ES2928145T3 - Composiciones y métodos para tratar la endometriosis - Google Patents

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Meera Nanjundan
Kyle A Bauckman
Idhaliz Flores
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Ponce Health Sciences Univ
University of South Florida
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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para tratar y/o prevenir la endometriosis o sus síntomas, ensayos para diagnosticar/pronosticar endometriosis, composiciones y formulaciones para tratar y/o prevenir la endometriosis o sus síntomas, y poblaciones de células endometióticas, incluidas poblaciones de células de vida extendida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para tratar la endometriosis
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud provisional de Estados Unidos con número de serie 62/081,464 presentada el 18 de noviembre de 2014, con el título “Composiciones y métodos para tratar la endometriosis”. Declaración sobre investigación o desarrollo patrocinado federalmente
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la subvención núm. 1R21HD075225-01A1, otorgada por los National Institutes of Health. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.
Lista de Secuencias
Esta solicitud contiene una lista de secuencias archivada en formato electrónico como un archivo ASCII.txt titulado 02309665.txt, creado el 18 de noviembre de 2015 y con un tamaño de 1,66 MB. El contenido de la lista de secuencias se incorpora en la presente descripción en su totalidad.
Antecedentes
La endometriosis es una enfermedad ginecológica que afecta a las mujeres en edad fértil. Aunque en sí misma es benigna, es una afección inflamatoria, crónica, y muy dolorosa que se caracteriza por lesiones endometriósicas en sitios ectópicos y quistes ováricos que conducen a la infertilidad y a un riesgo aumentado de subtipos específicos de cáncer de ovario. Los síntomas característicos de la endometriosis incluyen dolor pélvico crónico, dolor durante las relaciones sexuales (dispareunia), períodos dolorosos (dismenorrea), e infertilidad.
Las lesiones endometriósicas se caracterizan por tejido similar al endometrio funcional (glándulas epiteliales y estroma) fuera del útero, particularmente en el área peritoneal, que afecta los órganos reproductivos, la vejiga y el tracto intestinal. La endometriosis es la tercera causa principal de hospitalización ginecológica en los Estados Unidos. Las encuestas hospitalarias estiman que la prevalencia de la endometriosis entre todas las mujeres premenopáusicas es de hasta un 10 %, lo que equivale a unos 180 millones de mujeres y adolescentes afectadas en todo el mundo.
Debido al dolor intenso, las múltiples cirugías, que incluyen las histerectomías, y el impacto negativo en la capacidad reproductiva, la endometriosis afecta de sustancial y negativamente la calidad de vida de las adolescentes y mujeres afectadas. Las causas definitivas de la endometriosis no están claras. Sin embargo, el endometrio eutópico depositado en la cavidad peritoneal a través de la menstruación retrógrada se considera la fuente de células que forman las lesiones endometriósicas. El desarrollo de estrategias terapéuticas para diagnosticar, tratar, mitigar, o eliminar las lesiones y aliviar el dolor, sin interferir con el potencial de fertilidad, y la prevención de una mayor progresión de esta enfermedad son muy necesarios para estos pacientes.
Bauckman (2014; ProQuest Dissertations Publishing) divulga la caracterización de la respuesta al hierro en líneas celulares ginecológicas.
El documento número WO 00/47739 divulga el diagnóstico por autoantígenos de la endometriosis.
El documento número US 6,572,858 divulga usos para agentes terapéuticos antipalúdicos.
Fukuda y otros. (2015; Gynecologic Oncology 137, 538-545) divulga que la cloroquina antipalúdica suprime la proliferación y supera la resistencia al cisplatino de las células de cáncer de endometrio a través de la inhibición de la autofagia.
Ruíz y otros. (2016; Cell Death and Disease 7, e2059) divulga el efecto de la hidroxicloroquina y la caracterización de la autofagia en un modelo de endometriosis en ratones.
El documento número US 2009/0238876 divulga bisfosfonatos para tratar la endometriosis.
Breve descripción de los dibujos
Aspectos adicionales de la presente divulgación se apreciarán fácilmente tras la revisión de la descripción detallada de sus diversas modalidades, descritas más abajo, cuando se toman en conjunto con los dibujos adjuntos.
Las Figuras 1A-1E demuestran los resultados de un ensayo inmunohistoquímico para LC3 en tejido de ovario de un sujeto que tiene endometriosis ovárica (Figura 1A), tejido de las trompas de Falopio de un sujeto que tiene endometriosis de trompas de Falopio (Figura 1B), tejido de lesión de un sujeto que tiene endometriosis proliferativa (Figura 1C), tejido de control de endometrio proliferativo de control (Figura 1D), tejido de control de endometrio secretor (Figura 1E). La expresión de LC3 se evaluó mediante la comparación de la expresión relativa en tejido endometriósico (Figuras 1A-1B) con endometrio proliferativo de pacientes (Figura 1C) y controles (Figura 1D).
Las Figuras 2A-2B demuestran los resultados de una evaluación cualitativa de la intensidad de la tinción de LC3 de las Figuras 1A-1E. La intensidad de la tinción de LC3 en el estroma se evaluó independientemente del epitelio glandular. Los resultados se presentan como patrones de tinción negativos, débiles, moderados, y fuertes.
La Figura 3 demuestra la formación de estructuras “similares a piedras” (SLS) en lesiones endometriósicas. Las flechas indican SLS ilustrativas.
La Figura 4 demuestra los resultados de un inmunoensayo en el que se evaluó la expresión proteica de ATG7, ATG6, hVps34 en células endometriales normales (HES) y células endometriósicas inmortalizadas (IE). La expresión se evalúa en relación con un control de GAPDH.
La Figura 5 demuestra el efecto de un inhibidor autofágico sobre células endometriósicas in vivo. El valor de p entre los dos grupos fue de 0,0019.
Las Figuras 6A y 6B demuestran la expresión de diversas proteínas en líneas celulares endometriales primarias usadas para desarrollar una línea de células endometriales de vida prolongada. Las células endometriósicas primarias se compararon con líneas celulares endometrioides, células claras, adenocarcinoma, y de carcinoma seroso para determinar los patrones de expresión de promotores tumorales (EVI1, RON, EGFR, SnoN, AKT), supresores tumorales (TGFpRII, Smad2/3,pTEN), marcadores de autofagia (ATG5, ATG7, beclina-1, hVps34), marcadores epiteliales (E-cadherina) y marcadores estromales (Ncadherina, vimentina).
Las Figuras 7A y 7B demuestran la expresión de diversas proteínas en líneas celulares endometriales primarias usadas para desarrollar una línea de células endometriales de vida extendida. Las células endometriósicas D primarias se infectaron retroviralmente con el antígeno T grande de SV40 y se seleccionaron con puromicina. Se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron durante un mes. Se recolectó el lisado de cada colonia y se evaluó la expresión del antígeno T grande. Se usaron otros marcadores para evaluar el cambio en la expresión celular debido al antígeno T grande de SV40 (EVI1, SnoN y marcadores de autofagia), así como también la confirmación de la selección positiva de células epiteliales (ausencia de vimentina). La expresión de p53 indica inactivación a través de la expresión del antígeno T grande.
Las Figuras 8A-8L demuestran la confirmación de la ausencia de vimentina y la presencia de citoqueratina-18 (Cy3) (marcador epitelial) que se realizó mediante inmunofluorescencia. Las células T80 sirvieron como control positivo para Cy3 y SKOV3 se usó como control positivo para vimentina. Las Figuras 8A-8D muestran células endometriales de vida extendida. Las Figuras 8E-8H muestran células SKOV3. Las Figuras 81-8L muestran células T80. Las Figuras 8A, 8E, y 8I muestran la expresión de citoqueratina-18 (Cy3), las Figuras 8B, 8F, y 8J muestran la expresión de vimentina (FITC). Las Figuras 8C, 8G, y 8K muestran la tinción DAPI. Las Figuras 8D, 8H, y 8L muestran la imagen fusionada de la tinción de Cy3, FITC, y DAPI.
Las Figuras 9A-9D muestran imágenes de células endometriósicas humanas de vida prolongada tratadas (Figuras 9C-9D) con hidroxicloroquina (HCQ) o sin tratar (Figuras 9A-9B). Se aislaron células endometriósicas humanas de vida prolongada a partir de dos tipos de lesiones diferentes y, por lo tanto, se trataron por separado (C y D).
La Figura 10 muestra un gráfico que demuestra los resultados de un ensayo de viabilidad celular en células endometriósicas humanas de vida extendida tratadas con HCQ o de control. Se aislaron células endometriósicas humanas de vida prolongada a partir de dos tipos de lesiones diferentes y, por lo tanto, se trataron por separado (C y D).
La Figura 11 muestra una imagen de una inmunotransferencia Western que demuestra el contenido de proteína de LC3B-I, LC3B-II, y un control (Pan-actina) en células endometriósicas humanas de vida extendida tratadas con HCQ o de control. Se aislaron células endometriósicas humanas de vida prolongada a partir de dos tipos de lesiones diferentes y, por lo tanto, se trataron por separado (C y D).
La Figura 12 muestra un diagrama de un régimen de tratamiento para ratones para determinar los efectos de HCQ sobre lesiones endometriósicas.
Las Figuras 13A-13C muestran gráficos que demuestran el número de lesiones endometriósicas por ratón (Figura 13A), área de lesión (mm2) y volumen de lesión (mm3) en ratones tratados con un control (PBS) o HCQ como se establece en la Figura 12.
Las Figuras 14A-14D muestran imágenes representativas de tejido teñido con hematoxilina y eosina (H&E) del tejido del cuerno uterino (Figuras 14A y 14C) y tejido lesionado (Figuras 14B y 14D) en ratones de control (PBS) y tratados con HCQ de acuerdo con el conjunto de régimen que se establece en la Figura 12. Las puntas de flecha negras indicaron compartimentos glandulares y las flechas planas indican células epiteliales dentro de las lesiones (p = 0,03, según la prueba exacta de Fisher).
La Figura 15 muestra un gráfico que demuestra la cantidad de citocinas/quimiocinas G-CSF, eotaxina, e IP-10 (en pg/mL) presentes en el líquido peritoneal recolectado de ratones de control y ratones receptores mediante el uso de un ensayo de panel de perlas magnéticas de citocinas y quimiocinas de ratón.
La Figura 16 muestra un gráfico que demuestra la cantidad de citocinas/quimiocinas G-CSF, eotaxina e IP-10 (en pg/mL) presentes en el líquido peritoneal recolectado de ratones tratados con control (PBS) y ratones tratados con HCQ mediante el uso de un ensayo de panel de perlas magnéticas de citocinas y quimiocinas de ratón. Las Figuras 17A-17C muestran macrófagos en la cavidad peritoneal de ratones de control y con endometriosis inducida en el momento de la recolección de la muestra (2 semanas después de la inducción de la endometriosis). Las Figuras 17A-17B demuestran los resultados de la citometría de flujo mediante el uso de marcadores de macrófagos canónicos CD11b y F4/80 en ratones normales (Figura 17A) y receptores (Figura 17B). La Figura 17C muestra un gráfico que demuestra el número de macrófagos como porcentaje del total de células examinadas en ratones de control y receptores.
Las Figuras 18A-18C muestran macrófagos en la cavidad peritoneal de ratones tratados con el control (PBS) y tratados con HCQ en el momento de la recolección de la muestra (2 semanas después de la inducción de la endometriosis). Las Figuras 18A-18B demuestran los resultados de la citometría de flujo mediante el uso de marcadores de macrófagos canónicos CD11b y F4/80 en ratones normales (Figura 18A) y receptores (Figura 187B). La Figura 18C muestra un gráfico que demuestra el número de macrófagos como porcentaje del total de células examinadas en ratones de control y receptores.
Las Figuras 19A-19X muestran imágenes de secciones de tejido de los cuernos uterinos de ratones tratados con el control (PBS) (Figuras 19A-19F) y tratados con HCQ (Figuras 19G-19L) y de los ovarios de ratones tratados con el control (PBS) (Figuras 19M-19R) y tratados con HCQ (Figuras 19S-19X), donde las secciones de tejido se sometieron a diversas tinciones o análisis inmunohistoquímicos.
Las Figuras 20A-20J muestran imágenes de secciones de tejido de lesiones de ratones tratados con el control (PBS) (Figuras 20A-20E) y tratados con HCQ (Figuras 20F-20J), donde las secciones de tejido se sometieron a diversas tinciones o análisis inmunohistoquímicos.
Las Figuras 21A-21H muestran imágenes representativas de controles de tinción positivos (Figuras 21A-21E) y negativos (Figuras 21F-21H) usados para los anticuerpos usados en las Figuras 20A-20J.
Las Figuras 22A-22J muestran gráficos que demuestran la abundancia de ARNm de 10 moléculas implicadas en la ruta autofágica (expresada como cambio en veces de ARN) en los cuernos uterinos y lesiones en ratones tratados con el control (PBS) y con HCQ. • indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones tratados con PBS, ■ indica repeticiones individuales de lesiones de ratones tratados con PBS, ▲ indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones tratados con HCQ y ▼ indica repeticiones individuales de lesiones de ratones tratados con HCQ.
La Figura 23 muestra una imagen representativa de un análisis por inmunotransferencia Western que analiza los niveles de proteína de diversos marcadores autofágicos en los cuernos uterinos y lesiones de ratones tratados con PBS o HCQ.
Las Figuras 24A-24H muestran gráficos que demuestran la expresión normalizada de proteínas de diversos marcadores autofágicos en los cuernos uterinos y lesiones de ratones tratados con PBS o HCQ. • indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones tratados con PBS, ■ indica repeticiones individuales de lesiones de ratones tratados con PBS, ▲ indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones tratados con HCQ y ▼ indica repeticiones individuales de lesiones de ratones tratados con HCQ.
La Figura 25 muestra un mapa de calor que demuestra una comparación de ARN aislado de cuernos uterinos de ratones de control con relación a ratones receptores.
La Figura 26 muestra un diagrama de volcán que muestra los cambios en veces en los genes de autofagia en el endometrio eutópico entre ratones receptores y de control.
Las Figuras 27A-27M muestran gráficos que demuestran la expresión de ARNm (expresada como un cambio en veces) de diversos marcadores autofágicos en ratones tratados con PBS, de control, y receptores. • indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones de control, ■ indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones receptores, y A indica repeticiones individuales de ratones tratados con PBS.
La Figura 28 muestra una imagen representativa de una inmunotransferencia Western que demuestra la expresión de proteínas de diversos marcadores autofágicos en los cuernos uterinos de ratones de control y receptores.
Las Figuras 29A-29H muestran gráficos que demuestran la expresión de proteínas normalizada de diversos marcadores autofágicos en ratones de control y receptores.^ indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones de control y ■ indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones receptores.
Las Figuras 30A-30B muestran imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida (Figuras 30E-30G) y ratones de control (Figuras 30A-30D).
Las Figuras 31A-31J muestran imágenes inmunohistoquímicas representativas para endometrio (controles y pacientes) y lesiones (trompas de Falopio, ovarios, peritoneal, gastrointestinal, y piel).
Las Figuras 32A-32B muestran gráficos que demuestran el % de intensidad de tejido en cada categoría (ninguna, débil, moderada o fuerte) de expresión estromal (Figura 34A) y epitelial (Figura 34b ).
La Figura 33 muestra un diagrama resumen del efecto observado de HCQ sobre lesiones endometriósicas. Las Figuras 34A-34B muestran imágenes de células estromales del endometrio humanas T-HESC tratadas con HCQ y de control derivadas de un mioma.
La Figura 35 muestra un gráfico que demuestra la capacidad de supervivencia de las células T-HESC tratadas con control y HCQ.
La Figura 36 muestra una imagen de una inmunotransferencia Western representativa que demuestra la expresión de las proteínas LC3B-I, LC3B-II y Pan-actina en células T-HESC tratadas con HCQ y de control. La Figura 37 muestra una imagen de una inmunotransferencia Western representativa que demuestra la expresión de proteínas de diversos marcadores autofágicos y Pan-actina en células T-HESC tratadas con diversos ARNip.
La Figura 38 muestra un gráfico que muestra la supervivencia celular (expresada como unidades de luz relativas) de células T-HESC después de tratarse con diversos ARNip.
La Figura 39 muestra un diagrama que muestra una línea de tiempo de recolección de muestras y régimen de tratamiento.
Las Figuras 40A-40B muestran imágenes representativas de ratones de control (ratones no inyectados) o receptores. La flecha blanca indica lesiones ectópicas. Los ratones se trataron como se establece en la Figura 39.
Las Figuras 41A-41H muestran gráficos que muestran la expresión de ARNm (expresada como cambio en veces) de diversos marcadores autofágicos en lesiones y cuernos uterinos en el mismo ratón receptor. • indica repeticiones individuales de cuernos uterinos de ratones receptores, ■ indica repeticiones individuales de lesiones de los mismos ratones receptores
La Figura 42 muestra un diagrama de volcán que demuestra los cambios en veces en los genes de autofagia en el endometrio eutópico entre ratones receptores y de control.
Las Figuras 43A-43B muestran gráficos que muestran la intensidad positiva total (Figura 43A) y el % de células con una intensidad fuerte (Figura 43B) mediante el uso del sistema de puntuación H de la expresión de la proteína LC3B (según se determinó por inmunohistoquímica) en las muestras indicadas de controles y pacientes. La Figura 44 muestra imágenes de inmunotransferencias Western representativas que demuestran la expresión de proteínas LC3B-I y LC3B-II en diversos tejidos de ratones de control y receptores.
Las Figuras 45A-45I muestran gráficos que muestran la expresión de proteína normalizada de LC3B-II en diversos tejidos de ratones de control y receptores.
La Figura 46 muestra imágenes de inmunotransferencias Western representativas que muestran la expresión de proteínas LC3B-I y LC3B-II en diversos tejidos de ratones tratados con PBS y tratados con HCQ.
Las Figuras 47A-47H muestran gráficos que muestran la expresión de proteína normalizada de LC3B-II en diversos tejidos de ratones tratados con PBS y tratados con HCQ.
La Figura 48 muestra una tabla que muestra los resultados de validación de RT2 PCR y PCR en tiempo real para los diversos genes indicados en ratones de control y receptores.
La Figura 49 muestra una tabla que muestra el cambio en veces y los valores de P para diversos genes indicados en los cuernos uterinos de ratones con endometriosis inducida en relación con los de los ratones de control.
Descripción detallada
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, a la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, se incluye dentro de la divulgación. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también se incluyen dentro de la divulgación, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la divulgación. A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación.
Todas las publicaciones y patentes citadas en esta descripción divulgan y describen los métodos y/o materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones. La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente divulgación no tiene derecho a ser anterior a tal publicación en virtud de la divulgación anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar una confirmación independiente. Como será evidente para los expertos en la técnica al leer esta divulgación, cada una de las modalidades individuales descritas e ilustradas en la presente descripción tiene componentes y características discretas que pueden separarse o combinarse fácilmente con las características de cualquiera de las otras modalidades sin apartarse del alcance o espíritu de la presente divulgación. Cualquier método mencionado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos mencionados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Las modalidades de la presente divulgación emplearán, a menos que se indique de cualquier otra manera, técnicas de biología molecular, microbiología, nanotecnología, química orgánica, bioquímica, botánica y similares, que se encuentran dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura.
Definiciones
Como se usa en la presente descripción, “célula endometriósica” se refiere a una célula endometrial patológica que puede crecer y sobrevivir fuera del endometrio como parte de una lesión endometriósica.
Como se usa en la presente descripción, “lesión endometriósica” se refiere a una colección o población de células endometriósicas existentes en un sujeto o extraídas directamente de un sujeto.
Como se usa en la presente descripción, “endometriosis” se refiere a una enfermedad o afección que se caracteriza por un crecimiento ectópico aberrante (fuera del útero) y supervivencia de células endometriales que se transformaron a partir de células endometriales normales a células endometriales patológicas.
Como se usa en la presente descripción, “autofágico” se refiere a la autofagia o a la caracterización de esta.
Como se usa aquí, “autofagia” se refiere al mecanismo celular catabólico que involucra la degradación celular de componentes celulares innecesarios o disfuncionales a través de las acciones de los lisosomas.
Como se usa en la presente descripción, “célula(s) inmortalizada(s)” se refiere a una célula o población de células que evaden la senescencia celular normal y pueden proliferar indefinidamente debido a una diferencia biológica, tal como una mutación de ADN o expresión de una proteína exógena, cuya expresión o presencia, da como resultado un aumento en las capacidades de propagación en comparación con una célula promedio encontrada en la misma fuente que la(s) célula(s) inmortalizada(s). Mientras las condiciones del cultivo celular se mantengan adecuadamente, las células inmortalizadas pueden propagarse en el cultivo celular indefinidamente (número ilimitado de pases).
Como se usa en la presente descripción, “célula(s) de vida prolongada” se refiere a una célula o población de células que pueden cultivarse durante al menos entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20 pases más que una(s) célula(s) normal(es) o sin vida prolongada que se encuentra(n) en la misma fuente. La capacidad de proliferar durante de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 pases más puede ser el resultado de una diferencia biológica, tal como una mutación de ADN o la expresión de una proteína exógena, entre la célula endometriósica de vida prolongada y una célula endometriósica normal.
Como se usa en la presente descripción con referencia a la relación entre ADN, ADNc, ARNc, ARN y otros nucleótidos y polinucleótidos y proteínas/péptidos, el término “correspondiente a” se refiere a la relación biológica subyacente entre estas diferentes moléculas. Como tal, un experto en la técnica entendería que operativamente “correspondiente a” puede dirigirlos a determinar las posibles secuencias subyacentes y/o resultantes de otras moléculas dada la secuencia de cualquier otra molécula que tenga una relación biológica similar con estas moléculas. Por ejemplo, a partir de una secuencia de ADN puede determinarse una secuencia de ARN y a partir de una secuencia de a Rn puede determinarse una secuencia de ADNc.
Como se usa en la presente descripción, “célula(s) endometriósica(s) de vida prolongada” se refiere a una célula endometriósica que adquirió una diferencia biológica, tal como una mutación de ADN o la expresión de una proteína exógena, cuya expresión o presencia da como resultado un aumento en las capacidades de propagación de la(s) célula(s) endometriósica(s) en comparación con las células endometriósicas normales o no extendidas. La(s) célula(s) endometriósica(s) de vida prolongada pueden tener la capacidad de proliferar en cultivo durante de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 pases más en comparación con las células endometriósicas normales o sin vida prolongada.
Tal como se usa en la presente descripción, “población de células personalizada” se refiere a una población de células que contiene progenie in vitro de una célula derivada de una lesión endometriósica de un sujeto que necesita tratamiento, donde la población de células es adecuada para determinar las características de la lesión endometriósica del sujeto particular y comprobar la eficacia de los tratamientos directamente en las células de la lesión endometriósica.
Como se usa en la presente descripción, “inhibidor autofágico” se refiere a un compuesto, moléculas (por ejemplo, ADN, ARN, proteínas (por ejemplo, anticuerpos) u otra sustancia que interactúa con un transcrito, proteína, u otra molécula que participa en la vía de autofagia, de manera tal que la autofagia se reduce en comparación con un control.
Tal como se usa en la presente descripción, “derivado” se refiere a cualquier compuesto que tenga la misma o una estructura central similar al compuesto pero que tenga al menos una diferencia estructural, que incluye la sustitución, eliminación, y/o adición de uno o más átomos o grupos funcionales. El término “derivado” no significa que el derivado se sintetice a partir del compuesto original como material de partida o intermedio, aunque este puede ser el caso. El término “derivado” puede incluir sales, profármacos, o metabolitos del compuesto original. Los derivados incluyen compuestos en los que los grupos amino libres en el compuesto original se derivaron para formar clorhidratos de amina, p-tolueno sulfoamidas, benzoxicarboamidas, t-butiloxicarboamidas, derivados de tipo tiouretano, trifluoroacetilamidas, cloroacetilamidas, o formamidas. Los derivados incluyen compuestos en los que los grupos carboxilo del compuesto original se derivaron para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidracidas. Los derivados incluyen compuestos en los que los grupos hidroxilo en el compuesto original se derivaron para formar derivados O-acilo u O-alquilo. Los derivados incluyen compuestos en los que un grupo donante de enlaces de hidrógeno en el compuesto original se reemplaza con otro grupo donante de enlaces de hidrógeno, tal como OH, NH, o SH. Los derivados incluyen la sustitución de un grupo aceptor de enlaces de hidrógeno en el compuesto original con otro grupo aceptor de enlaces de hidrógeno, tales como ésteres, éteres, cetonas, carbonatos, aminas terciarias, iminas, tionas, sulfonas, amidas terciarias, y sulfuros.
Como se usa en la presente descripción, “aislado” significa separado de los constituyentes, celulares y de otro tipo, con los que el polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo, o fragmentos de estos normalmente se asocian en la naturaleza. Un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo, o fragmentos de estos que no son de origen natural, no requieren “aislamiento” para distinguirlos de su homólogo de origen natural.
Como se usa en la presente descripción, “unión específica”, “unido específicamente” y similares, se refieren a la unión que se produce entre tales especies emparejadas como nucleótido/nucleótido, enzima/sustrato, receptor/agonista, anticuerpo/antígeno, y lectina/carbohidrato que puede mediarse por interacciones covalentes o no covalentes o una combinación de interacciones covalentes y no covalentes. Cuando la interacción de las dos especies produce un complejo unido de forma no covalente, la unión que se produce suele ser electrostática, por enlaces de hidrógeno, o el resultado de interacciones lipofílicas. En consecuencia, la “unión específica” se produce entre especies emparejadas cuando existe una interacción entre las dos que produce un complejo unido que tiene las características de una interacción anticuerpo/antígeno o enzima/sustrato. En particular, la unión específica se caracteriza por la unión de un miembro de un par a una especie particular y a ninguna otra especie dentro de la familia de compuestos a la que pertenece el miembro correspondiente del miembro de unión. Así, por ejemplo, un anticuerpo se une, preferentemente, a un solo epítopo y a ningún otro epítopo dentro de la familia de proteínas. Como se usa en la presente descripción, “aptámero” se refiere a moléculas de ADN o ARN de simple cadena que pueden unirse a objetivos preseleccionados, que incluyen proteínas con alta afinidad y especificidad. Su especificidad y características no se determinan directamente por su secuencia primaria, sino por su estructura terciaria.
Tal como se usa en la presente descripción, “expresado diferencialmente” se refiere a la producción diferencial de ARN, que incluye, pero sin limitarse a, ARNm, ARNt, miARN, ARNip, ARNnp y piARN transcritos a partir de un gen o región reguladora de un genoma o el producto proteico codificado por un gen en comparación con el nivel de producción de ARN o proteína por el mismo gen o región reguladora en una célula normal o de control. En otro contexto, “expresado diferencialmente” también se refiere a secuencias de nucleótidos o proteínas en una célula o tejido que tienen diferentes perfiles de expresión temporal y/o espacial en comparación con una célula normal o de control.
Como se usa en la presente descripción, “separado” se refiere al estado de estar físicamente dividido de la fuente o población original de manera tal que el compuesto, agente, partícula, o molécula separados ya no pueden considerarse parte de la fuente o población original.
Como se usa en la presente descripción, “expresión” se refiere al proceso mediante el cual los polinucleótidos se transcriben en transcritos de ARN. En el contexto del ARNm y otras especies de ARN traducidas, “expresión” también se refiere al proceso o procesos mediante los cuales el ARN transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos, o proteínas.
Como se usa en la presente descripción, “péptido” se refiere a dos o más aminoácidos en los que el grupo carboxilo alfa de un aminoácido se une al grupo amino alfa de otro aminoácido. Las cadenas de 10 o más aminoácidos también se denominan en la presente descripción “polipéptidos” o “proteínas”.
Como se usa en la presente descripción, “polipéptidos” o “proteínas” son secuencias de residuos de aminoácidos. Esas secuencias se escriben de izquierda a derecha en la dirección del extremo amino al carboxi. De acuerdo con la nomenclatura estándar, las secuencias de residuos de aminoácidos se denominan mediante un código de tres letras o de una sola letra como se indica a continuación: alanina (Ala, A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutámico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), Lisina (Lys, K), Metionina (Met, M), Fenilalanina (Phe, F), Prolina (Pro, P), Serina (Ser, S), Treonina (Thr, T), Triptófano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y), y valina (Val, V).
Como se usa en la presente descripción, “gen” se refiere a una unidad hereditaria que corresponde a una secuencia de ADN que ocupa una ubicación específica en un cromosoma y que contiene la instrucción genética para una(s) característica(s) o rasgo(s) en un organismo. “Gen” también se refiere a la secuencia específica de ADN que se transcribe en un transcrito de ARN que puede traducirse en un polipéptido o ser una molécula de ARN catalítica que incluye, pero sin limitarse a, ARNt, ARNip, piARN, miARN, y ARNhc.
Como se usa en la presente descripción, “ácido desoxirribonucleico (ADN)” y “ácido ribonucleico (ARN)” generalmente se refieren a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. El ARN puede estar en forma de ARNt (ARN de transferencia), ARNnp (ARN nuclear pequeño), ARNr (ARN ribosomal), ARNm (ARN mensajero), ARN antisentido, ARNi (construcción de interferencia de ARN), ARNip (ARN de interferencia pequeño), microARN (miARN) o ribozimas.
Como se usa en la presente descripción, “secuencia de ácido nucleico” y “oligonucleótido” también abarca un ácido nucleico y un polinucleótido como se define anteriormente.
Como se usa en la presente descripción, “molécula de ADN” incluye ácidos nudeicos/polinudeótidos que se componen de ADN.
Como se usa en la presente descripción, “ácido nucleico” y “polinudeótido” generalmente se refieren a una cadena de al menos dos combinaciones de base-azúcar-fosfato y se refiere, entre otros, a ADN de simple y doble cadena, ADN que es una mezcla de regiones de simple y doble cadena, ARN de simple y doble cadena, y ARN que es una mezcla de regiones de simple y doble cadena, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de simple cadena o, más típicamente, de cadena doble o un mezcla de regiones de simple y doble cadena. En adición, polinucleótido, como se usa en la presente descripción, se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir la totalidad de una o más de las moléculas, pero más típicamente implican sólo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. “Polinucleótido” y “ácidos nucleicos” también abarcan tales formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, que incluyen células simples y complejas, entre otras. Por ejemplo, el término polinucleótido incluye ADN o ARN como se describe anteriormente que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiladas, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos como se usa el término en la presente descripción. “Polinucleótido” y “ácidos nucleicos” también incluyen PNA (ácidos nucleicos peptídicos), fosforotioatos, y otras variantes de la cadena principal de fosfato de los ácidos nucleicos nativos. Los ácidos nucleicos naturales tienen una cadena principal de fosfato, los ácidos nucleicos artificiales pueden contener otros tipos de cadenas principales, pero contienen las mismas bases. Por lo tanto, los ADN o ARN con estructuras modificadas para la estabilidad o por otras razones son “ácidos nucleicos” o “polinucleótidos” en el sentido en que se entiende este término en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, “microARN” se refiere a una pequeña molécula de ARN no codificante que contiene de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos que se encuentra en los organismos, que funciona en la regulación transcripcional y postranscripcional de la transcripción y traducción del ARN.
Como se usa en la presente descripción, “purificado” se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico, péptido o polipéptido u otro compuesto descrito en la presente descripción que tiene una mayor pureza en relación con el entorno natural.
Como se usa en la presente descripción, “alrededor de”, “aproximadamente”, y similares, cuando se usan en relación con una variable numérica, generalmente se refieren al valor de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95 % para la media) o dentro de ±10 % del valor indicado, el que sea mayor.
Tal como se usa en la presente descripción, “control” es un sujeto o muestra alternativo que se usa en un experimento con fines de comparación y se incluye para minimizar o distinguir el efecto de variables distintas de una variable independiente. Un “control” puede ser un control positivo, un control negativo, o un control de ensayo o reacción (un control interno de un ensayo o reacción que se incluye para confirmar que el ensayo fue funcional). En algunos casos, el control positivo o negativo también puede ser el control del ensayo o de la reacción.
Como se usa en la presente descripción, “forma de dosificación” o “forma de dosificación unitaria” se refiere a una formulación farmacéutica que se administra a un sujeto que necesita tratamiento y generalmente puede estar en forma de tabletas, cápsulas, sobres que contienen polvo o gránulos, soluciones líquidas o suspensiones, parches, y similares.
Tal como se usa en la presente descripción, “cantidad efectiva” puede referirse a la cantidad de un compuesto o molécula que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal, o ser humano que busca el investigador, veterinario, médico u otro clínico. La cantidad efectiva variará en dependencia del compuesto o molécula, el trastorno o condición (normal o anormal) y su gravedad, la vía de administración, tiempo de administración, tasa de excreción, fármaco o compuesto, juicio del investigador, veterinario, médico u otro clínico, forma de dosificación, y la edad, peso, salud general, sexo y/o dieta del sujeto a tratar. “Cantidad efectiva” puede referirse a la cantidad de un inhibidor autofágico, tal como HCQ, que puede tratar, mitigar, o prevenir la endometriosis, una lesión endometriósica, u otro síntoma de esta. La “cantidad efectiva” puede referirse a la cantidad de un inhibidor autofágico, tal como HCQ, que puede prevenir, mitigar y/o reducir la formación de nuevas lesiones endometriósicas y/o prevenir la progresión o el cambio de etapa de la endometriosis. Los términos “suficiente” y “efectiva”, como se usan en la presente descripción de manera intercambiable, pueden referirse a una cantidad (por ejemplo, masa, volumen, dosificación, concentración, y/o período de tiempo) necesaria para lograr uno o más resultados deseados. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a una cantidad necesaria para lograr uno o más efectos terapéuticos.
Como se usa en la presente descripción, “concentrado” se usa en referencia a una cantidad de una molécula, compuesto, o composición, que incluye, pero sin limitarse a, un compuesto químico, polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo, o fragmentos de estos, que indica que la muestra se distingue de su contraparte natural en que la concentración o número de moléculas por volumen es mayor que la de su contraparte natural. Como se usa en la presente descripción, “diluido” se usa en referencia a una cantidad de una molécula, compuesto, o composición que incluye, pero sin limitarse a, un compuesto químico, polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmentos de estos, que indica que la muestra se distingue de su contraparte natural en que la concentración o número de moléculas por volumen es menor que la de su contraparte natural.
Como se usa en la presente descripción, “formulación farmacéutica” se refiere a la combinación de un agente activo, compuesto, o ingrediente con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, que hace que la composición sea adecuada para uso diagnóstico, terapéutico, o preventivo in vitro, in vivo, o ex vivo.
Como se usa en la presente descripción, “vehículo, diluyente, aglutinante, lubricante, deslizante, conservante, agente saborizante, agente colorante, y excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo, diluyente, aglutinante, lubricante, deslizante, conservante, agente saborizante, agente colorante, o excipiente que es útil en la preparación de una formulación farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica, y no es biológicamente o de cualquier otra manera indeseable, e incluye un vehículo o excipiente que es aceptable para uso veterinario así como también para uso farmacéutico humano.
Como se usa en la presente descripción, “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier sal derivada de ácidos orgánicos e inorgánicos de un compuesto descrito en la presente descripción. La sal farmacéuticamente aceptable también se refiere a una sal de un compuesto descrito que tiene un grupo funcional ácido, tal como un grupo funcional de ácido carboxílico, y una base. La sal farmacéuticamente aceptable también incluye hidratos de una sal de un compuesto descrito en la presente descripción.
Como se usa de manera intercambiable en la presente descripción, “sujeto”, “individuo”, o “paciente”, se refiere a un vertebrado, preferentemente, un mamífero, con mayor preferencia un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, murinos, simios, humanos, animales de granja, animales para deportes, y mascotas. El término “mascota” incluye un perro, gato, conejillo de indias, ratón, rata, conejo, hurón, y similares. El término animal de granja incluye caballo, oveja, cabra, pollo, cerdo, vaca, burro, llama, alpaca, pavo, y similares.
Como se usa en la presente descripción, “biocompatible” o “biocompatibilidad” se refiere a la capacidad de un material para usarse por un paciente sin provocar una respuesta adversa o de cualquier otra manera inapropiada del hospedero en el paciente al material o a un derivado activo de este, tal como un metabolito, en comparación con la respuesta del hospedero en un paciente normal o de control.
Como se usa en la presente descripción, “terapéutico” se refiere a curar o tratar un síntoma de una enfermedad o afección.
El término “tratar”, como se usa en la presente descripción, puede incluir inhibir y/o resolver la enfermedad, trastorno o condición, por ejemplo, impedir su progreso; y aliviar la enfermedad, trastorno, o condición, por ejemplo, provocar la regresión de la enfermedad, trastorno, y/o condición. El tratamiento de la enfermedad, trastorno, o afección puede incluir mejorar al menos un síntoma de la enfermedad, trastorno, o afección en particular, incluso si la fisiopatología subyacente no se afecta, tal como tratar el dolor de un sujeto mediante la administración de un agente analgésico a pesar de que tal agente no trata la causa del dolor. “Tratar” puede referirse a reducir un síntoma de endometriosis, tal como reducir el tamaño de una lesión, reducir la recurrencia de lesiones endometriósicas, prevenir la aparición de nuevas lesiones, y/o prevenir o retrasar la progresión de la endometriosis a una etapa diferente.
El término “prevenir”, como se usa en la presente descripción, incluye evitar que ocurra una enfermedad, trastorno, o afección en un sujeto, que puede estar predispuesto a la enfermedad, trastorno, y/o afección pero que aún no se diagnosticó que la tenga. Como se usa en la presente descripción, “preventivo” puede referirse a impedir o detener una enfermedad o afección antes de que ocurra o mientras la enfermedad o afección aún se encuentra en la fase subclínica. “Prevenir” puede referirse a retrasar o detener la recurrencia de lesiones endometriósicas; detener, mitigar, y/o retrasar la aparición de nuevas lesiones endometriósicas; detener, mitigar, y/o retrasar la progresión de la endometriosis en un individuo.
Como se usa en la presente descripción, “mitigar” puede referirse a reducir una característica particular, síntoma, u otro parámetro biológico o fisiológico asociado con una enfermedad o trastorno, tal como la endometriosis.
Como se usa en la presente descripción, “separado” se refiere al estado de estar físicamente separado de la fuente o población original, de manera tal que el compuesto, agente, partícula, compuesto químico, o molécula separados ya no pueden considerarse parte de la fuente o población original.
Como se usa en la presente descripción, “medio tangible de expresión” se refiere a un medio que es físicamente tangible y no es un mero pensamiento abstracto o una palabra hablada no registrada. Los medios de expresión tangibles incluyen, pero sin limitarse a, palabras en un material celulósico o plástico o datos almacenados en un dispositivo adecuado, tal como una memoria flash o un CD-ROM.
Como se usa en la presente descripción, “derivado activo” y similares se refieren a un derivado de un inhibidor autofágico, tal como HCQ, que conserva la capacidad de tratar/mitigar la proliferación de células plasmáticas y/o las complicaciones secundarias asociadas con la endometriosis. Los expertos en la técnica conocen ensayos para probar la capacidad de un derivado activo para actuar de esta manera.
Como se usa en la presente descripción, “metabolito” se refiere a sustancias que resultan del metabolismo de un compuesto, tal como un agente activo de una formulación farmacéutica, tal como HCQ.
Como se usa en la presente descripción, “metabolito activo” se refiere a un metabolito que induce un efecto farmacéutico o clínico, tal como el tratamiento o la prevención de la endometriosis o un síntoma de esta, en un sujeto.
Como se usa en la presente descripción, “metabolito primario” se refiere a un metabolito que participa directamente en el crecimiento, desarrollo, y/o reproducción de una célula u organismo.
Como se usa en la presente descripción, “metabolito secundario” se refiere a un metabolito que no participa directamente en el crecimiento, desarrollo, y/o reproducción de una célula u organismo.
Como se usa en la presente descripción, “molécula de captura” se refiere a una molécula que se configura para unirse específicamente a una o más moléculas biomarcadoras de interés. Una molécula de captura puede ser un polinucleótido, anticuerpo, antígeno, patrón, aficuerpo, polipéptidos, péptidos o combinaciones de estos que se unen específicamente a uno o más biomarcadores de interés. Por ejemplo, la molécula de captura puede configurarse para unirse específicamente a un polinucleótido o polipéptido correspondiente a ATG-5, ATG-7, ATG-9, DJ-1(Park7), hVps34, beclina-1, p-ULK1, ATG1(ULK1), p-mTOR, mTOR, integrina, Src, FAK, ILK, rkB, AKT, LC3A, LC3 B,TSC1, TSC2, HO-1, PTEN, ARID1A, PIK3CA, K-RAS, BCL-2, ATG16, ATG12, ATG10, ATG3, LC3-1, ATG4, EVI1, RON, EGFR, SnoN, SkiL TGFpRN, p53, Smad2/3, p-ERK, ERK, PARP, PARP escindida, p62, ferritina, E-cadherina, N-cadherina, vimentina citoqueratina-18 y/o combinaciones de estos. Las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos representativas para los biomarcadores antes mencionados y cualquier otro biomarcador descrito en la presente descripción pueden ser 100 % idénticas, 90-100 % idénticas, 80-90 % idénticas, 70-80 % idénticas, 60-70 % idénticas, o 50-100 % idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-314 o 100 % idénticas, 90-100 % idénticas, 80-90 % idénticas, 70-80 % idénticas, 60-70 % idénticas, o 50-100 % idénticas a una secuencia correspondiente a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-314.
Como se usa en la presente descripción, “esencialmente discreto” aplicado a las características de una matriz se refiere a la situación en la que el 90 % o más de las características de una matriz no están en contacto directo con otras características de la misma matriz.
Tal como se usa en la presente descripción, “unido” aplicado a moléculas de captura de una matriz se refiere a una interacción o enlace covalente entre una molécula en la superficie del soporte y la molécula de captura para inmovilizar la molécula de captura en la superficie del soporte.
Tal como se usa en la presente descripción, "unido operativamente" aplicado a moléculas de captura de una matriz se refiere a una interacción no covalente entre la superficie del soporte y la molécula de captura para inmovilizar la molécula de captura sobre la superficie del soporte. Tales interacciones no covalentes incluyen, pero sin limitarse a, atrapamiento por el sustrato de la superficie, enlaces iónicos, interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Walls, interacciones dipolo-dipolo, interacciones dipolo-dipolo inducido, fuerzas de dispersión de London, enlace de hidrógeno, enlace de halógeno, interacciones electromagnéticas, interacciones n-n, interacciones catión-n, interacciones anión-n, interacciones polares n, y efectos hidrofóbicos.
Como se usa en la presente descripción, “biomarcador” puede referirse a cualquier molécula medible, que incluye, pero sin limitarse a, polinucleótidos y polipéptidos, o compuestos en un sujeto cuya presencia, cantidad absoluta, o cantidad relativa, es indicativa de alguna enfermedad, condición, síndrome, trastorno, o síntoma de este, o estado de este, tal como endometriosis.
Como se usa en la presente descripción, “fluido corporal” se refiere a cualquier líquido o sustancia similar a un líquido que se origina en el cuerpo de un organismo vivo. “Fluido corporal” incluye, entre otros, sangre entera, suero, capa leucocitaria de sangre u otra fracción de sangre que contiene sustancialmente solo glóbulos blancos y plaquetas, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, linfa, bilis y saliva.
Tal como se usa en la presente descripción, “aficuerpo” se refiere a una proteína diseñada que es un mimético de anticuerpos y puede unirse específicamente a una molécula diana, y se basa en un dominio de haz de tres hélices, donde cada una de las tres hélices contiene un polipéptido que tiene aproximadamente 58 aminoácidos.
Como se usa en la presente descripción, “variante” se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido de referencia, pero conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Un polipéptido variante y de referencia puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, adiciones, y/o eliminaciones). Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no codificarse por el código genético. Una variante de un polipéptido puede ser de origen natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que es de origen natural.
Como se usa en la presente descripción, “tipo salvaje” se refiere a la forma típica de un organismo, variedad, cepa, gen, proteína, o característica tal como se presenta en la naturaleza, a diferencia de las formas mutantes que pueden resultar de la reproducción selectiva o la transformación con un transgén.
Como se usa en la presente descripción, “diagnóstico” se refiere a la identificación o determinación de la naturaleza y circunstancias de una enfermedad, trastorno, condición, síndrome, o síntoma de este en un sujeto.
Como se usa en la presente descripción, “pronóstico” se refiere a determinar un pronóstico para una enfermedad, trastorno, afección, síndrome, o síntoma de estos.
Tal como se usa en la presente descripción, “pronóstico” se refiere a una predicción o previsión de una posibilidad de recuperación, completa o parcial, de una enfermedad, trastorno, afección, síndrome, o síntoma de este.
Tal como se usa en la presente descripción, “población de células personalizada” o “célula personalizada” se refieren a las células o una población autóloga de células que son una población de células in vitro o una célula que puede usarse para diagnosticar y/o pronosticar a un individuo y/o probar la respuesta del individuo a un tratamiento. Como se usa en la presente descripción, “emolientes” se refiere a un agente aplicado externamente que suaviza o alivia la piel y generalmente se conocen en la técnica y se enumeran en compendios, tal como el "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4a Ed., Pharmaceutical Press, 2003.
Como se usa en la presente descripción, “surfactantes" se refiere a agentes surfactantes que disminuyen la tensión superficial y por lo tanto aumentan las propiedades emulsionantes, espumantes, dispersantes, esparcidoras y humectantes de un producto.
Como se usa en la presente descripción, “emulsionantes” se refiere a sustancias activas superficiales que promueven la suspensión de un líquido en otro y promueven la formación de una mezcla estable, o emulsión, de aceite y agua.
Como se usa en la presente descripción, “aceite” se refiere a una composición que contiene al menos aproximadamente el 95 % en peso de una sustancia lipofílica. Los ejemplos de sustancias lipofílica incluyen, pero sin limitarse a, aceites, grasas, ácidos grasos, lecitinas, triglicéridos naturales y sintéticos y combinaciones de estos. Tal como se usa en la presente descripción, “emulsión” es una composición que contiene una mezcla de componentes no miscibles combinados homogéneamente. Los componentes no miscibles pueden incluir un componente lipofílico y un componente acuoso. “Emulsión” también puede referirse a una preparación de un líquido distribuido en pequeños glóbulos por todo el cuerpo de un segundo líquido. El primer líquido es la fase discontinua y el segundo líquido es la fase continua. Cuando el aceite es el primer líquido y el agua o una solución acuosa es el segundo líquido, se hace referencia en la presente descripción como una “emulsión de aceite en agua”. Cuando el agua o una solución acuosa es el primer líquido y el aceite o la sustancia oleaginosa es el segundo líquido, se hace referencia en la presente descripción como emulsión de “agua en aceite”. Tanto la fase oleosa como la fase acuosa, o ambas, pueden contener uno o más surfactantes, emulsionantes, estabilizadores de emulsión, tampones, y otros excipientes. Algunas emulsiones pueden ser geles o incluir de cualquier otra manera un componente de gel.
Como se usa en la presente descripción, “loción” se refiere a una formulación líquida de viscosidad baja a media. Las “lociones” pueden contener sustancias finamente pulverizadas que son insolubles en el medio de dispersión mediante el uso de agentes de suspensión y agentes dispersantes. Las “lociones” también pueden tener como fase dispersa sustancias líquidas que son inmiscibles con el vehículo y normalmente se dispersan por medio de agentes emulsionantes u otros estabilizadores adecuados.
Como se usa en la presente descripción, “crema” se refiere a un líquido viscoso o una emulsión semisólida del tipo “aceite en agua” o “agua en aceite”.
Como se usa en la presente descripción, “ungüento” se refiere a una preparación semisólida que contiene una base de ungüento y opcionalmente uno o más agentes activos.
Como se usa en la presente descripción en el contexto de las formulaciones farmacéuticas, “gel” se refiere a un sistema semisólido que contiene dispersiones del inhibidor autofágico en un vehículo líquido que se vuelve semisólido por la acción de un agente espesante o material polimérico (“agente gelificante”) disuelto o suspendido en el vehículo líquido. El líquido puede incluir un componente lipofílico, un componente acuoso o ambos. Los “geles” también pueden ser emulsiones. Sin embargo, algunos geles no son emulsiones porque no contienen una mezcla homogeneizada de componentes inmiscibles.
Discusión
La endometriosis es una enfermedad ginecológica que afecta a las mujeres en edad fértil. Aunque en sí misma es benigna, es una afección muy dolorosa caracterizada por lesiones endometriósicas en sitios ectópicos que conducen a la infertilidad y a un mayor riesgo de subtipos específicos de cáncer de ovario.
Se cree que la endometriosis es el resultado de eventos biológicos o fisiológicos que se asemejan a la metástasis que pueden caracterizarse en 6 etapas: (1) desprendimiento de células, (2) supervivencia celular, (3) escape de la vigilancia inmunológica, (4) adhesión al peritoneo, (5) angiogénesis, y (6) sangrado. Aunque la formación de una lesión endometriósica depende de la combinación de estos eventos, la primera etapa, la supervivencia, que, si ocurre, permitirá que las células se implanten y se desarrollen en una lesión endometriósica y, por lo tanto, desempeña una función importante en la patogénesis de la endometriosis. De hecho, las características alteradas de muerte celular en el endometrio eutópico de mujeres con endometriosis contribuirán a la supervivencia de las células endometriales retrógradas.
Anoikis es un evento de muerte celular debido a la disminución de la adhesión celular y la eliminación de las células desprendidas del sustrato. Por lo tanto, anoikis evitará que las células epiteliales se desprendan de su ubicación original (células “fuera de lugar”) para colonizar en sitios ectópicos. En el cáncer, la resistencia a anoikis conduce a metástasis tumorales.
Los mecanismos de resistencia a anoikis incluyen (1) adquisición de un fenotipo similar a la transición epitelialmesenquimatosa (EMT), (2) activación de integrina y mediadores de señalización aguas abajo (es decir, Src, FAK e ILK), (3) aumento de la expresión de TrkB, un receptor de tirosina quinasa neurotrófico (supresor de anoikis asociado a caspasa) en pacientes con endometriosis y determinados tipos de cáncer asociados con metástasis de cáncer y activación de la vía PI3K/AKT favorable a la supervivencia y (4) autofagia que promueve la supervivencia y conduce a una mayor unión a la matriz extracelular (ECM). La autofagia, un mecanismo de supervivencia que se activa en respuesta a múltiples tensiones, es un proceso de “autoconsumo” mediante el cual el material celular y los orgánulos dañados son secuestrados en autofagosomas y degradados. La autofagia permite que las células sobrevivan dado que se vuelven a adherir a la ECM en el momento oportuno. Curiosamente, la autofagia inducida por desprendimiento resulta directamente de una pérdida de compromiso de integrina-ECM. Las células epiteliales dependen de la adhesión celular mediada por integrinas a la ECM para un crecimiento y supervivencia adecuados! Las vías que vinculan la pérdida de compromiso de la integrina en la superficie celular con la activación de la maquinaria autofágica aún son esquivas.
En resumen, las células epiteliales, tales como las células endometriales, dependen de la adhesión celular mediada por integrinas a la ECM para un crecimiento y supervivencia adecuados. El desprendimiento de células de la ECM conduce a anoikis, un evento de muerte celular, que previene la colonización de células en sitios ectópicos. Si se induce la autofagia, las células escaparán de la anoikis y sobrevivirán. La autofagia, un proceso de “autoconsumo” mediante el cual el material celular dañado y los orgánulos son secuestrados en autofagosomas y degradados, es un mecanismo de supervivencia activado en respuesta a múltiples tensiones. Como se demuestra en la presente descripción, la desregulación de la autofagia en las células endometriósicas contenidas en las lesiones endometriales contribuye a la supervivencia celular aberrante. Con esto en mente, en una modalidad, se administra un inhibidor autofágico a un sujeto que tiene endometriosis. En otras modalidades, una célula endometriósica se pone en contacto con un inhibidor autofágico. Mediante la inhibición de la autofagia, puede reducirse al menos un síntoma de endometriosis, tal como el tamaño de la lesión.
Hasta ahora, no se sabía que un síntoma de endometriosis pudiera aliviarse o mitigarse mediante la inhibición de la autofagia en células endometriales o células endometriósicas. De hecho, se desconocía cómo la autofagia y su desregulación afectan la supervivencia de las células endometriales y su contribución al desarrollo de lesiones endometriósicas. Esto probablemente se deba, en parte, a que la endometriosis es un tumor benigno y la autofagia solo se correlacionó con tumores metastásicos que generalmente se asocian con tumores cancerosos invasivos. Dicho esto, en la presente descripción se divulgan composiciones, formulaciones, métodos, y ensayos que pueden mejorar el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de la endometriosis y las lesiones endometriósicas. Otras composiciones, compuestos, métodos, características y ventajas de la presente divulgación serán evidentes para un experto en la técnica tras el examen de los siguientes dibujos, descripción detallada, y ejemplos. Se pretende que todas estas composiciones, compuestos, métodos, características, y ventajas adicionales se incluyan dentro de esta descripción y estén dentro del alcance de la presente divulgación.
Líneas celulares
En la presente descripción se describen poblaciones de células de vida prolongada generadas a partir de lesiones endometriósicas después del cultivo in vitro. En una modalidad, una población de células de vida extendida contiene una célula endometriósica, donde la célula endometriósica es la progenie in vitro de una célula aislada de una lesión endometriósica, y donde la célula endometriósica puede tener una mayor expresión proteica de uno o más de los siguientes marcadores autofágicos seleccionados del grupo de ATG7, ATG5, y hVps34 en comparación con una célula de control no endometriósica adecuada u otra célula de control. Las células de control no endometriósicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de cáncer de ovario, células epiteliales de ovario no enfermas, y células epiteliales de ovario superficial (T80). En algunas modalidades, las células de vida prolongada también expresan el antígeno T grande.
La población de células de vida prolongada puede usarse como una herramienta de investigación para evaluar la efectividad y la seguridad de los compuestos para tratar la endometriosis. En algunas modalidades, la población de células es una población de células personalizada. Esto permite determinar la eficacia de los tratamientos sobre las células de lesiones endometriósicas del sujeto que recibirá el tratamiento.
Las células endometriósicas de vida prolongada pueden prepararse a partir de células endometriósicas primarias. Las células endometriósicas primarias pueden mantenerse en una mezcla 1:1 de Medio 199 y Medio MCDB131 complementado con aproximadamente un 8 % de suero fetal bovino, penicilina (100 U/mL; diluida 1:100 en medio de cultivo completo)/estreptomicina (100 mg/mL; diluida 1:100 en medio de cultivo completo), e insulina (5mg/mL) /transferrina (5mg/mL) /selenio (ITS) (5 pg/mL).
En algunas modalidades, las células endometriósicas primarias se transforman para expresar el oncogén de manera ubicua o condicional. En otras modalidades, las células endometriósicas primarias se infectan con partículas virales que portan un gen del antígeno T grande de SV40, de manera tal que las células transformadas expresan un antígeno T grande de SV40.
Formulaciones farmacéuticas
En la presente descripción se proporcionan formulaciones farmacéuticas que contienen una cantidad efectiva de un inhibidor autofágico o un derivado activo de este en un vehículo farmacéutico apropiado para la administración a un individuo que lo necesite. El individuo que lo necesita puede tener o puede sospecharse que tiene endometriosis o una lesión endometriósica. Las formulaciones pueden administrarse por vía oral, intravenosa, intramuscular, intravaginal, intraperitoneal, rectal, parenteral, tópica, intranasal, o subcutánea. Los inhibidores autofágicos adecuados incluyen, entre otros, cloroquina, hidroxicloroquina (también denominada en la presente descripción HCQ) y Lys05, sales farmacéuticamente aceptables de cloroquina, sales farmacéuticamente aceptables de hidroxicloroquina, sales farmacéuticamente aceptables de Lys05, anticuerpos que se unen específicamente a un inductor positivo de autofagia en células endometriales, ARNip, miARN, piARN u otras especies de ARN que se unen específicamente a un inductor positivo de autofagia en células endometriales, y otras moléculas, compuestos, o sustancias que se unen o de cualquier otra manera interactúan con una proteína u otra molécula implicada en mantener o aumentar la autofagia para reducir la autofagia en la célula.
Formulaciones parenterales
El inhibidor autofágico o el derivado activo de este puede formularse para administración parenteral, tal como inyección o infusión, en forma de solución o suspensión. El inhibidor autofágico puede ser HCQ o una de sus sales farmacéuticas. La formulación puede administrarse por cualquier vía, tal como el torrente sanguíneo o directamente al órgano o tejido a tratar.
Las formulaciones parenterales pueden prepararse como composiciones acuosas mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica. Típicamente, tales composiciones pueden prepararse como formulaciones inyectables, por ejemplo, soluciones o suspensiones; formas sólidas adecuadas para usar para preparar soluciones o suspensiones mediante la adición de un medio de reconstitución antes de la inyección; emulsiones, tales como emulsiones de agua en aceite (w/o), emulsiones de aceite en agua (o/w) y microemulsiones de estas, liposomas, o emulsiones. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, uno o más polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), aceites, tales como aceites vegetales (por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de maíz, aceite de sésamo, etc.), y combinaciones de estos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y/o mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico.
Las soluciones y dispersiones del inhibidor autofágico o su derivado activo pueden prepararse en agua u otro solvente o medio dispersante adecuadamente mezclado con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen, pero sin limitarse a, surfactantes, dispersantes, emulsionantes, agentes modificadores del pH, y combinaciones de estos.
Los surfactantes adecuados pueden ser agentes surfactantes aniónicos, catiónicos, anfóteros o no iónicos. Los surfactantes aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen iones carboxilato, sulfonato y sulfato. Los surfactantes aniónicos adecuados incluyen sodio, potasio, amonio o alquilsulfonatos de cadena larga y alquilarilsulfonatos tales como dodecilbencenosulfonato de sodio; sulfosuccinatos de dialquil sodio, tales como sulfonato de dodecilbenceno de sodio; sulfosuccinatos de dialquil sodio, tales como bis-(2-etiltioxil)-sulfosuccinato de sodio; y sulfatos de alquilo tales como laurilsulfato de sodio. Los surfactantes catiónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, compuestos de amonio cuaternario tales como cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, bromuro de cetrimonio, cloruro de estearil dimetilbencilamonio, polioxietileno y amina de coco. Los surfactantes no iónicos adecuados incluyen monoestearato de etilenglicol, miristato de propilenglicol, monoestearato de glicerilo, estearato de glicerilo, poligliceril-4-oleato, acilato de sorbitán, acilato de sacarosa, laurato de PEG-150, monolaurato de PEG-400, monolaurato de polioxietileno, polisorbatos, polioxietilen octilfeniléter, PEG- 1000 éter cetílico, éter tridecílico de polioxietileno, éter butílico de polipropilenglicol, Poloxamer® 401, estearoil monoisopropanolamida, y amida de sebo hidrogenado con polioxietileno. Los ejemplos de surfactantes anfóteros incluyen N-dodecil-p-alanina de sodio, N-lauril-p-iminodipropionato de sodio, miristoanfoacetato, lauril betaína y lauril sulfobetaína.
La formulación puede contener un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Los conservantes adecuados incluyen, entre otros, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y timerosal. La formulación también puede contener un antioxidante para evitar la degradación del inhibidor autofágico o un derivado activo de este. La formulación puede tamponarse a un pH de 3-8 para administración parenteral tras la reconstitución. Los tampones adecuados incluyen, entre otros, tampones de fosfato, tampones de acetato, y tampones de citrato.
Pueden usarse polímeros solubles en agua en las formulaciones para administración parenteral. Los polímeros solubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a, polivinilpirrolidona, dextrano, carboximetilcelulosa, y polietilenglicol. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del inhibidor autofágico o su derivado activo en la cantidad requerida en el disolvente o medio de dispersión apropiado con uno o más de los excipientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Las dispersiones pueden prepararse mediante la incorporación de diversos inhibidores autofágicos esterilizados o derivados de estos en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. Los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante técnicas de secado al vacío y liofilización, lo que produce un polvo del inhibidor autofágico o un derivado activo de este más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de este filtrada previamente estéril. Los polvos pueden prepararse de manera tal que las partículas sean de naturaleza porosa, lo que puede aumentar la disolución de las partículas. Los métodos para fabricar partículas porosas se conocen bien en la técnica.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral pueden estar en forma de solución acuosa estéril o suspensión de partículas formadas a partir de uno o más inhibidores autofágicos o derivados activos de estos. Los disolventes aceptables incluyen, por ejemplo, agua, solución de Ringer, solución salina tamponada con fosfato (PBS), y solución isotónica de cloruro de sodio. La formulación también puede ser una solución, suspensión o emulsión estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral tal como 1,3-butanodiol.
En algunos casos, la formulación puede distribuirse o envasarse en forma líquida. En otras modalidades, las formulaciones para administración parenteral pueden envasarse como un sólido obtenido, por ejemplo, mediante liofilización de una formulación líquida adecuada. El sólido puede reconstituirse con un vehículo o diluyente adecuado antes de la administración.
Las soluciones, suspensiones, o emulsiones para administración parenteral pueden tamponarse con una cantidad efectiva de tampón necesaria para mantener un pH adecuado para la administración ocular. Los tampones adecuados incluyen, pero no se limitan a, tampones de acetato, borato, carbonato, citrato, y fosfato.
Las soluciones, suspensiones, o emulsiones para administración parenteral también pueden contener uno o más agentes de tonicidad para ajustar el intervalo isotónico de la formulación. Los agentes de tonicidad adecuados incluyen, pero no se limitan a, glicerina, manitol, sorbitol, cloruro de sodio, y otros electrolitos.
Las soluciones, suspensiones, o emulsiones para administración parenteral también pueden contener uno o más conservantes para evitar la contaminación bacteriana de las preparaciones oftálmicas. Los conservantes adecuados incluyen, pero sin limitarse a, polihexametilenbiguanidina (PHMB), cloruro de benzalconio (BAK), complejos de oxicloro estabilizado (también conocidos como Purite®), acetato de fenilmercurio, clorobutanol, ácido sórbico, clorhexidina, alcohol bencílico, parabenos, timerosal, y mezclas de estos.
Las soluciones, suspensiones, o emulsiones para administración parenteral también pueden contener uno o más excipientes, tales como agentes dispersantes, agentes humectantes, y agentes de suspensión.
Formulaciones tópicas
El inhibidor autofágico o derivado activo de este puede formularse para administración tópica. El inhibidor autofágico puede ser HCQ o una de sus sales. Las formas de dosificación adecuadas para la administración tópica incluyen cremas, pomadas, ungüentos, aerosoles, geles, lociones, emulsiones, líquidos, y parches transdérmicos. La formulación puede formularse para administración transmucosal, transepitelial, transendotelial o transdérmica. Las formulaciones tópicas pueden contener uno o más potenciadores de la penetración química, agentes de permeabilidad de la membrana, agentes de transporte de la membrana, emolientes, surfactantes, estabilizadores, y combinaciones de estos.
En algunas modalidades, los conjugados pueden administrarse como una formulación líquida, tal como una solución o suspensión, una formulación semisólida, tal como una loción o ungüento, o una formulación sólida. En algunas modalidades, el inhibidor autofágico se formula como líquidos, que incluyen soluciones y suspensiones, tales como gotas para los ojos o como una formulación semisólida, tal como ungüento o loción para aplicación tópica en la piel, la mucosa, tal como el ojo, a la vagina, o al recto.
La formulación puede contener uno o más excipientes, tales como emolientes, surfactantes, emulsionantes, potenciadores de la penetración, y similares.
Los emolientes adecuados incluyen, entre otros, aceite de almendras, aceite de ricino, extracto de ceratonia, alcohol cetoestearoílico, alcohol cetílico, cera de ésteres cetílicos, colesterol, aceite de semilla de algodón, ciclometicona, palmitostearato de etilenglicol, glicerina, monoestearato de glicerina, monooleato de glicerilo, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, lanolina, lecitina, aceite mineral ligero, triglicéridos de cadena media, aceite mineral y alcoholes de lanolina, vaselina, alcoholes de vaselina y lanolina, aceite de soja, almidón, alcohol estearílico, aceite de girasol, xilitol y combinaciones de estos. En algunas modalidades, los emolientes pueden ser estearato de etilhexilo y palmitato de etilhexilo.
Los surfactantes adecuados incluyen, entre otros, cera emulsionante, monooleato de glicerilo, éteres de polioxietilenalquilo, derivados de aceite de ricino de polioxietileno, polisorbato, ésteres de sorbitán, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, ciclodextrinas, monoestearato de glicerina, poloxámero, povidona y combinaciones de estos. En algunas modalidades, el surfactante puede ser alcohol estearílico.
Los emulsionantes adecuados incluyen, entre otros, acacia, jabones metálicos, determinados aceites animales y vegetales y diversos compuestos polares, cera emulsionante aniónica, estearato de calcio, carbómeros, alcohol cetoestearílico, alcohol cetílico, colesterol, dietanolamina, palmitostearato de etilenglicol, glicerina monoestearato, monooleato de glicerilo, hidroxipropilcelulosa, hipromelosa, lanolina hidratada, alcoholes de lanolina, lecitina, triglicéridos de cadena media, metilcelulosa, aceite mineral y alcoholes de lanolina, fosfato de sodio monobásico, monoetanolamina, cera emulsionante no iónica, ácido oleico, poloxámero, poloxámeros, polioxietileno éteres de alquilo, derivados de aceite de ricino polioxietilenado, ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilenado, estearatos de polioxietileno, alginato de propilenglicol, monoestearato de glicerilo autoemulsionante, citrato de sodio deshidratado, laurilsulfato de sodio, ésteres de sorbitán, ácido esteárico, aceite de girasol, tragacanto, trietanolamina, goma xantana y combinaciones de estos. En algunas modalidades, el emulsionante puede ser estearato de glicerol.
Las clases adecuadas de potenciadores de la penetración incluyen, entre otros, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, ácidos grasos, éteres de alcoholes grasos, aminoácidos, fosfolípidos, lecitinas, sales de colato, enzimas, aminas y amidas, agentes formadores de complejos (liposomas, ciclodextrinas, celulosas modificadas y diimidas), macrocíclicos, tales como lactonas, cetonas y anhídridos macrocíclicos y ureas cíclicas, surfactantes, N-metilpirrolidonas y derivados de estos, DMSO y compuestos relacionados, compuestos iónicos, azona y compuestos relacionados, y disolventes, como alcoholes, cetonas, amidas, polioles (por ejemplo, glicoles).
Las emulsiones adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite. Cualquiera o ambas fases de las emulsiones pueden incluir un surfactante, un agente emulsionante, y/o un material líquido no volátil no acuoso. En algunas modalidades, el surfactante puede ser un surfactante no iónico. En otras modalidades, el agente emulsionante es una cera emulsionante. En modalidades adicionales, el material no acuoso no volátil líquido es un glicol. En algunas modalidades, el glicol es propilenglicol. La fase oleosa puede contener otros excipientes oleosos farmacéuticamente aceptables adecuados. Los excipientes oleosos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitarse a, aceite de ricino hidroxilado o aceite de sésamo que pueden usarse en la fase oleosa como surfactantes o emulsionantes.
También se describen en la presente descripción lociones que contienen un inhibidor autofágico. En algunas modalidades, la loción puede estar en forma de emulsión con una viscosidad de entre 100 y 1000 centistokes. La fluidez de las lociones puede permitir una aplicación rápida y uniforme sobre una amplia superficie. Las lociones pueden formularse para que se sequen sobre la piel y dejen una fina capa de sus componentes medicinales sobre la superficie de la piel.
También se describen en la presente descripción cremas que contienen un inhibidor autofágico. La crema puede contener agentes emulsionantes y/u otros agentes estabilizantes. En algunas modalidades, la crema está en forma de una crema que tiene una viscosidad superior a 1000 centistokes, normalmente en el intervalo de 20000 a 50000 centistokes. Las cremas, en comparación con los ungüentos, pueden ser más fáciles de untar y de quitar.
Una diferencia entre una crema y una loción es la viscosidad, que depende de la cantidad/uso de diversos aceites y el porcentaje de agua usada para preparar las formulaciones. Las cremas pueden ser más espesas que las lociones, pueden tener diversos usos y pueden tener aceites/mantequillas más variados, en dependencia del efecto deseado sobre la piel. En algunas modalidades de una formulación de crema, el porcentaje de base de agua puede ser de aproximadamente 60 % a aproximadamente 75 % y la base de aceite puede ser de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % del total, los otros porcentajes son el agente emulsionante, conservantes y aditivos para un total del 100 %.
También se describen en la presente descripción ungüentos que contienen un inhibidor autofágico y una base de ungüento adecuada. Las bases de pomadas adecuadas incluyen bases de hidrocarburos (por ejemplo, vaselina, vaselina blanca, pomada amarilla y aceite mineral); bases de absorción (vaselina hidrofílica, lanolina anhidra, lanolina y crema fría); bases eliminables con agua (por ejemplo, ungüentos hidrofílicos) y bases solubles en agua (por ejemplo, ungüentos de polietilenglicol). Las pastas suelen diferir de los ungüentos en que contienen un mayor porcentaje de sólidos. Las pastas suelen ser más absorbentes y menos grasosas que los ungüentos preparados con los mismos componentes.
También se describen en la presente descripción geles que contienen un inhibidor autofágico, un agente gelificante, y un vehículo líquido. Los agentes gelificantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, celulosas modificadas, tales como hidroxipropilcelulosa e hidroxietilcelulosa; homopolímeros y copolímeros de carbopol; y combinaciones de estos. Los disolventes adecuados en el vehículo líquido incluyen, pero no se limitan a, éter monoetílico de diglicol; alquilenglicoles, tales como propilenglicol; isosorbida de dimetilo; alcoholes, tales como alcohol isopropílico y etanol. Los disolventes pueden seleccionarse por su capacidad para disolver el fármaco. También pueden incorporarse otros aditivos, que pueden mejorar la sensación en la piel y/o la emoliencia de la formulación. Tales aditivos incluyen, entre otros, miristato de isopropilo, acetato de etilo, benzoatos de alquilo C12-C15, aceite mineral, escualano, ciclometicona, triglicéridos cáprico/caprílico, y combinaciones de estos.
También se describen en la presente descripción espumas que incluyen el inhibidor autofágico. Las espumas pueden ser una emulsión en combinación con un propelente gaseoso. El propelente gaseoso puede incluir hidrofluoroalcanos (HFA). Los propulsores adecuados incluyen HFA tales como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227), pero las mezclas y componentes de estos y otros HFA que están actualmente aprobados o pueden aprobarse para uso médico son adecuados. Los propulsores pueden estar desprovistos de gases propulsores de hidrocarburo, que pueden producir vapores inflamables o explosivos durante la pulverización. Además, las espumas no pueden contener alcoholes volátiles, que pueden producir vapores inflamables o explosivos durante el uso.
Los tampones pueden usarse para controlar el pH de una composición. Los tampones pueden tamponar la composición desde un pH de aproximadamente 4 a un pH de aproximadamente 7,5, desde un pH de aproximadamente 4 a un pH de aproximadamente 7, o desde un pH de aproximadamente 5 a un pH de aproximadamente 7. En algunas modalidades, el tampón puede ser trietanolamina.
Pueden incluirse conservantes para evitar el crecimiento de hongos y microorganismos. Los conservantes adecuados incluyen, entre otros, ácido benzoico, butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio, propionato de sodio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, y timerosal.
En determinadas modalidades, las formulaciones pueden proporcionarse a través de la administración continua de una o más formulaciones a un paciente que las necesite. Para aplicaciones tópicas, pueden realizarse aplicaciones repetidas o puede usarse un parche para proporcionar una administración continua de los análogos de noscapina durante un período de tiempo prolongado.
Formulaciones enterales
Los inhibidores autofágicos pueden prepararse en formulaciones enterales, tales como para administración oral. El inhibidor autofágico puede ser HCQ, un derivado activo de este, o una sal farmacéutica de este. Las formas de dosificación oral adecuadas incluyen tabletas, cápsulas, soluciones, suspensiones, jarabes, y pastillas. Las tabletas pueden fabricarse mediante el uso de técnicas de compresión o moldeado que se conocen bien en la técnica. Las cápsulas de gelatina o sin gelatina pueden prepararse como cubiertas de cápsulas duras o blandas, que pueden encapsular materiales de relleno líquidos, sólidos, y semisólidos, mediante el uso de técnicas que se conocen bien en la técnica.
Las formulaciones que contienen un inhibidor autofágico se preparan mediante el uso de vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se usa generalmente en la presente descripción, “vehículo” incluye, entre otros, diluyentes, conservantes, aglutinantes, lubricantes, disgregantes, agentes de hinchamiento, rellenos, estabilizadores, y combinaciones de estos. Los polímeros usados en la forma de dosificación incluyen, pero sin limitarse a, polímeros hidrofóbicos o hidrofílicos adecuados y polímeros independientes o dependientes del pH adecuados. Los polímeros hidrofóbicos e hidrofílicos adecuados incluyen, entre otros, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, etilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, acetato de polivinilo, y resinas de intercambio iónico. “Vehículo” también incluye todos los componentes de la composición de revestimiento que pueden incluir plastificantes, pigmentos, colorantes, agentes estabilizadores, y deslizantes.
Las formulaciones que contienen un inhibidor autofágico pueden prepararse mediante el uso de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, que incluyen diluyentes, conservantes, aglutinantes, lubricantes, desintegrantes, agentes de hinchamiento, rellenos, estabilizadores, y combinaciones de estos.
Las formulaciones de dosificación de liberación retardada pueden prepararse como se describe en las referencias estándar tales como “Pharmaceutical dosage form tablets”, eds. Liberman y otros (Nueva York, Marcel Dekker, Inc., 1989), “Remington - The science and practice of pharmacy”, 20a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, y “Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems”, 6a edición, Ansel y otros, (Media, PA: Williams and Wilkins, 1995). Estas referencias brindan información sobre excipientes, materiales, equipos y procesos para preparar tabletas y cápsulas y formas de dosificación de liberación retardada de tabletas, cápsulas, y gránulos. Estas referencias brindan información sobre vehículos, materiales, equipos y procesos para preparar tabletas y cápsulas y formas de dosificación de liberación retardada de tabletas, cápsulas, y gránulos.
Las formulaciones que contienen un inhibidor autofágico pueden recubrirse con un material de recubrimiento adecuado, por ejemplo, para retrasar la liberación una vez que las partículas pasan por el entorno ácido del estómago. Los materiales de recubrimiento adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros de celulosa tales como ftalato de acetato de celulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa; ftalato de acetato de polivinilo, polímeros y copolímeros de ácido acrílico y resinas metacrílicas que están disponibles comercialmente con el nombre comercial EUDRAGIT® (Roth Pharma, Westerstadt, Alemania), zeína, goma laca, y polisacáridos.
Los recubrimientos pueden formarse con una proporción diferente de polímero soluble en agua, polímeros insolubles en agua y/o polímeros dependientes del pH, con o sin excipiente insoluble en agua/no polimérico soluble en agua, para producir el perfil de liberación deseado. El recubrimiento puede realizarse en una forma de dosificación (matriz o simple) que incluye, entre otros, tabletas (comprimidas con o sin perlas recubiertas), cápsulas (con o sin perlas recubiertas), perlas, composiciones de partículas, “ingredientes que se” formula como, pero sin limitarse a, forma de suspensión o como una forma de dosificación por aspersión.
Adicionalmente, el material de recubrimiento puede contener vehículos convencionales tales como plastificantes, pigmentos, colorantes, deslizantes, agentes estabilizadores, formadores de poros y surfactantes. Los excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales incluyen, pero sin limitarse a, diluyentes, aglutinantes, lubricantes, desintegrantes, colorantes, estabilizadores, y surfactantes.
Los diluyentes, también denominados “rellenos”, pueden usarse para aumentar el volumen de una forma de dosificación sólida de manera que se proporcione un tamaño práctico para la compresión de tabletas o la formación de perlas y gránulos. Los diluyentes adecuados incluyen, entre otros, fosfato dicálcico dihidratado, sulfato de calcio, lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, cloruro de sodio, almidón seco, almidones hidrolizados, almidón pregelatinizado, dióxido de silicona, óxido de titanio, silicato de magnesio y aluminio y azúcar en polvo. Los diluyentes habituales incluyen sustancias en polvo inertes tales como almidones, celulosa en polvo, especialmente celulosa cristalina y microcristalina, azúcares tales como fructosa, manitol y sacarosa, harinas de cereales y polvos comestibles similares. Los diluyentes típicos incluyen, por ejemplo, diversos tipos de almidón, lactosa, manitol, caolín, fosfato o sulfato de calcio, sales inorgánicas tales como cloruro de sodio y azúcar en polvo. Los derivados de celulosa en polvo también son útiles.
Los aglutinantes pueden impartir cualidades cohesivas a una formulación de dosificación sólida y, por lo tanto, pueden garantizar que una tableta, una perla o un gránulo permanezcan intactos después de la formación de las formas de dosificación. Los materiales aglutinantes adecuados incluyen, entre otros, almidón, almidón pregelatinizado, gelatina, azúcares (que incluyen sacarosa, glucosa, dextrosa, lactosa y sorbitol), polietilenglicol, ceras, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto, alginato de sodio, celulosa, que incluyen hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, etilcelulosa y veegum, y polímeros sintéticos tales como copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, copolímeros de metacrilato de aminoalquilo, ácido poliacrílico/ácido polimetacrílico y polivinilpirrolidona. Los aglutinantes de tabletas típicos incluyen sustancias tales como almidón, gelatina y azúcares tales como lactosa, fructosa, y glucosa. También pueden usarse gomas naturales y sintéticas, que incluyen acacia, alginatos, metilcelulosa, y polivinilpirrolidona. El polietilenglicol, polímeros hidrofílicos, etilcelulosa y ceras también pueden servir como aglutinantes.
Pueden incluirse lubricantes para facilitar la fabricación de tabletas. Los lubricantes adecuados incluyen, entre otros, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, behenato de glicerol, polietilenglicol, talco, y aceite mineral. Puede incluirse un lubricante en la formulación de una tableta para evitar que la tableta y las perforaciones se peguen en el troquel. El lubricante puede elegirse entre tales sólidos resbaladizos como talco, estearato de magnesio y calcio, ácido esteárico y aceites vegetales hidrogenados.
Los desintegrantes pueden usarse para facilitar la desintegración o la “ruptura” de la forma de dosificación después de la administración, y generalmente incluyen, entre otros, almidón, glicolato de almidón de sodio, carboximetilalmidón de sodio, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilcelulosa, almidón pregelatinizado, arcillas, celulosa, alginina, gomas o polímeros reticulados, tales como PVP reticulado (Polyplasdone® XL de GAF Chemical Corp).
Los estabilizadores pueden usarse para inhibir o retardar las reacciones de descomposición de fármacos que incluyen, a manera de ejemplo, reacciones oxidativas. Los estabilizadores adecuados incluyen, pero sin limitarse a, antioxidantes, hidroxitolueno butilado (BHT); ácido ascórbico, sus sales y ésteres; vitamina E, tocoferol y sus sales; sulfitos tales como metabisulfito de sodio; cisteína y sus derivados; ácido cítrico; galato de propilo, e hidroxianisol butilado (BHA).
Agentes activos adicionales
En algunas modalidades, se incluyen uno o más agentes activos adicionales en la formulación farmacéutica que pueden contener un inhibidor autofágico tal como HCQ. Los agentes activos adicionales adecuados incluyen, pero sin limitarse a, antipiréticos, inmunomoduladores, quimioterapéuticos y analgésicos.
Los antipiréticos adecuados incluyen, entre otros, antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, ibuprofeno, naproxeno, ketoprofeno y nimesulida), aspirina y salicilatos relacionados (por ejemplo, salicilato de colina, salicilatos de magnesio y salicilato de sodio), paracetamol/acetaminofén, metamizol, nabumetona, fenazona, y quinina.
Los inmunomoduladores adecuados incluyen, entre otros, prednisona, azatioprina, 6-MP, ciclosporina, tacrolimus, metotrexato, interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-7 e IL-12), citocinas (por ejemplo, interferones (por ejemplo, IFN-a, IFN-p, IFN-£, IFN-k, IFN-w, e IFN-y), factor estimulante de colonias de granulocitos e imiquimod), quimiocinas (por ejemplo, CCL3, CCL26 y CXCL7), citosina fosfato-guanosina, oligodesoxinucleótidos, glucanos, anticuerpos, y aptámeros).
Los quimioterapéuticos adecuados incluyen, entre otros, paclitaxel, brentuximab vedotina, doxorrubicina, 5-FU (fluorouracilo), everolimus, pemetrexed, melfalán, pamidronato, anastrozol, exemestano, nelarabina, ofatumumab, bevacizumab, belinostat, tositumomab, carmustina, bleomicina, bosutinib, busulfán, alemtuzumab, irinotecán, vandetanib, bicalutamida, lomustina, daunorubicina, clofarabina, cabozantinib, dactinomicina, ramucirumab, citarabina, citoxano, ciclofosfamida, decitabina, dexametasona, docetaxel, hidroxiurea, descarbacina, leuprolida, epirubicina, oxaliplatino, asparaginasa, estramustina, cetuximab, vismodegib, aspargainasa erwinia chyrsanthemi, amifostina, etopósido, flutamida, toremifeno, fulvestrant, letrozol, degarelix, pralatrexato, metotrexato, floxuridina, obinutuzumab, gemcitabina, afatinib, imatinib mesylatem, carmustina, eribulina, trastuzumab, altretamina, topotecán, ponatinib, idarubicin, ifosfamida, ibrutinib, axitinib, interferón alfa-2a, gefitinib, romidepsina, i xabepilona, ruxolitinib, cabazitaxel, ado-trastuzumab emtansina, carfilzomib, clorambucilo, sargramostim, cladribina, mitotano, vincristina, procarbazina, megestrol, trametinib, mesna, cloruro de estroncio-89, mecloretamina, mitomicina, busulfán, gemtuzumab ozogamicina, vinorelbina, filgrastim, pegfilgrastim, sorafenib, nilutamida, pentostatina, tamoxifeno, mitoxantrona, pegaspargasa, denileukin diftitox, alitretinoína, carboplatino, pertuzumab, cisplatino, pomalidomida, prednisona, aldesleukin, mercaptopurina, ácido zoledrónico, lenalidomida, rituximab, octretide, dasatinib, regorafenib, histrelina, sunitinib, siltuximab, omacetaxina, tioguanina (tioguanina), dabrafenib, erlotinib, bexaroteno, temozolomida, tiotepa, talidomida, BCG, temsirolimus, clorhidrato de bendamustina, triptorelina, trióxido de aresnico, lapatinib, valrubicina, panitumumab, vinblastina, bortezomib, tretinoína, azacitidina, pazopanib, tenipósido, leucovorina, crizotinib, capecitabina, enzalutamida, ipilimumab, goserelina, vorinostat, idelalisib, ceritinib, abiraterona, epotilona, taflupósido, azatioprina, doxifluridina, vindesina, y ácido retinoico todo trans.
Los analgésicos adecuados incluyen, entre otros, paracetamol/acetaminofén, antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, ibuprofeno, naproxeno, ketoprofeno y nimesulida), inhibidores de la COX-2 (por ejemplo, rofecoxib, celecoxib y etoricoxib), opioides (por ejemplo, morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona, dihidromorfina, petidina, buprenorfina), tramadol, norepinefrina, flupiretina, nefopam, orfenadrina, pregabalina, gabapentina, ciclobenzaprina, escopolamina, metadona, cetobemidona, piritramida, y aspirina y salicilatos relacionados (por ejemplo, salicilato de colina, salicilatos de magnesio y salicilato de sodio).
Tratamientos
En la presente descripción se demuestra que la autofagia puede eliminar las células endometriales de una vía apoptótica normal, lo que puede permitir que las células sobrevivan y se conviertan en lesiones ectópicas. Por lo tanto, en algunas modalidades, la autofagia puede inhibirse en una célula endometrial, célula endometriósica, o célula de lesión endometriósica, o poblaciones de estas, al poner en contacto la célula o población de células con una cantidad efectiva de un inhibidor autofágico o metabolito activo de este. En algunas modalidades, el contacto de la célula con un inhibidor autofágico puede incluir la administración de un inhibidor autofágico o una formulación farmacéutica de este a un sujeto que lo necesite, como se describe en otra parte de la presente descripción. Los inhibidores autofágicos adecuados incluyen, entre otros, cloroquina, hidroxicloroquina, y Lys05, sales farmacéuticamente aceptables de cloroquina, sales farmacéuticamente aceptables de hidroxicloroquina, sales farmacéuticamente aceptables de Lys05, formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen una cantidad efectiva de cloroquina, Lys05 o hidroxicloroquina, derivados activos de cloroquina, Lys05 o hidroxicloroquina, anticuerpos que se unen específicamente a un inductor positivo de autofagia en células endometriales, ARNip, miARN, piARN u otras especies de ARN que se unen específicamente a un inductor positivo de autofagia en células endometriales y otras moléculas, compuestos, o sustancias que se unen o de cualquier otra manera interactúan con una proteína u otra molécula implicada en el mantenimiento o aumento de la autofagia para reducir la autofagia en la célula. En algunas modalidades, los ARNm de ATG5 y/o ATG7 pueden ser dianas mediante el uso de ARNip u otras especies de ARN que pueden unirse específicamente con el ARNm de ATG5 y/o ATG7. En otras modalidades, las células endometriósicas se ponen en contacto con compuestos, moléculas, o formulaciones farmacéuticas de estos que interrumpen la interacción entre beclina-1 y hVps34. En modalidades adicionales, las células endometriósicas se ponen en contacto con compuestos, moléculas, o formulaciones farmacéuticas de estos que inhiben la activación de ATG1/ULK1.
En algunas modalidades, la unión de una especie de ARN u otra molécula a una proteína u otra molécula en la vía autofágica da como resultado una reducción en la expresión y/o función de la proteína unida u otra molécula.
La cantidad efectiva del inhibidor autofágico, tal como HCQ, o la formulación farmacéutica de este puede oscilar entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 200 mg/kg. En algunas modalidades, la cantidad efectiva está en el intervalo entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 60 mg/kg. En otras modalidades, la cantidad efectiva está en el intervalo entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 700 mg. En algunas modalidades, la cantidad efectiva puede ser de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 600 mg. En modalidades adicionales, la célula endometrial, célula endometriósica, o célula de lesión endometriósica tiene una mayor expresión de al menos uno de los siguientes marcadores autofágicos seleccionados de ATG7, ATG5, y hVps34 en comparación con una célula de control o una población de células de control.
En otras modalidades, puede administrarse una cantidad efectiva del inhibidor autofágico, tal como HCQ, o una formulación farmacéutica de este, a un sujeto que tiene endometriosis, una lesión endometriósica, o que se sospecha que tiene endometriosis o una lesión endometriósica. La administración puede ser sistémica o localizada. En algunas modalidades, el inhibidor autofágico es como se describe anteriormente. La cantidad efectiva puede administrarse una o más veces al día. En una modalidad, la cantidad efectiva se administra una vez al día. En algunas modalidades, la cantidad efectiva puede ser de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 600 mg administrados una vez al día. En otra modalidad, la cantidad efectiva se administra dos veces al día. La cantidad efectiva puede administrarse una o más veces por semana. En algunas modalidades la cantidad efectiva se administra 1 día por semana. En otras modalidades, la cantidad efectiva se administra de 2 a 7 días por semana. La cantidad efectiva puede administrarse más de una vez al mes. En algunas modalidades, la cantidad efectiva se administra 2 veces por semana.
En algunas modalidades, la cantidad efectiva de un inhibidor autofágico o su formulación farmacéutica puede administrarse en una forma de dosificación. La cantidad efectiva puede dividirse en múltiples formas de dosificación. Por ejemplo, la cantidad efectiva puede dividirse en dos formas de dosificación y la primera forma de dosificación puede administrarse, por ejemplo, por la mañana, y la segunda forma de dosificación puede administrarse por la noche. Aunque la cantidad efectiva se administra en dos dosis, en un día, el sujeto recibe la cantidad efectiva. En algunas modalidades, la cantidad efectiva es de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 mg por día.
La forma de dosificación puede formularse para administración oral, vaginal, intravenosa, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular. La cantidad efectiva puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 200 mg/kg. En algunas modalidades, la cantidad efectiva está en el intervalo entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 60 mg/kg. La cantidad efectiva puede administrarse con o sin alimentos. La administración con alimentos es tal que hay alimentos presentes en el estómago al mismo tiempo que se administra la cantidad efectiva o poco tiempo después. En otras modalidades, puede administrarse por vía oral una dosis efectiva de aproximadamente 400 mg a 600 mg una vez al día con alimentos o un vaso de leche. En algunas modalidades, puede administrarse por vía oral una dosis efectiva inicial de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 600 mg una vez al día con alimentos o un vaso de leche hasta que se logre una mejoría en al menos un síntoma, seguida de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 50 % de la dosis inicial administrada por vía oral una vez al día.
Ensayos
También se describen en la presente descripción ensayos para detectar biomarcadores de endometriosis o lesión endometriósica, diagnóstico, y/o pronóstico de lesiones endometriósicas y endometriosis. Alteración de la expresión y/o activación de ATG-5, ATG-7, ATG-9, DJ-1(Park7), hVps34, beclina-1, p-ULK1, ATG1(ULK1), p-mTOR, mTOR, integrina, Src, FAK, ILK, rkB, AKT, LC3A, LC3 B, TSC1, TSC2, HO-1, PTEN, ARID1A, PIK3CA, K-RAS, BCL-2, ATG16, ATG12, ATG10, ATG3, LC3-1, ATG4, EVI1, RON, EGFR, SnoN, SkiL TGFpRIl, p53, Smad2/3, p-ERK, ERK, PARP, PARP escindida, p62, ferritina, E-cadherina, N-cadherina, vimentina, citoqueratina-18 y/o combinaciones de estas pueden participar en la patogenia de las lesiones endometriósicas. La evaluación de uno o una combinación de los biomarcadores antes mencionados puede proporcionar información previamente desapreciada que puede ayudar en un diagnóstico o pronóstico mejorado, más preciso y/o más temprano que las técnicas convencionales. Moléculas de captura
En la presente descripción se describen moléculas de captura configuradas para unirse específicamente a un biomarcador que puede participar en la patogenia de la endometriosis y/o lesiones endometriósicas. Las moléculas de captura pueden ser un anticuerpo o un fragmento de este, un aptámero, un aficuerpo, un polinucleótido, un péptido, o un polipéptido. En algunas modalidades, la molécula de captura es un polinucleótido. En otras modalidades, la molécula de captura es un anticuerpo o un fragmento de este. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. Los métodos para producir anticuerpos policlonales se conocen generalmente en la técnica. En algunas modalidades, los antisueros que contienen un anticuerpo policlonal se purifican por afinidad contra un epítopo o antígeno contra el que se generó el anticuerpo policlonal para obtener solo el anticuerpo o fragmentos de estos que se unen específicamente al epítopo o antígeno. Los métodos de purificación por afinidad de anticuerpos policlonales se conocen generalmente en la técnica. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Los métodos para producir anticuerpos monoclonales se conocen generalmente en la técnica. En algunas modalidades, el anticuerpo se contiene en un antisuero o medio de cultivo. En otras modalidades, el anticuerpo se proporciona como un producto seco o liofilizado que puede reconstituirse a una concentración deseada.
El anticuerpo puede usarse a cualquier concentración o dilución. En algunas modalidades, el anticuerpo se diluye de 1:1 a 1:500 000 en un diluyente adecuado. Los diluyentes adecuados se conocen generalmente, están disponibles comercialmente e incluyen, entre otros, agua, dimetilsulfóxido (DMSO), etanol y mezclas de estos. El diluyente puede contener uno o más conservantes, inhibidores de proteasas, sales, e indicadores de pH, sustratos de bloqueo, que incluyen, pero sin limitarse a, albúmina de suero bovino.
Biomarcadores
Las moléculas de captura descritas en la presente descripción pueden configurarse para unirse específicamente a un biomarcador como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el biomarcador puede participar en la patogenia de la endometriosis. El biomarcador puede participar en la vía autofágica, el desarrollo de resistencia a anoikis, y/o el estado de activación de una célula. El biomarcador puede ser un oligonucleótido, polinucleótido, péptido, polipéptido, lípido, ácido graso, polisacárido, metabolito primario, metabolito secundario, terpenos, o combinaciones de estos.
Los biomarcadores implicados en la patogenia de las lesiones endometriósicas pueden ser ATG-5, ATG-7, ATG-9, DJ-1(Park7), hVps34, beclina-1, p-ULK1, ULK, ATG1, p-mTOR, mTOR, p-AMK, AMK, integrina, Src, FAK, ILK, rkB, PI3K, AKT, LC3A (LC3-1), LC3 B (LC3-II),TSC1, TSC2, HO-1, PTEN, ARID1A, PIK3CA, K-RAS, PI3KIII, BCL-2, ATG16, ATG12, ATG10, ATG3, LC3-1, ATG4, EVI1, RON, EGFR, SnoN, SkiL TGFpRIl, p53, Smad2/3, p-ERK, ERK, PARP, PARP escindido, p62, ferritina, E-cadherina, N-cadherina, vimentina citoqueratina-18 y/o combinaciones de estos.
Ensayos mediante el uso de moléculas de captura
Las moléculas de captura descritas en la presente descripción pueden usarse en un ensayo para detectar y/o cuantificar una cantidad de uno o más biomarcadores presentes en una muestra o componente de esta obtenida de un sujeto. La muestra puede ser un fluido corporal, una cantidad de tejido corporal, órgano o hueso, célula obtenida de un sujeto, población de células obtenida de un sujeto o una célula o población de células obtenida de un sujeto y cultivada in vitro.
El ensayo puede contener las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta con una molécula de captura como se describe en la presente descripción que se configura para unirse específicamente a un biomarcador como se describe en la presente descripción y detectar la presencia de unión específica del biomarcador por la molécula de captura en comparación con un control. El control puede ser un control de ensayo, una molécula de captura de control negativo (se une específicamente a una molécula que no participa en la patogénesis de las lesiones endometriósicas), una molécula de captura de control positivo (se une específicamente a una molécula que se sabe que participa en la patogénesis de las lesiones endometriósicas), una muestra de control negativo (una muestra derivada de un tejido, sujeto, célula o población de células no endometriósica), una muestra de control positivo (una muestra derivada de un tejido, célula o población de células endometriósica o sujeto con endometriosis). El ensayo puede configurarse para usarse para ayudar en el diagnóstico, tratamiento, o pronóstico de endometriosis y lesiones endometriósicas mediante la molécula de captura específica o la combinación de moléculas de captura que se incluyen en el ensayo.
El ensayo también puede contener la etapa de procesar la muestra antes de poner en contacto la muestra o componente de esta con la molécula de captura. La etapa de procesamiento de la muestra, cuando la muestra es sangre completa, puede contener la etapa de procesamiento de la sangre completa para formar una fracción de plasma sanguíneo procesada. Los métodos para obtener plasma sanguíneo a partir de sangre completa se conocen generalmente en la técnica. En estas modalidades, la fracción de plasma sanguíneo procesada se pone en contacto con la molécula de captura en oposición a la sangre entera. En otras modalidades, la etapa de procesar la muestra, donde la muestra es sangre completa, puede contener la etapa de procesar la sangre completa para formar una fracción procesada de glóbulos blancos. Los métodos para obtener una fracción de glóbulos blancos o una capa leucocitaria se conocen generalmente en la técnica. En estas modalidades, la fracción de glóbulos blancos procesada se pone en contacto con la molécula de captura en oposición a la sangre completa.
El ensayo también puede contener la etapa de procesar una muestra de tejido antes de poner en contacto la muestra de tejido con la molécula de captura. El tejido puede fijarse en una solución de fijación adecuada antes de contactar con la molécula de captura. Las soluciones de fijación adecuadas se conocen generalmente en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, paraformaldehído y diluciones de este. El tejido puede incrustarse en un sustrato adecuado antes de contactar con la molécula de captura. Los sustratos adecuados incluyen, entre otros, parafina, agar, gelatina, u otra cera.
La muestra o componente de esta puede procesarse mediante el uso de cualquier método químico, método físico adecuado o combinaciones de estos para liberar, concentrar, separar y/o aislar los biomarcadores u otros componentes de la muestra antes de poner en contacto la muestra con la molécula de captura.
El ensayo también puede contener la etapa de cuantificar o calcular una cantidad de biomarcador presente en la muestra y/o la etapa de cuantificar una cantidad de biomarcador que se une específicamente a una molécula de captura. En algunas modalidades, la cantidad de biomarcador presente en la muestra se cuantifica mediante la cuantificación de la cantidad de biomarcador que se une específicamente a una molécula de captura. La unión específica del biomarcador y la molécula de captura puede dar como resultado una señal medible, detectable, y/o cuantificable en ensayos de unión, tales como inmunoensayos. Los métodos para cuantificar la cantidad de biomarcador unido específicamente a una molécula de captura con base en una señal medible, detectable, y/o cuantificable en un ensayo de unión se conocen generalmente en la técnica.
En algunas modalidades, la etapa de detectar la presencia de unión específica del biomarcador por la molécula de captura y/o la etapa de detectar, medir y/o cuantificar la cantidad de biomarcador específicamente unido por la molécula de captura se realiza, al menos en parte, mediante el uso de un método seleccionado de una matriz, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa (qPCR), PCR en tiempo real, qPCR en tiempo real, citometría de flujo, inmunotransferencia Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, hibridación in situ, secuenciación de nucleótidos, espectrometría de masas, electroforesis en gel 1-D, electroforesis en gel 2-D, cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía líquida, cromatografía de afinidad, o combinaciones de estas.
En modalidades adicionales, el ensayo puede contener las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta como se describe en la presente descripción con una pluralidad de moléculas de captura, donde cada molécula de captura se configura para unirse específicamente a un biomarcador que puede participar en la patogénesis de las lesiones endometriósicas, y detectar la presencia de unión específica de al menos un biomarcador por al menos una de las moléculas de captura en la pluralidad de moléculas de captura. En algunas modalidades, la pluralidad de moléculas de captura en el ensayo se configura de manera tal que pueden evaluarse los biomarcadores relacionados con la vía autofágica, desarrollo de resistencia a anoikis, estado de activación de la célula o combinaciones de estos que pueden estar presentes en una muestra o componente de esta por el ensayo. En algunas modalidades, la pluralidad de moléculas de captura puede configurarse de manera tal que puedan detectarse los biomarcadores autofágicos LC3A, ATG7, ATG5, beclina-1 y hVps34. En algunas modalidades, la pluralidad de moléculas de captura se configura de manera tal que pueden detectarse los biomarcadores de estado de activación p-ULK/ATG1, p-mTOR, pAMK. En modalidades adicionales, la pluralidad de moléculas de captura se configura de manera tal que pueden detectarse los biomarcadores autofágicos LC3A, ATG7, ATG5, beclina-1 y hVps34 y los biomarcadores de estado de activación p-ULK/ATG1, p-mTOR, pAMK.
El ensayo puede configurarse de manera tal que cada molécula de captura en la pluralidad de moléculas de captura se configure para que cada una se una específicamente a un biomarcador diferente. En otras modalidades, el ensayo puede configurarse de manera tal que al menos dos de las moléculas de captura se unan específicamente a un biomarcador diferente. En modalidades adicionales, el ensayo puede configurarse de manera tal que al menos dos de las moléculas de captura se unan específicamente al mismo biomarcador. En modalidades en las que el ensayo contiene la etapa de poner en contacto una muestra obtenida de un sujeto con una pluralidad de moléculas de captura, el ensayo puede contener, además, cualquier etapa adicional como se describe en la presente descripción, que incluye, pero sin limitarse a, cuantificar la unión específica de uno o más biomarcadores por una o más moléculas de captura y procesamiento de la muestra o componente de esta.
Matrices
También se describen en la presente descripción matrices, que incluyen micromatrices que pueden usarse para detectar una o más moléculas de interés (biomarcadores) presentes en una muestra. En una matriz, una o más moléculas de captura se unen o se unen operativamente a un soporte en ubicaciones esencialmente discretas en el soporte. Las moléculas de captura son como se describen en la presente descripción. Las ubicaciones discretas en el soporte donde la(s) molécula(s) de captura se unen o enlazan operativamente se denominan individualmente como una característica de la matriz y colectivamente como características. Las características pueden disponerse en cualquier disposición deseada sobre el soporte. La disposición puede ser tal que cada característica tenga su propia coordenada para permitir la identificación de la molécula de captura y/o biomarcador detectado en cualquier ubicación discreta dada en la matriz de acuerdo con la coordenada de la característica. Estas matrices también pueden denominarse "matrices ordenadas". Las características pueden disponerse en el soporte para que se separen entre 0,01 nm y 1 cm de otra característica en el soporte. Una sola característica puede contener una sola molécula de captura (formato único) o puede contener más de una molécula de captura (formato múltiple).
El soporte puede ser sólido o semisólido. El soporte puede ser rígido o ser flexible. El soporte puede contener una o más capas especializadas que afectan la funcionalidad o el rendimiento de la matriz. El soporte puede ser bidimensional o tridimensional. El soporte puede ser de vidrio, tal como dióxido de silicio o borosilicato; plástico, tal como poliestireno, nailon, difluoruro de polivinilideno; un material fibroso, tal como celulosa, carboximetilcelulosa o nitrocelulosa; un gel, tal como agarosa, un hidrogel o poliacrilamida. El soporte puede adoptar cualquier forma deseada, que incluye, pero sin limitarse a, un cuadrado, un rectángulo, un círculo, un cubo, un prisma rectangular u otra forma poligonal regular o irregular o su forma tridimensional correspondiente. El soporte puede tener una longitud, una anchura, una altura, un radio, y/o un diámetro. La longitud del soporte puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. La altura del soporte puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. La anchura del soporte puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. El radio del soporte puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. El diámetro del soporte puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm.
El soporte puede contener una única capa a la que se une o une operativamente la molécula de captura. En estas modalidades, el soporte también puede denominarse capa superficial. En otras modalidades, el soporte puede contener más de una capa. En modalidades con más de una capa, la capa a la que se une o une operativamente la molécula de captura se denomina capa superficial. La capa superficial puede modificarse para afectar la interacción y/o reducir la unión no específica entre una molécula de captura y el soporte y/o la molécula de captura y el biomarcador. En algunas modalidades, la capa superficial se modifica para mejorar la interacción entre la molécula de captura y la capa superficial y/o la interacción entre la molécula de captura y su biomarcador correspondiente. La modificación de la capa superficial también puede reducir la unión no específica de la molécula de captura y/o el biomarcador.
En algunas modalidades, la capa superficial se modifica con una modificación química. Las modificaciones químicas adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, grupos de hidróxido reactivos, grupos de amina primaria, secundaria, terciaria y/o cuaternaria reactiva, una monocapa de un anticuerpo reactivo que incluye, pero sin limitarse a, antiglutatión S-transferasa (anti-GST) anticuerpos, grupos epóxido reactivos, grupos metacrilato reactivos, grupos reactivos aldehído, proteínas A/G reactivas que se unen a inmunoglobulinas y recubrimientos peliculares tridimensionales, que son recubrimientos poliméricos que contienen sitios de unión covalente activados. En algunas modalidades, los recubrimientos poliméricos de película tridimensional incluyen, pero sin limitarse a, polisacáridos y polímeros hidrofílicos. En algunas modalidades, los sitios de unión covalente activados por película tridimensional incluyen, pero sin limitarse a, ésteres de N-hidroxisucamida. La capa superficial puede modificarse para que tenga carga positiva, neutra, o carga negativa. La capa superficial puede modificarse para que sea hidrofílica, hidrofóbica o para que contenga una mezcla de regiones hidrofóbicas e hidrofílicas. En algunas modalidades, las modificaciones se modelan en la capa superficial para formar áreas funcionalizadas discretas a las que se une o se une operativamente la molécula de captura. En algunas modalidades que tienen regiones hidrofóbicas e hidrofílicas mixtas, las regiones hidrofílicas se separan por regiones hidrofóbicas. En otras modalidades, que tienen regiones hidrofóbicas e hidrofílicas mixtas, las regiones hidrofóbicas se separan por regiones hidrofílicas.
En algunas modalidades, la capa superficial es un gel que incluye, pero sin limitarse a, agarosa, un hidrogel, o poliacrilamida. En algunas modalidades, el soporte contiene múltiples capas superficiales de gel discretas. Estas capas superficiales de gel también se denominan almohadillas y pueden disponerse sobre el soporte en una disposición ordenada de manera tal que cada almohadilla de gel sea una característica de la matriz. En algunas modalidades, la(s) misma(s) molécula(s) de captura se unen o se unen operativamente a todas las almohadillas de gel que forman la capa superficial del soporte. En otras modalidades, al menos dos de las almohadillas de gel tienen al menos una molécula de captura diferente unida o unida operativamente a ellas.
El soporte puede configurarse para tener una o más muescas o depresiones discretas tridimensionales en la capa superficial. La(s) molécula(s) de captura pueden unirse o unirse operativamente a la muesca. Las muescas tridimensionales pueden tener forma cuadrada, rectangular, redonda, o irregular. Las muescas tridimensionales pueden formar pozos o canales. Una o más muescas pueden conectarse a otra muesca mediante un canal conector tridimensional que se extiende entre uno o más pocillos. En algunas modalidades, el canal del conector es un canal de microfluidos. En algunas modalidades, el canal de microfluidos contiene papel absorbente. Una dimensión de la muesca puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. En algunas modalidades, la longitud de una muesca está en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. En modalidades adicionales, el ancho de una muesca puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. En modalidades adicionales, la altura de una muesca puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. En otras modalidades, el radio de una muesca puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. En modalidades adicionales, el diámetro de una muesca puede estar en el intervalo entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 cm. Las muescas pueden dimensionarse de manera que mantengan un volumen específico. En algunas modalidades, el volumen específico está en el intervalo entre aproximadamente 1 nL y aproximadamente 1000 mL. En una sola matriz, las muescas pueden tener todas aproximadamente la misma dimensión. En otras modalidades, al menos dos de las muescas difieren en al menos una dimensión. Cualquier superficie de una muesca puede modificarse como se describe anteriormente con respecto a la modificación de la capa superficial.
El soporte también puede contener capas adicionales debajo de la capa superficial y dentro del soporte. Las capas adicionales pueden estar directamente debajo de la capa superficial o contener otras capas, tal como el soporte, entre la capa adicional y la capa superficial. La capa adicional puede mejorar la relación señal/ruido, afectar la producción de señal producida por la unión de una molécula de captura a un biomarcador u otro sustrato y afectar otras propiedades o parámetros de rendimiento de la matriz. En algunas modalidades, la capa adicional es una capa dieléctrica. La capa dieléctrica puede mejorar el reflejo de la señal producida tras la unión de una molécula de captura y un biomarcador.
En algunas modalidades, la matriz es una micromatriz de tejido, que se refiere a un bloque de parafina u otro material de inclusión de tejido que contiene al menos dos muestras de tejido, donde las muestras de tejido se colocan en ubicaciones discretas y se organizan en un orden conocido. Las muestras de tejido pueden ser biopsias centrales. Después el bloque puede cortarse en rodajas y una parte de este bloque puede unirse o vincularse operativamente a un soporte sólido adecuado. Los soportes sólidos adecuados se describen en otra parte de la presente descripción. El bloque o porción de este puede entonces ponerse en contacto con una molécula de captura y puede detectarse la unión específica de un biomarcador y la molécula de captura. En algunas modalidades, más de una rebanada del bloque se une o enlaza operativamente al soporte sólido.
Métodos de diagnóstico y pronóstico de endometriosis y lesiones endometriósicas
También se describen en la presente descripción métodos para diagnosticar y pronosticar endometriosis y lesiones endometriósicas de un sujeto. Los métodos de diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y lesiones endometriósicas de un sujeto pueden realizarse mediante el uso de una o más de las moléculas de captura, ensayos, kits, y matrices descritos en la presente descripción.
Algunos métodos de diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o lesiones endometriósicas pueden incluir las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta con una molécula de captura configurada para unirse a un biomarcador como se describe en la presente descripción, detectar la presencia de unión específica del biomarcador mediante la molécula de captura, y diagnosticar una etapa, síntoma, presencia, y/o estado de endometriosis y/o una lesión endometriósica cuando se detecta la presencia de unión específica del biomarcador por la molécula de captura en comparación con un control. En algunas modalidades, LC3A, LC3B, ATG7, ATG5, hVps34 y/o DJ1 (Park 7) pueden detectarse en la muestra. La muestra puede ser un fluido corporal, una cantidad de tejido corporal, órgano o hueso, célula obtenida de un sujeto, población de células obtenida de un sujeto o una célula o población de células obtenida de un sujeto y cultivada in vitro. La muestra o componente de esta puede obtenerse de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene endometriosis o una lesión endometriósica.
El control puede ser un control de ensayo, una molécula de captura de control negativo (se une específicamente a una molécula que no participa en la patogénesis de las lesiones endometriósicas), una molécula de captura de control positivo (se une específicamente a una molécula que se sabe que participa en la patogénesis de las lesiones endometriósicas), una muestra de control negativo (una muestra derivada de un tejido, sujeto, célula o población de células no endometriósica), una muestra de control positivo (una muestra derivada de un tejido, célula o población de células endometriósica o sujeto con endometriosis).
Otros métodos de diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o una lesión endometriósica pueden incluir las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta con una molécula de captura configurada para unirse a un biomarcador como se describe en la presente descripción, detectar la presencia de unión específica del biomarcador mediante la molécula de captura, y diagnosticar una etapa, síntoma, presencia, y/o estado de endometriosis y/o una lesión endometriósica cuando no se detecta la presencia de unión específica del biomarcador por la molécula de captura en comparación con un control.
Otros métodos de diagnóstico y/o endometriosis y/o una lesión endometriósica pueden incluir las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta con una molécula de captura configurada para unirse a un biomarcador como se describe en la presente descripción, detectar la presencia de unión específica del biomarcador mediante la captura molécula, cuantificar una cantidad de biomarcador unido específicamente por la molécula de captura, y diagnosticar, y/o pronosticar un sujeto con endometriosis o una lesión endometriósica cuando la cantidad de biomarcador unido específicamente es mayor que un control. En algunas modalidades, la cantidad de LC3A, LC3B, ATG7, ATG5, hVps34 y/o DJ1 (Park 7) puede ser mayor que la del control. La cantidad puede ser una cantidad absoluta o una cantidad relativa. La cantidad puede ser relativa a una cantidad de control, una cantidad de referencia, y/o una cantidad estándar. Puede calcularse una cantidad absoluta a partir de una curva estándar. La cantidad de biomarcador específicamente unido puede ser de aproximadamente 0 % a aproximadamente 50 % mayor que el control, de 50 % a 100 % mayor que el control, de aproximadamente 100 % a aproximadamente 500 % mayor que el control, o de aproximadamente 500 % mayor que un control.
Otros métodos de diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o una lesión endometriósica pueden incluir las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta con una molécula de captura configurada para unirse a un biomarcador como se describe en la presente descripción, detectar la presencia de unión específica del biomarcador mediante la molécula de captura, cuantificar una cantidad de biomarcador específicamente unido por la molécula de captura, y diagnosticar y/o pronosticar un sujeto con endometriosis o una lesión endometriósica cuando la cantidad de biomarcador específicamente unido es menor que el control. La cantidad puede ser una cantidad absoluta o una cantidad relativa. La cantidad puede ser relativa a una cantidad de control, una cantidad de referencia, y/o una cantidad estándar. Puede calcularse una cantidad absoluta a partir de una curva estándar. La cantidad de biomarcador unido específicamente puede ser de aproximadamente 0 % a aproximadamente 50 % menor que el control, de 50 % a 100 % menor que el control, de aproximadamente 100 % a aproximadamente 500 % menor que el control, o de aproximadamente 500 % menor que el control. La unión específica del biomarcador y la molécula de captura puede dar como resultado una señal medible, detectable, y/o cuantificable en ensayos de unión, tales como inmunoensayos. Los métodos para cuantificar la cantidad de biomarcador unido específicamente a una molécula de captura con base en una señal medible, detectable, y/o cuantificable en un ensayo de unión se conocen generalmente en la técnica.
En otros métodos de diagnóstico de endometriosis y/o pronóstico de una lesión endometriósica pueden incluir las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta como se describe en la presente descripción obtenida de un sujeto con una pluralidad de moléculas de captura, donde cada molécula de captura se configura para unirse específicamente a un biomarcador como se describe en la presente descripción, detectar la presencia de unión específica de al menos un biomarcador por al menos una de las moléculas de captura en la pluralidad de moléculas de captura, y diagnosticar y/o pronosticar endometriosis y/o lesiones endometriósicas si la presencia de al menos una de se detecta el biomarcador unido por al menos una de las moléculas de captura de la pluralidad de moléculas de captura. En otras modalidades, el diagnóstico de endometriosis y/o lesiones endometriósicas ocurre si se detecta la presencia de al menos dos, tres o cuatro biomarcadores unidos por una o más moléculas de captura de la pluralidad de moléculas. En algunas modalidades, la pluralidad de moléculas de captura en el ensayo se configura de manera tal que los biomarcadores relacionados con la vía autofágica, desarrollo de resistencia a anoikis, estado de activación de la célula o combinaciones de estos pueden evaluarse mediante el método. En algunas modalidades, LC3A, LC3B, ATG7, ATG5, hVps34, DJ1 (Park 7) y/o combinaciones de estos pueden detectarse en la muestra.
La cantidad puede ser relativa a una cantidad de control, una cantidad de referencia, y/o una cantidad estándar. Puede calcularse una cantidad absoluta a partir de una curva estándar. La cantidad de biomarcador unido específicamente puede ser de aproximadamente 0 % a aproximadamente 50 % menor que el control, de 50 % a 100 % menor que el control, de aproximadamente 100 % a aproximadamente 500 % menor que el control, o de aproximadamente 500 % menor que el control. La unión específica del biomarcador y la molécula de captura puede dar como resultado una señal medible, detectable, y/o cuantificable en ensayos de unión, tales como inmunoensayos. Los métodos para cuantificar la cantidad de biomarcador unido específicamente a una molécula de captura con base en una señal medible, detectable, y/o cuantificable en un ensayo de unión se conocen generalmente en la técnica.
En otros métodos de diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o una lesión endometriósica pueden incluir las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta como se describe en la presente descripción obtenida de un sujeto con una pluralidad de moléculas de captura, donde cada molécula de captura se configura para unirse específicamente a un biomarcador como se describe en la presente descripción, detectar la unión específica de al menos un biomarcador por al menos una de las moléculas de captura en la pluralidad de moléculas de captura, cuantificar una cantidad de un biomarcador que se une específicamente a una molécula de captura en la pluralidad de moléculas de captura moléculas, y diagnosticar y/o pronosticar endometriosis y/o lesiones endometriósicas si la cantidad de al menos uno de los biomarcadores unidos por la molécula de captura es mayor que un control. En otras modalidades, el diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o lesiones endometriósicas ocurre si la cantidad de al menos dos biomarcadores unidos por una o más moléculas de captura de la pluralidad de moléculas es mayor que el control. En algunas modalidades, la pluralidad de moléculas de captura en el ensayo se configura de manera tal que los biomarcadores relacionados con la vía autofágica, desarrollo de resistencia a anoikis, estado de activación de la célula o combinaciones de estos pueden evaluarse mediante el método. En algunas modalidades, la cantidad de LC3A, LC3B, ATG7, ATG5, hVps34, DJ1 (Park 7) y/o combinaciones de estos puede ser mayor que la de un control.
La cantidad puede ser relativa a una cantidad de control, una cantidad de referencia, y/o una cantidad estándar. Puede calcularse una cantidad absoluta a partir de una curva estándar. La cantidad de biomarcador unido específicamente puede ser de aproximadamente 0 % a aproximadamente 50 % menor que el control, de 50 % a 100 % menor que el control, de aproximadamente 100 % a aproximadamente 500 % menor que el control, o de aproximadamente 500 % menor que el control. La unión específica del biomarcador y la molécula de captura puede dar como resultado una señal medible, detectable, y/o cuantificable en ensayos de unión, tales como inmunoensayos. Los métodos para cuantificar la cantidad de biomarcador unido específicamente a una molécula de captura con base en una señal medible, detectable, y/o cuantificable en un ensayo de unión se conocen generalmente en la técnica.
En otros métodos de diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o una lesión endometriósica pueden incluir las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta como se describe en la presente descripción obtenida de un sujeto con una pluralidad de moléculas de captura, donde cada molécula de captura se configura para unirse específicamente a un biomarcador como se describe en la presente descripción, detectar la unión específica de al menos un biomarcador por al menos una de las moléculas de captura en la pluralidad de moléculas de captura, cuantificar una cantidad de un biomarcador que se une específicamente a una molécula de captura en la pluralidad de moléculas de captura moléculas, y diagnosticar y/o pronosticar endometriosis y/o lesiones endometriósicas si la cantidad de al menos uno de los biomarcadores unidos por la molécula de captura es menor que un control. En otras modalidades, el diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o lesiones endometriósicas ocurre si la cantidad de al menos dos biomarcadores unidos por una o más moléculas de captura de la pluralidad de moléculas es menor que el control. En algunas modalidades, la pluralidad de moléculas de captura en el ensayo se configura de manera tal que los biomarcadores relacionados con la vía autofágica, desarrollo de resistencia a anoikis, estado de activación de la célula o combinaciones de estos pueden evaluarse mediante el método.
La cantidad puede ser relativa a una cantidad de control, una cantidad de referencia, y/o una cantidad estándar. Puede calcularse una cantidad absoluta a partir de una curva estándar. La cantidad de biomarcador unido específicamente puede ser de aproximadamente 0 % a aproximadamente 50 % menor que el control, de 50 % a 100 % menor que el control, de aproximadamente 100 % a aproximadamente 500 % menor que el control, o de aproximadamente 500 % menor que el control. La unión específica del biomarcador y la molécula de captura puede dar como resultado una señal medible, detectable, y/o cuantificable en ensayos de unión, tales como inmunoensayos. Los métodos para cuantificar la cantidad de biomarcador unido específicamente a una molécula de captura con base en una señal medible, detectable, y/o cuantificable en un ensayo de unión se conocen generalmente en la técnica.
En otros métodos de diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o una lesión endometriósica pueden incluir las etapas de poner en contacto una muestra o componente de esta como se describe en la presente descripción obtenida de un sujeto con una pluralidad de moléculas de captura, donde cada molécula de captura se configura para unirse específicamente a un biomarcador como se describe en la presente descripción, detectar la unión específica de al menos un biomarcador por al menos una de las moléculas de captura en la pluralidad de moléculas de captura, cuantificar una cantidad de un biomarcador que se une específicamente a una molécula de captura en la pluralidad de moléculas de captura moléculas, y diagnosticar y/o pronosticar endometriosis y/o lesiones endometriósicas si la cantidad de al menos un biomarcador unido a la molécula de captura es menor que un control y la cantidad de al menos un biomarcador unido a la molécula de captura es mayor que un control. En otras modalidades, el diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o lesiones endometriósicas ocurre si la cantidad de al menos dos biomarcadores unidos por una o más moléculas de captura de la pluralidad de moléculas es menor que el control y la cantidad de al menos dos biomarcadores unidos por una o más moléculas de captura de la pluralidad de moléculas es mayor que el control. En algunas modalidades, la pluralidad de moléculas de captura en el ensayo se configura de manera tal que los biomarcadores relacionados con la vía autofágica, desarrollo de resistencia a anoikis, estado de activación de la célula o combinaciones de estos pueden evaluarse mediante el método. En algunas modalidades, la cantidad de LC3A, LC3B, ATG7, ATG5, hVps34, DJ1 (Park 7) y/o combinaciones de estos puede ser mayor que la de un control.
La cantidad puede ser relativa a una cantidad de control, una cantidad de referencia, y/o una cantidad estándar. Puede calcularse una cantidad absoluta a partir de una curva estándar. La cantidad de biomarcador unido específicamente puede ser de aproximadamente 0 % a aproximadamente 50 % menor que el control, de 50 % a 100 % menor que el control, de aproximadamente 100 % a aproximadamente 500 % menor que el control, o de aproximadamente 500 % menor que el control. La unión específica del biomarcador y la molécula de captura puede dar como resultado una señal medible, detectable, y/o cuantificable en ensayos de unión, tales como inmunoensayos. Los métodos para cuantificar la cantidad de biomarcador unido específicamente a una molécula de captura con base en una señal medible, detectable, y/o cuantificable en un ensayo de unión se conocen generalmente en la técnica.
Cualquiera de los métodos de diagnóstico y/o pronóstico descritos en la presente descripción también puede contener las etapas de obtener la muestra del sujeto antes de poner en contacto a un componente de esta con una molécula de captura o una pluralidad de estas. En otras modalidades, cualquiera de los métodos descritos anteriormente también puede contener la etapa de procesar la muestra como se describe anteriormente en la presente descripción.
En algunas modalidades de los métodos de diagnóstico y/o pronóstico descritos en la presente descripción, la etapa de detectar la presencia de unión específica del biomarcador por la molécula de captura y/o la etapa de detectar, medir, y/o cuantificar la cantidad de biomarcador específicamente unido por la molécula de captura puede realizarse, al menos en parte, mediante el uso de un método seleccionado de una matriz, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa (qPCR), PCR en tiempo real, qPCR en tiempo real, citometría de flujo, una inmunotransferencia Western, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, hibridación in situ, secuenciación de nucleótidos, espectrometría de masas, electroforesis en gel 1-D, electroforesis en gel 2-D, cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía líquida, cromatografía de afinidad, o combinaciones de estos.
Los métodos de diagnóstico y/o pronóstico descritos en la presente descripción también pueden contener la etapa de procesar la muestra antes de ponerla en contacto con la molécula de captura. La etapa de procesamiento de la muestra, cuando la muestra es sangre completa, puede contener la etapa de procesamiento de la sangre completa para formar una fracción de plasma sanguíneo procesada. Los métodos para obtener plasma sanguíneo a partir de sangre completa se conocen generalmente en la técnica. En estas modalidades, la fracción de plasma sanguíneo procesada se pone en contacto con la molécula de captura en oposición a la sangre entera. En otras modalidades, la etapa de procesar la muestra, donde la muestra es sangre completa, puede contener la etapa de procesar la sangre completa para formar una fracción procesada de glóbulos blancos. Los métodos para obtener una fracción de glóbulos blancos o una capa leucocitaria se conocen generalmente en la técnica. En estas modalidades, la fracción de glóbulos blancos procesada se pone en contacto con la molécula de captura en oposición a la sangre completa.
Los métodos de diagnóstico y/o pronóstico descritos en la presente descripción también pueden contener la etapa de procesar una muestra de tejido antes de poner en contacto la muestra de tejido con la molécula de captura. El tejido puede fijarse en una solución de fijación adecuada antes de contactar con la molécula de captura. Las soluciones de fijación adecuadas se conocen generalmente en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, paraformaldehído y diluciones de este. El tejido puede fijarse en un sustrato adecuado antes de ponerse en contacto con la molécula de captura. Los sustratos adecuados incluyen, entre otros, parafina, agar, gelatina, u otra cera. La muestra o componente de esta puede procesarse mediante el uso de cualquier método químico, método físico adecuado o combinaciones de estos para liberar, concentrar, separar y/o aislar los biomarcadores u otros componentes de la muestra antes de poner en contacto la muestra con la molécula de captura.
Kit
Kit que contienen inhibidores autofágicos
Los inhibidores autofágicos descritos en la presente descripción pueden presentarse como un kit de combinación. Como se usa en la presente descripción, los términos "kit de combinación" o "kit de partes" se refieren al compuesto o formulaciones farmacéuticas y componentes adicionales que se usan para envasar, vender, comercializar, entregar, y/o administrar la combinación de elementos o un solo elemento, tal como el ingrediente activo, contenido en el mismo. Tales componentes adicionales incluyen, pero sin limitarse a, envases, jeringas, envases de blíster, botellas, y similares. Cuando uno o más de los componentes (por ejemplo, agentes activos) contenidos en el kit se administran simultáneamente, el kit de combinación puede contener los agentes activos en una sola forma de dosificación (por ejemplo, una tableta) o en formas de dosificación separadas.
Cuando los agentes no se administran simultáneamente, el kit de combinación puede contener cada agente en formulaciones farmacéuticas separadas. Las formulaciones farmacéuticas separadas pueden contenerse en un solo paquete o en paquetes separados dentro del kit. En algunas modalidades, el kit de combinación también incluye instrucciones impresas o contenidas de cualquier otra manera en un medio de expresión tangible. Las instrucciones pueden proporcionar información sobre el contenido del inhibidor autofágico o las formulaciones farmacéuticas que contienen el inhibidor autofágico, información de seguridad sobre el contenido de los compuestos o fórmulas farmacéuticas contenidas, información sobre las dosis, indicaciones de uso y/o régimen(es) de tratamiento recomendado(s) para el(los) compuesto(s) y/o formulaciones farmacéuticas contenidas en el mismo. En algunas modalidades, las instrucciones proporcionan instrucciones para administrar el inhibidor autofágico o la formulación farmacéutica que contiene un inhibidor autofágico a un sujeto que tiene endometriosis.
Kit que contienen las moléculas de captura
También se describen en la presente descripción kit que contienen una o más moléculas de captura descritas en la presente descripción. En algunas modalidades, el kit puede contener uno o más anticuerpos o fragmentos de estos configurados para unirse específicamente a un biomarcador descrito en la presente descripción. El kit puede contener polinucleótidos configurados para unirse específicamente a un biomarcador descrito en la presente descripción. El kit también puede contener un reactivo para realizar una matriz, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa (qPCR), PCR en tiempo real, qPCR en tiempo real, citometría de flujo, una inmunotransferencia Western, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, hibridación in situ, secuenciación de nucleótidos, espectrometría de masas, electroforesis en gel 1-D, electroforesis en gel 2-D, cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía líquida, cromatografía de afinidad, o combinaciones de estas. El kit puede contener instrucciones fijadas en un medio tangible de expresión donde las instrucciones prevén el diagnóstico y/o pronóstico de endometriosis y/o una lesión endometriósica.
Ejemplos
Ahora que se describieron las modalidades de la presente divulgación, en general, los siguientes ejemplos describen algunas modalidades adicionales de la presente divulgación.
Ejemplo 1: micromatriz de tejido para la evaluación de la autofagia en lesiones endometriósicas
Se usó una micromatriz de tejido (TMA) para evaluar la autofagia en lesiones endometriósicas. La TMA contenía lesiones ectópicas endometriósicas de diversos sitios junto con endometrio eutópico. Específicamente, la TMA contenía lesiones endometriósicas ectópicas de diversos sitios junto con endometrio eutópico (normal y de pacientes con endometriosis) de fases específicas del ciclo del endometrio 30. Se usaron un total de 164 biopsias centrales obtenidas de 83 bloques de tejido para construir la micromatriz de tejido (TMA). Para la mayoría de los bloques, se incluyeron 2 biopsias centrales diferentes en el TMA. El número total de núcleos en el TMA son 29 endometriosis ovárica, 16 endometriosis de las trompas de Falopio, 34 endometriosis peritoneal, 4 endometriosis cutánea (umbilical), 7 gastrointestinal (GU), 22 endometrio eutópico de pacientes con endometriosis (EE), 14 controles de endometrio en fase proliferativa (PE), y 38 controles de endometrio en fase secretora (SE).
Como se muestra en las Figuras 1A-1E, los niveles de LC3A se evaluaron mediante el uso de un anticuerpo que detecta tanto la forma soluble como la unida al autofagosoma de la proteína LC3A. Existían tres patrones de inmunorreactividad de LC3A: (1) citoplasmático difuso, (2) citoplasmático/perinuclear y (3) estructuras “similares a piedras” (SLS) que son componentes amorfos redondos grandes y densamente teñidos encerrados dentro de vacuolas citoplasmáticas. Previamente se observó que altos niveles de estructuras SLS LC3A se correlacionaban con la agresividad del tumor y/o la progresión de la enfermedad. La intensidad de la expresión estromal de LC3A se redujo en las lesiones ectópicas (ováricas y de Falopio) en relación con la intensidad en las glándulas epiteliales (Figuras 2A-2B), que muestran una mayor expresión de LC3A con estructuras claras de SLS (Figura 3). Además, como se presenta en la Figura 4, en relación con HES (una línea celular epitelial endometrial normal), las células endometriósicas de vida prolongada (abreviadas "IE") muestran una mayor expresión de marcadores autofágicos (es decir, ATG7, ATG5, y hVps34). En conjunto, los resultados sugieren que el epitelio glandular de las lesiones endometriósicas aumentó la expresión de LC3-II, lo que puede correlacionarse con mayores niveles de flujo autofágico en el epitelio de las lesiones.
Ejemplo 2 Efecto de un inhibidor autofágico sobre células endometriósicas de vida prolongada
Las células endometriósicas (IE) de vida extendida se trataron con cloroquina 25 pM durante hasta aproximadamente 96 horas. Después las células se tiñeron con cristal violeta y se midió el crecimiento global a una absorbancia de 570 nm, mediante el uso de un lector de placas Bioteck.
La cloroquina es un inhibidor del flujo autofágico, que inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma y probablemente conduce a una acumulación de autofagosomas en la línea celular IE. Además, se observó que la supervivencia celular se inhibía drásticamente con el tratamiento con cloroquina (CQ) (Figura 11). Además, se observó que también hubo un marcado aumento en los niveles de LC3-II (Figura 12). Estos resultados sugieren que las células endometriósicas de vida extendida pueden ser "adictas" a la autofagia para la supervivencia celular. Las células adictas a la autofagia dependen de la autofagia para la supervivencia celular. En otras palabras, sin autofagia, las células adictas a la autofagia sucumben a la muerte celular.
Ejemplo 3: Efecto de la hidroxicloroquina sobre la endometriosis in vivo
Para determinar el efecto de la hidroxicloroquina sobre la endometriosis in vivo, se alimentó a ratones (ratones de fondo C57BL/6 de 6-8 semanas de edad) con una dieta para ratones y se les dio acceso ad libitum al agua y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h bajo condiciones controladas. Antes de cualquier procedimiento invasivo, los ratones se anestesiaron mediante el uso de isofluorano (velocidad de flujo del vaporizador inicial de 3-5 %) implementado una vez antes de un procedimiento invasivo. A los ratones también se les administró ketoprofeno (10 mg/kg) por vía subcutánea como agente analgésico posoperatorio durante las primeras 24 horas y después según fuera necesario. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones estériles.
Se ordenó a los ratones a las 3-5 semanas de edad que los recibieran y les permitieran aclimatarse a las condiciones de alojamiento antes del inicio de la investigación cuando los ratones tenían entre 6 y 8 semanas de edad. Como la endometriosis es una enfermedad dependiente de estrógenos, los ratones donantes recibieron suplementos de estrógenos (ya sea en forma de gránulos o mediante inyección de 17-p-estradiol) para representar de cerca las condiciones in vivo, así como también para generar un perfil hormonal uniforme en ausencia del ciclado de animales normal. Los ratones donantes usados fueron ratones C57BL/6 (tipo salvaje) (Jackson Laboratories). Todos los ratones receptores tenían antecedentes genéticos C57BL/6. Los ratones donantes se trataron con 17-pestradiol (la dependencia de los estrógenos del crecimiento de las lesiones endometriósicas es un fenómeno bien conocido). Esto se administrará 1 semana antes de la recolección de cuernos uterinos y la inyección de fragmentos endometriales. La dependencia de estrógenos del crecimiento de las lesiones endometriósicas es un fenómeno conocido. Después de 1 semana de tratamiento con estrógenos, se sacrificó a los ratones donantes, se extrajeron los cuernos uterinos y se subdividieron en 2 fragmentos iguales que después pueden triturarse e inyectarse en 2 ratones receptores como se describe más abajo. Un cuerno uterino puede inyectarse en 1 ratón receptor, mientras que el otro cuerno uterino puede inyectarse en el segundo ratón receptor. De esta manera, puede recolectarse suficiente tejido del cuerno uterino de un solo ratón donante para subdividirlo en 2 ratones receptores.
Los fragmentos de endometrio se obtuvieron mediante la descamación suavemente de la serosa y el miometrio, seguido de trituración con una hoja de afeitar. Los fragmentos se suspendieron en aproximadamente 0,6 mL de solución salina tamponada con fosfato y se inyectaron con una aguja de calibre 18 a través de la pared abdominal debajo del ombligo en la cavidad peritoneal de los ratones receptores con una proporción de un donante por dos receptores (cantidades equivalentes). Este procedimiento se realizó bajo anestesia mediante el uso de isofluorano (velocidad de flujo inicial del vaporizador de 3-5 %) implementado una vez antes del procedimiento invasivo, así como también ketoprofeno (10 mg/kg) por vía subcutánea como agente analgésico posoperatorio durante las primeras 24 horas y después según sea necesario. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones estériles.
Dos semanas después de la inducción, las lesiones se desarrollaron y formaron estructuras similares a quistes. Cuando las lesiones se desarrollaron hasta este punto, los ratones se sacrificaron. Las lesiones se identificaron, removieron y analizaron.
Para evaluar el efecto de la hidroxicloroquina en la formación de lesiones, se usaron dos grupos de ratones C57BL/6: el primer grupo recibió inyecciones intraperitoneales diarias con 60 mg/kg de hidroxicloroquina en 100 ul de PBS y el segundo grupo recibió 100 pL de PBS y un tratamiento único con hidroxicloroquina (60 mg/kg) ((HCQ) disuelta en PBS) el día de la implantación del fragmento endometrial. Los ratones se sacrificaron para evaluar las lesiones 14 días después del inicio del tratamiento. Se inspeccionó el abdomen y se extirparon las lesiones del tejido circundante. Los resultados se muestran en la Figura 5, que demuestra la efectividad de la hidroxicloroquina en las lesiones endometriósicas.
Ejemplo 4: Desarrollo de células endometriósicas de vida prolongada
Las endometriósicas primarias se mantuvieron en una mezcla 1:1 de Medio 199 y MCDB131 con suero bovino setal al 8 % y penicilina/estreptomicina junto con insulina/transferrina/selenio (ITS) (estreptomicina (100 mg/mL; diluida 1:100 en medio de cultivo completo) e insulina (5 mg/mL)/transferrina (5 mg/mL)/selenio (5 pg/mL)). Se usó el antígeno T grande de SV40 para inmortalizar las células primarias. El vector pBABE-puro del antígeno LargeT se obtuvo de Addgene. Se generaron partículas retrovirales mediante la utilización de células HEK293T. Estas células se transfectaron con el vector pCGp y pVSVG. Las colecciones de medios retrovirales se recogieron a las 48 h y 72 h después de la transfección. Estas partículas se filtraron (eliminación de células HEK293T) y después se usaron para infectar las células endometriósicas primarias. Después de la infección, las células se trataron con puromicina (2,5 pg/mL) para seleccionar las células infectadas positivamente. Se aislaron seis colonias y se ampliaron y validaron para uso futuro.
Ejemplo 5: Caracterización de las células endometriósicas de vida extendida
Las células endometriósicas de vida extendida se caracterizaron antes de (células endometriales primarias) y después de la expresión del antígeno T grande (vida extendida). Como se demuestra en las Figuras 6A y 6B se compararon células endometriósicas primarias derivadas del tejido endometrial de una paciente con endometriosis (C y D primarias) con endometrioide (células TOV112D), línea celular de cáncer de ovario de células claras (TOV21G), adenocarcinoma endometrial (MFE 296, MFE319, AN3- CA, KLE, HEC-1A) y líneas celulares de carcinoma epitelial de ovario seroso (OVCAR8, HEY, SKOV3) para determinar los patrones de expresión de proteínas (perfiles) de promotores tumorales (EVI1, RON, EGFR, SnoN, AKT), supresores tumorales (TGFpRIl, Smad2/3,PTEN), marcadores de autofagia (ATG5, ATG7, beclina-1, hVps34), marcadores epiteliales (E-cadherina), y marcadores estromales (Ncadherina, vimentina). También se evaluó en tándem una célula normal del epitelio de la superficie del ovario inmortalizada (T80). La expresión de proteínas se evaluó mediante inmunotransferencia Western. Todas las células evaluadas fueron negativas para micoplasma y perfiladas con STR (repetición corta en tándem) para validar las líneas celulares y detectar la contaminación de células HeLa.
Como se demuestra en las Figuras 6A y 6B, las células primarias expresaron los supresores de tumores PTEN y Smad2/3 con niveles indetectables de los promotores de tumores EVI1 y SnoN/SkiL. No pudo detectarse la expresión de E-cadherina en las líneas celulares primarias C y D, aunque se observó un bajo nivel de expresión de los marcadores estromales, vimentina y N-cadherina. Estos resultados sugieren que las líneas celulares primarias contienen características de células estromales. De hecho, la observación visual de las células primarias bajo el microscopio óptico demostró claramente la presencia de dos tipos de células distintas, una con morfología de panal representativa de una población de células endometriósicas de tipo epitelial con otro tipo de células de una morfología de fibroblastos más alargada. Además, después de varios pases en cultivo, la población cambió mucho a favor de la morfología de tipo estromal, lo que sugiere que la población de células de tipo estromal era capaz de superar a la población epitelial de crecimiento más lento (datos no mostrados). En adición, se observó que la capacidad de crecimiento de la línea celular se ralentizaba notablemente después de 10 pases en cultivo, lo que dificultaba los estudios a largo plazo.
Las células endometriósicas D primarias se infectaron retroviralmente con el antígeno T grande de SV40 y se seleccionaron con puromicina. Se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron durante un mes. Se recolectó el lisado de cada colonia y se evaluó la expresión del antígeno T grande. Se usaron otros marcadores para evaluar el cambio en la expresión celular debido al antígeno T grande de SV40 (EVI1, SnoN y marcadores de autofagia), así como también la confirmación de la selección positiva de células epiteliales (ausencia de vimentina). La expresión de p53 indica inactivación a través de la expresión del antígeno T grande. Los resultados del análisis de expresión de proteínas en estas células se muestran en las Figuras 7A y 7B. La confirmación de la ausencia de vimentina y la presencia de citoqueratina-18 (Cy3) (marcador epitelial) se realizó mediante inmunofluorescencia. Las células T80 sirven como control positivo para Cy3 y SKOV3 como control positivo para vimentina. Estos resultados se muestran en las Figuras 8A-8L.
Se observó una expresión disminuida del marcador estromal vimentina (en relación con las células primarias) (Figuras 7A y 7B) en las células de vida extendida (IE), lo que sugiere la selección exitosa de la población de células endometriósicas de tipo epitelial. La naturaleza epitelial de las poblaciones seleccionadas se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia para citoqueratina-18 (un marcador epitelial) y vimentina (un marcador mesenquimatoso) (Figuras 8A-8L). Se utilizaron células T80 como control positivo para citoqueratina-18 y control negativo para vimentina. Se utilizaron células de cáncer de ovario SKOV3 como control positivo para vimentina y citoqueratina-18. Estos resultados sugieren que las células que expresan el antígeno T grande SV40 endometriósico tenían una fuerte expresión de citoqueratina-18 con una expresión indetectable de vimentina.
Como se demuestra en las Figuras 7A y 7B, la expresión estable del antígeno T grande de SV40 no altera significativamente la expresión proteica de EV11 y SnoN (signos promotores de tumores), Smad2/3 (supresor de tumores), ATG7, ATG5, beclina-1 y hVps34 (marcadores de autofagia) en comparación con las células endometriósicas primarias que no expresan el antígeno T grande de SV40. En comparación con el cáncer de ovario de células claras (TOV21G) y el cáncer de ovario endometrioide (TOV112D). La única diferencia observada en la expresión entre estas líneas y las células de vida extendida (IE) y estas líneas fue el aumento observado en p53. Este aumento podría deberse al papel del antígeno T grande en la inactivación de p53, lo que podría dar como resultado una incapacidad de p53 para renovarse.
Se observó que las células endometriales de vida extendida generadas a partir de la transformación de células endometriales primarias con antígeno T grande SV40 (células IE) tenían un perfil STR único. Dado que Ras y PIK3CA se consideran mediadores importantes en la transición de la endometriosis al cáncer de ovario de células claras, se evaluó el estado mutacional de los genes en las células de vida extendida (IE). Brevemente, se aisló el ADN genómico de las células IE y se sintetizaron y utilizaron para la secuenciación los cebadores para PIK3CA (específicamente en los exones 9 y 20), así como también K-Ras (específico para el sitio de unión a GTP). Sus secuencias se compararon con la expresión de la secuencia normal derivada de las células parentales T80 para confirmar que no había mutaciones presentes. Para determinar si las células IE carecen de marcadores de otros tipos de células potencialmente contaminantes, se aisló el ADN genómico de las células IE y se completó un análisis de perfiles de repetición en tándem corto (STR) (a través de Genetica Laboratories). STR es el análisis de segmentos repetidos de ADN (aproximadamente de 2 a 6 pares de bases) esparcidos por el genoma. En resumen, Genetica proporciona un cribado de ADN altamente sensible de las líneas celulares proporcionadas y las compara con las bases de datos disponibles. El servicio es útil tanto para tipos de células humanas como de ratones y permite la certeza de contaminación cruzada de hasta el 5 % del ADN. La evaluación incluyó un estudio de una base de datos de líneas celulares que incluía células de la ATCC. El análisis indicó que las células IE tenían un origen único a partir de cualquier otro tipo de célula en las bases de datos disponibles para Genetica.
Ejemplo 6:
Abreviaturas: ATG, gen relacionado con la autofagia; BNIP3, BCL2/proteína de interacción adenovirus de 19 kDa E1B; CK8, citoqueratina 8; EIF2AK3, factor de iniciación de la traducción eucariota 2-alfa cinasa 3; ERa, receptor de estrógeno alfa; FBS, suero fetal bovino; GABARAPL1, proteína asociada al receptor GABA(A) tipo 1; G-CSF, factor estimulante de colonias de granulocitos; GI, tracto gastrointestinal; HCQ, hidroxicloroquina; IGF1, factor de crecimiento similar a la insulina 1; IP-10, proteína inducida por interferón gamma de 10 kDa; IRGM1, familia M1 de GTPasas relacionadas con la inmunidad; ITS, insulina transferrina selenio; LC3B, proteína asociada a microtúbulos 1 cadena ligera 3 beta; PE, fosfatidiletanolamina; PIK3C3, fosfatidilinositol 3-quinasa, subunidad catalítica tipo 3; PBS, solución salina tamponada con fosfato; PRKAA1, subunidad catalítica alfa 1 activada por AMP; PR, receptor de progesterona; PTEN, homólogo de fosfatasa y tensina; SQSTM1, Sequestosoma 1; STR, repetición corta en tándem; SV40, virus de simio 40; TEM, microscopía electrónica de transmisión; TMA, micromatriz de tejido; ULK1, cinasa 1 activadora de autofagia similar a unc-51.
Introducción: La endometriosis es una enfermedad crónica, dolorosa, y debilitante en la que crecen células estromales y glandulares similares al endometrio fuera de la cavidad uterina.[1,2] Es una enfermedad inflamatoria y dependiente de estrógenos que afecta del 6 al 10 % de las mujeres durante sus años reproductivos y hasta el 50 % de las mujeres que reciben tratamientos de fertilidad. [3] La hipótesis de Sampson (la teoría más aceptada) establece que el tejido endometrial que se desprende durante la menstruación llega a la cavidad peritoneal al salir del útero a través de las trompas de Falopio por la menstruación retrógrada. [4-6] Estas células endometriales desprendidas sobreviven, se implantan y crecen en lugares ectópicos, y se convierten en lesiones endometriósicas.
[5, 7]
Las células epiteliales normalmente sufren anoikis, un mecanismo de muerte celular programada, al separarse de la matriz extracelular. [8] Sin ligarse a la teoría, la autofagia podría potencialmente alterar la respuesta anoikis en las células endometriales. Esta vía celular participa en la homeostasis celular. [9, 10] Bajo condiciones de estrés, los cambios en el flujo autofágico pueden conducir a una supervivencia celular alterada. [9, 10] La autofagia es un proceso complejo que comienza con la formación de vesículas de doble membrana, denominadas autofagosomas, que engullen componentes citoplasmáticos. Brevemente, los autofagosomas se fusionan con los lisosomas para degradar y reciclar su carga compuesta por proteínas oxidadas, lípidos, y organelos dañados. Actualmente, existe evidencia limitada de que la autofagia contribuye al desarrollo y progresión de la endometriosis. En un modelo de inducción quirúrgica de endometriosis murina, se detectó un aumento de la expresión de ATG9A, un mediador autofágico que participa en la formación de vesículas [11], en el endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida. [12] En los endometriomas humanos (endometriosis ovárica), hubo una reducción de la proteína LC3-II (la forma conjugada de LC3) en comparación con el tejido endometrial eutópico de control. [13] En contraste, un estudio independiente informó que la expresión de proteína de LC3-II se elevó mientras que p62 (que se une a la carga ubiquitinada para la degradación) disminuyó en endometriomas de ovario en comparación con endometrio eutópico de participantes sin enfermedad. [14]
Este ejemplo evalúa los efectos terapéuticos de un inhibidor del flujo autofágico y lisosomotrópico, la hidroxicloroquina (HCQ), [15-17] en células endometriósicas humanas y en un modelo de endometriosis en ratones establecido. Los resultados demuestran un tratamiento no hormonal para esta enfermedad aún incurable y común.
Resultados:
La hidroxicloroquina altera la supervivencia de las células endometriales y endometriósicas humanas, así como también el número de lesiones y la histopatología en un modelo de endometriosis en ratones. Para evaluar si un inhibidor del flujo autofágico podría alterar la capacidad de supervivencia de las células aisladas de lesiones endometriósicas humanas, tratamos células endometriósicas humanas de vida prolongada (aisladas de dos pacientes individuales derivados de diferentes tipos de lesiones y, por lo tanto, se probaron por separado) con hidroxicloroquina 25 pM (HCQ). Esta dosis se seleccionó en base a nuestros estudios previos. [18] Como se muestra en las Figura 9A y 9B, se observó una marcada reducción en la supervivencia celular de células endometriósicas humanas de dos tipos diferentes de lesiones (p < 0,0001) después de 5 días de tratamiento con HCQ. Para validar la actividad de HCQ, se realizó un análisis de inmunotransferencia Western para LC3B, que mostró que LC3B-II aumentó con el tratamiento con HCQ en estas células endometriósicas humanas (Figura 9C). Se observó una reducción similar en la supervivencia celular y un aumento en la proteína LC3B-II en las células del estroma endometrial humano T-HESC (derivadas de mioma, Figuras 37-38). Para confirmar el efecto de la inhibición de la autofagia, realizamos la inactivación por ARNip para ATG5, beclina-1, ATG7, PIK3C3, y LC3B en células endometriales y endometriósicas humanas. Se logró una eficiencia de inactivación superior al 90 % de los mediadores autofágicos descritos anteriormente en células T-HESC (Figura 37). Los niveles de proteína de p21 (un inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina implicado en la detención del ciclo celular) aumentaron con el ARNip dirigido a beclina-1, ATG7, y LC3B. Por lo tanto, estos mediadores autofágicos se investigaron para evaluar sus efectos sobre la viabilidad celular mediante el uso del ensayo CellTiter-glo en estas células. Como se muestra en la Figura 38, la viabilidad celular de T-HESC se redujo significativamente en todas estas condiciones de inactivación, particularmente con ATG7. Sin ligarse a la teoría, estas observaciones sugieren que el uso de HCQ (o la orientación de mediadores autofágicos) puede ser perjudicial para la supervivencia de las células endometriales y endometriales humanas.
Para determinar si el tratamiento con HCQ altera la formación de lesiones endometriósicas, se utilizó un modelo de endometriosis inducida murina en el que los ratones reciben inyecciones de fragmentos de cuerno uterino que se convierten en lesiones en 2 semanas. [19, 20] Los ratones receptores (con endometriosis inducida) se trataron con 60 mg/kg de HCQ21 o solución salina tamponada con fosfato (PBS, Figura 12). Este tratamiento se repitió una vez cada siete días después de la inducción. Los ratones que no se inyectaron con fragmentos de cuerno uterino ni se trataron se usaron como controles (Figura 39). Todos los ratones se sacrificaron al mismo tiempo (14 días después de la inducción de endometriosis para los grupos de tratamiento con PBS y HCQ). Las lesiones ectópicas que se desarrollaron en los ratones receptores (flecha blanca, Figuras 40A-40B) se contaron, midieron, y recolectaron para análisis de ARN y proteína, así como también para tinción histológica. No se observaron lesiones en el grupo de control (marcado como N, Figuras 40A-40B). La mayoría (87,5 %) de los ratones con endometriosis inducida desarrollaron lesiones. En el momento de la recolección, notamos que las lesiones endometriósicas variaban en tamaño, color y ubicación entre los grupos de tratamiento. Como se muestra en las Figuras 13A-13C, hubo una reducción significativa en el número de lesiones que se desarrollaron en ratones tratados con HCQ en comparación con los tratados con PBS (p = 0,0007; ratones tratados con PBS, n = 24 [con un total de 46 lesiones] y HCQ -ratones tratados, n=25 [con un total de 18 lesiones]).
Un subconjunto seleccionado al azar de las lesiones y cuernos uterinos recolectados se procesaron para teñirlos con hematoxilina y eosina (H&E) (lesiones endometriósicas confirmadas patológicamente de ratones tratados con PBS y HCQ, n = 15 cada uno; cuernos uterinos derivados de ratones tratados con PBS, n = 10 y cuernos uterinos derivados de ratones tratados con HCQ, n = 10). Curiosamente, como se muestra en las Figuras 14A-14D, se observó un patrón de epitelio irregular en 5 de 10 cuernos uterinos derivados de ratones tratados con HCQ en comparación con los derivados de ratones tratados con PBS. En adición, observamos que los crecimientos ectópicos de los ratones tratados con HCQ no se parecían histológicamente a las lesiones endometriósicas (es decir, no contenían los componentes glandulares esperados) mientras que los tratados con PBS sí (Figuras 14A-14D, las puntas de flecha negras indican compartimentos glandulares mientras que las flechas negras indican células epiteliales dentro de las lesiones) (p=0,03, según la prueba exacta de Fisher). Juntos, estos resultados demuestran que HCQ reduce el número de lesiones endometriósicas y altera la organización celular dentro de estos tejidos.
Niveles alterados de macrófagos peritoneales y citocina IP-10 de ratones tratados con HCQ. Para investigar los cambios en la respuesta inflamatoria a la endometriosis, se cuantificaron 32 citocinas/quimiocinas en el líquido peritoneal recolectado de ratones control (n = 4) y receptores (n = 3) mediante el uso de un ensayo de panel de perlas magnéticas de citocinas y quimiocinas de ratón. De las 32 citocinas/quimiocinas analizadas, se identificó que G-CSF, eotaxina, e IP-10 (también conocida como CXCL10) estaban dentro de los límites de sensibilidad y detección del ensayo. Figura 15. Por el contrario, se identificó que IP-10 aumentó significativamente (p = 0,0079) en el líquido peritoneal obtenido de ratones tratados con HCQ (n = 5) en comparación con ratones tratados con PBS (n = 5), mientras que G-CSF y eotaxina permanecieron sin cambios (Figura 16).
También se evaluó el número de macrófagos en ratones receptores de control, receptores (no tratados), tratados con PBS, y tratados con HCQ. No hubo cambios significativos en el número de macrófagos presentes en la cavidad peritoneal de los ratones control y con endometriosis inducida en el momento de la recolección de la muestra (2 semanas después de la inducción), mediante el uso de los marcadores canónicos de macrófagos CD11b y F4/80 (Figuras 17A-17C). Sin embargo, se observó un aumento significativo (p = 0,0079) en el número de macrófagos en ratones tratados con HCQ en comparación con ratones tratados con PBS (Figuras 18A-18C). Estos datos indican que la HCQ altera la respuesta inflamatoria de los ratones con endometriosis inducida.
HCQ induce la desorganización celular en lesiones endometriósicas y endometrio eutópico murinos. Para determinar si el tratamiento con HCQ altera la histopatología (organización de los tejidos) de los cuernos uterinos y otros tejidos de los receptores, se desarrolló una micromatriz de tejido murino (TMA) compuesta por 113 núcleos y se realizó tinción H&E, así como también inmunohistoquímica. El TMA contenía cuernos uterinos y ovarios de 10 ratones tratados con PBS y 10 con HCQ, así como también una glándula mamaria, un riñón, un ganglio linfático, y un intestino delgado de un ratón tratado con PBS para usar como controles de anticuerpos. Con base en la tinción con H&E, observamos que el epitelio luminal del endometrio del cuerno uterino de los ratones tratados con HCQ tenía un patrón irregular (Figuras 19A-19X). La vimentina y la citoqueratina 8 (CK8) parecían localizarse adecuadamente en los compartimentos estromal y epitelial, respectivamente, independientemente del tratamiento con HCQ. El receptor de estrógeno a (ERa) se localizó principalmente en la capa de células epiteliales de las glándulas endometriales, mientras que el receptor de progesterona (PR) parecía distribuirse uniformemente entre los compartimentos de células estromales y epiteliales. [24] Sin embargo, la tinción de PR fue comparativamente mucho más débil que la de ERa. Nuevamente, no se observaron diferencias en los tejidos de ratones tratados con PBS y HCQ para el patrón o la intensidad de tinción de ERa y PR. La expresión de LC3B parecía más intensa en los ratones tratados con HCQ en relación con los ratones tratados con PBS tanto en el compartimento estromal como en el epitelial (Figuras 19A-19X). También se tiñeron los mismos marcadores inmunohistoquímicos en los ovarios, pero no se observaron diferencias marcadas en la intensidad o el patrón de localización de ninguna de estas proteínas en estos tejidos de ratones tratados con HCQ en relación con los de ratones tratados con PBS.
La inducción de endometriosis regula negativamente la expresión de ARNm y proteínas de marcadores autofágicos en el endometrio murino ectópico en comparación con el eutópico. Para determinar si la expresión de mediadores autofágicos en los cuernos uterinos y las lesiones difiere entre ratones tratados con PBS y HCQ, se usó PCR en tiempo real para cuantificar los niveles de transcripción de ARNm de 10 moléculas principales involucradas en la vía autofágica. En los animales tratados con PBS, se determinó que los niveles de ARNm de ATG5 (p = 0,0294), ATG4B (p = 0,0004), ATG2B (p = 0,0440) y beclina-1 (p < 0,0001) se redujeron significativamente en las lesiones endometriósicas analizadas en comparación con los cuernos uterinos (cuernos uterinos de ratones tratados con PBS, n = 14; lesiones de ratones tratados con PBS, n = 28; cuernos uterinos de ratones tratados con HCQ, n = 15; y lesiones de ratones tratados con HCQ, n = 7) (Figura 4a). Debido a la disponibilidad limitada de muestras, LC3B y ATG2B se analizaron mediante el uso de un número menor de muestras (es decir, para LC3B: cuernos uterinos de ratones tratados con PBS, n = 9; lesiones de ratones tratados con PBS, n = 18; cuernos uterinos de HCQ ratones tratados, n = 10 y lesiones de ratones tratados con HCQ, n = 4. Para ATG2B: cuernos uterinos de ratones tratados con PBS, n = 5; lesiones de ratones tratados con PBS, n = 10; cuernos uterinos de ratones tratados con HCQ, n = 5; y lesiones de ratones tratados con HCQ, n = 2). No se observaron diferencias significativas entre las lesiones y los cuernos uterinos de los ratones C57BL/6 tratados con HCQ (probablemente debido al menor número de lesiones disponibles en el grupo HCQ, aunque se observaron tendencias similares). Sin embargo, las lesiones obtenidas de estos ratones tratados con HCQ tenían un aumento significativo en ATG5 (p = 0,0499) y ATG3 (p = 0,0248) en comparación con las lesiones de los ratones tratados con PBS (Figuras 22A-22J). Un patólogo certificado confirmó componentes epiteliales y estromales en las lesiones analizadas. Las lesiones (bloques independientes y no en el TMA descrito anteriormente [ver la sección de Materiales y métodos de este Ejemplo]) también se inmunotiñeron para CK8, vimentina, Era, y PR, y LC3B (Figuras 20A-20J). Las células epiteliales de las glándulas dieron positivo para la expresión de CK8, Era, y PR, lo que proporciona datos de apoyo de que las lesiones recolectadas se originaron en tejido endometrial (Figuras 20A-20J). Se observó una ausencia de componentes glandulares en cuatro de las siete lesiones teñidas de ratones tratados con HCQ, como lo demuestra la tinción inmunohistoquímica de CK8, Era, y PR. Estos resultados (con los datos de H&E presentados en las Figuras 14A-14D) sugieren que la HCQ altera la organización de los crecimientos ectópicos en el modelo murino de endometriosis. Las Figuras 21A-21H muestran imágenes representativas de controles de tinción positivos y negativos para los anticuerpos usados.
La cepa de ratón Balb/c también se usó para el modelo de inducción para demostrar que los cambios observados en la expresión del gen de autofagia son independientes de la cepa genética de ratón usada. [20] En este modelo, se identificó que los niveles de ARNm de ATG7 (p = 0,0174), ATG4B (p = 0,0020) y beclina-1 (p < 0,0001) se redujeron significativamente en las lesiones endometriósicas (n = 8) en comparación a cuernos uterinos (n = 8) derivados de estos ratones receptores (Figuras 41A-41F).
Los niveles de proteína de los marcadores autofágicos se analizaron tanto en lesiones como en cuernos uterinos de ratones tratados con PBS y HCQ (Figura 23) de los siguientes grupos: (1) ratones tratados con PBS: cuernos uterinos (n = 15), (2) HCQ -ratones tratados: cuernos uterinos (n = 15), (3) ratones tratados con PBS: lesiones (n = 10) y (4) ratones tratados con HCQ: lesiones (n = 7). LC3B-I, LC3B-II, Lc 3A-I y LC3A-II disminuyeron en las lesiones en comparación con los cuernos uterinos de ratones tratados con PBS y HCQ. La expresión de GABARAPL1-I se detectó en cuernos uterinos recolectados de ambos grupos de ratones tratados y disminuyó en las lesiones; sin embargo, la forma conjugada, GABARAPL1-II, no se observó en ninguno de los especímenes murinos. También se observó una disminución de p62 en lesiones endometriósicas en relación con los cuernos uterinos que fue independiente del tratamiento con HCQ. Los niveles de proteína FOXO1 y AMPKa en los cuernos uterinos fueron variables entre las muestras analizadas, aunque ambos se redujeron dentro de las lesiones (Figuras 23 y 24A-H). Para determinar si el tratamiento con HCQ alteró la expresión de mediadores autofágicos en otros órganos, se recolectaron diversas muestras de tejido (riñones, timo, bazo, pulmón, páncreas, corazón e hígado) de cada grupo de tratamiento (5 ratones tratados con PBS y 5 ratones tratados con HCQ). ratones) y se evaluaron los niveles de LC3B (Figuras 46 y 47A-47H). El pulmón y el corazón mostraron diferencias en la expresión de LC3B-II después del tratamiento con HCQ. En general, estos resultados sugieren que la expresión proteica de los mediadores autofágicos se desregula en las lesiones endometriósicas.
La expresión de ARN de los marcadores autofágicos se desregula en el endometrio eutópico tras la inducción de la endometriosis. El endometrio eutópico de pacientes con endometriosis difiere del endometrio eutópico de sujetos sin endometriosis. [25, 26] Para identificar los cambios en la expresión de los principales marcadores autofágicos en este contexto, se usó una matriz de perfiles centrados en la autofagia RT2-PCR para analizar el ARN aislado de los cuernos uterinos del control (no inducido) y del receptor (no tratado). Los cuernos uterinos de los ratones receptores se compararon con los de los ratones receptores tratados con PBS para verificar que no se produjo ningún cambio significativo tras la inyección intraperitoneal con PBS. Se seleccionaron tres muestras representativas de cada grupo en función de la calidad del ARN. En la Figura 25 se muestra un mapa de calor que compara la expresión génica en ARN aislado de cuernos uterinos de ratones de control respecto a ratones receptores. Los resultados indicaron que existe un subconjunto de genes de autofagia que se expresa de manera diferencial. En la Figura 26 se muestra un gráfico de volcán que muestra los cambios en veces en los genes de autofagia en el endometrio eutópico entre ratones receptores y de control. Se identificaron genes desregulados (con significación estadística) entre estos dos grupos de muestras. IGF1 fue el marcador autofágico que aumentó significativamente (p = 0,044); los 12 marcadores restantes se redujeron significativamente (BNIP3, p = 0,015; ATG9B, p = 0,015; Lc 3a , p = 0,007; LC3B, p = 0,0012; PRKAA1, p = 0,023; ATG4C, p = 0,031; FAS, p = 0,003; IRGM1, p = 0,025; GABARAPL1, p = 0,045; PTEN, p = 0,048; EIF2AK3, p = 0,043 y s QsTM1, p = 0,054). Como se muestra en la Figura 42, no se observaron cambios significativos tras el tratamiento con PBS en la matriz de RT2-PCR.
Para validar estos “mejores resultados” (es decir, aumentados al menos dos veces con p < 0,05) identificados a partir de la matriz del perfilador de RT2-PCR de la vía autofágica, realizamos una PCR en tiempo real mediante el uso de sondas/cebadores marcados con TaqMan FAM (Figuras 27A-27M y 48). Con este enfoque, se validaron 10 de los 13 “mejores resultados” (Figuras 27A-27M): ATG4C (p = 0,0167), ATG9B (0,0113), EIF2AK3 (p = 0,0068), FAS (p = 0,0034), LC3A (p = 0,0306), LC3B (p = 0,0040), GABARAPL1 (p = 0,0360), PTEN (p = 0,0295), SQSTM1 (p = 0,0008) y PRKAA1 (p = 0,0065) se redujeron significativamente. Se observó que aumentó la expresión de EIF2AK3 (p = 0,0014) (Figuras 27A-27M). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la autofagia se desregula en el endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida.
Aumento de las gotas de proteína y lípidos LC3 en el endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida en comparación con el endometrio eutópico de los controles. Para determinar si los cambios en el nivel de ARN de los marcadores autofágicos clave observados entre el endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida (n = 10) y ratones no inducidos (control) (n = 10) se tradujeron en cambios en el nivel de proteína, se evaluaron sus niveles de proteína a través de análisis por inmunotransferencia Western. Como se muestra en las Figuras 28 y 29A-29H y 49, beclina-1 (cambio de 2,20 veces, p = 0,0330), LC3B-I (cambio de 4,00 veces, p = 0,0185), LC3B-II (cambio de 6,76 veces, p = 0,0364), LC3A-II (cambio de 1,97 veces, p = 0,0135) y GABARAPL1 (cambio de 1,95 veces, p = 0,0334) aumentaron significativamente en los cuernos uterinos de ratones con endometriosis inducida en relación con los de ratones de control. LC3A-I y LC3B-I tienen un peso molecular esperado de aproximadamente 16 kDa, mientras que LC3A-II y LC3B-II tienen un peso molecular esperado de aproximadamente 14 kDa.27. Cuando se evaluó la expresión de GABARAPL1, no se detectó la forma conjugada. Sin ligarse a la teoría, esta observación sugiere que la forma primaria expresada en estos tejidos es la forma citosólica (GABARAPL1-I). Para evaluar si los niveles aumentados de LC3B eran específicos de los cuernos uterinos en los ratones con endometriosis inducida, se analizaron los niveles de proteína LC3B en homogeneizados preparados a partir de riñones, timo, bazo, pulmón, páncreas, corazón, hígado, y ovarios de tanto ratones receptores (n = 3) como controles (n = 4). De los nueve tejidos analizados, sólo el riñón izquierdo, bazo e hígado parecían mostrar diferencias en los niveles de LC3B-II (Figuras 44 y 45A-45I).
Para comprobar si los aumentos observados en LC3A y LC3B se correlacionaban con un aumento en la formación de autofagosomas en el endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida, se realizó TEM (Figuras 30A-30G). Aunque no se identificaron autofagosomas en endometrio eutópico de ratones de control (Figuras 30A-D) y endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida (Figuras 30E-G), se observó un aumento en el número de gotitas de lípidos en las células epiteliales del endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida. En adición, también se observó que había más células epiteliales densas en electrones “no saludables” en los cuernos uterinos de ratones con endometriosis inducida (Figura 30E) en comparación con ratones de control (Figura 30A). Juntos y sin ligarse a la teoría, estos resultados sugieren que la expresión de mediadores autofágicos (es decir, LC3) se desregula en el endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida, lo que se asocia con una acumulación de gotitas de lípidos en las células epiteliales.
Tinción inmunohistoquímica de LC3B en el epitelio y los componentes del estroma del endometrio eutópico y ectópico en pacientes con endometriosis. La localización celular de LC3B dentro del endometrio ectópico y eutópico humano se evaluó mediante la aplicación de un enfoque inmunohistoquímico (IHC) mediante el uso de una micromatriz de endometriosis humana y tejido endometrial. [28] Se muestran imágenes IHC representativas del endometrio (controles y pacientes) y lesiones (trompas de Falopio, ovarios, peritoneal, gastrointestinal, y piel) (Figuras 31A-31J). Se observó que LC3B se localizaba principalmente en el epitelio, aunque también se observó tinción en el estroma. Para cuantificar la intensidad de la expresión de LC3B en estas ubicaciones celulares específicas, segmentamos las secciones mediante el uso del sistema de puntaje H en expresión fuerte, moderada, débil, o sin expresión (Figuras 32A-32B). La proporción de fuerte expresión fue elevada en las células epiteliales del endometrio proliferativo de los casos (40,6 %) y de las lesiones de ovario y trompa de Falopio (38,8 % y 38,0 %, respectivamente). El tejido endometriósico con la mayor proporción de fuerte expresión estromal fue el tracto gastrointestinal (GI) (17,4 %), seguido del endometrio proliferativo de los controles (14,1 %), endometrio proliferativo de las pacientes con endometriosis (13,6 %), y endometrio secretor de los controles (12,0 %) (Figuras 32A-32B). Se observó una diferencia significativa en la expresión de LC3B en el epitelio del endometrio secretor en comparación con el endometrio proliferativo (p = 0,0193) (Figura 43B). También se observó un aumento significativo en la expresión en el epitelio de las trompas de Falopio y lesiones endometriósicas de ovario en comparación con el epitelio del endometrio secretor de los controles (p = 0,0220 y p = 0,0097, respectivamente). En el estroma de las lesiones endometriósicas peritoneales, LC3B disminuyó en comparación con el estroma del endometrio proliferativo de los controles (p = 0,0101). En adición, en relación con el estroma, la inmunotinción de LC3B positiva fue significativamente más elevada en el componente epitelial de las lesiones en la trompa de Falopio, ovario y peritoneo, pero no en las lesiones derivadas del tracto gastrointestinal y la piel (Figura 43A). Juntos y sin ligarse a la teoría, la expresión y localización de LC3B fue predominante en el epitelio en relación con los componentes del estroma en todos los tipos de tejido evaluados.
Materiales y métodos:
Ética y micromatrices de tejidos. Todos los protocolos de este estudio se aprobaron por la Institutional Review Board (IRB) del Ponce Research Institute (Ponce, Puerto Rico). Las muestras en la micromatriz de tejido (TMA) se obtuvieron sin identificador a partir de muestras archivadas en un laboratorio de patología privado (Laboratorios de Patología del Sur en Ponce, Puerto Rico). Los detalles sobre la micromatriz de tejido humano (TMA) usada en este estudio se describieron anteriormente. [28] Brevemente, TMA contiene 164 núcleos, que se componen de lesiones (de los ovarios (n = 29), trompas de Falopio (n = 16), peritoneo (n = 34), la piel (n = 4) y tracto gastrointestinal (n =7)), endometrio eutópico de pacientes con endometriosis (n = 22), así como también endometrio secretor (n = 38) y proliferativo (n = 14) de pacientes sin endometriosis. Los pacientes y controles reclutados en este biobanco no estaban actualmente o estuvieron durante al menos 3 meses antes de la cirugía con ningún medicamento hormonal.
Manejo de animales.
Modelo de ratón C57BL/6. Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 de cinco semanas de edad de los laboratorios Jackson. Todos los animales se mantuvieron bajo un fotoperíodo estándar de 12 h; el alimento y el agua estuvieron disponibles ad libitum durante todo el estudio. Todos los procedimientos experimentales y el cuidado de los animales se aprobaron por el Animal Care and Use Committee (IACUC) de la University of South Florida (R IS00000101), de acuerdo con los principios descritos en la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals de los National Institutes of Health. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones asépticas con anestesia. El modelo de ratón de endometriosis se realizó como se describió previamente. [19, 20] Los animales donantes recibieron una inyección peritoneal de 3 pg/ratón de p-estradiol-17-valerato (Sigma, St. Louis, MO); la dosis utilizada se basó en datos previamente informados.20 Una semana después de la inyección de estrógeno, los animales donantes se sacrificaron y cada cuerno uterino se recolectó y picó mediante el uso de un Kirkland Tissue Mincer (Kirkland Products) con solución salina normal estéril. El material triturado se centrifugó a 1500 rpm durante 1 min. La endometriosis se indujo mediante la inyección de fragmentos de cuerno uterino por vía intraperitoneal en el animal receptor. Después los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: los animales tratados con HCQ recibieron una inyección intraperitoneal de 100 pL de 60 mg/kg de HCQ (#AC26301, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) mientras que los animales del tratamiento de control recibieron una inyección intraperitoneal de 100 pL de PBS estéril. La dosis de HCQ utilizada se basó en datos publicados previamente y fue comparable a las dosis usadas en el tratamiento de pacientes con enfermedades autoinmunes. [21] Se administró un segundo tratamiento con HCQ una semana después de la inducción de la endometriosis, mediante el uso de esta dosis. Dos semanas después de la inducción, los ratones se sacrificaron y los tejidos (que incluyen las lesiones) se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Las lesiones se midieron con un calibrador. El volumen de las lesiones se calculó de acuerdo con la fórmula: 4/3nr2R. [52]
Modelo de ratón Balb /c
Se obtuvieron ratones hembra Balb/c de ocho semanas de edad de Charles River Laboratories (Calco, Como, Italia) y se manipularon como se describió anteriormente [19, 20] y de acuerdo con las directrices de la Unión Europea, así como también con la aprobación del Institutional Animal Care and Use Committee of San Raffaele Scientific Institute (Protocolo n. 484) (Milán, Italia). Brevemente, a los ratones donantes se les inyectó 17p-estradiol (AMSA, Roma, Italia; 3 pg/ratón) y se sacrificaron una semana más tarde. El útero se extirpó y fragmentó, después de rasparlo para extirpar el miometrio, mediante el uso de tijeras. Los tejidos endometriales se pesaron y se resuspendieron en solución salina con ampicilina (1 mg/mL). Dos ratones receptores recibieron una inyección intraperitoneal mediante el uso de una jeringa que contenía la mitad de la resuspensión (Día 0). Los ratones se sacrificaron mediante la administración de una dosis letal de anestésico el día 12. Se abrió el abdomen y las lesiones se aislaron y recolectaron por un operador ciego al experimento.
Cultivo celular de células endometriósicas y T-HESC humanas de vida prolongada, tratamiento con HCQ, transfección con ARNip, y ensayo de supervivencia. Las condiciones de cultivo de células endometriósicas humanas primarias y la extensión de la vida se describieron previamente. [18] Estas células se derivaron de dos tipos diferentes de lesiones (dos pacientes independientes) que se evaluaron por separado como se describe más abajo. Brevemente, las células se mantuvieron en MCDB 131:Medio 199 (proporción 1:1) suplementado con FBS al 8 %, penicilina/estreptomicina e insulina/transferrina/selenio (ITS). Se prolongó la vida de las células mediante el uso del antígeno T grande de SV40. Se usaron partículas retrovirales generadas en HEK293T para infectar las células primarias. Se usaron medios que contenían puromicina (2,5 pg/mL) para seleccionar colonias resistentes de células primarias. En adición, obtuvimos la línea celular T-HESC, que son células del estroma endometrial humano derivadas de un mioma uterino (ATCC, Manassas, VA). Esta línea celular se mantuvo en DMEM/F12 sin rojo fenol (1:1) que contenía 8 % de FBS tratado con carbón dextrano, 500 ng/mL de puromicina, 1 % de ITS+ Premezcla (BD Bioscience, San José, CA) y 15 mM de HEPES. Las líneas celulares usadas en el presente estudio se probaron para ser micoplasma negativas y perfiladas por STR (repetición corta en tándem) (Genetica DNA Laboratories, Cincinnati, OH). Las células endometriósicas se sembraron a 50000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos, mientras que las células T-HESC se sembraron a 250000 células/pocillo en una placa de 6 pocillos. Se preparó una reserva de hidroxicloroquina (HCQ) 50 mM (núm. AC26301, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Estados Unidos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (y se esterilizó con un filtro de 0,22 pm); se usó a una concentración final de 25 pM en medio completo. [18, 53] Las células se trataron durante 18 horas con HCQ antes de la recolección de proteínas y los análisis por inmunotransferencia Western. Para los estudios de supervivencia, las células se sembraron a una densidad de 5000 células/pocillo en una placa opaca de 96 pocillos y se trataron con HCQ 25 pM durante cinco días. Después se evaluó la viabilidad celular mediante el uso del reactivo CellTiter-glo (Promega, Madison, WI). [18] Para los estudios de transfección con ARNip, se sembraron células T-HESC a 350000 células/pocillo en una placa de 6 pocillos. Después de la adherencia durante la noche, las células se transfectaron con ARNip de control no dirigido, ATG5, beclina-1, ATG7, PIK3C3 o LC3B de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. [18, 54] El día después de la segunda ronda de transfección de ARNip, las células se volvieron a sembrar a razón de 5000 células/pocillo en placas opacas de 96 pocillos. Tres días después de volver a sembrar, se evaluó la viabilidad celular mediante el uso del reactivo CellTiter-glo como se describe anteriormente.
Inmunohistoquímica de LC3B. Las muestras en el TMA se recolectaron sin identificación de muestras archivadas en un laboratorio de patología como se describe en Sujetos humanos anteriormente. Brevemente, los portaobjetos se desparafinaron y tiñeron mediante el uso del sistema automatizado Ventana Discovery XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) con solución EZ Prep. El método de recuperación de antígeno térmico se realizó a un pH de 8,0. El anticuerpo primario, LC3 (AP1802a) que detecta LC3B se obtuvo de Abgent (San Diego, CA) y se diluyó en una proporción de 1:25 en diluyente de anticuerpos Dako (Carpenteria, CA) seguido de una incubación de 32 min a temperatura ambiente. Se usó tejido de cáncer de mama humano como control positivo y se omitió el anticuerpo primario para el control negativo. Se usó el anticuerpo secundario Ventana OmniMap anticonejo y el kit Ventana ChromoMap como sistema de detección. Se usó hematoxilina como contratinción.
Después el TMA teñido con LC3 se escaneó mediante el uso de Aperio™ ScanScope XT (Vista, CA) con un aumento de 200 X y una lente objetivo de apertura numérica de 0,8 a través de la detección de matriz trilineal de Basler. Después, cada núcleo se segmentó mediante el uso del software de bloque de TMA asociado con el programa Spectrum (versión 10.2.5.2352), seguido de una segmentación manual en regiones epiteliales y estromales bajo la supervisión de un patólogo. El análisis de imágenes se realizó mediante el uso de un algoritmo Aperio Positive Pixel Count® v9.0 con los siguientes umbrales: Valor de matiz = 0,1; Ancho de matiz = 0,5; Umbral de saturación de color =0,04; IWP(alto) = 220; IWP(bajo) = IP(alto) = 175; IP(bajo) = ISP(alto) = 100; ISP(Bajo) = 0 para segmentar la tinción positiva de diversas intensidades. Después, los datos se compilaron para cada núcleo en las regiones separadas del epitelio y el estroma, que se representaron por porcentaje de positividad, y después se correlacionaron directamente con la expresión de proteínas.
Aislamiento de ARN, PCR en tiempo real, y RT2-PCR. El ARN total se aisló mediante el uso del kit RNeasy mediante el seguimiento de las instrucciones del fabricante (QIAGEN, Valencia, CA). La concentración y la pureza del ARN se determinaron mediante el uso de un NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA). La masa de la lesión varió según las muestras, y esto se reflejó en las cantidades de ARN obtenidas (intervalo de masa: 0,9 mg a 25 mg). Se seleccionaron tres muestras de ARN de cuernos uterinos, con una relación 260/280 superior a 1,8 y una relación 260/230 superior a 1,7, de animales receptores, donantes, tratados con HCQ, y tratados con PBS (12 muestras en total) para análisis por RT2-PCR. La síntesis de ADNc se realizó mediante el uso de 0,5 |jg de ARN total, después de la etapa de eliminación de ADN mediante el uso del kit RT2 de primera cadena según las instrucciones del fabricante (QIAGEN, Valencia, CA). Después de la eliminación del ADN, la mezcla de reacción se incubó a 42 °C durante 15 min, seguido de 95 °C durante 5 min mediante el uso de un ciclador térmico DNA Engine® Peltier (Bio-Rad, Hercules, CA). Se adicionó un total de 102 jL de la mezcla de reacción de ADNc a la mezcla maestra que contenía 1248 jL de agua libre de ARNasas y 1350 jL de mezcla maestra 2 x RT2 SYBR verde. Se adicionaron cuidadosamente veinticinco jL de la mezcla maestra a cada pocillo de la matriz de autofagia de PCR del perfilador RT2. La cuantificación se realizó mediante el uso del ciclador Applied Biosystems (Life Technologies, Grand Island, NY). El programa de ciclos de PCR incluyó activación durante 10 min a 95 °C, seguido de 40 ciclos durante 15 segundos a 95 °C con 1 min a 60 °C. El programa de ciclos de PCR finalizó con un análisis de la curva de fusión y los datos se analizaron mediante el uso del software basado en la web de QIAGEN.
Para estudios de PCR en tiempo real, se utilizó One-step Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) con las siguientes sondas y cebadores como se describió anteriormente: 18 LC3B, Mm00782868_sH; ATG4B, Mm01701111_m1 ATG9A, Mm01264420_m1; ATG5, Mm00504340_m1; ATG7, Mm00512209_m1; ATG3, Mm00471287_m1 PIK3C3, Mm00619489_m1; ULK1, Mm00437238_m1; ATG9B, Mm01157883_g1; Beclina-1, Mm01265461_m1 ATG2B, Mm00512973_m1; ATG4C, Mm01259886_m1; BNIP3, Mm01275600_g1; EIF2AK3, Mm00438700_m1 FAS, Mm01204974_m1; LC3A, Mm00458725_g1; GABARAPL1, Mm00457880_m1; IGF1, Mm00439560_m1 IRGM1, Mm00492596_m1; SQSTM1 (p62), Mm00448091_m1; PRKAA1, Mm01296700_m1; PTEN,Mm00477208_m1. Los valores de CT se normalizaron a p-actina (Mm00607939_s1) y los cambios en veces del ARN se determinaron mediante el uso de la ecuación 2'ññCt.
Análisis de aislamiento de proteínas, SDS-PAGE, e inmunotransferencia Western. Los tejidos usados para los análisis de proteínas incluyeron cuernos uterinos, lesiones ectópicas, ovarios, timo, riñones, corazón, páncreas, bazo, e hígado. Las muestras se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Los tejidos se homogeneizaron en tampón de lisis enfriado con hielo que contenía Triton X-100 al 1 %, HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, eGtA 1 mM, glicerol al 10 %, y cóctel inhibidor de proteasas (Roche, Indianápolis, IN) mediante el uso de un Homogeneizador PowerGen 125 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Las muestras se centrifugaron a 14000 rpm durante 10 min a 4 °C. Se recolectaron los sobrenadantes y se determinó la concentración de proteína total mediante el uso del ensayo BCA (ThermoScientific, Rockford, iL) y un lector de microplacas Bio Tek synergy 2 (Winooski, VT). Las muestras se normalizaron y después se corrieron en geles de poliacrilamida SDS al 10 o 12 % preparados en un sistema Criterion® Cassette (Bio-Rad, Hercules, CA) como se describió anteriormente. [54] Se usaron los siguientes anticuerpos y diluciones: policlonal de conejo para LC3B (núm. 2775, 1:1000), monoclonal de conejo para LC3A (núm. 4599 (D50G8), 1:1000), policlonal de conejo para Beclina-1 (núm. 3738, 1:1000), monoclonal de conejo para GABARAPL1 (núm. 13733 (E1J4E), 1:1000), monoclonal de conejo para AMPKa (núm. 2603 (23A3), 1:500), monoclonal de conejo para FOXO1 (núm. 2880 (C29h4), 1:1000) y policlonal de conejo para Pan-actina (núm. 4968, 1:500) se obtuvieron todos de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). El anticuerpo monoclonal de ratón p62 (núm. 610832, 1:1000) se obtuvo de BD Biosciences (San José, CA).
Tinción con hematoxilina/ eosina, construcción de micromatrices de tejidos, e inmunohistoquímica. Las muestras recolectadas se conservaron inmediatamente en formalina tamponada neutra al 10 % en las instalaciones para animales. Las muestras se incluyeron en parafina, se seccionaron, y se transfirieron a portaobjetos para tinción con hematoxilina/eosina e inmunohistoquímica. Un patólogo revisó cada caso y delimitó la región de interés, que contenía células epiteliales y estromales, para cada muestra. Se preparó una micromatriz de tejido de ratón en la Tissue Core Facility del Moffitt Cancer Center. La micromatriz de tejido de ratón contenía un total de 113 muestras centrales, que incluían 10 cuernos uterinos y 10 ovarios de ratones tratados con PBS y HCQ. Como muestras de control para los anticuerpos utilizados, el TMA incluyó tejido mamario, hígado, intestino delgado, y ganglios linfáticos de ratón de un ratón tratado con PBS. Las lesiones se analizaron a partir de bloques independientes. Los portaobjetos se tiñeron con un sistema automatizado Leica Bond RX (Leica Biosytems, Buffalo Grove, IL) mediante el seguimiento de las instrucciones del fabricante con reactivos patentados. Los portaobjetos se desparafinaron en un sistema automatizado con Dewax Solution (Leica Biosystems). El método de recuperación de antígeno usado para el Receptor de Progesterona (PR) fue enzimático con la Solución enzimática 1 a los 15 min (Leica), para la vimentina y el Receptor de Estrógeno (ER) se indujo por calor con la Solución de recuperación del epítopo 1 a los 20 min (Leica), para la citoqueratina 8 (CK-8) se indujo con calor con la Solución de recuperación del epítopo a los 10 min (Leica), y para LC3b se indujo con calor con Solución de recuperación del epítopo 1 a los 10 min (Leica Biosystems). Todos los anticuerpos se diluyeron en diluyente de anticuerpos Dako (Carpenteria, CA): PR (núm. ab131486, 1:500, Abcam, Cambridge, MA), vimentina (núm. 5741 (D21H3), 1:100, Cell Signaling, Danvers, MA), ERa (núm. ab32063 (E115), 1:200, Abcam, Cambridge, MA), Citoqueratina-8 (núm. ab53280 (EP1628Y), 1:200, Abcam, Cambridge, MA) y Lc 3B (núm. ab51520, 1:1500, Abcam, Cambridge, MA) y se incubó durante 30 min. Se usó el Leica Bond Polymer Refine Detection System con una incubación de polímero durante 8 min. Se usó hematoxilina como contratinción y los portaobjetos se deshidrataron y cubrieron con un cubreobjetos, mediante el seguimiento del protocolo histológico estándar.
Análisis de moléculas inflamatorias peritoneales murinas. Después de sacrificar a los animales, se inyectó 1 mL de PBS estéril en la cavidad peritoneal, se masajeó suavemente el área abdominal y se recolectó el líquido. El líquido recolectado se centrifugó a 1390 rpm durante 5 min a 4 °C y el sobrenadante resultante se almacenó a -80 °C. Los niveles de quimiocinas y citocinas se analizaron mediante el uso de un MCYTOMAG-70K-PX32 (Millipore, Billerica, MA) mediante el seguimiento de las instrucciones del fabricante. Brevemente, se adicionaron 200 pL de tampón de lavado a cada pocillo y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en un agitador de placas. Después de la incubación, se decantó el tampón de lavado y se invirtió la placa y se golpeó varias veces con una toalla absorbente. Después se adicionaron 25 pL de tampón de ensayo a cada pocillo seguidos de 25 pL de estándares de concentración, controles de ensayo, o muestras. La botella premezclada se agitó por vórtex y se adicionaron 25 pL de perlas a cada pocillo. La placa se incubó toda la noche a 4°C, protegida de la luz. Después la placa se incubó durante 1 min en el imán manual y el contenido del pocillo se decantó suavemente y se golpeó suavemente sobre almohadillas absorbentes. Cada pocillo se lavó dos veces con 200 pL de tampón de lavado, seguido de la incubación en el imán manual. La solución de detección de anticuerpos se dejó calentar a temperatura ambiente y después se adicionaron 25 pL a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placas, protegido de la luz. A continuación, se adicionaron 25 pL de Estreptavidina-Ficoeritrina a cada pocillo que contenía los anticuerpos de detección y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente protegidos de la luz en un agitador de placas. Después de la incubación, la placa se lavó dos veces como se describió anteriormente y se adicionaron 150 pL de Sheath Fluid a cada pocillo. La placa se analizó mediante el uso del instrumento MAGPlX™ y las soluciones de software xPONENT, versión 4.2.
Citometría de flujo. El sedimento obtenido después de la centrifugación del líquido de lavado peritoneal (ver anteriormente) se utilizó para la tinción de macrófagos. Cuando fue necesario, se realizó la lisis de glóbulos rojos de acuerdo con el protocolo del fabricante (eBioscience, San Diego, CA). Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 mL de PBS frío y se transfirieron a tubos de citometría de flujo. Las muestras se centrifugaron durante 1 min a 1390 rpm. Se decantó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 100 pL de PBS. Las células se bloquearon mediante el uso de 0,5 pg de Mouse BD Fc, Block™ (núm. 553141, BD Pharmingen, San Jose, CA) durante 5 min en hielo. Las células se incubaron en 0,4 pg de CD11b clon M1/70 antirratón de APC de rata (núm.
553312, BD Pharmingen, San Jose, CA) y anti mPE-F4/80/EMR1 (núm. FAB5580C, R&D Systems, Minneapolis, MN)) a temperatura ambiente durante 30 min, protegido de la luz. Después de la incubación, se adicionaron 700 pL de PBS a cada tubo y se centrifugaron durante 1 min a 4 °C. Se decantó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 300 pL en PBS y se analizaron por citometría de flujo.
Microscopio de transmisión por electrones. Después de la inducción de la anestesia, se abrió la cavidad abdominal de los ratones para exponer los cuernos uterinos. Se extrajeron ambos cuernos uterinos y se cortaron en secciones transversales de piezas de 2-3 mm de largo, que después se enjuagaron en tampón fosfato 0,1 M para eliminar el exceso de sangre, y se colocaron en glutaraldehído al 2,5 % en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2 a 4° C. El tejido se fijó en glutaraldehído a 4°C durante 24 h. Después de la fijación, el tejido se enjuagó en tampón, se cortó en anillos de 1 mm de espesor y se postfijó en tetróxido de osmio al 1 % a 4 °C durante 2 h. Después de los enjuagues con tampón y agua destilada, el tejido se deshidrató a través de una serie graduada de diluciones de acetona, se aclaró con óxido de propileno, se infiltró durante la noche, se incrustó en una mezcla de resina epoxi LX 112 (Ladd Research, Williston, VT) y se polimerizó a 70 °C. Se obtuvieron secciones transversales completas de los cuernos uterinos con un grosor de 0,25 pm-0,35 pm y un grosor de 70-80 nm, y se tiñeron con tinción de azul de toluidina al 1 % (para microscopía óptica) o acetato de uranilo al 8 % y citrato de plomo de Reynold (para microscopía electrónica) respectivamente. Se observó y fotografió el endometrio de los animales de control y experimentales mediante el uso de un FEI Morgagni TEM (Hillsboro, OR) con una cámara AMT ActiveVu (Woburn, MA).
Análisis estadístico. Todos los análisis se realizaron mediante el uso del software GraphPad Prism (versión 6.04, La Jolla, CA). Para calcular la importancia de la desorganización observada de las células epiteliales en el endometrio eutópico de ratones con endometriosis inducida tratados con HCQ (en comparación con los tratados con PBS, como control), usamos la prueba exacta de Fisher. Todos los demás análisis estadísticos se calcularon mediante el uso de la prueba t de Student no paramétrica y las barras de error que se muestran representan los errores estándar de la media (SEM). La significación estadística se fijó en p < 0,05 (* indica p < 0,05, ** indica p < 0,01, *** indica p < 0,001 y **** indica p < 0,0001).
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor autofágico para usar en un método de tratamiento de la endometriosis en un sujeto que lo necesite.
2. Una formulación farmacéutica para usar en el tratamiento de la endometriosis en un sujeto que lo necesite, que comprende:
una cantidad efectiva de un inhibidor autofágico y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. Un kit para usar en el tratamiento de la endometriosis, el kit comprende:
una cantidad efectiva de un inhibidor autofágico proporcionado en una forma de dosificación; instrucciones fijadas en un medio tangible de expresión, donde las instrucciones proporcionan instrucciones para administrar el inhibidor autofágico a un sujeto que tiene endometriosis.
4. El inhibidor autofágico para usar de acuerdo con la reivindicación 1, la composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 2 o el kit para usar de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el inhibidor autofágico se selecciona del grupo que consiste en cloroquina, Lys05, hidroxicloroquina, sales farmacéuticamente aceptables de estas, ARNip de ATG5, ARNip de ATG7, o combinaciones de estos.
5. El inhibidor autofágico para usar de acuerdo con la reivindicación 1 o 4, la composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 2 o 4 o el kit para usar de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde la forma de dosificación se formula para la administración oral, vaginal, intravenosa, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular.
6. El inhibidor autofágico para usar de acuerdo con la reivindicación 1 o 4, la composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, o el kit para usar de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde el inhibidor autofágico se proporciona en una cantidad efectiva que está en el intervalo de 1 mg /kg a 200 mg/kg.
7. El inhibidor autofágico para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 6, la composición farmacéutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 4 a 6, o el kit para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde el inhibidor autofágico es hidroxicloroquina.
8. Un método que comprende poner en contacto una célula de lesión endometriósica con una cantidad efectiva de un inhibidor autofágico in vitro.
9. El método de la reivindicación 8, en donde poner en contacto una célula de lesión endometriósica con una cantidad efectiva de un inhibidor autofágico previene la recurrencia de una célula de lesión endometriósica.
10. El método de la reivindicación 8, en donde el inhibidor autofágico se selecciona del grupo que consiste en cloroquina, Lys05, hidroxicloroquina, sales farmacéuticamente aceptables de estas, ARNip de ATG5, ARNip de ATG7, o combinaciones de estos.
11. El método de la reivindicación 8, en donde el inhibidor autofágico es hidroxicloroquina.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde la cantidad efectiva está en el intervalo de 1 mg/kg a 200 mg/kg.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde la célula de lesión endometriósica tiene mayor expresión en comparación con una célula de control de al menos un marcador autofágico seleccionado del grupo que consiste en ATG7, ATG5, y hVps34.
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