CN110974842B - 鉴定用于治疗癌症的化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

用于鉴定治疗癌症的化合物的方法。本发明涉及用于在那些能够激活MDA‑5蛋白或增加NOXA蛋白水平并触发自体吞噬的化合物中鉴定用作癌症治疗的治疗剂的候选化合物的方法。其是基于以下事实：dsRNA感应器MDA‑5的激活能够通过自主地和选择性地激活肿瘤细胞的自体吞噬和凋亡两者而不引起天然拮抗剂NOXA、MCL‑1的稳定来破坏癌症细胞。本发明还涉及与运载体诸如聚乙烯亚胺聚阳离子(PEI)复合的具有相同或相似性质的双链RNA诸如聚肌苷酸‑聚胞苷酸(pIC)用于制备治疗癌症的药物的用途。

Description

鉴定用于治疗癌症的化合物的方法
本申请是国际申请号PCT/EP2010/059593，国际申请日2010年7月5日，中国申请号201080030049.1，发明名称为“鉴定用于治疗癌症的化合物的方法”的首次分案申请201510106426.X的再次分案申请。
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域，并且主要集中于鉴定可用于治疗不同类型的癌症，例如：黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌的化合物。
此外，本发明还涵盖通过这样的方法鉴定的化合物，例如化合物BO-110(参见下文)，该化合物能够在所有上文所示类型的癌症中促进彻底的肿瘤细胞死亡。
背景技术
黑素瘤仍然是具有增加的发病率和极差的晚期预后的实体瘤的典型(Jemal等人，2008)。已付出了相当的努力来鉴定黑素瘤化学和免疫抗性的潜在分子决定物。美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于治疗转移性黑素瘤的唯一药剂是烷化剂达卡巴嗪(DTIC)和免疫调节物IL-2(Tawbi和Kirkwood，2007)。然而，转移性黑素瘤的持久和完全响应罕有地使多于5％的患者受益，并且继发毒性可能使严重的。因此，具有转移性黑素瘤的患者目前的平均存活为6到10个月，所以，改进的疗法的开发在这一疾病中是优先的(Jemal等人，2007)。
最初，称为pIC(聚肌苷-聚胞苷酸(polyinosine-polycytydylicacid))的病毒dsRNA合成类似物，一种已用于独立于干扰素(IFN)刺激免疫系统四十多年的化合物(Field等人，1967)，被认为是针对黑素瘤的有希望的治疗剂。遗憾的是，使用裸露pIC的临床研究揭示了其低稳定性、低IFN诱导和不存在对黑素瘤的抗肿瘤效应(Robinson等人，1976)。因此，作为单一剂，pIC被视为黑素瘤的不良药剂。
高通量组织遗传学分析和系统性功能研究已显著提升了我们对黑素瘤起始和进展以及与治疗失败相关的复杂机制的了理解(Fecher等人，2007；Gray-Schopfer等人，2007)。鉴定了BRAF/MAPK；PI3K/AKT、NF-κB或NOTCH信号级联中的一致性缺陷和改变，为理性药物设计提供了令人兴奋的平台(Gray-Schopfer等人，2007)。然而，黑素瘤试验中尚未证明靶向疗法有效(Flaherty，2006)。还评估了线粒体和/或内质网控制的死亡程序，尽管在体内常常是无效的(Hersey和Zhang，2008)。因此，目前的抗癌药物要么无法以生产性方式到达其靶标，要么必须以对正常细胞区室(compartment)造成无法耐受的毒性的剂量方案施用(Tawbi和Kirkwood，2007)。重要的是在治疗过程中可激活补偿机制，选择具有甚至更高化学抗性的细胞群(Lev等人，2004；Shatton等人，2008；Wolter等人，2007)。
事实上，认为黑素瘤具有通过不同途径逃避凋亡的强大能力，这赋予黑素瘤进展、形成转移灶和幸免于不同疗法的治疗的能力(由Ivanov等人，2003综述)。
与旨在从“内部”(即通过激活细胞死亡的内在程序)杀伤肿瘤细胞的标准化学疗法相反，免疫疗法传统上涉及细胞-细胞相互作用的间接级联。在黑素瘤中，大多数努力集中于加强两个区室：抗原呈递细胞和细胞毒性T细胞的水平或功能效力(Wilcox和Markovic，2007)。还测试了针对抑制性免疫调节物(如CTL4)的疫苗以及抗体，尽管在IV期临床试验中遭遇挫折(Kirkwood等人，2008)。最近，进行经由激活Toll样受体(TLR)-3、-4、-7和-9刺激先天免疫系统来支持自然杀伤细胞(NK)、树突细胞(DC)和T细胞对黑素瘤细胞的细胞毒性破坏(Kirkwood等人，2008，和Tormo等人，2007)。然而，多项研究，包括我们自己的研究，已显示细胞通过下调(删减)免疫反应性表面标志物绕过免疫疗法的固有能力。黑素瘤还可对宿主发挥阻遏作用(如抑制抗原呈递细胞的成熟或阻断完全T-细胞激活)(Tormo等人，2006；Ilkovitch和Lopez，2008；Verma等人，2008)。因此，黑素瘤呈现逃避免疫调节物的抗肿瘤活性的遗传能力。
在免疫疗法领域，其增加已作为黑素瘤治疗的潜在阳性因子进行研究的分子之一是MDA-5(黑素瘤分化相关基因5)，它是一种最初被描述为与黑素瘤分化相关的基因的产物(Kang等人，2002)。MDA-5是识别并被长的双链RNA(dsRNA)激活的解旋酶(Yoneyama等人，2005)。其他RNA解旋酶是RIG-I(视黄酸诱导蛋白1，也称为Dsx58)，其识别短dsRNA的裸露3磷酸，和LGP2(也称为Dhx58)，其是dsRNA感应的负调节物。
因为长dsRNA可由病毒在病毒感染中产生，MDA-5充当抵抗病毒病原体的先天免疫的第一线(Akira等人，2006)。此外，MDA-5具有胱天蛋白酶激活募集结构域(CARD)。合在一起，解旋酶和CARD结构域激活NF-κB和参与细胞因子调节的其他转录因子(Kawai等人，2005)。因此，MDA-5的最熟知的功能是免疫刺激。
从治疗角度讲，已知IFN-β和dsRNA均诱导Mda-5基因的转录。因此，已提出dsRNA对IFN诱导的生长抑制中Mda-5表达的增加起作用。此外，已显示(Kang等人，2002)IFN-β对内源MDA-5的诱导是细胞生长抑制的(换言之，停止细胞周期)。因此，为了激活肿瘤细胞死亡，已以高水平异位过表达MDA-5(Kovacsovics等人，2002)。而且，MDA-5异位表达的这一促凋亡活性在具有超活性RAS/MEK/ERK途径的肿瘤细胞中是无效的(Lin等人，2006)，黑素瘤正是这种情况(Chin等人，2006)。因此，本领域中一个待解决的问题是如何用化学治疗剂以肿瘤区室专一性方式激活内源MDA-5(而不在正常细胞中诱导继发毒性)。
美国专利申请US2007/0259372提出通过能够增强MDA-5表达的化合物鉴定IFN-β、IFN-α或IFN-γ的激动剂或拮抗剂。该专利还暗示Mda-5基因表达的诱导物(借助其启动子)可被视为诱导肿瘤细胞终末分化的候选化合物。它还暗示MDA-5通过其CARD结构域在凋亡信号产生中的可能作用。然而，目前为止，尚不知道可触发凋亡的MDA-5靶标是什么，以及如何以对肿瘤细胞可示踪和选择性的方式激活该靶标。此外，由于黑素瘤细胞具有活跃的RAS/MEK/ERK活性途径(其抑制MDA-5)，以及避开凋亡性细胞死亡的显著能力，并不明确MDA-5介导的凋亡信号将是针对黑素瘤的有效治疗机制。因此，根据有关MDA-5调节和功能的先前信息，此蛋白并未显示作为鉴定针对黑素瘤的治疗剂的候选物的程序中的强靶标。
自体吞噬显示作为参与癌症细胞的内源死亡机制的替代策略。
这一过程涉及最终导致胞质溶胶组分被隔离用于随后由溶酶体的降解的事件的复杂级联(Xie和Klionsky，2007)。取决于吞食的机制和递送至自体溶酶体的货物的性质，已描述了自体吞噬的多种机制。在抗癌治疗背景中，大量自体吞噬(macroautophagy)或细胞内的细胞器和蛋白质聚集物的大量降解由于其通过使关键细胞器(如内质网或线粒体)功能障碍或过度剥夺这些关键细胞器来危害细胞生存力的潜能而引起关注(Hoyer-Hansen，2008)。
然而，不了解自体吞噬是如何调节的，并且其治疗潜能是不清楚和不简单的(Hippert等人，2006)。另一方面，大量自体吞噬(下文我们将简单地称其为“自体吞噬”)已显示保护细胞免受大量攻击性胞内和胞外信号包括抗癌药物的显著潜能。通过这一活性，自体吞噬可促进肿瘤发展(Mizushima等人，2008；Kroemer和Levine，2008)。
自相矛盾的是，自体吞噬还与细胞死亡相关(Kromer等人，2009)。因此，过度的或持续的自体吞噬可通过剥夺关键细胞器(即内质网或线粒体)、重接(rewiring)存活信号、下调溶酶体酶、和/或激活依赖胱天蛋白酶的凋亡程序而杀伤细胞(Xie和Klionsky，2007)。
因此，自体吞噬是将加重黑素瘤化学抗性和免疫抗性还是相反改善治疗响应是不清楚的。而且，截至目前在哺乳动物细胞中描述的20多种自体吞噬基因无一在黑素瘤中得到详细表征。因此，自体吞噬在黑素瘤和正常细胞中是否以不同方式调节以为治疗干预提供窗口是未知的。相似的情形适用于攻击性癌症诸如影响胰腺、膀胱、前列腺和脑的那些癌症。
在这种情形下，需要鉴定用于替代那些已审定的治疗剂的并且特别是对于治疗免疫受损的(immunocompromised)患者有效的治疗癌症的治疗剂。还必须鉴定用于开发程序的新的治疗靶标，以用于在能作用于这些靶标的化合物中鉴定用于治疗癌症的候选治疗剂。
因此，本发明为两个问题都提供了解决方案。
发明描述
如上所述，本发明首先集中于鉴定治疗靶标、标志物或参数，这为开发用于鉴定能够治疗癌症的化合物(在那些能够作用于这些治疗靶标、标志物或参数的化合物中)的方法奠定了基础。
可用于鉴定能够治疗癌症的化合物的、本发明中鉴定的标志物之一是家族解旋酶MDA-5的激活水平。这一参数可通过检查造成解旋酶和胱天蛋白酶结构域分开的该蛋白的蛋白水解切割的存在来测定：将成为治疗癌症的治疗剂的候选化合物应该造成所述蛋白水解切割，蛋白水解切割是候选化合物可导致自体吞噬和凋亡机制激活的指示，自体吞噬和凋亡机制激活将会导致癌症细胞死亡。用于此测试的一种可能方法是免疫印迹(蛋白质印迹)细胞培养物蛋白提取物，并测试对应于完整蛋白和对应于解旋酶结构域和胱天蛋白酶结构域的片段的信号条带。具体地，如实施例3中所示，30kD条带的出现指示蛋白水解切割的存在。可选地，它还可测定MDA-5家族的其他解旋酶的激活，诸如RIG-I或LGP2的激活。
也用于鉴定能够治疗癌症的、本发明中鉴定的另一标志物是NOXA表达水平。背后的原理是当激活自体吞噬和凋亡机制时，对应的基因表达水平的增加。可以进行这些蛋白的表达水平的测定，例如，测定对应的信使RNA的浓度(这可通过例如RNA印迹或RT-PCR进行)或对应的细胞培养物的蛋白提取物中蛋白本身的浓度(例如，通过类似蛋白质印迹的转移)。此外，还可通过免疫组织化学(在组织样本中)原位检测NOXA。
在本发明的优选的实施方案中，MDA-5和NOXA均被检查，以证实自体吞噬和凋亡机制被激活，这是由于MDA-5被视为它们之间的连接点。
另外，本发明可包括测定用于抵抗癌症的候选化合物对自体吞噬的诱导的步骤。自体吞噬的诱导可通过几种技术测定，这些技术包含：
·监测自体吞噬基因8(其被称为ATG8或LC3)表达的蛋白的翻译后修饰。当被插入自体吞噬体时，LC3蛋白被加工和脂化，自体吞噬体是在自体吞噬过程中绑架细胞内组分的膜性结构。由于该蛋白的构象和电泳迁移率被脂化改变，验证自体吞噬的诱导的可能技术之一是使用以针对此蛋白的抗体进行的免疫印迹技术。这一技术允许在进行电泳之后，验证对应于该蛋白的条带在对照样品中与其中推测化合物诱导自体吞噬的样品相比是不同的。可选地，如果抗体特异地识别形成的自体吞噬体，则抗体的结合将证实用候选化合物处理的样品中自体吞噬的诱导。
·监测LC3蛋白胞内分布的改变，因为自体吞噬的另一标志是LC3从胞质溶胶易位到新形成的自体吞噬体(Xie和Klionsky，2007)。因此，蛋白灶的形成可被视为指示自体吞噬体的形成，特别是在早期。这可通过在固定的细胞或固定的组织上通过免疫荧光或免疫组织化学监测内源LC3来检测。可选地，自体吞噬可通过测定LC3产生的荧光的细胞内定位而在活细胞中显现。通常用作荧光蛋白GFP(绿色荧光蛋白)或RFP(红色荧光蛋白)，其允许通过荧光显微术示踪自体吞噬：细胞荧光分布从弥散模式到聚焦染色的改变指示自体吞噬的诱导。在本发明中，这一方法涉及使用转染有允许融合蛋白瞬时表达的载体(诸如质粒或重组病毒)的细胞，或其中能够表达报告子蛋白和LC3形成的融合蛋白的DNA区段已以稳定方式整合到基因组中的细胞。这一策略的一个实例显示于下面的实施例1，其中细胞已先用重组反转录病毒转染。这造成含有蛋白GFP和LC3的编码部分在一起的DNA片段，以将导致融合蛋白的方式插入细胞基因组，进入细胞基因组DNA。因此，可以进行稳定转染的细胞的细胞内分布变化的测试。
·使用透射电子显微术检测候选化合物进入细胞。这一情形针对自体吞噬过程中更晚期的自体吞噬体形成。致密结构积累(膜结合的)的显现视为自体吞噬体形成的指示性特征。自体吞噬的过程可在该过程的较晚阶段(即用待测试的化合物处理后24或30小时)证实，此时电子显微镜应显示指示细胞塌陷的大吞噬泡(large phagocytic vacuoles)的形成。
考虑到以上讨论，本发明的第一种实施方案涉及用于鉴定将被用于治疗癌症的化合物的方法(下文称本发明的方法)，该方法包含以下步骤：
a)使候选化合物与癌症细胞培养物或衍生自癌症细胞的癌症细胞系接触；
b)测定以下参数中的至少一种：
i.家族解旋酶MDA-5的激活水平；
ii.NOXA表达水平；
iii.或其组合；
c)将步骤b)中获得的数据与相似处理的相同细胞、但是不存在所述候选化合物的对照中观察到的数据进行比较；
d)选择与所述对照相比产生步骤b)中测定的一个或多个参数的显著增加的化合物。
应注意的是，当分析得到p值＜0.05时，从用候选化合物处理的细胞培养物和未处理的对照获得的数据之间的差异将被视为是统计学显著的。
在优选的实施方案中，本发明的方法还测定候选化合物是否在癌症细胞中、在衍生自癌症细胞的细胞系中、或在癌症模型小鼠中诱导自体吞噬。如以上所解释的，自体吞噬诱导的测定还可通过检查自体吞噬蛋白的表达水平、翻译后修饰的存在或细胞内定位来进行。更具体地，自体吞噬的诱导通过选自以下的技术测定：蛋白LC3电泳迁移率的改变或检测蛋白LC3灶形成。可选地，自体吞噬的诱导通过借助显微镜观察例如使用透射电子显微术检查自体吞噬体的存在来测定。
在进一步优选的实施方案中，以上描述的本发明的方法包含三个步骤：测定MDA-5的激活水平、NOXA的表达水平和自体吞噬的诱导。
本发明的方法可用于鉴定用作治疗几种类型的癌症的治疗剂的化合物，所述癌症例如：黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌。
因此，如果本发明旨在鉴定用作用于治疗黑素瘤的治疗剂的化合物，那么它将包含下列步骤：
a)使候选化合物与黑素瘤细胞培养物、或衍生自黑素瘤细胞的细胞系接触；
b)测定以下参数中的至少一种：
i.家族解旋酶MDA-5的激活水平；
ii.NOXA表达水平；
iii.或其组合；
c)将步骤b)中获得的数据与相似处理的相同细胞、但是不存在所述候选化合物的对照中观察到的数据进行比较；
d)选择与所述对照相比产生步骤b)中测定的一个或多个参数的显著增加的化合物。
至于有效的细胞系，可以使用来自任何黑素瘤细胞系、优选人来源的细胞系。用于本发明实施例的有效的细胞系的实例是人细胞系SK-Mel-19、SK-Mel-28、SK-Mel-103和SK-Mel-147，以及鼠B16细胞。正常细胞对照、黑素细胞或其他皮肤细胞、以及免疫系统的细胞，其通常代表癌症治疗的继发毒性的位点。
可选地，本发明的方法可集中于鉴定用作治疗以下癌症类型中的至少一种癌症的治疗剂的化合物：胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌。在这种情形下，本发明的方法将包含下列步骤：
a)使候选化合物与上述癌症类型的至少一种癌症的癌症细胞培养物，或衍生自上述癌症类型的至少一种癌症的细胞系接触；
b)测定以下参数中的至少一种：
i.家族解旋酶MDA-5的激活水平；
ii.NOXA表达水平；
iii.或其组合。
c)将步骤b)中获得的数据与相似处理的相同细胞、但是不存在所述候选化合物的对照中观察到的数据进行比较；
d)选择与所述对照相比产生步骤b)中测定的一个或多个参数的显著增加的化合物。
在这种情形下，细胞系将选自以下胰腺癌细胞系的组：IMIMPC2、MiaPaCa2、Aspc1、A6L、SKPC1和Panc-1；或选自以下结肠癌细胞系的组：CACO、SW480和SW1222；或选自以下膀胱癌细胞系的组：RT112、MGHU4、639V、253J、MGHu3和SW1170；或选自以下胶质瘤细胞系的组：U87MG、U251和T98G；或选自以下乳腺癌细胞系的组：MDA231、MCF7和T47D；或选自以下前列腺癌细胞系的组：LNCaP、PC3和DU145；或选自以下肺癌细胞系的组：H1299和NCI H460；或选自以下卵巢癌细胞系的组：NCI H23、CHQK1和SK-OV-3。
进行本发明的方法的优选方式在下文本发明的实施例中描述。在这种情形下，本发明的方法通过使用以下的组合进行：MDA-5激活测定、基因表达分析(观察NOXA表达的增加)和通过已提及的三种可能方法证实自体吞噬激活：通过免疫印迹监测LC3蛋白翻译后修饰、通过借助于荧光蛋白GFP的荧光检测示踪LC3的细胞内分布改变(用先前已用含有能够表达融合蛋白GFP-LC3的结构的重组反转录病毒转染的细胞)、通过在用候选化合物处理5小时的电子透射显微术证实自体吞噬体形成和在处理30小时证实吞噬泡。
值得注意的是，以上所解释的本发明的方法允许鉴定包含双链RNA(dsRNA)或其类似物和聚阳离子的组合的新的化合物。在本发明的优选实施方案中，所述化合物是BO-110(pICPEI)，其包含聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)和聚乙烯亚胺(PEI)的组合。
如以下本发明的实施例和附图中所示的，BO-110可有效地用于治疗不同类型的癌症，例如：黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌。
因此，本发明还涉及包含BO-110的药物组合物，其用于治疗癌症，例如：黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌。该药物组合物还可用于治疗免疫受损的患者。
令人惊奇的是，pIC和PEI的功能相互作用实现了协同的技术效应，这改进和改变了单独特征的技术效应之和。因此，BO-110以不同于其组分PEI和pIC的方式进入细胞和发挥作用。具体地，在PEI不具有可测量的细胞效应，而孤立的pIC信号瞬时诱导最终在体内没有生物学影响的免疫响应时，BO-110能够选择性地杀伤肿瘤细胞。因此，BO-110示例了对于基因或化合物描述的合成致死性(synthetic lethality)概念，其作为单一剂无活性，但是组合起来具有不同的和可治疗开发的抗癌效应。
因此，本发明最重要的点之一是意外地发现病毒dsRNA模拟物聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)改变了其进入和递送至肿瘤细胞的路径。根据被TLR-3(Toll样受体3)的标准识别，当pIC与特异地允许胞质溶胶递送的运载体(carrier)家族组合时，可将这一dsRNA靶向至dsRNA感应器(dsRNA sensor)的家族(不同于TLR3)。这一活性使得dsRNA的作用模式从无关紧要的免疫调节物改变为肿瘤细胞的巨大杀手。用聚乙烯亚胺(PEI)以及lipofectamine、polyfect或superfect展示了抗癌活性。尽管这些运载体自身作为治疗剂不具有生物活性，但是本发明显示它们能够保护pIC分子，保持其处于允许自体吞噬激活的稳定形式。因此，dsRNA/聚阳离子的组合，如BO-110所示例的，代表具有抗癌效力的新的分子实体。更重要的是，BO-110的作用模式是没有料想到的。该化合物促进了自体吞噬和凋亡的双重诱导，导致协同和选择性地杀伤肿瘤细胞，特别是但不限于黑素瘤细胞，而不影响正常区室的生存力。凋亡机制是经由蛋白NOXA参与的。与其他诱导NOXA的化学治疗剂不同，BO-110不需要肿瘤阻遏物蛋白p53。这是重要的优势，因为在绝大多数人癌症中，p53是突变、缺失或失活的。该效应明显优于裸露的病毒RNA的经典响应，该经典响应解释了裸露的pIC用于治疗黑素瘤的临床研究中的不良结果。
因此，BO-110而不是未复合的dsRNA足以促进癌症细胞的自我杀伤和阻断体内、甚至免疫受损的小鼠中的癌症转移。本发明稍后描述的遗传、功能和超微结构分析说明自体吞噬的诱导不是由pIC触发用于细胞保护，而是选择性地破坏肿瘤细胞。进一步证实这些结果，尽管pIC被视为IFN控制的免疫性的诱导物，观察到的效应不依赖于IFN-α产生和分泌途径的激活。与这一观察相一致，自体吞噬途径激活甚至发生在免疫受损的动物中。总的来说，这些数据说明BO-110靶向和鉴定用于临床开发内在病原体识别程序、自体吞噬和肿瘤细胞死亡的新的干预点。
遗传和功能研究将内源MDA-5鉴定为BO-110驱动的自体吞噬途径和凋亡途径之间的联系。这也不同于限制于外源组分引起的凋亡性细胞死亡的关于MDA-5的先前公开。MDA-5/NOXA相互作用也是新的。
因此，MDA-5显示为用于筛选治疗癌症的药剂、具有通过自体/溶酶体和内在凋亡蛋白酶触发肿瘤自我破坏的特异特征的合适靶标。如上文提及的，这一策略具有超越独立参与这些机制中的任一种的标准治疗剂的优势。
相似地，因为能够激活这一途径而允许发现这一途径的实体是复合物BO-110或dsRNA类似物和阳离子运载体的其他组合。这些药剂因此是用于制备治疗癌症的药物的良好候选物。
如本发明中所用的，术语“双链RNA的长片段”与称为短RNA或干扰RNA(siRNA)的RNA片段相对使用。因此，如果双链RNA片段每条链包含至少25个核苷酸，则认为该双链RNA(双链体)是“长的”。优选所使用的片段在长度上相似于在大多数RNA病毒的细胞周期过程中细胞中出现的双链RNA中间体，这些双链RNA中间体显示为MDA-5解旋酶家族的天然底物，所以尤其是如果本发明的双链RNA含有每条链至少100个核苷酸，且更特殊地如果它含有每条链至少1000个核苷酸，则它被视为是“长的”。
天然存在的和对本发明的使用可能有用的双链RNA片段可以是以下病毒的细胞周期过程中发生的双链RNA中间体：副黏液病毒(诸如新城病的病毒NDV、仙台病毒(SDV))、弹状病毒(疱疹性口炎病毒(VSV))；黄病毒(丙型肝炎病毒(HCV))、正黏液病毒(流感病毒)和微小RNA病毒(脑-心肌炎的病毒(EMCV)。
至于双链RNA类似物，除了聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylicacid，pIC)之外，其他dsRNA模拟物对本发明也可能是有用的：a)骨架由类似于核糖的化合物形成的那些模拟物，诸如基于LNA(锁核酸：抗水解)、吗啉代和PNA(肽核酸)的那些，b)其中RNA的核苷酸的典型氮碱基的至少一种碱基已被类似物替代的那些模拟物，其还导致与天然现象不同的配对，诸如二氨基嘌呤(其通过三个氢键与尿嘧啶配对)，黄嘌呤/二胺嘧啶对(其中形式嘌呤黄嘌呤的酮/酮与胺/胺嘧啶形成三个氢键)，或异鸟嘌呤/异胞嘧啶对(其中形式嘌呤异鸟嘌呤的胺/酮与嘧啶酮-胺异胞嘧啶形成三个氢键)。
至于适合于本发明目的的聚阳离子运载体，使用所有能够改变质膜的通透性和/或通过以下诱导内吞的那些：促进双链RNA或其类似物进入细胞、和将它们释放到胞质溶胶、由此增加双链RNA的胞质溶胶感应器诸如解旋酶MDA-5的激活。除了聚乙烯亚胺(PEI)和Lipofectamine之外，此定义下还涵盖聚-L-赖氨酸、polisilazane、polidihidroimidazolenium、聚烯丙基胺(polialilaminem)和乙氧基化聚乙烯亚胺(ePEI).
下面通过实施例和附图更详细地阐述本发明。
附图简述
图1.BO-110诱导的大量自体吞噬造成黑素瘤细胞死亡。
图1A显示用1μg/ml PEI-复合的pIC(BO-110)处理12h的SK-Mel-103黑素瘤细胞中eGFP-LC3的自体吞噬体样聚焦染色的落射荧光显现。用PEI作为单一剂处理的细胞显示为参考对照。
图1B显示用BO-110或安慰剂对照处理后显示eGFP-LC3的加重的荧光发射的SK-Mel-103细胞的时间依赖性积累。雷帕霉素用作经典的自体吞噬诱导物。
图1C显示分离自如所示地处理的SK-Mel-103细胞的总细胞提取物的免疫印迹。处理在每行的上方指示:对照(无处理的：细胞群仅在媒介物存在下孵育)、pIC或BO-110处理的细胞。所分析的蛋白在图的左侧指示：未修饰的ATG8(LC3 I)、脂化的ATG8(LC3 II)和上样对照β-肌动蛋白)。图的右侧显示以kDa计的分子量。
图1D显示用BO-110或PEI对照处理的SK-Mel-103细胞的电子显微镜显微照片。箭头示出膜结合的自体吞噬体和自体溶酶体。
图1E显示与媒介物(左侧列)或BO-110(右侧列)孵育后5小时SK-Mel-103细胞在高(上)和低(下)放大率下的显微照片。
图1F显示如图片中所示处理30小时后细胞集落的明视野(左图和中图)和电子显微术(右图)的代表性显微照片。
图2.使用显微镜以时间间隔检查黑素瘤细胞中BO-110诱导的自体吞噬。
用PEI(对照)或BO-110处理表达eGFP-LC3的SK-Mel-103黑素瘤细胞后以所示时间间隔拍摄的显微照片的顺序。局灶性聚集物指示自体吞噬体形成。箭头标出处理过程中细胞塌陷(collapsing)和分离(濒死细胞)。
图3.由于PEI的存在,pIC至胞质溶胶的递送以选择性方式触发黑素瘤细胞死亡。
图3A显示其中显示如所示地处理24和48小时后通过锥虫蓝排出测定评价的细胞死亡百分比的图片(NT：白色条，PEI处理:深灰色条,pIC处理:浅灰色条,BO-110黑色条)。数据代表用图片上方所示的不同细胞系进行的三次独立实验的平均值土SEM值。如所示的，仅有用BO-110处理的黑素瘤细胞群有效死亡。
图3B：用媒介物(Ctr)、PEI、pIC或BO-110处理、并在处理后12h显现的SK-Mel-28和SK-Mel-103细胞的电子显微镜显微照片。对于每种细胞系，显示以两种不同的放大率拍摄的照片。箭头标出仅在BO-110处理的细胞中观察到的自体溶酶体。
图4.BO-110对肿瘤细胞的选择性细胞毒活性。
图4A显示分离自人包皮的黑素细胞(上行)、人黑素瘤细胞SK-Mel-103(中行)和鼠B16黑素瘤系(下行)用媒介物、PEI、pIC或BO-110处理后的代表性明视野图像，如所示的。
图4B显示FM(包皮黑素细胞)和SK-Mel-103对PEI和pIC处理作为单独的剂或组合(BO-110)(每个图片中的右侧条组)的剂量响应曲线。响应表示为处理后24小时死亡细胞的百分比。
图4C中的图片代表进行处理后24小时通过锥虫蓝排出测定评价的细胞死亡百分比(Ctrl：无处理；PEI、pIC和BO-110)。数据代表用所示的细胞系(SK-Mel-103或包皮成纤维细胞)进行的三次独立实验的平均值土SEM。如图4C中所示，仅有用BO-110处理的黑素瘤细胞群有效死亡。
图5.MDA-5是黑素瘤细胞中BO-110细胞毒性的感应器和驱动者。
图5A显示分离自未处理的(NT)或用PEI、pIC、B0-110或硼替佐米(Bor)处理的SK-Mel-28(上图)和SK-Mel-147(下图)的总细胞提取物的免疫印迹，如不同行所示。星号对应于非特异性条带。箭头指示应该观察到指示MDA-5切割的30kDa条带的位置。
图5B：未感染的或用表达乱序或MDA-5shRNA的慢病毒感染的SK-Mel-147细胞中MDA-5的加工，通过用pIC、B0-110或媒介物处理后的细胞提取物的免疫印迹显现，如所示的。如图5A所示，星号标示非特异性条带，而箭头示出指示MDA-5切割的30kDa条带的位置。
图5C显示在用单独的pIC(灰色条，)、B0-1101复合物(黑色条，/>)处理或未处理的细胞(未填充的条)后24小时通过锥虫蓝排出测定显示的MDA-5shRNA对B0-110诱导靶向毒性的抑制效应。还显示了用对照shRNA("sh对照”)感染的结果。数据代表三次独立实验的平均值土SEM。
图6.自体吞噬药理学抑制剂对BO-110细胞毒活性的效应。
图6A显示3-甲基腺嘌吟(3-MA)和氯喹(Chlor)对自体吞噬体中eGFP-LC3位置改变的效应，根据用BO-110(黑色填充的条)或用缓冲液对照(未填充的条)处理后12h由于GFP-LC3而具有荧光灶的SK-Mel-103细胞的百分比评估。
图6B显示用媒介物(白色条)或BO-110(黑色条)处理后20小时通过锥虫蓝排出评价的氯喹(Chlor)、胃酶抑素A(PEP)或E64d对细胞死亡的抑制效应。数据显示为三次独立实验的平均值土SEM。
图6C显示用樱桃色-GFP-LC3转染以检测用BO-110或25nM雷帕霉素处理后的自体吞噬体形成(35个红色和绿色灶)和自体溶酶体(仅红色灶)的SK-Mel-103细胞的荧光共聚焦显微照片。
图6D显示用媒介物(白色条)或BO-110(黑色条)处理后20小时通过锥虫蓝排出评价的100μM 100巴佛洛霉素(bafilomicine)(Bafil)、20uM氯喹(Chlor)或10μg/ml胃酶抑素(PEP)对细胞死亡的抑制效应。数据显示为三次独立实验的平均值±SEM。
图6E显示用BO-110处理(上部照片)或在氯喹存在下用BO-110处理(底行照片)并稳定转染EGFP-Rab5野生型(图中左列)或与BO-110红色Fluor标记的孵育(中间一列照片)的SK-Mel-103细胞的共聚焦荧光图像。在氯喹不存在或存在下，可观察到黑素瘤细胞中BO-110的内化。
图6F显示用于通过切割的存在和荧光DQ-BSA的释放(在用媒介物(对照)和用BO-110处理的SK-Mel-103细胞二者中均造成绿色荧光查看依赖溶酶体的蛋白水解的共聚焦荧光图像。在氯喹(Chlor：图片的中间一行)存在下，在DQ-BSA列(中间列)中未观察到荧光信号。显示溶酶体区室的溶酶体示踪剂-红色(LTR-Red:左列照片)存在下细胞的同时图像，这在所有三行照片中均产生信号。
图6G显示代表对应于图6F中测试细胞中的DQ-BSA和红色-溶酶体示踪剂信号的共定位的条形图(Ctrl:对照,黑色填充的条,：Chl：氯喹，未填充的条；BO-110，灰色填充的条，/>)。在两次独立实验中在最少150个细胞中评价了共定位,并相对于对照细胞中获得的值进行表示(AU：荧光任意单位)。
图6H显示用BO-110或缓冲液对照处理后SK-Mel-103中由于GFP-LC3(原始信号为绿色，指示自体吞噬体的定位)和溶酶体示踪剂(原始信号为红色，指示溶酶体存在)的荧光
灶的共聚焦免疫荧光图像,如图像中所示。用Hoescht对核进行染色(上部的照片，原始信号为蓝色)。在底部一行中，显示了三个先前图像的叠加,其在具有分别对应于GFP-LC3和溶酶体示踪剂的绿色和红色信号图像的区域中产生黄色或橙色，指示对应于GFP-LC3和溶酶体示踪剂的信号位于同一区域。
图6I显示用缓冲液对照、用pIC(“对照”)或用BO-110处理并在溶酶体示踪剂(原始的红色信号)或Hoescht(原始的蓝色信号)存在下孵育的表达eGFP-LC3(原始的绿色信号)的SK-Mel-103细胞中实时拍摄的共聚焦显微术图像,如图像中所示。三个图像的叠加(每种处理、对照或BO-110右下方)揭示用BO-110处理后但不是用裸露的pIC处理后GFP-LC3和溶酶体(如通过自体溶酶体形成所预期的)之间强烈的共定位(黄色信号)。在图的第三行,在重叠图像下方，显示了通过在给定平面中定量绿色信道的总细胞荧光强度(照片标记有代表eGFP-LC3的“GFP”)和红色信道的总细胞荧光强度(照片标记为代表溶酶体示踪剂的“LYSO”)获得的照片。在以用BO-110处理的细胞获得的照片中，两种信号eGFPLC3和溶酶体示踪剂的相似分布指示共定位,并因此指示自体吞噬体和溶酶体的融合。
图6J显示SK-Mel-103的基于群体的分析的代表，用pIC(对照)或用BO-110处理细胞,其代表eGFP-LC3(绿色荧光,X-轴)和溶酶体示踪剂(红色信号,Y轴)的信号强度。方形包括用两种标志物双重染色的细胞。
图7.BO-110处理后的内体运输以及两性体(amphisome)的产生和分辨。
图7A显示用BO-110或媒介物对照处理后在所示时间由实时荧光显微术捕获的表达EGFP-Rab7的SK-Mel-103黑素瘤细胞的顺序图像。值得注意的是,BO-110导致产生大量小泡。星号标示内体-内体融合(为了清楚，仅显示了一些实例。)
图7B显示稳定转染反转录病毒的SK-Mel-103细胞的共聚焦显微术照片，其通过以下造成绿色荧光的表达:EGFP-Rab7 wt融合蛋白(野生型Rab7)(从左起第一列和第三列照片，在第二种情形中，照片是在溶酶体示踪剂-红色存在下获得的，如该列上所示)或在溶酶体示踪剂存在下孵育的融合EGFP-Rab7 T22N(右列照片)。另外用BO-110(图的底行)或用媒介物对照(上图)处理细胞。用BO-110处理后10小时捕获图像。照片中位于右侧的两列含有对应于Rab7镶嵌小泡的平均面积的值。
图7C显示按照片上显示的所示时间间隔(以秒计)拍摄的一系列共聚焦显微照片，其说明了用BO-110处理后溶酶体与Rab7-阳性小泡的融合和溶酶体向Rab7-阳性小泡的掺入。
图7D显示用BO-110处理的和稳定转染反转录病毒的SK-Mel-103的实时荧光显微术图像，其产生绿色或红色荧光，如由GFP-Rab7wt(照片中的GFP-Rab7)、樱桃色-LC3(照片中的Ch-LC3)所产生的，或由于溶酶体示踪剂-蓝色(图中的LTR-蓝色)而产生蓝色荧光。处理后1小时按所示时间(分钟)拍摄图像。箭头标示第一序列，其中所示的每个标志物能够被显现。
图7E显示具有内体Rab7的小泡表面上的LC3在其内化和随后降解之前的掺入。这些内体/LC3杂合结构(两性体)通过表达EGFP-Rab7或樱桃色-LC3(照片中的Ch-LC3)SK-Mel-103细胞的实时显微术荧光显现。
图8.BO-110细胞毒性依赖于效应物和调节性胱天蛋白酶的激活。
图8A显示在每张图片下方列出的化合物的存在下，用作为缓冲液对照的PEI(Ctr,通过未填充的条表示)、pIC(灰色填充的条)或复合物BO-110(黑色填充的条)处理SK-Mel-147细胞引起的细胞死亡的百分比:媒介物(不含PEI的对照缓冲液)(左侧图片)、维生素E(+Vite，中间图片)或胱天蛋白酶抑制剂ZVAD-fmk(+ZVAD，右侧图片)。所有情形中用锥虫蓝排出测量百分比。
图8B显示转移性黑素瘤细胞系提取物(示于左侧)的免疫印迹的结果。它们是通过在所示的后处理时间(以小时计，在每条泳道上方)收集细胞获得的。处理在时间上方显示：NT(无处理:在缓冲液存在下孵育的对照细胞群)、PEI、pIC、复合物BO-110或Bor(硼替佐米25mM)。每张图片旁边显示了所分析的蛋白:casp-9(胱天蛋白酶9)、casp-8(胱天蛋白酶8)或微管蛋白(上样对照)。右侧的数字指示对应于该高度存在的蛋白条带以kDa计的相对质量。
图8C显示通过在以所示的小时(24和48小时)处理后收集细胞获得的SK-Mel-103细胞系提取物的免疫印迹的结果。处理显示在围栏上方，时间以下:NT(无处理:在仅缓冲液存在下孵育的对照细胞群)、PEI、pIC和复合物BO-110。每张图片旁边显示了所分析的蛋白：casp-9(胱天蛋白酶9)、casp-8(胱天蛋白酶8)、casp-7(胱天蛋白酶7)、Casp-3(胱天蛋白酶3)或微管蛋白(上样对照)。
图9.BO-110经由NOXA触发凋亡，不依赖于p53状态并且不诱导MCL-1的补偿性激活。
图9A显示通过在处理后所示时间(以小时计)收集细胞获得的SK-Mel-28细胞(上)或SK-Mel-147(下)的免疫印迹照片。处理在时间上方显示:NT(无处理:在缓冲液存在下孵育的对照细胞群)、PEI、pIC、复合物BO-110或Bor(硼替佐米25mM)。每张图片旁边显示了分析其水平的蛋白：NOXA、Mcl-1或微管蛋白(上样对照)。
图9B显示代表Mcl-1(上)和NOXA(下部图片)的相对水平的两张单独图片，通过作为所示的自处理后时间的函数的获自SK-Mel-28细胞的免疫印迹后的密度测定计算，表示为相对于在未处理的对照细胞中获得的对应值的百分比。每条曲线旁边示出了对应的处理。
图9C显示对SK-Mel-103总细胞提取物的免疫印迹所拍摄的照片，所述总细胞提取物通过对于每个处理组在处理后(所示时间以小时计)收集细胞获得。处理在每条泳道上方示出:NT(无处理:在缓冲液存在下孵育的对照细胞群)、PEI、pIC、复合物BO-110或Bor(硼替佐米25mM)。每张图片旁边显示了分析其水平的蛋白：NOXA、Bcl-xL、Bcl-2或微管蛋白(上样对照)。图的底部示出了处理后观察到的细胞死亡的百分比。
图9D显示设计用于评估NOXA蛋白表达的免疫印迹的照片。提取物获自用表达无活性的shRNA(sh Ctrl)或针对NOXA的shRNA的慢病毒载体感染两天后用pIC或BO-110处理24h的SK-Mel-103黑素瘤细胞。
图9E显示代表SK-Mel-103黑素瘤细胞的死亡率的图片(表示为死亡细胞的百分比)，所述细胞用对照shRNA(灰色填充的条，)或针对NOXA的shRNA(黑色填充的条，/>)转导并用pIC或BO-110孵育24h(NT：无处理，细胞用施用的媒介物孵育。)
图9F对应于MDA-5下调对BO-110诱导NOXA的抑制效应,通过用shRNA对照或针对MDA-5的shRNA转导的SK-Mel-103细胞中的NOXA水平(表示为任意单位,au)表示。NOXA水平通过密度测定测量，并表示为相对于未处理的对照(N Inf：无干扰，水平在用裸露的pIC处理的情形中产生值1和在BO-110处理情形中100)。
图10.B0-110在免疫活性小鼠中的抗黑素瘤活性。
图10A
上图°B16黑素瘤细胞在同基因C57BL/6中产生异种移植物的实验方法的示意图。还示出了肿瘤外周注射50μg(以100μl)(2ng/kg)裸露的pIC和PEI-复合的pIC的处理时间。对照组接受100μl的5％葡萄糖或仅PEI。
下图。表示通过在所示时间点的测径器测量评价的肿瘤生长。每个实验组分析10个肿瘤。常规地，当肿瘤体积超过1000mm3时处死小鼠。实验重复两次，得到相似结果。
图10B显示在同基因C57BL/6中静脉内植入B16-EGFP黑素瘤细胞以随后用10μg(以100μ1)(1ng/kg)的pIC或B0-110在所示时间点静脉内处理。对照组接受5％葡萄糖中的PEI。细胞接种后14天,将小鼠安乐死，加工肺用于荧光成像。
图10C显示代表手动计数外部转移灶获得的每个处理组中观察到的肺转移灶数目的条形图(C)。(NT/PEI和BO-110之间P*V0.01；n＝5；广义Mann-Whitney检验)。
图11.BO-110诱导IFN-α但不足以促进黑素瘤细胞死亡。
图11A显示用pIC或BO-110B16处理黑素瘤细胞和骨髓来源的巨噬细胞，分离RNA，并对IFN靶标IFIT-I进行定量PCR。显示了相对于对照未处理的细胞评价的IFIT-1的相对mRNA水平。
图11B显示用从10pg/ml(已经高于通过ELISA测定的BO-110-处理细胞中IFN-α的分泌量)开始的所示浓度的人重组IFN-α处理SK-Mel-103黑素瘤细胞。细胞死亡在处理后24h测定。作为对照,细胞平行地用BO-110处理(24h)。应注意的是，高水平的IFN-α对黑素瘤细胞不是细胞毒性的,并且不能重演BO-110的有效杀伤。
图12.免疫抑制没有损害BO-110阻断黑素瘤转移性散布的能力。
图12A显示SCID Beige小鼠(NK、B和T细胞严重免疫缺陷的)中B16-驱动的黑素瘤肺转移灶的产生和治疗。图像对应于用B16黑素瘤细胞i.v.接种并用PEI、pIC或BO-110处理的小鼠的代表性肺部在可见光或荧光下的照片。在细胞注射后14天捕获图像。
图12B显示图12A中所示的由B16诱导的转移灶的平均数目的表示(PEI、pIC和BO-110处理组之间P*<0.01；n＝5；广义Mann-Whitney检验)。
图12C显示用PEI、pIC或BO-110处理的小鼠中B16-驱动的肺部的组织学分析。显示了来自所示处理组的肺部的代表性H&E染色并在两种不同放大率(10x和40x)下显现。
图12D显示SCID Beige小鼠(NK、B和T细胞严重免疫缺陷的)中SK-Mel-103-驱动的黑素瘤肺转移灶的产生和治疗。图像对应于用K-Mel-103黑素瘤细胞i.v.接种并用PEI、pIC或BO-110处理的小鼠的代表性肺部在荧光或可见光下H&E染色(下行)的照片。
图12E显示图12D中所示的由SK-Mel-103诱导的转移灶的平均数目的表示((P*<0.01；n＝5；广义Mann-Whitney检验)。
图13.Tyr：：NRASQ61K x INK4a/ARF-/-小鼠中BO-110抑制转移性散布扩散。
图13A显示用DMBA处理以诱导色素病变并且然后用5％葡萄糖中的PEI(对照：Ctrl.)、pIC或BO-110处理的Tyr：：Tyr：：RasQ16K x INK4a/ARF-/-小鼠中转移灶的无进展存活率的Kaplan-Meier图。
图13B显示图13A中每个测试组发展的表皮黑素细胞新生物的累积平均数目的条形图。每5天进行计数,并按图片中所示的大小范围将肿瘤分组。
图13C显示通过旨在测试用5％葡萄糖中的PEI(对照)、裸露的pIC或BO-110处理的小鼠的代表性实例的代谢活性(18F-FDG的掺入)的PET/CT获得的横切片(左列)和冠状切片(右列)的代表性图像。肿瘤用白色虚线圈出。星号示出动物心脏的位置。
图13D显示采自图13A中描述的每个处理组的黑素细胞病变的苏木精-伊红染色。
图13E显示用5％葡萄糖媒介物(对照)或用BO-110处理的小鼠的皮肤组织样品、心、肝或肺(如照片左侧所示)的苏木精-伊红染色，其说明正常细胞区室中没有与BO-110处理有关的毒性。
图14.BO-110对多种肿瘤细胞的细胞毒活性。
图14A代表通过BO-110处理后18小时(左侧条)和30小时(右侧条)进行的锥虫蓝排出测定评价的不同肿瘤细胞系中的细胞死亡百分比：胰腺癌(Pa)、结肠癌(C)、膀胱癌(B1)、胶质瘤(G)、乳腺癌(Br)，黑素瘤(M)、前列腺癌(Pr)、肺癌(L)和卵巢癌(O)。数据代表用所示细胞系进行的三次独立实验的平均值土SEM。
图14B显示用媒介物或BO-110处理24小时后下列肿瘤细胞系的代表性明视野图像:MiaPaCa(胰腺癌)、BT549(乳腺癌)、639V(膀胱癌)和T98G(成胶质细胞瘤),如所示的。虽然BT549在最初是BO-110抗性的，但是它在长期生存力测定中最终塌陷°639V和T98G对BO-110的细胞毒效应高度敏感。
图14C显示用媒介物或BO-110处理24小时后所示肿瘤细胞系的生存力测定。对于短期生存力测定，处理的细胞在处理后24小时被固定并用结晶紫染色以显现细胞集落形成。对于长期生存力测定，将处理24小时的细胞的十分之一铺板并在48h后固定和用结晶紫染色。
图15.BO-110诱导细胞死亡依赖于肿瘤细胞系中MDA-5、Noxa和自体吞噬的激活。
此图显示从用媒介物(示为“-”)或BO-110(示为“+”)处理24小时后的下列肿瘤细胞系中分离的总细胞提取物的免疫印迹:BT549(乳腺癌)、639V(膀胱癌)和T98G(成胶质细胞瘤)。所分析的蛋白为:MDA-5FL(MDA-5全长)、MDA-5C(MDA-5切割)、NOXA、胱天蛋白酶-9或微管蛋白(上样对照)。应注意的是,NOXA和MDA-5FL的更高诱导以及胱天蛋白酶-9和MDA-5c的切割发生于BO-110更敏感的肿瘤细胞。
实施例
下面描述的实施例的测定使用以下材料和实验技术进行：
细胞和细胞培养物。
人转移性黑素瘤细胞系SK-Mel-19、SK-Mel-28、SK-Mel-103和SK-Mel-147和以及小鼠B16细胞先前已被描述(Soengas等人,2001。这些细胞在补充10％胎牛血清(Nova-TechInc.，Grand Island，NY，USA)的Dulbecco改进的Eagle培养基(Life Technologies，Rockville，MD，USA)中培养。
人黑素细胞如所述地分离自人新生包皮(Fernandez等人，2005)，并维持在补充黑素细胞生长因子(HMG-I)、含有10ng/ml 12-十四酸佛波酯13-乙酸盐(CascadeBiologies，Portland，OR，USA)的Medium 254中。
人成纤维细胞分离自人新生包皮,并维持在补充10％胎牛血清的DMEM培养基中。
另外，来自其他肿瘤类型的细胞获自美国国立癌症研究院抗癌药物筛选项目(National Cancer Institute(NCI)Anticancer Drug Screening Program)使用的60个人肿瘤细胞系组，代表九种肿瘤组织类型。对于胰腺肿瘤，选择的细胞系为：IMIMPC2、MiaPaCa、Aspc1、A6L、SKPC-1和Panc-1；对于结肠癌：CACO、SW480和SW1222；对于膀胱癌：RT112、MGHU4、639V、253J、MGHu3和SW1170；对于胶质瘤和成胶质细胞瘤：U87MG、U251和T98G；对于乳腺癌：MDA-231、MCF7和T47D；对于前列腺癌：LNCaP、PC3和DU145；对于肺癌：H1299和NCIH460；和对于卵巢癌：NCI H23和SK-OV-3。
所有细胞在补充有10％胎牛血清(Nova-Tech Inc.，Grand Island，NY，USA)的Dulbecco改进的Eagle培养基(Life Technologies，Rockville，MD，USA)中培养。
PEI复合的pIC(BO-110)的产生。
dsRNA的合成类似物pIC购自InvivoGen(San Diego，CA)。
反应性jetPEI、jetPEI-Fluor和invivo-jetPE获自Polyplus-转染(Ikirch，Francia)。根据生产商的方案，含有聚乙烯亚胺的线性衍生物的这些产物被用于以1比5的N/P比(每个RNA磷酸对应的JetPEI的氮残基)在体外和体内复合pIC。
除非另外指明，培养的细胞中使用的pIC的浓度是1μg/ml和在小鼠中的1-2ng/kg。
药物处理和细胞死亡测定。
硼替佐米(万珂(Velcade)，以前的PS-341)获自Millenium Pharmaceuticals Inc(Cambridge，MA)；阿霉素(多柔比星)获自Sigma Chemical(St.Louis，MO)和依托泊苷获自Bristol-Myers Squibb(New York，NY)。抗氧化剂Tiron和Vit-E购自Sigma(St.Louis，MO)，和广谱胱天蛋白酶抑制剂ZVAD购自R&D System(Minneapolis、MN)。3-甲基腺嘌呤(3-MA)获自Sigma Chemical(St.Louis，MO)。氯喹获自Sigma Chemicall(St Louis，MO，USA)。
响应于药物处理的细胞生存力测定在接种黑素细胞和黑素瘤细胞之后、药物处理之前至少12小时进行。所示时间和处理浓度下细胞死亡的百分比通过先前描述的标准锥虫蓝排出测定评价(Wolter等人，2007；Fernandez等人，2005)。
响应于药物处理的细胞增殖测定在接种肿瘤细胞后、药物处理之前至少12小时进行。所示时间和处理浓度下的细胞生长通过结晶紫染色测定评价。
蛋白质免疫印迹。
为了测定蛋白水平的变化，如所示地处理2x106细胞，并在处理后不同时间收获。使总细胞裂解物在还原条件下在10％、12％或4-15％梯度SDS凝胶中进行电泳，随后转移至Immobilon-P膜(Millipore，Bedford，MA，USA)。
蛋白条带通过ECL系统(GE Healthcare，Buckighamshire，UK)检测。
初级抗体包括：casp-9和-3，来自Novus Biological(Littleton，CO，USA)；casp-8(Ab-3)，来自Oncogene Research Products(San Diego，CA，USA)；casp-7，来自CellSignaling Technology(Beverly，MA，USA)；Bcl-xL，来自BD Transduction Laboratories(Franklin Lakes，NJ，USA)；Blc-2，来自Dako Diagnostics(Glostrup，Denmark)；NOXA，来自Calbi ochem(San Di ego，CA，USA)；MDAp53，来自Novocastra Laboratories(Newcastle，UK)；和微管蛋白(克隆AC-74)，来自Sigma Chemical(St Louis，MO，USA)。MDA-5抗体已在之前描述。
二级抗体为来自GE Healthcare的抗小鼠抗体或抗兔抗体。图像J(Image J)用于定量不同处理诱导的蛋白水平的改变，将未处理的对照视为基础表达的参照。
RNA干扰。
用于下调NOXA的shRNA慢病毒载体先前已有报道(Fernandez等人，2005)。用于下调MDA-5(靶序列，SEQ ID NO：1)的plko慢病毒载体购自OpenBiosystems(Huntsville，AL)。还设计了乱序寡核苷酸以产生对照shRNA。病毒如所述地产生自293FT细胞，并在赋予＞80％感染效力的条件下使用(Denoyelle等人，2006)。MDA-5的下调通过免疫印迹和RT-PCR(SEQ ID NO：2的正向引物和SEQ ID NO：3的反向引物)证实。当示出时，用pIC或BO-110的处理在用表达对应的shRNA的病毒感染后3天启动。
微阵列表达谱测定。
总RNA分离自至少两次独立实验，并用RNeasy试剂盒(Quiagen)纯化。用BO-110处理的样品用2.5mg Cy5-UTP进行标记，并用作与用PIC或PEI孵育得到的Cy3-dUTP标记的2.5g RNA的杂交反应的参照。将标记的RNA按照生产商的说明与来自Agilent(SantaClara，CA，USA)的双色寡核苷酸完整人基因组微阵列(4x44K)杂交。洗涤后，用Scanarray105000XL(GSI Lumonics Kanata，Ontario，Canada)扫描玻片，并用GenePix 4.0程序(AxonInstruments Inc.，Union City，CA)分析图像，如先前所述(Alonso等人，2007)。对荧光强度测量进行自动背景扣除。将Cy3：Cy5关系归一化为所有点的中值比率。归一化后，丢弃对于两个信道强度(中值的和)均低于局部背景的点。对剩余点之间的关系进行对数转化(底为2)，重复的点阵列调整为中值。在对照和测试样品中差异表达的基因的非加权分组(UPGMA：非加权组)用基因表达模式分析套件(GEPAS)进行。
体内治疗响应。
雌性C57BL/6小鼠购自NIH(Bethesda，MA)。具有受损的NK、T和B细胞淋巴细胞功能的雌性SCID Beige小鼠购自Charles Rivers(Wilmington，MA)。所有动物在实验开始时为6-12周龄。动物护理按照密歇根大学癌症中心(University of Michigan Cancer Center)的制度程序提供。
皮肤中的移植物移入通过皮下注射105B16黑素瘤细胞产生。单独的或与invivoJetPEI复合的2ng/kg μg pIC在肿瘤植入后第7、11、15和21天通过肿瘤外周注射施用。另外的处理组包括JetPEI作为单一剂和安慰剂对照。肿瘤体积通过测径器测量评价，并计算为V＝L x W2/2，其中L和W分别代表肿瘤长度和宽度。
肺转移灶的代用模型通过i.v注射4x105 B16-eGFP或5x105 SK-Mel-103-eGFP黑素瘤细胞产生。在第3、6和9天通过i.v.注射单独的或与invivoJetPEI复合的1ng/kg pIC进行处理。在攻击后14天收获肺部，手动计数外部转移灶并根据数量和大小评分。可选地，Illumatool TLS LT-9500荧光系统(Lightools Research，Encinitas，CA，USA)和肿瘤细胞发射的荧光用Hamamatsu Orca 100 CCD照相机捕获。独立于石蜡切片分析监测苏木精-伊红染色转移性参与。实验以每组五只小鼠进行，并重复二到四次。当对照群体显示不适或呼吸缺陷迹象时，将小鼠安乐死。
将Tyr：：N-RasQ61K小鼠与Ink4a/Arf敲除小鼠在C57BL/6背景中杂交产生原发性黑素瘤(Ackermann等人，2005)。对于皮肤中黑素瘤的诱导，在8-10周龄时将小鼠用220mg 7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)涂抹一次。形成早期黑素细胞新生物(直径至少1mm的病变)后，用作为单一剂的或与vivoJetPEI复合的1ng/kg pIC的每周两次腹膜内注射处理小鼠。计数黑素瘤和胎块(痣)，并使用测径器以两个直径测量其大小，表示为以mm3计的肿瘤平均大小。
还通过PET-CT(正电子发射体层摄影-计算机体层摄影术)评估肿瘤大小。PET-CT图像的探索和采集以用于小动物的PET-CT系统View Explore General Electrics(Fairfield，CT，USA)进行。注射15MBq 18F-FDG(2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖)用于PET图像的成像和采集，并使用3DOSEM算法重建。CT图像以16次拍摄用35KeV和200uA能量采集，并且使用FDK算法重建图像。通过分析用苏木精-伊红染色的石蜡切片独立地监测黑素瘤、转移灶和其他器官。
透射电子显微术。
对于透射电子显微术(TEM)，所示细胞群用0.1Sorensen′s缓冲液pH 7.5润洗，并在2.5％戊二醛中固定1.5h，随后脱水并在Spurr′s树脂中包埋。然后，将块切成60-100nm超薄切片，并置于铜载网上。对于常规分析，超薄切片用2％乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。电子显微照片用Philips CM-100透射电子显微镜(FEI，Hillsbrough，OR)和Kodak 1.6Megaplus数码照相机采集。
共聚焦和荧光显微术：GFP-LC3加重的圆点(punctuated dots)的定量。
克隆到pCNA表达载体的eGFP-LC3融合体惠赠自Gabriel Nunez(密歇根大学癌症中心)。将eGFP-LC3和片段eGFP-Rab7wt、eGFP-Rab7 T22N、eGFP-Rab5wt、eGFP-樱桃色-LC3和樱桃色-LC3克隆到pLVO-puro慢病毒载体用于稳定基因转移。黑素瘤来源的细胞(即SK-Mel-103)用pLVO-eGFP-LC3感染并用嘌呤霉素进行选择。GFP-LC3-相关的荧光发射使用Leica AF6000荧光显微镜成像，并通过LAS AF V1.9(Leica，Solms，Germany)分析图像。对于共聚焦实时显微术，我们使用与控制CO2和温度的孵育室偶联的Leica TCS-SP2-AOBS-UV超级谱线显微镜。图像通过LCS(Leica，Solms，Germany)分析。对于共定位实验，50nM或200nM浓度的溶酶体示踪剂TM红色或蓝色(Invitrogen，Carlsbrad，CA)和5ug/ml浓度的Hoescht 33342(Invitrogen，Carlsbrad，CA)在成像前10分钟加入。共定位图像用LAS AFV1.9(Leica，Solms，Germany)进行分析。
细胞因子表达。
培养物上清液中的人干扰素α通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测量。人IFN-αELISA试剂盒和重组hIFN-α购自PBL Interferon Source(Piscataway，NY)并根据生产商的方案使用。通过实时PCR测量来自骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和B16黑素瘤细胞的IFN-α表达水平。准备BMDM，铺板和处理，如先前所述(Celada等人，1984)。IFIT-1RNA转录物的实时定量PCR分析使用获自Applied Biosystems的TaqMan引物和探针在AppliedBiosystems7700序列检测仪上在用β-肌动蛋白归一化后进行。
统计分析。
生存力数据表示为平均值+/-s.em，并使用双尾学生t-检验确定差异的统计分析。P＜0.05视为显著的。对于体内肿瘤生长和转移灶的统计评估，使用广义Mann-WhitneyWilcoxon检验比较两组之间的连续变量的值。P值＜0.05视为显著的。
实施例1.通过基于LC3荧光的差别分析鉴定黑素瘤细胞中的自体吞噬诱导物。通过超微结构分析证实BO-110诱导自体吞噬性细胞死亡。
如上文所讨论的，自体吞噬(对于细胞死亡和存活两者的诱导)的标志是自体吞噬蛋白基因8(ATG8)/LC3从胞质溶胶到新生的自体吞噬体的位置改变。基于这一观察，GFP-LC3融合蛋白细胞内分布的改变(即弥散模式到聚焦染色)用作早期自体吞噬的标志物。自体吞噬体的存在还看通过电子显微术或光学显微术证实。
1.1.基于LC3的荧光分析。
为了解决自体吞噬在黑素瘤对药物的响应中的作用，使用基于GFP-LC3的差异分析筛选商业可获得的化学治疗药物和免疫调节物。用表达自体吞噬体LC3标志物的GFP衍生物的慢病毒载体，诸如pLVO-eGFP-LC3稳定转染黑素瘤细胞。
人细胞系SK-Mel-103基于其高度转移性和化学抗性表型被选作初始筛选的模型系统(Soengas等人，2001)。随后的验证研究在一组具有多样遗传背景的人细胞系上进行(参见下文)。
发现许多抗癌药物诱导局灶性GFP-LC3荧光发射而不显著影响细胞生存力。然而，在死亡诱导剂中，发现PEI和dsRNA模拟物聚肌苷-聚胞苷酸的复合物(BO-110)对于引起GFP-LC3灶尤其有效。约50％的细胞在低剂量(0.5-1μg/ml)BO-110下孵育4-6h内显示明显的加强的GFP-LC3染色(参见图1A、图1B中的代表性显微照片和定量)。事实上，动力学分析指示BO-110比雷帕霉素导致更快的GFP-LC3灶产生(图1B)，雷帕霉素是用于自体吞噬诱导的一种经典阳性对照(Klionsky等人，2008)。
令人感兴趣的是，在晚期时间点，BO-110处理能够诱导细胞死亡，甚至在对标准DNA损害药剂诸如多柔比星或依托泊苷具有内在抗性的黑素瘤细胞系中也是如此，像在SK-Mel-103的情形中。
对内源LC3的分析显示电泳迁移率的改变(图1C)，对应于此蛋白在自体吞噬体形成过程中的特征性脂化和需要ATG5来产生GFL-LC3灶形成。
本发明的作者不知晓将pIC与癌症细胞的自体吞噬联系起来的任何先前报道。因此，下列测试集中于此化合物，因为它可揭示增强对诱导自体吞噬和肿瘤细胞死亡的dsRNA的潜在的细胞内感受器的理解的新要素。
1.2.BO-110对细胞的效应的超微结构分析。
上一段中描述的用BO-110处理的细胞中的GFP-LC3聚焦染色与自体吞噬体的形成一致。然而，为了排除异位表达的GFP-LC3非特异地聚集的可能(Klionsky等人，2008)，通过电子显微术独立地分析了响应(图1D)。
对BO-110的早期响应(5h)涉及将细胞碎片隔绝的膜结合的电子致密结构的显著积累(图1D)，这是自体吞噬体的鉴别性特征。这些结构的大小和数量甚至通过光学显微术也是作为细胞内颗粒可见的(图1E)。
在晚期时间点，用BO-110处理诱导细胞塌陷(图1F，中图)，通过电子显微术发现这与大于500nm直径的大吞噬泡的形成有关(图1F，右图。
图2显示通过选择在不同时间拍摄的荧光显微照片概括的自体吞噬诱导的时间进化，这可在EGFP随时间重新分布的显微照片中看出：从弥散性染色到局灶性聚集物，指示自体吞噬体的形成，一种以广泛的细胞塌陷为极点的过程。对照细胞在整个测试期显示弥散性染色，指示LC3积累的基础水平。
令人感兴趣的是，质膜和核膜的完整性得以保留，并且用BO-110处理的细胞显示凋亡程序特征性的染色质凝聚。自体吞噬的诱导依赖于BO-110，因为PEI(对照)对自体吞噬体的数目或大小影响极小(图1D-F)。加在一起，这些发现支持涉及自体吞噬体形成、然后是具有凋亡样特征的细胞死亡的BO-110细胞毒效应。
实施例2.不同人和鼠黑素瘤细胞系对与阳离子轭合的pIC的敏感性分析和对黑素细胞的选择性。
为了确定用SK-Mel-103细胞进行的初始研究中发现的BO-110的促自体吞噬活性是否是更广泛的抗黑素瘤活性的反映，测试了另外一组细胞系。
选择黑素瘤细胞以与常见的黑素瘤相关事件关联，诸如BRAF或NRAS中的突变、INK4a/ARF或PTEN基因座的缺失、或各种抗凋亡Bcl-2家族成员的上调，已知这些事件有助于黑素瘤的进展和化学抗性。
P53突变在黑素瘤中是罕见的(Soengas和Lowe，2003)。然而，由于p53可能在凋亡和自体吞噬程序的激活中起关键作用，我们还对表达突变的p53的SK-Mel-28细胞系进行测试，以确定此肿瘤阻遏物是否是BO-110的抗黑素瘤活性严格需要的。此外，还在分析中包括鼠转移性黑素瘤细胞系B16作为广泛用于黑素瘤的免疫疗法的模型的实例(Wenzel等人，2008)，以评估假定与物种间的差异相关的治疗响应的差异。平行地，我们还分析了分离自人包皮的黑素细胞。
表1中显示了人转移性黑素瘤细胞系的遗传背景：
表1.人转移性黑素瘤细胞系的遗传背景。
p53突变状态通过借助RT-PCR对外显子2-10直接测序确定。具有多态性P72R的样品标示为R。p53的诱导性通过对用多柔比星(0.5mg/ml，12h)处理的提取物进行免疫印迹确定。具有高内源水平p53的系以星号标示。PTEN、Apaf-1、Casp-8、Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1水平通过免疫印迹测定并按对照黑素细胞归一化。BRAF和NRAS突变状态通过分别对PCR-扩增的外显子15和3的基因组片段进行直接测序确定。对多柔比星(DOX；0.5μg/ml，30h)的响应分类为++、+、-/+、-，分别代表细胞死亡百分比为100-70、70-50、50-30和＜30％。对BO-110(1ug/ml，30h)的响应分类为+++、++、+，分别代表细胞死亡百分比为100-90、90-60和60-40％。具有高内源水平p53的系以星号标示。
使用这些系，进行了与实施例1中对SK-Mel-103细胞系描述的那些测试相似的测试，以验证这些细胞的每一种对pIC和PEI作为独立的药剂或组合使用的敏感性。结果概括于图3。
用BO-110处理后，测试的五种黑素瘤细胞系(SK-Mel-19、-28、-103、-147和B16)被以相似的动力学和敏感性杀伤(图3A)。需要指出的是，在其中进行测试的所有黑素瘤系中，BO-110对自体吞噬的早期激活不变地跟随有细胞死亡。
电子显微术显示清晰的自体吞噬体，在p53突变系SK-Mel-28中也如此(图3B)。如图3A和图4B中描绘的剂量响应曲线(其显示对应于四种独立分离株的系的代表性数据)中所示，重要的是注意到，在处理后24小时，在引起70％的SK-Mel-103黑素瘤细胞死亡的条件下，正常黑素细胞保持活性并且没有显示自体吞噬的标志物。
此外，如图4A中所示，在广泛的BO-110浓度范围内未观察到黑素细胞形态学、颗粒或胞质溶胶GFP-LC3分布的显著变化。图4C还显示正常人皮肤成纤维细胞还比黑素瘤细胞对BO-110具有更大抗性。
令人感兴趣的是，发现PEI在其对肿瘤细胞的选择性中至关重要。因此，当处理中未包括PEI时，pIC的抗黑素瘤活性降低70-80％(图3A)。没有PEI，裸露的pIC在黑素瘤细胞和黑素细胞中几乎是无效的，并且显示极小的作为自体吞噬诱导物的活性(图3B)。
PEI是基因疗法中的经典媒介物，因为它能够通过内吞作用促进DNA和RNA分子的摄取(综述于Payne，2007)。用BO-110处理的黑素瘤细胞中发现的多层结构(参见下面图2B的照片)事实上与涉及内体-溶酶体杂合体(两性体)到自体吞噬体的多次融合事件是一致的(Maiuri等人，2007)。
实施例3.PE I不存在和存在下pIC对MDA-5的定性地不同的激活。
除了有利于DNA或RNA分子的内吞之外,PEI还可促进内体膨胀和允许遗传物质有效地递送至胞质溶胶(修订于Payne，2007)。因此,PEI看有利于pIC访问胞质溶胶内的感应器。黑素瘤分化相关基因-5(MDA-5)是这些感应器之一(Akira,2006),因此作者测试了该蛋白是否是BO-110-介导的对黑素瘤细胞的杀伤的驱动者。
如所述地,通过监测细胞死亡过程中将MDA-5分成解旋酶和胱天蛋白酶激活募集结构域(CARD)的蛋白水解切割分析MDA-5的激活(Kovasovics等人,2002；Barral等人，2007)。
这一分析通过在使来自用PEI、pIC或BO-110处理的SK-Mel-28和SK-Mel-147细胞的提取物电泳之后对这些提取物免疫印迹来进行。硼替佐米用作有效诱导细胞死亡的阳性对照。结果示于图5。
令人感兴趣的是，蛋白免疫印迹揭示PEI-pIC复合物BO-110诱导MDA-5加工的强大和持续能力(图3A)。裸露的pIC可诱导这一加工，但是以显著较低的水平,并且既不是在所有测试的细胞中如此,也不是以持续的方式(对应于SK-Mel-28细胞的泳道无一显示存在蛋白水解切割的特征性30kD条带,其应出现在图5A和B中箭头的高度)或持续的(参见图5A,其中30kD条带的强度随SK-Mel-147细胞中pIC处理的时间而降低)。
为了明确MDA-5对BO-110的细胞毒活性的贡献，将与MDA-5互补的短发夹RNA(shRNA)经由慢病毒载体转导进黑素瘤细胞以稳定敲低MDA-5(参见图3B中的蛋白免疫印迹)oMDA-5shRNA显著降低BO-110驱动的黑素瘤细胞死亡而对于对照细胞没有可检测的非特异性效应(图3A,p<0.05)。
重要的是,MDA-5的诱导和加工不单纯是黑素瘤细胞中死亡机制激活的结果。用能够激活黑素瘤中内在和死亡受体两种凋亡途径的蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理对MDA-5水平或加工没有作用(图5A)。这些结果说明通过BO-110和其他促凋亡诱导物执行的死亡程序存在重要机制差异。
实施例4.自体吞噬的药理学抑制剂损害BO-110的细胞毒活性。
接下来，测定集中于BO-110-诱导的细胞死亡执行过程中涉及的机制。3-甲基腺嘌吟(3-MA)和氯喹分别由于其干扰自体吞噬体形成或自体溶酶体活性的能力而常用于独立地验证自体吞噬机制(Maiuri等人，2007；Klionsky等人，2008)。
为了检查这一干扰是否发生在BO-110处理的黑素瘤细胞中，使SK-Mel-103黑素瘤细胞在用BO-110或用缓冲液对照(媒介物)处理后12小时经受3-甲基腺嘌呤或氯喹处理。结果示于图6。
如通过荧光显微术显示的(图6A和图6B)，3-MA阻断BO-110引起的GFP-LC3灶形成。在氯喹存在下，自体吞噬体积累，但令人感兴趣的是，这一诱导作为死亡诱导物没有效验(图6C，观察到在氯喹存在下观察到的死亡细胞的百分比低于对胃酶抑素A、E64d、或二者的组合所观察到的死亡细胞的百分比)。因此，这些结果支持如下情节：其中细胞毒性BO-110不是自体吞噬体形成的被动副产物，溶酶体的溶解活性是BO-110-杀伤黑素瘤细胞的必需介导物。
实施例5.BO-110驱动自体吞噬体/溶酶体融合以随后进行死亡程序。
如果自体溶酶体是BO-110的关键驱动者，阻断溶酶体水解应在BO-110处理过程中保护黑素瘤细胞。阻断所有依赖于溶酶体的活性是不可行的，原因是具有重叠靶标的许多酶位于这一细胞器中(Fehrenbacher和Jaattella，2005)。但是，关于溶酶体活性的有用信息可由广谱蛋白酶抑制剂E64d和胃酶抑素A提供，因为这些化合物有效阻断自体溶酶体中的多种组织蛋白酶(B、D和L)(Klionsky等人，2008)。因此，进行试验以比较氯喹、胃酶抑素A或E64d对用缓冲液对照或BO-110处理后20小时的细胞死亡的效应。结果示于图6C，该图已在前面提及。值得注意的是，胃酶抑素A和E64d将BO-110引起的细胞死亡降低了50％。
为了证实小泡对应于之前所鉴定的包括大型内体的大的多囊泡结构，其继而募集多个自体吞噬体(以产生称为两性体的杂合结构)和这些小泡不是停止的自体吞噬体的结果，其中溶酶体要么不被募集要么功能障碍，或自体溶酶体是降解不充分的材料聚集的结果，用GFP和樱桃色-LC3的融合体转染黑素瘤细胞。樱桃色-GFP-LC3信号由于两种荧光蛋白(樱桃色和GFP)而导致红色和绿色荧光自体吞噬体，但是它们在自体溶酶体的酸性环境中松开GFP信号(绿色)。
使用这一策略揭示，事实上，与雷帕霉素相似，BO-110在黑素瘤细胞中诱导自体溶酶体的形成，如图6C中仅存在红色LC3灶所示的。与前面的试验一致，氯喹阻断BO-110触发的黑素瘤细胞死亡(图6D)，而不影响此dsRNA模拟物的内体摄取(如通过Fluo Red-标记的BO-110与GFP-融合的早期内体蛋白Rab5的共定位所测定的(图6E)。广谱蛋白酶抑制剂E64d和胃酶抑素A和液泡型ATP酶阻断剂巴佛洛霉素(图6D)观察到相似的抑制性效应，支持依赖于溶酶体的BO-110的新的作用模式。
为了独立地监测BO-110处理过程中的溶酶体活性，测试了细胞加工DQ-BSA(BSA的衍生物，除非被蛋白水解酶切割，否则其绿色荧光被猝灭)的能力。如图6F所示，DQ-BSA在BO-110存在下被有效切割。值得注意的是，在溶酶体检测到DQ-BSA发射，如与溶酶体示踪剂红色(一种细胞通透性依赖于pH并在掺入功能溶酶体酸时发射红色荧光的染料)的共定位所示的。结果与当用氯喹阻断溶酶体活性时用BO-110处理的SK-Mel-103细胞中由于DQ-BSA观察到的极少荧光发射相反(图6F和图6G)。
为了进一步表征BO-110引起自体吞噬过程的起始和完全发育的能力，通过共聚焦显微术显现了自体吞噬体和溶酶体融合。对于此目的，用BO-110或作为对照的相应缓冲液处理稳定表达GFP-LC3的SK-Mel-103细胞，并在溶酶体示踪剂-红色存在下孵育。基于单独细胞和细胞群的绿色和红色荧光(分别用于GFP-LC3融合体和溶酶体示踪剂)的双重发射分析显示自体溶酶体和溶酶体的清晰共定位(参见图6H和6I中的代表性荧光显微照片和图6J中的相应定量)。重要的是，此共定位是BO-110触发的响应的早期事件，并进展为有序的细胞塌陷。
确定自体吞噬体响应于BO-110与活性溶酶体融合之后，我们评估了这些细胞器是否与内体相互作用或被募集至内体。首先，在表达与晚期内体标志物Rab7融合的GFP的黑素瘤细胞中评估了内体动力学(Luzio等人，2007。在未处理的黑素瘤细胞中(图7A中的左图)检测了基础内体产生和消退(即大小的渐进性减小)。然而，BO-110处理显著诱导了内体活性，诱导了持续的和多重的内体产生(图7A中的中图和右图)。发现这些内体填充有溶酶体，如通过GFP-Rab7和溶酶体示踪剂红色的双重成像所示的(图7B)。此外，时间推移显微术揭示了溶酶体至GFP-Rab7-镶嵌内体的多重募集的快速动力学，还如图7C中的融合时间的顺序系列所示。重要的是，如图7B(右图)所示，如果细胞过表达Rab7蛋白的已知的显性阴性突变体Rab7-T22N，内体-溶酶体融合受到显著抑制。总之，这些结果揭示了BO-110处理的肿瘤细胞中内体/溶酶体区室的动态动员。
实施例6.BO-110连接了自体吞噬和凋亡性胱天蛋白酶。
溶酶体蛋白酶可在多个水平影响死亡程序(Maiuri等人，2007；Hoyer-Hansen和Jaatella，2008)。在线粒体的情形中，它们可以活性氧簇(ROS)产生不正常和/或参与经典凋亡性胱天蛋白酶(调节性casp-9和效应物casp-3和-7)。依赖于casp-8的外部途径也可响应于溶酶体激活(Fehrenbacher和Jaattella，2005。为了解决BO-110作用模式中ROS的作用，在具有不同抗氧化活性的清除剂维生素E、Trolox或Tiron和广谱胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk的存在下进行处理。分析每种情形中细胞死亡结果的结果示于图8A，其中用维生素E获得的数据显示为用所提及的化学抗氧化剂获得的结果的代表性情形，所这些试剂以阻断黑素瘤中ROS控制的凋亡的剂量使用(Fernandez，2006)。如图中所示，这些抗氧化剂的存在，没有观察到对BO-110引起的细胞死亡的显著效应。相反，广谱胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk抑制BO-110杀伤达70％。总的来说，这些结果支持依赖胱天蛋白酶的机制激活自体吞噬程序的下游。
BO-110事实上有效地促进了胱天蛋白酶加工，如通过免疫印迹在经受以下处理后的不同时间收集的细胞提取物所测定的：除不含PEI的缓冲液对照外无处理(NT)或用PEI、pIC、复合物BO-110或已知的胱天蛋白酶切割诱导物硼替佐米处理(图8B和图8C)。图8B比较了PEI、pIC和BO-110在转移性黑素瘤的不同系中诱导胱天蛋白酶8和9的凋亡性加工的能力：在测试的所有人黑素瘤细胞系中，用BO-110处理后20h，胱天蛋白酶9和8的有效激活是清晰可见的；与对硼替佐米观察到的相似。此外，BO-110对胱天蛋白酶加工的动力学和程度是高度一致的(图5B)，而与BRAF(如SK-Mel-19)、NRAS(SK-Mel-103、-147)、或p53(SK-Mel-28)的突变状态无关。
图8C显示了使用SK-Mel-103系进行的相似的测试，其采用了更完整的分析，除了凋亡性胱天蛋白酶9和8之外，还包括效应物胱天蛋白酶3和7。利用SK-Mel-147系进行了相同的测试，其产生了相似的结果。SK-Mel-103和-147中casp-9、-3和-7的有效加工尤其相关。这些系具有低水平的Apaf-1，并且在响应于经典抗癌剂诸如多柔比星、依托泊苷或顺铂(参见图1C中的图表)参与casp-9/Apaf-l凋亡体中是非常低效的(Fernandez等人，2005；Soengas等人，2006)。因此，这些结果显示了BO-110激活凋亡程序和绕过对标准化学治疗药物具有抗性的内在机制的卓越能力。
实施例7.在不存在抗凋亡Bcl-2家族成员的补偿效应下BO-110对细胞死亡的激活。
为了更详细地分析BO-110的作用模式和鉴定可能由此药剂独特地激活的事件，比较了药物响应和硼替佐米的效应。选择此药剂是因为它还是黑素瘤细胞中凋亡机制的强力激活物(Wolter等人，2007；Fernandez等人，2006)。
然而，我们预期硼替佐米和BO-110在机制上是不同的。硼替佐米靶向蛋白酶体而不是溶酶体(Qin等人，2005)。此外，如图5A所示，硼替佐米杀伤黑素瘤细胞而不诱导或加工MDA-5。硼替佐米还令人感兴趣的是它可以促进促凋亡NOXA的巨大积累，而且还诱导其抗凋亡拮抗剂因子Bcl-2家族成员MCL-1的快速和显著的上调(Fernandez等人，2005)。重要的是，MCL-1充当蛋白酶体抑制的内部补偿机制并在体外和体内阻断硼替佐米的抗肿瘤发生效应(Wolter等人，2007；Qin等人，2006)。
为了评估硼替佐米和pIC(裸露的或与PEI复合的)之间的相似性和不同，将黑素瘤细胞与这些化合物中的每一种孵育，并在处理后不同时间点收集提取物以评估NOXA、MCL-1和其他Bcl-2家族成员(Bcl-xL或Bcl-2)的水平。结果示于图9。
如图9A和B所示，裸露的pIC不能一致地或以持续的方式在SK-Mel-28或SK-Mel-147黑素瘤细胞(分别表达p53 L145R突变或p53wt的细胞)中诱导NOXA。另一方面，BO-110在SK-Mel-28、SK-Mel-147和SK-Mel-103中分别诱导超过基础水平35、10和5倍的NOXA(参见图9A和C中的免疫印迹，和来自SK-Mel-28细胞中获得的结果的图9B中的代表性定量)，再次强调了裸露的和PEI-复合的pIC的不同活性。
对于NOXA的抑制性调节物，MCL-1水平几乎没有受到BO-110的诱导(图9A和图9B的第一张照片)。这与硼替佐米相反，硼替佐米强力激活NOXA，但同时诱导MCL-1的积累，如先前所述的(Fernandez等人，2005)。其他抗凋亡Bcl-2家族成员诸如Bcl-2和Bcl-xL也不受BO-110影响(参见图9C中SK-Mel-103的免疫印迹)。
在补偿机制不存在下，BO-110诱导的NOXA的相对较低的水平可能足以促进细胞死亡。为了检验这一假设，用先前说明的shRNA转导黑素瘤细胞以特异性地抑制NOXAmRNA和蛋白(Fernandez等人，2005)，并使用以表达无活性的shRNA对照的慢病毒载体感染的对照细胞作为对照。如图9D所示，shRNA引起的NOXA蛋白表达的50％降低，抑制BO-110对NOXA的上调也达近50％，并抑制了BO-110毒性(图9E)。
接下来，我们使用针对MDA-5的shRNA来明确BO-110对NOXA的调节对这一蛋白的需求，并如前进行测定但定量NOXA水平。结果示于图9F图中。令人感兴趣的是，MDA-5shRNA抑制NOXA蛋白水平达70％(图9F)，对其他Bcl-2家族成员没有继发作用。
总之，这些结果揭示了MDA-5在NOXA诱导驱动的凋亡机制中的新作用点。
实施例8.裸露的pIC和BO-110在免疫活性小鼠中的不同效力。
接下来，在体内评估了pIC和BO-110的抗黑素瘤活性。在黑素瘤模型中，裸露的pIC必须以高剂量或与其他药剂(如蛋白合成抑制剂)组合施用以有效激活先天免疫程序。以上实施例中获得的数据表明，pIC在PEI存在下将显著更有效。
首先在免疫活性背景中分析了处理响应。将未转导的或以GFP转导的(便于通过荧光成像进行检测)B16小鼠黑素瘤细胞植入同基因正常小鼠。使用了两种测量：(i)皮下(s.c)或(i i)静脉内注射肿瘤细胞，以分别在局部位点或作为远端转移灶评估肿瘤进展。用PEI、pIC或BO-110或100ul葡萄糖5％(NT组)处理小鼠。
图10A概括了用B16产生s.c异种移植物的实验策略以及剂量和处理方案。在处理时间，以肿瘤外周注射进行2ng/kg裸露的pIC或与PEI复合的pIC的注射。
显著地，发现BO-110在所有研究情形中优于pIC。因此，皮下生长B16黑素瘤的接受媒介物、PEI或单独的pIC的小鼠由于过度的肿瘤生长必须在植入后15-25天内处死(图10A)。在相同条件下，BO-110处理组中的皮下黑素瘤是不可检测的或显著较小的(图10A).
图10B概括了静脉内植入B16-eGFP黑素瘤细胞的实验策略和用pIC、PEI、BO-110或葡萄糖5％(NT组)进行的随后处理。在该图中还显示了来自处死的动物肺部的荧光图像(图10B和肺转移灶定量(图10C)。在该实验中，BO-110在黑素瘤肺转移灶替代模型中也比裸露的pIC强5倍，如通过荧光成像测定的。
实施例9.IFN未重演BO-110的死亡诱导特征。
pIC是IFN-驱动的细胞免疫的经典诱导物(Wenzel等人，2008)。然而，前面实施例中呈现的数据表明，当与PEI复合时，pIC还可以细胞自主方式起作用，这可能不同于“职业”免疫细胞中IFN-介导的响应。为了评估这一可能性，测试了B16黑素瘤细胞和巨噬细胞分泌和响应于IFN-α的能力。RT-PCR表明，用BO-110处理后，两种细胞类型均激活经典IFN-α靶标诸如IFIT-1(具有三十四肽重复的IFN-诱导蛋白)(图11A)。在巨噬细胞中，PEI对于pIC-介导的IFN靶标诱导是可有可无的(图11A)。这是预期的，因为这些细胞可有效感应病毒dsRNA。然而，仅用裸露的pIC时，黑素瘤细胞无法诱导IFIT-1(图11A)。
为了直接评估黑素瘤细胞的IFN-α产生，使用重组人IFN-α作为参考对照进行了Elispot测定。BO-110处理后黑素瘤细胞分泌的IFN-α水平低于10pg/ml。为了确定IFN-α是否可替代BO-110(即IFN-α分泌是否是黑素瘤细胞死亡的主要诱导物)，向黑素瘤细胞添加增加量的此细胞因子。令人感兴趣的是，高剂量的IFN-α(超过BO-110处理后分泌的水平的10倍)不能影响黑素瘤细胞生存力(图11B)。
令人感兴趣的是，还注意到微阵列测试显示，对pIC的响应除了非常短暂之外，涉及的缩影基因都是对干扰素的干扰素响应预期的，如图11C所示)。相反，BO-110的效应除了维持之外还扩展到另外的转录物。
因此、这些结果说明巨噬细胞和黑素瘤细胞中对于dsRNA的识别和感应的内在差异。
实施例10.BO-110可在严重免疫受损的背景中抑制转移性生长。
因为黑素瘤细胞经常是免疫抗性的，在高度免疫缺陷的背景中测试了BO-110对黑素瘤细胞的直接毒性是否仍然有效。与黑素瘤免疫耐受性相关的最常见的效应物机制是NK、T和B细胞信号传导的缺陷(Kirkwood等人，2008)。因此，在小鼠SCIDBeige小鼠中测试了pIC(作为单一剂或与PEI复合)阻断黑素瘤生长的效力，SCIDBeige小鼠具有受损的NK、T和B细胞淋巴细胞功能。
为了监测肺转移灶对照中的处理效力，用GFP标记黑素瘤细胞并静脉内注射，按照图10中描述的处理方案进行。B16-黑素瘤(图12A、B和C)和SK-Mel-103(图12D和E)分别作为鼠和人黑素瘤s的代表性实例进行分析。
在两种细胞模型中，BO-110均能抑制肺部的黑素瘤生长。图12A显示BO-110处理后肺表面可见的B16转移灶数目的惊人差异(参见图12B中的定量)。组织学分析还证实BO-110组中B16-驱动的肺结节的数目和大小的减小(图12C)。相似的分析显示BO-110(但不是未复合的pIC)在控制SK-Mel-103的散布生长中清晰的抗肿瘤效应(图12D和E)。总之，我们的数据证明dsRNA模拟物的新作用模式，其在不具有活性免疫系统的SCIDbeige小鼠(Cray和Chapeau、1990)中诱导强力的体内抗黑素瘤活性。
实施例11.BO-110抑制人黑素瘤动物模型的转移性生长。
为了比较pIC和BO-110之间的差异，使用了更相关的背景。Tyr：：NRASQ61K xINK4a/ARF-/-小鼠以与人疾病相似的特征形成黑素瘤(Ackermann等人，2005)。用DMBA(7，12-二甲基苯并[a]蒽，获自Sigma)的单次表皮处理对小鼠进行处理。色素病变达到1mm直径后，通过每周两次的腹膜内注射(i.p)施用配制为适于体内递送的对照PEI、裸露的pIC或与PEI轭合的pIC。
再次观察到BO-110的抗肿瘤活性显著高于裸露的pIC，如通过直接测量肿瘤大小(图13A和13B)、通过PET-CT测定肿瘤的代谢活性(图13C)和组织学分析(图13A)所测定的。
令人感兴趣的是，在所用的处理剂量下，BO-110使无进展病变的时间框加倍(图13A)而无继发毒性信号(参见分析图13D)。
这些结果支持基于施用dsRNA类似物抵抗黑素瘤细胞的攻击性行为的生存力。
实施例12.BO-110对多种肿瘤细胞的细胞毒活性。
由于黑素瘤中存在的和影响dsRNA感应和自体吞噬的遗传学和表观遗传学变化可能在不同癌症类型之间不是保守的，BO-110对其他肿瘤性恶性疾病是否具有治疗益处并不明确。特别是胰腺肿瘤、结肠肿瘤、膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、肺肿瘤和卵巢肿瘤是攻击性的，并且对多种治疗是抗性的，部分是因为死亡程序的多种灭活。
为了确定BO-110是否可代表具有广谱作用的新型抗癌策略，从公知的NCI-60组中选择了属于上述癌症类型的独立分离的细胞系(图14)。因此，总的来说，这些系涵盖了具有不同遗传背景的多种肿瘤(即胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌)。如图14所示，所分析的细胞系与黑素瘤参考对照相比对BO-110具有相似的敏感性。根据这些数据推论，BO-110能够参与自体吞噬和凋亡的诱导，导致协同和选择性地杀伤(而不影响正常区室的生存力)不仅是黑素瘤，而且还杀伤属于其他肿瘤类型的细胞，例如：胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌的细胞。
实施例13.BO-110诱导的细胞死亡依赖于肿瘤细胞系中MDA-5、Noxa和自体吞噬的激活
由于不能事先(即基于肿瘤细胞类型)预测对BO-110的敏感性，因此必须确定介导对BO-110的响应的信号级联。黑素瘤细胞中的高通量遗传分析(基于cDNA阵列)表明，BO-110能够促进dsRNA感受器MDA-5以及促凋亡因子NOXA的强烈上调。令人感兴趣的是，使用免疫印迹测定，我们证明事实上对BO-110的敏感性和抗性(如在HCTl16或MiaPaCa2系中)与细胞诱导MDA-5和NOXA的能力相关(图15)。与以上所表明的BO-110的促凋亡作用一致，敏感的细胞系显示明显的胱天蛋白酶-9加工，这可显现为电泳迁移率的改变(图15)。
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Claims (10)

1.包含聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)和直链聚乙烯亚胺(PEI)的组合的复合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其中所述复合物以1/5的N/P比率形成，所述N/P比率为直链PEI的氮残基和pIC磷酸的比率，所述癌症选自由膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌组成的组。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物
(i)促进膀胱癌细胞或源自膀胱癌细胞的细胞系中自体吞噬和凋亡的双重诱导，并且不影响正常的膀胱细胞；或
(ii)促进胰腺癌细胞或源自胰腺癌细胞的细胞系中自体吞噬和凋亡的双重诱导，并且不影响正常的胰腺细胞；或
(iii)促进结肠癌细胞或源自结肠癌细胞的细胞系中自体吞噬和凋亡的双重诱导，并且不影响正常的结肠细胞；或
(iii)促进乳腺癌细胞或源自乳腺癌细胞的细胞系中自体吞噬和凋亡的双重诱导，并且不影响正常的乳腺细胞；或
(iv)促进前列腺癌细胞或源自前列腺癌细胞的细胞系中自体吞噬和凋亡的双重诱导，并且不影响正常的前列腺细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物促进膀胱癌细胞或选自由RT112,MGHU4,639V,253J,MGHu3和SW1170的人膀胱癌细胞系组成的组的源自膀胱癌细胞的细胞系中的自体吞噬和凋亡的双重诱导。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物促进胰腺癌细胞或选自由IMIMPC2,MiaPaCa2,Aspc1,A6L,SKPC1和Panc-1的人胰腺癌细胞系组成的组的源自胰腺癌细胞的细胞系中的自体吞噬和凋亡的双重诱导。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物促进结肠癌细胞或选自由CACO,SW480和SW1222的人结肠癌细胞系组成的组的源自结肠癌细胞的细胞系中的自体吞噬和凋亡的双重诱导。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物促进乳腺癌细胞或选自由MDA231,MCF7和T47D的人乳腺癌细胞系组成的组的源自乳腺癌细胞的细胞系中的自体吞噬和凋亡的双重诱导。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物促进前列腺癌细胞或选自由LNCaP,PC3和DU145的人前列腺癌细胞系组成的组的源自前列腺癌细胞的细胞系中的自体吞噬和凋亡的双重诱导。
8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其中所述药物包含在适于通过肿瘤外周或腹膜内注射施用的药物组合物中。
9.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其中所述聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)的长度为每条链至少25个核苷酸。
10.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其中所述聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)长度为每条链至少100个核苷酸。
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