RU2720984C2 - Терапевтические композиции и способы применения для лечения рака - Google Patents
Терапевтические композиции и способы применения для лечения рака Download PDFInfo
- Publication number
- RU2720984C2 RU2720984C2 RU2017134519A RU2017134519A RU2720984C2 RU 2720984 C2 RU2720984 C2 RU 2720984C2 RU 2017134519 A RU2017134519 A RU 2017134519A RU 2017134519 A RU2017134519 A RU 2017134519A RU 2720984 C2 RU2720984 C2 RU 2720984C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- cancer
- virus
- tumor
- alpha
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 281
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 67
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 28
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 9
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 claims abstract description 95
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 237
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 141
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 31
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 30
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 28
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 27
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 19
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 18
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 17
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 7
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 7
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 125000000625 hexosyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 claims description 4
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003076 Angiosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001258 Hemangiosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010133 Oligodendroglioma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001611 myxosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 93
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 86
- 125000003169 alpha-Gal epitope group Chemical group [C@H]1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](O[C@@H]([C@@H]1O)CO)O[C@H]1[C@@H]([C@H](C(O[C@@H]1CO)*)NC(C)=O)O)O 0.000 description 70
- FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N diazinon Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC(C)=NC(C(C)C)=N1 FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 59
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 51
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 28
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 25
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 25
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 24
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 21
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 15
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 11
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 9
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 9
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 9
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 8
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 8
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 6
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- ODDPRQJTYDIWJU-UHFFFAOYSA-N 3'-beta-D-galactopyranosyl-lactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)OC(CO)C1O ODDPRQJTYDIWJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 5
- 101100508081 Human herpesvirus 1 (strain 17) ICP34.5 gene Proteins 0.000 description 5
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 5
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 5
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 5
- 101150027249 RL1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 3
- 108010035601 Coxsackie and Adenovirus Receptor Like Membrane Protein Proteins 0.000 description 3
- 102000008198 Coxsackie and Adenovirus Receptor Like Membrane Protein Human genes 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 3
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000219774 Griffonia Species 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 208000009147 Jaw Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 108010044715 asialofetuin Proteins 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010051747 multiple endocrine neoplasia Diseases 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 206010060999 Benign neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000288950 Callithrix jacchus Species 0.000 description 2
- 208000016623 Choroid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 2
- 101000856513 Homo sapiens Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101100195053 Human herpesvirus 1 (strain 17) RIR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100025509 Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 2
- 208000013625 Nelson syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000005890 Neuroma Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 208000009095 Orbital Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 210000000860 cochlear nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002357 laparoscopic surgery Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 2
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 208000025303 orbit neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000010918 peritoneal neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010055837 phosphocarrier protein HPr Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 2
- GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039358 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Human genes 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 6S-folinic acid Natural products C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XGWFJBFNAQHLEF-UHFFFAOYSA-N 9-anthroic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=C(C=CC=C3)C3=CC2=C1 XGWFJBFNAQHLEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006678 Abdominal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 208000009888 Adrenocortical Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 241001545522 Aguacate virus Species 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000023514 Barrett esophagus Diseases 0.000 description 1
- 208000023665 Barrett oesophagus Diseases 0.000 description 1
- 206010005056 Bladder neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000008720 Bone Marrow Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 101710091342 Chemotactic peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000015612 Complement 3b Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010024114 Complement 3b Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000022523 Conjunctival Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 229940123780 DNA topoisomerase I inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 206010070179 Denys-Drash syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010061825 Duodenal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 208000009129 Ear Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000027666 Endometrial Stromal Tumors Diseases 0.000 description 1
- 208000005431 Endometrioid Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000009849 Female Genital Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000009317 Femoral Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000321 Gardner Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000219726 Griffonia simplicifolia Species 0.000 description 1
- 108010016101 Griffonia simplicifolia lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000696272 Gull adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000702620 H-1 parvovirus Species 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010019629 Hepatic adenoma Diseases 0.000 description 1
- HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N His-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- 101001035740 Homo sapiens 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000633780 Homo sapiens Signaling lymphocytic activation molecule Proteins 0.000 description 1
- 241000193096 Human adenovirus B3 Species 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010056305 Hypopharyngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010057412 Iris neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000009164 Islet Cell Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 208000002404 Liver Cell Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 208000006395 Meigs Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010070665 Mesoblastic nephroma Diseases 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000002231 Muscle Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 208000008846 Neurocytoma Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 208000010505 Nose Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000004179 Oral Leukoplakia Diseases 0.000 description 1
- 241000283283 Orcinus orca Species 0.000 description 1
- 241000283868 Oryx Species 0.000 description 1
- 208000003178 Otorhinolaryngologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 208000000863 Palatal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061332 Paraganglion neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000657 Paraneoplastic Endocrine Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061336 Pelvic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 208000007641 Pinealoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000011185 Polyneuropathy in malignant disease Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 208000007500 Pulmonary Sclerosing Hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 201000008183 Pulmonary blastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000004680 Rectal Fistula Diseases 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 208000016624 Retinal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000021906 Retroperitoneal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 208000009125 Sigmoid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000008115 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010074687 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010068771 Soft tissue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 208000000133 Spinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000000573 Supratentorial Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000025194 Sweat Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 1
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000000728 Thymus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000000365 Topoisomerase I Inhibitor Substances 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150085955 US11 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000023915 Ureteral Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000008385 Urogenital Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000009311 VIPoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000007960 WAGR syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011358 absorbing material Substances 0.000 description 1
- 206010059394 acanthoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 208000015234 adrenal cortex adenoma Diseases 0.000 description 1
- 208000020990 adrenal cortex carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000003354 adrenal cortical adenoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000007128 adrenocortical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002156 anal fistula Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 206010006007 bone sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 201000010983 breast ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 208000003362 bronchogenic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013276 bronchoscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000002052 colonoscopy Methods 0.000 description 1
- 210000001953 common bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 208000017903 conjunctival tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002574 cystoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000000330 endometrial stromal sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000028730 endometrioid adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029179 endometrioid stromal sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N folinic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- 235000008191 folinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011672 folinic acid Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical class O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 201000008361 ganglioneuroma Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 201000002735 hepatocellular adenoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 102000046537 human SLAMF1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 208000022013 kidney Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 229960001691 leucovorin Drugs 0.000 description 1
- 210000003715 limbic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 208000020141 lung sclerosing hemangioma Diseases 0.000 description 1
- RVFGKBWWUQOIOU-NDEPHWFRSA-N lurtotecan Chemical compound O=C([C@]1(O)CC)OCC(C(N2CC3=4)=O)=C1C=C2C3=NC1=CC=2OCCOC=2C=C1C=4CN1CCN(C)CC1 RVFGKBWWUQOIOU-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004086 maxillary sinus Anatomy 0.000 description 1
- 101150024228 mdm2 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001370 mediastinum Anatomy 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003550 mucous cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036473 myasthenia Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 239000006218 nasal suppository Substances 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- 208000025437 neoplasm of hypopharynx Diseases 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 208000002761 neurofibromatosis 2 Diseases 0.000 description 1
- 208000022032 neurofibromatosis type 2 Diseases 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 208000008511 optic nerve glioma Diseases 0.000 description 1
- 201000008557 oral mucosa leukoplakia Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 201000002530 pancreatic endocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 230000000803 paradoxical effect Effects 0.000 description 1
- 208000007312 paraganglioma Diseases 0.000 description 1
- 210000003695 paranasal sinus Anatomy 0.000 description 1
- 201000005989 paraneoplastic polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000012111 paraneoplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 208000023974 pharynx neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010035059 pineocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 description 1
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 201000005825 prostate adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 201000010383 sebaceous gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 208000015093 skull base neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000021865 skull neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 208000024363 trachea neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000003744 tubulin modulator Substances 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 208000025421 tumor of uterus Diseases 0.000 description 1
- 208000024722 urethra neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 208000013139 vaginal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
- PNVNVHUZROJLTJ-UHFFFAOYSA-N venlafaxine Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(CN(C)C)C1(O)CCCCC1 PNVNVHUZROJLTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/761—Adenovirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0031—Rectum, anus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0043—Nose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01087—N-Acetyllactosaminide 3-alpha-galactosyltransferase (2.4.1.87), i.e. alpha-1,3-galactosyltransferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16632—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16671—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01057—Phosphatidylinositol alpha-mannosyltransferase (2.4.1.57)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Описан онколитический вирус, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент гексозилтрансферазу, в котором фермент представляет собой фермент альфа 1,3-галактозилтрансферазу. Также описана фармацевтическая композиция, содержащая описанный онколитический вирус. Также описаны способы лечения индивида с новообразованием или рака, использующие описанный онколитический вирус. Изобретение позволяет лечить новообразования или рак, специфически лизируя опухолевые клетки. 6 н. и 14 з.п. ф-лы, 9 ил., 8 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения рака. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композициям сконструированных онколитических вирусов для введения пациенту, страдающему раком, которые специфически лизируют опухолевые клетки и активно выделяют опухолевые клетки и клеточный детрит для антигенпрезентирующих клеток, с целью создания противоопухолевого иммунитета.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Опухоли могут развиваться у раковых пациентов, поскольку иммунная система не способна выявлять опухолевые клетки как клетки, которые должны быть уничтожены. У большой части раковых пациентов опухолевые клетки экспрессируют аутологичные опухолевые антигены. Эти аутологичные опухолевые антигены, также называемые «неоантигены», могут вызывать защитный противоопухолевый иммунный ответ. Опухолевые клетки, или мембраны опухолевых клеток, подлежат интернализации антигенпрезентирующими клетками с целью индуцирования развития противоопухолевого иммунного ответа. Однако иммунная система у многих раковых пациентов демонстрирует «неосведомленность» в отношении опухолевых антигенов, которые ассоциированы с ранним развитием опухоли «скрытым» путем, так что опухоль является фактически «невидимой» для антигенпрезентирующих клеток (Pardoll, 2000; Clin Immunol. 95:S44-49, и Dunn et al., 2002; Nat Immunol; 3: 991-8).
Кроме того, микроокружение опухоли и местное цитокиновое окружение часто являются подавляющими в отношении иммунной функции и могут активно индуцировать анергию и гибель иммунных клеток (Malmberg, Cancer Immunol Immunother., 53: 879-92; Lugade et al.; J Immunol. 2005; 174: 7516-23 (2004); Schreiber et al., Science (New York, N.Y.), 331(6024), 1565-70 (2011)). Эффективное лечение опухолевых поражений требует два компонента: 1. Деструкцию поражений, которые являются достаточно большими, чтобы выявить их визуально посредством метода лучевой диагностики, и 2. Индуцирование защитного, системного противоопухолевого иммунного ответа против опухолевых антигенов. Такой иммунный ответ будет уничтожать любые не подлежащие лечению поражения (например, поражения, которые могут быть не доступны лечению, не удаляемы посредством операции) и приводит к иммунно опосредованному выявлению, регрессии и/или деструкции микрометастазов, которые не могут быть определены визуально и не определяются посредством методов лучевой диагностики. Часто размер опухоли тормозит эффективность системного противоопухолевого иммунного ответа в установленный срок. В дополнение к использованию активного противоопухолевого иммунитета для уменьшения размера опухоли часто необходимы хирургическое удаление или другие средства, такие как внутриопухолевая инъекция композиций.
В последнее время были разработаны онколитические вирусы, которые пригодны для селективного уничтожения опухолевых клеток посредством литической репликации и тем самым для уменьшения размера опухоли (Liu et al., World J Gastroenterol. 2013 Aug 21; 19(31):5138-43). Пригодные вирусы деактивируют, так чтобы они больше не являлись патогенными, т.е. не реплицировались в неопухолевых клетках и не убивали их, но так чтобы они могли тем не менее проникать и убивать опухолевые клетки. Один иллюстративный вирус, вирус простого герпеса (HSV), был предложен для применения с целью онколитического лечения рака. Был идентифицирован ряд мутаций HSV, которые тем не менее позволяют вирусу реплицироваться в культуре или в активно делящихся клетках in vivo (например, в опухолях), но которые предотвращают значительную репликацию в нормальной ткани.
В дополнение к HSV, для онколитического лечения рака была продемонстрирована перспектива для различных дополнительных вирусов. Комбинированное использование онколитического HSV с доставкой гена, кодирующего иммуномодулирующий белок, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), закодированный в геноме деактивированного вируса, как было продемонстрировано, обладает иммуностимулирующими свойствами против опухоли, подлежащей лечению, в частности после инактивации вирусных функций, которые обычно уменьшают иммунные ответы на HSV. Таким образом, при таком применении мутант онколитического HSV следовало бы инокулировать в первичную или вторичную опухоль, в которой возникала бы репликация и онколитическая деструкция опухоли. Проблема данного подхода состоит в том, что GM-CSF используется для мобилизации антигенпрезентирующих клеток в область поражения, но поглощение опухолевого материала этими клетками после этого является случайным. Антигенпрезентирующие клетки довольно эффективны в поглощении материала в виде небольших частиц и растворимых антигенов, но не работают при интернализированных клетках или более крупных фрагментах клеток.
Индуцирование защитного противоопухолевого иммунного ответа требует поглощения опухолевых клеток и клеточных компонентов антигенпрезентирующими клетками, затем процессинга опухолевых антигенов и их транспортировки антигенпрезентирующими клетками в дренирующие лимфатические узлы. В лимфатических узлах иммуногенные опухолевые антигенные пептиды презентируются антигенпрезентирующими клетками в ассоциации с молекулами МНС класса I или класса II для активации опухолеспецифических CD8+ и CD4+ T-клеток, соответственно. Только после того, как Т-клетки активируются процессированными и презентированными опухолевыми антигенными пептидами, эти лимфоциты пролиферируют, покидают лимфатические узлы и циркулируют в организме для поиска и уничтожения метастатических опухолевых клеток, экспрессирующих рассматриваемые опухолевые антигены. Вследствие этого, получение эффективного противоопухолевого иммунного ответа требует эффективного и активного выделения опухолевых клеток для антигенпрезентирующих клеток.
Вследствие этого, требуются композиции и способы нехирургического уменьшения размера опухоли посредством лизиса клеток и активного выделения опухолевых клеток, клеточного детрита и фрагментов мембран для рекрутинга антигенпрезентирующих клеток и обеспечения иммунного ответа. Также необходимы пути повышения эффективности интернализации антигенпрезентирующими клетками опухолевых клеток и фрагментов клеток в пределах микроокружения опухоли.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с первым аспектом, изобретение относится к онколитическому вирусу, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент гексозилтрансферазу.
В соответствии с дополнительным аспектом изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей онколитический вирус, как определено здесь, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
В соответствии с дополнительным аспектом изобретение относится к способу лечения индивида с новообразованием, который включает стадии:
i) экспрессии эндогенного фермента, доставляемого онколитическим вирусом, как определено здесь, по меньшей мере в одну раковую клетку для модифицирования гликозилирования клеточной мембраны; и
ii) индуцирования лизиса по меньшей мере одной раковой клетки, возникающего в результате введения онколитического вируса.
В соответствии с дополнительным аспектом изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение терапевтически эффективного количества онколитического вируса, как определено здесь, нуждающемуся в лечении пациенту, страдающему раком или имеющему новообразование или опухоль.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГУРА 1: Представляет собой схематическое изображение серии клеточных событий, имеющих отношение к настоящим способам. Эти события включают A) введение сконструированных вирусных композиций, B) инфицирование, репликацию, экспрессию альфа 1,3-галактозилтрансферазы и альфа-gal эпитопов, и C) онколизис и рекрутинг антигенпрезентирующих клеток в область опухоли.
ФИГУРА 2: Представляет собой схематическое изображение опухолевой клетки, инфицированной онколитическим вирусом, содержащим альфа 1,3-галактозилтрансферазу, и экспрессирующей альфа-gal эпитопы на своей клеточной поверхности до лизиса. Альфа-gal-меченные фрагменты мембран интернализированы антигенпрезентирующими клетками. (1) Опухолевые клетки содержат опухолеассоциированные антигены (TAA) в цитоплазме и на клеточной мембране, которые являются уникальными для опухоли и для каждого отдельного пациента. Эти TAА представлены на клеточной мембране в виде (•,,) и в виде белковых молекул внутри клетки (спирали и волнистые линии). Онколитический вирус (заполненные окружности с 11 внешними спицами), введенный в опухолевое поражение, содержит ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы, вставленный в его геном. (2) онколитический вирус, инфицирующий опухолевые клетки, вводит ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы в опухолевые клетки. Этот ген транскрибируется и транслируется внутри инфицированной клетки, приводя к выработке фермента альфа 1,3-галактозилтрансферазы (α1,3GT). Этот фермент синтезирует альфа-gal эпитопы на гликопротеинах, гликолипидах и протеогликанах поверхности клетки. Связывание натуральных анти-Gal антител с этими альфа-gal эпитопами активирует систему комплемента и таким образом генерирует хемотаксические факторы в форме расщепляющих комплемент пептидов, которые мобилизуют антигенпрезентирующие клетки в обрабатываемое опухолевое поражение. (3) Опухолевые клетки лизируются онколитическим вирусом и анти-Gal, связывающимися с альфа-gal эпитопами на клеточных мембранах посредством комплементзависимой цитотоксичности и посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Мертвые клетки и фрагментированные клеточные мембраны, покрытые анти-Gal антителами (которые связаны с альфа-gal эпитопами), интернализированы антигенпрезентирующими клетками (APC) посредством взаимодействия между Fc-фрагментом анти-Gal антитела, покрывающего клетки, или клеточные мембраны, и Fcγ-рецепторами на APC. TAA, интернализированные в результате этого поглощения, процессируются APC, и затем TAА-пептиды презентируются на мембране APC клеток в ассоциации с молекулами MHC. APC мигрируют в дренирующие лимфатические узлы, где презентированные TAА-пептиды связываются с T-клеточными рецепторами опухолеспецифических Т-клеток. В результате данного взаимодействия эти Т-клетки активируются. Активированные опухолеспецифические Т-клетки пролиферируют и покидают лимфатические узлы, чтобы циркулировать, выявлять и уничтожать метастатические опухолевые клетки.
ФИГУРА 3: Представляет собой схематическую хронологию для появления альфа-1,3 галактозилтрансферазы (α1,3GT) и альфа-gal эпитопов в клетках HeLa, трансдуцированных аденовирусом, содержащим ген α1,3GT (AdαGT).
ФИГУРА 4: Представляет собой график, демонстрирующий экспрессию альфа-gal эпитопов на клетках мышиной меланомы B16, трансдуцированных AdαGT, как показано посредством связывания IB4 (BS) лектина (A) Bandeiraea simplicifolia и мышиного анти-Gal IgG (B). A. Экспрессия альфа-gal эпитопов на клетках B16AdαGТ, (т.е. клетках B16, трансдуцированных AdαGT [1×1010 инфекционных единиц (ИЕ)/мл]), как измерено посредством проточной цитометрии клеток, окрашенных BS-лектином. Лектин спарен с флуоресцеином (FITC). Тонкая линейная гистограмма с заполненной точками областью клеток B16Adcont (т.е. клеток меланомы, трансдуцированных аденовирусом, не содержащим вставленные гены); Толстая линейная гистограмма - клетки B16AdαGТ. B. Связывание анти-Gal в сыворотке мыши, нокаутированной по альфа 1,3-галактозилтрансферазе с альфа-gal эпитопами на клетках BL6AdαGТ (), или на клетках B16Adcont (), как определено посредством ELISA. Представлены данные 3 репрезентативных мышей из 6 мышей со сходными результатами.
ФИГУРА 5: Представляет собой график, демонстрирующий защиту нокаутированных по альфа 1,3-галактозилтрансферазе мышей от заражения опухолью B16 с использованием вакцины B16AdαGT. Нокаутированных по альфа 1,3-галактозилтрансферазе мышей, продуцирующих анти-Gal, вакцинировали 2×106 облученных клеток B16, экспрессирующих альфа-gal эпитопы (B16AdαGT)(), или облученных клеток B16, трансдуцированных контрольным аденовирусом (B16Adcont) (). Эту иммунизацию повторили через одну неделю. Через одну неделю мышей заражали 0,2×106 живых клеток B16 (A) или 0,5×106 живых клеток B16 (B). Мышей подвергали ежедневному мониторингу на опухолевый рост в течение 2 месяцев. Результаты представлены в виде процента мышей, остающихся без опухоли в различные дни после заражения опухолью. Представлены результаты 22 мышей в экспериментальной группе и 21 в контрольной группе в (A) и в отдельном эксперименте 21 мышей в экспериментальной группе и 18 в контрольной группе в (B).
ФИГУРА 6: Представляет собой геномные структуры CRAd-αGT (A) и CRAd-GFP (B). Геномная последовательность Ad5 была модифицирована для экспрессии knob фибера Ad3. Последовательности E3 или E1 были модифицированы посредством делеции или замещения нуклеотидными последовательностями генов α1,3GT или GFP, соответственно.
ФИГУРА 7: Количественная оценка жизнеспособности раковых клеток человека после инфицирования CRAd-αGT. Клетки A549 и A375 засеяли в 96-луночные планшеты, инфицированные серийным титрованием вируса, начиная с 1,2×1011 вирусных частиц (VP)/мл CRAd-αGT или 9,7×1010 ВЧ/мл контрольного вируса CRAd-GFP, и инкубировали в течение 72 часов. Жизнеспособность клеток определяли количественно, используя люминисцентный анализ жизнеспособности клеток Cell Titre Glo (Promega).
ФИГУРА 8: Визуализация жизнеспособности раковых клеток человека после инфицирования CRAd-αGT. Клетки A549 (рака легкого) и A375 (меланомы) засеяли в 24-луночные планшеты, инфицированные 3,6×107 вирусных частиц (ВЧ)/мл CRAd-αGT или 1,9×1010 ВЧ/мл контрольного вируса CRAd-GFP, и инкубировали в течение 72 часов. Визуализацию проводили с применением световой микроскопии при 10-кратном увеличении.
ФИГУРА 9: Анализ связывания анти-Gal с раковыми клетками человека после инфицирования CRAd-αGT. Клетки A549 и A375 инфицировали либо 1,44×106 вирусных частиц (ВЧ)/мл CRAd-αGT, либо 1,16×106 ВЧ/мл контрольного вируса CRAd-GFP. Клетки анализировали на связывание анти-Gal и экспрессию GFP посредством проточной цитометрии.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с первым аспектом изобретение относится к онколитическому вирусу, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент гексозилтрансферазу.
Настоящее изобретение относится к композициям и способам для комбинирования лизиса опухолевых клеток, индуцированного онколитическим вирусом, с активным иммуноопосредованным выделением и рекрутингом антигенпрезентирующих клеток (APC) в область опухоли. Сконструированные онколитические вирусы, которые экспрессируют гексозилтрансферазу, такую как альфа 1,3-галактозилтрансфераза, будут модифицировать гликозилирование инфицированных клеток, так чтобы они экспрессировали альфа-gal эпитопы на клеточных мембранах перед вирусиндуцированным лизисом. Когда опухолевые клетки впоследствии лизируются вирусом, фрагменты клеточных мембран будут опсонизироваться натуральными анти-Gal антителами, которые связывают альфа-gal эпитопы для формирования иммунных комплексов. Анти-Gal антитела будут усиливать фагоцитоз фрагментов клеток опухоли с помощью APC через взаимодействие между Fc-участком анти-Gal антител и Fcγ-рецепторами (FcγR) на APC. Подобным образом, интактные опухолевые клетки, которые экспрессируют альфа-gal эпитопы после инфицирования вирусом, также будут опсонизироваться анти-Gal и поглощаться APC через FcγR. Поглощение антигена через FcγR приводит к активации и созреванию APC, которые процессируют опухолевые антигены для презентирования на молекулах MHC и мигрируют в дренирующие лимфатические узлы, где они презентируют опухолевые антигены Т-клеткам. Путем этого процесса генерируется защитный иммунный ответ против личных опухолевых антигенов пациента.
В дополнение к вышесказанному, экспрессия альфа-gal эпитопов на поверхности клеток и последующее образование их комплекса с анти-Gal антителами приведут к активации комплемента. Активация комплемента приводит к: высвобождению хемотаксических пептидов, которые мобилизуют APC в опухоль; опсонизации интактных опухолевых клеток и фрагментов мембран опухолевых клеток молекулами C3b комплемента; опосредованному комплементом лизису интактных опухолевых клеток. Интактные опухолевые клетки и фрагменты опухолевых клеток, опсонизированные молекулами C3b комплемента, связываются и интернализируются APC через взаимодействие между C3b и рецепторами комплемента на APC.
Вследствие этого, в дополнение к онколитическому вирусиндуцированному лизису инфицированных опухолевых клеток, опсонизация опухолевых клеток и фрагментов клеток анти-Gal антителами и последующая активация комплемента и образование иммунных комплексов, которые фагоцитируются APC, приводит к защитному противоопухолевому иммунному ответу. Вследствие этого, разрушение опухолевой массы посредством комбинации вирусиндуцированного онколизиса и иммунной активации улучшается, чем при отдельном введении либо нерепликативного вируса, экспрессирующего альфа 1,3-галактозилтрансферазу, либо одного репликационно-компетентного онколитического вируса, не экспрессирующего альфа 1,3-галактозилтрансферазу.
Таким образом, настоящее изобретение относится к улучшенному лечению различных типов рака и даже лечению таких типов, которые до сих пор считались неизлечимыми.
Настоящее изобретение направлено на композиции и способы применения онколитических вирусов, которые были модифицированы для доставки гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей ген гликозилтрансферазы, такой как альфа 1,3-галактозилтрансфераза. Предпосылка заключается в том, что вирус специфически инфицирует опухолевые клетки, которые затем продуцируют и экспрессируют функциональный фермент альфа 1,3-галактозилтрансферазу. Фермент альфа 1,3-галактозилтрансфераза в последующем продуцирует и интегрирует альфа-gal эпитопы на поверхности опухолевых клеток. Интеграция альфа-gal эпитопов на мембране опухолевой клетки возникает перед лизисом клеток, индуцированным онколитическим вирусом, так что полученные впоследствии остатки клеточных мембран метятся альфа-gal эпитопами. Не желая быть связанными каким-либо конкретным механизмом, предполагается, что связывание меченных альфа-gal фрагментов опухолевых клеток природными анти-Gal антителами активирует систему комплемента (как делает большинство взаимодействий антиген/антитело) и генерирует расщепляющие комплемент хемотаксические факторы, которые мобилизуют APC в подлежащую лечению опухоль. Опухолевые клетки и фрагменты мембран опухолевых клеток, которые экспрессируют альфа-gal эпитопы, опсонизируются анти-Gal и активно выделяются для фагоцитоза APC, мобилизованными в опухоль. Предполагается, что подход, описанный в данной заявке, механистически отличается от предыдущих подходов к онколитическому вирусу, который экспрессирует GM-CSF, где APC произвольным образом интернализируют растворимые молекулы, которые находятся по соседству, посредством пиноцитоза с минимальным фагоцитозом материала в виде частиц. При настоящем подходе мембраны опухолевых клеток более эффективно фагоцитируются APC, поскольку фрагменты опухолевых клеток или интактные опухолевые клетки экспрессируют альфа-gal эпитопы, которые в последующем связываются с анти-Gal антителами. Взаимодействие между Fc-фрагментом анти-Gal антител, покрывающих фрагменты опухолевых клеток/интактные опухолевые клетки, и FcγR на APC стимулируют APC к интернализации, процессингу и презентации антигенов Т-клеткам. Дополнительно, активация комплемента и последующая опсонизация фрагментов опухолевых клеток и интактных опухолевых клеток белком C3b комплемента делает способными APC связывать комплемент с рецепторами для эффективной интернализации, процессинга и презентации опухолевых антигенов Т-клеткам.
Способы по изобретению парадоксальны, поскольку они, по-видимому, не направлены на модификацию гликозилирования поверхности клетки опухоли репликацией компетентного онколитического вируса для выделения фрагментов клеточных мембран и интактных клеток для поглощения APC.
Экспрессия и интеграция клеточных мембран альфа-gal эпитопов перед вирусиндуцированным лизисом клеток предоставляет способ мечения фрагментов мембран опухолевых клеток для рекрутинга APC и активного поглощения APC, индуцирующий защитный противоопухолевый иммунный ответ по сравнению с менее эффективными способами, описанными ранее. Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом, на Фигурах 1 и 2 предоставлены принципиальные схемы, которые показывают один возможный механизм, посредством которого, как предполагается, заявленные композиции и способы обладают терапевтическим действием.
В вариантах осуществления настоящего раскрытия будут задействованы, если не указано иное, методики медицины, органической химии, биохимии, молекулярной биологии, фармакологии и т.п., которые находятся в рамках специальных знаний предшествующего уровня техники. Такие методики полностью объяснены в литературе.
Следует заметить, что в описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст явно не определяет иное. В настоящем описании и последующей формуле изобретения будет сделана ссылка на ряд терминов, которые, как будет определено, имеют следующие значения, если не будет очевидным противоположное намерение.
Перед описанием ряда вариантов осуществления предоставлены и должны использоваться следующие определения, если не указано иное.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой фермент галактозилтрансферазу. В дополнительном варианте осуществления фермент представляет собой фермент альфа 1,3-галактозилтрансферазу.
I. Композиции
Композиции, используемые в настоящем описании, содержат онколитический вирус и последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую галактозилтрансферазу, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, пригодный для введения. Таким образом, в соответствии с дополнительным аспектом изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей онколитический вирус, как определено здесь, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
A. Вирусы
В одном варианте осуществления вирус сконструирован, чтобы быть онколитическим. В альтернативном варианте осуществления вирус является природным онколитическим.
В одном варианте осуществления онколитический вирус содержит рекомбинантный связывающий домен, специфичный для маркера стволовой опухолевой клетки.
В одном варианте осуществления вирус является репликационно-ограниченным и лизирует только раковые клетки, не затрагивая нераковые клетки.
Онколитические вирусы с ограниченной репликацией являются особенно пригодными для композиций и способов, описанных в настоящем описании. Такие вирусы реплицируются в раковых клетках и убивают них. Они могут дополнительно кодировать гетерологичный ген (или гены), который кодирует белок, который обладает дополнительными противоопухолевыми свойствами. Термин онколитический вирус обозначает, что он включает любой вирус, который инфицирует/проникает и лизирует раковые клетки. Идеальный онколитический вирус эффективно убивает клинически значимую фракцию раковых клеток пациента путем прямого цитолиза с минимальной деструкцией ткани, не являющейся неопластической.
Онколитические вирусы являются предпочтительными (из перспективы безопасности), если они по своей природе не являются патогенными (например, по своей природе не инфицируют людей) или вызывают только легкое заболевание у людей (например, аденовирусы вызывают гриппоподобные симптомы). Вирусы, которые успешно используют в одобренных вакцинах и вводят тысячам или миллионам человек (например, вакцина от натуральной оспы), по этой причине также являются предпочтительными. Если вирус является патогенным у людей и связан с серьезным заболеванием (например, нейротоксичность, ассоциированная с некоторыми штаммами вируса герпеса), то является предпочтительным создание множественных делеций или мутаций в вирусном геноме, чтобы сделать их специфичными для раковых клеток и снизить риск того, что одно событие генетической рекомбинации с эндогенным вирусом приведет к полностью патогенному штамму. Желательными являются проникновение в выделенную опухолевую клетку и специфичность репликации. Более того, при использовании у пациентов вирус должен быть безопасным и непатогенным. Онколитические вирусы, полученные от многих различных типов вирусов, описаны Liu et al. (Liu et al., Nature Clinical Practice Oncology 4: (2) 101-117, 2007). Среди этих оболочечных вирусов наиболее значимыми являются такие как, но не ограничиваясь, вирус простого герпеса (HSV), вирус коровьей оспы (VV) и парамиксовирусы, такие как вирус кори (MeV), вирус болезни Ньюкасла (NDV) или рабдовирусы, такие как вирус везикулярного стоматита (VSV). Помимо применения немодифицированного вируса дикого типа, генная инженерия может дополнительно повысить безопасность и эффективность онколитических вирусов.
Отличительная особенность векторов онколитических вирусов, ограничивающих репликацию, которые кодируют гетерологичный ген, состоит в том, что начальная доза гетерологичного гена может многократно быть увеличена in vivo посредством репликации в раковых клетках и высвобождения из раковых клеток в пределах инъецированного поражения (поражений). На это указывает, например, Liu et al. (Liuetal., 2003), который описывает свойства вектора мутантного вируса простого герпеса-1 (HSV-1), который кодирует гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). В совокупности данные виды терапии рака называются «усиленные терапевтические вакцины» (Bauzon&Hermiston, 2014). Инженерия оболочечных белков может ограничивать инфицирование вирусом опухолевыми клетками, и введение «суицидальных» генов может усилить терапевтические эффекты (Nakamura et al., Expert Opin. Bio. Ther. 4: (10): 1685-1692, 2004); Liu et al., Nature Clinical Practice Oncology 4: (2) 101-117, 2007; Liu et al., Gene Therapy, 10(4), 292-303, 2003).
Вирусы могут быть получены от хорошо изученных лабораторно-адаптированных штаммов, которые поддерживались несколькими последовательными пассажами через иммортализованные клеточные линии в культуре тканей. Однако опухоли человека у пациентов растут более медленно, чем иммортализованные клеточные линии в оптимизированных условиях культивирования, и могут иметь другие факторы окружающей среды и развития, которые ограничивают скорость метаболизма и деления клеток (такие как гипоксическая окружающая среда, которая может существовать в центре крупной опухолевой массы, результат недостаточной нутритивной поддержки). Вследствие этого предпочтительно выбирать вирус для оптимального роста in vivo (in situ), а не исходя из характеристик его роста в культуре тканей. Например, штамм HSV-1, полученный из клинического изолята JS1 (полученный от пациента и подвергшийся только короткому времени размножения в культуре тканей) использовали для создания онколитических вирусов для лечения раковых пациентов (Liu, 2003). Важным соображением при выборе клинического изолята является то, что оптимальные условия могут быть идентифицированы так, чтобы его можно было размножать in vitro, что необходимо для увеличения и получения клинического материала. Предполагается, что мутации в геноме улучшают репликацию вируса в культуре тканей, не ухудшая его рост в опухолях in vivo.
В дополнение к выбору вирусного вектора, основанного на его способности реплицироваться и лизировать опухолевую ткань у пациентов, предусмотрены дополнительные мутации в геноме, которые дополнительно улучшают его способность к репликации in vivo. Например, из клинического штамма HSV-1, JS1, удалены два гена (Liu, 2003). Первая делеция, ICP34.5, ограничивает репликацию вируса раковыми клетками; вторая, ICP47, приводит к ранней экспрессии US11, который кодирует вирусный белок, блокирующий фосфорилирование белка хозяина, PKR. PKR является ключевым компонентом врожденного иммунного ответа на инфицирование вирусом - при фосфорилировании он останавливает трансляцию белка в инфицированных клетках и ограничивает репликацию вируса. Вследствие этого, репликация in vivo мутантного штамма JS1 ICP34.5-/ICP47 усиливается по сравнению с штаммом дикого типа (без мутаций).
В ряде вариантов осуществления онколитический вирус представляет собой онколитический репликационно-компетентный аденовирус, вирус коровьей оспы, вирус герпеса, реовирус, вирус кори или вирус болезни Ньюкасла.
В другом варианте осуществления вирус представляет собой РНК- или ДНК-вирус человеческого или нечеловеческого происхождения, такой как аденовирус, герпесвирус, вирус коровьей оспы, вирус кори, вирус болезни Ньюкасла, автономные парвовирусы, вирус везикулярного стоматита (VSV) или реовирус.
Иллюстративные онколитические вирусы, показанные в таблице 1, в настоящее время находятся в клинических испытаниях и могут быть модифицированы, как описано в настоящем описании, для использования в предлагаемых терапевтических методах. В различных вариантах осуществления онколитический вирус представляет собой оболочечный вирус, полученный из вирусных семейств герпесвирид, поксвирид, рабдовирид или парамиксовирид, предпочтительно из семейства парамиксовирид, рода морбилливирус.
Некоторые онколитические вирусы генетически модифицированы для приобретения опухолеспецифической репликации (аденовирус, герпесвирус, вирус коровьей оспы), тогда как другие являются опухолеспецифическими вирусами по своей природе (реовирус, вирус болезни Ньюкасла, автономный парвовирус, определенные штаммы кори и вирус везикулярного стоматита (VSV)).
i) Аденовирус
В одном варианте осуществления онколитический вирус представляет собой аденовирус. Данные представлены в настоящем описании в примерах 1-3 и 8 и Фигурах 4-9, которые демонстрируют положительные результаты, достигнутые с применением аденовирусов, содержащих альфа 1,3-галактозилтрансферазу. Аденовирусы человека являются безоболочечными, двухнитевыми ДНК-вирусами приблизительно 30-38 kB. Отличительной особенностью аденовирусов является то, что они кодируют ряд вирусных белков, которые ингибируют наиболее важные регуляторные белки хозяина. Некоторые из этих регуляторных белков хозяина (такие как p53) являются дефектными при многих видах рака. Вследствие этого, делеция вирусного гена делает мутантные вирусы селективными для репликации при видах рака с дефектным регуляторным белком хозяина.
Таким образом, мутация гена E1B-55kD аденовируса, ингибирующего белок р-53, (например, в вирусе dl1520), является селективной для опухолей, которые имеют ограниченную или отсутствующую функцию p53. Функция p53 утрачена у большинства видов рака человека через различные механизмы, включая генную мутацию, сверхэкспрессию p53-связывающих ингибиторов (например, mdm2, папилломавируса E6 человека), и утрата p53-ингибирующего пути модулируется p14ARF.
Подобным образом, делеции в консервативной области 2 E1a имеют дефектное связывание белка ретинобластомы (RB), и эти мутанты исследуют для использования против опухолей с нарушениями пути RB (например, в вирусе dl922/947).
Другой подход к получению селективной репликации аденовирусов в раковых клетках состоит в регулировании экспрессии продукта вирусного гена E1a, используя промотор, специфичный для исследуемой ткани или рака. Например, его используют для нацеливания онколитических аденовирусов на рак простаты (посредством генетической модификации генома для введения промотора/энхансера простатспецифического антигена (PSA) перед геном E1a.
В одном варианте осуществления вирус представляет собой условно реплицирующийся аденовирус (CRAd), в котором репликация ограничивается опухолевыми клетками. Было продемонстрировано, что CRAd избирательно реплицируются в раковых клетках, вызывая их лизис и смерть (Fueyo et al., 2000; Kanno et al., 2012; Bramante et al., 2015). CRAd были образованы с использованием аденовируса 5 (Ad5), который был генетически модифицирован для экспрессии регулятора волокна аденовируса 3 (Ad3) для создания химерного вируса Ad5/3 (Kanerva et al., 2003; Kim et al., 2013).
Таким образом, в одном варианте осуществления CRAd представляет собой химерный вирус Ad5/3. Химерный вирус Ad5/3 способен связываться и проникать в клетки, используя CD46, Ad3-рецептор, а не коксаки-аденовирусный рецептор (CAR), который связывается Ad5. Это является преимуществом, поскольку многие опухоли имеют вариабельную экспрессию CAR, при том, что все ядерные клетки экспрессируют CD46 (Ulasov et al., 2006). Вирус становится условно-репликативным посредством введения делеции 24 пар оснований (Δ24) в константной области 2 (CR2) вирусного гена немедленного раннего ответа (E1a) (Kanerva et al., 2003). Таким образом, в одном варианте осуществления химерный вирус Ad5/3 дополнительно содержит делецию 24 пар оснований (Δ24) в константной области 2 (CR2) вирусного гена немедленного раннего ответа (E1a), в настоящем описании известного как Ad5/3-Δ24 CRAd. Эта мутация приводит к вирусному белку E1, который неспособен связывать белок ретинобластомы (Rb) для индуцирования S-фазы в пределах клетки (Fueyo et al., 2000). Вследствие этого, вирус неспособен реплицироваться в неделящихся нормальных клетках, но эффективно реплицируется в клетках, которые имеют неактивный путь Rb/p16, фенотип, обозначенный как общий для всех видов рака (Sherr, 1996). Химерный, условно-реплицирующийся Ad5/3-Δ24 CRAd может быть дополнительно модифицирован посредством замещения гена (E3) ранней области аденовируса трансгеном, что приводит к Ad5/3-Δ24 CRAd, который специфически продуцирует трансген во время репликации (Koski et al., 2010; Kanerva et al., 2013; Bramante et al., 2015). Химерный, условно-реплицирующийся Ad5/3-Δ24 CRAd дополнительно модифицирован путем замещения гена ранней области (E3) аденовируса трансгеном альфа 1,3-галактозилтрансферазы, что приводит к Ad5/3-Δ24 CRAd, который специфически продуцирует альфа 1,3-галактозилтрансферазу во время репликации. Таким образом, в одном варианте осуществления Ad5/3-Δ24 CRAd дополнительно содержит трансгенную альфа 1,3-галактозилтрансферазу, в настоящем описании известную как CRAd-αGT. Данные представлены в настоящем описании в примере 8 и Фигурах 6-9, которые демонстрируют, что человеческий рак легкого и клетки меланомы, инфицированные CRAd-αGT, экспрессируют альфа-gal эпитопы на поверхности клеток и связываются анти-Gal антителами перед вирусиндуцированным лизисом.
ii) Вирус герпеса
В одном варианте осуществления онколитический вирус представляет собой вирус герпеса. Методология представлена в настоящем описании в примерах 4-7, которые демонстрируют, как можно достичь положительных результатов с применением вируса герпеса, содержащего альфа-1,3 галактозилтрансферазу. Вирус герпеса (HSV) представляет собой оболочечный, двухнитевой ДНК-вирус приблизительно 152 kbp, и имеет природную тропность к нейронных и слизистых клеток. Как предполагается, HSV может быть полезным как в качестве вектора доставки генов в нервную систему и какую-либо другую область и для онколитического лечения рака. При обоих применениях вирус, однако, должен быть деактивирован, так чтобы он больше не был патогенным, но так, чтобы он все еще мог проникать в клетки и выполнять желаемую функцию. Таким образом, для доставки нетоксичных генов в намеченные клетки с применением HSV становится понятно, что в большинстве случаев экспрессия генов немедленного раннего ответа из вируса должна быть предотвращена/минимизирована. Для онколитического лечения рака, которое может также включать доставку гена (генов), улучшающих терапевтический эффект, был идентифицирован ряд мутаций HSV, которые все-таки позволяют вирусу реплицироваться в культуре или в активно делящихся клетках in vivo (например, в опухолях), но которые предотвращают значительную репликацию в нормальной ткани. Такие мутации включают разрушение генов, кодирующих ICP34.5, ICP6 и тимидинкиназу. Среди них, вирусы с мутациями ICP34.5 или ICP34.5 вместе с мутациями, например, ICP6, до сих пор показывали наиболее благоприятный профиль безопасности. Вирусы с делецией только ICP34.5, как было показано, реплицируются во многих типах опухолевых клеток in vitro и селективно реплицируются в искусственно индуцированных опухолях головного мозга у мышей, щадя при этом окружающие ткани. Ранние клинические испытания также показали свою безопасность у человека. Примеры таких вирусов и использования описаны в публикациях PCT WO 2001/053506, WO 98/004726, WO 98/051809 и WO 99/060145.
В одном варианте осуществления онколитический вирус представляет собой вирус HSV1. Один иллюстративный штамм онколитического вируса представляет собой штамм HSV1 JS 1, размещенный в Европейской коллекции культивируемых клеток (ECACC), CAMR, Sailsbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom, 2 января 2001 года под номером доступа 01010209. Штаммы онколитического вируса, такие как этот, могут быть модифицированы, как описано в настоящем описании, для экспрессии ферментов галактозилтрансфераз для использования в предоставленных способах.
iii) Вирус коровьей оспы
В одном варианте осуществления онколитический вирус представляет собой вирус коровьей оспы. Вирус коровьей оспы представляет собой оболочечный, двухнитевой ДНК-вирус приблизительно 200 kB. Этот вирус реплицируется в цитоплазме, перенося со своей инфекционной частицей ферменты, необходимые для репликации ДНК и транскрипции ее генов. Вирус коровьей оспы обладает многими качествами, которые делают его хорошим онколитическим вирусом. Он имеет большой геном со способностью принимать множественные чужеродные гены, он имеет широкий круг хозяев, он быстро реплицируется, и его можно легко рекомбинировать для изготовления вирусных мутантов. Были установлены хорошие показатели безопасности посредством использования вируса коровьей оспы в качестве противооспенной вакцины.
iv) Вирус кори
В одном варианте осуществления вирус представляет собой вирус кори (MeV) или вакцинный штамм MeV, такой как штамм Edmonston (MeVEdm). MeV использует два оболочечных гликопротеина (белок слияния (F) и белок гемагглютинин (H)) для проникновения в выделенную клетку. Белок F представляет собой трансмембранный белок I типа, тогда как белок H представляет собой трансмембранный домен II типа, т.е. его амино-конец выходит непосредственно в области цитоплазмы. Таким образом, оба белка содержат трансмембранную и цитоплазматическую область. Одной известной функцией белка F является опосредование слияния вирусных мембран с клеточными мембранами клетки хозяина. Функции, характерные для белка H, включают распознавание рецептора на намеченной мембране и поддержку белка F в его функции слияния с мембраной. Прямое и высокоэффективное слияние мембран на поверхности клеточной мембраны является особым свойством вируса кори и морбилливирусов, тем самым отличая их от многих других оболочечных вирусов, которые становятся эндоцитозированными и будут сливаться только при падении рН при эндоцитозе. Оба белка организованы на вирусной поверхности в правильной структуре плотно упакованных спайков, H-тетрамеров и F-тримеров (Russell et al., Virology 199:160-168, 1994).
Штамм Edmonston MeV (MeVEdm) использует единственный белок в качестве основного рецептора, а именно белок, который, как известно, является регулятором фактора активации комплемента, CD46 (Gerlier et al., Trends Microbiol. 3:338-345, 1995). CD46 экспрессируется на всех ядерных клетках человека. Большинство клинических изолятов вируса кори, однако, не может эффективно использовать CD46 в качестве рецептора. Человеческий SLAM (сигнальная лимфоцит-активирующая молекула, также известная как CDw150) представляет собой недавно обнаруженный мембранный гликопротеин, который экспрессируется на некоторых Т- и В-клетках, а также обнаруживается, что он действует как клеточный рецептор для MeV, включая штамм Edmonston (Tatsuo et al., Nature 406(6798):893-7, 2000). Точные биологические функции и взаимодействия белков H и F MeV остаются в значительной степени неясными.
В клиническом развитии рака существует ряд онколитических вирусов, которые могут быть модифицированы с включением кодирующей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей гексозилтрансферазу, такую как альфа1,3-галактозилтрансфераза. Примеры таких онколитических вирусов включают Ad-mda7 (p53 Inc), Ad-p53 (p53 Inc.), CG-0070 (Cold Genesys, Inc.), DNX-2401 (DNAtrix, Inc.), DWP-418 (Daewoong Pharmaceutical), HSV, экспрессирующий huIL-12 (Univ. Alabama Birmingham), G-47 Delta (Univ. Tokyo Hospital), ганцикловир/ADV-TK (Shenzhen Tiandakang), GLONC-1 (Genelux Corp.), GLONC-2 (Genelux Corp.), GLONC-3 (Genelux Corp.), HF-10 (Takara Holdings), HSV-1716 (Virttu Biologics), JX-929 (Jennerex Bioterapeutics), KH-901 (Chengdu Kanghong Pharmaceuticals), вакцину MV-NIS (Mayo Clinic), Онколитический NDV-HUJ (Hadassah medical), OBP-301 (Oncolys BioPharma), Онколитический AdV (Erasmus MC), ONCOS-102 (Oncos Therapeutics), ORCA-010 (Orca Therapeutics), парвовирус H-1 (Oryx GmbH), пексастимоген девацирепвек (Jennerex Bioterapeutics), PV-701 (Wellstat Biologics), талимоген лахерпарепвек (Amgen), TG-1042 (Ascend Biopharmaceuticals), VCN-01 (VCN Biosciences) и VirRx-007 (p53 Inc.).
Вирусы по изобретению инфицируют и реплицируются в опухолевых клетках, в последующем убивая опухолевые клетки. Таким образом, такие вирусы являются репликационно-компетентными. Предпочтительно, они селективно репликационно-компетентны в опухолевых клетках. Это означает, что они либо реплицируются в опухолевых клетках, а не в неопухолевых клетках, либо что они более эффективно реплицируются в опухолевых клетках, чем в неопухолевых клетках. Клетки, в которых вирус способен реплицироваться, являются пермиссивными клетками.
Измерение способности к селективной репликации может быть проведено с помощью описанных в настоящем описании тестов для измерения способности к репликации и уничтожения опухолевых клеток, а также, при необходимости, проанализировано посредством статистических методов, упомянутых в настоящем описании.
Вирус изобретения предпочтительно обладает большей способностью, чем немодифицированный родительский штамм, инфицировать или реплицироваться в опухолевой клетке, уничтожать опухолевые клетки или распространяться между клетками в тканях. Предпочтительно эта способность является статистически значимо большей способностью. Например, вирус в соответствии с изобретением может иметь в 1,1 раза, 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раз, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 50 раз или 100 раз большую, чем способность немодифицированного родительского штамма в отношении тестируемого свойства.
Свойства вирусного штамма в отношении опухолевых клеток можно измерить любым способом, известным в данной области. Например, способность вируса инфицировать опухолевую клетку может быть определена количественно путем измерения дозы вируса, необходимой для заражения определенного процента клеток, например, 50% или 80% клеток. Способность реплицироваться в опухолевой клетке можно измерять с помощью измерений роста, как это выполнено в Примерах, например, посредством измерения роста вируса в клетках в течение 6, 12, 24, 36, 48 или 72 часов или дольше. Подобным образом, способность вируса лизировать опухолевые клетки может быть определена количественно посредством измерения соотношения живых (по сравнению с мертвыми) клеток в культурах, инкубированных с заданной дозой вируса в течение периода, составляющего 6, 12, 24, 36, 48 или 72 часов или дольше.
B) Последовательности и Промоторы Гетерологичных нуклеиновых кислот
Вирусы по изобретению могут быть модифицированы, чтобы они несли последовательности гетерологичных нуклеиновых кислот. В одном варианте осуществления гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует гексозилтрансферазу. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновых кислот кодирует галактозилтрансферазу. В одном конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновых кислот кодирует альфа 1,3-галактозилтрансферазу. Термины «α1,3-галактозилтрансфераза», «альфа-1,3-галактозилтрансфераза», «альфа1,3GT», «α1,3GT», «гликопротеин альфа-галактозилтрансфераза 1» и «GGTA1», как используется в настоящем описании, относится к любому ферменту, способного синтезировать альфа-gal эпитопы. Фермент продуцируется у большинства млекопитающих, за исключением людей, приматов и мартышкообразных. Углеводная структура, продуцируемая ферментом, является иммуногенной у человека, а большинство здоровых людей имеют высокие титры природных анти-альфа-gal антител, также называемых «анти-Gal» антителами. В некоторых вариантах осуществления термин «альфа 1,3GT» относится к мышиному альфа1,3GT (например, Mus musculus - нуклеотиды от 460 до 1680 GenBank Номер доступа NM_010283) и к продукту его гена, а также к его функциональным аналогам у млекопитающих (например, других мартышкообразных, полуобезьян и неприматных млекопитающих, но не мартышкообразных, обезьян и людей). В некоторых вариантах осуществления термин «альфа1,3GT» относится к общему гену мармозеток (например, Callithrix jacchus - GenBank Номер доступа S71333), бычьему альфа 1,3GT (например, Bos taurus - GenBank Номер доступа NM_177511), кошачьему альфа1,3GT (например, Felis catus - GenBank Номер доступа NM_001009308), овечьему альфа1,3GT (например, Ovis aries - GenBank Номер доступа NM_001009764), крысиному альфа1,3GT (например, Rattus norvegicus - GenBank Номер доступа NM_145674) и свиному альфа1,3GT (например, Sus scrofa - GenBank Номер доступа NM_213810). Некоторые варианты осуществления содержат функциональный вариант альфа1,3GT млекопитающих, который отличается от последовательностей альфа1,3GT дикого типа млекопитающих, например, в менее чем 1-5% остатков. В частности, варианты альфа1,3GT включают, но без ограничения, встречающиеся в природе функциональные варианты альфа1,3GT млекопитающих, а также чтобы найти применение в композициях и способах настоящего изобретения предусматриваются не встречающиеся в природе варианты, созданные посредством рекомбинантных или других средств (например, замещения, делеции или добавления 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, предпочтительно соответствующих остатку от функционального гомолога альфа1,3GT млекопитающих). В других вариантах осуществления используют процессированные формы альфа1,3GT млекопитающих, которые сохраняют каталитическую активность (например, GGTA1 не содержащий 90 аминокислотной N-концевой стеблевой области). Однако делеция 3 аминокислот из C-конца этого фермент приводит к его полной инактивации (Henion, T.R., B.A. Macher, F. Anaraki и U. Galili, Glycobiology 4:193-201, 1994).
Альфа1,3-галактозилтрансфераза была ранее сконструирована в аденовирусе и использована для клеточного переноса (Deriy et al. Glycobiology, 12(2), 135-44 2002; Deriy et al. Cancer Gene Therapy, 12(6), 528-39, 2005). Альфа 1,3-галактозилтрансферазу никогда не конструировали для экспрессии онколитическими вирусами для комбинированного способа лизиса/иммунизации, описанного в настоящем описании.
В вариантах осуществления, описанных в настоящем описании, гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот предпочтительно функционально связана с контрольной последовательностью, обеспечивающей возможность экспрессии указанного гена в клетке in vivo. Вирусы по изобретению могут, таким образом, использоваться для доставки гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот в клетку in vivo, когда они будут экспрессироваться.
В соответствии с дополнительным аспектом изобретение относится к способу получения онколитического вируса, как определено здесь, который включает стадию включения нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент гексозилтрансферазу, в геном указанного онколитического вируса.
Гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот может быть вставлена в вирусный геном посредством любой пригодной методики, такой как гомологическая рекомбинация штаммов HSV, например, плазмидными векторами, несущими ген, окруженный последовательностями HSV.
Гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот может быть вставлена в пригодный плазмидный вектор, содержащий последовательности вируса герпес, с применением методик клонирования, хорошо известных в данной области. Таким образом, в одном варианте осуществления указанная стадия включения содержит клонирование. Гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот может быть вставлена в любую локализацию вирусного генома, предоставленная, чтобы онколитические свойства еще сохранялись. Гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот может быть вставлена во множественные сайты в пределах вирусного генома. Например, в геном может быть вставлено от 2 до 5 генов.
Транскрибированная последовательность гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот предпочтительно функционально связана с контрольной последовательностью, обеспечивающей возможность экспрессии гена в опухолевой клетке. Термин «функционально связана» относится к непосредственной близости, в которой описанные компоненты находятся во взаимосвязи, обеспечивающей им возможность функционировать надлежащим для них образом. Контрольная последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что в условиях, сравнимых с контрольной последовательностью, достигается экспрессия кодирующей последовательности.
Контрольная последовательность содержит промотор, позволяющий экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот и сигнал для окончания транскрипции. Промотор выбирают из промоторов, которые функциональны у млекопитающих, предпочтительно в опухолевых клетках человека. Промотор может быть получен из промоторных последовательностей генов эукариот. Например, промотор может быть получен из генома клетки, в которой должна происходить экспрессия гетерологичного гена, предпочтительно млекопитающего, предпочтительно опухолевой клетки человека. Что касается эукариотических промоторов, они могут быть промоторами, которые функционируют универсальным образом (такие как промоторы бета-актина, тубулина) или, в качестве альтернативы, способом, специфическим для опухоли. Могут также быть промоторы, которые реагируют на конкретные стимулы, например, промоторы, которые связывают рецепторы к стероидными гормонами. Могут также использоваться вирусные промоторы, например, промотор длинного концевого повтора вируса лейкоза мыши Moloney (MMLV LTR) или другие ретровирусные промоторы, промотор IE или человеческого цитомегаловируса (CMV) или промоторы генов вируса герпеса, включая те, которые стимулируют экспрессию транскриптов, связанных с латентностью.
Кассеты экспрессии и другие пригодные конструкты, содержащие гетерологичную последовательность нуклеиновых кислот и контрольные последовательности, могут быть изготовлены с применением обычных методик клонирования, известных квалифицированным специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning--A laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
Также может быть выгодным, чтобы промоторы были индуцируемыми, так чтобы уровни экспрессии последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты можно было регулировать во время жизни опухолевой клетки. Индуцируемый означает, что уровни экспрессии, полученные с использованием промотора, можно регулировать. Например, вирус изобретения может дополнительно содержать гетерологичную последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую слитый белок активатора транскрипции tet-репрессора/VP16 под контролем сильного промотора (например, промотора CMV IE), а гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот может быть под контролем промотора, реагирующего на слитый белок активатора транскрипции tet репрессора/VP16, описанный ранее (Gossen и Bujard, 1992, Gossen et al., 1995). Таким образом, в этом примере экспрессия гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот может зависеть от присутствия или отсутствия тетрациклина.
В геноме вируса герпеса могут быть размещены множественные гетерологичные гены. Вследствие этого вирус изобретения может содержать две или более гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, например, от 2 до 3, 4 или 5 гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот. Можно вводить более одного гена и ассоциированных контрольных последовательностей в специфический штамм онколитического вируса либо на одном сайте, либо на нескольких сайтах в геноме вируса. В качестве альтернативы могут быть использованы пары промоторов (одинаковых или различных промоторов, обращенных в противоположных направлениях друг от друга, причем каждый из них может влиять на экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты.
В другом варианте осуществления иммуномодулирующий белок коэкспрессируется с ферментом галактозилтрансферазой. Предпочтительно иммуномодулирующий белок будет усиливать противоопухолевую активность вируса. Более предпочтительно, белок представляет собой GM-CSF или другой цитокин, хемокин, такой как RANTES, или другую иммуномодулирующую молекулу, такую как B7.1, B7.2 или CD40L. Наиболее предпочтительной иммуномодулирующей молекулой является GM-CSF. Таким образом, в одном варианте осуществления онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую GM-CSF. Иммуномодулирующий ген может представлять собой любой аллельный вариант гена дикого типа, или он может представлять собой мутантный ген. Иммуномодулирующий ген будет получен от млекопитающего, предпочтительно грызуна или примата, более предпочтительно от человека.
C) Фармацевтические Композиции
Фармацевтические композиции онколитических вирусов настоящего изобретения могут быть составлены любым общепринятым способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей или эксципиентов. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть составлены для ряда способов введения, включая системное, местное или локальное введение. Методики и готовые формы можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa.
В одном варианте осуществления композиция онколитического вируса составлена для внутривенного введения, внутримышечного введения, интраперитонеального введения, интратуморального введения, подкожного введения, перорального введения, ректального введения, интравагинального введения, интраназального введения, чресслизистого введения или чрескожного введения.
В дополнительном варианте осуществления композиция онколитического вируса составлена для внутривенного введения, внутримышечного введения, интраперитонеального введения, подкожного введения, перорального введения, ректального введения, интравагинального введения, интраназального введения, чресслизистого введения или чрескожного введения.
Доставка подходящего онколитического вируса в раковые клетки, подлежащие лечению, может выполняться с использованием «раздетого» вируса или путем инкапсуляции вируса в носитель, например, в наночастицы, липосомы или другие везикулы.
Введение осуществляется предпочтительно в «терапевтически эффективном количестве», что является достаточным для того, чтобы проявить пользу для индивида. Фактическое вводимое количество, а также скорость и период действия будут зависеть от природы и тяжести опухоли, подлежащей лечению. Назначение лечения, например, решения о дозировке и т. д., входят в компетенцию врачей общей практики и других врачей и, как правило, учитывают расстройство, подлежащее лечению, состояние отдельного пациента, место доставки, способ введения и другие факторы, известные специалистам-практикам. Примеры методик и протоколов, упомянутых выше, можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.
Онколитический вирус можно вводить в любой терапевтически эффективной дозе. Терапевтически эффективные дозы могут составлять приблизительно, но не ограничиваясь, 103, приблизительно 104, приблизительно 105, приблизительно 106, приблизительно 107, приблизительно 108 или приблизительно 109 бляшкообразующих единиц (БОЕ).
Для системного введения предпочтительной является инъекция, включая интратуморальную, внутримышечную, внутривенную, интраперитонеальную и подкожную. С целью инъекции фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть приготовлены в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса или раствор Рингера. В дополнение, фармацевтические композиции могут быть приготовлены в твердой форме и повторно растворены или суспендированы непосредственно перед использованием. Также пригодны лиофилизированные формы фармацевтической композиции.
Системное введение может также осуществляться через чресслизистые или чрескожные средства. Для чресслизистого или чрескожного введения в составе используют пенетранты, соответствующие проницаемому барьеру. Такие пенетранты обычно известны в данной области и включают, например, для чресслизистого введения, желчные соли и производные фузидовой кислоты. В дополнение, для облегчения проникновения могут использоваться детергенты. Чресслизистое введение может происходить с использованием назальных спреев или суппозиториев. Для местного введения векторные частицы изобретения могут быть в составе мазей, бальзамов, гелей или кремов, как в целом известно в данной области. Раствор для промывания также можно использовать местно для лечения повреждения или воспаления, чтобы ускорить заживление.
Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для парентерального введения посредством инъекции, например, посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Препараты для инъекций могут быть представлены в виде стандартной лекарственной формы, например, в ампулах или в мультидозовых контейнерах, с необязательно добавленным консервантом. Фармацевтические композиции могут быть дополнительно приготовлены в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных основах, и могут содержать другие агенты, включая суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
Изобретение также включает набор, содержащий фармацевтическую композицию изобретения и устройство доставки для доставки композиции субъекту. В качестве примера устройством доставки может быть сжимаемая распылительная бутылка, распылительная бутылка с отмеренной дозой, аэрозольное распылительное устройство, атомайзер, устройство подачи сухого порошка, самовыталкивающее устройство для нанесения растворителя/порошка, шприц, иглу, тампон или контейнер, отмеряющий дозу. Набор может дополнительно содержать обучающий материал, как описано в настоящем описании.
II) Способы
Композиции вируса по изобретению могут использоваться в способах терапии рака человека или животного организма. В частности, вирусы по изобретению могут использоваться в онколитическом лечении рака, либо с дополнительной пролекарственной терапией или стимуляцией противоопухолевого иммунного ответа, либо без них. Композиции вируса по изобретению могут использоваться в терапевтическом лечении любой солидной опухоли у млекопитающего, предпочтительно у человека.
Таким образом, в соответствии с дополнительным аспектом, изобретение относится к способу лечения индивида с новообразованием, который включает стадии:
i) экспрессии эндогенного фермента, доставляемого онколитическим вирусом, как определено здесь, по меньшей мере в одну раковую клетку для модифицирования гликозилирования клеточной мембраны; и
ii) индуцирования лизиса по меньшей мере одной раковой клетки, возникающего в результате введения онколитического вируса.
В одном варианте осуществления способ направлен на лечение индивида с раком посредством введения эффективного количества композиции онколитического вируса, в котором инфицирование вирусом вызывает экспрессию гексозилтрансферазы перед лизисом.
В одном варианте осуществления онколитический вирус вводят в эффективном количестве, чтобы инфицировать по меньшей мере одну раковую клетку индивида.
В другом варианте осуществления альфа-gal эпитопы вставляют в мембрану инфицированной клетки в течение 10 часов после инфицирования.
В другом варианте осуществления альфа-gal эпитопы вставляют в мембрану инфицированной клетки до лизиса инфицированной клетки.
В одном варианте осуществления способ направлен на лечение индивида с раком.
В другом варианте осуществления способ направлен на лечение индивида с опухолью.
В другом варианте осуществления способ направлен на лечение индивида с раком.
В одном варианте осуществления мембрана модифицированной клетки активно выделяет фрагменты мембраны для рекрутинга антигенпрезентирующих клеток.
В другом варианте осуществления фермента достаточно для экспрессии альфа-gal эпитопов на мембране инфицированной клетки перед лизисом.
В другом варианте осуществления экспрессии альфа1,3-галактозилтрансферазы достаточно для индуцирования эффективного иммунного ответа на инфицированную клетку после лизиса.
В другом варианте осуществления альфа-gal эпитопов достаточно для привлечения антигенпрезентирующих клеток в область опухоли.
В другом варианте осуществления фермент экспрессируется в течение 4 часов после инфицирования.
В другом варианте осуществления альфа-gal эпитопов достаточно для связывания анти-gal антител в области опухоли.
Опосредованная анти-Gal деструкция опухолей, описанная в этом способе, может быть достигнута посредством инъекции геннотерапевтических векторов, содержащих ген альфа1,3-галактозилтрансферазы. В одном варианте осуществления настоящее изобретение рассматривает способ лечения пациентов с меланомой с множественными метастазами, включающий внутриопухолевые инъекции репликационно-компетентного онколитического вируса, содержащего ген альфа1,3-галактозилтрансферазы. В одном варианте осуществления внутриопухолевая инъекция композиций вируса приводит к трансдуцированным опухолевым клеткам, экспрессирующим альфа-gal эпитопы, в котором эти опухолевые клетки индуцируют интратуморальное воспаление до лизиса. Интратуморальное воспаление мобилизует антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги и определенные B-клетки. Инфицированные клетки могут быть либо лизированы сконструированными репликационно-компетентными вирусами композиций, описанных в настоящем описании, либо в качестве альтернативы уничтожены природным анти-Gal антителом, связанным с альфа-gal эпитопами на трансдуцированных клетках через механизмы комплементзависимого цитолиза (CDC) или антителозависимого клеточноопосредованного цитолиза (ADCC). Хотя понимать механизм изобретения не является необходимым, предполагается, что опсонизированные анти-Gal опухолевые мембраны будут активно выделять фрагменты мембран опухолевых клеток или интактных опухолевых клеток для антигенпрезентирующих клеток и таким образом, способствовать защитному противоопухолевому иммунитету.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении рассматривается способ лечения пациентов с колоректальным раком, имеющих множественные метастазы в ободочной кишке и в печени, включающий внутриопухолевые инъекции онколитического вируса, содержащего ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы. В одном варианте осуществления инъекция включает колоноскопию или лапароскопию как средство доставки вирусного вектора в опухолевые поражения.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении рассматривается способ лечения пациентов с раком легкого, имеющих множественные метастазы в легких, включающий внутриопухолевые инъекции онколитического вируса, содержащего ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы. В одном варианте осуществления инъекция включает бронхоскопию.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении рассматривается способ лечения пациентов с раком мочевого пузыря, включающий онколитический вирус, содержащий вектор вирусного гена альфа 1,3-галактозилтрансферазы. В одном варианте осуществления вектор вводят посредством цистоскопии.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении рассматривается способ лечения пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы, включающий онколитический вирус, содержащий вектор вирусного гена альфа 1,3-галактозилтрансферазы. В одном варианте осуществления вектор вводят посредством эндоскопии или лапароскопии.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении рассматривается способ лечения пациентов с раком молочной железы, содержащий вектор вирусного гена альфа 1,3-галактозилтрансферазы. В одном варианте осуществления вектор вводят посредством инъекции непосредственно в опухоль.
Введение онколитического вируса, содержащего вектор вирусного гена альфа 1,3-галактозилтрансферазы, может быть выполнено в любую солидную опухоль или лимфому, которая достижима для интратуморальной доставки гена альфа 1,3галактозилтрансферазы. Например, интратуморальная доставка описана в US 7820628.
Альтернативные способы доставки гена альфа 1,3-галактозилтрансферазы могут быть выполнены также с любым типом вирусного и невирусного вектора, который может доставлять гены. Например, эти способы включают, но без ограничения, аденовирусный вектор, аденовирусный вирус-хелпер, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, векторы депротеинизированной ДНК, вирус герпеса или векторы депротеинизированной РНК или ДНК-векторы.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении рассматривается способ введения векторов, содержащих ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы, посредством инъекции в меланомные поражения или любое другое опухолевое поражение, в результате чего эпитопы вставляются в мембраны опухолевых клеток. Как и в случае опухолевых клеток, трансдуцированных онколитическим вирусом, содержащим ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы, анти-Gal IgG будет связываться с мембранами опухолевых клеток, экспрессирующих альфа-gal эпитопы, и будет нацеливать их для антигенпрезентирующих клеток для получения системного иммунного ответа также против нелеченных опухолевых поражений, которые экспрессируют опухолевые антигены. Квалифицированный специалист в данной области должен признать, что в настоящем изобретении рассматривается создание адаптивного противоопухолевого иммунитета, обусловленного нацеливанием анти-Gal антителом для антигенпрезентирующих клеток посредством любой композиции, вводимой в опухолевую массу, что приводит к связыванию in situ этого природного антитела с опухолевыми клетками.
A) Введение
Вирусы по изобретению можно использовать у пациента, предпочтительно пациента человека, нуждающегося в лечении. Пациентом, нуждающемся в лечении, является индивид, страдающий раком, предпочтительно индивид с солидной опухолью. Целью терапевтического лечения является улучшение состояния пациента. Как правило, терапевтическое лечение, использующее вирус изобретения, облегчает симптомы рака.
В соответствии с дополнительным аспектом изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение терапевтически эффективного количества вируса по изобретению пациенту, страдающему раком или имеющему новообразование или опухоль, нуждающемуся в лечении.
В соответствии с дополнительным аспектом изобретение относится к онколитическому вирусу, как определено здесь, или к фармацевтической композиции, как определено здесь, для применения в лечении рака.
Введение онколитического вируса по изобретению индивиду, страдающему опухолью, будет, как правило, убивать клетки опухоли, таким образом уменьшая размер опухоли и/или предотвращая распространение злокачественных клеток из опухоли, при этом также мобилизуя антигенпрезентирующие клетки (APC) в область опухоли и индуцируя защитный противоопухолевый иммунный ответ.
Для получения фармацевтической композиции один способ введения терапии включает комбинировние вируса с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
Пригодные носители и разбавители включают изотонические солевые растворы, например, фосфатно-буферный солевой раствор. Композиции, описанные в настоящем описании, можно вводить с использованием обычных путей введения, чтобы способствовать инфицированию вирусом области опухоли.
В одном варианте осуществления композиции вводят посредством инъекции (например, интраперитонеальной, внутримышечной, внутривенной, подкожной), ингаляции или инсуффляции (например, либо через рот, либо через нос чресслизистым или интраназальным способом) или посредством перорального, буккального, парентерального или ректального путей введения.
В одном варианте осуществления композицию вводят посредством инъекции непосредственно в намеченную ткань, которой может быть опухоль или кровеносный сосуд, кровоснабжающий опухоль. Количество вводимого вируса в случае HSV находится в диапазоне, составляющем от 104 до 1010 бляшкообразующих единиц (БОЕ), предпочтительно от 105 до 108 БОЕ, более предпочтительно приблизительно от 106 до 108 БОЕ. Как правило, для инъекции следует использовать вплоть до 500 мкл, как правило, от 1 до 200 мкл, предпочтительно от 1 до 10 мкл фармацевтической композиции вируса и фармацевтически приемлемого пригодного носителя или разбавителя. Однако для некоторых видов использования онколитической терапии также можно использовать более крупные объемы вплоть до, но не ограничиваясь, 10 мл, в зависимости от опухоли и участка инокуляции.
Описанные пути введения и дозы предназначены только в качестве руководства, поскольку квалифицированный специалист может легко определить оптимальный путь введения и дозировки. Дозировку можно определить в соответствии с различными параметрами, особенно в соответствии с локализацией опухоли, размером опухоли, возрастом, массой и состоянием пациента, подлежащего лечению, и пути введения. Дозировку и частоту дозирования можно сначала оптимизировать преклинически посредством изучения свойств вируса в культуре тканей и в пригодной животной модели.
Для получения фармацевтической композиции вирус можно скомбинировать с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Пригодным носителем для большинства вирусов будет забуференный физиологический раствор, такой как фосфатно-буферный солевой раствор (PBS). Фармацевтическая композиция будет идеально составлена, чтобы сделать возможным введение соответствующей дозы вируса в объеме вплоть до 1 мл, хотя могут быть случаи, когда вводят объем вплоть до 10 мл. В случаях, когда объемы опухолевого поражения индивида считаются слишком маленькими для лечения оптимальной дозой, возможно, что оптимальную дозу вводят в виде лечения множественных поражений, и каждую вводят в виде части общей оптимальной дозы. Также предусматривается, что для получения эффективного противоопухолевого ответа может потребоваться несколько доз. Интервал между дозами может быть определен на основе данных эффективности, полученных на доклинических моделях, или из клинического опыта, полученного с аналогичным штаммом вируса.
Предпочтительно вирус вводят посредством инъекции непосредственно в опухоль. Вирус также можно вводить системно или посредством инъекции в кровеносный сосуд, кровоснабжающий опухоль. Вирус также можно вводить в виде интравезикальной обработки; как можно было бы использовать для лечения рака мочевого пузыря. Оптимальный путь введения будет зависеть от размера опухоли.
В одном варианте осуществления способ представляет собой способ лечения индивида, имеющего новообразование, включающий введение эффективного количества модифицированного онколитического вируса, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент галактозилтрансферазу.
Таким образом, онколитические вирусы настоящего изобретения могут быть составлены для введения, например, посредством инъекции, ингаляции или инсуффляции (через рот либо через нос) или посредством перорального, буккального, парентерального или ректального введения.
B) Показания
В конкретных вариантах осуществления онколитические вирусы, пригодные для настоящих способов, можно вводить больному с раком простаты, молочной железы, легкого, печени, эндометрия, мочевого пузыря, ободочной кишки или шейки матки; аденокарциномой; меланомой; лимфомой; глиомой или саркомами, такими как саркомы мягких тканей и костей.
В дополнительном варианте осуществления изобретение направлено на сконструированный онколитический вирус изобретения для лечения или предотвращения рака, включая, но не ограничиваясь, новообразования, опухоли, метастазы или любое заболевание или расстройство, характеризующиеся неконтролируемым ростом клеток, и в частности его полирезистентные формы. Рак может представлять собой полифокальную опухоль. Примеры типов рака и расстройств пролиферации, подлежащих лечению лекарственными средствами изобретения включают, но без ограничения, лейкоз (например, миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный, эритролейкоз, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), лимфому (например, ходжкинскую лимфому и неходжкинскую лимфому), фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, саркому Юинга, рак ободочной кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак простаты, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак, аденокарциному, почечно-клеточный рак, гепатому, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак матки, опухоль яичка, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, эпителиальный рак, глиому, астроцитому, олигодендроглиому, меланому, нейробластому, ретинобластому, дисплазию и гиперплазию. В конкретном варианте осуществления терапевтические соединения изобретения вводят пациентам с раком простаты (например, простатит, доброкачественная гипертрофия простаты, доброкачественная гиперплазия простаты (BPH), параганглиома простаты, аденокарцинома простаты, внутриэпителиальная неоплазия предстательной железы, простато-ректальные свищи и атипичные стромальные поражения простаты). В особенно предпочтительном варианте осуществления лекарственные средства настоящего изобретения используют для лечения рака, глиомы, рака печени и/или рака ободочной кишки. Лечение и/или предотвращение рака включает, но без ограничения, облегчение симптомов, ассоциированных с раком, замедление прогрессирования рака, способствование регрессии рака и способствование иммунному ответу.
В рамках изобретения, термин новообразование относится к аномальному росту ткани. Новообразование может быть доброкачественным или злокачественным. Обычно злокачественное новообразование называют раком. Виды рака отличаются от доброкачественных новообразований способностью злокачественных клеток внедряться в другие ткани либо путем прямого роста в прилежащую ткань посредством инвазии, либо посредством имплантации в отдаленные участки путем метастазирования (т.е., переносом по кровеносной или лимфатической системе).
Способы настоящего изобретения пригодны для лечения доброкачественных и злокачественных новообразований (рака).
Как определено здесь, поверхностное новообразование представляет собой новообразование, расположенное на наружной поверхности тела, которое ограничено и не распространяется на окружающие ткани или другие части тела. Внутренние новообразования расположены во внутренних органах или других внутренних частях тела. Инвазивное новообразование представляет собой новообразование, которое начинает прорастать сквозь барьеры нормальных тканей и инвазирует окружающие зоны, например, инвазивный рак молочной железы, который распространился за пределы протоков и долек.
Неисключающий список типов новообразований, рассматриваемых для лечения способом, раскрытым в настоящем описании, включает следующие категории: (a) абдоминальные новообразования, включающие перитонеальные новообразования и ретропперитонеальные новообразования; (b) новообразования костей, включающие новообразования бедра, новообразования черепа, новообразования нижней челюсти, новообразования верхней челюсти, новообразования нижней челюсти, новообразования неба, новообразования носа, новообразования глазницы, новообразования основания черепа и новообразования позвоночника; c) новообразования молочной железы, включающие новообразования грудной железы у мужчин, карцинома протоков молочной железы и филлоидную опухоль; (d) новообразования пищеварительной системы, включающие новообразования желчевыводящих путей, новообразования желчных протоков, новообразования общего желчного протока, новообразования желчного пузыря, новообразования желудка и кишечника, новообразования пищевода, новообразования тонкой кишки, новообразования слепой кишки, новообразования червеобразного отростка, колоректальные новообразования, аденоматозный полипоз толстой кишки, колоректальный синдром Гарднера, новообразования толстой кишки, аденоматозный полипоз толстой кишки, синдром Гарднера толстой кишки, новообразования сигмовидной кишки, врожденные неполипозные колоректальные новообразования, новообразования прямой кишки, новообразования ануса, новообразования двенадцатиперстной кишки, новообразования подвздошной кишки, новообразования тощей кишки, новообразования желудка, новообразования печени, гепатоцеллюлярную аденому, гепатоцеллюлярную карциному, новообразования поджелудочной железы, аденому островковых клеток, инсулиному, карциному островковых клеток, гастриному, глюкагоному, соматостатиному, випому, карциному панкреатического протока, и перитонеальные новообразования; (e) новообразования эндокринных желез, включающие новообразования надпочечников, новообразования коры надпочечников, адренокортикальную аденому, адренокортикальную карциному, множественные эндокринные неоплазии, множественные эндокринные неоплазии типа 1, множественные эндокринные неоплазии типа 2a, множественные эндокринные неоплазии типа 2b, новообразования яичников, гранулезоклеточную опухоль, лютеому, синдром Мейгса, опухоль яичников из клеток Сертоли-Лейдига, текому, новообразования поджелудочной железы, паранеопластические эндокринные синдромы, новообразования паращитовидных желез, новообразования гипофиза, синдром Нельсона, новообразования яичек, опухоль яичек из клеток Сертоли-Лейдига и новообразования щитовидной железы (f) новообразования глаза, включая новообразования конъюнктивы, новообразования глазницы, новообразования сетчатки, ретинобластому, новообразования сосудистой оболочки глазного яблока, новообразования собственно сосудистой оболочке глаза и новообразования радужной оболочки; (g) новообразования головного мозга, головы и шеи, включающие новообразования пищевода, новообразования лица, новообразования века, новообразования рта, новообразования десен, пероральную лейкоплакию, волосистую лейкоплакию, новообразования губ, новообразования неба, новообразования слюнных желез, новообразования околоушной слюнной железы, новообразования подъязычной слюнной железы, новообразования подчелюстной слюнной железы, новообразования языка, оториноларингологические новообразования, новообразования уха, новообразования гортани, новообразования носа, новообразования околоносовых синусов, новообразования верхнечелюстных синусов, новообразования глотки, гипофарингеальные новообразования, новообразования носоглотки, новообразования ротоглотки, новообразования миндалин, новообразования паращитовидных желез, новообразования щитовидной железы и новообразования трахеи; (h) гематологические новообразования, включающие новообразования костного мозга; (i) новообразования нервной системы, включающие новообразования центральной нервной системы, новообразования головного мозга, новообразования желудочков мозга, новообразования сосудистого сплетения, папиллому сосудистого сплетения, субтенториальные новообразования, новообразования ствола мозга, новообразования желудочка, нейроцитому, пинеоцитому, супратенториальные новообразования, новообразования гипоталамуса, новообразования гипофиза, синдром Нельсона, новообразования черепно-мозговых нервов, новообразования зрительного нерва, глиому зрительного нерва, невриному слухового нерва, нейрофиброматоз 2, паранеопластические синдромы нервной системы, миастенический синдром Ламберта-Итона, энцефалит с поражением лимбической системы, поперечный миелит, паранеопластическую мозжечковую дегенерацию, паранеопластическую полинейропатию, новообразования периферической нервной системы, новообразования черепно-мозговых нервов, невриному слухового нерва и новообразования зрительного нерва; (j) новообразования таза; (k) новообразования кожи, включающие акантому, новообразования сальных желез, новообразования потовых желез и базальноклеточный рак; (l) новообразования мягких тканей, включающие новообразования мышц и сосудистые новообразования; (m) новообразования селезенки; (n) новообразования грудной полости, включающие новообразования сердца, новообразования средостения, новообразования дыхательной системы, новообразования бронхов, новообразования легкого, бронхогенную карциному, немелкоклеточный рак легкого, солитарные бессимптомные округлые тени в легких, синдром Панкоста, бластому легкого, склерозирующую гемангиому легкого, новообразования плевры, злокачественный экссудат в плевральной полости, новообразования трахеи, новообразования вилочковой железы, и тимому; (o) урогенитальные новообразования, включающие новообразования женских половых органов, новообразования фаллопиевых труб, новообразования матки, новообразования шейки матки, новообразования эндометрия, эндометриоидную карциному, эндометриальные стромальные опухоли, эндометриальную стромальную саркому, новообразования влагалища, новообразования вульвы, новообразования мужских половых органов, новообразования полового члена, новообразования простаты, новообразования яичек, урологические новообразования, новообразования мочевого пузыря, новообразования почек, почечно-клеточный рак, нефробластому, синдром Дениса-Драша, синдром WAGR, мезобластную нефрому, новообразования мочеточников и новообразования мочеиспускательного канала; (p) и дополнительные виды рака, включающие карциному почки, рак легкого, меланому, лейкоз, пищевод Барретта, метаплазия предраковых клеток.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить отдельно или в комбинации с другими типами стратегий лечения рака (например, лучевая терапия, химиотерапия, гормональная терапия, иммунотерапия и противоопухолевые агенты). Примеры противоопухолевых агентов включают, но без ограничения, цисплатин, ифосфамид, паклитаксел, таксаны, ингибиторы топоизомеразы I (e. g., CPT-11, топотекан, 9-AC и GG-211), гемцитабин, винорелбин, оксалиплатин, 5-фторурацил (5-FU), лейковорин, винорелбин, темодал и таксо.
Чтобы дополнительно проиллюстрировать изобретение, предоставлены следующие неограничивающие примеры.
Пример 1: Описание предварительных исследований экспрессии альфа-gal-эпитопов на опухолевых клетках путем трансдукции аденовирусным вектором, содержащим ген α1,3GT
Индуцирование экспрессии альфа-gal эпитопов (Gal-альфа1-3Gal-beta1-4GlcNAc-R) на опухолевых клетках человека была ранее изучено посредством трансдукции репликативно-дефектного аденовирусного вектора, который содержит ген α1,3GT, как подробно описано у Deriy et al. Glycobiology 2002, 12: 135-144. С этой целью открытую рамку считывания (ORF) мышиной кДНК альфа-1,3GT вставили в репликационно-дефектный аденовирусный вектор, в котором были удалены ранние гены E1 и E3. Это было достигнуто посредством использования челночной плазмиды pAd, содержащей альфа кДНК 1,3GT, которая допускает гомологичную рекомбинацию кДНК в репликационно-дефектный аденовирусный вектор. В этой плазмиде ген α1,3GT вставляли после промотора цитомегаловируса (CMV), который является весьма эффективным промотором в клетках млекопитающих. Полученный аденовирусный вектор, содержащий вставленный мышиный ген α1,3GT под промотором CMV, был передан в клеточную линию почки человека 293 (ATCC), которая содержит комплементирующий вирусный ген E1. Выделенный вирусный клон оценили на наличие кДНК α1,3GT, которая продуцирует каталитически активный фермент, посредством трансдукции клеток 293 и анализа экспрессии альфа-gal эпитопа спустя 24 ч посредством проточной цитометрии после связывания IB4 Bandeiraea simplicifolia (BS-лектин). BS-лектин специфически связывается с альфа-gal эпитопами.
Репликативно дефектный аденовирус, контактирующий с геном α1,3GT, был обозначен AdαGT и дополнительно передан клеточной линии 293, которая содержит комплементирующий вирусный ген E1. Концентрацию AdαGT определяли в виде единиц множественности заражения (MOI) и определяли как наибольшее разбавление аденовирусного вектора, который демонстрирует цитопатическое действие в клетках 293 через 6 дней после инфицирования. Способность AdαGT индуцировать синтез и экспрессию альфа-gal эпитопов на опухолевых клетках человека исследовали на клеточной линии HeLa карциномы шейки матки человека, в которой, подобно другим злокачественным или нормальным клеткам человека, отсутствуют альфа-gal эпитопы.
Трансдукция клеток HeLa привела к немедленному проникновению в каждую клетку ~20 копий AdαGT. Появление мРНК α1,3GT, происходящей из AdαGT, определяли посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR) с применением прямых и обратных праймеров, специфичных для мышиного гена α1,3GT (5'-ATGAATGTCAAGGGAAAAG-3' (SEQ ID NO: 1) и 3'-TCAGACATTATTTCTAACCA-5' (SEQ ID NO: 2)). На основании данного анализа мРНК α1,3GT была обнаружена в цитоплазме клеток HeLa через 4 ч после трансдукции. Фактическое появление фермента α1,3GT в цитоплазме определяли посредством каталитической активности данного фермента. α1,3GT переносит галактозу от донора сахара UDP-Gal к девяти терминальным остаткам N-ацетиллактозамина на N-связанных углеводных цепях белка асиалофетуина, покрывающего лунки для ELISA. Синтезированные de novo альфа-gal эпитопы идентифицировали посредством ELISA с моноклональным анти-Gal антителом M86 (Galili et al. Transplantation, 65:1129-1132, 1998). Посредством применения данного анализа каталитическую активность α1,3GT сначала определили в трансдуцированных клетках HeLa через 6 ч (см. хронологию на Фигуре 3). Первоначальное появление α-gal эпитопов определяли посредством чувствительного анализа связывания моноклонального анти-Gal M86 антитела, называемого анализ ингибирования ELISA, который измеряет число альфа-gal эпитопов на клетку (Galili et al., supra). Посредством применения данного анализа экспрессии альфа-gal эпитопов на поверхности клетки HeLa определили гликоконъюгаты через 10 ч после трансдукции на уровне 6×104/клетка. В течение 48 ч после трансдукции число экспрессированных альфа-gal эпитопов повысилось до 2×106 эпитопов/клетка. (Фигура 3).
Поскольку AdαGT является репликативно-дефектным и не может пролиферировать в делящихся клетках, каждое клеточное деление трансдуцированных клеткок HeLa приводит к снижению числа копий α1,3GT на 50%. Соответственно, уменьшается экспрессия альфа-gal эпитопов на поверхности клеток, так что в течение 2 недель после трансдукции альфа-gal эпитопы на клетках не выявляются, и ген α1,3GT в клетках не определяется.
Пример 2: Экспрессия альфа-gal эпитопов на клетках меланомы B16-BL6, трансдуцированных аденовирусным вектором, содержащим ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы
С целью достижения введения гена альфа 1,3-галактозилтрансферазы в клетки, данный ген вставляли в репликационно-некомпетентный аденовирусный вектор, как описано ранее (Deriy et al. Glycobiology 2002, 12: 135). Полученный в результате вектор обозначили AdαGT, и он является весьма эффективным в индукции экспрессии альфа-gal эпитопов на опухолевых клетках человека (Deriy L et al., supra). Экспрессию альфа-gal эпитопов определяли на трансдуцированных AdαGT клетках меланомы B16-BL6. Эти клетки являются субклоном меланомы B16 и называются клетки BL6. Трансдукция клеток BL6 AdαGT приводит к внутриклеточной выработке альфа1,3-галактозилтрансферазы, которую кодирует ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы в трансдуцирующем AdαGT. Экспрессию альфа-gal эпитопов de novo на глюкоконъюгатах клеточной поверхности после синтеза этого эпитопа альфа 1,3-галактозилтрансферазой оценивали через 48 часов после трансдукции. Альфа-gal эпитопы определяли посредством связывания лектина IB4 Bandeiraea (Griffonia) simplicifolia (BS-лектин - лектин, специфичный для α-gal эпитопов), что измеряли посредством проточной цитометрии и посредством связывания анти-Gal антитела с трансдуцированными клетками, что измеряли посредством ELISA. Клетки BL6, трансдуцированные AdαGT (называемые клетки BL6AdαGТ) демонстрировали значительное изменение после связывания BS-лектина, что измерено посредством проточной цитометрии, по сравнению с клетками B16, трансдуцированными контрольным «пустым» аденовирусом, в котором отсутствует вставка гена альфа1,3-галактозилтрансферазы (называемых клетками BL6Adcont) (Фигура 4A). В дополнение, ~15% клеток BL6AdαGТ демонстрировали гораздо более высокую степень связывания лектина, чем остальная часть популяции, указывая на то, что эти клетки экспрессируют альфа-gal эпитопы в большом количестве эпитопов на клетку.
Способность мышиного анти-Gal IgG связываться с альфа-gal эпитопами на клетках BL6AdαGТ была продемонстрирована посредством ELISA (Фигура 4B). клетки BL6cont или клетки BL6AdαGТ прикрепляли к лункам для ELISA посредством высушивания. В дальнейшем в лунки добавляли сыворотку, содержащую анти-Gal IgG, в серийных двукратных разведениях, и связывание анти-Gal IgG определяли посредством связывания пероксидазы хрена (HRP), конъюгированной с козьим антимышиным IgG антителом. Значения неспецифического связывания IgG были вычтены путем параллельного измерения связывания IgG с лунками, покрытыми нетрансдуцированных клетками BL6. Анти-Gal легко связывались с клетками BL6AdαGТ даже при серийном разведении 1:128, тогда как в лунках, покрытых клетками BL6Adcont, связывание не наблюдалось при любом серийном разведении (Фигура 4B).
Пример 3: Эффективность клеток BL6AdαGТ в получении защитного противоопухолевого иммунного ответа
Эффективность трансдуцированных AdaGT опухолевых клеток в качестве вакцин исследовали на мышах, нокаутированных по альфа 1,3-галактозилтрансферазе, как подробно описано у Deriy et al. Cancer Gene Therapy 12: 528-539, 2005). В качестве модели опухоли служили клетки B16-BL6. Мышей, продуцирующих анти-Gal, вакцинировали 2×106 облученных клеток BL6AdaGТ или 2×106 облученных клеток BL6, которые были трансдуцированы контрольным родительским аденовирусным вектором с отсутствием гена альфа 1,3-галактозилтрансферазы. Последние клетки, называемые BL6Adcont, не экспрессировали альфа-gal эпитопы и служили для иммунизации контрольных мышей. Через одну неделю иммунизацию повторили. Через одну неделю после второй иммунизации мышей заражали подкожно 0,2×106 или 0,5×106 живых клеток BL6. В течение 2 месяцев проводили мониторинг развития опухоли. Две трети мышей, иммунизированных клетками BL6AdαGТ и зараженных 0,2×106 нетрансдуцированных родительских клеток BL6, были защищены от заражения, тогда как в контрольной группе опухоль не развивалась только у 20% (Фигура 5A). Когда мышей заражали более высмокими дозами, составляющими 0,5×106 живых клеток BL6, у одной трети мышей, иммунизированных клетками BL6AdaGТ, развивалась защита от заражения опухолью, тогда как у всех контрольных мышей, вакцинированных клетками BL6, трансдуцированными контрольным вирусом Adcont, опухоль развивалась в течение 25 дней после заражения клетками BL6 (Фигура 5B). Эти результаты означают, что трансдуцированные AdaGT опухолевые клетки, экспрессирующие альфа-gal эпитопы, могут служить в качестве противоопухолевых вакцин, которые эффективно определяют мишень для антигенпрезентирующих клеток и таким образом, могут индуцировать иммунный ответ против таких же опухолевых клеток, у которых отсутствуют альфа-gal эпитопы.
Пример 4: Кинетика экспрессии альфа-gal эпитопа по сравнению с цитолизом в опухолевых клетках, инфицированных вирусом герпеса, содержащим ген α1,3GT (HSVαGT)
Цель этого эксперимента состоит в определении in vitro хронологии экспрессии альфа-gal эпитопов на опухолевых клетках человека и мыши после инфицирования клеток онколитическим вирусом герпеса, содержащим ген α1,3GT (HSVαGT). Этот анализ потребовался с целью с целью подтверждения того, что экспрессия альфа-gal эпитопов на инфицированных клетках возникает перед цитолизом клеток этим онколитическим вирусом. Предполагается, что после того, как альфа-gal эпитопы экспрессируются на клеточных мембранах, они будут связываться с натуральным анти-Gal антителом даже после того, как клетки лизируются онколитическим вирусом HSVαGT. Иммунные комплексы, образованные между анти-Gal и фрагментированными мембранами опухолевых клеток (из-за лизиса клеток), будут эффективно выделяться для поглощения APC, такими как дендритные клетки и макрофаги, как результат взаимодействия между Fc-фрагментом анти-Gal антитела иммунокомплекса и Fcγ-рецепторами (FcγR) на APC (см. Фигуры 1 и 2). Для получения HSVαGT ген α1,3GT ниже промотора CMV амплифицируется ПЦР из репликативно-дефектного вируса AdαGT, описанного выше и у Deriy et al. 2002, supra. Ген ниже промотора CMV вставляется в онколитический HSV, и суспензию полученных в итоге HSVαGT получают посредством передачи в клетки HeLa в соответствии со способами, известными квалифицированными специалистами в данной области.
Экспрессию альфа-gal эпитопов определяют на HSVαGT инфицированных клетках меланомы B16F10 (B16) мышей и на клетках HeLa карциномы шейки матки человека. Исследование с мышиными клетками меланомы требуется для определения последующей выполнимости исследования in vivo с этими клетками у мышей. Меланома B16 является единственной известной клеточной линией опухолевых клеток мыши, которая не имеет альфа-gal-эпитопов и, таким образом, имитирует опухолевые клетки человека в отсутствие этого углеводного эпитопа. Исследование с клетками HeLa требуется для подтверждения предположения, что экспрессия альфа-gal эпитопа в опухолевых клетках человека, инфицированных HSVαGT, возникает перед цитолизом клеток этим вирусом. Исследование описано для клеток B16, но также является идентичным для клеток HeLa.
Суспензию вируса HSVαGT добавили к монослою клеток B16 в концентрации 1×106-2×107 БОЕ (бляшкообразующих единиц)/мл. Инфицированные клетки отделяли каждые 2 часа и определяли экспрессию гена α1,3GT вируса посредством обнаружения мРНК α1,3GT. Эту мРНК определяли посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR) с применением прямых и обратных праймеров, специфичных для мышиного гена α1,3GT (5'-ATGAATGTCAAGGGAAAAG-3' (SEQ ID NO: 1) и 3′-TCAGACATTATTTCTAACCA-5' (SEQ ID NO: 2)), как описано для AdαGT выше. Первоначальное появление фермента α1,3GT в цитоплазме инфицированных клеток определяли посредством каталитической активности этого фермента при ELISA с использованием асиалофетуина в качестве акцептора для фермента, а UDP-Gal использовали в качестве донора сахара. Асиалофетуин дополнительно функционирует в качестве твердофазного антигенного покрытия лунок для ELISA. Синтезированные de novo альфа-gal эпитопы идентифицировали посредством ELISA с моноклональным анти-Gal антителом M86 (Galili, 1998, supra). Последующее появление альфа-gal эпитопов определяли посредством связывания лектина IB4 Bandeiraea (Griffonia) simplicifolia (BS-лектин - лектин, специфичный для альфа-gal эпитопов), которое измеряют посредством проточной цитометрии и посредством связывания анти-Gal с инфицированными клетками, обработанными с покрытием ELISA высушенными клетками в лунках для ELISA. Экспрессию альфа-gal эпитопа дополнительно определяли количественно посредством чувствительного анализа связывания моноклонального анти-Gal M86 антитела, называемого анализ ингибирования ELISA, который измеряет число альфа-gal эпитопов на клетку (Galili et al. 1998, supra). В качестве контроля для инфицирования вирусом использовали «пустой» HSV (т.е. вирус с отсутствующим геном α1,3GT).
Продолжали проводить мониторинг культур клеток микроскопически на цитолиз с целью определить период после инфицирования, при котором клетки подвергаются цитолизу.
Пример 5: Эффективность HSVαGT в качестве онколитического вируса in situ
Эффективность HSVαGT в качестве онколитического вируса и в качестве средства для создания защитного противоопухолевого иммунитета против ряда опухолеассоциированных антигенов (TAA) определяли в соответствии с исследованиями (Galili et al. J Immunol.; 178: 4676-87, 2007; Abdel-Motal et al. Cancer Immunol Immunother.;58: 1545-55, 2009.). Данные исследования выполнены на мышах, нокаутированных по альфа 1,3-галактозилтрансферазе, продуцирующих анти-Gal антитела. В качестве модели опухоли служили клетки B16. Продуцирующим анти-Gal мышам, нокаутированным по альфа 1,3-галактозилтрансферазе, в правую боковую область живота подкожно вводили 1×106 клеток B16. В результате этой инъекции клетки B16 за 5-6 дней развивались в меланомное опухолевое поражение диаметром 4-5 мм. HSVαGT в количестве, варьирующем между 103 и 106 БОЕ в объеме 0,1 мл вводили в опухоли посредством инъекции. Онколитический HSV с отсутствующим геном α1,3GT («пустой» HSV) использовали в качестве контрольного вируса, неспособного индуцировать экспрессию α-gal эпитопов. Динамическое наблюдение за мышами на исчезновение опухолевого поражения проводили в течение 2 месяцев. Мышей с опухолями, достигшими диаметра 20 мм, умервщляли. Количество HSVαGT, которое в два раза превышало количество, указывающее на полное устранение опухоли (т.е. 100% онколизис) определяли и использовали для дальнейших исследований, оценивающих защитный противоопухолевый иммунный ответ, вызванный этим лечением. Сравнение с контрольным HSV, не имеющим ген α1,3GT, определяло, является ли HSVαGT более или менее эффективным в индуцировании онколизиса, чем контрольный вирус.
Пример 6: Эффективность инфицированных HSVαGT поражений в получении защитного противоопухолевого иммунного ответа против отдаленных метастазов
Продуцирующим анти-Gal мышам, нокаутированным по альфа 1,3-галактозилтрансферазе, в правую боковую область живота подкожно вводили 1×106 клеток B16, а в левую боковую область вводили 1×104, 1×105 или 1×106 клеток B16. Развитие опухоли в левой боковой области представляет отдаленный метастаз, который может не развиваться в опухолевое поражение, если инъекция HSVαGT в правую боковую область превращает ее в вакцину, которая вызывает системный защитный противоопухолевый ответ. Когда опухоль в правой боковой области достигала размера (диаметра) 4-5 мм (в пределах 5-6 дней), в нее вводили посредством инъекции 0,1 мл суспензии HSVαGT в количестве, которое дважды превышало количество, которое индуцирует 100% цитолиз меланомного поражения. Онколитический HSV, не имеющий вставленного гена α1,3GT, использовали в качестве контрольного вируса, неспособного индуцировать экспрессию альфа-gal эпитопов. Динамическое наблюдение за ростом опухоли в левой боковой области проводили в течение 2 месяцев. Преобразование опухоли, в которую инъецировали HSVαGT, в вакцину, приводит к предотвращению роста отдаленных метастазов в левой боковой области в обнаруживамое поражение, когда в левую боковую область инъекционно вводят 1×104, 1×105 или 1×106 клеток B16. Предполагается, что предотвращение опухолевого роста является более эффективным (т.е. предотвращение развития большего количества опухолевых клеток в поражение в левой боковой области), когда в опухоль в правой боковой области инъекционно вводили HSVαGT, а не HSV, не имеющий гена α1,3GT.
Пример 7: Эффективность инфицированных HSVαGT поражений в получении защитного противоопухолевого иммунного ответа против заражения опухолевыми клетками
Продуцирующим анти-Gal мышам, нокаутированным по альфа 1,3-галактозилтрансферазе, в правую боковую область живота подкожно вводили 1×106 клеток B16. Когда опухоль в правой боковой области достигала размера (диаметра) 4-5 мм (в пределах 5-6 дней), в нее вводили посредством инъекции 0,1 мл суспензии HSVαGT в количестве, которое дважды превышало количество, которое индуцирует 100% цитолиз меланомного поражения. В качестве контрольного вируса, не способного индуцировать экспрессию альфа-gal эпитопов, использовали онколитический HSV, не имеющий вставленного гена α1,3GT. Через три недели после инъекции онколитического вируса в поражение в правой боковой области в левую боковую область инъекционно вводили 0,3×106, 1×106, 3×106 или 10×106 клеток B16 в качестве опухолевого заражения. Индуцирование защитного противоопухолевого иммунного ответа как результат инъекции HSVαGT в область в правой боковой области (которая преобразует опухоль в вакцину) приводит к предотвращению развития заражающих опухолевых клеток в левой боковой области в опухолевое поражение. Предотвращение опухолевого роста является более эффективным (т.е. предотвращение развития большего количества заражающих опухолевых клеток в поражение), когда в опухоль в правой боковой области инъекционно вводят HSVαGT, а не HSV, не имеющий ген α1,3GT.
Пример 8: Выработка и Эффективность репликационно-компетентного онколитического аденовируса, который кодирует функциональный ген альфа 1,3-галактозилтрансферазы
Настоящее исследование описывает выработку Ad5/3-Δ24-αGT CRAd (CRAd-αGT), в котором ген E3 был замещен мышиным геном альфа 1,3-галактозилтрансферазы (α1,3GT). α1,3GT синтезирует углеводный антиген галактоза-альфа-1,3-галактозил-бета-1,4-N-ацетил-глюкозамин-R (альфа-gal). Когда вирус реплицируется, белок α1,3GT продуцируется наряду с вирусными белками, белок αGT в последующем катализирует продукцию альфа-gal. Анти-Gal антитела образуют комплекс с альфа-gal клеточной поверхности, способствуя иммунной активации и поглощению иммунных комплексов антигенпрезентирующими клетками.
Материалы и Способы
Клеточные линии
Клеточные линии A549 (рака легкого человека) и A375 (меланомы человека) были куплены у Европейской коллекции клеточных культур (ECCAC). Клетки A549 сохраняли в F-12K+10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки A375 сохраняли в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM)+10% фетальной бычьей сыворотки. Обе клеточные линии инкубировали при 37°C и 5% CO2.
Получение вируса
Получение вируса осуществлялось по контракту Imanis Life Sciences (Rochester, Minneapolis, US). Конструирование вируса проводили с применением общепринятых челночных и больших аденовирусных плазмид и способов рекомбинантной ДНК, точно как подробно описано (Danthinne and Werth, 2000; Danthinne, 2001). С целью создания CRAd-αGT, 1,1 Kb мышиного гена α1,3GT (GenBank учетный номер M85153) синтезировали посредством методик интегрированной ДНК (IDT) и клонировали в челночный вектор Ad5 E3 с промотором CMV 5' последовательности α1,3GT. В космиде, кодирующей геном Ad5, с последовательностью knob фибера, замещенной последовательностью Ad3, последовательность 24-bp, кодирующая аминокислотную последовательность LTCHEAGF (SEQ ID NO: 3), была удалена из области E1a. Последовательность E3 была удалена из космиды Ad5/3 и заменена на последовательность CMV-αGT, субклонированную из челночного вектора. Для создания контроля, CRAd, последовательность, кодирующую зеленого флуоресцентного белка (GFP), синтезировали с помощью IDT и клонировали в челночный вектор Ad5 E1 с промотором CMV 5' последовательности GFP. E1 последовательность была удалена из космиды Ad5/3 и заменена на последовательность CMV-GFP последовательность, субклонированную из челночного вектора. Область E3 была удалена. Структуры химерного вируса показаны на Фигуре 6.
Клетки HEK 293 трансфицировали химерными вирусными космидами и после 48 часов инкубации готовили необработанные лизаты. Для амплификации вируса клетки HEK 293 засеяли в 15 см планшеты и инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO2. На следующий день клетки инфицировали необработанным лизатом из инфицированных вирусом клеток и инкубировали в течение 48 часов при 37°C, 5% CO2, после чего собирали клетки и супернатант.
Вирусные частицы высвобождали из инфицированных клеток посредством трех циклов замораживания-оттаивания и освобождали от клеточного супернатанта посредством осаждения сульфатом аммония (Schagenetal., 2000). Очищение вируса выполняли посредством центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия (CsCl). Кратко, препарат необработанного вируса загружали в двухэтапный градиент CsCl в пробирку центрифуги Бекмана SW28 и центрифугировали в течение 2 часов при 20000 об/мин. Полосу вируса собирали и загружали в непрерывный градиент CsCl и снова центрифугировали. Полученную полосу вируса собирали и тотчас диализировали в 4×0,5 л буфера GTS (2,5% глицерин, 25 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl pH 8,0) в течение 18 часов при 4°C. Приблизительно 1 мл диализированной суспензии вируса собирали и фильтровали через 0,22 мкм мембрану Supor (Pall), затем замораживали при -70°C.
Концентрацию вируса определяли, используя способ OD260-SDS и коэффициент экстинкции, составляющий 1,1×1012 вирусных частиц (ВЧ) на поглощение 260 единиц в присутствии SDS. Было обнаружено, что концентрации вируса составляют 3,6×1012 ВЧ/мл для CRAd-αGT и 2,9×1012 ВЧ/мл для CRAd-GFP. Чистоту препаратов вируса определяли посредством соотношений A260/A280 и A320/A260 и, как было обнаружено, они находятся в диапазоне, ассоциированном с чистым вирусом (1,2-1,4 и 0,22-0,27, соответственно) для обоих вирусов.
Титр вируса определяли посредством анализа титрования в конечной точке (TCID50) с применением общепризнанного способа Рида-Менча (ReedandMuench, 1938). Кратко, клетки HEK293 засеяли в 24-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37°C. На следующий день 10-кратно разбавленную серию очищенного CsCl вирусного маточного раствора добавили к засеянным клеткам HEK293 и клетки инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 14 дней. Лунки оценивали на наличие цитопатического действия (CPE) посредством визуальной оценки под микроскопом и подсчитывали TCID50, используя уравнение Рида-Менча (ReedandMuench,1938). Определили, что титр вируса составил 6,8×1011 TCID50/мл для CRAd-αGT и 2,7×1011 TCID50/мл для CRAd-GFP.
Определение уничтожения клеток CRAd-
α
GT
Субконфлюентные монослои клеток A549 и A375 собрали из флаконов с тканевой культурой с использованием раствора для диссоциации клеток (CDS, Sigma-Aldrich). Клетки подсчитали, используя гемоцитометр, и живые клетки отличали от мертвых посредством вытеснения трипанового синего. Клетки разбавили в среде и добавили в стерильные 96-луночные белые планшеты для тканевых культур с 90 мкл/лунку, чтобы предоставить либо 5×103, либо 1×104 клеток/лунку.
Каждый вирус разбавили 1:3 в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS)+10% FBS для предоставления рабочих маточных растворов, составляющих 1,2×1012 ВЧ/мл для CRAd-αGT и 9,67×1011 ВЧ/мл для CRAd-GFP. Рабочие маточные растворы серийно разбавляли 1 в 5 в PBS+10% FBS для получения серий титрования 1,2×1012-1,2×105 ВЧ/мл для CRAd-αGT и 9,67×1011-9,9×104 для CRAd-GFP. Серии титрования разбавляли 1:10 в планшетах для анализа (10 мкл на лунку вируса к 90 мкл посеянных клеток) и планшеты инкубировали в течение 72 часов при 37°C/5% CO2. Жизнеспособность клеток определяли с применением люминисцентного реагента для определения жизнеспособности клеток Cell Titre Glo (Promega), в соответствии с инструкциями изготовителя, и планшеты считывали на планшетном ридере EnVision 2102 (Perkin Elmer). Относительные единицы люминисценции (RLU) наносили на график против log вирусных частиц/мл.
Для визуализации цитолитического действия вируса CRAd-αGT клетки A549 и A375 засеивали в чистые 96-луночные или 24-луночные планшеты, как подробно описано выше и ниже, и инфицировали различными разбавлениями CRAd-αGT и CRAd-GFP, вновь подробно описанными выше и ниже, оценивали под световым микроскопом. Изображения клеток были сделаны с YenCam 10 (Yenway) и поддерживающим программным обеспечением.
Определение связывания анти-Gal с раковыми клетками человека, инфицированными CRAd Ad5/3-
Δ
24-
α
GT
Клетки A549 и A375 собрали из флаконов с культурами тканей, как описано выше. После подсчета клетки разбавляли в культуральной среде и добавляли в 24-луночные планшеты с тканевой культурой в объеме 540 мкл/лунку, каждая равнялась 3×104 клеток/лунку.
Каждый вирус разбавляли 1:10000 в PBS+10% FBS (1:100 и затем 1:100) для предоставления растворов 3,6×108 ВЧ/мл для CRAd-αGT и 2,9×108 для CRAd-GFP. Эти растворы дважды разбавляли 1:25 в PBS+10% FBS для получения концентраций вируса, составляющих 1,44×107 и 5,8×105 ВЧ/мл для CRAd-αGT и 1,16×107 и 4,6×105 ВЧ/мл для CRAd-GFP. Три разведения вируса дополнительно разбавляли 1:10 на засеянные клетки (60 мкм вируса на 540 мкм клеток на лунку). Равный объем PBS+только 10% FBS добавили в лунки, служившие в качестве контроля без вирусов.
Планшеты инкубировали в течение 72 часов. В конце инкубации наличие альфа-gal антигена на поверхности инфицированных клеток определяли посредством проточной цитометрии. Инфицированные и неинфицированные (контроль без вирусов) клетки собирали из 24-луночных планшетов с использованием CDS, промывали в PBS+0,5% BSA и инкубировали с 40 мкг/мл моноклонального человеческого анти-Gal антитела M86 IgG1 (Absolute Antibody), разбавленного PBS+0,5% BSA, при 4°C в течение 1 часа. Клетки вновь промывали в PBS+0,5% BSA и инкубировали с конъюгированным с аллофикоцианином (APC) античеловеческим IgG (Biolegend), разбавляли PBS+0,5% BSA при 4°C в течение 30 минут в темноте. Клетки промывали PBS+0,5% BSA и анализировали на проточном цитометре Beckman Coulter FC500. Неокрашенные клетки использовали для установки напряжений для прямого рассеяния, бокового рассеяния и флуоресцентных каналов 1 и 4. Для испытываемых образцов регистрировали сигналы GFP (канал 1) и APC (канал 4). Для определения компенсации использовали одноцветные контроли.
Результаты
CRAd-
α
GT лизирует раковые клетки человека
Цитолитическое действие CRAd-αGT и контрольного CRAd-GFP на клетки A549 и A375 определяли количественно, используя анализ жизнеспособности клеток на основе планшетов (Фигура 7). Снижение жизнеспособности клеток наблюдали в лунках, в которых клетки, инфицированные либо CRAd-αGT, либо CRAd-GFP, зависели от концентрации вируса. Количество вирусных частиц CRAd-αGT, требуемое для снижения жизнеспособности клеток на 50%, было ниже, чем для контрольного вируса CRAd-GFP. Это соответствует титру вируса, измеренному посредством анализа TCID50 (см. раздел Материалы и Способы выше).
Цитолитическое действие CRAd-αGT у раковых клеток A549 и A375 человека визуализировали посредством световой микроскопии и сравнивали с CRAd-GFP (Фигура 8). Клетки, которые инфицировали либо CRAd-αGT, либо CRAd-GFP, и затем инкубировали в течение 72 часов, были уничтожены обоими вирусами. Неинфицированные клетки были здоровыми, без очевидного лизиса.
Клетки, инфицированные CRAd-
α
GT, связывают анти-Gal антитела
Для исследования, приводит ли инфицирование клеток CRAd-αGT к экспрессии каталитически активного белка α1,3GT и последующей экспрессии альфа-gal на поверхности клеток, связывание альфа-gal-специфических анти-Gal антител с клетками, инфицированными CRAd-αGT, определяли и сравнивали со связыванием анти-Gal антител с CRAd-GFP и неинфицированными клетками с применением проточной цитометрии (Фигура 9). Клетки, которые инфицировали CRAd-αGT, были прочно связаны с анти-Gal, но были отрицательными для экспрессии GFP. Наоборот, клетки, которые инфицировали CRAd-GFP, были отрицательными для связывания анти-Gal, но были положительными для экспрессии GFP. Неинфицированные клетки были отрицательными на анти-Gal связывание и экспрессию GFP.
Заключение
Инфицирование клеток человеческого немелкоклеточного рака легкого (A549) и меланомы (A375) CRAd-αGT привело к лизису и смерти клеток. Лизис клеток возникает как следствие репликации CRAd-αGT, который является селективным для раковых клеток вследствие делеции участка 24-bp из вирусного гена E1a (Fueyoetal.,2000).
В дополнение к лизису клеток, инфицирование раковых клеток CRAd-αGT привело к специфическому связыванию анти-Gal антител с поверхностью клеток, тогда как анти-Gal не связывается с неинфицированными или инфицированными CRAd-GFP клетками. Поскольку анти-Gal специфически связываются с альфа-gal эпитопом, авторы изобретения могут заключить, что репликация CRAd-αGT в раковых клетках приводит к экспрессии каталитически активного фермента α1,3GT, который в последующем катализирует синтез альфа-gal.
Связывание анти-Gal Антител с экспрессирующими альфа-gal погибающими опухолевыми клетками и детритом опухолевых клеток, созданных онколитическим действием вируса, будет усиливать адаптивный иммунный ответ на опухолевые неоантигены. Антигенпрезентирующие клетки (APC), несущие активирующие Fcγ-рецепторы, поглощают опухолевый клеточный детрит и мертвые клетки, образующие комплекс с анти-Gal IgG, посредством активации Fcγ-рецепторов. Активация Fcγ-рецепторов на APC приводит к активации APC, созреванию и улучшению презентирования антиген Т-клеткам (Regnaultetal., 1999; Rafiqetal., 2002; Platzeretal., 2014).
References
Bramante et al. (2015). Int.J. Cancer 137:1775-1783. Danthinne (2001). Biotechniques 30:612-6, 618-9. Danthinne and Werth (2000). Gene Ther. 7:80-7. Fueyo et al. (2000). Oncogene 19:2-12. Kanerva et al. (2013). Clin. Cancer Res. 19:2734-2744. Kanerva et al. (2003). Mol. Ther. 8:449-458. Kannoetal. (2012). Anticancer Res. 32:4891-5. Kim et al. (2013). Gynecol. Oncol. 130:518-24. Koski et al. (2010). Mol. Ther. 18:1874-84. Platzer (2014). Front. Immuno l.5:140. Rafiq et al. (2002). J. Clin. Invest. 110:71-9. Reed and Muench (1938). Am. J. Epidemiol. 27:493-497. Regnault et al. (1999). J. Exp. Med. 189:371-80. Schagen et al. (2000). Gene Ther. 7:1570-4. Sherr (1996). Science 274:1672-7. Ulasov et al. (2006). Hum. Gene Ther. 17:556-64.
--->
список последовательностей
<110> AGALIMMUNE LIMITED
<120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
<130> AGA-C-P1835PCT
<150> 1505860.5
<151> 2015-04-07
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> ДНК
<213> искуственная
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 1
atgaatgtca agggaaaag 19
<210> 2
<211> 20
<212> ДНК
<213> искуственная
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 2
tcagacatta tttctaacca 20
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> мышиный
<400> 3
Leu Thr Cys His Glu Ala Gly Phe
1 5
<---
Claims (21)
1. Онколитический вирус, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент гексозилтрансферазу, в котором фермент представляет собой фермент альфа 1,3-галактозилтрансферазу.
2. Онколитический вирус по п.1, который содержит рекомбинантный связывающий домен, специфичный для маркера стволовой опухолевой клетки.
3. Онколитический вирус по п.1 или 2, который имеет ограниченную репликацию.
4. Онколитический вирус по любому из пп.1-3, который представляет собой РНК- или ДНК-вирус человеческого или нечеловеческого происхождения, такой как аденовирус, герпесвирус, вирус коровьей оспы, вирус кори, вирус болезни Ньюкасла, автономные парвовирусы, вирус везикулярного стоматита (VSV) или реовирус.
5. Онколитический вирус по п.4, который представляет собой аденовирус.
6. Онколитический вирус по п.5, который представляет собой условно реплицирующийся аденовирус (CRAd).
7. Онколитический вирус по п.6, который представляет собой Ad5/3 химерный вирус.
8. Онколитический вирус по п.7, в котором Ad5/3 химерный вирус дополнительно содержит делецию 24 пар оснований (Δ24) в константной области 2 (CR2) вирусного гена немедленного раннего ответа (E1a) (Ad5/3-Δ24 CRAd).
9. Онколитический вирус по любому из пп.1-8, который содержит последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую альфа 1,3-галактозилтрансферазу.
10. Онколитический вирус по п.9, который представляет собой Ad5/3-Δ24-αGT CRAd (CRAd-αGT).
11. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая онколитический вирус по любому из пп.1-10 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, которая составлена для внутривенного, внутримышечного, интраперитонеального, интратуморального, подкожного, перорального, ректального, интравагинального, интраназального, чресслизистого или трансдермального введения.
13. Способ лечения индивида с новообразованием, который включает стадии i) экспрессии эндогенного фермента, доставляемого онколитическим вирусом по любому из пп.1-10 по меньшей мере в одну раковую клетку для модифицирования гликозилирования клеточной мембраны; и
ii) индуцирования лизиса по меньшей мере одной раковой клетки, возникающего в результате введения онколитического вируса.
14. Способ по п.13, в котором онколитический вирус вводят в эффективном количестве для инфицирования по меньшей мере одной раковой клетки индивида.
15. Способ по п.13 или 14, который направлен на лечение индивида с раком или индивида с опухолью.
16. Способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества онколитического вируса по любому из пп.1-10 пациенту, страдающему раком или имеющему новообразование или опухоль, нуждающемуся в лечении.
17. Применение онколитического вируса по любому из пп.1-10 или фармацевтической композиции по п.11 или 12 в лечении рака.
18. Способ по любому из пп. 13-16 или применение по п.17, в котором рак выбран из лейкоза (например, миелобластного, промиелоцитарного, миеломоноцитарного, моноцитарного, эритролейкоза, хронического миелоцитарного (гранулоцитарного) лейкоза, и хронического лимфоцитарного лейкоза), лимфомы (например, ходжкинской лимфомы и неходжкинской лимфомы), фибросаркомы, миксосаркомы, липосаркомы, хондросаркомы, остеогенной саркомы, ангиосаркомы, эндотелиосаркомы, саркомы Юинга, рака ободочной кишки, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичников, рака простаты, плоскоклеточного рака, базальноклеточного рака, аденокарциномы, почечно-клеточного рака, гепатомы, опухоли Вильмса, рака шейки матки, рака матки, опухоли яичка, рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, эпителиального рака, глиомы, астроцитомы, олигодендроглиомы, меланомы, нейробластомы, ретинобластомы, дисплазии и гиперплазии.
19. Способ получения онколитического вируса по любому из пп.1-10, который включает стадию включения нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент гексозилтрансферазу, в геном указанного онколитического вируса.
20. Способ по п.19, в котором указанная стадия включения включает клонирование.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1505860.5 | 2015-04-07 | ||
GBGB1505860.5A GB201505860D0 (en) | 2015-04-07 | 2015-04-07 | Therapeutic compositions and methods of use for treating cancer |
PCT/GB2016/050973 WO2016162675A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-04-07 | Therapeutic compositions and methods of use for treating cancer |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017134519A RU2017134519A (ru) | 2019-04-04 |
RU2017134519A3 RU2017134519A3 (ru) | 2019-10-10 |
RU2720984C2 true RU2720984C2 (ru) | 2020-05-15 |
Family
ID=53190234
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017134519A RU2720984C2 (ru) | 2015-04-07 | 2016-04-07 | Терапевтические композиции и способы применения для лечения рака |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20180104288A1 (ru) |
EP (1) | EP3280798B1 (ru) |
JP (2) | JP2018512150A (ru) |
KR (1) | KR102544032B1 (ru) |
CN (1) | CN107787364A (ru) |
BR (1) | BR112017021700A2 (ru) |
CA (1) | CA2981925A1 (ru) |
ES (1) | ES2743952T3 (ru) |
GB (1) | GB201505860D0 (ru) |
HK (1) | HK1251009B (ru) |
IL (1) | IL254842B (ru) |
MX (1) | MX2017012867A (ru) |
RU (1) | RU2720984C2 (ru) |
WO (1) | WO2016162675A1 (ru) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2971008B1 (en) | 2013-03-14 | 2018-07-25 | Salk Institute for Biological Studies | Oncolytic adenovirus compositions |
JP7015551B2 (ja) | 2016-02-23 | 2022-02-15 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現 |
JP7054527B2 (ja) | 2016-02-23 | 2022-04-14 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ |
CA3045892A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Salk Institute For Biological Studies | Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof |
CN110856724B (zh) * | 2018-08-24 | 2022-05-27 | 杭州康万达医药科技有限公司 | 包含核酸及car修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用 |
JPWO2020230838A1 (ru) * | 2019-05-14 | 2020-11-19 | ||
CN115103905A (zh) * | 2020-01-10 | 2022-09-23 | 香港大学 | 表达α-1,3-半乳糖基转移酶的重组病毒及其用途 |
CN112941039A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-06-11 | 南京大学 | 一种新型类囊泡溶瘤病毒及其在制备抗肿瘤药物上的应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030186850A1 (en) * | 2000-05-11 | 2003-10-02 | Glycozym Aps | Methods of modulating functions of polypeptide GalNAc-transferases and of screening test substances to find agents herefor, pharmaceutical compositions comprising such agents and the use of such agents for preparing medicaments |
US20050201993A1 (en) * | 2002-10-09 | 2005-09-15 | Link Charles J.Jr. | Antitumor vaccination using allogeneic tumor cells expressing alpha (1,3)-galactosyltransferase |
EA013615B1 (ru) * | 2004-11-12 | 2010-06-30 | Байер Шеринг Фарма Акциенгезельшафт | Рекомбинантный онколитический парамиксовирус и его применение |
WO2014089558A1 (en) * | 2012-12-07 | 2014-06-12 | North Carolina State University | Beta-hexosyl-transferases and uses thereof |
RU2536931C2 (ru) * | 2009-05-06 | 2014-12-27 | Фундасио Институт Д`Инвестигасио Биомедика Де Бельвитге (Идибель) | Онколитический аденовирус для лечения рака, его применение и фармацевтическая композиция, содержащая его |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9615794D0 (en) | 1996-07-26 | 1996-09-04 | Medical Res Council | Mutant herpes simplex virus strains and uses thereof |
US5998174A (en) | 1997-05-12 | 1999-12-07 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Multigene vectors |
GB9810904D0 (en) | 1998-05-20 | 1998-07-22 | Univ London | Mutant herpes simplex viruses and uses thereof |
DE60107203T3 (de) | 2000-01-21 | 2009-07-23 | Biovex Ltd. | Herpes-virusstämme für die gentherapie |
US6713055B2 (en) | 2000-11-27 | 2004-03-30 | Geron Corporation | Glycosyltransferase vectors for treating cancer |
US20030099616A1 (en) * | 2001-07-25 | 2003-05-29 | Irving John M. | Dual specificity tumor killing vectors driven by the telomerase promoter |
DE60331933D1 (de) * | 2002-10-09 | 2010-05-12 | Central Iowa Healthy System | Benutzung von alpha (1,3) -galactosyltransferase exprimierenden allogenen tumorzellen zur impfung gegen tumoren |
US7820628B2 (en) | 2005-02-22 | 2010-10-26 | University Of Massachusetts Medical School | Tumor lesion regression and conversion in situ into autologous tumor vaccines by compositions that result in anti-Gal antibody binding |
EP2085092A1 (en) * | 2008-01-29 | 2009-08-05 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Attenuated oncolytic paramyxoviruses encoding avian cytokines |
CA2836299A1 (en) * | 2011-04-15 | 2012-10-18 | Genelux Corporation | Clonal strains of attenuated vaccinia viruses and methods of use thereof |
CN105779397B (zh) * | 2014-12-22 | 2019-07-19 | 彭霞 | 溶瘤异源重组新城疫病毒及其制备方法与应用 |
-
2015
- 2015-04-07 GB GBGB1505860.5A patent/GB201505860D0/en not_active Ceased
-
2016
- 2016-04-07 ES ES16716896T patent/ES2743952T3/es active Active
- 2016-04-07 CA CA2981925A patent/CA2981925A1/en active Pending
- 2016-04-07 RU RU2017134519A patent/RU2720984C2/ru active
- 2016-04-07 MX MX2017012867A patent/MX2017012867A/es active IP Right Grant
- 2016-04-07 BR BR112017021700-7A patent/BR112017021700A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-04-07 JP JP2017552992A patent/JP2018512150A/ja active Pending
- 2016-04-07 KR KR1020177027601A patent/KR102544032B1/ko active IP Right Grant
- 2016-04-07 CN CN201680020049.0A patent/CN107787364A/zh active Pending
- 2016-04-07 US US15/564,774 patent/US20180104288A1/en not_active Abandoned
- 2016-04-07 WO PCT/GB2016/050973 patent/WO2016162675A1/en active Application Filing
- 2016-04-07 EP EP16716896.2A patent/EP3280798B1/en active Active
-
2017
- 2017-10-02 IL IL254842A patent/IL254842B/en unknown
-
2018
- 2018-08-10 HK HK18110254.0A patent/HK1251009B/zh unknown
-
2019
- 2019-11-27 US US16/698,682 patent/US12023362B2/en active Active
-
2020
- 2020-12-02 JP JP2020199987A patent/JP7066812B2/ja active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030186850A1 (en) * | 2000-05-11 | 2003-10-02 | Glycozym Aps | Methods of modulating functions of polypeptide GalNAc-transferases and of screening test substances to find agents herefor, pharmaceutical compositions comprising such agents and the use of such agents for preparing medicaments |
US20050201993A1 (en) * | 2002-10-09 | 2005-09-15 | Link Charles J.Jr. | Antitumor vaccination using allogeneic tumor cells expressing alpha (1,3)-galactosyltransferase |
EA013615B1 (ru) * | 2004-11-12 | 2010-06-30 | Байер Шеринг Фарма Акциенгезельшафт | Рекомбинантный онколитический парамиксовирус и его применение |
RU2536931C2 (ru) * | 2009-05-06 | 2014-12-27 | Фундасио Институт Д`Инвестигасио Биомедика Де Бельвитге (Идибель) | Онколитический аденовирус для лечения рака, его применение и фармацевтическая композиция, содержащая его |
WO2014089558A1 (en) * | 2012-12-07 | 2014-06-12 | North Carolina State University | Beta-hexosyl-transferases and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US12023362B2 (en) | 2024-07-02 |
US20180104288A1 (en) | 2018-04-19 |
HK1251009B (zh) | 2020-06-26 |
BR112017021700A2 (pt) | 2018-07-24 |
KR20180015113A (ko) | 2018-02-12 |
CN107787364A (zh) | 2018-03-09 |
CA2981925A1 (en) | 2016-10-13 |
JP2021045152A (ja) | 2021-03-25 |
RU2017134519A3 (ru) | 2019-10-10 |
JP2018512150A (ja) | 2018-05-17 |
IL254842A0 (en) | 2017-12-31 |
ES2743952T3 (es) | 2020-02-21 |
KR102544032B1 (ko) | 2023-06-14 |
GB201505860D0 (en) | 2015-05-20 |
JP7066812B2 (ja) | 2022-05-13 |
IL254842B (en) | 2022-01-01 |
US20200155626A1 (en) | 2020-05-21 |
WO2016162675A1 (en) | 2016-10-13 |
MX2017012867A (es) | 2018-05-11 |
EP3280798A1 (en) | 2018-02-14 |
EP3280798B1 (en) | 2019-06-19 |
RU2017134519A (ru) | 2019-04-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2720984C2 (ru) | Терапевтические композиции и способы применения для лечения рака | |
US9744224B2 (en) | Methods for treating cancer by administration of nucleic acids encoding FAP and cancer antigens | |
JP2019501205A (ja) | 腫瘍崩壊性ウイルス及びチェックポイント阻害剤の併用療法 | |
JP2014500004A (ja) | 抗ctla−4モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクター | |
JP2005521398A (ja) | 癌治療用の強力な腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス | |
KR20170098947A (ko) | 복합 면역요법을 위한 방법 및 조성물 | |
JP2021509815A (ja) | 改変ワクシニアベクター | |
Gleich | Gene therapy for head and neck cancer | |
US20230137548A1 (en) | Neural stem cell-mediated cancer treatment | |
KR100852687B1 (ko) | 튜머 네크로시스 팩터 알파를 진핵세포에서 발현하는플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는항암 치료용 조성물 | |
US20210077554A1 (en) | Methods of Neoplasm Treatment Utilizing Complementary Oncolytic Viruses and CAR T-Cells | |
JP2022521268A (ja) | 腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び使用法 | |
JP4423508B2 (ja) | 癌遺伝子治療薬 | |
KR20220116191A (ko) | 4-1bbl 아쥬반트화 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라 (mva)의 의약적 용도 | |
JP2022023978A (ja) | がんを治療するためのアデノウイルス及び化学療法剤の組合せ | |
Gdor et al. | Gene therpay for prostate cancer | |
US20240165175A1 (en) | Muc16 promoter containing virus | |
WO2008013276A1 (fr) | Agent thérapeutique pour mésothéliome malin | |
WO2022230971A1 (ja) | コロナウイルスに対する免疫応答を誘発する人工アジュバントベクター細胞、および当該細胞を含む医薬組成物、並びにそれらの使用 | |
Guinn et al. | 8th international conference on oncolytic virus therapeutics | |
Li | Improved therapeutic efficacy of decorin expressing oncolytic adenovirus driven by cancer-and tumor microenvironment-specific promoter in pancreatic cancer | |
Batra et al. | Gene Therapy for Lung Cancer | |
Center et al. | 581. A Chimeric Fusion of the Human Achaete Scute Homolog 1 (hASH1) and the Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) Promoters Is a Promising Regulator of Suicide Gene Therapy in Small Cell Lung Cancer (SCLC) | |
Howe et al. | Gene therapy for human brain tumors | |
Biotech | LOW PATHOGENIC HUMAN ENTEROVIRUSES AS NOVEL ANTI-CANCER AGENTS AGAINST MALIGNANT GLIOMA |