모상피암 또는 난소암을 포함하는 부인암, 급성 또는 만성 백혈병, 악성림프종 또는 다발성 골수증을 포함하는 혈액암, 골종양 또는 연부종양을 포함하는 골 또는 연부 종양, 및 소아 백혈병 또는 소아 고형종양을 포함하는 소아암 등일 수 있고, 바람직하게는 흑색종일 수 있다. 또한 본 발명에서 암 전이란 특정 부위에서 발생한 암 또는 재발암이 폐 부위로 전이되는 것을 일컫는다.
상기 재발암은 통상의 암 치료 후, 재발생한 암을 의미한다.
본 발명에서 "복합체"란 하기 서열번호 2로 이루어진 세포투과성 펩타이드와 하기 서열번호 1로 이루어진 siChi3l1을 포함하며, 이들의 유전적 융합이나 화학적 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, 상기 dNP2-siChi3l1 복합체에 있어서, 상기 서열번호 2의 dNP2-HA2와 서열번호 1의 siChi3l1을 혼합하여 제조하였을 때, 상기 혼합 비율이 10:1 미만인 경우, 제대로 복합체를 형성하지 못하거나, 비강 경로로 투여된다 하더라도 폐 내에 효과적으로 전달되지 못하여 siChi3l1가 투과 및 표적하지 못하는 문제가 있음을 확인하였다.
따라서 상기 dNP2-siChi3l1 복합체에 있어서, 상기 서열번호 2의 dNP2-HA2와 서열번호 1의 siChi3l1을 혼합하여 제조하였을 때, 상기 서열번호 2의 dNP2-HA2와 서열번호 1의 siChi3l1은 혼합비율 즉, dNP-HA2 펩타이드의 질소원자(N) 대 핵산 골격 포스페이트(P) 간의 비가 10-40 : 1일 수 있고, 보다 바람직하게는 22-28 : 1일 수 있으며, 가장 바람직하게는 25 : 1일 수 있다.
본 발명에 따른 dNP2-siChi3l1 복합체를 비강 경로를 통해 투여함으로써, 종래 siChi3l1, 혹은 상기 복합체를 다른 경로를 통해 투여할 때 보다 암이 폐로 전이되는 것에 대한 약리효과가 현저히(2~3 배 이상) 우수하였음을 확인하였다.
본 발명의 실험예에서 흑색종 세포의 주입을 통해 유도된 흑색종 폐 전이 동물모델에서, dNP2-siChi3l1 복합체를 투여하였을 때, 면역 조절 효과를 조사한 결과, Th1, CTl 기능이 향상됨으로써 흑색종에 의한 폐 전이가 2~6배 가량 현저히 억제되었음을 확인하였다.
본 발명에 따른 dNP2-siChi3l1 복합체를 비강 경로 외에 다른 경로를 통해 투여할 경우 본 발명의 암의 폐 전이에 대한 약리효과를 달성하기 위하여 2배 이상의 농도를 투여해야 한다는 단점이 발생할 수 있다.
상기 암은 통상의 암을 의미하며, 상기 암은 뇌종양, 척수종양, 망막 세포종, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암, 후두암, 경부암을 포함하는 두경부암, 흑색종을 포함하는 피부암, 유방암, 갑상선암, 악성부신종양을 포함하는 유방암, 내분비암, 폐암, 흉막종양, 악성부신종양을 포함하는 호흡기암, 식도암, 위암, 소장의 악성종양, 대장암, 항문암, 간암, 담도암 또는 췌장암을 포함하는 소화기암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암 또는 음경암을 포함하는 비뇨기암, 자궁경부암, 자궁체부암, 융모상피암 또는 난소암을 포함하는 부인암, 급성 또는 만성 백혈병, 악성림프종 또는 다발성 골수증을 포함하는 혈액암, 골종양 또는 연부종양을 포함하는 골 또는 연부 종양, 및 소아 백혈병 또는 소아 고형종양을 포함하는 소아암 등일 수 있고, 바람직하게는 흑색종일 수 있다. 또한 본 발명에서 암 전이란 특정 부위에서 발생한 암 또는 재발암이 폐 부위로 전이되는 것을 일컫는다.
상기 재발암은 통상의 암 치료 후, 재발생한 암을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 제제화한 것일 수 있다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한, 상기 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 비강, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으나, 가장 바람직하게는 비강 경로를 통해서 주입되는 것일 수 있다. 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여와 같은 다른 투여경로로 투여될 경우 동등한 효과를 얻기 위해서는 약학 조성물의 농도를 2 배 이상 투여해주어야 한다는 단점이 존재하므로, 소량으로 최대의 효과를 얻기 위해서는 비강을 통해 흡수하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 비강 경로로 투여할 수 있는 제형이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명에 사용된 "비강 경로를 통한 투여"는 안정제 또는 기타 부형제의 첨가 여부에 관계없이 용액형, 분말형 또는 에어로졸화 또는 분무화 용액형 또는 분말형의 흡입에 의하여 비강을 통해 기도 또는 폐에 투여할 수 있도록 함으로써, 상기 약학적 조성물이 기도, 기관, 기관지 폐포에 투여될 수 있는 모든 투여형을 포함한다.
구체적으로 비강 경로 투여 방법으로는 압축 공기/산소 혼합물을 이용한 가압 분무기, 초음파 분무기, 전기 미세 펌프 분무기, 계량 흡입기(MDI) 및 건조 분말 흡입장치(DPI)를 사용할 수 있다. 에어로졸의 경우 기계식 환기 또는 관이 삽입된 환자의 기관내 튜브를 경유하여 전달 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1 일 0.01 ng/kg 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 약학 조성물을 개체의 비강 경로를 통해 투여하여, 인간을 제외한 동물의 암의 폐 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 약학 조성물을 생체 또는 세포 내 주입은 비내(nasal), 점막 내(mucosal), 흡입(inhalation)의 경로로 주입함으로써 수행될 수 있다. 상기 전달 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비면역원성, 비감염성이며, 레트로바이러스 또는 아데노 바이러스와 같은 벡터 유기체에 DNA가 패키징되어 있지 않기 때문에 플라스미드 크기에 제한을 받지 않는다. 따라서 어떤 실용적인크기의 재조합 유전자 발현 구조물에도 사용될 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
<실험방법>
1) 동물모델
6-8 주령의 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. Chi3l1 KO 마우스는 Jack A Elias(Brown University)에서 제공받은 것을 사용하였다. 모든 마우스는 특정 무균 시설(한양 대학교)에서 사육 및 보관하였고, 21 ± 1 ℃ 온도, 50 ± 5% 습도 및 12 시간 주기의 낮과 밤 사이클(regular chow, PicoLab Rodent Diet)의 시설조건을 유지하였다. 정기적으로 먹이와 멸균수(autoclaved water)를 제공하였다.
모든 동물 프로토콜은 한양대학교 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받아 수행하였고, 실험은 한양 대학교 동물실험윤리위원회의 가이드라인에 따라 수행하였다.
2) 인비트로 상에서 T 세포 활성화 및 분화(differentiation)
WT와 Chi3l1 KO naive CD4 T 세포를 마우스 CD4+CD25-CD62L+ T 세포 분리용 키트 ⅠⅠ(Miltenyi Biotec)의 메뉴얼에 따라, 분리하였다. 순도(purity)는 약 95%였다. 형광 염료(Fluorochrome)로 라벨링된 CD4+CD25-CD44-CD62Lhigh naive CD4 T 세포와 CD8+CD25-CD44-CD62Lhigh naive CD8 T 세포는 FACS Aria 세포 분류기(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에 따라 분류하였고, 이때 순도는 약 98%였다. 정제된 naive CD4와 CD8 T 세포는 2 ㎍/㎖ 플래이트에 부착된 항CD3, 항CD28 항체(BD Biosciences)에 의해 활성화되었고, 3일 또는 5일간 다음의 사이토카인에 노출함에 따라, 분화하였다; Th0에 대한 배지만 단독 사용; CTL에 대한 IL-2(50 U/㎖ Peprotech); Th1에 대한 IL-12(0.2 ng/㎖, BD Biosciences), IL-2(50 U/㎖) 및 항 IL-4 항체(5 ㎍/㎖, BD Biosciences); Th2에 대한 IL-4(30 ng/㎖, BD Biosciences), IL-2(50 U/㎖) 및 항 IFNγ 항체(5 ㎍/㎖, BD Biosciences); 및 Th17에 대한 TGF-β(0.5 ng/㎖, R&D Systems), IL-6(30 ng/㎖, BD BioSciences), IL-23(20 ng/㎖, BD Biosciences), IL-1β(20 ng/㎖ R&D Systems), 항-IFNγ(5 ㎍/㎖) 및 항IL-4(5 ㎍/㎖) 항체를 포함되어 있다.
Th2 서브 세트에서 IL-4 발현을 측정하기 위하여, Th2 세포를 5일 째에 수확하고, 24 시간 동안 플래이트에 부찰된 항CD3 항체로 다시 활성화시켰다. 일부 실험에서, rmChi3l1 단백질 또는 IFNγ-neutralizing 항체 또는 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1의 지시된 양을 Th1- 또는 CTL-skewing 조건에서 첨가하였다. Il-2, IFNγ, IL-4 및 Il-17은 ELISA(eBioscience)을 사용하여 배양 상등액으로부터 측정하였다.
3) 유세포 분석(flow cytometry )
세포 증식을 측정하기 위하여, 분류된 WT와 Chi3l1 KO naive CD4 T 세포를 CFSE(0.75 μM, Invitrogen)으로 37 ℃에서 10분간 염색하고, 완전한 RPMI 배지로 세척하였다. CFSE로 표지된 세포를 플래이트에 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체와 함께 3 일동안 자극하였다. 분열 중인 세포(Dividing cells)를 항-mouse CD4-perCP-Cy5.5 항체와 함께 염색한 후, 유세포 분석법으로 분석하였다. 세포 내 사이토카인 발현 수준을 분석하기 위하여, 세포를 eBioscience 세포 Stimulation Cocktail(단백질 운반체 저해제를 추가)으로 4 시간동안 재자극하고, 항-mouse CD4-PerCP-Cy5.5 또는 CD8-PerCP-Cy5.5로 15분 동안 염색하였다. 세포를 고정하고, 침출시키고, 항-mouse IFNγ-FITC, IL4-PE 또는 TNFα-PE 및 IL-17-APC로 CD4 T 세포를 염색하거나, IFNγ-APC, TNFα-PE, Granzyme B-FITC로 CD8 T 세포를 염색하였다. 이를 유세포 분석법으로 분석하였다.
폐 흑색종 전이 모델(pulmonary melanoma metastasis model)에서, 정제된 림프구를 4 시간동안 eBioscience 세포 Stimulation Cocktail(단백질 운반체 저해제를 추가)으로 재자극하고, 항-mouse CD4-APC-Cy7, CD8-PerCP-Cy5.5, NK1.1-PE로 30 분간 염색하였다. 이후 상기 세포를 고정하고, 침출하고, 항-mouse IFNγ-APC, Granzyme B-FITC, T-bet-PE-cy7, Foxp3-PE로 염색한 후, 유세포 분석법으로 분석하였다.
4) 웨스턴 블롯
농축된 naive CD4 T 세포를 3일 또는 5일 동안 Th0, Th1 및 Th2 헬퍼 T 세포로 편향되도록 하고, 얼음에서 HALT 억제제(Thermo Fisher Scientific)의 존재 하에서 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology)으로 30 분 동안 용해시켰다. 용해물에서의 단백질의 양은 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)로 사용하여 결정하였다. SDS-PAGE 후, 단백질을 PVDF 멤브레인(Bio-Rad)으로 옮겼다. 막은 0.1% Tween-20을 함유하는 트리스 완충 식염수 중 5% skim milk로 차단(blocked)하였다. 차단 후, 막을 1 차 항체(하기 기재)와 함께 밤새 4 ℃에서 배양하였다. 다음 막을 2 차 항체(하기 기재)와 함께 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척된 막을 EZ-Western Lumi Pico 또는 Femto 시약(DoGen)으로 분석하였다. 밴드 강도는 퓨전-솔로(Fusion-Solo)로 측정하였고, 획득된 이미지로부터 얻은 gate 밴드 강도는 퓨전-캡 어드밴스(Fusion-capt advance)(Vilber Lourmat)을 사용하여 분석하였다. Mouse anti-Chi131 항체는 R&D Systems로부터 구입하였고, 마우스 p-Erk, p-Akt, pSTAT1, pSTAT4, pSTAT6, tSTAT1, tSTAT4 및 tSTAT6 항체 및 HRP-결합된 항토끼는 Cell Signaling Technology로부터 입수하였다.
5) 정량적 실시간 PCR(Quantitative real-time PCR )
생체 외에서 분화시킨 CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 분리된 폐 림프구로부터 총 RNA를 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 폐 조직은 TRIzol(Thermo Fisher Scientific)을 넣은 균질기로 파쇄하고, 총 RNA를 추출 하였다. cDNA는 ReverTra Ace qPCR RT 마스터 믹스(Toyobo)를 사용하여 합성하였다. Real-time PCR은 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)를 사용하여 Bio-Rad CFX Connect 실시간 PCR 검출 시스템에서 수행되었다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 열거하였다.
Forward 5' to 3' Reverse 3' to 5'
Actb TGTCCCTGTATGCCTCTGGT CACGCACGATTTCCCTCTC
Chi3l1 GTACAAGCTGGTCTGCTACTTC ATGTGCTAAGCATGTTGTCGC
Tbx21 AGCAAGGACGGCGAATGTT GGGTGGACATATAAGCGGTTC
Runx3 GACTCCTTCCCCAACTATACACC GTGCTCGGGTCTCGTATGAA
Ifng ATGAACGCTACACACTGCATC CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC
Gata3 GAAGGCATCCAGACCCGAAAC ACCCATGGCGGTGACCATGC
Il4 GGTCTCAACCCCCAGCTAGT GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT
Il13 CAGCCTCCCCGATACCAAAAT GCGAAACAGTTGCTTTGTGTAG
Il5 CTCTGTTGACAAGCAATGAGACG TCTTCAGTATGTCTAGCCCCTG
Il10 GCTCTTACTGACTGGCATGAG CGCAGCTCTAGGAGCATGTG
Junb TCACGACGACTCTTACGCAG CCTTGAGACCCCGATAGGGA
Rorgt GACCCACACCTCACAAATTGA AGTAGGCCACATTACACTGCT
Il17 TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA CTTTCCCTCCGCATTGACAC
Il21 GGACCCTTGTCTGTCTGGTAG TGTGGAGCTGATAGAAGTTCAGG
Gmcsf GGCCTTGGAAGCATGTAGAGG GGAGAACTCGTTAGAGACGACTT
Batf GTTCTGTTTCTCCAGGTCC GAAGAATCGCATCGCTGC
Socs1 CTGCGGCTTCTATTGGGGAC AAAAGGCAGTCGAAGGTCTCG
Socs3 ATGGTCACCCACAGCAAGTTT TCCAGTAGAATCCGCTCTCCT
Socs5 GAGGGAGGAAGCCGTAATGAG CGGCACAGTTTTGGTTCCG
Perforin GAGAAGACCTATCAGGACCA AGCCTGTGGTAAGCATG
Gzmb CCTCCTGCTACTGCTGAC GTCAGCACAAAGTCCTCTC
Il13ra2 ACCGAAATGTTGATAGCGACAG ACAATGCTCTGACAAATGCGTA
Chit1 TGGGCAGGTGTGATGACTCT CCCTGGGAAAGAACCGAACTG
Amcase CTGCGTCAGTATGGGTTTGAT TGGGCCTGTTGCTCTCAATAG
Ym-1 ACCTGCCCCGTTCAGTGCCAT CCTTGGAATGTCTTTCTCCACAG
Foxp3 CCCATCCCCAGGAGTCTTG ACCATGACTAGGGGCACTGTA
Eomes TCATCGCTGTGACGGCCTACCA GGGGAATCCGTGGGAGATGGAGT
Tnfsf10 ATGGTGATTTGCATAGTGCTCC GCAAGCAGGGTCTGTTCAAGA
Ccr5 TTTTCAAGGGTCAGTTCCGAC GGAAGACCATCATGTTACCCAC
Cxcr3 TACCTTGAGGTTAGTGAACGTCA CGCTCTCGTTTTCCCCATAATC
Cxcr2 ATGCCCTCTATTCTGCCAGAT GTGCTCCGGTTGTATAAGATGAC
Ctse GACATCAGTCCCTTCGGAAGA AGGGGTTCATTGACACTCGAATA
Twist1 GGACAAGCTGAGCAAGATTCA CGGAGAAGGCGTAGCTGAG
6) RNA 시퀀싱
총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 WT 및 Chi310 KO naive 및 Th1 세포로부터 분리하였다. RNA 품질은 RNA 6000 Nano Chip(Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands)을 사용하여 Agilent 2100 bioanalyzer에 의해 평가되었다. RNA 정량은 ND-2000 spectrophotometer(Thermo Inc., DE, USA)를 사용하여 수행하였다. 대조군(controls)과 실험군(test) RNA의 경우, SENSE mRNA-Seq 라이브러리 준비 키트 (Lexogen, Inc., Austria)를 사용하여 라이브러리 구축을 수행하였다.
요약하면 총 RNA 2 ㎍을 준비하고 oligo-dT로 장식된 자성 비드와 함께 배양한 다음, 세척을 통해 mRNA를 제외한 다른 모든 RNA를 제거하였다. 라이브러리 제작은 자성비드에 여전히 결합되어 있는 폴리(A) RNA의 starter/stopper heterodimers의 무작위 하이브리드화에 의해 시작된다. 이러한 starter/stopper heterodimers는 Illumina-compatible 링커 서열을 포함하고 있다. 단일 튜브 역전사 및 라이게이션 반응은 스타터를 다음 하이브리드화된 heterodimers로 확장시키고, 새로 합성된 cDNA 삽입물을 stopper에 연결시킨다. 두 번째 가닥 합성은 자성비드로부터 라이브러리를 분리시키는 것으로 수행되고, 이후 라이브러리를 증폭시킨다. 바코드는 라이브러리가 증폭되었을 때 도입된다. high-throughput sequencing은 HiSeq 2000 instrument(Illumina, Inc., USA)를 사용하여 paired-end 100 sequencing으로 수행되었다. mRNA-Seq 판독은 TopHat 소프트웨어 도구를 사용하여 매핑되어 정렬된 목록을 얻었다. BIOCONDUCTOR 버전 3.0(Gentleman et al., 2004)을 사용하여 R 버전 3.2.2(R development Core Team, 2011)에서 Edge R을 사용하여 고유 및 다중 정렬의 계수를 기반으로, 차별적으로 발현된 유전자를 확인하였다. 정렬된 목록은 조립된 전사물을 위해 사용되거나, 전사물의 정도(abundances)를 추정하고, cufflink를 사용하여 유전자 또는 isoform의 차별적인 발현을 검출하는데 사용하였다. 우리는 유전자 부위의 발현 수준을 결정하기 위해 FPKM(백만 단편(fragment) 당 엑손의 kilo base 당 단편) 방법을 사용하였다. 샘플 간의 비교를 위해 전역 정규화 방법(global normalization method)을 사용하였다. 유전자 분류는 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)을 기반으로 하였다.
7) 겔 지연 분석(gel retardation assay).
세포 침투성 펩타이드와 siRNA 복합체를 형성하기 위한 최적 조건을 결정하기 위하여, 1.5 ㎍ Chi311 siRNA(Bioneer)과 dNP-2-HA 펩타이드(Genscript)를 1:1, 1:10, 1:25의 N/P 비율(ratio)(dNP-HA2 펩타이드의 질소원자(N) 대 핵산 골격 포스페이트(P) 간의 비)로 혼합하여, 어두운 곳, 실온 조건에서 30 분 동안 배양하여 복합체를 제조하였다. 배양 후, 상기 복합체를 DNA loading dye와 혼합하고 2% agarose gel에서 20 분 동안 겔 전기 영동을 수행 하였다.
8) 흑색종 폐암 전이 동물모델(Pulmonary melanoma metastasis model).
C57BL6 / J 마우스 흑색종으로부터 확립된 마우스 흑색종 세포주(B16F10)는 하상준(연세대학교)으로부터 제공받아 사용하였다. 완전한 DMEM 배지에서 90 % 컨플루언스까지 배양한 후, 세포를 얻어, 예열된 PBS 버퍼액을 사용하여 106 세포/㎖ 농도가 되도록 용액을 제조하고, 이를 이용하여, 꼬리 정맥을 통해 마우스에 5 x 105 세포를 주입하였다.
세포를 주입하고 14 일이 지난 후, 마우스를 희생시키고, 폐 표면에 흑색 점으로 가시화된 흑색종 콜로니의 수를 세었다. 조직학적 분석(histological analysis)을 수행하기 위해, 파라핀 폐 조직 블록에 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)을 사용하여 탈파라핀화하고, 염색하였다. 폐 조직의 종양 크기는 Image J software 1.48v로 측정하였다. 다른 폐엽(lung lobes)은 기계적으로 잘게 썬 다음, 이를 Collagenase D(1 ㎎/㎖, Roche)와 Ca2+ 및 Mg2+를 포함하는 DPBS로 37 ℃에서 30 분간 배양하였다. Enzymatic digestions 반응은 0.5M EDTA용액으로 중단시켰다. 소화된 세포를 40-μm 세포 여과기로 여과하고, 적혈구(RBC)를 Ack 완충액으로 용해시켰다. 폐 림프구 세포를 Percoll 구배로 농축하고, 전체 세포를 유세포 분석법 및 정량적 실시간 PCR에 사용하였다.
9) 인비트로 상에서( in vitro ), 세포독성 분석
100 ㎕ 배지에 B16F10 흑색종 세포를 96-웰 플레이트에 seeding 하였다. 활성화된 WT 및 Chi311 KO NK 및 CD8 T 세포를 상이한 밀도로 B16F10 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다. 8 시간(NK 세포의 경우) 또는 24 시간(CD8 T 세포의 경우) 후에, 웰 플레이트를 PBS로 세척하고, CCK-8를 포함하는 배지를 첨가하여 생존하는 B16F10 흑색종 세포를 계수하였다. CTL 활성의 백분율은 양성 대조군의 OD 값에 비례하게 나타내었다.
10) 인비트로 상에서( in vitro ), siRNA 형질주입.
HEK293T 세포에서 Chi311을 발현시키기 위해, Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 클로닝된 Chi3l1 과발현 벡터로 세포를 형질주입하였다. 일부 실험에서, EGFP 또는 Chi311 siRNA가 첨가되었다. 형질주입은 제조사의 프로토콜을 따라 수행하였다. dNP-2-siChi3l1은 독립적으로 첨가하였고, 배지는 6 시간 후에 교환하였다. 형질주입된 세포는 2 일 동안 배양하였고, 배양액과 세포를 각각 수확하였다. 배양액에서 Chi311의 수준은 ELISA(R&D)를 사용하여 결정하였고, 형질주입된 세포에서의 Chi311 mRNA는 실시간 PCR를 통해 정량화하였다.
11) 인 비보 상에서( in vivo ), siRNA 형질주입.
2.5 ㎍의 Chi3l1 siRNA(Bioneer) 또는 EGFP siRNA(Bioneer)를 70 ㎍ dNP-2-HA2 펩타이드와 함께 30 분 동안 어두운 곳, 상온 조건 하에서 배양 하였다. 펩타이드-siRNA 복합체를 마우스의 비강으로 투여하였고, 24 시간마다 3 일 동안 희생시켰다. 폐 조직은 단백질 용해물을 얻기 위해 T-PER 조직 단백질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific)이나 RNA 추출물을 얻기 위해 TRIzol을 처리하여 파괴하였다. 폐에서 Chi311 단백질은 Chi311 ELISA kit(R & D Systems)로 측정하였다. dNP2-siRNA 복합체를 처리한 WT 폐암 전이 모델에서, 펩타이드-siRNA 복합체를 B16F10 흑색종을 주입한 흑색종 폐암 전이모델에 비강을 통해 2 일마다 투여하였다. 흑색종 세포를 주입하고 14 일 후, 마우스를 희생시키고 분석하였다.
12) 통계 분석
모든 실험은 Prism 5 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 student t-test (two-tailed)에 의해 통계적으로 분석하였다. 이때, P 수치가 < 0.05인 것은 통계적으로 유의하다고 간주한다.
본 발명에서 별도의 언급이 없는 한, 당업계의 통상의 규정에 따라 표기하였으며, 예를 들어, CD4+은 CD4 T 세포, CD8+은 세포독성 T 세포, NK+CD4-CD8-는 자연살해 세포, NK-CD4-CD8-은 그 외의 면역 세포군을 의미한다.
< 제조예 1> dNP2 - HA2 펩타이드 및 Chi3l1 siRNA 의 합성
서열번호 1의 Chi3l1 siRNA 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 dNP2-HA2 펩타이드를 합성하였다.
이때, 서열번호 1의 서열로 표시되는 Chi3l1의 siRNA(이하, 'siChi3l1'라고도 함), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드(이하 'dNP2'라고도 함)로 표기하였다.
각각의 서열을 설계한 후, 서열번호 1의 서열로 표시되는 Chi3l1 siRNA는 바이오니아에서, 서열번호 2의 서열로 표시되는 dNP2-HA2 펩타이드는 Genscript에 의뢰하여 합성 제작한 것을 사용하였다.
서열번호 1
CAGGAGUUUAAUCUCUUGCAA
서열번호 2.
KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRKGLFGAIAGFIENGWEGMIDG
<실시예 1> dNP2-siChi3l1 복합체의 제조.
제조예 1에서 제조된 서열번호 1의 siChi3l1과 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 dNP2-HA 펩타이드를 융합하기 위하여, 2 ug의 siChi3l1과 70 ug의 dNP2-HA2 펩타이드를 상온, 암 조건 하에서 30분 동안 반응시켜 제조하였다.
< 비교예 1> dNP2 - siEGFP 의 합성 및 분리정제
제조예 1로부터 제조된 서열번호 2의 세포 투과성 펩타이드를 녹색 형광 단백질(EGFP)에 대한 siRNA와 융합하기 위한 전반적인 과정은 siRNA 대신 EGFP siRNA를 사용한다는 것을 제외하고는 실시예 1과 모두 동일하게 수행하였다. 상기 EGFP siRNA는 바이오니아에서 판매되는 AccuTargetTM Positive Control siRNAs 를 사용하였다.
< 실험예 1> T 세포 활성화 및 증식에서의 Chi3l1 의 역할
도 2는 비장 면역 세포 증식에 있어서, 키티나제(chitinase)와 Chi3l1 유전자, Chi3l3(Ym-1) 유전자, chitotriosidase와 AMCase의 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
비장 면역 세포는 마커를 통해 FACS로 분류하여 그래프에 표기하였고, 분류를 위해 사용한 마커는 다음과 같다. CD11c+MHCII+: DC; CD11c-CD11b+: 대식세포(macrophage); CD8+CD4-CD62L+CD44-: 미성숙 CD8 T 세포; CD4+CD8-CD62L+CD44-: 미성숙 CD4 T 세포; CD19+: B 세포; 및 CD3-NK1.1+: NK 세포를 사용하였다. RNA는 면역 세포 집단으로부터 6 개를 추출하여 측정하였고, cDNA는 100 ng 총 RNA로부터 합성되었다. 타겟의 수준을 RT-PCR (n = 4)을 통해 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 비장 대식세포, DC, T 세포, B 세포 및 NK 세포에서 Chi3l1, Chi3l3(Ym-1), chitotriosidase 및 AMCase mRNA 수준을 비교분석한 결과, 비장의 대식세포에서 키티나제와 Chi3l3(Ym-1) 유전자가 현저히 발현되고 있음을 확인하였다. CD4, CD8 T 세포, B 세포, NK 세포에서 Chi3l1의 유전자 발현이 가장 높음을 확인하였다.
도 3은 미성숙된 CD4 T 세포와 활성화된 CD4 T 세포에서 Chitinase-like protein(Chi3l1, Ym-1)과 Chitinase(Chitotriosidase, AMCase)의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 4는 미성숙된 CD8 T 세포와 활성화된 CD8 T 세포에서 Chitinase-like protein(Chi3l1, Ym-1)과 Chitinase(Chitotriosidase, AMCase)의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3, 4에 나타난 바와 같이, 비활성화된 세포(NA)에서 Chi3l1 발현은 상대적인 결과가 확인되었다. Chi3l1은 항-CD3 및 CD28 항체에서 강하게 유도되는 것을 확인하였다. 이를 통해 T 세포 활성화 과정에서 Chi3l1가 중요한 역할을 수행하고 있음을 알 수 있다.
도 5는 일차 및 이차 림프관에 존재하는 WT(야생형) 마우스와 Chi3l1 KO 마우스의 면역 세포의 증식을 분석하여 비교한 결과이다. 구체적으로 도 5a는 흉선에서 CD4+CD8+ 세포, CD4+ 세포, CD8+ 세포의 퍼센트를 유세포 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 5b 및 도 5c는 비장에서 수상 세포(CD11c+ MHCII+) 및 대식 세포(CD11b+)의 퍼센트를 유세포 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 5d 내지 도 5f는 비장, 말초 (鼠蹊) 림프절, 장간막 림프절에서의 면역 세포를 유세포 분석법으로 분석하여 나타낸 그래프이며, 도 5g는 CD4 T 세포에서의 Foxp3 발현을 유세포 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 상기 데이터들은 적어도 5 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, WT(야생형) 마우스와 Chi3l1 KO 마우스 사이의 면역 세포 발달에는 유의한 차이가 확인되지 않았다.
도 6a는 MACS로 분류된 WT(야생형) 및 Chi311 KO의 미성숙(naive) CD4 T 세포에서, IFNγ 및 IL-4 발현을 유세포 분석법으로 측정하여 나타낸 도면이고, 도 6b는 도 6a의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이때, WT(야생형) 및 Chi311 KO의 미성숙(naive) CD4 T 세포는 3 일 동안 TcR 자극에 의해 활성화된 것이다. 도 6c는 WT(야생형) 및 Chi311 KO 마우스의 비장 세포를 TcR로 자극한 후, 이의 배양 상등액을 ELISA로 측정하여 발현된 IFNγ, IL-2, IL-4 및 IL-17 사이토카인을 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.d는 감지되지 않은 것이고, ns는 유의하지 않은 것을 나타낸다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 6은 Chi3l1이 T 세포 활성화의 음성 조절 인자인지 여부를 조사하기 위한 것으로, 야생형(WT) 마우스와 Chi310 KO 마우스의 비장 세포로부터 MACS로 정제된 미성숙 CD4 T 세포와 FACS로 정제된 CD8 T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 3 일 동안 활성화시켰다. Cytokine flow cytometric analysis와 ELISA assay를 통해 CD4 T 세포에서 Chi311의 결핍은, IFNγ와 IL-2 생산을 유의하게 증가시켰고, IL-4 생산은 감소시켰으며, IL-17의 생산에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
도 7a는 CD3 및 CD28 항체 자극으로 활성화된 WT(야생형) 미성숙 CD8 T 세포 및 Chi311 KO naive CD8 T 세포에서 IL-2 사이토카인과 IFNγ 발현을 분석하여 나타낸 도면이고, 도 7b는 WT(야생형) 미성숙 CD8 T 세포 및 Chi311 KO naive CD8 T 세포에서 IFNγ의 발현 정도를 나타낸 그래프이고, 도 7c는 도 7a의 배양 상등액에서 IFNγ와 TNFα를 측정한 ELISA 결과 그래프이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.d는 감지되지 않은 것이고, ns는 유의하지 않은 것을 나타낸다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 7에 나타난 바와 같이, Chi3I1 KO CD8 T 세포는 IFNγ(도 7a)와 TNFα(도 7c)의 발현이 증가되었음을 확인하였고, 이를 통해 Chi311이 T 세포 활성화에 관련이 있음을 예상할 수 있다. 구체적으로 Chi3l1은 IFNγ, TNFα, IL-2를 부정적으로 조절하지만, IL-4 나 IL-17은 부정적으로 조절하지 않는 다는 것을 확인하였다. IL-2 및 IFNγ는 T 세포 증식에 중요한 사이토카인이기 때문에, 야생형과 비교하여 Chi311 KO T 세포의 증식 특성을 확인하고자 하였다.
도 8a는 비활성화 조건(upper)과 항-CD3과 CD28 자극 조건(lower)으로 3일 후에, CFSE 분석을 통해, 분할된 WT(야생형) CD4 T 세포와 Chi311 KO CD4 T 세포의 함량을 분석하여 나타낸 도면이다. 도 8b는 도 8a의 결과로부터 분할된 세포와 비분할된 세포의 퍼센트를 나타낸 그래프이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.d는 감지되지 않은 것이고, ns는 유의하지 않은 것을 나타낸다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 8에 나타난 바와 같이, CFSE로 표지된 Chi311 KO CD4 T 세포는 대조군인 야생형 CD4 T 세포와 비교하여 TcR 자극에 반응하여 분열된 세포의 비율이 더 높은 것을 확인하였다.
도 9a는 WT(야생형) CD4 T 세포;와 Chi311 KO naive CD4 T 세포;와 항-CD3 및 항-CD28으로 자극된 WT(야생형) CD4 T 세포;와 항-CD3 및 항-CD28으로 자극된 Chi311 KO naive CD4 T 세포;의 웨스턴블롯 결과를 도시한 도면이다. 도 9b는 도 9a를 β-액틴으로 정규화하고, 이에 대한 각 표적 분자들의 상대적 농도 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.d는 감지되지 않은 것이고, ns는 유의하지 않은 것을 나타낸다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 9에 나타난 바와 같이, Akt, Erk, STAT1, 및 STAT5의 인산화는 Chi311 KO T 세포에서 증가되었으며, 이를 통해 Chi311이 T 세포 증식을 조절하는 중요한 인자임을 알 수 있다.
앞선 결과들을 종합하면 Chi311은 T 세포에서 발현되고 T 세포 활성화 및 증식을 조절한다는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 2> Chi3l1 의 Th1 분화 억제
도 10은 Chi3I1 KO CD4 T 세포는 민감한 IFNγ 반응을 통해 Th1와 Th2로의 분화 양상을 분석하기 위한 결과이다.
구체적으로 도 10a는 특정 cytokine-skewing 조건하에서 WT(야생형) naive CD4 T 세포와 Chi311 KO naive CD4 T 세포의 Th1, Th2 및 Th17 세포로 분화되는 양상을 측정하여 나타낸 도면이다. 혈청-특이적 사이토카인 발현을 분석하기 위하여 세포 내 사이토카인 염색을 수행하였다. 도 10b는 도 10a의 결과 중에서 부분 집합에 해당하는 사이토카인의 퍼센트를 분석하여 나타낸 그래프이다. 다만 맨 상단에 위치한 그래프는 Th1 세포에 대한 것이고, 중간에 위치한 그래프는 Th2 세포에 대한 것이며, 맨 하단에 위치한 그래프는 Th17에 대한 그래프이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
앞선 실험을 통해 Chi311의 결핍은 IL-2와 IFNγ의 증가를 유도하나, IL-4의 감소를 초래한다는 것을 확인하였기 때문에, Th1과 Th2의 effector T 세포 분화를 조절할 것이라고 예상하였다. 실제 Chi311이 Th1과 Th2 분화를 조절 하는지를 확인하고자 MACS 분류된 CD4+CD62LhighCD44low 야생형 naive CD4 T 세포와 CD4+CD62LhighCD44low Chi311 KO naive CD4 T 세포를 다양한 분화 조건으로 배양할 경우, Th1, 2 및 Th17 세포로 분화하는지 양상을 분석하였다.
도 10a, b에 나타난 바와 같이 Chi3l1은 IFNγ 세포의 비율은 Th1뿐만 아니라 Th2 및 Th17 조건에서도 유의하게 증가하는 반면, Th2에서 IL-4는 감소하였고 Th17에는 차이가 없음을 확인하였다.
도 10c는 도 10a의 배양상등액에서 IFNγ, TNFα, IL-4 및 IL-17을 ELISA로 분석하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 10c에 나타난 바와 같이 배양상등액에 축적된 사이토카인은 도 10a, b와 동등한 양상을 갖고 있는 것을 확인되었다.
도 10d는 도 10a에서 분화된 T 세포의 사이토카인과 전사인자들의 RNA 발현 수준을 정량화 실시간 PCR을 통해 분석한 그래프이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 10d에 나타난 바와 같이 Th1 분화의 중요한 전사인자인 T-bet, Runx3 및 Eomes는 Chi311 결핍 Th1 세포에서 IFNγ 및 GM-CSF와 함께 증가되었음을 확인할 수 있다. 한편 IL-4 관련 Th2 분화에 중요한 인자인 JunB는 유의하게 감소하였고, Th17 관련 인자들은 차이가 관찰되지 않았다.
도 10e는 야생형 Th1, Th2 세포와 Chi3l1 KO Th1, Th2 세포에서 STAT 인산화를 웨스턴블롯으로 측정하여 나타낸 도면(좌측)과 웨스턴블롯에 대한 상대적인 농도 분석으로 정량화한 총 STAT 그래프(우측)이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 10e에 나타난 바와 같이 Chi311이 결핍된 Th1 세포에서는 인산화 된 STAT1의 수준이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 인산화된 STAT4의 수준에는 차이가 없었다. 이를 통해 Chi311이 IL-12가 아닌 IFNγ 신호를 조절한다는 것을 알 수 있다.
도 10f는 야생형 naive CD4 T 세포와 Chi3l1 KO naive CD4 T 세포는 표시된 농도의 IFNγ 중화 항체로 Th1 세포로 분화시키고, 3일이 지난 후, 세포를 수확하고, 세포 내 염색을 통해 IFNγ과 IL-4 발현을 측정하여 나타낸 도면이다. 도 10g는 IFNγ 중화 항체가 없는 야생형 Th1 세포에서 IFNγ 발현에 대한 IFNγ 발현의 퍼센트를 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않음을 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01.
도 10f, g에 나타난 바와 같이 IFNγ 중화 항체를 Th1 배지에 첨가하여 IFNγ 생성을 평가한 결과, IFNγ 생성 세포의 비율은 IFNγ 중화 항체가없는 Chi311 KO Th1 세포에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 야생형 Th1 세포와 Chi311 KO Th1 세포에서는 IFNγ 생산이 항체의 용량이 증가함에 따라 저하되는 것을 확인하였다.
< 실험예 3> 미성숙 CD4 T 세포에서 IFN γ에 대한 STAT1 의 인산화 분석
앞선 실험들을 통해 Th2 세포에서 STAT6의 인산화가 유의하게 감소하여, Chi311이 Th2와 유사한 T 세포를 만들기 위해 IFNγ 신호를 부정적으로 조절할 수 있음을 확인할 수 있다. 이러한 IFNγ 의존성을 확인하고자, 재조합 IFNγ를 야생형 미성숙 CD4 T 세포와 Chi311 KO 미성숙 CD4 T 세포에 처리하고 pSTAT1 수준을 분석하였다.
도 11a는 FACS로 정제한 야생형 미성숙 CD4 T 세포와 Chi3l1 미성숙 CD4 T 세포를 20 ng/㎖ IFNγ로 처리한 후, 사이토카인 처리한 세포로 적정한 시간동안(0, 5, 10, 20 min) 용해하고, BCA 측정법으로 단백질을 정량화한 다음, pSTAT1의 수준을 웨스턴블롯으로 측정하여 나타낸 도면이다.
도 11b는 도 11a에서의 β-actin에 대한 pSTAT1의 상대적인 세기를 바 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 총 두 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. ** p <0.01.
도 11에 나타난 바와 같이, Chi311 KO T 세포는 야생형 T 세포와 비교하여, pSTAT1가 증가된 것을 확인할 수 있다.
도 12a는 야생형 미성숙 CD8 T 세포와 Chi3l1 미성숙 CD8 T 세포를 FACS Aria ΙΙΙ로 분류하고, IFNγ neutralizing 항체의 정해진 농도(0, 5, 20 ㎍/㎖)와 함께 플레이트에 결합한 항-CD3, CD28, Il-2로 활성화하였다. 이를 ICS에 따른 유세포 분석법을 통해 IFNγ과 Granzyme B 발현을 측정하여 나타낸 도면이다.
도 12b, c는 도 12a에서의 IFNγ(b)과 Granzyme B(c) 의 상대적인 %를 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. * p<0.05. *** p <0.001.
도 12에 나타난 바와 같이, 야생형 KO Th1 세포와 Chi311 KO Th1 세포에서 20 ㎍/㎖ neutralizing 항체를 처리하였을 때, IFNγ 생성은 동일했다. 이는 증가한 IFNγ 생산이 IFNγ 신호에 의존한다는 것을 의미한다. CD8 T 세포에서의 IFNγ 의존성을 확인할 수 있었다.
또한 IFNγ와 Granzyme B 생성이 활성화된 Chi311 KO CD8 T 세포는 IFNγ neutralizing 항체 처리를 통해 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 그리고 20 ㎍/㎖ IFNγ neutralizing 항체에서 야생형 T 세포가 동등한 양(equivalent)임을 알 수 있다.
상기 결과를 종합하면, Chl3l1이 IFNγ-매개 STAT1 인산화를 저해를 통해, Th1 분화를 음성적으로 조절할 수 있음을 확인할 수 있다.
< 실험예 4> Chi311 의 Th1 관련 및 종양 유전자 발현을 억제 효과
도 13a는 미성숙 세포(naive), Th1-skewed 야생형 CD4 T 세포, Chi3l1 KO CD4 T 세포에서 100-bp RNA 염기서열을 비교한 것으로, 야생형 Th1 세포(WT-Th1)와 Chi3l1 KO Th1 세포(KO-Th1)에서 상향조절된 유전자를 정향화하고, 야생형 Th1 세포와 관련된 Chi3l1 KO Th1 세포에서 증가한 유전자와 비교하여, 흥미로운 유전자들을 선별하여 나타낸 다이아그램이다.
도 13b는 상향 조절(적색) 또는 하향 조절(청색)과 관련된 흥미로운 유전자들의 heatmap 분석 결과이다. 도 13c는 야생형 Th1 세포와 관련된 Chi3l1 KO Th1에서, 최소 두 배의 하향, 상향 조절효과를 갖는 RNA-시퀀싱 데이터에 대한 산포도(scatterplot)이다.
도 13d는 도 13c에서 IFNγ 작용기작과 세포독성과 관련된 유전자의 발현을 정량화 실시간 PCR으로 분석한 결과 그래프이다. 도 13e는 야생형 CD8 T 세포와 Chi3l1 KO CD8 T 세포를 활성화시키고, 이들의 흥미로운 유전자를 정량화 실시간 PCR로 분석한 결과 그래프이다. 각 그래프 상단에 분석 대상 유전자를 표기하였다(일예로 SOCS1, SOCS3 ... CCR5, T-bet 등). 데이터는 총 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차이다. n.s는 유의하지 않다는 것을 의미한다. ** p<0.01. *** p <0.001.
Chi311이 IFNγ 매개 신호 전달 경로를 조절하는 방법을 확인하고자, 야생형 미성숙 CD4 T 세포와 Chi311 KO 미성숙 CD4 T 세포 및 이로부터 분화된 Th1 세포로부터 RNA를 분리하였다. 야생형 세포(WT), 및 Chi311 KO 세포, 이들의 미성숙 세포(naive) 및 이들로부터 분화된 Th1 세포의 전 사체(transcriptome)에 대한 RNA 염기 서열을 분석하였다.
야생형 Th1 세포와 Chi3l1 KO Th1 세포 사이의 유전자 발현 차이를 확인하기 위하여, 미성숙 T 세포와 비교하여 Th1 세포에서의 가장 발현량이 높은 유전자를 분류하였다. Chi3l1 KO Th1 세포에서 야생형 Th1 세포와 다르게 발현되는 유전자를 분류한 것이다(도 13a). 이를 통해 야생형 Th1 세포와 비교하여 Chi3l1 KO Th1 세포에서 31 개의 상향 조절 유전자와 72 개의 하향 조절 유전자를 확인하였다.
도 13b를 통해, Chi3l1 KO Th1 세포에서 IFNγ 조절유전자인 twist1, socs1이 감소하고, ifng, ctse, cxcr2, tnfsf10(TRAIL로 알려짐) 유전자는 증가한 것을 확인하였다. 도 13c를 통해 도 13b의 패턴을 요약하여 나타내었다.
도 13d를 통해, 야생형 Th1 세포와 Chi3l1 KO Th1 세포의 정량적 실시간 PCR 분석을 수행하여, RNA 시퀀싱 결과를 확인하였다. 그 결과 STAT1의 인산화를 억제하는 포스파타제인 SOCS1의 발현이 야생형 Th1 세포에 비해 감소한 것을 확인하였고, SOCS3, SOCS5는 큰 차이가 없었다.
도 13e를 통해, Th1 억제 분자인 Twist1dl Chi3l1 KO Th1가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 Chi3l1 KO Th1 세포가 CTSE, TRAIL, IFNγ 및 CXCR2를 어떻게 생성하는지 확인할 수 있었다. 도 13e의 분자발현 양상과 도 13d의 양상은 동일하였다.
즉, 활성화된 Chi3l1 KO CD8 T 세포는 T-bet, IFNγ, Perforin 및 Granzyme B의 발현 수준이 높다는 것을 확인하였다. 이는 Chi3l1 KO CD8 T 세포가 CTL 기능과 관련한 작동 분자의 발현을 유도한다는 것을 알 수 있다. 상술한 실험을 종합하면 Chi3l1은 Th1 관련, CTL 반응을 억제한다는 것을 알 수 있다.
< 실험예 5> 인 비보(in vivo )에서, Chi3l1 효과
Chi3l1 결핍 T 세포에서 작동체(effector) 기능 분자의 증가가, Chi3l1 KO Th1 세포와 CTL이 항종양 면역에 기여하는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해 B16F10 흑색종 폐암 전이모델을 이용하였다. 흑색종 폐암 전이 모델은 앞선 실험방법 8)을 사용하였으며, 분석방법 또한 실험방법을 참고하였다.
도 14a는 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델에 Ⅳ 투여로 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입하고, 2 주 후에 분석한 결과이다. 구체적으로 흑색종 세포가 주입된 야생형 모델과 흑색종 세포가 주입된 Chi3l1 KO 모델로부터 적출된 폐를 촬영한 것으로, 이를 살펴본 결과 14일에 전이성 흑색종 콜로니가 폐 표면에서 관찰되었음을 확인하였고, Chi3l1 KO 모델이 야생형 모델보다 흑색종 전이가 덜 일어났음을 알 수 있다.
도 14b는 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입한 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델의 폐에서의 흉막 콜로니의 상대적 크기와 수를 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 흑색종 폐 전이는 야생형 모델에 비해 Chi3l1 KO 모델에서 유의하게 감소되었음을 알 수 있다.
도 14c는 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입한 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델로부터 적출된 폐 조직을 H&E 염색으로 분석한 결과이다. 두 모델에서 종양 침윤(infiltration)의 상대적 크기를 측정하여 우측 그래프에 나타낸 결과, 야생형 모델에 비해 Chi3l1 KO 모델에서 혈관 주위에 침윤된 종양이 유의하게 감소하였음을 확인하였다.
도 14d-g는 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입한 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델의 폐로부터 Percoll을 통해 폐 림프구 세포를 얻고, 이를 유세포 분석법으로 측정한 결과로, 세포 내 사이토카인 염색을 통해 CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포 및 non-lymphocytic polulation에서 IFNγ, Foxp3, Granzyme B를 측정하여 나타낸 도면 및 그래프이다. 각 그래프에는 해당되는 유전자와 모델을 표기하였다. 도 14 e, g에는 IFNγ+, Foxp3+ 및 Granzyme B+의 MFI의 대표적인 퍼센트를 기재하였다.
도 14d, e에 나타난 바와 같이, IFNγ 생산 CD4 T 세포와 CD8 T 세포의 침투가 증가한 것은, 야생형 모델보다 Chi3l1 KO 모델의 폐에서 유의하게 더 높음을 확인하였다. 이를 통해 Chi3l1이 결핍될 경우 폐에서 CD4 T 세포와 CD8 T 세포가 증가하고, 이로 인해 IFNγ의 생산이 유의하게 증가함을 확인할 수 있다.
또한, 도 14f, g를 살펴보면, 흑색종 세포가 주입된 두 모델에서 NK 세포와 비-림프구 집단의 IFNγ 생성에는 차이가 없음을 확인하였다.
도 14h는 5×105 B16F10 흑색종 세포를 주입한 야생형 모델과 Chi3l1 KO 모델로부터 분리한 폐 림프구 세포에서 분자의 발현을 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 흑색종 세포가 주입된 Chi311 KO 모델에서는 야생형 모델과는 달리 CTSE, TRAL, IFNγ, T-bet, Perforin 및 Granzyme B를 포함하는 항 종양 면역 분자에 대한 mRNA를 증가시키는 반면 Th1 억제 분자 Twist1와 SOCS1가 유의하게 감소하고 있음을 확인하였다.
도 14i는 다양한 E:T 비율 조건 하에서, B16F10 표적 세포에 대한 야생형 CD8 T 세포와 Chi3l1 KO CD8 T 세포의 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 14j는 야생형 CD8 T 세포와 Chi3l1 KO CD8 T 세포와 NK 세포의 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 14i, j에 나타난 바와 같이, CD8 T 세포에서 종양세포를 파괴하는(tumoricidal) 활성이 증가하고 있음을 확인하고자, 미리 활성화시킨 야생형 CD9 T 세포 또는 Chi3l1 KO CD8 T 세포와 B16F10 흑색종(melanoma) 세포를 함께 공-배양(co-culturing)하여 분석하였다. 그 결과 Chi3l1 KO CD8 T 세포에서는 야생형 CD8 T 세포에서보다 더 강력한 종양세포 살해 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
이에 반해 야생형 NK 세포와 Chi3l1 KO NK 세포는 세포 독성 측면에서 크게 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 이를 종합하면 본 발명에서의 Chi3l1은 Th1과 CTL 반응의 음성 조절자임을 알 수 있다.
<실험예 6> dNP2 펩타이드와 siChi3l1을 이용한 치료용 siRNA 복합체의 Th1, CTL 조절 효과
본 발명에서 면역 조절 단백질을 T 세포로 전달하기 위하여, 새로운 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide;CPP), dNP2와 siChi3l1와 융합한 복합체를 제안하고, 이러한 복합체가 효과적으로 암의 폐 전이를 억제하는 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다.
dNP2 펩타이드(서열번호 2)와 Chi3l1의 활성을 억제하는 siRNA인 siChi3l1(서열번호 1)를 융합한 복합체를 이용해, 항 종양 면역을 유도할 수 있다는 새로운 전략을 구상하였다.
상기 복합체는 구체적으로 HA2를 포함하는 dNP2 펩타이드를 합성한 후, siChi3l1와 상기 dNP2-HA2 펩타이드를 1:1, 1:10, 1:25 비율로 혼합 및 융합하여 각각의 복합체(순서대로 dNP2-siChi3l1 1:1, 1:10, 1:25 표기함)를 제조하였다. 도 15a는 dNP2-HA2 펩타이드와 Chi3l1 siRNA가 융합하여 형성된 dNP2-siChi3l1 복합체의 구조를 도시한 도면이다.
이하에서, 상기 dNP2-siChi3l1 복합체 세포 내 전달을 확인하고, 이로 인한 암의 폐 전이 억제 활성을 분석하고자 하였다. 이를 위해 생체 내(in vivo) 실험을 통해 Chi3l1을 효과적으로 감소시키는지를 분석하고, 생체 외(in vitro) 실험을 통해 Th1 분화와 CD8 T 세포 분화를 향상시키는지를 분석하였다.
도 15b는 N/P 비율에 따른 dNP2-siChi3l1 복합체의 아가로스 겔 지연(retardation) 분석 결과로, dNP2-HA2 펩타이드와 siChi3l1가 10:1로 혼합되어 융합된 dNP2-siChi3l1 복합체일 때, dNP2-HA2 펩타이드는 성공적으로 siChi3l1과 비공유 상호작용(noncovalent interaction)을 통해 결합되는 것을 알 수 있다.
도 15c는 HEK293T 세포에 Lipofectamine에 의해 Chi3l1 siRNA를 처리한 경우(Lipo-siChi3l1), dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 경우(dNP2-siChi3l1), 상기 HEK293 T 세포로부터 Chi3l1 mRNA의 발현정도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 15d는 ELISA를 통해 상기 도 15c로부터 Chi3l1의 상대적인 발현량을 분석한 그래프이다. 이때, 상기 HEK293T 세포는 pDNA를 통해 Chi3l1를 과발현한 것(음성 대조군;pDNA+로 표기)으로 사용하였다. pDNA를 처리하지 않은 HEK293T 세포는 양성 대조군으로 pDNA-로 표기하였다.
dNP2-siChi3l1 복합체의 knockdown 효과를 확인하기 위해, Chi3l1이 과발현되는 HEK293T 세포를 사용하였고, dNP2-siChi3l1 복합체 또는 Lipo-siChi3l1의 knockdown 효과를 Chi3l1 mRNA 발현량(도 15c)와 Chi3l1 단백질 발현수준(도 15d)을 통해 비교한 결과, dNP2-siChi3l1 복합체는 Chi3l1 발현을 유의하게 억제하였고, 억제수준은 양성 대조군과 유사하였다.
도 15e는 흑색종 폐암 전이 동물모델에 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1을 비강을 통해 처리한 후, 폐에서 Chi3l1 mRNA 발현량을 분석하여 나타낸 그래프이다. 0 일째에 발현된 Chi3l1 mRNA를 기준으로 하여, 각 날짜별로 측정된 Chi3l1 mRNA의 상대적인 발현양을 계산하여 표기하였다.
구체적으로 흑색종 폐암 전이 동물모델에 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1 복합체를 비강을 통해 주입하고, 동물모델을 희생시킨 후, 생체 내에서(in vivo) Chi3l1 knockdown 효과를 RT-PCR을 통해 3일 동안 매일 평가하였고, 이를 도 15f, g에 나타내었다. 이에 따르면 70 ㎍ dNP2-HA2 펩타이드와 2.5 ㎍ siChi3l1(N/P 비율 1:25)를 혼합하여 제조된 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 경우, 1일째에 폐로부터 Chi3l1 mRNA 발현이 현저히 감소하였음을 확인하였다. 또한 2일째의 폐에서 Chi3l1 발현이 최대로 감소하였고, 3일째부터 Chi3l1 발현이 복원되기 시작함을 확인하였다.
도 15f는 흑색종 폐암 전이 동물모델에 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1을 비강을 통해 처리한 후, 폐에서 Chi3l1 단백질 발현수준을 웨스턴 블롯으로 분석 결과이다. 도 15g는 도 15f의 결과에 대한 밀도 분석(densitometric analysis)으로, β-actin 대비 Chi3l1 단백질 발현수준을 계산하여 나타낸 그래프이다. Chi3l1 밴드강도를 β-actin 밴드 강도에 대해 정량화하였다.
도 15f, g에 나타난 바와 같이 Chi3l1의 발현 수준이 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 후부터 2일째까지 현저히 감소하였고, 3일째에는 Chi3l1 발현수준이 복원되기 시작함을 확인하였다.
다음으로 Th1 분화에 dNP2-siChi3l1의 기능을 확인하고자 하였다. 도 15h는 다양한 농도(100 ng, 250 ng)의 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1를 야생형 naive CD4 T 세포에 처리하고, 5일 동안 배양한 후, Th1 세포로의 분화여부를 측정하여 나타낸 그래프(좌)와, 각각의 경우에서 IFNγ 및 TNFα 발현정도를 유세포 분석으로 분석하여 나타낸 그래프(우)이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 15h에 나타난 바와 같이 FACS로 분류된(sorted) 야생형 naive CD4 T 세포에 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리하고 5일이 지난 후, Th1 세포로 분화되었음을 확인하였다. IFNγ-, TNFα- 생성세포를 유세포 분석으로 분석한 결과, 100 ng 내지 250 ng dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 군이 dNP2-siEGFP를 처리한 군에 비해 IFNγ-, TNFα- 생성 세포가 유의하게 증가하였음을 알 수 있다. 이는 Chi3l1을 표적으로 하는 siRNA를 T 세포로 전달함으로써 Th1 분화를 강화시켰음을 의미한다.
도 15i는 다양한 농도(100 ng, 250 ng)의 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1를 항-CD3, 항-CD28 및 IL-2로 활성화된 야생형 naive CD8 T 세포에 처리하고, 3일 동안 배양한 후, CD8 T 세포로의 분화여부를 측정하여 나타낸 그래프(좌)와, 각각의 경우에서 IFNγ 및 TNFα 발현정도를 유세포 분석으로 분석하여 나타낸 그래프(우)이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 15i에 나타난 바와 같이, dNP2-siChi3l1를 처리한 군에서, IFNγ 및 TNFα 생산능을 갖는 활성화된 CD8 T 세포가 더 많이 관찰되었다. 이를 통해 dNP2 펩티드과 siChi3l1의 융합이 성공적으로 이루어져, 복합체를 형성하였고, 상기 복합체를 통해 siChi3l1의 전달이 생체 내, 외에서(in vivo, in vitro) 효과적으로 이루어졌으며, 폐의 Chi311 유전자를 넉다운시키고, Th1 및 CTL 기능을 향상시킴을 확인하였다.
따라서, dNP2-siChi3l1 복합체도 siChi3l1을 단독으로 사용했을 때와 같이 Chi3l1 유전자의 발현을 억제하여 Th1 및 CTL 기능을 향상시킴으로써, 암이 폐로 전이되지 않도록 예방하거나 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
다만 dNP2-siChi3l1 복합체는 siChi3l1을 단독으로 사용하는 경우와 달리 비강 경로를 통해 siChi3l1을 폐 조직내로 주입 및 발현할 수 있고, 이를 통해 효과적으로 암의 전이를 예방 혹은 억제 효과가 소량으로도 현저하다. 즉, dNP2-siChi3l1 복합체를 사용하는 경우, siChi3l1을 단독으로 사용하는 경우와 달리 직접적으로 비강을 통해 siRNA를 투여하여, 암의 전이를 예방 또는 억제하는 효과를 달성할 수 있다는 점에서 현저한 효과와 장점을 갖고 있다 할 것이다.
< 실험예 7> dNP2 - Chi3l1 복합체의 비강 내 투여를 통한, 암의 폐 전이 억제 효과
본 발명은 흑색종 폐전이의 조절에 있어서, 생체 내에서(in vivo) dNP2-siChi3l1 효율을 조사하고자 하였다.
우선 5 x 105 B16F10 흑색종 세포를 야생형 마우스에 주입하여 흑색종 폐암 전이 동물모델을 제조하였고, 구체적으로 실험방법 8) 흑색종 폐암 전이 동물모델을 참조한다. 14일이 지난 후, 마우스를 희생시켜, 폐 표면에 암의 전이가 효과적으로 발생하였는지 확인하였다.
다음 2.5 ㎍ siEGFP와 70 ㎍ dNP2-HA 펩타이드를 혼합하여 제조된 복합체를 비강을 통해 투여한 대조군, 2.5 ㎍ siChi3l1와 70 ㎍ dNP2-HA 펩타이드를 혼합하여 제조된 복합체를 비강을 통해 투여한 실험군을 제조하였다. 상기 복합체는 0일에서 12일 동안 매일 하루에 2차례 동일한 양으로 주입하였고, 14일째에 폐전이 여부를 분석하였다.
도 16a는 흑색종 폐 전이 동물모델을 이용한 대조군과 실험군의 제조방법을 개략적으로 도시한 도면이다. 도 16b는 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1를 처리한 흑색종 폐 전이 동물모델로부터 적출한 폐의 사진으로, 이에 따르면 두 그룹 모두에서 폐 표면에 흑색종의 콜로니가 관찰되었고, 구체적으로 dNP2-siEGFP를 처리한 군보다 dNP2-siChi3l1를 처리한 흑색종 폐 전이 동물모델에서 흑색종 콜로니의 생성이 현저히 억제되었음을 알 수 있다.
도 16c는 dNP2-siEGFP 또는 dNP2-siChi3l1를 처리한 흑색종 폐 전이 동물모델의 폐에 형성된 흉막 콜로니(pleural colonies)들의 상대적인 크기와 수를 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 흑색종 전이가 dNP2-siEGFP를 처리한 군보다 dNP2-siChi3l1를 처리한 흑색종 폐 전이 동물모델에서 흑색종 콜로니의 생성이 현저히 억제되었음을 알 수 있다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 16d는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 폐의 부분을 H&E로 염색하고 광학 현미경으로 촬영한 이미지이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 16d에 나타난 바와 같이 폐의 단면 슬라이드를 조직학적 분석을 통해 살펴본 결과, 혈관 주위에 암의 침투가 dNP2-siEGFP를 투여한 대조군에 비해 dNP2-siChi3l1을 투여한 실험군에서 현저히 감소하였음을 확인하였다.
도 16e는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 percoll을 통해 분리한 폐 림프구(lymphocytes)에서 유세포 분석으로 CD4와 CD8 T 세포에서 IFNγ, Granzyme B을 분석한 결과 그래프이다.
도 16e에 나타난 바와 같이, dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군에서 IFNγ-생성 CD4 T 세포와 CD8 T 세포가 증가되었음을 확인할 수 있다.
도 16f는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 분리한 폐 조직에서, 세포 내에 존재하는 사이토카인 염색을 통해 CD4+IFNγ+ 또는 CD8+IFNγ+ 집단에서 T-bet을 분석하여 나타낸 그래프이다. 도 16h, g는 도 16f에서 MFI를 구체적으로 분석하여 나타낸 그래프이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 16f, h 및 도 16g에 나타난 바와 같이 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군의 CD5 T 세포와 CD8 T 세포에서 T-bet과 Granzyme B의 세기가 대조군에 비해 현저히 증가하였음을 확인하였다.
도 16i는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 Percoll을 통해 분리한 폐 림프구 파편에서 표적하는 유전자의 발현을 분석하여 나타낸 그래프이다. 상기 데이터들은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 16i에 나타난 바와 같이 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군은 항종양 면역과 관련된 CTSE, TRAL, IFNγ, T-bet, Perforin 및 Granzyme B 유전자 발현을 증가시키는 것으로 확인되었고, Th1 Twist1 및 SOCS1는 감소키는 것을 확인하였다.이를 종합하면, dNP2-siChi3l1 복합체는 Th1 및 CTL의 항 종양 면역반응을 현저히 향상시키는 예방 또는 치료효과를 갖는 유효성분임을 알 수 있다.
도 17은 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군에서 NK 세포 기능이 영향을 미치지 않음을 확인하기 위한 실험으로, 도 17a는 dNP2-siChi3l1 복합체를 처리한 실험군과 dNP2-siEGFP 복합체를 처리한 대조군으로부터 Percoll로 분리한 폐 림프구에서 NK 세포(NK1.1+CD4-CD8-)와 비 림프구 집단(NK1.1-CD4-CD8-)를 유세포 분석으로 분석한 결과 그래프이다.
도 17b는 도 17a의 실험데이터로부터 각 군에서 IFNγ+ 세포의 퍼센트를 계산하여 나타낸 그래프이고, 도 17c는 도 17a의 실험데이터로부터 각 군에서 Granzyme B의 MFI를 계산하여 나타낸 그래프이다. 상기 데이터들은 적어도 5 회의 독립적인 실험의 평균이며, ± SD로 표기하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 17에 나타난 바와 같이 IFNγ+와 Granzyme B 발현을 갖는 다른 세포 또는 NK 세포에서 유의미한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
< 실험예 8> 투여 경로에 따른 dNP2 - siChi3l1 복합체의 투여를 통한 흑색종의 폐 전이 억제 효과
가. 비강내 투여
C57BL6 / J 마우스 흑색종으로부터 확립된 마우스 흑색종 세포주(B16F10)는 하상준(연세대학교)으로부터 제공받아 사용하였다. 완전한 DMEM 배지에서 90 % 컨플루언스까지 배양한 후, 세포를 얻어, 예열된 PBS 버퍼액을 사용하여 106 세포/㎖ 농도가 되도록 용액을 제조하고, 이를 이용하여, 꼬리 정맥을 통해 마우스에 5 x 105 세포를 주입하였다.
흑색종 세포주를 주사하고 이틀 후(이미 세포의 전이가 끝난 후), 비강으로 2.5 ㎍ dNP2-siChi3l1 복합체(실험군) 또는 2.5 ㎍ dNP2-siEGFP(대조군)를 이틀마다 12일동안 투여한 다음 14일 째 희생시켰다. 이후 상기 동물모델로부터 폐, 비장 및 서혜부 림프절을 적출하여 관찰하였다.
도 18은 실험예 8. 가에서의 실험군과 대조군의 실험 조건을 도시화한 도면이고, 도 19는 실험예 8. 가의 실험군과 대조군에서의 폐 표면에 흑색 점으로 가시화된 흑색종 콜로니의 개수를 계산하여 나타낸 그래프이며, 도 20은 실험예 8의 실험군과 대조군에서 적출한 폐의 사진이다.
상기 도 19, 20에 나타난 바와 같이, dNP2-siChi3l1 복합체를 비강으로 투여할 경우 폐로 전이된 흑색종의 숫자가 2 내지 6배 감소하였음을 알 수 있다.
도 21 및 도 22는 실험예 8. 가에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 폐에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 이 중에서 도 21A, 도 22A는 각각의 면역 세포로부터 암을 억제할 수 있는 싸이토카인 단백질 IFNγ(x 축), TNFα(y 축)가 얼마나 발현되는지 비교한 것으로, 1사분면은 IFNγ와 TNFα를 모두 발현하는 것이고, 2사분면은 TNFα만 발현하는 것, 3사분면은 아무것도 발현하지 않는 것, 4사분면은 IFNγaks 발현하는 것을 나타낸다. 도 21B, 도 22B는 도 21A, 도 22A의 결과를 분석하여 나타낸 그래프이다.
이에 따르며, dNP2-siChi3l1 복합체가 투여된 실험군의 폐에서는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포로부터 TNFα 싸이토카인의 발현이 증가하고 있음을 알 수 있다.
도 23은 실험예 8. 가에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 비장에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 이 중에서 도 23A는 각각의 면역 세포로부터 암을 억제할 수 있는 싸이토카인 단백질 IFNγ(x 축), TNFα(y 축)가 얼마나 발현되는지 비교한 것으로, 1사분면은 IFNγ와 TNFα를 모두 발현하는 것이고, 2사분면은 TNFα만 발현하는 것, 3사분면은 아무것도 발현하지 않는 것, 4사분면은 IFNγaks 발현하는 것을 나타낸다. 도 23B는 도 23A의 결과를 분석하여 나타낸 그래프이다.
이에 따르며, dNP2-siChi3l1 복합체가 투여된 실험군과 dNP2-siEGFP가 투여돈 대조군의 비장에서는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포로부터 유의미한 범위의 싸이토카인 변화가 관찰되지 않았다.
도 24는 실험예 8. 가에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 서혜부 림프절에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 이 중에서 도 24A는 각각의 면역 세포로부터 암을 억제할 수 있는 싸이토카인 단백질 IFNγ(x 축), TNFα(y 축)가 얼마나 발현되는지 비교한 것으로, 1사분면은 IFNγ와 TNFα를 모두 발현하는 것이고, 2사분면은 TNFα만 발현하는 것, 3사분면은 아무것도 발현하지 않는 것, 4사분면은 IFNγaks 발현하는 것을 나타낸다. 도 24B는 도 24A의 결과를 분석하여 나타낸 그래프이다.
이에 따르며, dNP2-siChi3l1 복합체가 투여된 실험군과 dNP2-siEGFP가 투여돈 대조군의 서혜부 림프절에서는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포로부터 유의미한 범위의 싸이토카인 변화가 관찰되지 않았다.
나. 꼬리 정맥을 통한 투여
C57BL6 / J 마우스 흑색종으로부터 확립된 마우스 흑색종 세포주(B16F10)는 하상준(연세대학교)으로부터 제공받아 사용하였다. 완전한 DMEM 배지에서 90 % 컨플루언스까지 배양한 후, 세포를 얻어, 예열된 PBS 버퍼액을 사용하여 106 세포/㎖ 농도가 되도록 용액을 제조하고, 이를 이용하여, 꼬리 정맥을 통해 마우스에 5 x 105 세포를 주입하였다.
흑색종 세포주를 주사하고 이틀 후(이미 세포의 전이가 끝난 후), 꼬리 정맥으로 5 ㎍ dNP2-siChi3l1 복합체(실험군) 또는 5 ㎍ dNP2-siEGFP(대조군)를 이틀마다 12일동안 투여한 다음 14일 째 희생시켰다. 이후 상기 동물모델로부터 폐, 비장 및 서혜부 림프절을 적출하여 관찰하였다. 비강 경로에 비해 2 배의 복합체를 투여하였다.
도 25는 실험예 8. 나에서의 실험군과 대조군의 실험 조건을 도시화한 도면이고, 도 26은 실험예 8. 나의 실험군과 대조군에서의 폐 표면에 흑색 점으로 가시화된 흑색종 콜로니의 개수를 계산하여 나타낸 그래프이며, 도 27은 실험예 8. 나의 실험군과 대조군에서 적출한 폐의 사진이다.
상기 도 26, 27에 나타난 바와 같이, dNP2-siChi3l1 복합체를 비강으로 투여할 경우 폐로 전이된 흑색종의 숫자가 2 내지 4배 감소하였음을 알 수 있다.
도 28은 실험예 8. 나에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 폐에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 이 중에서 좌측의 그래프는 각각의 면역 세포로부터 암을 억제할 수 있는 싸이토카인 단백질 IFNγ(x 축), TNFα(y 축)가 얼마나 발현되는지 비교한 것으로, 1사분면은 IFNγ와 TNFα를 모두 발현하는 것이고, 2사분면은 TNFα만 발현하는 것, 3사분면은 아무것도 발현하지 않는 것, 4사분면은 IFNγaks 발현하는 것을 나타낸다. 우측의 그래프는 좌측 그래프의 결과를 분석하여 나타낸 그래프이다.
이에 따르며, dNP2-siChi3l1 복합체가 투여된 실험군의 폐에서는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포로부터 TNFα 싸이토카인의 발현이 증가하고 있음을 알 수 있다. 그러나 비강 투여인 실험예 8의 가.보다 2배의 농도로 dNP2-Chi3l1 복합체를 투여하였다는 점을 고려한다면, 비강으로 투여하였을 때보다 낮은 치료 및 예방효과를 나타내고 있다할 것이다.
도 29는 실험예 8. 나에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 비장에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 이 중에서 좌측 그래프는 각각의 면역 세포로부터 암을 억제할 수 있는 싸이토카인 단백질 IFNγ(x 축), TNFα(y 축)가 얼마나 발현되는지 비교한 것으로, 1사분면은 IFNγ와 TNFα를 모두 발현하는 것이고, 2사분면은 TNFα만 발현하는 것, 3사분면은 아무것도 발현하지 않는 것, 4사분면은 IFNγaks 발현하는 것을 나타낸다. 우측 그래프는 좌측 그래프의 결과를 분석하여 나타낸 그래프이다.
이에 따르며, dNP2-siChi3l1 복합체가 투여된 실험군과 dNP2-siEGFP가 투여돈 대조군의 비장에서는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포로부터 유의미한 범위의 싸이토카인 변화가 관찰되지 않았다.
도 30은 실험예 8. 나에서의 실험군과 대조군으로부터 적출한 서혜부 림프절에서 면역 세포를 percoll gradient를 통해 분리한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 이 중에서 우측 그래프는 각각의 면역 세포로부터 암을 억제할 수 있는 싸이토카인 단백질 IFNγ(x 축), TNFα(y 축)가 얼마나 발현되는지 비교한 것으로, 1사분면은 IFNγ와 TNFα를 모두 발현하는 것이고, 2사분면은 TNFα만 발현하는 것, 3사분면은 아무것도 발현하지 않는 것, 4사분면은 IFNγaks 발현하는 것을 나타낸다. 우측 그래프는 좌측 그래프의 결과를 분석하여 나타낸 그래프이다.
이에 따르며, dNP2-siChi3l1 복합체가 투여된 실험군과 dNP2-siEGFP가 투여돈 대조군의 서혜부 림프절에서는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포로부터 유의미한 범위의 싸이토카인 변화가 관찰되지 않았다.
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  10. 하기 서열번호 2로 표시되는 세포투과성 펩타이드와 하기 서열번호 1로 표시되는 Chi311 siRNA가 융합된 복합체를 유효성분으로 하고,
    상기 서열번호 2로 표시되는 세포투과성 펩타이드의 질소원자(N) 대 서열번호 1의 Chi311 siRNA의 핵산 골격 포스페이트(P) 간의 비(N:P)가 10-40 : 1인 것을 특징으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 비강 경로를 통해 폐 내에 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 분무액 또는 분말형을 흡입함으로써 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 코 점막 또는 기관지 점막 또는 폐 상피세포 투과활성을 갖는 것을 특징으로 하는 암의 폐 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제10항에 따른 약학 조성물을 개체의 비강 경로를 통해 투여하여, 인간을 제외한 동물의 암의 폐 전이를 예방 또는 치료하는 방법.
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