JP2022023978A - がんを治療するためのアデノウイルス及び化学療法剤の組合せ - Google Patents

Abstract

【課題】瘍溶解性アデノウイルスベクター及び化学療法剤を提供する。【解決手段】ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを、２種の化学療法剤と組み合わせる。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬分野に関する。具体的には、本発明は、ヒトのがんを治療するために、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを２種の化学療法剤と組み合わせて使用する新規な戦略に関する。また、悪性中皮腫の治療において、ウイルス及び化学療法剤のこの組合せを使用する方法も開示される。ウイルス及び２種の化学療法剤に加えて、他の医薬品も治療プロトコールに含むことができる。

悪性中皮腫（ＭＭ）は、中皮から生じるがんの侵襲性の稀な形態である。ＭＭは、主にアスベストへの曝露によって引き起こされ、通常３０年を超える長い潜伏期間を示す。中皮腫患者の診断後の生存期間の中央値は、典型的にわずか９～１２カ月である。ＭＭは、ＭＭの症例の８５．５％において胸膜（肺の外膜及び内部胸壁）に影響を及ぼし、ＭＭの症例の１３．２％において腹膜（腹腔膜）に影響を及ぼし、ＭＭの症例の０．５％において心膜（心臓を取り囲む嚢）に影響を及ぼし、ＭＭの症例の０．８％において精巣鞘膜（精巣を取り囲む嚢）に影響を及ぼす。ＭＭ腫瘍は、しばしば標準治療(therapy)への応答性が低く、その発症率は、世界的に上昇し続けている。ＭＭの発症率が低かったことにより、新しい薬物の発見は長い間限定的であり続けたため、新しい治療(treatment)様式が高く求められている。
典型的に、がんは、手術、ホルモン治療、化学療法、放射線療法及び／又は他の治療などの従来の治療レジメンを用いて治療される。しかし多くの場合、がんは、進行した段階で特徴付けられることが多く、現在の治療では治癒させることができない。
ウイルス療法は、相対的に新規な治療手法であり、これは、ウイルスが細胞内で増殖してその細胞を死滅させる一部のウイルスの自然能力、及び隣接細胞に拡大する能力を利用し、それによって初期注入用量の治療効果を増幅させるものである。ウイルス療法では、がん細胞の形質導入及びウイルス複製は、腫瘍を有効に安全に根絶させるために、ウイルスゲノムの遺伝子操作によって注意深く調節される。腫瘍の安全な根絶には、アデノウイルスゲノムに様々な遺伝的改変を導入し、それによって複製を腫瘍細胞に排他的に限定し、最終的には健康な組織への副作用なしに、腫瘍を選択的に根絶することが必要である。

アデノウイルスの非常に重要な制御遺伝子の特異的欠失を利用して、機能障害タンパク質を作成し、又は標的細胞中に存在する特異的な遺伝的特色への依存をもたらす、それらの発現の欠陥を引き起こすことができる。Ｅ１Ａの部分的欠失は、正常細胞における複製を制限するが、がん細胞などの標的細胞における複製を可能にする。ＣＲ２（定常領域２）における２４塩基対の欠失を特色とする、条件的に複製するウイルスが作成され、神経膠腫及び乳がん異種移植の治療において強力かつ選択的であることが示された（Fueyo et al. 2000; Heise et al. 2000）。それらのウイルスのがん特異性は、機能障害Ｅ１ＡがＥ２Ｆ１転写因子を放出できなくなり、それによって遊離Ｅ２Ｆ１が必要になることから生じる。Ｅ２Ｆ１は、ｐＲｂ経路がほとんどの場合撹乱されているがん細胞において、豊富に存在する（Hanahan and Weinberg 2000）。

臨床結果及び前臨床結果によって、非武装腫瘍溶解性ウイルスを用いる治療は、持続的な抗腫瘍性治療免疫応答をもたらすには十分に免疫賦活性ではないことが示されている。これに関して、腫瘍溶解性ウイルスは、免疫賦活性がより高くなるように武装されてきた。ウイルスは、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などの高度免疫原性タンパク質を発現するように操作され得る。免疫原性タンパク質は、腫瘍の微小環境内で発現すると、特異的で持続的な抗腫瘍免疫を有する強力な刺激物質になる。腫瘍細胞への免疫療法遺伝子の導入、さらにはタンパク質へのそれらの翻訳によって、免疫応答が活性化され、腫瘍細胞がより効率的に破壊される。これに関して最も関連性が高い免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）及び細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。

ＯＮＣＯＳ－１０２（Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭ－ＣＳＦ；国際公開第２０１０／０７２９００号に開示されている）は、がん細胞への遺伝子送達を増強するためのキメラカプシド、及びがん細胞に複製を限定するためのＥ１Ａ領域のＲｂ結合部位における２４ｂｐの欠失を含む、血清型５アデノウイルスである。ＯＮＣＯＳ－１０２は、免疫刺激効果を増強するために、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）で武装される。ＯＮＣＯＳ－１０２の安全性及び免疫学的活性は、既に、第１相臨床研究（ＮＣＴ０１５９８１２９）で実証されている。この第１相研究では、ＯＮＣＯＳ－１０２を用いる胸膜中皮腫の局所的治療によって、ラストラインの難治性悪性胸膜中皮腫の患者において、全身性抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答及び腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤が誘導された。

Koski et al. (2010)は、標準治療に対して難治性の進行性固形腫瘍の患者合計２１人の、ＯＮＣＯＳ－１０２を用いる治療について開示している。これらの研究によれば、ＯＮＣＯＳ－１０２は、がん患者を治療するのに安全であると思われる。また、有効性の有望な徴候も見られた。
国際公開第９９／５９６０４号は、がんへのアデノウイルスの直接注射、ならびにシスプラチン及び５－フルオロウラシルの２種の化学療法剤の投与からなる、扁平細胞がんを治療するための方法を開示している。
Siurala et al. (2015)は、イホスファミドを伴う又は伴わない、カプシド改変腫瘍溶解性アデノウイルスＣＧＴＧ－１０２（ＯＮＣＯＳ－１０２と同じ）とドキソルビシンの組合せを開示している。この組合せは、完全免疫担当性Ｓｙｒｉａｎハムスターにおいて確立された軟部組織肉腫腫瘍に対してｉｎ ｖｉｖｏで試験した場合、有効であることが見出された。
米国特許出願公開第７３９３４７８号は、シスプラチン及び治療剤を含む有効量のミセルを対象に投与する工程を含む、対象における腫瘍成長を阻害するための方法を開示している。この方法の治療剤は、例えばＧＭ－ＣＳＦであり得る。
実際、悪性中皮腫（ＭＭ）の治療は、２００３年以来ずっと変化していない。ＭＭの最も一般的に使用される第一選択の化学療法は、化学療法剤のペメトレキセド（二ナトリウム（Ｄｉｓｏｓｉｕｍ）ペメトレキセド、Ａｌｉｍｔａ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）及びそれらの組合せを用いて実施される。従来のがん治療レジメンは進歩しているにもかかわらず、ヒト中皮腫は、依然不治のものであり、新しい代替治療が切実に求められている。

本発明の目的は、患者のがんを治療するための、腫瘍溶解性アデノウイルス及び化学療法剤の新規な組合せ、腫瘍溶解性アデノウイルス及び化学療法剤を使用する新規な併用治療を提供すること、ならびに従来のがん治療に関係する問題を解決することである。

本発明の一態様は、ヒトのがんの治療、好ましくはヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスであって、それを必要とするヒト患者へのウイルスの投与が、２種の化学療法剤の投与と組み合わせて行われる、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本発明の別の態様は、ヒトのがん、好ましくは患者におけるヒト悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含む、方法である。
本発明のさらに別の態様は、ヒト悪性中皮腫の治療におけるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの使用であり、ウイルスが２種の化学療法剤と組み合わせて患者に投与される、使用である。

以下の図は、本発明のある特定の態様及び特色をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つ又は複数を、例を含めた具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より良好に理解され得る。

ヒト中皮腫細胞：ＪＬ－１、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ及びＨ２２６の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性研究における、ペメトレキセド及びシスプラチン、もしくはペメトレキセド及びカルボプラチン単独による、又はＯＮＣＯＳ－１０２（１０ＶＰ／細胞）との組合せによる、又はＯＮＣＯＳ－１０２単独による治療。ａ）抗腫瘍有効性を、ＭＴＳ細胞生存性アッセイによって測定した。細胞生存率を、治療の７２時間後に、未治療細胞（ｍｏｃｋ）に対して決定した。治療の４８時間後の、ｂ）壊死細胞（ＰＩ）の量、及びｃ）初期アポトーシス細胞（ＦＩＴＣ標識アネキシン－Ｖ）の量を、フローサイトメトリーによって分析した。エラーバー、平均±ＳＥＭ：^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。 ヒト中皮腫細胞：ＪＬ－１、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ及びＨ２２６の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫原性の腫瘍細胞死における、ペメトレキセド及びシスプラチン、もしくはペメトレキセド及びカルボプラチン単独による、又はＯＮＣＯＳ－１０２（１０ＶＰ／細胞）との組合せによる、又はＯＮＣＯＳ－１０２単独による併用治療。ａ）細胞外ＡＴＰを、治療の４８時間後（Ｊｌ－１、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ）及び７２時間後（Ｈ２２６）に、ＡＴＰ決定キットを使用して上清から測定した。ｂ）上清への細胞外ＨＭＧＢ１分泌を、治療の３日後に、ＥＬＩＳＡアッセイを利用して測定した。ｃ）試験したヒト中皮腫細胞の外側細胞表面へのカルレティキュリン曝露を、治療の２４時間後（Ｈ２２６、Ｊｌ－１）及び４８時間後（ＭＳＴＯ－２１１Ｈ）に、フローサイトメトリーによって測定した。エラーバー、平均±ＳＥＭ：^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。 ３種の中皮腫細胞株（Ｊｌ－１、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、Ｈ２２６）において測定した、ＯＮＣＯＳ－１０２の腫瘍溶解有効性、受容体発現プロファイル及びウイルス感染力アッセイ。ａ）ＯＮＣＯＳ－１０２（０．１、１、１０、１００及び１０００ＶＰ／細胞）の腫瘍溶解有効性を、治療開始の３日後に、ＭＴＳ細胞生存率アッセイによって測定した。細胞生存率プロファイルを、未治療細胞（ｍｏｃｋ）に対して決定した。ｂ）中皮腫細胞株上でのＣＡＲ、ＤＳＧ２及びＣＤ４６の発現を、特異的抗体染色後にフローサイトメトリーによって測定した。ｃ）ＯＮＣＯＳ－１０２感染力アッセイを、５つの治療群について実施した。ＯＮＣＯＳ－１０２感染力の決定は、ウイルスヘキソンタンパク質の染色後の感染細胞の視覚的定量、及び最後に検出されたスポットについての算出に基づいて行った。５つの複製ごとに、非オーバーラップフィールドの５つの画像を、ＡＭＧ ＥＶＯ ＸＬ顕微鏡を使用して得た。感染力の比較のために、データを５つのウェルのスポットの平均数として提示した。エラーバー、平均±ＳＥＭ：^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。 ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（１群当たりマウス７匹、１群当たり１４個の腫瘍）のヒト中皮腫異種移植モデルにおける、ペメトレキセド（腹腔内（ＩＰ）１００μｌ中１０ｍｇ／ｋｇ）、シスプラチン（ＩＰ１００μｌ中１．５ｍｇ／ｋｇ）又はカルボプラチン（ＩＰ１００μｌ中８ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＯＮＣＯＳ－１０２の抗腫瘍有効性（１Ｅ＋８ＶＰ／マウス腫瘍内（ｉ．ｔ．））を分析し、ｍｏｃｋ又は各治療単独と比較した。ａ）ｓ．ｃ．Ｈ２２６腫瘍（６×１０⁶個の細胞／腫瘍）を担持しているＢＡＢＬ／ｃヌードマウスを、治療スキーム（表１）に従って、８つの群でＯＮＣＯＳ－１０２（ｉ．ｔ．）及び化学療法（ＩＰ）を用いて治療した。動物を、３日ごとに２カ月間通して治療した。ｂ）生存プロファイルを、カプラン－マイヤー試験によって算出した。ｃ）ＯＮＣＯＳ－１０２によって産生されたヒトＧＭ－ＣＳＦを、動物の安楽死後、ＥＬＩＳＡ技術を利用して腫瘍、肝臓及び血清から分析した。ｄ）アデノウイルスコピー（Ｅ４遺伝子）を、安楽死させた動物の腫瘍、肝臓及び血清からｑＰＣＲによって測定した。エラーバー、平均±ＳＥＭ：^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。 ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（１群当たりマウス２匹、マウス１匹当たり２個の腫瘍）のヒト中皮腫異種移植モデルにおける、ＯＮＣＯＳ－１０２（１Ｅ＋８ＶＰ／マウスｉ．ｔ．）、ペメトレキセド（ＩＰ１００μｌ中１０ｍｇ／ｋｇ）及びシスプラチン（ＩＰ１００μｌ中１．５ｍｇ／ｋｇ）、それら３種の組合せ、又は化学療法剤の組合せの抗腫瘍有効性。ａ）ｓ．ｃ．Ｈ２２６腫瘍（７×１０⁶個の細胞／腫瘍）を担持しているＢＡＢＬ／ｃヌードマウスを、４つの群でＯＮＣＯＳ－１０２（ｉ．ｔ．）及び化学療法（ＩＰ）を用いて治療した。動物を、３日ごとに５４日間通して治療した。ｂ）体重を、実験を通してモニタリングし、測定した。質量（ｇ）を、体重の百分率値に変換し、０日目の体重を１００％として設定した。ｃ）生存プロファイルを、カプラン－マイヤー試験によって算出した。エラーバー、平均±ＳＥＭ：^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。 ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（１群当たりマウス２匹、マウス１匹当たり２個の腫瘍）のヒト中皮腫異種移植モデルにおける、ＯＮＣＯＳ－１０２（１Ｅ＋８ＶＰ／マウスｉ．ｔ．）、ペメトレキセド（ＩＰ１００μｌ中６．７ｍｇ／ｋｇ）及びカルボプラチン（ＩＰ１００μｌ中５．４ｍｇ／ｋｇ）、それら全３種の組合せ、又は化学療法剤の組合せの抗腫瘍有効性。ａ）ｓ．ｃ．Ｈ２２６腫瘍（７×１０⁶個の細胞／腫瘍）を担持しているＢＡＢＬ／ｃヌードマウスを、４つの群でＯＮＣＯＳ－１０２（ｉ．ｔ．）及び化学療法（ＩＰ）を用いて治療した。動物を、３日ごとに３０日間通して治療した。ｂ）体重を、実験を通してモニタリングし、測定した。質量（ｇ）を、体重の百分率値に変換し、０日目の体重を１００％として設定した。ｃ）生存プロファイルを、カプラン－マイヤー試験によって算出した。エラーバー、平均±ＳＥＭ：^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。

別段定義されない限り、本願で使用されるあらゆる技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。

中皮腫は、標準治療に対して治療抵抗性のがんであり、世界的に致死的症例の数が増大し続けている。胸部の肺、ならびに腹部臓器、例えば胃、腸、肝臓及び心臓は、それぞれ胸膜、腹膜、及び心膜などの膜で包まれている。このような膜の表面を被覆する一部は、中皮と呼ばれる。このような中皮から生じる腫瘍は、中皮腫と呼ばれる。悪性中皮腫には、類上皮型、肉腫型及び二相型の３つの主な組織学的サブタイプがある。本明細書で使用される「悪性中皮腫」（ＭＭ）は、胸膜、腹膜、心膜又は精巣鞘膜に影響を及ぼす中皮腫を指す。現在まで、ＭＭに対する最も有効な標準治療は、ペメトレキセド及びシスプラチンの組合せであり、これは４１％の奏効率（ＲＲ）をもたらしている。シスプラチン及びペメトレキセドの組合せは、単剤による化学療法と比較して、中皮腫の患者の生存を改善している。しかし、ＭＭはまだ、ＰＦＳ／ＯＳ中央値の予後が治療の開始から１２カ月までという致死的疾患であり、したがって新しい治療様式が必要である。

本明細書で使用される「抗ウイルス応答」という用語は、ウイルス感染に対する細胞の応答を指し、それには、例えば、インターフェロンの産生、サイトカイン放出、ケモカインの産生、リンホカインの産生又はそれらの任意の組合せが含まれる。
本明細書で使用される「正常宿主細胞」及び「正常組織」という表現は、抗ウイルス応答が変化しない、非がん性の非感染細胞又は組織を指す。
本明細書で使用される「腫瘍溶解性作用物質」という用語は、腫瘍細胞の成長を阻害し、かつ／又は腫瘍細胞を死滅させることができる作用物質を指す。
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト及び動物、ヒト及び動物の組織、ならびにヒト及び動物の細胞を含めた、任意の生存生物を指す。
本明細書で使用される「患者」という用語は、本明細書に記載される併用治療を用いる治療から利益を受ける可能性が高い、ＭＭなどの疾患に罹患している任意の対象（好ましくはヒト）を指す。
アデノウイルスは、正二十面体カプシドを有する、エンベロープのない直径７０～９０ｎｍのウイルスである。それらのゲノムは、２５～４５キロベースの間で変わるサイズの直鎖状二重鎖ＤＮＡであり、両端に逆位末端配列（ＩＴＲ）を有し、５’末端に末端タンパク質が結合している。

正二十面体カプシドは、３種の主なタンパク質によって形成され、その中でもヘキソン三量体が最も豊富に存在する。カプシドの１２個の頂点のそれぞれは、共有結合によって線維に結合しているペントン基部である五量体タンパク質も含有する。この線維は、ペントン基部から突出し、ノブを有する棒状構造の三量体タンパク質である。他のウイルスタンパク質ＩＩＩａ、ＩＶａ２、ＶＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸも、ウイルスカプシドと会合している。タンパク質ＶＩＩ、小ペプチドミュー及び末端タンパク質（ＴＰ）は、ＤＮＡと会合している。タンパク質Ｖは、タンパク質ＶＩを介してカプシドとの構造的連結を提供する。
本明細書で使用される「カプシド」という用語は、ヘキソン、線維及びペントン基部タンパク質を含む、ウイルスのタンパク質シェルを指す。

すべてのヒトアデノウイルスは、それらの線維構造が類似している。ヒトアデノウイルスのそれぞれは、Ｎ末端尾部、繰り返し配列を有する軸、及び球状構造を有するＣ末端ノブドメインを有する。ノブドメインは、主に標的細胞受容体との結合に関与しており、その球状構造は、側方及び頂点の結合のために表面が大きくなっている。異なるサブグループのアデノウイルスの線維タンパク質は、長さ及び曲がる能力が最も明確に異なっている。

線維は、標的細胞へのウイルスの結合に関与する。最初に、線維タンパク質のノブドメインが、標的細胞の受容体に結合し、第２に、ウイルスがインテグリン分子と相互作用し、第３に、ウイルスが標的細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれる。次に、ウイルスゲノムは、エンドソームから核に輸送され、ウイルスゲノムの複製が始まり得る。
本明細書で使用される、カプシドの「Ａｄ５／３キメラ現象」は、線維のノブ部分がＡｄ血清型３に由来し、線維の残りがＡｄ血清型５に由来する、キメラ現象を指す。
アデノウイルスは、ウイルスゲノムを複製する細胞機構に依存する。アデノウイルスは、静止状態の細胞に感染し、それらを細胞周期のＳ期のような状態に誘導して、ウイルスのＤＮＡ複製を可能にし得る。アデノウイルスゲノムは、前初期（Ｅ１Ａ）、初期（Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）、中期（ＩＸ、Ｉｖａ）、及び後期（Ｌ１～Ｌ５）遺伝子に分けることができる。
Ｅ３遺伝子産物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス複製にとって必須ではないが、様々な宿主免疫応答の調節に割り当てられる。Ｅ３－ｇｐ１９Ｋは、小胞体（ＥＲ）から原形質膜へのクラス１の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の輸送を阻害し、それによって、ＭＨＣによるＴリンパ球へのペプチドの提示を防止する。

アデノウイルスＥ１Ａタンパク質は、元々、静止状態の正常細胞においてＤＮＡの複製を誘導することができるｐＲｂ結合タンパク質として説明された。Ｅ１Ａタンパク質の非常に重要な機能の１つは、ｐＲｂとＥ２Ｆの相互反応を撹乱し、それによってＥ２Ｆ転写因子を放出して、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターを活性化し、それらが調節するアデノウイルスＥ２Ａなどの遺伝子の転写を活性化することである。Ｅ１Ａタンパク質の保存領域２（ＣＲ２）は、ｐＲｂのポケット結合ドメインとの強力な相互作用を形成し、ＣＲ１は、ｐＲｂのＥ２Ｆ結合の実際の撹乱を媒介する。ＣＲ２における２４塩基対の欠失を特色とする、条件的に複製するウイルスが作成され、神経膠腫及び乳がん異種移植の治療において強力かつ選択的であることが示された。それらのウイルスのがん特異性は、機能障害Ｅ１ＡがＥ２Ｆ１転写因子を放出できなくなり、それによって遊離Ｅ２Ｆ１が必要になることから生じる。

ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、国際公開第２０１０／０７２９００号に既に開示されている。ＯＮＣＯＳ－１０２は、Ａｄ５ゲノムとは異なる以下の改変を示す、血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）である。
１．Ｅ１Ａ遺伝子定常領域２（ＣＲ２）における２４塩基対（ｂｐ）の欠失。機能障害Ｅ１Ａタンパク質は、Ｅ２Ｆ１転写因子に結合できず、そのＥ２Ｆ１転写因子を網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）から放出できなくなり、アデノウイルス遺伝子転写のために遊離Ｅ２Ｆ１が必要になる。遊離Ｅ２Ｆ１は、ｐＲｂ経路がほとんどの場合に撹乱されているがん細胞において、豊富に存在する。それによって、Ｅ１Ａに２４ｂｐの欠失を有するウイルスは、がん細胞において効率的に複製することができる。ｍＲＮＡへのＥ１Ａ遺伝子転写は、内因性Ｅ１Ａプロモーターによって調節される。
２．９６５ｂｐの欠失が、６．７Ｋタンパク質及びｇｐ１９Ｋタンパク質をコードする初期３（Ｅ３）領域に導入されている。これらのタンパク質は、アデノウイルスが宿主免疫調節機構から逃れる能力と関連しており、それらの機能は、アデノウイルス複製のために消費される。
３．ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質をコードする導入遺伝子が、Ｅ３領域に挿入されており、６．７Ｋ及びｇｐ１９Ｋを置き換えている。ｍＲＮＡへのＧＭ－ＣＳＦ遺伝子の転写は、内因性Ｅ３プロモーターによって調節される。換言すれば、ウイルス遺伝子をコードするＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの９６５塩基対において、Ｅ３領域からｇｐ１９Ｋ及び６．７Ｋが欠失しており、それらを置き換えるために、導入遺伝子ＧＭ－ＣＳＦが導入されている。
４．血清型５線維ノブが、血清型３線維によって置き換えられており、それによって、血清型５受容体ＣＡＲの代わりに血清型３受容体を介してウイルスを細胞内に侵入させる。

ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスでは、未変性Ｅ１Ａプロモーターが存在し、すなわちこのプロモーターは、別のプロモーターによって置き換えられていない。

つまり、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスでは、ＧＭ－ＣＳＦは、内因性ウイルスＥ３調節エレメント下にあり、それによって、感染の約８時間後に複製関連の導入遺伝子発現が開始する。ウイルスは、腫瘍選択的に複製し、したがって、腫瘍に限定されたＧＭ－ＣＳＦの産生が生じる。腫瘍特異性は、２４ｂｐの欠失によって達成され、それによって、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位が廃止され、過去の報告において実証されている通り、ウイルスは、ヒトのほぼすべてのがんを含めたｐ１６－Ｒｂ経路欠損を有する細胞において、選択的に複製する。ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの腫瘍溶解的効力は、野生型対照ウイルスよりも有効であることが示された。

ＧＭ－ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスは、腫瘍溶解によってがん細胞に直接的に作用しながら、抗がん免疫を誘導する。ＧＭ－ＣＳＦは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、主に樹状細胞の動員及び成熟、ならびに先天免疫アームの細胞の動員と関連する、全身性抗腫瘍免疫の強力なインデューサーである。しかし、全身的に上昇したサイトカインレベルは、毒性副作用の危険性がある。ＧＭ－ＣＳＦの高血清濃度によって媒介された副作用の直接的な危険性に加えて、骨髄性抑制性細胞（ＭＤＳＣ）の動員により、間接的な危険性が生じる。ＭＤＳＣの免疫抑制効果は、一般にがん患者にとって潜在的に有害であると同時に、がん免疫療法の状況では、特に逆効果になるおそれがある。したがって、ＧＭ－ＣＳＦの発現を腫瘍部位に限定することは、極めて重要である。

ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、良好な潜在的腫瘍溶解可能性があり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的に活性なヒトＧＭ－ＣＳＦを産生することが示されている（Koski et al. 2010）。免疫能を有するハムスターにおいて、ウイルスは、侵襲性の同系膵臓腫瘍の成長を阻止するのに有効であることが示された。腫瘍におけるウイルス複製の証拠は、ウイルスコピー数を測定することによって示された。複製の選択性は、直接的に注射された肝組織において、ウイルスコピー数が増大しなかったことにより実証された。腫瘍において複製と関連するＧＭ－ＣＳＦの限局的産生が実証されたが、血清又は肝臓へのＧＭ－ＣＳＦの漏出は、極めて少なかった。低用量のシクロホスファミドとＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを組み合わせると、抗腫瘍効果が増強され得るが、シクロホスファミド単独治療では、腫瘍成長は著しく低減されなかったことも示された。

全体的に、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを用いる進行がん患者の治療は、安全であると思われ、有効性の可能性を示す有望な徴候が観測された。ウイルスは、単回投与後でも長期間にわたって血清中に存在するが、複数回の注射によって、腫瘍の形質導入が改善され、抗腫瘍性免疫が増強される可能性が高い。
本明細書で使用される「化学療法」は、疾患の治療に化合物又は薬物を使用することを指すが、化学療法という用語は、ほとんどの場合、がんの治療と関連する。がん化学療法用の化合物は、ほぼ１００種の個々の薬物を包含する。
化学療法剤の最も一般的な副作用は、悪心及び嘔吐である。また、個体の大部分は、骨髄機能抑制、すなわち赤血球、白血球細胞及び血小板を産生する骨髄の抑制に苦しむ。これら及び他の副作用は、白血球細胞の破壊及び産生欠如を伴う免疫系の抑制、ならびに関連する日和見感染の危険性によっても悪化する。
幅広い化学療法剤に共通する他の副作用には、抜け毛（脱毛症）、食欲低下、体重減少、味覚変化、口内炎及び食道炎（炎症及び痛み）、便秘、下痢、疲労、心臓損傷、神経系の変化、肺損傷、生殖組織損傷、肝臓損傷、腎臓損傷、ならびに泌尿器系損傷が含まれる。

がん細胞死は、免疫原性又は非免疫原性であり得ることが示されている。免疫原性細胞死（ＩＣＤ）は、細胞表面の構造の変化を含み、免疫原性促進因子を放出させる。その後、ＩＣＤは、ＡＰＣが腫瘍抗原を取り込むように引き付け、それらを処理し、最後に抗腫瘍性免疫応答（特異的な抗腫瘍Ｔ細胞）を誘発する。がん治療の成功は、化学療法、腫瘍溶解性ウイルス又はそれら２つの組合せのいずれを使用しようと、免疫原性の腫瘍細胞死の誘導及び抗腫瘍免疫応答の誘導に依存する。一部の化学療法剤及び腫瘍溶解性アデノウイルスは、ＩＣＤの強力なインデューサーとして作用し、したがって、抗がん活性に寄与する抗がん免疫応答に対して有益な影響を及ぼすことが知られている。ＩＣＤは、外側原形質膜におけるカルレティキュリン（ＣＲＴ）などのＩＣＤバイオマーカーの存在、その後の高移動度群ボックス１タンパク質（ＨＭＧＢ１）及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の細胞外放出によって評価され得る。
過去に開示されている通り、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを用いるがん治療、ならびに化学療法剤を用いる治療は、単独で使用される場合、いくらかの有効性があることが示されている。本発明者らは、アデノウイルス遺伝子治療と、従来の治療などの他の治療の組合せが、いずれか１つの単独よりも、ＭＭの治療において有効になり得るかどうかの研究に努めた。

本明細書で使用される「併用治療」は、ＯＮＣＯＳ－１０２及び化学療法剤、好ましくはペメトレキセド及びシスプラチンか、又はペメトレキセド及びカルボプラチンかのいずれかを、それを必要とする患者に投与することを指す。併用治療では、ウイルス及び化学療法剤は、数日間にわたって複数用量で投与され得る。化学療法剤の投与は、ウイルス投与の開始前に開始することができ、複数用量の化学療法剤は、複数用量のウイルスが投与される期間中にも、さらに投与され得る。治療プロトコールは、ウイルスで初回のプライミングを行い、その後、化学療法剤を投与し、次にウイルス及び化学療法剤の両方の投与を継続することも含み得る。別の実施形態では、併用治療は、まず、化学療法剤のペメトレキセド及びシスプラチンを含むが、併用治療中、シスプラチンはカルボプラチンで置き換えられる。このことは、例えば治療にシスプラチンが使用されると過度の副作用が現れるので、必要になる場合がある。他の医薬品も、併用治療と同時に投与され得る。
本明細書で使用される「同時的」は、本明細書に記載される併用治療の前、後又はそれと同時に投与された、医薬品又は治療を指す。同時治療の期間は、数分間から数週間で変わり得る。典型的に、本明細書に記載される併用治療と同時的な治療は、数日間又は数週間継続する。

本明細書で使用される「プライミング」という用語は、従来の細胞傷害性の化学療法の能力を用いるアポトーシスを誘導する前治療を使用することを指す。腫瘍溶解性ウイルスを用いて行われた腫瘍プライミングによって、免疫原性がん細胞死が生じるが、このことは、細胞表面上にカルレティキュリンが提示され、天然アジュバント、具体的には高移動度群タンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１）及び瀕死細胞内から出てくるＡＴＰが放出され、最終的にＤＣが刺激され、その後、適応免疫応答が活性化されることと関連する。腫瘍環境におけるこのウイルス誘導性変化は、有意義な抗腫瘍性免疫応答のプライミングには必須である。抗原提示細胞は、瀕死の腫瘍細胞から腫瘍抗原を捕捉し、それらをＭＨＣクラスＩ及びＩＩの提示のために処理し、流入領域リンパ節に遊走し、抗原特異的Ｂ細胞及びＴ細胞を刺激する。例えば、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、細胞傷害性の腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し得る。本明細書で使用される「プライミング」という用語は、ウイルスの投与前に投与される場合、この種の免疫原性がん細胞死を引き起こす化学療法剤の能力も指す。他方では、化学療法剤を用いる腫瘍プライミングは、アポトーシスを誘導する前治療を使用する、間質腔の拡大も意味する。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、所期の結果を果たすことができる、化合物、治療剤、ウイルス又は薬物の量を指す。例えば、化学療法剤及び／又はアデノウイルスの有効量は、臨床結果を含めた、有益な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回又は複数回の投与で投与され得る。本明細書に記載される通り、有効量は、悪性中皮腫を寛解させ、安定化し、逆転させ、その進行を緩徐させ、かつ／もしくは遅延させ、又は悪性中皮腫を治癒させるのに十分な量である。本発明では、化学療法剤及びＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの効果は、例えば、前記治療に対する腫瘍反応をモニタリングすることによってモニタリングされ得る。腫瘍反応のモニタリングは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて実施され得る。例えば、腫瘍反応のモニタリングは、Ranki et al. (2014)に列挙されているものなどの細胞の免疫学的状態を測定する方法を用いて実施され得る。例えば、モニタリングは、腫瘍における腫瘍浸潤性リンパ球の存在を測定することによって行うことができ、ＴＨ１型の応答は、マイクロアレイを用いてモニタリングすることができ、ＩＦＮγ酵素結合ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）をモニタリングに利用することもできる。
したがって、有効量は、腫瘍において所望の効果又は反応を引き起こすことができるか、又は引き起こすために必要な量である。当技術分野で理解されている通り、有効量は、中でも、患者の病歴、ならびに使用される化学療法剤のタイプ及び／又は投与量などの他の因子に応じて変わり得る。

本明細書で使用される「毒性」という用語は、化学療法剤の投与と関連する毒性事象を指す。このような事象には、好中球減少症、血小板減少、中毒死、疲労、食欲不振、悪心、皮膚発疹、感染症、下痢、粘膜炎、及び貧血が含まれるが、それらに限定されない。毒性作用は、当分野で公知の任意の従来の方法を用いてモニタリングされ得る。
本明細書で使用される「治療期間」という用語は、併用治療が実施される期間を指す。治療期間は、ＯＮＣＯＳ－１０２及び化学療法剤の複数回の投与からなり得、投与は複数周期で実施され得る。治療期間は、数週間又は数カ月間継続し得る。治療期間は、最長１年間継続し得る。

本明細書で使用される「投与期間」という用語は、アデノウイルス、化学療法剤、又は他の医薬品が患者に投与される期間を指す。投与期間中、単回用量又は複数回用量の当該薬剤が投与され得る。投与期間は、数分間、数時間、数日間、数週間、又は数カ月間であり得る。投与期間は、複数周期からなり得る。例えば、３週間（２１日間）周期が、化学療法剤の投与に使用され得る。
白金系抗悪性腫瘍薬（非公式にはプラチンと呼ばれる）は、がんを治療するための化学療法剤である。これらは、白金の配位錯体である。カルボプラチン及びシスプラチンは、白金系抗悪性腫瘍薬である。
ペメトレキセドは、葉酸に化学的に類似しており、葉酸代謝拮抗剤と呼ばれるクラスの化学療法薬物に含まれる。ペメトレキセドは、プリン及びピリミジン合成に使用される３種の酵素であるチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、及びグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ（ＧＡＲＦＴ）を阻害することによって働く。ペメトレキセドは、前駆体であるプリンヌクレオチド及びピリミジンヌクレオチドの形成を阻害することによって、分裂正常細胞及び分裂がん細胞の両方の成長及び生存に必要なＤＮＡ及びＲＮＡの形成を防止する。

ペメトレキセドは、切除不能なＭＰＭを治療するために、シスプラチンと組み合わせて使用されることがＦＤＡによって承認されている（それぞれ５００ｍｇ／ｍ²及び７５ｍｇ／ｍ²）。大規模Ｉ第ＩＩＩ相(Large I phase III)ＥＭＰＨＡＣＩＳ治験では、シスプラチン単独と比較して、シスプラチン及びペメトレキセドの両方で治療した患者において、アウトカムが改善されたことが示された。シスプラチン単独では生存期間中央値が９カ月であったのと比較して（ｐ＝０．０２）、併用群における患者の生存期間中央値は、１２カ月であったことも示された。多くのＭＭ患者においてシスプラチンの毒性が高いことに起因して、カルボプラチンが代替として試験されている。しかし、これらの第一選択の化学療法剤は、すべて、ＭＭに対する有効性が低いことが示されている。

治療組成物は、一般に特定の投与経路に対して製剤化される。本明細書に記載される併用治療では、ペメトレキセドは、その有効濃度で使用される。一例として、ＭＭの治療では、ペメトレキセドは、５００ｍｇ／ｍ²までの１日当たりの総用量で投与され得る。ペメトレキセドは、２１日周期が使用される場合、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）注入として、各２１日周期の１日目に１０分間かけて投与され得る。例えば、副作用が生じる場合、その用量は、２００ｍｇ／ｍ²～４５０ｍｇ／ｍ²、より好ましくは２５０ｍｇ／ｍ²～３７５ｍｇ／ｍ²などに低減され得る。ペメトレキセドは、適切な場合には、腹腔内投与することもできる。

本明細書に記載される併用治療では、シスプラチンは、その有効濃度で使用される。ＭＭの治療では、シスプラチンの典型的な用量は、ペメトレキセド注入終了のおよそ３０分後に開始して、２時間にわたるｉ．ｖ．注入で７５ｍｇ／ｍ²である。投与されるシスプラチンの量は、３０ｍｇ／ｍ²～７５ｍｇ／ｍ²で変わり得る。例えば、副作用が生じる場合、その用量は、３０ｍｇ／ｍ²～７０ｍｇ／ｍ²、より好ましくは３５ｍｇ／ｍ²～６０ｍｇ／ｍ²、最も好ましくは３７．５ｍｇ／ｍ²～５６．２５ｍｇ／ｍ²などに低減され得る。シスプラチンは、適切な場合、腹腔内投与することもできる。
ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスとの併用治療では、シスプラチン及びペメトレキセドは、０．７５：１０～３：１０の間のモル比で投与され得る。最も好ましくは、その比は、１．５：１０である。

本明細書に記載される併用治療では、カルボプラチンは、その有効濃度で使用される。ＭＭの併用治療治療では、カルボプラチンの典型的な用量は、正常な腎機能の患者に対して４００ｍｇ／ｍ²である。カルボプラチンは、ペメトレキセドが約１０分間かけて注入され、注入が終了しておよそ３０分後に開始して、３０分間～６０分間にわたってｉ．ｖ．注入され得る。しかし、カルボプラチンの用量は、一般に、患者の糸球体濾過率（ＧＦＲ）及び濃度対時間曲線下標的面積（ＡＵＣ、ｍｇ／ｍｌ×分による）を考慮するＣａｌｖｅｒｔ式（ｍｇ／ｍ²ではなくｍｇで算出される）に従って、総用量（ｍｇ）＝（標的ＡＵＣ）×（ＧＦＲ＋２５）により算出される。したがって、カルボプラチン用量は、例えば副作用に起因して、特に腎機能低下に起因して調整され、低減され得る。

ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスとの併用治療では、投与用量は、典型的に、約５００ｍｇ／ｍ²のペメトレキセド及び約ＡＵＣ５のカルボプラチンである。好ましい一実施形態では、正常な腎機能を有する患者の場合、約５００ｍｇ／ｍ²のペメトレキセド及び約４００ｍｇ／ｍ²のカルボプラチンが投与され得る。しかし、投与量は、ペメトレキセド２５０ｍｇ／ｍ²～５００ｍｇ／ｍ²の間、及びカルボプラチン２００ｍｇ／ｍ²～４００ｍｇ／ｍ²の間で変わり得る。ある特定の場合、特に化学療法剤が毒性作用を示す場合には、約３７５ｍｇ／ｍ²のペメトレキセド及び約３００ｍｇ／ｍ²のカルボプラチンが投与され得る。したがって、ペメトレキセド及びカルボプラチンは、５：４のモル比で投与され得る。しかし、この比は、５：８～５：２の間で変わり得る。
本発明の一目的は、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスであって、２種の化学療法剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与される、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本明細書に記載される併用治療では、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、複数回用量で、やはり複数回用量で投与され得る化学療法剤とは異なる回数で投与され得る。
本発明の別の目的は、２種の化学療法剤と組み合わせて患者に投与され、２種の化学療法剤が、ペメトレキセド及びシスプラチンであるか、又はペメトレキセド及びカルボプラチンであるかのいずれかである、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本発明のさらに別の目的は、ペメトレキセド及びシスプラチンと組み合わせて、それを必要とする患者に投与され、ペメトレキセド及びシスプラチンのモル比が１０：０．７５～１０：３である、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本発明のさらに別の目的は、ペメトレキセド及びシスプラチンと組み合わせて、それを必要とする患者に投与され、ペメトレキセド及びシスプラチンのモル比が１０：１．５である、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本発明のさらなる目的は、ペメトレキセド及びカルボプラチンと組み合わせて患者に投与され、ペメトレキセド及びカルボプラチンのモル比が５：８～５：２である、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本発明のさらに別の目的は、ペメトレキセド及びカルボプラチンと組み合わせて、それを必要とする患者に投与され、ペメトレキセド及びカルボプラチンのモル比が５：４である、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の好ましい実施形態では、ＯＮＣＯＳ－１０２と、ペメトレキセド及びシスプラチン又はペメトレキセド及びカルボプラチンに加えて、シクロヘキサミド、シアノコバラミン、葉（Ｆｏｌａｔｉｃ）酸及びデキサメタゾンの様々な組合せも使用され得る。より具体的には、シクロヘキサミド、シアノコバラミン、葉酸及びデキサメタゾンからなる薬剤の一覧から、１種、２種、３種又は４種及びそれらの任意の組合せが、ＯＮＣＯＳ－１０２とペメトレキセド及びシスプラチン、又はＯＮＣＯＳ－１０２とペメトレキセド及びカルボプラチンを含む併用治療と同時に使用され得る。一例として、対象は、記載される併用治療の化学療法剤の投与前、投与中及び投与後に、過敏反応を低減又は排除する１種又は複数の補助剤を用いて、例えば化学療法剤の投与前、投与中及び投与後にデキサメタゾン、葉酸、及びビタミンＢ１２の１つ又は複数を用いて治療され得る。ある特定の実施形態では、対象は、化学療法剤の投与前日、投与当日及び投与翌日に、デキサメタゾン２～２５ｍｇを経口により治療され、化学療法剤の投与の７日前に開始される期間中、少なくとも１つの治療期間中ずっと、及び化学療法剤の最終投与後２１日間、葉酸４００～１０００μｇを経口により毎日治療され、ある治療期間の化学療法剤の初回投与の１週間前に１０００μｇのビタミンＢ１２を筋肉内により治療される。

ＯＮＣＯＳ－１０２を、それを必要とする患者に投与するために、任意の従来の方法が使用され得る。投与経路は、製剤又は組成物の形態、疾患、腫瘍の位置、患者、併存症及び他の因子に応じて変わる。本発明の好ましい一実施形態では、投与は、腫瘍内、筋肉内、動脈内、胸膜内、小胞内、腔内もしくは腹膜の注射、又は経口投与によって実施される。好ましくは、投与は、腫瘍内注射又は腹腔内注射として実施される。
注射は、腫瘍の位置及びサイズに従って、患者ごとに個別化され得る。例えば、ウイルスは、０．５ｍｌ～１０ｍｌの体積で注射（ｉ．ｔ．）され得る。注射は、複数の、好ましくは５つの異なる腫瘍部位に行われ得る。腹腔内投与量の体積は、２００ｍｌ～８００ｍｌで変わり得る。好ましくは、投与体積は、５００ｍｌである。

ベクターの有効用量は、少なくとも、治療を必要とする対象、腫瘍のタイプ、腫瘍の位置及び腫瘍の段階に応じて変わる。用量は、例えば約１０⁸ウイルス粒子（ＶＰ）～約１０¹⁴ＶＰ、好ましくは約５×１０⁹ＶＰ～約１０¹³ＶＰ、より好ましくは約８×１０⁹ＶＰ～約１０¹²ＶＰで変わり得る。本発明の特定の一実施形態では、用量は、約５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰの範囲である。したがって、投与されるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの量は、５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰの範囲であり得る。好ましくは、ＯＮＣＯＳ－１０２は、３×１０¹¹ＶＰ／５ｍｌで投与される。他方では、プラーク形成単位で表すと、ＯＮＣＯＳ－１０２は、前記患者の悪性中皮腫の腫瘍への直接注射によって、又は腹腔内により、約１０⁸～１０¹²個のプラーク形成単位の用量で投与され得る。
本発明の一目的は、２種の化学療法剤と組み合わせて、それを必要とする患者に投与され、ウイルスの量が５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰである、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本発明の別の目的は、２種の化学療法剤と組み合わせて患者に投与され、３×１０¹¹ＶＰ／５ｍｌの量で投与される、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本発明のさらなる態様は、２種の化学療法剤と組み合わせて患者に投与され、化学療法剤及びウイルスが有効量で投与される、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明のさらに別の目的は、２種の化学療法剤と組み合わせて、それを必要とする患者に投与され、腹腔内により、又は腫瘍への直接注射によって投与され、２種の化学療法剤が静脈内又は腹腔内される、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。
本発明の一態様によれば、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのウイルスであって、２種の化学療法剤と組み合わせて、それを必要とする患者に投与され、２種の化学療法剤の投与前に投与され、前記化学療法剤の投与期間中にも投与される、ウイルスである。
本発明の別の態様によれば、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのウイルスであって、２種の化学療法剤が、ウイルスが投与される前に投与され、前記ウイルスの投与期間中にも投与される、ウイルスである。

好ましい一実施形態によれば、併用治療の薬剤は、１カ月～１０カ月の間の期間中にウイルスを１回～１０回投与して初回プライミングを与え、次にウイルス投与開始の例えば１週間～４週間後に化学療法剤を投与することによって投与され得る。投与は、例えば以下の逐次的順序であり得る。ウイルスを、それを必要とする対象に４カ月の期間中６回投与することによって、ウイルスによるプライミングを行う。典型的に、治療期間の初めにおいて、投与間の時間は、治療が進行したときよりも短い。化学療法剤、好ましくはペメトレキセド及びシスプラチン、又はペメトレキセド及びカルボプラチンの投与は、ウイルス投与を開始して３週間後に開始され得る。化学療法剤の投与は、投与が、例えば約３週間の周期で合計６回行われるように継続され得る。投与回数は、１回～６回で変わり得る。

本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞のビリオン媒介性腫瘍溶解を誘導し、腫瘍細胞に対するヒト免疫応答を活性化する。本発明の好ましい一実施形態では、この方法又は使用は、対象における制御性Ｔ細胞を下方制御することができる物質の投与をさらに含む。「制御性Ｔ細胞を下方制御することができる物質」は、Ｔ抑制因子又は制御性Ｔ細胞と識別される細胞の量を低減する作用物質を指す。これらの細胞は、以下の免疫表現型マーカー、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋、ＣＤ１２７－及びＧＩＴＲ＋の１つ又は複数からなるとして識別されている。Ｔ抑制因子又は制御性Ｔ細胞を低減するこのような作用物質は、抗ＣＤ２５抗体又は化学療法剤からなる群から選択され得る。 導入遺伝子ＧＭ－ＣＳＦの免疫調節機能は、武装した腫瘍溶解性アデノウイルスの中心的作用機序であり、さらに、アデノウイルス自体は、免疫系の強力な活性化因子であり、このことは、ウイルスの全体的な抗腫瘍有効性に著しく寄与する。

本明細書で使用される「ウイルス感作物質」は、腫瘍溶解性ウイルスの有効性を改善し得る作用物質を指す。このような併用治療に適しているか、又はウイルス感作物質として使用され得る作用物質には、オール－トランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンが含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、使用されるウイルス感作物質は、シクロホスファミドである。 また、チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１又は抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ又はイピリムマブ）は、併用治療との併用に適している。

本発明の一態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含む、方法である。ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤は、有効量で投与される。
本発明の別の態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、悪性中皮腫細胞を死滅させるか、又は悪性中皮腫細胞の成長を防止するのに十分な量及び時間で、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含む、方法である。
本発明の好ましい一態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含み、化学療法剤が、ペメトレキセド及びシスプラチン、又はペメトレキセド及びカルボプラチンのいずれかである、方法である。

本発明の別の好ましい態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含み、前記化学療法剤が、ウイルスの投与期間の開始前に最初に投与され、ウイルスの投与期間中も投与される、方法である。
本発明の別の好ましい態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含み、前記ウイルスが、化学療法剤の投与期間の開始前に最初に投与され、前記化学療法剤の投与期間中も投与される、方法である。
本発明のさらに別の好ましい態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含み、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスが前記患者に１回～１０回投与され、化学療法剤が前記患者に１回～６回投与される、方法である。

本発明のさらに別の好ましい態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含み、ＯＮＣＯＳ－１０２の前記投与が、前記患者の悪性中皮腫腫瘍への直接注射によって、又は腹腔内注射として、１０⁸～１０¹²個のプラーク形成単位の用量で行われる、方法である。
本発明のさらに別の好ましい態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含み、投与されるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの量が５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰの範囲である、方法である。

本発明のさらに別の好ましい態様は、患者の悪性中皮腫を治療するための方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含み、前記化学療法剤が、２５０ｍｇ／ｍ²～５００ｍｇ／ｍ²の用量のペメトレキセド及び３０ｍｇ／ｍ²～７５ｍｇ／ｍ²の用量のシスプラチン又は２５０ｍｇ／ｍ²～５００ｍｇ／ｍ²の用量のペメトレキセド及び２００ｍｇ／ｍ²～４００ｍｇ／ｍ²の用量のカルボプラチンで投与される、方法である。
本発明のさらなる態様は、ヒト悪性中皮腫の治療におけるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの使用であって、ウイルスが２種の化学療法剤と組み合わせて患者に投与される、使用である。

患者へのシクロホスファミド（ＣＰＯ）の同時的投与は、併用治療期間中に行われ得る。シクロホスファミドは、いくつかの自己免疫障害でも使用されている一般的な化学療法剤である。シクロホスファミドは、いくつかの機構を介して腫瘍溶解性ウイルス有効性を改善することが示されている。シクロホスファミドは、先天的抗ウイルス応答を減弱し、抗腫瘍溶解性ウイルス中和抗体の作製を緩徐し、Ｔレグを標的化することができ、腫瘍の脈管構造に影響を及ぼして、腫瘍溶解性ウイルスの血管外漏出を増強することができる。いくつかの前臨床研究では、シクロホスファミドは、腫瘍溶解性ウイルスの免疫クリアランスを遅延させ、ウイルス感染の持続性を増強し、治療有効性を延長し得ることが示されている。本発明では、シクロホスファミドは、腫瘍に対する免疫応答を増強するために、ウイルス複製、ならびにＮＫ及び細胞傷害性Ｔ細胞のＧＭ－ＣＳＦ誘導性刺激の効果を増強するためのウイルス感作物質として使用され得る。シクロホスファミドは、静脈内ボーラス用量又は低用量の経口メトロノミック投与として使用され得る。本発明の実施形態において使用され得る他の適切なウイルス感作物質には、テモゾロミド及びエルロチニブが含まれる。
制御性Ｔ細胞を低減するために、患者は、ＯＮＣＯＳ－１０２の各注射の１～３日前に、低用量のＣＰＯを受ける。ＣＰＯは、例えば３００ｍｇ／ｍ²のｉ．ｖ．ボーラスとして投与される。ボーラスは、１００～６００ｍｇ／ｍ²で変わり得る。ＣＰＯの投与経路は、例えば経口投与であってもよい。メトロノミック化学療法も使用され得る。

また葉酸は、併用治療の開始前及び併用治療中にも患者に投与され得る。葉酸の投与は、併用治療の初回用量の化学療法剤の投与の少なくとも５日前に開始され得る。例えば、投与は、併用治療の化学療法剤の投与開始の１～２週間前に開始され得る。葉酸は、毎日（経口投与；ＰＯ）投与することができ、投与は、併用治療中も継続され得る。投与は、化学療法剤の最終投与の約３週間後まで継続され得る。葉酸の典型的な用量は、４ｍｇ（ＰＯ）である。本発明の好ましい一態様は、それを必要とする患者の中皮腫を治療するための方法であって、（ａ）ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程と、葉酸を患者に投与する工程とを含む、方法である。

シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）は、併用治療の開始前及び併用治療中も、患者に投与され得る。シアノコバラミンの投与は、典型的に、併用治療の化学療法剤の投与開始の１～２週間前に開始される。シアノコバラミンは、例えば筋肉内注射（ｉ．ｍ．）として、９週間の間隔で、併用治療中も投与され得る。投与は、化学療法剤の最終投与の約３週間後まで継続され得る。シアノコバラミンの典型的な量は、１０００ｍｃｇ（μｇ）である。本発明の好ましい一態様は、それを必要とする患者の中皮腫を治療するための方法であって、（ａ）ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程と、シアノコバラミンを患者に投与する工程とを含む、方法である。
葉酸及びシアノコバラミンは、一般に、治療に関係する血液学的毒性及び胃腸管毒性を低減するために使用される。これらの副作用は、例えばペメトレキセドの投与と関連し得る。

デキサメタゾンも、併用治療に付された患者に投与され得る。典型的に、デキサメタゾンは、併用治療の化学療法剤の投与前日、投与当日及び投与翌日に投与される。デキサメタゾンは、４ｍｇでＢＤ（すなわち１日２回）により５日間、６周期まで週３回の頻度で投与され得る。本発明の一目的は、それを必要とする患者の中皮腫を治療するための方法であって、（ａ）ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程と、（ｂ）デキサメタゾンを患者に投与する工程とを含む、方法である。

本明細書に記載される併用治療は、シクロホスファミドを患者に投与する工程をさらに含み得る。本発明の一目的は、それを必要とする患者の中皮腫を治療するための方法であって、（ａ）ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含み、工程（ａ）の前にシクロホスファミドを患者に投与する工程をさらに含む、方法である。
本発明のさらなる態様は、患者における腫瘍成長を低減するための方法であって、前記患者における腫瘍成長が低減される条件下で、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含む、方法である。
この方法は、併用治療の投与前に、患者が腫瘍を有すると同定する工程を含み得る。腫瘍診断は、任意の従来の方法で行われ得る。患者は、例えば画像診断技術を使用して、腫瘍を有すると同定され得る。この方法は、併用治療を患者に投与した後、腫瘍成長の低減を測定する工程をさらに含み得る。腫瘍の低減は、任意の従来の方法によって研究され得る。腫瘍成長の低減は、例えば画像診断技術を使用して測定され得る。
本発明の別の態様は、腫瘍の成長を阻害するための併用治療の使用である。腫瘍成長の阻害の目標は、例えば腫瘍質量の低減及び腫瘍体積の低減であり得る。さらに、併用治療は、腫瘍の拡大を阻害するために使用され得る。

治療に関係する病変サイズの増大に相当する腫瘍の偽性進行は、腫瘍サイズに対する現在の併用治療の効果を明らかにすることを企図された画像化経過観察の結果に影響を及ぼし得ることにも留意されたい。この種の効果は、化学療法及び放射線療法を組み合わせた後、患者の約３０％において観測された。したがって、偽性進行は、本明細書に記載される併用治療が使用される場合、患者のある特定の一部に存在し得る。これらの患者については、腫瘍サイズの低減は、治療の有効性の適切な指標ではない。
また、がん細胞の成長を低減する方法であって、有効量のＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を、治療を必要とする対象に投与する工程を含む、方法が開示される。

また、ヒト患者における腫瘍又はがん細胞を阻害又は死滅させる方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を用いて患者を治療することからなり、化学療法剤が、ペメトレキセド及びシスプラチン、又はペメトレキセド及びカルボプラチンのいずれかである、方法が開示される。
さらに、腫瘍又はがん細胞を死滅させる方法であって、腫瘍又はがん細胞を、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤と接触させる工程を含み、化学療法剤が、ペメトレキセド及びシスプラチン、又はペメトレキセド及びカルボプラチンのいずれかである、方法が開示される。
またさらに、悪性中皮腫を治療するための方法であって、単独で投与されるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス又は前記ウイルスなしに一緒に投与される２種の化学療法剤の効果と比較して、増強された治療効果を有する併用治療を提供するために、有効量のＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び有効量の２種の化学療法剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法が開示される。

本発明の一実施形態では、ＯＮＣＯＳ－１０２は、ｉｎ ｓｉｔｕがんワクチンとして作用する。本明細書で使用される「ｉｎ ｓｉｔｕがんワクチン」は、腫瘍細胞を死滅させ、かつ腫瘍細胞に対する免疫応答を増大するがんワクチンを指す。ウイルス複製は、免疫系に対する強力な危険信号であり（＝ＴＨ１タイプの応答に必要とされる）、したがって、ＡＰＣのＧＭ－ＣＳＦ媒介性の成熟及び活性化、ならびにＮＫ細胞の動員に対する強力な同時刺激現象として作用する。腫瘍細胞溶解は、ＡＰＣに腫瘍フラグメント及びエピトープを提示する一助にもなり、さらに、同時刺激は炎症によって生じる。したがって、エピトープ非依存性（すなわちＨＬＡ拘束性ではない）応答は、各腫瘍の状況で生じ、したがってｉｎ ｓｉｔｕで起こる。腫瘍特異的免疫応答は、腫瘍細胞溶解時に瀕死細胞から特異的腫瘍抗原が放出されると、腫瘍環境で活性化される。
本発明の好ましい一実施形態では、この方法又は使用は、同時的な放射線療法を対象に行う工程をさらに含む。

本発明の好ましい一実施形態では、この方法又は使用は、自己貪食を誘導する作用物質を対象に投与する工程をさらに含む。自己貪食とは、リソソーム機構を介して細胞自体の構成要素が分解することを含む異化プロセスを指す。「自己貪食を誘導する作用物質」は、自己貪食を誘導することができる作用物質を指し、それに限定されるものではないが、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、リチウム、タモキシフェン、クロロキン、バフィロマイシン、テムシロリムス、シロリムス及びテモゾロミドからなる群から選択され得る。本発明の特定の一実施形態では、この方法は、テモゾロミドを対象に投与する工程をさらに含む。テモゾロミドは、経口又は静脈内テモゾロミドのいずれかであり得る。
本発明の一目的は、ウイルス治療単独又は化学療法だけの使用と比較して、安全特性が改善しており、がんに対する効果が改善された、ＯＮＣＯＳ－１０２腫瘍溶解性アデノウイルス及び化学療法剤の治療上有効な新規な使用を開発することであった。

現在の実験結果では、単剤治療としてのＯＮＣＯＳ－１０２が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト中皮腫細胞株を死滅させ、治療に対して難治性のＨ２２６悪性胸膜中皮腫の異種移植モデルにおいていくらかの抗腫瘍活性を示したことが示された。それとは対照的に、悪性中皮腫のための現在の標準ケア（ＳｏＣ）化学療法レジメン（ペメトレキセド＋シスプラチン又はペメトレキセド＋カルボプラチン）では、この中皮腫の異種移植モデルにおいて抗腫瘍有効性は示されなかった。しかし驚くべきことに、ＯＮＣＯＳ－１０２をＳｏＣ化学療法レジメンと組み合わせると、相乗的な抗腫瘍効果が見られた。このデータは、悪性中皮腫の治療に対して、ＯＮＣＯＳ－１０２をＳｏＣ化学療法と組み合わせる強力な理論的根拠を示している。

化学療法は、ＯＮＣＯＳ－１０２と共に行うと、現在の異種移植モデルにおいてＩＣＤマーカーの発現を増大した。過去には、ＯＮＣＯＳ－１０２が、ハムスターにおいて機能的ヒトＧＭ－ＣＳＦを産生し、腫瘍特異的免疫を誘導することが示されており、このことは、ＧＭＣ－ＳＦが、現在の異種移植モデルにおいても樹状細胞（ＤＣ）の動員及び活性化に関与し、Ｔ細胞を刺激し、最後に抗腫瘍免疫を発生させ得ることを示している。例に詳細に記載されるヒト中皮腫がんモデルでは、ＧＭ－ＣＳＦの機能は、免疫不全マウスの免疫系によって喪失した。しかし、中皮腫に対する免疫系調節に関するＧＭ－ＣＳＦの実用性は、既に臨床研究において示されている（Ranki et al. 2014）。

過去の臨床データによって、ＯＮＣＯＳ－１０２は、腫瘍特異的免疫応答をプライミングすることができることが実証されており、このことは、化学療法に対して難治性の悪性胸膜中皮腫の患者において細胞傷害性の腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することを意味する（Ranki et al. 2014）。しかし、この現在の免疫不全動物モデルでは、化学療法の開始前のＯＮＣＯＳ－１０２によるプライミングは、いかなるさらなる利益も示さなかった。このことは、免疫不全マウスモデルでは免疫系が非常に最小限の役割を果たすので、驚くべきことではない。

現在のデータは、第一選択の化学療法と組み合わせたＯＮＣＯＳ－１０２が、ＭＭに対する効率的な治療として使用され得ることを強力に示唆している。ＯＮＣＯＳ－１０２は、その安全性プロファイルに起因して、腫瘍だけで限局的に複製し、中皮腫細胞に対する高い指向性を呈した。動物研究中、主な副作用は記録されなかった。併用治療は相乗効果を示し、中皮腫に対して最も有効な治療であり、したがって、第一選択の標準化学療法より有効でもあった。さらに、ＯＮＣＯＳ－１０２と化学療法の組合せは、免疫原性の腫瘍細胞死の誘導、及び最後に抗がん免疫応答の誘導の増強に起因して、腫瘍微小環境における免疫抑制性微小環境の主な障壁を克服するための強力なツールである。本発明者らは、併用治療がＩＣＤを増大することを示しており、このことは、腫瘍の免疫原性細胞死の活性が増強されたことを示唆している。さらに、本発明による併用治療は、中皮腫細胞におけるＯＮＣＯＳ－１０２の感染力を改善した。この動物モデルにおけるＧＭ－ＣＳＦ機能は喪失したが、過去の研究では、このサイトカインは、ＡＰＣ及びナチュラルキラー細胞を直接的に動員することによって、ならびに腫瘍部位においてＡＰＣを活性化し、成熟させることによって、重要な機能を果たすことが知られている。
本発明のアデノウイルスベクターは、目的の部位にベクターを輸送できることに加えて、導入遺伝子の発現及び持続性も保証する。さらに、ベクターならびに導入遺伝子に対する免疫応答は、最小限に抑えられる。
本発明は、従来の治療に対する治療抵抗性に関する問題を解決する。さらに本発明は、健康な組織への毒性又は損傷が少ない、選択的治療のためのツール及び方法を提供する。本発明の利点には、他の治療剤と比較して、副作用が異なり、少ないことも含まれる。重要なことに、この手法は、放射線治療を含めた他の多くの治療形態と相乗効果があり、したがって、併用レジメンにおいて使用するのに適している。

本発明は、腫瘍細胞が、ビリオンによって引き起こされた腫瘍溶解によって破壊される、がん治療を達成する。さらに、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）及び樹状細胞（ＤＣ）の活性化を含めた、ヒト免疫応答を活性化する様々な異なる機構が、本発明の治療上の使用のために動員される。
したがって本願は、悪性細胞に対して宿主の免疫系を有効に動員すると同時に、優れた安全記録を維持しながら、悪性細胞において直接的な腫瘍溶解活性及び化学療法活性を提供するための戦略を記載し、その方法及び手段を提供する。
本発明の態様は、効率的で正確な遺伝子導入、ならびにがん治療における特異的で十分な腫瘍死滅能の増大を達成するための新規な方法及び手段を対象とする。

化学療法剤の使用と組み合わせた腫瘍溶解性アデノウイルスを用いる本発明の治療の予期しない有効性により、ｉｎ ｖｉｖｏ研究で実証される通り、悪性中皮腫のための現在の標準ケア（ＳｏＣ）化学療法レジメン（ペメトレキセド＋シスプラチン、又はペメトレキセド＋カルボプラチン）と比較して、治療有効性の著しい改善が提供される。
つまり、提示されたデータは、悪性中皮腫の治療に対して、ＯＮＣＯＳ－１０２を第一選択の化学療法と組み合わせる強力な理論的根拠を示している。

以下の例は、本発明の様々な実施形態を単に例示する目的で提示されており、本発明を制限することを意味しない。当業者は、本発明が目的を達成し、前述の目標及び利点、ならびに本明細書に固有の目的、目標及び利点を得るために、十分に適合されることを容易に理解されよう。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含される、本明細書における変更及び他の使用を、当業者は思い付くであろう。

ＯＮＣＯＳ－１０２の構築
ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードするキメラ腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＮＣＯＳ－１０２）の構築及び特徴付けは、既に説明されている（国際公開第２０１０／０７２９００号及びKoski et al.）。それから間もなく、アデノウイルスの標準調製技術を使用して、Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦが作製され、増幅された。キメラ５／３線維であるｐＡｄＥａｓｙ５／３を含有するｐＡｄＥａｓｙ－１由来のプラスミドを、大腸菌において、Ａｄ５／３ｌｕｃ１ウイルスゲノム及びｐＡｄＥａｓｙ－１のＢｓｔＸＩ消化８．９ｋｂフラグメントの相同組換えによって作成した。次に、Ｅ１Ａに２４ｂｐ欠失を含有するシャトルベクター（ｐＳｈｕｔｔｌｅＤ２４）を、ＰｍｅＩで線状化し、ｐＡｄＥａｓｙ５／３を用いて組み換えてｐＡｄ５／３－Ｄ２４を得た。ヒトＧＭＣＳＦ遺伝子をＥ３領域に挿入するために、Ａｄ５ゲノム由来のＳｐｅＩからＮｄｅＩのフラグメントをｐＧＥＭ５Ｚｆ⁺（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）のマルチクローニング部位に挿入することによって、Ｅ３－クローニングベクターｐＴＨＳＮを作成した。さらに、ｐＴＨＳＮを、ＳｕｎＩ／ＭｕｎＩで消化し、Ｅ３領域に９６５ｂｐ欠失（６．７Ｋ及びｇｐ１９Ｋが欠失）を作成した。ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする４３２ｂｐ相補的ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）を、遺伝子にフランキングする特異的制限部位ＳｕｎＩ／ＭｕｎＩを特色とするプライマーで増幅し、次にＳｕｎＩ／ＭｕｎＩ消化ｐＴＨＳＮに挿入した。ｐＡｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦを、大腸菌において、ＦｓｐＩ線状化ｐＴＨＳＮ－ＧＭＣＳＦとＳｒｆＩ線状化ｐＡｄ５／３－Ｄ２４を相同的に組み換えることによって作製した。Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦウイルスゲノムを、ＰａｃＩで消化し、増幅及びレスキューのためにＡ５４９細胞にトランスフェクトすることによって放出させた。すべてのクローニング相を、ＰＣＲ及び多重階制限消化により確認した。シャトルプラスミドｐＴＨＳＮ－ＧＭ－ＣＳＦを、配列決定した。野生型Ｅ１が存在しないことを、ＰＣＲを用いて確認した。Ｅ１領域、導入遺伝子、及び線維を、最終ウイルスにおいて、配列決定及びＰＣＲを用いてチェックした。Ａ５４９細胞に対して、Ｏｎｃｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（フィンランド、ヘルシンキ）によるｃＧＭＰの原理に従ってウイルス産生を行って、野生型組換えの危険性を回避した。ウイルス原液の緩衝液製剤は、１０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｚｍａ塩基、７５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５％（質量／体積）スクロース、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ（＋）ヒスチジン、０．５％（体積／体積）ＥｔＯＨ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ、１００μｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡであり、０．９％（質量／体積）ＮａＣｌ溶液（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、ドイツ、メルズンゲン）を希釈剤として使用した。ＯＮＣＯＳ－１０２は、ＧＬＰのＢｉｏｖｉａｎ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）によって産生されたものであり、使用まで－８０℃で保存した。ＯＮＣＯＳ－１０２を、使用するために適用直前に解凍し、使用まで氷上で保存した。ＯＮＣＯＳ－１０２を、解凍した後に層流ボックス内で希釈して、必要な濃度を得、注射シリンジを調製し、使用まで氷上で保存した。

細胞株
ヒト類上皮中皮腫細胞株ＪＬ－１（ＡＣＣ５９６、ＤＳＭＺから購入した）を、２０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１６０００－０４４、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１％ペニシリン＆ストレプトマイシン（１５１４０－１２２、Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、１０５６７－０１４、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ヒト悪性二相型中皮腫ＭＳＴＯ－２１１Ｈ（ＡＣＣ３９０、ＤＳＭＺから購入した）及びヒト上皮中皮腫ＮＣＩ－Ｈ２２６（Ｈ２２６、ＣＲＬ－５８２６、ＡＴＣＣから購入した）を、１０％熱不活化ＦＢＳ（１６０００－０４４、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１％ペニシリン＆ストレプトマイシン（１５１４０－１２２、Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ａ１０４９１－０１、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。すべての細胞株を、５％ＣＯ₂を用いて３７℃でインキュベートした。

化学療法剤
ペメトレキセド二ナトリウム（ｓｃ－２１９５６４）、シスプラチン（ｓｃ－２００８９６）及びカルボプラチン（ｓｃ－２０２０９３）は、すべてＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、使用前に滅菌水で再構成した。
ペメトレキセド（ｐｅｍ）１０ｍｇを、滅菌水１ｍｌに懸濁させて、１０ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。この溶液を原液として使用し、室温で保存した。物質を、溶液の添加時に１～５分間振とうして、均質な溶液を得た。原液を、０．９％ＮａＣｌでさらに希釈し、１００μｌ中１０ｍｇ／ｋｇ／マウスを使用した。
シスプラチン（ｃｉｓ）１５０ｍｇを、滅菌水１５０ｍｌに懸濁させて、１ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。この溶液を原液として使用し、室温で保存した。物質を、溶液の添加時に１～５分間振とうして、均質な溶液を得た。原液を、０．９％ＮａＣｌでさらに希釈し、１００μｌ中１．５ｍｇ／ｋｇ／マウスを使用した。
カルボプラチン（ｃａｒ）２５ｍｇを、０．９％ＮａＣｌ１０ｍｌに懸濁させて、２．５ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。この溶液を原液として使用し、室温で保存した。物質を、溶液の添加時に１～５分間振とうして、均質な溶液を得た。原液をさらに希釈し、１００μｌ中８ｍｇ／ｋｇ／マウスを使用した。

細胞生存率－ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死アッセイ
中皮腫細胞を、９６ウェルプレート上に１ウェル当たり１．０×１０⁴個の細胞で播種した。終夜インキュベーションした後、細胞に、ウイルス粒子／細胞比１０（ＶＰ／細胞）のＯＮＣＯＳ－１０２を感染させた。ウイルス及び化学療法剤を、５％ＦＢＳを含有する培地で希釈した。ペメトレキセド、シスプラチン及びカルボプラチンを、それぞれ以下の予め選択された準最適濃度、０．６２５ｍｇ／ｍｌ、０．００２６ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ（Ｈ２２６細胞）、０．６２５ｍｇ／ｍｌ、０．０００６ｍｇ／ｍｌ、０．００１９６ｍｇ／ｍｌ（Ｊｌ－１細胞）、０．０８３ｍｇ／ｍｌ、０．００２６ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ（ＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞）で試験した。以下の８つの異なる治療の組合せを評価した。ＯＮＣＯＳ－１０２単独、ペメトレキセド＋シスプラチン、ペメトレキセド＋カルボプラチン、ＯＮＣＯＳ－１０２＋ペメトレキセド＋シスプラチン、ＯＮＣＯＳ－１０２＋ペメトレキセド＋カルボプラチン、ＯＮＣＯＳ－１０２＋ペメトレキセド＋シスプラチン（プライミング：最初にウイルスを投与し、感染の２４時間後に化学療法を添加した）、ＯＮＣＯＳ－１０２＋ペメトレキセド＋カルボプラチン（プライミング：最初にウイルスを投与し、感染の２４時間後に化学療法を添加した）及びｍｏｃｋ（増殖培地だけ）。細胞生存率を、製造者の使用説明書（Ｇ３５８２、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、ＭＴＳによって３日後に決定した。

アポトーシス細胞及び壊死細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
中皮腫細胞を、６ウェルプレート上に５×１０⁵個の細胞／ウェルで播種した。細胞に、１０ＶＰ／細胞のＯＮＣＯＳ－１０２を感染させ、前述の治療スキームに従って化学療法剤を補充した。アポトーシス細胞及び壊死細胞の量を、ＴＡＣＳアネキシンＶ－ＦＩＴＣキットを用いて、フローサイトメーター（４８３０－０１－Ｋ、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ Ｉｎｃ．）によって、製造者の使用説明書に従って４８時間後に測定した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞死の免疫原性
ＣＲＴ曝露。細胞株を、６ウェルプレート上に５×１０⁵個の細胞／ウェルにより２組で播種した。細胞に、１０ＶＰ／細胞のＯＮＣＯＳ－１０２を感染させ、かつ／又は先に提示の治療の組合せによる化学療法剤を加えた。２４時間後（Ｈ２２６、Ｊｌ－１）及び４８時間後（ＭＳＴＯ－２１１Ｈ）、細胞を回収し、４℃において４０分間にわたって、１：１０００希釈したウサギポリクローナル抗カルレティキュリン抗体（ａｂ２９０７、Ａｂｃａｍ）で染色し、その後、１：１００希釈したＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（Ａ２１２０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。

ＨＭＧＢ－１放出。細胞株を、細胞培養プレート上に３組で播種し、１０ＶＰ／細胞のＯＮＣＯＳ－１０２を感染させ、かつ／又は先に提示の治療の組合せによる化学療法剤を加えた。７２時間後、上清を収集し、Ｅｌｉｓａキットを用いて製造者の使用説明書（ＳＴ５１０１１、ＩＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に従ってＨＭＧＢ－１を測定した。
ＡＴＰ放出。細胞株を、細胞培養プレート上に３組で播種し、前述の通り治療した。上清を、４８時間後（Ｊｌ－１、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ）及び７２時間後（Ｈ２２６）に収集し、発光分析のために、ＡＴＰ決定キットを用いて製造者のプロトコール（Ａ２２０６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って分析した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス感染力－免疫細胞化学アッセイ（ＩＣＣ）
中皮腫細胞株を、２４ウェルプレート上に６×１０⁵個の細胞／ウェルにおいて５組で播種し、前述の８つの異なる治療の組合せを用いて治療した。２４時間後、上清を吸引し、細胞を、氷冷メタノール（３２２４１５－１００ＭＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて１５分間インキュベーションすることによって固定した。ＯＮＣＯＳ－１０２の感染力の決定は、感染細胞内のウイルスヘキソンタンパク質を視覚的に定量することに基づいて行った。簡潔には、細胞を、１：２０００希釈したマウス抗ヘキソン抗体（ＮＢ６００－４１３、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で、暗室中でＲＴにおいて１時間にわたって染色し、その後、１：５００希釈したビオチン－ＳＰ－コンジュゲート二次抗体（１１５－０６５－０６２、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で、暗室中でＲＴにおいて１時間にわたって染色した。その後、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ペルオキシダーゼ（Ｅ２８８６－１ＭＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：２００で添加し、暗室中でＲＴにおいて３０分間にわたってインキュベートした。最後に、感染細胞を、最長５分間、染料：ＤＡＢ（Ｄ３９３９－１ＳＥＴ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することによって可視化した。５つの複製（ウェル）ごとに、非オーバーラップフィールドの５つの画像を、ＡＭＧ ＥＶＯ ＸＬ顕微鏡を使用して得た。感染力データを、５つのウェルのスポットの平均数として提示する。

中皮腫細胞株におけるＣＡＲ、ＣＤ４６、及びＤＳＧ２の発現
ヒトアデノウイルスは、コクサッキーウイルスＢ及びＡｄ受容体（ＣＡＲ）、ＣＤ４６又はデスモグレイン２（ＤＳＧ－２）に結合すると細胞に感染する。中皮腫細胞を、４℃で４０分間にわたってマウスモノクローナル抗ＣＡＲ抗体（１μｇ／１×１０⁶個の細胞）（ｓｃ－５６８９２ ＦＩＴＣ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、又は４℃で４０分間にわたってマウスモノクローナル抗ＣＤ４６抗体（１μｇ／１×１０⁶個の細胞）（ａｂ７８９、Ａｂｃａｍ）もしくはマウスモノクローナル抗ＤＳＧ２抗体（１μｇ／１×１０⁶個の細胞）（ａｂ１４４１５、Ａｂｃａｍ）で標識し、その後、フローサイトメトリー測定のために、１：２０００希釈したＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（ａ２１２０６、Ａｂｃａｍ）で標識した。

用量レベル及び経路の正当化
導入遺伝子ＧＭ－ＣＳＦの免疫調節機能は、ＯＮＣＯＳ－１０２の中心的作用機序である。さらに、アデノウイルス自体は、先天的免疫系の強力な活性化因子である。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは免疫不全であり、したがって、ウイルスの複製依存性腫瘍溶解機能だけを研究することができ、それによって、主な作用機序（免疫媒介効果）は喪失されている。２Ｅ＋８／マウス及び１Ｅ＋８／マウスの用量を試験した２つのパイロット研究の結果に基づいて（図５及び６）、５Ｅ＋７ＶＰ／腫瘍ｉ．ｔ．（１Ｅ＋８ＶＰ／マウス）の用量を選択した。ＯＮＣＯＳ－１０２及び化学療法の潜在的に相加的／相乗的な組合せの効果を評価できるように、準最適ウイルス用量（＝根治的ではない）を選択した。注射経路は、臨床治験で使用される経路、すなわち腫瘍内に基づいて選択した。
化学療法剤の用量及び投与経路は、技術的な実現可能性に基づいて選択した。

動物の選択、無作為化、群割当て、飼育、食餌及び水、ならびに順応
動物を、複数群に無作為に分類した。動物群を、別々のケージに飼い、それらのケージに研究カードを取り付けた。カードには、研究番号、治療群、個々の動物のＩＤ、ならびにそれらの起源及び到着日を記した。各ケージの個々の動物には、識別のために耳介穿孔で目印を付した。ケージ間で動物が混合することを回避するために、１度に１つのケージだけを取り扱った。
動物を、バイオセーフティーレベル２（ＢＳＬ２）の施設において湿度及び温度モニタリング環境で飼育した。動物を、フィルタの蓋を備えた、個々に換気されたプラスチックケージ（ＧｒｅｅｎＬｉｎｅ、Ｓｃａｎｂｕｒ）で飼育した。
動物は、提供された標準ペレット食を自由に摂取した。水は、順応及び研究期間中、自由に供給された。
動物を７日間順応させた後、実験パートを開始した。すべての動物が、順応期間中ずっと良好な健康を維持した。

臨床的観測
すべての動物を、順応及び投与期間中、さらに各治療の６０分後に、臨床徴候、罹患率及び死亡率について毎日観察した。実験過程では、腫瘍寸法が許容される最大値に達したことにより（任意直径で１．５ｃｍ）、マウスを死亡させた。動物の健康について毎日追跡し、腫瘍に起因する異常感を示していないことを調べた。６３日目に二酸化炭素を用いてマウスを死亡させ、それを実験のエンドポイントにした。さらに、頸椎脱臼を行った。

動物の体重を、実験中ずっと追跡し、以下の群でわずかな体重減少が観測された。ｐｅｍ＋ｃｉｓ（４８日目で１０％減少、６０日目で１１％減少）、ＯＮＣＯＳ－１０２プライミング＋ｐｅｍ＋ｃｉｓ（４８日目で９％減少、６０日目で１２％減少）（図５Ｂ）、ｐｅｍ＋ｃａｒ（６０日目で６％減少）（図６Ｂ）。ＯＮＣＯＳ－１０２単独、又はペメトレキセド及びシスプラチン（単剤の場合）と組み合わせて治療した群では、健康問題（＞３０％の体重減少及び皮膚問題（＝発疹）に起因して、数匹の動物を屠殺した。これらの有害事象は、２匹のｍｏｃｋ治療動物も皮膚問題（発疹）に罹患していたので、治療に関係する可能性は低かった。獣医には、さらなる調査のためにこれらの問題が通知されたが、これらの事象の原因は不明のままであった。さらに、剖検では、数匹の動物において（ｐｅｍ＋ｃｉｓ、ｐｅｍ＋ｃａｒ）、腸（空腸及び回腸）及び胃のいくらかの形態変化が示された。
腫瘍サイズ進行の分析
腫瘍サイズを、細胞注射の８日後に開始して測定し、記録した。治療の初日及び腫瘍サイズ測定の初日を、図４Ａでは０日目と示している。腫瘍を、３日ごとに測定した。
最大直径及び最小直径を記録し、腫瘍体積を、０．５２×長さ×（幅）²の式を使用して算出した。腫瘍サイズ進行を、１００％と任意に設定した０日目の最初の測定点の百分率として示した。
データ編集及び統計分析
体重を、全実験を通して３日ごとに測定した。ベースラインからの体重変化百分率を、動物ごとに算出した。

腫瘍体積（表２）：絶対的腫瘍体積を、腫瘍体積分析のエンドポイントにした。腫瘍体積を、２１日目及び４８日目に別個に評価した。マウスごとに２個の腫瘍を測定したので、腫瘍体積の分析方法として、反復測定の分散分析を適用した。モデルは、固定効果としての共変数として、群効果及びベースライン値を含有していた。群間のペアワイズ比較を、テューキー法で調整した。相乗作用の算出を、ＦＴＶ（腫瘍体積分率）法を使用することによって行った。
時点選択の理論的根拠：２１日目は、すべての動物がまだ生存していた最終日であり、４８日目には、１群当たり動物１匹以下が死亡していた。

ヒト中皮腫異種移植モデル
動物実験は、ヘルシンキ大学の実験動物学会及び南フィンランド州の州政府によって承認された。６～８週齢のマウスを、Ｓｃａｎｂｕｒ（Ｋａｒｌｓｌｕｎｄｅ、デンマーク）から得、実験開始前に１週間隔離した。マウスを、イソフルランＦｏｒａｎｅ（Ｂａｘｔｅｒ）で麻酔し、５０μｌ中ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞を両方の側腹部に注射した（６Ｅ＋０６／側腹部）。腫瘍を８日間成長させた後、治療した。ウイルスを、６日ごとに投与した。１つの群には、ＯＮＣＯＳ－１０２だけを投与し、２つの群には、ＯＮＣＯＳ－１０２及び化学療法（ペメトレキセド＋シスプラチン、又はペメトレキセド＋カルボプラチン）を６日ごとに投与したが、他の２つの群には、ＯＮＣＯＳ－１０２プライミングを投与した後、化学療法（ペメトレキセド＋シスプラチン、又はペメトレキセド＋カルボプラチン）及びＯＮＣＯＳ－１０２の併用治療を、３日間周期で交代に投与した。ｍｏｃｋ動物は、０．９％生理食塩水で治療した。ＯＮＣＯＳ－１０２を、０．９％生理食塩水で希釈し、腫瘍１個当たり５×１０⁷ＶＰの用量で腫瘍内注射した（動物１匹当たり２個の腫瘍）。注射は、腫瘍中に均一に分布するように、扇型パターンで行った。ペメトレキセド、シスプラチン、及びカルボプラチンを、０．９％ＮａＣｌで希釈し、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、及び８ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。注射体積は、化学療法剤１種当たり１００μｌであった。

腫瘍サイズを、治療の初日に開始して、３日ごとに２つの寸法をノギスで測定した。最大直径及び最小直径を記録し、腫瘍体積を、０．５２×長さ×（幅）²の式を使用して算出した。腫瘍サイズ進行を、１００％と任意に設定した０日目の最初の測定点の百分率として示した（図４Ａ）。すべての動物を、順応及び投与期間中、さらに各治療の３０分後に、臨床徴候、罹患率又は死亡率について毎日観察した。実験過程中、腫瘍寸法が許容される最大（１．５ｃｍ）直径に達したら、マウスを死亡させた。

ヒトＧＭ－ＣＳＦのＥＬＩＳＡ
収集したＢＡＬＢ／ｃヌード組織試料（腫瘍及び肝臓）から、製造者の使用説明書に従って、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ－２７１４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した組織抽出試薬Ｉ（ＦＮＮ００７１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全タンパク質を抽出した。タンパク質抽出物及び予め収集した血清を、製造者の使用説明書に従って、ＥＬＩＳＡ（ａｂ１００５２９、Ａｂｃａｍ）を使用してヒトＧＭ－ＣＳＦ濃度について分析した。

定量的リアルタイムＰＣＲ
アデノウイルスＥ４コピー数のためのｑＰＣＲを、既に記載されているプロトコールに従って行った（ＦＷプライマー：５’－ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＧＡ ＧＡＣ ＡＡＣ－３’、ＲＶプライマー：５’－ＡＣＴ ＡＣＧ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＣＡ Ｔ－３’、プローブＥ４：５’－（６ＦＡＭ）－ＴＧＧ ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＣＴ ＡＣＧ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＡＴＣ Ｔ－（ＴＡＭＲＡ）－３’）（Koski et al. 2010）。全ＤＮＡを、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス試料（腫瘍、肝臓、血液）から、ＱＩＡａ
ｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキット（５１１０６、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者のプロトコールに従って抽出した。その後、単離したＤＮＡを、アデノウイルスＥ４コピー数について分析し、それをそれぞれマウスベータ－アクチン（肝臓、血液）及びヒトベータ－アクチン（腫瘍）に対して正規化した（ＦＷプライマー：５’－ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＴＧ Ｃ－３’、ＲＶプライマー：５’－ＴＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＣＣ ＡＴ－３’、プローブマウスベータ－アクチン：５’－（６ＦＡＭ）－ＡＧＧ ＣＴＣ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＧＧ－（ＴＡＭＲＡ）－３’；（ＦＷプライマー：５’－ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＡＧ－３’、ＲＶプライマー：５’－ＣＴＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＴＴ ＧＣＧ ＧＴＧ ＧＡＣ－３’、プローブヒトベータ－アクチン：５’－（６ＦＡＭ）－ ＡＧＧ ＡＧＴ ＡＴＧ ＡＣＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＣＣＴ Ｃ－（ＴＡＭＲＡ）－３’）。試料を、ＬｉｇｈＣｙｃｌｅｒ ｑＰＣＲ機器（ＬｉｇｈＣｙｃｌｅｒ ４８０、Ｒｏｃｈｅ）を使用して分析した。
統計分析
統計的有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、テューキーの多重比較試験及びノンパラメトリックマン－ホイットニー試験を用いて分析した。生存曲線及び統計分析を、カプラン－マイヤー試験を使用して実施した。すべての統計分析、算出及び試験を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国、サンディエゴ）を使用して実施した。結果を、平均±ＳＥＭとして表す。すべてのｐ値は、両側又は片側であり、≦０．０５の場合に統計的に有意とみなした。

（例１）
中皮腫に対する第一選択の化学療法と組み合わせたＯＮＣＯＳ－１０２のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗悪性腫瘍活性の改善
ＯＮＣＯＳ－１０２の腫瘍溶解的効力を、３種の中皮腫細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した（図１Ａ）。ＪＬ－１（類上皮中皮腫）、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ（悪性二相型）及びＨ２２６（上皮形態）細胞は、１０ＶＰ／細胞（準最適用量）によって３日間でそれぞれ細胞の１８％、２４％及び１１％が死滅したので、腫瘍溶解に対して相対的に抵抗性を示すように見えた。ＪＬ－１及びＨ２２６細胞株は、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞（ペメトレキセド＋シスプラチン又はペメトレキセド＋カルボプラチン）と比較して、化学療法媒介性の細胞傷害性に対する抵抗性が高かった。化学療法剤を用いるインキュベーションにより、ＪＬ－１の１０％及びＨ２２６細胞の１１～１２％だけが３日間で死滅した。それとは対照的に、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞の６３％及び７３％が、それぞれペメトレキセド＋シスプラチン及びペメトレキセド＋カルボプラチンとの共培養により３日目までに死滅した。単剤治療（ウイルス又は化学療法）で観測された結果と比較して、ＯＮＣＯＳ－１０２と化学療法剤の組合せは、Ｈ２２６及びＪＬ－１細胞において細胞傷害性を著しく増大した。しかし、化学療法をＯＮＣＯＳ－１０２と組み合わせると、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞では細胞傷害性の増大は見られなかった。一般に、Ｈ２２６及びＪＬ－１細胞は、特に化学療法に対して感受性があるＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞よりも、腫瘍溶解（ＯＮＣＯＳ－１０２単独）、及び化学療法剤の細胞傷害効果の両方に対して抵抗性が高かった。

細胞生存率の結果と一致して、アポトーシスＨ２２６及びＪＬ－１細胞の数は、あらゆる治療群において一般に少なかったが、併用治療では、単剤療法と比較してアポトーシス細胞の数がわずかに増大した。Ｈ２２６及びＪＬ－１細胞とは対照的に、アポトーシスＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞の数は、化学療法単独及び化学療法＋ＯＮＣＯＳ－１０２で治療された細胞において著しく高かった（図１Ｂ）。

（例２）
ＯＮＣＯＳ－１０２及び化学療法の組合せは、中皮腫細胞株において免疫原性細胞死及びウイルス複製を増強する
免疫原性細胞死マーカー、例えば細胞表面へのカルレティキュリンＡの曝露、ならびにＡＴＰ及びＨＭＧＢ１の細胞外放出を、ＯＮＣＯＳ－１０２、化学療法剤、又はその両方の組合せに曝露した後に、中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｏｌｉｍａ）細胞培養物から測定した（図２）。ＯＮＣＯＳ－１０２＋化学療法の群において最も多いＣＲＴ曝露量、ならびにＡＴＰ及びＨＭＧＢ１の細胞外放出量が測定されたので、ＯＮＣＯＳ－１０２＋化学療法を用いる治療によって、Ｊｌ－１及びＨ２２６中皮腫において最も免疫原性の高い腫瘍細胞死が誘導された。次に、ＯＮＣＯＳ－１０２及び化学療法の同時適用は、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞における化学療法単独と同等の免疫原性があったが、このことは、細胞生存率アッセイによる観測と一致しており、化学療法に対するこれらの細胞の高い感受性が確認される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯＮＣＯＳ－１０２複製に対する化学療法の影響も評価した。ＯＮＣＯＳ－１０２を感染させ、化学療法剤（ペメトレキセド＋シスプラチン又はペメトレキセド＋カルボプラチン）で予め治療（プライミング）したＨ２２６及びＪｌ－１細胞は、感染細胞の数が対照細胞よりも著しく増大することを示した（ｐ＜０．００１対ＯＮＣＯＳ－１０２）（図３Ｃ）。他方では、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞を化学療法で予め治療しても、感染細胞の数は増大しなかった。それとは対照的に、化学療法をＯＮＣＯＳ－１０２と同時に３種の中皮腫細胞株に行うと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス複製が阻害又は制限される。

（例３）
ＯＮＣＯＳ－１０２は、中皮腫細胞に対する高い指向性を示す
ＯＮＣＯＳ－１０２は、線維ノブ５が、血清型ノブ３ドメインによって置き換えられている、キメラ腫瘍溶解性アデノウイルスである。ＣＤ４６、ＤＳＧ２（Ａｄ３）、及びＣＡＲ（Ａｄ５）受容体に対する陽性細胞をスクリーニングした（図３Ｂ）。ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、Ｈ２２６及びＪＬ－１は、それらの表面上に、高レベルのＣＤ４６（それぞれ９８％、９６％及び９８％）、ＤＳＧ２（それぞれ９５％、７％及び６４％）を発現した。
ＣＡＲ受容体は、３種の中皮腫のうちＨ２２６（８８％）及びＪｌ－１（１５％）の２種によって発現された。

（例４）
ペメトレキセド及びシスプラチン、又はペメトレキセド及びカルボプラチンと組み合わせたＯＮＣＯＳ－１０２は、ヒト異種移植中皮腫モデルのＭＭに対して改善された抗悪性腫瘍有効性を示した
次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＯＮＣＯＳ－１０２及びペメトレキセド及びシスプラチン、又はペメトレキセド及びカルボプラチンの相乗作用が観測されたことを考慮して、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルでも抗腫瘍活性が増強されるかどうかを評価した。したがって、ヒト中皮腫Ｈ２２６細胞株を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下移植し、腫瘍を、表１に提示した治療レジメンに従って治療した。

腫瘍成長（体積）を、示された時点で算出し、時間関数として記録した（図４Ａ）。Ｈ２２６中皮腫異種移植腫瘍は、治療のいずれもが腫瘍成長を著しく低減しなかったので、標準化学療法剤（ペメトレキセド＋シスプラチン、ペメトレキセド＋カルボプラチン）に対して難治性であるように見えた。化学療法単独は、使用した準最適用量に部分的に起因して、中皮腫に対して最も非効率的な治療様式であった。ＯＮＣＯＳ－１０２＋ペメトレキセド＋シスプラチンで治療した動物１匹は、２１日目までには完全な腫瘍退行（両方の腫瘍）を示した。さらに、ＯＮＣＯＳ－１０２プライミング＋ペメトレキセド＋シスプラチンで治療した動物１匹は、４５日目までには両方の腫瘍の完全な退行を示した。ＯＮＣＯＳ－１０２単独は、腫瘍成長をある程度調節することができた（４８日目でｐ＝０．０７４のｍｏｃｋ対ＯＮＣＯＳ－１０２）。胸膜中皮腫に対して最も有効な治療様式は、ＯＮＣＯＳ－１０２でプライミングしたペメトレキセド及びシスプラチンを用いたものであった（この治療は、６０日目で初期腫瘍サイズの９７％を示したのに対して、４７３％（ｍｏｃｋ）、５６３％（ペメトレキセド＋シスプラチン）及び６７２％（ペメトレキセド及びカルボプラチン）であった。さらに、すべての併用レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔｓ）（ＯＮＣＯＳ－１０２＋化学療法）において、本発明者らは、特に化学療法単独、ウイルス単独及びｍｏｃｋと比較して、最も著しい抗悪性腫瘍活性を観測した（６０日目で初期腫瘍サイズの９７％（ウイルスプライミング＋ペメトレキセド＋シスプラチン）、１３８％（ウイルス＋ペメトレキセド＋シスプラチン）、１５１％（ウイルスプライミング＋ペメトレキセド＋カルボプラチン）及び１６３％（ウイルス＋ペメトレキセド＋カルボプラチン）に対して、２０６％（ウイルス単独）、４７３％（ｍｏｃｋ）、５６３％（ペメトレキセド＋シスプラチン）及び６７２％（ペメトレキセド＋シスプラチン））。ＯＮＣＯＳ－１０２及び化学療法剤は、試験したすべての組合せにおいて、４８日目で強力な相乗的抗腫瘍効果を示した（Ｒ＝２．１９のＯＮＣＯＳ－１０２＋ペメトレキセド＋シスプラチン；Ｒ＝１．７のＯＮＣＯＳ－１０２＋ペメトレキセド＋カルボプラチン；Ｒ＝２．５のＯＮＣＯＳ－１０２プライミング＋ペメトレキセド＋シスプラチン；Ｒ＝１．４１のＯＮＣＯＳ－１０２プライミング＋ペメトレキセド＋カルボプラチン）。２１日目で、ペメトレキセド＋シスプラチンと組み合わせたＯＮＣＯＳ－１０２は、両方のレジメンに対して相乗効果を示し（Ｒ＝１．８のＯＮＣＯＳ－１０２＋ペメトレキセド＋シスプラチン；Ｒ＝１．３２のＯＮＣＯＳ－１０２プライミング＋ペメトレキセド＋シスプラチン）、一方でペメトレキセド＋カルボプラチンの組合せは、相加効果を示した（併用群についてＲ＝１．０及び０．９３）。

表２は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける中皮腫の、ＯＮＣＯＳ－１０２及びペメトレキセド＋シスプラチン、又はペメトレキセド＋カルボプラチンによる併用治療を開示している。

（例５）
ＯＮＣＯＳ－１０２は、腫瘍組織において限局的に複製し、ヒトＧＭ－ＣＳＦを産生する マウス臓器（腫瘍、肝臓）及び血清におけるアデノウイルスＥ４コピー及びＧＭ－ＣＳＦレベルの定量を、ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡによって行った。ＯＮＣＯＳ－１０２は、腫瘍だけに存在し（限局的に）、ウイルス粒子は、あらゆる試験群で血清又は肝臓において検出されなかった（図４Ｄ）。ＯＮＣＯＳ－１０２は、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質を産生し、そのタンパク質は、５つの試験群で腫瘍において最高濃度で検出された（図４Ｃ参照）。

参考文献

ＯＮＣＯＳ－１０２の構築
ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードするキメラ腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＮＣＯＳ－１０２）の構築及び特徴付けは、既に説明されている（国際公開第２０１０／０７２９００号及びKoski et al.）。それから間もなく、アデノウイルスの標準調製技術を使用して、Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭ－ＣＳＦが作製され、増幅された。キメラ５／３線維であるｐＡｄＥａｓｙ５／３を含有するｐＡｄＥａｓｙ－１由来のプラスミドを、大腸菌において、Ａｄ５／３ｌｕｃ１ウイルスゲノム及びｐＡｄＥａｓｙ－１のＢｓｔＸＩ消化８．９ｋｂフラグメントの相同組換えによって作成した。次に、Ｅ１Ａに２４ｂｐ欠失を含有するシャトルベクター（ｐＳｈｕｔｔｌｅＤ２４）を、ＰｍｅＩで線状化し、ｐＡｄＥａｓｙ５／３を用いて組み換えてｐＡｄ５／３－Ｄ２４を得た。ヒトＧＭＣＳＦ遺伝子をＥ３領域に挿入するために、Ａｄ５ゲノム由来のＳｐｅＩからＮｄｅＩのフラグメントをｐＧＥＭ５Ｚｆ+（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）のマルチクローニング部位に挿入することによって、Ｅ３－クローニングベクターｐＴＨＳＮを作成した。さらに、ｐＴＨＳＮを、ＳｕｎＩ／ＭｕｎＩで消化し、Ｅ３領域に９６５ｂｐ欠失（６．７Ｋ及びｇｐ１９Ｋが欠失）を作成した。ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする４３２ｂｐ相補的ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）を、遺伝子にフランキングする特異的制限部位ＳｕｎＩ／ＭｕｎＩを特色とするプライマーで増幅し、次にＳｕｎＩ／ＭｕｎＩ消化ｐＴＨＳＮに挿入した。ｐＡｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭ－ＣＳＦを、大腸菌において、ＦｓｐＩ線状化ｐＴＨＳＮ－ＧＭＣＳＦとＳｒｆＩ線状化ｐＡｄ５／３－Ｄ２４を相同的に組み換えることによって作製した。Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭ－ＣＳＦウイルスゲノムを、ＰａｃＩで消化し、増幅及びレスキューのためにＡ５４９細胞にトランスフェクトすることによって放出させた。すべてのクローニング相を、ＰＣＲ及び多重階制限消化により確認した。シャトルプラスミドｐＴＨＳＮ－ＧＭ－ＣＳＦを、配列決定した。野生型Ｅ１が存在しないことを、ＰＣＲを用いて確認した。Ｅ１領域、導入遺伝子、及び線維を、最終ウイルスにおいて、配列決定及びＰＣＲを用いてチェックした。Ａ５４９細胞に対して、Ｏｎｃｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（フィンランド、ヘルシンキ）によるｃＧＭＰの原理に従ってウイルス産生を行って、野生型組換えの危険性を回避した。ウイルス原液の緩衝液製剤は、１０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｚｍａ塩基、７５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５％（質量／体積）スクロース、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ（＋）ヒスチジン、０．５％（体積／体積）ＥｔＯＨ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ、１００μｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡであり、０．９％（質量／体積）ＮａＣｌ溶液（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、ドイツ、メルズンゲン）を希釈剤として使用した。ＯＮＣＯＳ－１０２は、ＧＬＰのＢｉｏｖｉａｎ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）によって産生されたものであり、使用まで－８０℃で保存した。ＯＮＣＯＳ－１０２を、使用するために適用直前に解凍し、使用まで氷上で保存した。ＯＮＣＯＳ－１０２を、解凍した後に層流ボックス内で希釈して、必要な濃度を得、注射シリンジを調製し、使用まで氷上で保存した。

Claims (25)

1. ヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスであって、２種の化学療法剤と組み合わせて患者に投与される、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
2. ２種の化学療法剤が、ペメトレキセド及びシスプラチンであるか、又はペメトレキセド及びカルボプラチンであるかのいずれかである、請求項１に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
3. ペメトレキセド及びシスプラチンのモル比が、１０：０．７５～１０：３である、請求項２に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
4. ペメトレキセド及びシスプラチンのモル比が、１０：１．５である、請求項３に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
5. ペメトレキセド及びカルボプラチンのモル比が、５：８～５：２である、請求項２に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
6. ペメトレキセド及びカルボプラチンのモル比が、５：４である、請求項５に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
7. ウイルスの量が、５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰである、請求項１～６のいずれか１項に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
8. ３×１０¹¹ＶＰ／５ｍｌの量で投与される、請求項７に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
9. 前記化学療法剤及び前記ウイルスが、有効量で投与される、請求項１～８のいずれか１項に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
10. 前記ウイルスが、腹腔内により、又は腫瘍への直接注射によって投与され、２種の化学療法剤が、静脈内又は腹腔内投与される、請求項１～９のいずれか１項に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
11. ２種の化学療法剤の投与前に投与され、前記化学療法剤の投与期間中にも投与される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
12. ２種の化学療法剤が、前記ウイルスが投与される前に投与され、前記ウイルスの投与期間中にも投与される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のヒト悪性中皮腫の治療において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
13. 患者の悪性中皮腫を治療する方法であって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を前記患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
14. 前記ウイルス及び前記化学療法剤が、有効量で投与される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記化学療法剤が、ペメトレキセド及びシスプラチンであるか、又はペメトレキセド及びカルボプラチンであるかのいずれかである、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 前記化学療法剤が、前記ウイルスの投与期間の開始前に最初に投与され、前記ウイルスの投与期間中にも投与される、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記ウイルスが、前記化学療法剤の投与期間の開始前に最初に投与され、前記化学療法剤の投与期間中にも投与される、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
18. ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスが、前記患者に１回～１０回投与され、前記化学療法剤が、前記患者に１回～６回投与される、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. ＯＮＣＯＳ－１０２の前記投与が、１０⁸～１０¹²個のプラーク形成単位の用量で、前記患者の悪性中皮腫の腫瘍への直接注射によって、又は腹腔内注射として行われる、請求項１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 投与されるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの量が、５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰの範囲である、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２種の化学療法剤を患者に投与する工程の前に、シクロホスファミドを投与する工程をさらに含む、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 葉酸を患者に投与する工程をさらに含む、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. シアノコバラミンを患者に投与する工程をさらに含む、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. デキサメタゾンを患者に投与する工程をさらに含む、請求項１３～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. ヒト悪性中皮腫の治療におけるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの使用であって、前記ウイルスが、２種の化学療法剤と組み合わせて患者に投与されることを特徴とする使用。

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