CN115103905A - 表达α-1,3-半乳糖基转移酶的重组病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了病毒以及由此类病毒组成和制备的疫苗，其包括编码α‑1,3‑半乳糖基转移酶(α‑1,3‑GT)的异源核酸片段，使得当病毒感染宿主细胞时该核酸片段表达α‑1,3‑GT。此类病毒产生具有α‑1,3‑半乳糖的蛋白质。α‑1,3‑半乳糖在受感染细胞的蛋白质上的存在，可以有力地刺激宿主对病毒的病毒蛋白的免疫反应，从而增强病毒作为疫苗的效果。还公开了包括此类病毒和/或由此类病毒产生的疫苗。还公开了制备和使用此类病毒和疫苗的方法，如向有需要的受试者施用所公开的疫苗，以及如制备包括由所公开的病毒表达的一种或多种病毒蛋白的疫苗。

Description

表达α-1,3-半乳糖基转移酶的重组病毒及其用途

本国际专利申请要求于2020年1月10日提交的美国临时专利申请号： 62/959,581的申请日的权益，其全部内容通过引用并入以用于所有目的。

技术领域

所公开的发明总体上属于疫苗领域，具体而言属于减毒活疫苗领域。

背景技术

流感是高度传染性疾病，对全球公共卫生产生重大影响(Krammer等人,Nat.Rev.Dis.Primers,4:3(2018))。在鸟类种群中确定了16种HA亚型和9 种NA亚型。这些HA亚型可分为2组(第1组：H1、H2、H5、H6、H8、 H9、H11、H12和H16；第2组：H3、H4、H7、H14和H15)。在这些亚型中，已知只有H1N1、H2N2和H3N2病毒会引起流行病。

人类季节性和大流行性流感的二次发作率预估分别约为15％和 33％(WorldHealth Organization，网站 who.int/csr/disease/swineflu/assess/disease_swineflu_assess_20090511/en/(2019 年7月访问))。鉴于动物流感病毒可能引发流行病的事实，迫切需要有效的“通用”策略来控制流感。在现有的控制措施中，接种疫苗是预防流感感染最有效的方法之一。当前，市面上可供人使用的流感疫苗主要有两大类，即灭活疫苗和减毒活疫苗(Rajao和Perez,Front.Microbiol.,9:123(2018)；Paules等人,N.Engl.J.Med.,378:7-9(2018))。

然而，当前的商业疫苗通常具有对漂移的抗原变体较差的疫苗有效性和短期的疫苗诱导的保护。此外，当前可用的疫苗都没有设计以诱导针对不同动物流感亚型的广泛交叉保护性免疫反应，而这是“通用流感疫苗”的关键特征。

仍然需要开发有效和安全的“通用”流感疫苗。还需要提供有效和安全的“通用”流感疫苗的策略。

因此，本发明的一个目的是提供用于预防病毒感染如流感、水痘、麻疹、呼吸道合胞病毒、传染性单核细胞增多症和单纯疱疹病毒感染的改进疫苗。

本发明的另一个目的是提供病毒疫苗，其能够提供更强和更持久的保护，尤其是对于免疫反应不佳的高风险人群。

本发明的另一个具体目的是提供改进的流感疫苗。

发明概述

公开了病毒以及由此类病毒组成和制备的疫苗，其包括编码α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-GT)的异源核酸片段，使得当病毒感染宿主细胞时该核酸片段表达α-1,3-GT。此类病毒产生具有α-1,3-半乳糖的蛋白质。α-1,3-半乳糖在受感染细胞的蛋白质上的存在，可以有力地刺激宿主对病毒的病毒蛋白的免疫反应，从而增强病毒作为疫苗的效果。还公开了包括此类病毒和/或由此类病毒产生的疫苗。还公开了制备和使用此类病毒和疫苗的方法，如向有需要的受试者施用所公开的疫苗，以及如制备包括由所公开的病毒表达的一种或多种病毒蛋白的疫苗。

公开了包括编码α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-GT)的异源核酸片段的病毒，使得当病毒感染宿主细胞时，该核酸片段表达α-1,3-GT。通常，当此类病毒感染宿主细胞时，α-1,3-GT的表达导致受感染宿主细胞中的蛋白质具有α-1,3-半乳糖。例如，在某些形式中，当病毒感染宿主细胞时，至少一种暴露于宿主细胞表面上的蛋白质将具有α-1,3-半乳糖。还公开了包括此类病毒和 /或由此类病毒产生的疫苗。还公开了制备和使用此类病毒和疫苗的方法。编码α-1,3-GT的异源核酸片段可以是(或被认为是)编码α-1,3-GT的基因或基因的编码部分。当病毒感染宿主细胞时，该核酸片段/基因通常应该能够表达 (配置以表达)α-1,3-GT，使得当病毒感染宿主细胞时病毒表达α-1,3-GT。

在一些形式中，当病毒感染宿主细胞时由病毒表达的至少一种病毒蛋白将具有α-1,3-半乳糖。在一些形式中，病毒是活的和减毒的。在一些形式中，将核酸片段引入病毒的基因组中。

在一些形式中，将核酸片段以框内方式引入病毒的病毒编码区的阅读框。在一些形式中，将核酸片段紧接在病毒的病毒编码区的阅读框的终止密码子之前引入。在一些形式中，病毒进一步包含在核酸片段和病毒的病毒编码区之间编码的蛋白酶切割位点。

在一些形式中，病毒是流感病毒。在一些形式中，将核酸片段以框内方式引入病毒的神经氨酸酶(NA)编码区的阅读框。在一些形式中，将核酸片段紧接在病毒NA编码区的阅读框的终止密码子之前引入。在一些形式中，病毒进一步包含在核酸片段和病毒的NA编码区之间编码的蛋白酶切割位点。在一些形式中，蛋白酶切割位点包含在2A自切割肽中。在一些形式中，2A 自切割肽衍生自猪捷申病毒(teschovirus)-1。在一些形式中，2A自切割肽侧接短肽接头。在一些形式中，肽接头是GSG。

在一些形式中，α-1,3-GT是哺乳动物α-1,3-GT。在一些形式中，α-1,3- GT是小鼠α-1,3-GT。

在一些形式中，病毒通过以下方式减毒：在培养的细胞中连续传代、在异源宿主动物中连续传代、病毒中的基因缺失、病毒的定点诱变、改变病毒的密码子使用、选择冷适应突变体、使用来自异源宿主物种的相关病毒、使用天然存在的减毒病毒株、或其组合。在一些形式中，病毒通过在培养的细胞中连续传代而减毒，其中培养的细胞是Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。

在一些形式中，病毒是流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人乳头瘤病毒、麻疹病毒、人免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、登革热病毒、东方马脑炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人疱疹病毒、人SARS冠状病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、里夫特裂谷热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、人嗜T淋巴细胞病毒或默克尔细胞多瘤病毒。在一些形式中，病毒是流感病毒。

在一些形式中，疫苗包括所公开的病毒。在一些形式中，病毒是活的和减毒的。在一些形式中，疫苗包括由所公开的病毒表达的一种或多种病毒蛋白，其中一种或多种病毒蛋白包含α-1,3-半乳糖。

在一些形式中，使用所公开疫苗的方法包括向有需要的受试者施用所公开的疫苗。在一些形式中，疫苗通过鼻内、肺内、经口、皮下、肌内、皮内或腹膜内施用。

还公开了制备疫苗的方法，该疫苗包括由所公开的病毒表达的一种或多种病毒蛋白，其中一种或多种病毒蛋白包含α-1,3-半乳糖。在一些形式中，该方法包括用病毒感染细胞，由此产生一种或多种包含α-1,3-半乳糖的病毒蛋白。在一些形式中，该方法进一步包括纯化一种或多种病毒蛋白质。

所公开的方法和组合物的其他优点将部分地在下面的描述中阐述，并且将部分地从描述中理解，或者可以通过所公开的方法和组合物的实践来了解。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是对所要求保护的本发明的限制。

附图说明

并入并构成本说明书一部分的附图说明了所公开的方法和组合物的几个实施方案，并且与发明描述一起用于解释所公开的方法和组合物的原理。

图1是显示cRNA意义上的WT和突变NA片段的示意图。小鼠α-1,3- GT基因ORF紧接在NA ORF的终止密码子之前引入(空心箭头)。如图所示，将侧接两个短肽接头(GSG)的猪捷申病毒-1的自身蛋白水解切割位点引入NA和α-1,3-GT ORF的连接处。指示了5’和3’非翻译区(UTR)和起始密码子 (黑色箭头)。红框代表NA ORF区的5’末端vRNA包装信号序列。

图2是显示NAGT突变体在MDCK细胞中的复制动力学的图(MOI： 0.001)。使用标准噬斑测定法确定后代病毒滴度。平均值±SD；**:p<0.01， ***:p<0.001。

图3是显示由NAGT病毒感染的人A549细胞增强人单核细胞衍生的巨噬细胞的吞噬活性的条形图。平均±SD；*：p<0.05。

图4A-4F是显示抗体依赖性NK细胞测定的图。在热灭活人血清存在 (图4A、4C和4E)或不存在(图4B、4D和4F)的情况下，通过PBS(图4E和 4F)、WT病毒(图4C和4D)或NAGT(图4A和4B)处理的人A549与激活的人NK细胞共同孵育。在不同的实验条件下孵育后，流感NP阳性细胞的百分比如图所示。这些图是使用来自健康供体的血清样品的代表性FACS图。

图5是显示所有测试的人血清对NK细胞的刺激作用以杀伤WT和 NAGT感染的A549细胞的图(NP+A549细胞的倍数减少；N＝6；配对t检验)。平均值±SD；*：p<0.05。

图6是显示对ADCC活性的萤光素酶报告基因测定的图。由WT或 NAGT感染的A549细胞首先用连续稀释的人血清样品处理，然后通过ADCC 测定进行测试。每个数据点代表6种不同人血清样品的平均读数。平均值±SD；*：p<0.05。

图7是显示疫苗接种和病毒攻击的示意图。小鼠在4周龄和6周龄时通过腹膜内途径用兔RBC进行致敏和增强。小鼠在8周龄时接种NAGT突变体，然后通过鼻内途径用致死剂量的流感病毒攻击。在4、6和8周龄以及在不同的疫苗接种后(第1、5和11天)/攻击后(第0、3和7天)时间点收集相关样品。

图8是显示针对不同流感病毒(H1N1/PR8、H3N2/HK68、H1N1/布里斯班/07和H5N2/HK/MPF461/07)的脾CD4⁺T细胞回忆反应的图。通过ICS研究T细胞。显示了激活T细胞(TNFα⁺)的百分比。数据代表平均值±SD；***： p<0.001。

图9是显示针对不同流感病毒(H1N1/PR8、H3N2/HK68、H1N1/布里斯班/07和H5N2/HK/MPF461/07)的脾CD8⁺T细胞回忆反应的图。通过ICS研究T细胞。显示了激活T细胞(TNFα⁺)的百分比。数据代表平均值±SD；***： p<0.001。

图10A-10C是显示疫苗接种后脾脏中的专职抗原呈递细胞(DC和巨噬细胞)和中性粒细胞的图。在接种疫苗后第1、5和21天收获接种疫苗的WT 小鼠和KO小鼠。未接种疫苗的小鼠(-)用作对照。显示了所有研究样品的代表性FACS图和DC(图10A)、中性粒细胞(图10B)和巨噬细胞(图10C)的百分比。来自接种疫苗的小鼠的数据以灰色框突出显示。点线用于同一时间点 KO小鼠和WT小鼠之间的比较(t检验)。数据代表平均值±SD；*：p<0.05， **：p<0.01。

图11A-11E是显示疫苗接种后肺中的专职抗原呈递细胞(DC和肺泡巨噬细胞)和中性粒细胞的图。在接种疫苗后第1、5和21天收获接种疫苗的 WT小鼠和KO小鼠。未接种疫苗的小鼠(-)用作对照。从所有研究样品中观察到的代表性FACS图和DC(图11A)、CD11b^低/-DC(图11B)和CD11b^高DC (图11C)、中性粒细胞(图11D)和肺泡巨噬细胞(图11E)的百分比。来自接种疫苗的小鼠的数据以灰色框突出显示。数据代表平均值±SD；*：p<0.05，**： p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001。

图12A-12C是显示NAGT突变体针对致死性同源攻击对小鼠的保护的图。接种疫苗和未接种疫苗(-)的小鼠在接种疫苗后3周用致死剂量的 H1N1(A/PR/8/34；40MLD₅₀)进行攻击。图12A显示了攻击后14天每天评估的不同小鼠组的存活率(对数秩检验)。每个接种疫苗组有16只小鼠。图12B 显示了不同小鼠组的体重减轻。图12C显示了在攻击后第3天和第7天小鼠的肺病毒滴度。来自接种疫苗的小鼠的数据以灰色框突出显示。

图13A-13B是显示感染后第7天感染小鼠BAL中PR8特异性CD4⁺(图 13A)和CD8⁺(图13B)T细胞回忆反应的图。活性由ICS测定确定。数据代表平均值±SD；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001。

图14A-14B是显示感染后第7天感染小鼠脾脏中PR8特异性CD4⁺(图 14A)和CD8⁺(图14B)T细胞回忆反应的图。活性由ICS测定确定。数据代表平均值±SD；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001。

图15A-15D是显示NAGT突变体针对致死性异亚型H3N2攻击对小鼠的保护的图。接种疫苗和未接种疫苗(-)的小鼠在接种疫苗后3周用致死剂量的H3N2病毒(HK68；10MLD₅₀)进行攻击。图15A显示了攻击后14天每天评估的存活率(对数秩检验)。每个接种疫苗组有≥20只小鼠。图15B显示了不同小鼠组的体重减轻。图15C显示了在攻击后第3天和第7天小鼠的肺病毒滴度。来自接种疫苗的小鼠的数据以灰色框突出显示。图15D显示了在攻击之前(接种疫苗后3周)和之后(攻击后第7天和第14天)小鼠中的HK68特异性中和抗体滴度。来自接种疫苗的小鼠的数据以灰色框突出显示。虚线用于同一时间点KO小鼠和WT小鼠之间的比较(t检验)。数据代表平均值±SD； *：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001。

图16A-16B是显示感染后第7天感染小鼠BAL中HK68特异性CD4⁺(图 16A)和CD8⁺(图16B)T细胞回忆反应的图。数据代表平均值±SD；**：p<0.01， ***：p<0.001，****：p<0.0001。

图17A-17B是显示感染后第7天感染小鼠脾脏中HK68特异性CD4⁺(图 17A)和CD8⁺(图17B)T细胞回忆反应的图。虚线用于同一时间点KO小鼠和 WT小鼠之间的比较(t检验)。数据代表平均值±SD；*：p<0.05，****：p<0.0001。

图18A-18C是显示攻击后第7天受感染肺组织中总DC(图18A)、CD11b ^低/-DC(图18B)和CD11b^高CD(图18C)的百分比的图。虚线用于同一时间点 KO小鼠和WT小鼠之间的比较(t检验)。数据代表平均值±SD；*：p<0.05， **：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001。

图19A-19C是显示NAGT突变体针对致死性异亚型H5N1攻击对小鼠的保护的图。接种疫苗和未接种疫苗(-)的小鼠在接种疫苗后3周用致死剂量的H5N1病毒(VN1203；10MLD₅₀)进行攻击。图19A显示了攻击后14天每天评估的存活率(对数秩检验)。每个接种疫苗组有10只小鼠。图19B显示了在攻击后第7天小鼠的肺病毒滴度。图19C显示了不同小鼠组的体重减轻。数据代表平均值±SD；*：p<0.05，**：p<0.01，****：p<0.0001。

图20A-20B是显示NAGT突变体在小鼠中增强的保护需要抗-α-Gal抗体的图。图20A显示了这些小鼠组在致死性HK68病毒攻击(10MLD₅₀)后的存活率。每个组有5只小鼠。图20B显示了不同小鼠组的体重减轻。数据代表平均值±SD；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001。

图21A-21B是显示在病毒攻击后在BAL中通过NAGT突变疫苗接种增强的多功能T细胞反应的图。图21A显示了攻击后第7天BAL中PR8特异性多功能CD8⁺T细胞。从图13B中呈现的数据重新分析数据。图21B显示了攻击后第7天BAL中的HK68特异性多功能CD4⁺T细胞。从图16A中呈现的数据重新分析数据。数据代表平均值±SD；*：p<0.05，**：p<0.01，***： p<0.001。

发明详述

所公开的方法和组合物可以通过参考以下特定实施方案的详细描述和其中包括的实施例以及参考附图及其先前和随后的描述来更容易地理解。

甲型流感病毒具有多种抗原性多样的HA亚型。经典流感疫苗是亚型特异性的，它们不能对多种流感亚型产生令人满意的异亚型免疫力 (heterosubtypic immunity)。本文公开了可在受感染细胞中生成α-Gal表位的活病毒和减毒病毒以及含有一种或多种病毒的疫苗。所公开的病毒可以增加疫苗的免疫原性和保护作用，从而允许针对不同流感亚型的广泛交叉反应性免疫反应。

抗-α-Gal抗体是由人自然产生的。因此，被公开的病毒感染的细胞可以促进被感染细胞的调理作用，导致增强的疫苗诱导的免疫反应。例如，感染携带α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-GT)基因的病毒的细胞，可以体外增强人巨噬细胞的吞噬作用和NK细胞的细胞毒性，并且可以体内诱导针对致死性异亚型第1组(例如，H5)或第2组(例如，H3)流感攻击的100％保护。相比之下，病毒对没有抗-α-Gal抗体表达的小鼠的异亚型保护作用只是部分的，这表明增强的疫苗诱导的保护作用涉及接种疫苗后的抗-α-Gal抗体。此外，所公开的疫苗可以刺激CD11b^低/-肺树突细胞，已知该细胞在流感病毒清除中起关键作用。

已发现病毒和由此类病毒组成并制备的疫苗，包括编码α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-GT)的异源核酸片段，使得该核酸片段表达α-1,3-GT，当病毒感染宿主细胞时是有用的因为α-1,3-GT的表达。此类病毒产生具有α-1,3-半乳糖的蛋白质。α-1,3-半乳糖在受感染细胞的蛋白质上的存在，可以有力地刺激宿主对病毒的病毒蛋白的免疫反应(因为人宿主会产生抗-α-1,3-半乳糖的抗体)，从而增强病毒作为疫苗的作用。还公开了包括此类病毒和/或由此类病毒产生的疫苗。还公开了制备和使用此类病毒和疫苗的方法，如向有需要的受试者施用所公开的疫苗，以及如制备包括由所公开的病毒表达的一种或多种病毒蛋白的疫苗。

应当理解，除非另有说明，否则所公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定的试剂，并且因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并非旨在进行限制。

如本文所用，术语“强效的免疫反应”是指抗体介导的反应、细胞介导的适应性免疫反应、先天免疫反应或其组合，其在施用病毒后产生，并以对相同病毒的后续攻击提供免疫保护的水平生成。

如本文所用，术语“免疫反应”、“免疫应答”或“免疫响应”是指直接针对抗原的体液(抗体介导)反应、细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导) 反应或两者的进展。这种反应可以是通过施用免疫原诱导的主动反应或通过施用抗体或致敏T细胞诱导的被动反应。与I类或II类MHC分子相关的多肽表位的呈递引发细胞免疫反应，以激活抗原特异性CD4⁺T辅助细胞、CD8⁺细胞毒性T细胞或两者。该反应还可能涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞或其他先天免疫成分的激活。细胞介导的免疫反应的存在可以通过增殖测定 (CD4⁺T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞反应对免疫原的保护或治疗作用的相对贡献可以通过从免疫的同基因动物中分别分离抗体和T细胞并在第二受试者中测量保护或治疗作用来区分。

如本文所用，术语“免疫保护”是指针对感染原的一种或多种抗原建立的免疫反应，该免疫反应通过防止疾病的进展或疾病的一种或多种症状的进展，在免疫反应建立后防止感染原的未来攻击至少一年、至少两年、至少三年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年、或至少十年，从而保护宿主免受病原体的未来攻击。感染原的未来攻击可以来自例如，与用于建立免疫保护的病原体相同、相似或不同的病原体、病原体亚型、病原体株或病原体颗粒。例如，在感染原是病毒的情况下，该病毒的未来攻击可以来自例如与用于建立免疫保护的病原体相同、相似或不同的病毒、病毒亚型、病毒株或病毒颗粒。

如本文所用，术语“减毒活病毒”或“活减毒病毒”或“减毒病毒”是指以下列方式从原始亲本病毒或野生型病毒改变的病毒：减弱其感染宿主、在宿主内复制、被包装、再次感染宿主或其组合的能力。通常，这种减毒可以通常在病毒的几个或所有宿主中，或仅在病毒的仅一个或几个宿主中。因此，减毒活病毒的减毒(即其感染宿主、在宿主内复制、被包装、再次感染宿主或其组合的能力被减弱)通常与一个或多个病毒宿主相关，其中减毒活病毒在病毒的更多其他宿主之一中没有显著地或可检测地减毒。本文公开的减毒活病毒通常是遗传改变的，并且可以称为突变的、突变的、基因工程的、重组的或组合。

如本文所用，术语“减毒活疫苗”或“活减毒疫苗”或“减毒疫苗”是指含有减毒活病原体例如病毒的药物组合物。药物组合物含有至少一种免疫活性成分，该成分在受试者中诱导针对病毒的免疫反应，保护受试者免受病毒或病毒引起的可能死亡或两者，并且任选地可以包括一种或多种增强活性成分的免疫活性的附加成分。疫苗还可以包括药物组合物典型的其他成分。至少一种免疫活性成分是一种或多种本文所述的减毒活病毒。

如本文所用，术语“同源病毒攻击”是指同一受试者的第二次或随后的病毒攻击，其中该病毒与第一次病毒攻击中使用的病毒、病毒亚型、毒株或感染性病毒颗粒在遗传上基本相同。在同源病毒攻击中(其中同一受试者的第二次或随后的病毒攻击使用与第一次攻击中使用的病毒基本相同或相似的病毒亚型的病毒)，可以获得同源免疫保护。

如本文所用，术语“异源病毒攻击”是指同一受试者的第二次或随后的病毒攻击，其中该病毒与第一次病毒攻击中使用的病毒、病毒亚型、毒株或感染性病毒颗粒在遗传上显著不同。在异源病毒攻击中(其中同一受试者的第二次或随后的病毒攻击使用与第一次攻击中使用的病毒具有显著不同的病毒亚型的病毒)，可以获得异亚型免疫保护。

如本文所用，术语“复制”是指基因组复制。当涉及病毒时，术语“复制”也意味着“病毒复制”，其涵盖病毒基因组的复制、病毒蛋白的产生、病毒基因组的包装以及新病毒颗粒的形成等过程。

如本文所用，在病毒的上下文中，术语“未改变的复制”、“基本相同的复制”和“相似的复制”是指病毒的复制与同种参考病毒的复制相当或基本相同。例如，当减毒活病毒的复制与减毒活病毒的野生型病毒的复制相当或基本相同时，这种复制可以称为未改变或类似的复制。复制可以通过本领域中用于测量病毒复制的任何技术来测量，如通过病毒产量或通过病毒复制或产生的速率来测量。例如，复制可以通过本身、或每单位时间、或每单位重量的器官、或每单位重量的蛋白质或核酸、或每单位长度的核酸的噬斑形成单位的数量、病毒粒子的数量、病毒颗粒的数量等来测量。例如，“基本相同的复制率”是指每单位重量组织的病毒颗粒数量的变化，其中一种病毒的数量变化与另一种病毒的数量变化基本相同。如本文所用，术语“基本相同”是指相同或相似的值，例如复制值或病毒数量变化的值。当相互比较时，这些值可以相同或可以在±10％的范围内彼此不同。

如本文所用，在病毒的上下文中，术语“慢速复制”和“减弱复制”是指比相同物种的参考病毒复制更慢或更少的病毒复制。例如，当减毒活病毒的复制慢于或少于减毒活病毒的野生型病毒的复制时，这种复制可以称为慢速或减弱复制。复制可以通过本领域中用于测量病毒复制的任何技术来测量，如通过病毒产量或通过病毒复制或产生的速率来测量。例如，复制的减少可以是噬斑形成单位的数量、病毒粒子的数量、病毒颗粒的数量等的任何减少。相对于野生型病毒的噬斑形成单位数、病毒粒子数或病毒颗粒数减少的范围可以是例如10％至90％。

如本文所用，术语“主毒株”和“主病毒”是指可以允许与病毒的另一种毒性亚型或毒株重组以产生杂合病毒的病毒亚型或毒株。

如本文所用，术语“同义取代”是指生物体基因组中位于编码区但不导致编码氨基酸序列改变的核苷酸的改变。

如本文所用，术语“沉默突变”是指生物体基因组中不会显著改变生物体的表型的核苷酸的改变。沉默突变可以发生在非编码区(内含子内的基因之外)，也可以发生在外显子内。当沉默突变发生在外显子或编码区内时，它们要么不会导致编码的氨基酸序列发生变化(即同义取代)，要么会导致具有与原始氨基酸相似特性的替代氨基酸的插入，在任何一种情况下，表型都没有显著变化。

如本文所用，术语“哺乳动物宿主”在病毒的上下文中是指能够被病毒感染和繁殖病毒的任何哺乳动物生物体。

如本文所用，术语“核酸区域”或“基因组区域”是指基因组的任何区域。该区域可以是基因组的片段、两个或多个核苷酸的区段或整个基因组。

如本文所用，术语“涉及包装或剪接”在病毒的上下文中是指编码负责包装或剪接基因组材料的蛋白质的基因组区域，或具有限定包装或剪接位点 (如剪接供体位点和剪接受体位点)的核酸序列的基因组区域。

如本文所用，术语“核酸分子”是指处于任何可能构型的任何核酸，例如单链、双链或其组合。核酸包括例如DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学生成的DNA或RNA的类似物、锁核酸分子(LNA)、蛋白质核酸分子(PNA)和tecto-RNA分子(例如Liu,B.等人,J.Am.Chem.Soc., 126:4076-4077(2004))。PNA分子是其中骨架是假肽而不是糖的核酸分子。因此，与例如DNA或RNA相比，PNA通常具有电荷中性骨架。然而，PNA 能够杂交至少互补和基本互补的核酸链，就像例如DNA或RNA(PNA被视为结构模拟物)。LNA分子具有修饰的RNA骨架，在C4'和O2'之间具有亚甲基桥，其将呋喃糖环锁定在N型构型中，从而为各自的分子提供更高的双链稳定性和核酸酶抗性。与PNA分子不同，LNA分子具有带电的骨架。DNA 或RNA可以是基因组来源或合成来源，并且可以是单链或双链。此类核酸可以是例如mRNA、cRNA、vRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA合成 DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸、混合聚合物、正义链和反义链、或者可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基。相应的核酸可以是含有非天然核苷酸类似物的核酸、连接至亲和标签或标记的核酸、或两者。当在本文中提及时，术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用。

如本文所用，术语“野生型病毒”是指天然形式的病毒，因为其在人类进行遗传或其他类型的有意操作之前，存在于自然界的宿主中。

如本文所用，术语“亲本病毒”是指在人为进行最初或进一步的遗传或其他类型的有意操作之前的病毒。

如本文所用，术语“基因工程”和“基因修饰”是指使用生物技术在核苷酸、密码子、基因、片段、框架或染色体水平上对生物体进行基因操作。通过首先使用分子克隆方法分离和复制感兴趣的遗传物质以生成DNA序列，或者通过合成DNA，然后将该构建体插入到宿主基因组中，将新的核苷酸、碱基、碱基对或DNA插入宿主基因组中。核苷酸、密码子、基因、片段、框架或染色体可以被移除(“敲除”)、添加(“敲入”)或替换。基因工程化生物体也可以称为突变的生物体、突变生物体、重组生物体或其组合。通常，所有这些术语都可以互换地适用于基因工程化生物体。

如本文所用，术语“氨基酸水平的保守位点”是指生物体基因组中的位点，该位点在相同生物体的不同毒株之间或同属的不同物种之间超过90％的时间在该位点使用相同的氨基酸。如本文所用，术语“氨基酸水平上的半保守位点”是指生物体基因组中的位点，该位点在相同生物体的不同毒株之间或在同属的不同物种之间超过80％的时间在该位点使用相同的氨基酸。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以引入病毒的遗传物质或重组表达载体的原核细胞和真核细胞。

如本文所用，术语“转化”和“转染”是指通过本领域已知的许多技术将核酸(例如载体)引入细胞中。

如本文所用，术语“免疫细胞”是指造血来源的并且在免疫反应中发挥作用的细胞。免疫细胞包括淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞)、天然杀伤细胞和骨髓细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞)。

术语“T细胞”指CD4+T细胞或CD8+T细胞。术语T细胞包括TH1细胞、TH2细胞和TH17细胞。

术语“T细胞细胞毒性”包括由CD8+T细胞激活介导的任何免疫反应。示例性免疫反应包括细胞因子的产生、CD8+T细胞的增殖、颗粒酶或穿孔素的产生以及感染原的清除。

如本文所用，“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人体和动物的组织、器官、体液或其组合接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他与合理的收益/风险比相称的问题或并发症的那些化合物、材料、组合物、剂型或其组合。

术语“个体”、“受试者”和“患者”是指作为使用所公开的组合物的治疗的靶标的任何个体。受试者可以是哺乳动物。因此，受试者可以是人。受试者可以是有症状的或无症状的。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年和新生儿受试者，无论雄性还是雌性，均涵盖在内。受试者可以包括对照受试者或测试受试者。

如本文所用，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，无论修饰(例如，磷酸化或糖基化)如何。

如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以为所治疗失调、疾病或病症提供治疗，以诱导或增强免疫反应，或以其他方式提供期望药理学效应、生理学效应、或两者的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，因素如受试者相关变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病、疾病阶段和正在实施的治疗。

如本文所用，术语“载体”或“赋形剂”是指制剂中的有机或无机成分、天然或合成的非活性成分，其与一种或多种活性成分组合。

如本文所用，术语“佐剂”是指改变其他试剂效果的试剂、药理学试剂、免疫试剂或其组合。可以将佐剂添加到疫苗中，通过增强免疫反应如提供更高量的抗体和更持久的保护来改变免疫反应，从而最大限度地减少注射外来物质的量。佐剂还可用于通过辅助破坏对特定细胞类型免疫系统的免疫反应来增强疫苗的功效，例如根据疫苗的类型激活T细胞而不是分泌抗体的B细胞。

如本文所用，术语“剂量方案”是指关于制剂、施用途径、疫苗剂量、给药间隔和免疫保护持续时间的疫苗施用。

“有效量”或“治疗有效量”是指组合物、病毒或疫苗的量，当施用于哺乳动物，优选人时，足以在哺乳动物，优选人中实现疾病或病症的治疗或疾病或病症的预防。构成“治疗有效量”的化合物、病毒或疫苗的量将根据化合物、病毒、或疫苗、病症及其严重程度、施用方式和待治疗哺乳动物的年龄而变化，但可以由本领域普通技术人员在考虑到其自身知识和本公开内容后常规确定。

如本文所用，“治疗”或“疗法”涵盖对患有感兴趣的疾病或病症的哺乳动物，优选人的感兴趣的疾病或病症的治疗，并且包括：

(i)防止该疾病或病症在哺乳动物中发生，特别是当该哺乳动物易患该病症但尚未被诊断为患有该病症时；

(ii)抑制疾病或病症，即阻止其发展；

(iii)缓解疾病或病症，即导致疾病或病症消退；或

(iv)缓解由疾病或病症引起的症状，即在不解决潜在疾病或病症的情况下缓解疼痛。如本文所用，术语“疾病”和“病症”可以互换使用或可以不同，因为特定的疾病或病症可能没有已知的致病因子(因此病因尚未解决)，因此尚未被认为是一种疾病而只是不期望的病症或综合征，其中临床医生已经确定了或多或少的特定症状组。

材料

A.病毒

公开了包括编码α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-GT)的异源核酸片段的病毒，使得当病毒感染宿主细胞时该核酸片段表达α-1,3-GT。通常，当此类病毒感染宿主细胞时，α-1,3-GT的表达导致受感染宿主细胞中的蛋白质具有α- 1,3-半乳糖。例如，在某些形式中，当病毒感染宿主细胞时，至少一种暴露于宿主细胞表面上的蛋白质将具有α-1,3-半乳糖。编码α-1,3-GT的异源核酸片段可以是(或被认为是)编码α-1,3-GT的基因或基因的编码部分。当病毒感染宿主细胞时，该核酸片段/基因通常应该能够表达(配置以表达)α-1,3-GT，使得当病毒感染宿主细胞时病毒表达α-1,3-GT。

在一些形式中，当病毒感染宿主细胞时，由病毒表达的至少一种病毒蛋白将具有α-1,3-半乳糖。在一些形式中，病毒是活的和减毒的。

在一些形式中，将核酸片段引入病毒的基因组中。在一些形式中，将核酸片段以框内方式引入病毒的病毒编码区的阅读框。在一些形式中，将核酸片段紧接在病毒的病毒编码区的阅读框的终止密码子之前引入。在一些形式中，病毒进一步包含在核酸片段和病毒的病毒编码区之间编码的蛋白酶切割位点。

在一些形式中，病毒是流感病毒。在一些形式中，将核酸片段以框内方式引入病毒的神经氨酸酶(NA)编码区的阅读框。在一些形式中，将核酸片段紧接在病毒NA编码区的阅读框的终止密码子之前引入。在一些形式中，病毒进一步包含在核酸片段和病毒的NA编码区之间编码的蛋白酶切割位点。在一些形式中，蛋白酶切割位点包含在2A自切割肽中。在一些形式中，2A 自切割肽衍生自猪捷申病毒-1。在一些形式中，2A自切割肽侧接短肽接头。在一些形式中，肽接头是GSG。

在一些形式中，α-1,3-GT是哺乳动物α-1,3-GT。在一些形式中，α-1,3- GT是小鼠α-1,3-GT。

在一些形式中，病毒通过以下方式减毒：在培养细胞中连续传代、在异源宿主动物中连续传代、病毒中的基因缺失、病毒的定点诱变、改变病毒的密码子使用、选择冷适应突变体、使用来自异源宿主物种的相关病毒、使用天然存在的减毒病毒株、或它们的组合。在一些形式中，病毒通过在培养的细胞中连续传代而减毒，其中培养的细胞是Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。

任何病毒都可以用于和制备所公开的病毒。优选引起人类疾病的病毒。例如，病毒可以是爱知病毒(Aichi virus)、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、版纳病毒(Banna virus)、巴马森林病毒(Barmah forest virus)、布尼亚维拉病毒 (Bunyamwera virus)、拉克罗斯布尼亚病毒(Bunyavirus La Crosse)、北美野兔布尼亚病毒(Bunyavirus snowshoe hare)、猕猴疱疹病毒(Cercopithecine herpesvirus)、金迪普拉病毒(Chandipura virus)、基孔肯雅病毒、柯萨基病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、登革热病毒、Dhori病毒、Dugbe病毒、Duvenhage 病毒、东部马脑炎病毒、埃博拉病毒、埃可病毒、脑心肌炎病毒、Epstein-Barr病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒、汉坦病毒、亨德拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠病毒68、70，人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒1、人乳头瘤病毒2、人乳头瘤病毒、人乳头瘤病毒16、人乳头瘤病毒18、人副流感病毒、人细小病毒、人细小病毒B19、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人SARS冠状病毒、人嗜T淋巴细胞病毒、人环曲病毒 (torovirus)、流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、伊斯法罕病毒、JC多瘤病毒、日本脑炎病毒、朱宁沙粒病毒、KI多瘤病毒、昆津病毒(Kunjin virus)、拉各斯蝙蝠病毒、维多利亚湖马尔堡病毒、兰加特病毒、拉沙病毒、洛兹达雷病毒、跳跃病病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、马丘波病毒、马亚罗病毒、MERS冠状病毒、麻疹病毒、门戈脑心肌炎病毒、默克尔细胞多瘤病毒、莫科拉病毒、传染性软疣病毒、猴痘病毒、腮腺炎病毒、墨累河谷脑炎病毒、纽约病毒、尼帕病毒、诺沃克病毒、O'nyong-nyong 病毒、Orf病毒、奥罗普切病毒、Pichinde病毒、脊髓灰质炎病毒、蓬塔托罗白蛉病毒、普马拉病毒、狂犬病病毒、裂谷热病毒、罗斯河病毒、轮状病毒、轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C、风疹病毒、鹭山病毒、唾液病毒A、白蛉热西西里病毒、札幌病毒、塞姆利基森林病毒、首尔病毒、辛德毕斯病毒、南安普敦病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱传波瓦桑病毒、托斯卡纳病毒、乌库涅米病毒、水痘-带状疱疹病毒、天花病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西方马脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒或寨卡病毒。一些引起疾病的人类病毒的特征显示于表1。

优选的病毒包括流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人乳头瘤病毒、麻疹病毒、人免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、登革热病毒、东方马脑炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人疱疹病毒、人SARS冠状病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、裂谷热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、人嗜T淋巴细胞病毒和默克尔细胞多瘤病毒。

表1.人类致病病毒

适用于生成减毒活病毒的病毒的实例包括以下病毒科的病毒：腺病毒科、乳头瘤病毒科、细小病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、肝炎病毒科、多瘤病毒科、指环病毒科、呼肠孤病毒科、小核糖核酸病毒科、杯状病毒科、披膜病毒科、沙粒病毒科、黄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、冠状病毒科、星状病毒科、博尔纳病毒科、动脉炎病毒科、肝炎病毒科。病毒必须从它们的基因组中生成mRNA来产生蛋白质并自我复制，但是在每个病毒科中使用不同的机制来实现这一点。病毒基因组可以是单链(ss)或双链(ds)RNA或DNA，并且可以使用或可以不使用逆转录酶(RT)。此外，ssRNA病毒可以是正义(+)或反义(-)。

这种分类将病毒分为七组：

I：dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)

II：ssDNA病毒(+链或“正义”)DNA(例如细小病毒)

III：dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)

IV：(+)ssRNA病毒(+链或正义)RNA(例如小核糖核酸病毒、披膜病毒)

V：(-)ssRNA病毒(-链或反义)RNA(例如正粘病毒、弹状病毒)

VI：在生命周期中具有DNA中间体的ssRNA-RT病毒(+链或正义)RNA (例如逆转录病毒)

VII：dsDNA-RT病毒(例如肝炎病毒)

DNA和RNA病毒的实例列于表2和表3中。

表2.可用于产生减毒活病毒的DNA病毒的实例。

表3.可用于产生减毒活病毒的RNA病毒的实例。

具有分段基因组的病毒也适用于形成本文所述的减毒活病毒。具有分段基因组的病毒包括正粘病毒科、布尼亚病毒科和沙粒病毒科的病毒。正粘病毒科包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。布尼亚病毒科包括布尼安维拉病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、裂谷热病毒和汉姆坦病毒。沙粒病毒科包括淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、拉沙病毒、朱宁病毒(阿根廷出血热)。

1.流感病毒

在一些形式中，本文所述的病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。本文公开的甲型流感病毒或乙型流感病毒可根据世界卫生组织修订的流感病毒命名系统(Bulletin ofthe World Health Organization,58(4):585-591(1980))进行分类。修订后的命名系统与1971年的系统类似，由两部分组成：(a)类型和毒株名称，和(b)对于甲型流感病毒，表面抗原(H和N)的抗原特异性的描述。

甲型、乙型和丙型流感病毒的毒株名称含有以下信息：

1.基于NP抗原的抗原特异性(甲型、乙型或丙型)对病毒抗原类型的描述。

2.起源宿主。这不适用于从人来源分离的毒株，但适用于从非人宿主(例如猪、马、鸡和火鸡)分离的所有毒株。对于来自非人物种的病毒，使用起源宿主的拉丁二项式命名法和通用名称，例如，Anas acuta(针尾鸭)。此后，该物种的通用名称用于毒株，例如A/鸭/USSR/695/76(H2N3)。当从非生物材料中分离出病毒时，会具体说明材料的性质，例如A/湖水/威斯康星/1/79。

3.地理起源。

4.毒株号。

5.分离年份。

对于甲型流感病毒，括号中的抗原描述遵循毒株名称并包括以下信息。

(a)描述血凝素抗原特性的索引，即H1、H2、H3、H4等。亚型编号是简单的顺序系统，统一应用于所有来源的流感病毒。

(b)描述神经氨酸酶抗原特性的索引，即N1、N2、N3、N4等。与H抗原亚型一样，这是简单的顺序编号系统，统一应用于所有甲型流感病毒。

从人中分离的甲型流感病毒的示例性命名法列于表4中。

表4.从人中分离的甲型流感病毒的血凝素抗原和神经氨酸酶抗原的参考毒株和亚型实例。

H和N亚型	参考毒株
HlNl	A/PR/8/34(H1N1)
			A/Weiss/43(H1N1)
	A/FM1/47(H1N1)
			A/英格兰/1/51(H1N1)
	A/丹佛/l/57(H1N1)
			A/新泽西/8/76(H1N1)
	A/USSR/90/77(H1N1)
		H2N2	A/新加坡/1/57(H2N2)
	A/日本/305/57(H2N2)
			A/英格兰/12/64(H2N2)
	A/东京/3/67(H2N2)
		H3N2	A/香港/1/68(H3N2)
	A/英格兰/42/72(H3N2)
			A/查莫斯港/1/73(H3N2)
	A/维多利亚/3/75(H3N2)
			A/德克萨斯/1/77(H3N2)

i.甲型流感

本文所述的减毒活甲型流感病毒，包括例如药物组合物中的相应病毒，可以基于任何甲型流感病毒，如禽流感、人流感、猪流感、马流感或犬流感。存在各种不同的甲型流感病毒亚型，其表面的HA和NA糖蛋白的性质不同。因此，甲型流感病毒通常根据存在的血凝素和神经氨酸酶(位于病毒包膜表面的两种蛋白质)的蛋白质形式的组合分为亚型。已鉴定出了18种血凝素形式(H1至H18)和11种神经氨酸酶形式(N1至N11)。

合适的病毒株包括但不限于H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、 H1N7、H1N8、H1N9、H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、 H2N8、H2N9、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N7、H3N8、 H3N9、H4N1、H4N2、H4N3、H4N5、H4N6、H4N7、H4N8、H5N1、H5N2、 H5N3、H5N4、H5N6、H5N7、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N3、H6N4、 H6N5、H6N7、H6N8、H6N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、 H7N7、H7N8、H7N9、H8N1、H8N2、H8N3、H8N4、H8N5、H8N6、H8N7、 H9N1、H9N2、H9N3、H9N4、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H9N9、H10N1、 H10N2、H10N3、H10N4、H10N5、H10N6、H10N7、H10N8、H10N9、H11N1、 H11N2、H11N3、H11N4、H11N5、H11N6、H11N7、H11N8、H11N9、H12N1、 H12N2、H12N3、H12N4、H12N5、H12N6、H12N7、H12N8、H12N9、H13N1、 H13N2、H13N3、H13N4、H13N5、H13N6、H13N8、H14N3、H14N5、H14N6、 H15N8、H15N9、H16N3。在一些形式中，流感病毒是H1N1、H1N2、H2N2、 H3N1、H3N2、H5N1和H7N7毒株之一。

H1N1病毒株的实例是甲型流感病毒株A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/ 波多黎各/8/1934(H1N1)，Genebank登录号为NC 002016、NC 002017、NC 002018、NC 002019、NC002020、NC 002021、NC 002022、NC 002023。H1N1 毒株的其他实例是甲型流感毒株A/Brevig Mission/1/1918 H1N1)(甲型流感病毒(毒株A/南卡罗莱纳/1/1918 H1N1)、甲型流感病毒株A/俄罗斯：圣彼得堡 /8/2006 H1N1、甲型流感病毒株A/美国：德克萨斯/UR06-0195/2007 H1N1-毒株A/Brevig Mission/1/1918 H1N1、甲型流感病毒株A/南卡罗莱纳/1/1918 H1N1、甲型流感病毒株A/猪/洛瓦/15/1930 H1N1、甲型流感病毒株A/Wilson- Smith/1933 H1N1、甲型流感病毒株A/WS/1933 H1N1和毒株A/美国：费城 /1935 H1N1。H1N1毒株的其他实例是甲型流感病毒株A/新西兰：南坎特伯雷/35/2000 H1N1。H1N2毒株的实例是甲型流感病毒株A/Xianfeng/3/1989 H1N2。H1N3毒株的两个实例是甲型流感/鸭/NZL/160/1976H1N3和毒株A/ 鲸/太平洋/19/1976 H1N3。H1N4毒株的实例是甲型流感病毒株A/野鸭/荷兰/30/2006 H1N4。H1N5毒株的实例是甲型流感病毒株A/针尾鸭/ALB/631/1981 H1N5。H1N6毒株的实例是甲型流感病毒株A/海鸦/阿拉斯加/305/1976 H1N6。 H1N7毒株的实例是甲型流感病毒A/猪/英格兰/191973/92 H1N7。H1N8毒株的实例是毒株A/埃及鹅/南非/AI1448/2007。H2N1毒株的实例是甲型流感病毒株A/日本/Bellamy/57 H2N1。H2N2毒株的实例是甲型流感病毒株A/韩国 /426/68 H2N2，其Genebank登录号为NC 007366、NC 007367、NC007368、 NC 007369、NC 007370、NC 007374、NC 007375、NC 007376、NC 00737、 NC007378、NC 007380、NC 007381和NC 007382。H2N2毒株的其他三个实例是甲型流感病毒株A/日本/305/1957 H2N2、A/捷克共和国/1/1966 H2N2 和毒株A/新加坡/新加坡/1/1957H2N2。H2N3毒株的实例是甲型流感病毒株 A/野鸭/明尼苏达/-00692/2008 H2N3。H2N4毒株的实例是A/野鸭/阿尔伯塔 /149/2002 H2N4。H2N5毒株的实例是甲型流感病毒株A/燕鸥/澳大利亚/1/04 H2N5。H2N6毒株的实例是甲型流感病毒株A/厚嘴海鸦/阿拉斯加/44145-199/2006 H2N6。H2N7毒株的实例是甲型流感病毒株A/北方琵嘴鸭/加利福尼亚/HKWF1128/2007 H2N7。H2N8毒株的实例是甲型流感病毒株A/火鸡/ 加利福尼亚/1797/2008 H2N8。H2N9毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/德国/1972 H2N9。H3N1毒株的实例是甲型流感病毒株A/野鸭/ALB/26/1976 H3N1。H3N2毒株的实例是甲型流感病毒株A/纽约/392/2004H3N2，其 Genebank登录号为NC 007371、NC 007372和NC 007373。H3N2毒株的另外五个实例是甲型流感病毒株NX-31 H3N2、毒株A/香港/5/1983 H3N2、A/ 里约/6/69 H3N2、A/香港/MA/1968 H3N2和甲型流感病毒株A/上海/N12/2007 H3N2。H3N3毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/香港/22A/1976 H3N3。H3N4 毒株的实例是甲型流感病毒株A/野鸭/ALB/1012/1979H3N4。H3N5毒株的实例是甲型流感病毒株A/北方琵嘴鸭/加利福尼亚/HKWF1046/2007H3N5。 H3N6毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸡/南昌/9-220/2000 H3N6。H3N8毒株的实例是甲型流感毒株A/马/迈阿密/1/1963 H3N8和毒株A/鸭/乌克兰 /1/1963 H3N8。H3N9毒株的实例是甲型流感病毒株A/天鹅/Shimane/227/01 H3N9。

H4N1毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸡/新加坡/1992(H4N1)。H4N2毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/香港/24/1976(H4N2)。H4N3毒株的实例是甲型流感病毒株A/野鸭/瑞典/65/2005(H4N3)。H4N4毒株的实例是甲型流感病毒株A/灰水鸭/澳大利亚/2/1979 H4N4。H4N5毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/北海道/1058/2001(H4N5)。H4N6毒株的两个实例是甲型流感病毒株 A/鸭/捷克斯洛伐克/1956 H4N6和甲型流感病毒株A/鸭/阿尔伯塔/28/1976 H4N6。H4N7毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/蒙古/583/02 H4N7。H4N8 毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸡/亚拉巴马/1/1975 H4N8。H4N9毒株的实例是甲型流感病毒株A/WDk/ST/988/2000(H4N9)。H5N1毒株的实例是甲型流感病毒(A/鹅/广东/1/96(H5N1))，其Genebank登录号为NC 007357、NC 007358、NC 007359、NC 007360、NC 007362、NC 007363和NC 007364。 H5N1毒株的其他实例是甲型流感毒株A/鸭/香港/2986.1/2000 H5N1、甲型流感毒株/乌骨鸡/香港/SF189/2001 H5N1、甲型流感毒株A/鸡/香港NU562/2001 H5N1、甲型流感病毒株A/鸡/香港/FY150/2001 H5N1、甲型流感毒株A/鸡/ 香港/715.5/2001 H5N1、甲型流感毒株A/珍珠鸡/香港/38/2002 H5N1、甲型流感毒株A/鸡/香港/31.2/2002 H5N1、甲型流感毒株A/鸡/香港/37.4/2002 H5N1、甲型流感毒株A/乌骨鸡/香港NU100/2002 H5N1、甲型流感毒株A/鸡/香港 /96.1/2002 H5N1、甲型流感毒株A/鸡/香港NU22/2002 H5N1、甲型流感毒株 A/水鸭/中国/2978.1/2002 H5N1、甲型流感毒株A/香港/212/2003 H5N1、甲型流感毒株A/鸡/汕头/4231/2003 H5N1、甲型流感毒株A/鹅/广西/345/2005 H5N1。H5N2毒株的实例是甲型流感毒株A/鸡/宾夕法尼亚/1370/1983 H5N2。 H5N3毒株的实例是甲型流感毒株A/鸭/马来西亚/F119-3/97 H5N3。H5N4毒株的实例是甲型流感毒株A/环境/纽约/200269-18/2002 H5N4。H5N5毒株的实例是甲型流感毒株A/鸭/马萨诸塞/Sg-00440/2005H5N5。H5N6毒株的实例是A/鸭/波茨坦/2216-4/1984 H5N6。H5N7毒株的实例是A/野鸭/丹麦/64650/03 H5N7。H5N8毒株的实例是毒株A/鸭/爱尔兰/113/1983 H5N8。H5N9 毒株的两个实例是甲型流感毒株A/火鸡/安大略/7732/1966 H5N9和毒株A/ 鸡/意大利/22AM 998H5N9。

H6N1毒株的实例是A/鸡/台湾/PF1/02(H6N1)。H6N2毒株的实例是甲型流感毒株A/鸡/加利福尼亚/1316/2001(H6N2)。H6N5毒株的实例是甲型流感毒株A/海鸥/澳大利亚/1972 H6N5。H6N8毒株的实例是甲型流感毒株A/火鸡/明尼苏达/501/1978 H6N8。H7N1毒株的实例是甲型流感毒株A/鸡瘟病毒 /罗斯托克/8/1934 H7N1。H7N2毒株的实例是甲型流感毒株A/鸭/香港/293/1978(H7N2)。H7N3毒株的实例是甲型流感毒株A/火鸡/俄勒冈/1971H7N3。H7N7毒株的五个实例是甲型流感毒株A/马/底特律/1/1964 H7N7、甲型流感毒株A/马/剑桥/1/1973 H7N7和甲型流感毒株A/马/圣保罗/1/1976 H7N7、甲型流感毒株A/马/布拉格/1/1956 H7N7和甲型流感毒株A/鸡/威布里治H7N7。H8N2毒株的实例是甲型流感毒株A/鸭/阿拉斯加 /702/1991(H8N2)。H8N4毒株的实例是甲型流感毒株A/火鸡/安大略 /6118/1968 H8N4。H8N4毒株的实例是甲型流感毒株A/鸭/筑波 /255/2005(H8N5)。H8N7毒株的实例是甲型流感毒株A/鸭/阿拉斯加 /702/1991(H8N7)。

H9N1毒株的实例是甲型流感病毒A/鸭/汕头/2030/00(H9N1)。H9N2毒株的实例是甲型流感病毒A/香港/1073/99(H9N2)，其Genebank登录号为NC 004905、NC 004906、NC004907、NC 004908、NC 004909、NC 004910、NC 004911和NC 004912。H9N3毒株的实例是甲型流感病毒A/鸭/越南/340/2001 H9N3。H9N4毒株的实例是甲型流感病毒A/滨鸟/德国/231/2003 H9N4。H9N5 毒株的实例是甲型流感病毒A/鸭/香港/702/79 H9N5。H9N7毒株的实例是A/ 火鸡/苏格兰/70(H9N7)。H9N8毒株的实例是A/鸡/韩国/04164/2004(H9N8)。 H9N9毒株的实例是A/火鸡/法国/03295/2003 H9N9。H10N1毒株的实例是甲型流感病毒A/鸭/香港/938/80 H10N1。H10N2毒株的实例是甲型流感病毒A/ 鸭/阿拉斯加/658/1991 H10N2。H10N5毒株的实例是甲型流感病毒A/鸭/香港 /15/1976 H10N5。H10N7毒株的实例是甲型流感毒株A/鸡/德国/n/1949 H10N7、毒株A/鸭/德国/1949 H10N7和毒株A/鸭/曼尼托巴/1/1953 H10N7。 H10N7毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/德国/1949 H10N7。H11N1毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/宫城/47/1977 H11N1。H11N2毒株的实例是 A/鸭/扬州/906/2002 H11N2。H11N3毒株的实例是A/鸡/泰国/CU5388/2009 H11N3。H11N6毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/英格兰/1/1956 H11N6。 H11N8毒株的实例是毒株A/鸭/乌克兰/2/1960H11N8。H11N9毒株的两个实例是甲型流感毒株A/鸭/乌克兰/1/1960 H11N9和甲型流感毒株A/燕鸥/澳大利亚/G70C/1975 H11N9。H12N1毒株的实例是A/野鸭/阿尔伯塔 /342/1983(H12N1)。H12N2毒株的实例是A/鸭/Primorie/3691/02 H12N2。 H12N3毒株的实例是A/大天鹅/蒙古/232/2005 H12N3。H12N5毒株的实例是甲型流感病毒株A/鸭/阿尔伯塔/60/1976H12N5。H12N6毒株的实例是A/野鸭/阿尔伯塔/221/2006 H12N6。H12N7毒株的实例是A/鸭/维多利亚/30a/1981 H12N7。H12N8毒株的实例是A/野鸭/荷兰/20/2005 H12N8。H12N9毒株的实例是A/红胸滨鹬/澳大利亚/5745/1981 H12N9。

H13N1毒株的实例是A/鸟粪/伊利诺斯/185997-30/2007 H13N1。H13N2 毒株的实例是甲型流感病毒株A/鲸/缅因/328/1984 H13N2。H13N3毒株的实例是A/滨鸟/新西兰/840/1986 H13N3。H13N6毒株的两个实例是甲型流感病毒株A/鸥/马里兰/704/1977 H13N6和毒株A/鸥/明尼苏达/945/1980 H13N6。 H13N8毒株的实例是A/黑头鸥/瑞典/1/2005H13N8。H14N3毒株的实例是 A/野鸭/Gur/263/82 H14N3。H14N5毒株的三个实例是A/野鸭 /Gurjev/263/1982 H14N5、A/野鸭/阿斯特拉罕/266/1982 H14N5和A/银鸥/阿斯特拉罕/267/1982 H14N5。H14N6毒株的实例是毒株A/野鸭 /Gurjev/244/1982 H14N6。H15N8毒株的实例是A/鸭/澳大利亚/341/1983 H15N8。H15N9毒株的实例是A/海鸥/西澳大利亚/2576/79H15N9。H16N3 毒株的实例是A/黑头鸥/瑞典/2/99 H16N3。

此类病毒亚型在血清学上是可区分的，这意味着对一种亚型特异的抗体不会以相当高的亲和力与另一种亚型结合。然而，表征根据本发明的甲型流感病毒基因的核酸位置适用于任何甲型流感病毒株。

ii.乙型流感

本文所述的减毒活病毒也可以是乙型流感病毒。乙型流感减毒活病毒，包括药物组合物中的乙型减毒活流感病毒，可以基于任何乙型流感病毒株。合适的病毒株包括但不限于乙型流感病毒株B/马里兰/1959、毒株B/山形 /1/1973、毒株B/维多利亚/3/1985、毒株B/苏联/100/1983、毒株B/东京 /942/1996、毒株B/德克萨斯/4/1990、毒株B/新加坡/222/1979、毒株B/南达科他州/5/1989、毒株B/巴黎/329/1990、毒株B/列宁格勒/179/1986、毒株B/ 香港/8/1973、毒株B/福冈/80/1981、毒株B/曼谷/163/1990、毒株B/北京/1987 年、毒株B/瑞士/9359/99、毒株B/威斯康星/6/2006、毒株B/西弗吉尼亚 /01/2009、毒株B/华盛顿/08/2009、毒株B/乌拉圭/NG/02、毒株B/德克萨斯 /18/2001、毒株B/台湾/S117/2005、毒株B/台湾/3799/2006、毒株B/西班牙 /WV45/2002、毒株B/首尔/232/2004、毒株B/南里奥格兰德/57/2008、毒株B/ 魁北克/517/98、毒株B/菲律宾/5072/2001、毒株B/奥斯陆/1871/2002、毒株 B/大阪/983/1997、毒株B/米兰/05/2006、毒株B/约翰尼斯堡/116/01或毒株B/亚利桑那/12/2003。

B.减毒

当公开的病毒用作疫苗或用于疫苗时，减毒病毒是有用的。这是因为病毒将被设计和期望感染宿主细胞、复制和产生病毒蛋白，但不引起疾病。减毒病毒是通过降低病毒的毒力但仍保持其活力(或“存活”)而产生的病毒 (Badgett等人,J.Virol.76(20):10524–10529(2002))。减毒吸收病毒并对其进行改变，使其变得无害或毒性降低。这些病毒与通过“杀死”病毒(灭活疫苗)产生的病毒形成对比。

存在许多减弱病毒的方法。每种都有有用的元素，但大多数方法在使用或有用性方面存在一些限制。减毒形式的实例包括培养细胞中的连续传代、异源宿主动物中的连续传代、病毒中的基因缺失、病毒的定点诱变、改变病毒的密码子使用、冷适应突变体的选择、使用来自异源宿主物种的相关病毒、使用天然存在的减毒病毒株、或其组合。在一些形式中，病毒通过在培养的细胞中连续传代而减毒，其中培养的细胞是Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。减毒类别包括经验性减毒病毒(empirically attenuated virus)、复制缺陷病毒、单周期病毒、复制保真减毒病毒、密码子去优化病毒、miRNA控制的病毒和锌指核酸酶(ZFN)控制的病毒。

经验性减毒病毒通常由不同细胞类型的盲传(blind passage)产生。通过适应新环境，病毒积累了介导减毒的突变。宿主免疫能够限制减毒病毒的毒力和传播。经验性减毒病毒具有极好的免疫原性，所需剂量很少。只有一些病毒可以经验性减毒，并且经验性减毒的病毒容易恢复为野生型和突破性疾病。

复制缺陷病毒通常是通过从病毒中删除基因组复制所需的一个或几个基因来产生的。然后可以在反式表达缺失蛋白质的辅助细胞系中生产病毒疫苗(Dudek和Knipe，Virology 344:230–239(2006))。施用的病毒无法复制其基因组。复制缺陷病毒通常提供良好的免疫原性，具有已知的减毒机制。复制缺陷病毒的有效性可能受到限制，因为宿主中的复制仅限于接种部位。

单周期病毒通常是通过删除病毒组装和传播所需的一个或几个基因来产生的。单周期病毒与复制缺陷病毒的区别在于它们的基因组复制能力 (Loudon等人，J GeneMed.3:458–467(2001))。单周期病毒能够复制其基因组，但在组装或传播方面存在缺陷。单周期病毒通常提供良好的免疫原性，具有已知的减毒机制。复制缺陷病毒的有效性可能受到限制，因为宿主中的复制仅限于接种部位。

复制保真减毒病毒通常是通过工程改造或选择对核苷类似物具有抗性的病毒来产生的。抗性病毒具有更高的复制保真度，这导致病毒后代的多样性更少，从而导致减毒(例如，宿主在攻击病毒方面更有效)(Vignuzzi等人， Nature 439:344-348(2006)；Pfeiffer和Kirkegaard,PLoS Pathog.1:e11(2005))。复制保真减毒病毒通常提供强免疫原性，具有已知的减毒机制，并且对抗原转移/漂移不敏感。复制保真减毒病毒仅限于RNA病毒。恢复为野生型是可能的。具有较高复制保真度的病毒的安全性尚未明确确定。

密码子去优化病毒通常是通过将病毒中的密码子更改为宿主中不太偏向的同义密码子来产生的(Baker等人，Future Virology 10(6):715-730(2015))。密码子去优化病毒表达效率的损失导致病毒产量降低。密码子去优化病毒通常提供很强的免疫原性，不会恢复为野生型，并且适用于许多病毒。可能的安全问题。密码子去优化病毒的安全性尚未明确确定。

miRNA控制的病毒通常是通过在病毒中添加miRNA序列来产生的(Fay 和Langlois，Non-Coding RNA 4(4):25(2018))。选择miRNA序列以限制病毒可以在哪些宿主细胞中复制(例如，改变的趋向性)。miRNA控制的病毒可以提供强免疫原性，具有已知的减毒机制，并且可以防止潜伏感染。miRNA控制的病毒仅限于一些RNA病毒。miRNA控制的病毒的安全性尚未明确确定。

锌指核酸酶(ZFN)控制的病毒通常是通过引入编码ZFN的序列来产生的，该序列靶向病毒中用于病毒复制和其他重要的病毒过程的序列。接种后，免疫原性病毒基因和病毒特异性ZFN都会得到表达。虽然病毒蛋白会刺激天然免疫反应，但ZFN会切割病毒DNA并限制复制。ZFN控制的病毒产生强烈的免疫原性，具有已知的减毒机制，并且可以防止潜伏感染。ZFN控制的病毒仅限于非整合DNA病毒。ZFN控制的病毒的安全性尚未明确确定。

C.疫苗

本文公开的一种组合物是疫苗。疫苗可以含有核酸、氨基酸或其组合。疫苗(或免疫原性组合物)包括在药学上可接受的赋形剂和任选的佐剂中的免疫原性量(优选有效量或保护量)的组合物，如外膜蛋白(分离的或纯化的，或存在于外膜囊泡，幽灵或死亡的、活的或减毒活的全细胞制剂中)。在这种情况下，免疫原性量可以限定为足以在宿主中引发抗体反应的蛋白质的量。优选的疫苗是包括所公开的病毒和/或由所公开的病毒产生的疫苗。

免疫原性量的所公开组合物的一种可以配制在药学上可接受的赋形剂和任选的佐剂中，以预防或治疗感染性疾病。通过向哺乳动物施用有效量的疫苗(有效量是能够在一定程度上保护宿主免受感染的量)，疫苗可用于在易受病原体感染的哺乳动物中诱导免疫反应。疫苗还可以通过以有效量施用于哺乳动物来预防感染。

疫苗能够引发针对多种病毒的交叉保护性免疫反应。

本文所述的疫苗通常是根据有关病原体的基本信息(如病毒如何感染细胞以及免疫系统如何对其作出反应)以及实际考虑因素(如世界上将使用该疫苗的地区)生成的。本文所述的疫苗可以是例如，减毒活疫苗；灭活疫苗；亚单位疫苗；类毒素疫苗；缀合疫苗；DNA疫苗；或重组载体疫苗。

通常，本文所述的减毒活病毒可用于减毒活疫苗。示例性疫苗包括减毒活流感病毒疫苗，其可以通过用单次有效剂量进行免疫来有效地保护宿主免于流感。

疫苗可以引发体液反应、细胞介导的免疫反应或其组合。理想情况下，免疫反应在随后用相同或不同亚型或毒株的未减毒病毒攻击时提供保护。本文所述的减毒活病毒用作疫苗时，可提供同亚型免疫保护、异亚型免疫保护或两者。

i.减毒活疫苗

减毒活疫苗含有已在实验室中削弱的活病毒版本，因此不会引起疾病。因为减毒活疫苗是最接近自然感染的疫苗，所以这些疫苗是免疫系统的好“老师”：它们引发强烈的细胞和抗体反应，通常只需一或两剂即可获得终身免疫。

尽管减毒活疫苗有优势，但也有一些缺点。生物的本质是改变或变异，活的减毒疫苗中使用的生物体也不例外。疫苗中的减毒病毒存在可能会恢复为毒性形式并引起疾病的很小的可能性。然而，通过在病毒基因组中引入大量突变，这种可能性显著降低。此外，并非每个人都可以安全地接种减毒活疫苗。为了自我保护，免疫系统受损或减弱的人(例如因为他们接受了化疗或感染了HIV)不能接种活疫苗。

另一个限制是，减毒活疫苗通常需要冷藏以保持效力。如果疫苗需要运往海外并由缺乏普遍冷藏的发展中国家的医护人员储存，那么活疫苗可能不是最佳选择。

ii.灭活疫苗

灭活疫苗是通过用化学物质、热或辐射杀死致病病原体产生的。此类疫苗比活疫苗更稳定、更安全：死亡的病原体无法突变回它们的致病状态。灭活疫苗通常不需要冷藏，它们可以很容易地以冻干形式储存和运输，这使得发展中国家的人们可以使用它们。

然而，与活疫苗相比，大多数灭活疫苗刺激较弱的免疫系统反应。因此，可能需要多次额外剂量或加强注射，才能维持个人的免疫力。在人们无法定期获得医疗护理并且无法按时进行加强注射的地区，这可能是一个缺点。

iii.亚单位疫苗

相对于整个病原体，亚单位疫苗只包括最能刺激免疫系统的抗原。在一些情况下，这些疫苗使用表位，即抗体或T细胞识别和结合的抗原的非常特定的部分。由于亚单位疫苗仅含有必需抗原，而不含有构成微生物的所有其他分子，因此对疫苗产生不良反应的机会较低。

亚单位疫苗可以含有1种抗原、20种抗原、1至20种抗原之间的任意数量的抗原或超过20种抗原。一旦鉴定出最能刺激免疫系统的抗原，就可以通过以下两种方式之一将它们制备成亚单位疫苗：1)在实验室中培养病原体，然后使用化学物质将其分解并收集重要的抗原；或2)可以使用重组DNA 技术制备抗原。这种方式产生的疫苗称为“重组亚单位疫苗”。

iv.类毒素疫苗

类毒素疫苗可用于分泌毒素的病原体。当病原体的毒素是疾病的主要原因时，就会使用这些疫苗。毒素通常通过用福尔马林(甲醛和无菌水的溶液) 处理来灭活。这种被称为类毒素的“解毒”毒素可安全用于疫苗。

当免疫系统接受含有无害类毒素的疫苗时，它将学习如何抵抗天然毒素。免疫系统会产生抗体来锁定和阻断毒素。针对白喉和破伤风的疫苗是类毒素疫苗的实例。

v.缀合疫苗

缀合疫苗通常在病原体具有多糖外包衣(例如许多有害细菌)时制备。多糖包衣掩盖了细菌的抗原，使婴儿和年幼儿童的未成熟免疫系统无法对其识别或响应。缀合疫苗是特殊的亚单位疫苗，可以解决这个问题。

在制备缀合疫苗时，婴儿免疫系统可以识别的来自病原体的抗原或类毒素通常与多糖相连。这种连接有助于未成熟的免疫系统对多糖包衣作出反应并抵御致病细菌。

vi.DNA疫苗

DNA疫苗使用编码免疫原性抗原的病原体基因。研究发现，当病原体抗原的基因被引入体内时，一些细胞会摄取该DNA。然后DNA指导这些细胞制备抗原分子。细胞分泌抗原并将其显示在细胞表面上。针对病原体的DNA 疫苗会引起对细胞分泌的自由漂浮抗原的强烈抗体反应，并且疫苗还会刺激针对细胞表面上展示的微生物抗原的强烈细胞反应。此外，DNA疫苗的设计和产生相对容易且成本低廉。

所谓的裸DNA疫苗由直接施用到体内的DNA组成。这些疫苗可以通过针头和注射器或使用高压气体将包被有DNA的微小金颗粒直接射入细胞的无针装置进行施用。有时，将DNA与促进细胞摄取的分子混合。

vii.重组载体疫苗

重组载体疫苗类似于DNA疫苗，但它们使用减毒病毒或细菌将微生物 DNA引入机体细胞。“载体”是指用作载剂的病毒或细菌。载剂病毒将病原体的DNA运送到细胞。重组载体疫苗与自然感染非常相似，因此可以刺激免疫系统。

减毒细菌也可以用作载体。在这种情况下，插入的遗传物质会使细菌在其表面展示其他微生物的抗原。实际上，无害细菌模仿有害微生物，从而引发免疫反应。

1.载剂

可以使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制药物组合物，所述载剂包括促进将活性化合物加工成可药用制剂的赋形剂和助剂。适当的配方取决于所选择的施用途径。在一种形式中，通过吸入上呼吸道或下呼吸道粘膜施用。典型的制剂包括载剂如无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水。还经常添加粘度调节剂和防腐剂。

特别用于肠内、局部和粘膜施用的任选的药学上可接受的赋形剂包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、稳定剂和表面活性剂。稀释剂也称为“填充剂”，通常是增加固体剂型体积所必需的，以便为片剂的压制或珠粒和颗粒的形成提供实用的尺寸。合适的稀释剂包括但不限于二水合磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预糊化淀粉、二氧化硅、二氧化钛、硅酸铝镁和糖粉。

粘合剂用于赋予固体剂型粘合特性，从而确保片剂或珠粒或颗粒在剂型形成后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、糖类(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨糖醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄芪胶、海藻酸钠、纤维素包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和硅酸镁铝，以及合成聚合物如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。

崩解剂用于促进剂型在施用后崩解或“分解”，通常包括但不限于淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、藻氨酸、树胶或交联聚合物如交联PVP(来自GAF Chemical Corp的

XL)。

稳定剂用于抑制或延缓分解反应，包括例如氧化反应。

表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐如十二烷基苯磺酸钠的钠、钾、铵；二烷基磺基琥珀酸钠如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐如月桂基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰子胺。非离子表面活性剂的实例包括单硬脂酸乙二醇酯、肉豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油-4-油酸酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酰化物、PEG-150 月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、

401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛油酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-b-丙氨酸钠、N-月桂基-b-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻两性乙酸、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。

如果期望，组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、染料、pH缓冲剂或防腐剂。

2.佐剂

在一种形式中，佐剂是合成的糖脂α-半乳糖基神经酰胺(αGalCer)。在CD1d的情况下呈递抗原的树突状细胞可导致自然杀伤T细胞(NKT细胞)快速先天和长时间地产生细胞因子如干扰素和IL-4。CD1d是主要组织相容性复合物I类分子，可将糖脂抗原呈递给NKT细胞的亚群。有利的是，αGalCer 对人类没有毒性，并且已被证明可作为佐剂，从而引发抗原特异性CD4+和 CD8+T细胞反应。例如，已经表明，αGalCer与疟疾疫苗结合使用可导致针对受感染细胞的细胞毒性反应，这是针对感染性疾病疫苗的理想方案。除αGalCer外，还可以使用其他糖脂作为佐剂来激活NKT细胞介导的免疫反应。

在另一种形式中，佐剂可以是但不限于以下的一种或多种：油乳剂(例如，弗氏佐剂)；皂苷制剂；病毒体和病毒样颗粒；细菌和微生物衍生物，包括但不限于碳水化合物如脂多糖(LPS)；免疫刺激性寡核苷酸；ADP-核糖基化毒素和解毒衍生物；明矾；BCG；含矿物质的组合物(例如，矿物盐如铝盐和钙盐、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等)；生物粘合剂、粘膜粘合剂或两者；微粒；脂质体；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂；聚磷腈；胞壁酰肽；咪唑喹诺酮类化合物；和表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚)。

佐剂还可以包括免疫调节剂，如细胞因子、白介素(例如，IL-1、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如，干扰素-.gamma.)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；和共刺激分子，如B7家族的分子。此类蛋白质佐剂可以作为全长多肽或其活性片段提供，或以DNA形式如质粒 DNA提供。

D.试剂盒

还提供了用于用本文所述的减毒活病毒免疫受试者的一个或多个试剂盒。试剂盒可以包括例如，减毒活病毒、药学上可接受的载剂、佐剂、上药器和使用它们的指导材料。在进一步的形式中，减毒活病毒可以是一种或多种脊髓灰质炎病毒、一种或多种鼻病毒、一种或多种流感病毒等。在期望针对特定病毒的多种不同分离物免疫宿主的情况下，可以优选多于一种病毒。说明书可以提供对指导减毒活病毒的施用有用的任何信息。

方法

公开了制备和使用所公开的病毒和疫苗的方法。

A.制备病毒的方法

制备具有分段或单一基因组的重组病毒的方法在本领域中通常是已知的。这些包括使用分子生物学中的标准反向遗传技术和基因组操作的方法 (Hoffmann等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97(11):6108-6113(2000)；Zhou等人,J.Virol.,72(4):3241-3247(1998))。所有合成基因通常都亚克隆到表达构建体中。然后使用构建体在体外接触，即感染相同的宿主细胞。然后宿主细胞产生含有操纵基因组的包装病毒。然后收获包装的病毒并使用标准病毒学技术确定其效价，并用于进一步表征。

量化病毒颗粒的方法是本领域已知的。实例包括基于噬斑的测定，其用于根据感染剂量确定病毒浓度。病毒噬斑测定确定病毒样品中噬斑形成单位 (pfu)的数量，这是衡量病毒数量的一种方法。焦点形成测定(FFA)是噬斑测定的变体，但FFA不依赖细胞裂解来检测噬斑形成，而是采用免疫染色技术，使用对病毒抗原特异的荧光标记抗体在形成实际噬斑之前来检测受感染的宿主细胞和感染性病毒颗粒。FFA特别适用于量化不裂解细胞膜的病毒类别，因为这些病毒不适合噬斑测定。另一种测定是终点稀释测定(50％组织培养感染剂量(TCID₅₀))。TCID₅₀是感染性病毒滴度的量度。该终点稀释测定量化了杀死50％的受感染宿主或在50％的接种组织培养细胞中产生细胞病变效应所需的病毒量。

病毒的病毒蛋白可以从如本文所述产生的病毒中分离或纯化。这样做的方法通常是已知的。

B.病毒和疫苗的施用

所公开的病毒可用于病毒感染的预防性治疗、病毒感染的治疗性治疗或两者；也就是说，其可以用于治疗病毒感染、预防病毒感染或两者。可以通过本领域已知的任何途径将病毒作为药物组合物施用。通常，药物组合物可以例如静脉内、皮下、肌内或鼻内施用。为此目的，药物组合物的病毒可以以合适的可注射或可吸入形式提供。本公开的减毒活病毒可以在一些形式中包括在用于将可吸入或可注射形式的病毒施加到受试者的装置中。

可以以本身已知的方式制备包括本公开的病毒的药物组合物，例如通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制作、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。该组合物可以是免疫原性组合物如疫苗。形成本公开的疫苗组合物的主要成分的相应疫苗可以包括单一抗原、抗原组合、单一病毒或病毒组合，例如相同物种的至少两种或三种病毒，包括一个或多个重配株(reassortant)。

任何本发明免疫和治疗方法的某些形式进一步包括向受试者施用至少一种佐剂。适用于基于蛋白质和核酸的疫苗的多种佐剂(包括颗粒佐剂)，以及将佐剂与抗原组合的方法，是本领域技术人员熟知的。用于基于核酸的疫苗的合适佐剂包括但不限于以纯化的蛋白质或核酸形式递送的Quil A、咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫特(resiquimod)和白介素-12。适用于蛋白质免疫的佐剂包括但不限于明矾、弗氏不完全佐剂(FIA)、皂苷、Quil A和QS-21。

本公开的药物组合物的示例性施用途径包括经口、经皮和肠胃外递送。合适的施用途径可以例如包括埋植(depot)、经口、直肠、经粘膜或肠道施用；肠胃外递送，包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

作为说明性实例，对于注射，根据本公开的药物组合物可以配制成水溶液，例如在生理相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。对于经口施用，可以通过将病毒与本领域熟知的药学上可接受的载体组合来容易地配制相应的药物组合物。此类载剂能够将本发明的病毒配制成片剂、丸剂、锭剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬液等，以供待治疗的患者经口摄入。

用于经口使用的药物制剂可以通过添加固体赋形剂、任选地研磨所得混合物和加工颗粒混合物来获得，如果期望，在添加合适的助剂后，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂，如糖，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；淀粉及其衍生物，如玉米淀粉、糊精和小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、羟丙基淀粉、小麦淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其组合；纤维素制剂，如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基纤维素；无机化合物，如氯化钠、硼酸、硫酸钙、磷酸钙和沉淀碳酸钙。如果期望，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。

糖衣丸芯配有合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛或其组合；漆溶液；和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于识别或表征病毒剂量的不同组合。合适的流化剂包括但不限于氧化镁、合成硅酸铝、偏硅酸、镁铝氧化物、水合硅酸、无水硅酸、滑石、硬脂酸镁和高岭土。合适的结合剂包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷、聚乙烯醇、阿拉伯树胶、黄芪胶、海藻酸钠、明胶和面筋。合适的稳定剂包括但不限于蛋白质，例如白蛋白、鱼精蛋白、明胶和球蛋白；和氨基酸及其盐。合适的增稠剂包括但不限于蔗糖、甘油、甲基纤维素和羧甲基纤维素。合适的pH调节剂包括但不限于盐酸、氢氧化钠、磷酸盐、柠檬酸盐和碳酸盐。

可经口使用的药物组合物包括但不限于由明胶制备的推入式胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制备的软密封胶囊。推入式胶囊可含有减毒活病毒，并与填充剂如乳糖、结合剂如淀粉、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁) 或两者、以及任选地稳定剂混合。在软胶囊中，一种或多种病毒可以溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。所有用于经口施用的制剂都应采用适合此施用的剂量。

对于颊部施用，相应的药物组合物可以采用以常规方式配制的片剂或含片的形式。

对于通过吸入的施用，根据本公开使用的药物组合物可以使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，从加压包装或喷雾器以气溶胶喷雾剂形式方便地递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。可配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其含有病毒和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

可以配制相应的药物组合物用于通过注射，例如通过快速推注或连续输注进行肠胃外施用。注射用制剂可以以单位剂型存在，例如，存在于安瓿或多剂量容器中并添加防腐剂。所述组合物可以采用如在油性或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配方剂，如混悬剂、稳定剂、分散剂或其组合。

用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的病毒水溶液。此外，可以将病毒的混悬液制备成合适的油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬液可含有增加混悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。

在一些形式中，活性成分如本文所述的病毒，可以作为粉末形式与合适的载体例如无菌无热原(SPF)水在使用前构成。

合适的哺乳动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、牛、山羊、绵羊、猪、狗、猫、马、豚鼠、犬、仓鼠、貂、海豹、鲸鱼、骆驼、黑猩猩、恒河猴和人。

本公开的减毒病毒的剂量和期望浓度可以根据所设想的特定用途而变化。合适剂量或施用途径的确定完全在普通医师的技能范围内。动物实验为确定人类预防和治疗用途的有效剂量提供了可靠的指导。可以按照Mordenti, J.和Chappell,W."The use ofinterspecies scaling intoxicokinetics"In Toxicokinetics and New DrugDevelopment,Yacobi等人编辑,Pergamon Press, 纽约1989，第42-96页进行有效剂量的种间缩放。

施用的材料的量或剂量应足以在合理的时间范围内影响受试者的治疗或预防反应。例如，材料的剂量应足以防止由未减毒的野生型病毒引起的症状性感染。剂量应足以刺激免疫反应、治疗或预防野生型病毒感染或两者。

用于确定施用剂量的许多测定是本领域已知的。为了本方法的目的，可以进行包括比较响应于施用于一组哺乳动物的若干不同剂量的减毒病毒而存在的抗病毒抗体和免疫细胞类型的测定。剂量也可以通过可能伴随施用的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。在确定剂量时可以考虑多种因素，例如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、施用材料、施用途径和所治疗疾病的严重程度。

用于受试者如哺乳动物成年生物体的减毒活病毒疫苗的剂量可以是约 10²至约10¹⁵，例如约10³至约10¹²、约10³至约10¹⁰、约10³至约10⁸、约10⁵至约10⁸、约10³至约10⁶、约10⁴至约10⁸、约10⁴至约10⁷、约10⁴至约10⁶或约10⁴至约10⁵噬斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。然而，剂量应该是使用现有疫苗作为起点按照常规方法确定的安全有效量。

可使用一种或多种药学上可接受的载剂以常规方式配制根据本公开使用的药物组合物，载剂包括赋形剂和助剂，其有助于将病毒加工成可药用的制剂。适当的配方取决于所选的施用途径。如果组合物(包括其组分)的施用可以由受体受试者耐受，则被认为是“药理学上可接受的”。如果施用量在生理上是显著的，则称此药剂以“治疗有效量”施用。如果本公开的组合物的存在导致受体受试者的生理发生可检测的变化，例如增强针对至少一种感染性病毒株的至少一种初级或次级体液或细胞免疫反应，则本公开的组合物具有生理意义。

在一些形式中，本文所述的减毒活病毒和药物组合物的有效剂量通常可以包括每剂每次施用约10²p.f.u.、10³p.f.u.、10⁴p.f.u.、10⁵p.f.u.、10⁶p.f.u.、 10⁷p.f.u.、10⁸p.f.u.、10⁹p.f.u.或更多。施用速率可以不同。通常，施用速率可以是例如每月一次、每三个月一次、每六个月一次、每年一次，或根据需要进行加强疫苗接种。

如本文所用，“免疫原”或“免疫原性量”是指物质(抗原)诱导免疫反应的能力。免疫反应是生物体免疫系统对抗原反应的反应性改变，在脊椎动物中，这可以涉及抗体产生、细胞介导免疫的诱导、补体激活或免疫耐受的发展。

如本文所用，“佐剂”是增加抗原刺激免疫系统的能力的物质。

如本文所用，“减毒”是指减弱疾病因子(病原体)的程序。在此类疾病因子的上下文中，术语“减毒”是指已经减弱的此类疾病因子。例如，减毒病毒是减弱的、不太具有活力的病毒。针对病毒性疾病的疫苗可以由减毒、毒性较低的病毒株制备，这种病毒能够刺激免疫反应并产生免疫力，但不会引起疾病或引起不太严重的疾病。可以使用本领域技术人员已知的方法通过病原体的化学处理、辐射或遗传修饰来实现减毒。减毒可能导致增殖减少、对宿主细胞的附着或毒素的产生或强度降低。

如本文所用，术语“需要治疗”是指护理人员(例如，在人的情况下为医生、护士、执业护士或个人；在动物(包括非人哺乳动物)的情况下为兽医)做出的判断：受试者需要或将从治疗中受益。该判断是基于护理人员专业知识范围内的多种因素做出的，但包括作为由公开的化合物可治疗的病症的结果的受试者生病或将生病的知识。

如本文所用，“受试者”包括但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生虫和任何其他生物体或实体。受试者可以是脊椎动物，更具体地，哺乳动物(例如，人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。受试者可以是无脊椎动物，更具体地是节肢动物(例如昆虫和甲壳类动物)。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年和新生儿受试者以及胎儿，无论雄性还是雌性，均涵盖在内。患者是指患有疾病或病症的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。

“疗法”和“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症为目的的受试者的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或病症的治疗，还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种针对相关疾病、病理状况或病症的改善的特定疗法的治疗。应当理解，治疗虽然旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症，但实际上不需要导致治愈、改善、稳定或预防。治疗效果可以如本文所述和本领域已知的适用于所涉及的疾病、病理状况或病症的方式测量或评估。这种测量和评估可以用定性和/或定量的方式进行。因此，例如可以将疾病、病理状况或病症的特点或特征和/或疾病、病理状况或病症的症状降低到任何效果或降低到任何量。

细胞可以在体外。或者，细胞可以在体内并且可以存在于受试者中。“细胞”可以是来自任何生物体的细胞，包括但不限于细菌。

在一方面，本文所述的化合物可以施用于需要从公认的医疗状况得到缓解或改善的受试者，其包括人或动物，包括但不限于小鼠、狗、猫、马、牛或羊等。

如本文所提供的术语化合物的“有效量”是指无毒但足以提供期望结果的化合物的量。正如下文将指出的，所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、正在治疗的疾病的严重程度、使用的特定化合物、其施用方式等。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，合适的有效量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。

本文所述的化合物的剂量或量大到足以在进行递送的方法中产生期望的效果。剂量不应太大以引起不良副作用，如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随受试者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。个体医生可以根据所涉及受试者的临床状况调整剂量。可以改变剂量、给药方案和施用途径。

可以通过评估已知可用于评估受试者状态的病史、体征、症状和客观实验室测试的特定方面来确定根据本文所述方法施用的特定剂量的化合物或组合物的功效。这些体征、症状和客观实验室测试将根据治疗或预防的特定疾病或状况而有所不同，正如任何治疗此类患者的临床医生或在该领域进行实验的研究人员所知道的那样。例如，如果基于与适当对照组的比较和/或对一般群体或特定个体中疾病正常进展的了解：(1)受试者的身体状况显示得到改善(例如，肿瘤已部分或完全消退)，(2)疾病或病症的进展显示稳定、或减慢、或逆转，或(3)减少或消除了对治疗疾病或病症的其他药物的需求，那么特定的治疗方案将被认为是有效的。

“药学上可接受的”是指不是生物学或其他方面不期望的材料，即该材料可以与所选化合物一起施用于受试者而不会引起任何不期望的生物学效应或以有害方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。

任何具有式I的化合物可以与药学上可接受的载剂组合用于治疗性使用。本文所述的化合物可以方便地配制成由一种或多种化合物与药学上可接受的载剂组成的药物组合物。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, 最新版,来自E.W.Martin MackPub.Co.,Easton,PA，其公开了典型的载剂和制备药物组合物的常规方法，这些药物组合物可以与本文所述的化合物的制剂的制备缀合使用，并通过引用并入本文。这些最典型地是用于将组合物施用于人的标准载剂。在一方面，施用于人和非人的标准载剂，包括溶液如无菌水、盐水和生理pH的缓冲溶液。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。

除了所选分子之外，本文所述的药物组合物可以包括但不限于载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。

本文所述的化合物和药物组合物可以多种方式施用于受试者，这取决于是否期望局部或全身治疗以及待治疗的区域。因此，例如，本文所述的化合物或药物组合物可以作为眼用溶液和/或软膏施用于眼睛表面。此外，化合物或药物组合物可以通过阴道、直肠、鼻内、经口、通过吸入或肠胃外途径，例如通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、直肠内、动脉内、淋巴管内、静脉内、鞘内和气管内途径施用于受试者。如果使用肠胃外施用，通常以注射为特征。可将注射剂制备成常规形式，或者作为液体溶液或混悬液、适合在注射前溶解或混悬在液体中的固体形式、或作为乳液。最近修订的肠胃外施用方法涉及使用缓释或缓释系统以保持恒定剂量。参见例如，美国专利第 3,610,795号，其通过引用并入本文。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬液和乳液，它们也可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些) 等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

用于局部施用的制剂可以包括软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载剂、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或期望的。

用于经口施用的组合物可以包括粉末或颗粒、在水或非水介质中的混悬液或溶液、胶囊、小袋或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是期望的。

术语“高”、“更高”、“增加”、“升高”或“提升”是指例如与对照相比，增加到基础水平以上。术语“低”、“更低”、“降低”或“下降”是指例如与对照相比，降低到基础水平以下。

如本文所用，术语“调节”是指与合适的对照相比，化合物以一些可测量的方式改变活性的能力。由于测定中化合物的存在，活性相比于不存在这些化合物的对照可以增加或减少。优选地，与不存在化合物时的活性水平相比，活性增加至少25％，更优选地至少50％，最优选地至少100％。类似地，与不存在化合物时的活性水平相比，活性降低优选地至少25％，更优选地至少50％，最优选地至少100％。增加已知活性的化合物是“激动剂”。减少或阻止已知活性的化合物是“拮抗剂”。

术语“抑制”是指降低或减少活性或表达。这可以是完全抑制或部分抑制活性或表达。可以将抑制与对照或标准水平进行比较。抑制可以是1％、2％、 3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、 16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、 28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、 40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、 52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、 64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、 76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

如本文所用，术语“监测”是指本领域中可以测量活性的任何方法。

如本文所用，术语“提供”是指将化合物或分子添加到本领域已知的事物中的任何方式。提供的实例可以包括使用吸量管、移液器、注射器、针头、导管、枪等。其可以是手动的或自动的。其可以包括通过任何方式或任何其他方式向培养皿、细胞、组织、无细胞系统提供核酸的转染，并且可以在体外或体内进行。

如本文所用，术语“预防”是指在疾病或病症的临床症状发作之前施用化合物以防止与疾病或病症相关的异常的物理表现。

通过以下编号的段落可以进一步理解所公开的组合物和方法。

1.包含编码α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-GT)的异源核酸片段的病毒，其中当所述病毒感染宿主细胞时，所述核酸片段表达α-1,3-GT，其中当所述病毒感染所述宿主细胞时，至少一种暴露在所述宿主细胞表面上的蛋白质包含α-1,3-半乳糖。

2.段落1的病毒，其中当所述病毒感染所述宿主细胞时，由所述病毒表达的至少一种病毒蛋白包含α-1,3-半乳糖。

3.段落1或2的病毒，其中所述病毒是活的和减毒的。

4.段落1-3中任一项的病毒，其中所述核酸片段引入所述病毒的基因组中。

5.段落1-4中任一项的病毒，其中所述核酸片段以框内方式引入所述病毒的病毒编码区的阅读框中。

6.段落5的病毒，其中所述核酸片段紧接在所述病毒的病毒编码区的阅读框的终止密码子之前引入。

7.段落6的病毒，其中所述病毒进一步包含在所述核酸片段和所述病毒的病毒编码区之间编码的蛋白酶切割位点。

8.段落1-7中任一项的病毒，其中所述病毒是流感病毒。

9.段落8的病毒，其中所述核酸片段以框内方式引入所述病毒的神经氨酸酶(NA)编码区的阅读框。

10.段落9的病毒，其中所述核酸片段紧接在所述病毒的NA编码区的阅读框的终止密码子之前引入。

11.段落10的病毒，其中所述病毒进一步包含在所述核酸片段和所述病毒的NA编码区之间编码的蛋白酶切割位点。

12.段落7-11中任一项的病毒，其中所述蛋白酶切割位点包含在2A 自切割肽中。

13.段落12的病毒，其中所述2A自切割肽衍生自猪捷申病毒-1。

14.段落12或13的病毒，其中所述2A自切割肽侧接短肽接头。

15.段落14的病毒，其中所述肽接头是GSG。

16.段落1-15中任一项的病毒，其中所述α-1,3-GT是哺乳动物α- 1,3-GT。

17.段落1-16中任一项的病毒，其中所述α-1,3-GT是小鼠α-1,3-GT。

18.段落1-17中任一项的病毒，其中所述病毒通过以下方式减毒：在培养的细胞中连续传代、在异源宿主动物中连续传代、病毒中的基因缺失、病毒的定点诱变、改变病毒的密码子使用、选择冷适应突变体、使用来自异源宿主物种的相关病毒、使用天然存在的减毒病毒株、或其组合。

19.段落18的病毒，其中所述病毒通过在培养的细胞中连续传代而减毒，其中所述培养的细胞是Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。

20.段落1-19中任一项的病毒，其中所述病毒是流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人乳头瘤病毒、麻疹病毒、人免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、登革热病毒、东方马脑炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人疱疹病毒、人SARS冠状病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、里夫特裂谷热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、人嗜T淋巴细胞病毒或默克尔细胞多瘤病毒。

21.段落20的病毒，其中所述病毒是流感病毒。

22.包含段落1-21中任一项的病毒的疫苗，其中所述病毒是活的和减毒的。

23.包含由段落1-21中任一项的病毒表达的一种或多种病毒蛋白的疫苗，其中所述一种或多种病毒蛋白包含α-1,3-半乳糖。

24.疫苗接种方法，所述方法包括向有需要的受试者施用段落22或 23的疫苗。

25.段落24的方法，其中所述疫苗经鼻内、肺部、经口、皮下、肌内、皮内或腹膜内施用。

26.制备段落23的疫苗的方法，所述方法包括用所述病毒感染细胞，由此产生一种或多种包含α-1,3-半乳糖的病毒蛋白。

27.段落26的方法进一步包括纯化所述一种或多种病毒蛋白。

本文所述的重组流感病毒PR8/NAGT根据布达佩斯条约于2019年8月 22日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为P.O.Box 1549, Manassas,VA 20110美国，保藏号如下：PTA-125887。截至2019年8月22 日，保藏材料的存活能力已得到验证。

实施例

实施例1.在体外表达α-1,3-半乳糖基转移酶的NA突变体的表征。

材料和方法

NAGT突变体的生成

将从Balb/c小鼠的脾组织RT-PCR扩增的小鼠α-1,3-GT基因导入表达 PR8 NAvRNA(pHW2000-PR8-NA)(34)的质粒中，如图1所示。重组PR8 WT 病毒和NAGT病毒通过标准反向遗传技术(Hoffmann等人，PNAS，97：6108- 6113(2000))生成。拯救的病毒在含10天龄的胚胎的鸡蛋中培养，用于进一步扩增。拯救的病毒的病毒序列通过标准Sanger测序来确认。

蛋白质印迹分析

感染后24小时收获感染的A549细胞(MOI＝1)。细胞裂解物在12％分离 PAGE凝胶中分离。在测定中，1000倍稀释的兔抗神经氨酸酶抗体(ab21304； Abcam)和2000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG(ab205718； Abcam)分别用作一抗和二抗。

免疫荧光染色测定

如Leung等人，J.Virol.,86:10704-13(2012)中所述，感染后24小时将受感染的细胞(MOI＝1)固定在PBS中的4％多聚甲醛溶液中。在测定中，5倍稀释的小鼠抗-α-Gal单克隆IgM(M86，Enzo life sciences)和2000倍稀释的荧光染料缀合的山羊抗小鼠IgG/IgA/IgM抗体(10667，Invitrogen)分别用作一抗和二抗。DAPI用作核复染剂(Invitrogen)。对感染后24小时被WT病毒或 NAGT病毒感染的人A549细胞进行α-Gal表位染色。为了检测非透化细胞上的α-Gal表位，对用NAGT突变体或PBS(对照)处理的人A549细胞进行染色。染色方案如上所述，区别在于在初始细胞固定中未使用Triton X-100。

病毒复制动力学测定

用流感病毒(MOI＝0.001)一式三份感染MDCK细胞。在37℃下1小时的病毒吸附期后，用酸化PBS(pH 2.0)和PBS(pH 7.0)分别简单洗涤感染的细胞一次和两次，然后如Leung等人,J.Virol.,86:10704-13(2012)所述补充病毒培养基。后代病毒的滴度通过标准噬斑测定确定。

抗体依赖性NK细胞测定

如Jegaskanda等人，J.Immunol.，190:1837-1848(2013)中所述，以10的 MOI用NAGT或WT PR8病毒感染人A549细胞5小时。感染的细胞用PE- Cy7抗人HLA-A、B、C抗体(克隆W6/32，Biolegend)染色。PBS处理的细胞用作阴性对照。在热灭活的人血清(1:20稀释)存在下，将处理的A549细胞与抗人CD107a APC(克隆LAMP-1，Biolegend)处理的CD16.NK92细胞(Fox Chase Cancer Centre)共同孵育5小时。孵育后，细胞混合物用抗人CD56- PE抗体(克隆MEM188，Biolegend)染色并固定。然后用抗NP-FITC(Abcam) 抗体对处理过的细胞混合物进行染色。通过BD LSR Fortessa获得用于NK 细胞激活(CD56⁺CD107a⁺)和感染A549细胞(NP⁺HLA⁺)的信号。在没有与人血清预孵育的情况下生成感染细胞的信号，而在有/没有与人血清预孵育的情况下来自模拟感染细胞的信号用作对照。使用FlowJo分析所有数据。由于α-Gal表达，感染细胞的减少倍数(％)等于：

ADCC

商业萤光素酶报告基因测定试剂盒用于测量ADCC活性(ADCC受体生物测定试剂盒，Promega)。简而言之，A549细胞由WT或NAGT突变体(10 MOI)感染。感染后5小时，将细胞与稀释的人血清和重组Jurkat效应细胞共孵育6小时。不添加人血清的细胞混合物用作对照。通过标准萤光素酶测定法测量受感染细胞诱导的效应细胞的萤光素酶活性。ADCC反应的诱导倍数等于：

吞噬作用测定

如Manches等人，Haematologica，90：625-34(2005)中所述制备人单核细胞衍生的巨噬细胞。实验前一天，A549细胞由WT病毒或NAGT病毒(MOI＝1)感染，然后进行过夜培养。在实验当天，将感染的细胞与人血清在 4℃下孵育30分钟。将血清处理的细胞以3:1的比例添加到巨噬细胞中，并将细胞混合物在37℃下孵育2小时。孵育的细胞混合物用PBS洗涤，固定在4％多聚甲醛中，然后用Giemsa染色。在标准光学显微镜下检查染色的巨噬细胞。收集原代人单核细胞和人血清样品的工作得到了当地IRB的批准。

统计分析

除非另有说明，否则使用单因素方差分析来确定对细胞免疫反应幅度和细胞群图谱的影响。

结果

专职抗原呈递细胞(APC)如树突状细胞(DC)对抗原的摄取在获得性免疫中起关键作用。抗原摄取过程可以通过对抗原进行调理来增强，并且高水平的预先存在的特异性针对抗原的抗体可以促进这一过程(Boudreau和Alter, Front.Immunol.,10:440(2019))。半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)表位在膜表面的表达可以增强它们的调理作用，从而导致由在健康个体中自然表达的抗-Gal 抗体介导的APC的吞噬作用。这导致专职APC对感染细胞增强的吞噬作用 (Galili,Immunology,140:1-11(2013))。人多克隆抗-α-Gal抗体以不同的形式存在(IgA、IgG和IgM)，它们在健康个体中大量表达(约占循环免疫球蛋白的 1％)。α-Gal表位由多种活生物体表达。在内质网内α-1,3-半乳糖基转移酶(α- 1,3-GT)发生酶促反应后，该表位由表面糖蛋白或糖脂呈递(Galili,Immunology, 140:1-11(2013))。然而，人、猿类和旧大陆猴具有缺陷的α-1,3-GT基因，它们无法表达该表位(Galili,Immunology,140:1-11(2013))。由于食物和正常菌群中α-Gal表位的持续刺激，这些灵长类动物在其一生中会天然产生高水平的抗-α-Gal抗体。

已在癌症疗法和实验性疫苗中证明了使用α-Gal表位通过增强抗原摄取来刺激T细胞和B细胞反应(Albertini等人，Cancer Immunol.Immunother.， 65:897-907(2016)；Abdel-Motal等人，Vaccine，28：1758-65(2010)；Henion 等人，Vaccine，15：1174-82(1997))。先前的病毒疫苗研究是基于人工包被有α-Gal表位的灭活病毒抗原，这些疫苗已显示可以增强针对同源病毒感染的适应性免疫反应。然而，这种策略需要额外的酶处理以在这些抗原上生成α-Gal表位，从而降低了抗原产量和成本效益。本文生成了含有α-1,3-GT基因的减毒流感病毒，以便在感染细胞中表达α-Gal表位。

为了在感染细胞中表达α-gal表位，制备了在其神经氨酸酶(NA)vRNA 片段中携带小鼠α-1,3-GT基因的重组A/PR/8/34 H1N1(PR8)病毒(以下称为 NAGT突变体)(图1)。α-1,3-GT基因以同样的方式紧接在NA开放阅读框 (ORF)的终止密码子之前插入。将侧接短肽接头(GSG)的衍生自猪捷申病毒- 1的2A肽插入到NA和α-1,3-GT ORF的连接处，以使NA/α-1,3-GT多肽有效切割为NA和α-1,3-GT蛋白(Kim等人，PLoS One，6：e18556(2011))。 NA/α-1,3-GT多肽切割为NA和α-1,3-GT蛋白在通过蛋白质印迹检测流感 NA蛋白感染中得到证实，其中由WT病毒和NAGT病毒(MOI为1)感染的人A549细胞在感染后48小时收获(数据未显示)。将NA vRNA 5’端的包装信号(UTR和ORF区域的157nt)插入到NA/GT ORF序列的终止密码子附近。NAGT突变体在MDCK细胞中减毒(病毒滴度降低约2.5log)，但它仍然能够在感染细胞中实现相对稳健的复制，最大滴度为约5.8e5 pfu/ml(图2)。初步的小鼠感染研究表明，NAGT突变体在小鼠中减毒(WT的MLD50＝178 pfu；NAGT的MLD50＝2700pfu)。NAGT突变体在小鼠中的毒性比其WT对照低约15倍。尽管这种病毒背景(PR8)在小鼠中是致死性的，但它是制备季节性流感疫苗的标准主毒株。可能需要突变体的进一步减毒，例如通过使用密码子偏向微调病毒减毒水平(Fan等人，J.Virol.，89:10762-73(2015))。因此，NAGT突变体的减毒水平可以通过使用这种策略或其他方法来调整。

由NAGT突变体而非WT病毒感染的人细胞可以在细胞质和细胞表面表达α-Gal表位，如通过由WT病毒或NAGT病毒感染的人A549细胞中感染后24小时α-Gal表位的免疫荧光染色所证明的(数据未显示)。

NAGT突变体表达α-Gal表位可导致人抗-α-Gal抗体与感染细胞结合，增强APC对感染细胞的调理作用，从而增强疫苗诱导的适应性反应。为了证明这一点，经WT病毒和NAGT病毒感染的细胞用正常人血清处理，并获得了原代人单核细胞衍生的巨噬细胞吞噬这些细胞的能力。如图3所示， NAGT突变体感染的人A549细胞能显著增强人巨噬细胞的吞噬活性 (p<0.05)。由NAGT突变体感染的细胞在与人血清孵育后更容易被NK细胞杀伤(图4A和图4B)。这种增强的杀伤作用在由WT病毒感染的细胞中要小得多(图4C和图4D)。由WT病毒感染的细胞刺激的较低杀伤作用可能是由于正常个体中常见的流感病毒抗体的存在。在测试的6份人血清中，在5个样品中，由NAGT突变体感染的细胞比由WT病毒感染的细胞更可能被NK 细胞杀伤(图5；p<0.05)。NAGT突变体对免疫效应细胞的刺激作用通过使用抗体依赖性细胞毒性(ADCC)报告基因测定来证实(图6)。

总之，上述结果表明，NAGT感染的细胞的α-Gal表位表达可以刺激APC 的吞噬作用、NK细胞介导的细胞毒性和ADCC。这些增强的作用表明抗-α- Gal抗体对感染细胞的调理作用可以增强疫苗诱导的反应。

实施例2.用NAGT突变体接种后α-1,3-GT敲除小鼠的表征。

材料和方法

α-1,3-GT KO小鼠模型和免疫研究

WT C57BL/6及其α-1,3-GT KO小鼠(Tearle等人,Transplantation,61:13- 9(1996))购自中国Shanghai Model Organisms Center Inc。为了在KO小鼠中诱导抗-α-Gal抗体，在4和6周龄的小鼠腹膜内注射兔RBC膜(100μl PBS 中3x10⁸)(LaTemple和Galili，Xenotransplantation，5：191-6(1998))。在4、 6和8周龄时收集来自处理的小鼠的血清。如下所述通过ELISA测量处理的小鼠中的血清抗-α-Gal IgG1抗体水平。对于疫苗接种，在8周龄时将NAGT 病毒(25μl PBS中的150pfu)鼻内给予KO小鼠和WT小鼠。模拟疫苗接种的(PBS)WT小鼠和KO小鼠用作对照。

ELISA

将Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(3原子间隔区，Dextra)、重组NP或HA (SinoBiological)在4℃下在96-ELISA板(Nunc MaciSorp)上包被过夜。将汇集的血清样品(每组N≥4)从1:40开始连续稀释2倍。抗小鼠IgG1 HRP缀合抗体(31430,Invitrogen)用作二抗。测量450nm处的吸光度。每个样品重复测试一次。终点滴度≥4倍的差异被认为是显著的。

感染样品中的细胞图谱

使用Valkenburg等人,PNAS,111:5676-81(2014)中描述的方案在接种疫苗后第1、3、5和21天以及感染后第3和7天收获小鼠肺和脾组织(n≥5)。用RBC裂解缓冲液(eBioscience)溶血后，用Zombie Aqua(Biolegend)对细胞进行染色，然后对不同的细胞标志物进行染色(通过如下进行Fc阻断：抗- CD16/CD32,BD biosciences；抗-CD11b-FITC,CD11c-PerCP/Cy5.5,Ly6G- APC,F4/80-PE,MHC II-PB,Biolegend)。如Valkenburg等人,PNAS,111:5676- 81(2014)中所述固定染色细胞(BD Cytofix/cytoperm缓冲液)。研究了肺中DC 标志物(CD11c+MHCII高Ly6G-F4/80-)、中性粒细胞标志物(Ly6G高CD11b 高)、肺泡巨噬细胞标志物(CD11c+F4/80+)和脾脏中巨噬细胞标志物 (CD11b+F4/80+)。在BD LSRFortessa上进行信号采集，并通过FlowJo分析数据。这些细胞的门控策略显示在相应的图中。

ICS测定

CD4⁺和CD8⁺T细胞回忆反应如Horton等人，J.Immunol.Methods, 323:39-54(2007)和Yan等人,Virology,525:73-82(2018)中所述进行测定。检测到T细胞的1型(IFN-γ、TNF-α、IL-2)和2型(IL-4)细胞因子的产生。在感染后第7天收获脾细胞和来自BAL的细胞(每组n≥3)。RBC裂解后，用PR8 或HK68病毒刺激分离的淋巴细胞，并与抗CD28、抗CD49d(BDbiosciences)、 IL-2(Roche)共同孵育6小时，然后与Golgi plug(Brefeldin A,BDbiosciences) 孵育过夜。对于接种疫苗后3周的脾细胞，使用PR8、HK68、H1N1/布里斯班/07(H1N1)和HK/MPF461/07(H5N2)病毒刺激细胞。处理过的细胞首先用 Zombie Aqua^TM(Biolegend)染色，然后用T细胞标志物(通过如下进行Fc阻断：抗-CD16/CD32,BDbiosciences；抗-CD4 APC/Cy7,CD8 PerCP/Cy5.5, Biolegend)染色。然后用Cytofix/cytoperm缓冲液(BD)固定染色的细胞，然后进行细胞内细胞因子染色(IFN-γFITC、TNF-αAPC、IL-2PE、IL-4PE/Cy7、 Biolegend)。在BD LSR Fortessa上进行信号采集，并通过FlowJo分析数据。

统计分析

除非另有说明，否则使用单因素方差分析来确定对细胞免疫反应幅度和细胞群分布的影响。

结果

WT实验室小鼠具有功能性α-1,3-GT基因，它们不产生抗-α-Gal抗体以避免自身免疫。因此，使用α-1,3-GT敲除(KO)小鼠品系评价NAGT突变体的疫苗潜力(图7)(Tearle等人，Transplantation，61：13-9(1996))。这些KO 小鼠首先腹膜内注射兔RBC两次以刺激抗-α-Gal抗体产生(LaTemple和 Galili，Xenotransplantation，5：191-6(1998))。RBC处理的KO小鼠(第8-11 周)可以稳定地产生和维持高水平的抗-α-Gal抗体(表5)。相反，在RBC处理的WT小鼠中没有检测到抗-α-Gal抗体。

表5.第11周病毒攻击前不同实验组的抗-α-Gal抗体滴度。

在预定的鼻内疫苗接种剂量(150pfu)下，接种疫苗的WT小鼠和KO小鼠在接种疫苗后3周都可以产生高水平的针对H1N1而非H3N2病毒的中和抗体滴度(表6)，证明病毒疫苗本身不会刺激异亚型中和抗体的产生。使用细胞内细胞因子染色(ICS)测定法在体外测量接种疫苗小鼠脾脏组织中针对不同流感病毒亚型的流感病毒特异性CD4⁺或CD8⁺T回忆反应(TNF-α⁺)。与模拟接种疫苗的KO小鼠的结果相比，来自接种疫苗的WT小鼠和KO小鼠的脾CD4⁺T细胞可以由不同的病毒亚型(H1N1、H3N2和H5N2；p<0.05)刺激(图8)，证明在接种疫苗的小鼠中存在交叉反应性CD4⁺T细胞反应。在接种疫苗的小鼠中未观察到交叉反应性CD8⁺T细胞反应，但接种疫苗的WT 小鼠和KO小鼠对同源病毒(PR8)有一些但不显著的CD8⁺回忆反应(图9)。因此，在疫苗接种后第21天，接种疫苗的WT小鼠和KO小鼠之间的抗体和T细胞反应相似。

表6.在第11周病毒攻击前不同实验组中H1N1和H3N2病毒特异性中和抗体滴度。

为了确定NAGT突变体是否可以在其他免疫细胞中诱导更强烈的反应，在接种疫苗后1、5和21天研究了接种疫苗的小鼠脾脏(图10A-10C)和肺(图 11A-11E)中DC、巨噬细胞和中性粒细胞的频率。在接种疫苗后第1天，在 KO小鼠的脾组织中观察到DC群体(CD11c⁺MHCII^高Ly6G^-F4/80^-)的升高(图10A)，表明该突变体可以刺激DC迁移到脾中。相比之下，这些WT小鼠和 KO小鼠在这些时间点的脾脏中的中性粒细胞或巨噬细胞谱是相似的(图10B 和图10C)。

在这些接种疫苗的小鼠中观察到肺DC(CD11c⁺MHCII^高Ly6G^-F4/80^-)频率增加，分别在接种疫苗的WT小鼠和KO小鼠的第5天和第21天达到峰值(图11A)。除了动力学差异之外，在这些时间点，WT小鼠和KO小鼠中研究的DC群体略有不同(CD11b^高与CD11b^低/-)(图11B和图11C)。接种疫苗的KO小鼠增加的DC群体主要是CD11b^低/-(图11B)。相反，在接种疫苗后第5天，在接种疫苗的WT小鼠中可以检测到CD11b^高DC群体的显著增加 (图11C)和CD11b^低/-的微弱增加(相对未接种疫苗的对照不显著)(图11B)。在接种疫苗后第1天，在接种疫苗的WT小鼠中观察到中性粒细胞频率升高 (图11D)，这表明NAGT突变体在WT小鼠中引起相对更严重的炎症反应，因为这些小鼠中缺乏控制感染的抗-α-Gal抗体(Ueki等人，PNAS，115:E6622-E6629(2018))。接种疫苗的WT小鼠和KO小鼠在接种疫苗后都具有降低水平的肺泡巨噬细胞(图11E)，但是这种降低是无法区分的。

DC对于免疫监视至关重要。这种细胞群可以通过适应性免疫反应帮助消除病原体。调理的免疫复合物可以通过抗体的Fc部分与DC的Fcγ受体之间的相互作用被单核细胞衍生的DC有效内化(Guilliams等人，Nat.Rev. Immunol.，14:94-108(2014))。载有抗原的DC可以迁移到引流淋巴结以激活 T细胞。在淋巴系统中增加这种DC-T细胞相互作用有望增强针对流感病毒的免疫记忆反应(Eisenbarth,Nat.Rev.Immunol.,19:89-103(2019)；Lehmann等人,J.Exp.Med.,214:1509-1528(2017))。肺小鼠肺DC(CD11c⁺MHCII^高)可分为两个主要亚群：CD11b^低/-DC和CD11b^高DC(Condon等人,J.Leukoc.Biol., 90:883-95(2011))。在这项研究中，两个疫苗组在接种疫苗后具有增加的肺组织中的总DC群体，但这些接种疫苗的小鼠中增加的DC亚群是不同的。接种疫苗的KO小鼠中增加的DC群体完全是CD11b^低/-，而接种疫苗的WT小鼠中增加的DC群体主要是CD11b^高(图11B)。这表明NAGT突变体可以调节这些小鼠组中的保护性DC反应。

总体而言，这些结果表明NAGT突变体可以在接种疫苗后指导WT小鼠和KO小鼠中的DC和其他APC反应。

健康个体经常通过外部来源(例如，食物)暴露于α-Gal表位。这些常规暴露也解释了为何不同形式的α-Gal抗体(包括血清IgG)在正常个体中保持在高水平。有必要对这种疫苗方案的安全性进行进一步测试，如反复免疫 NAGT突变体的健康个体中的任何副作用。

实施例3.NAGT突变体可以保护小鼠免受致死性病毒攻击。

材料和方法

病毒攻击研究

在8周龄时，将NAGT病毒(25μl PBS中的150pfu)鼻内给予KO小鼠和WT小鼠。模拟接种疫苗的(PBS)WT小鼠和KO小鼠用作对照。如 Valkenburg等人,PNAS,111:5676-81(2014)中所述，在接种疫苗3周后，对处理的小鼠进行麻醉和用致死剂量(H1：40MLD₅₀；H3或H5：10MLD₅₀)的流感病毒进行鼻内攻击。本研究中使用的流感病毒是：PR8(A/波多黎各/8/1934；H1N1)、小鼠适应的HK68(A/香港/1/68；H3N2)或高致病性禽类H5N1(A/越南/1203/2004；H5N1)病毒。监测发病率和体重减轻14天，并记录生存曲线。百分之三十的体重减轻被设定为安乐死的人道终点。在指定的不同时间点收集来自代表性小鼠的组织样品。所有H5研究均在生物安全3级设施中进行。所有动物实验均经香港大学活体动物教学与研究委员会(CULATR)批准。

病毒负荷测定

在感染后第3天和第7天(N≥3)收获受攻击小鼠的肺，然后进行机械匀浆。使用Reed-Muench公式在MDCK细胞中通过TCID₅₀测定滴定病毒负荷。

血清学测定

如前所述通过ELISA和微量中和(MN)测定研究病毒攻击前后的热处理血清，以测量流感病毒特异性抗体滴度(Valkenburg等人,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 111:5676-81(2014)；Valkenburg等人,Vaccine 36:4198-4206(2018))。

如上所述进行ELISA。对于MN测定，将经过RDE处理的混合血清样品(每组n≥3)从1:10开始连续稀释2倍，并针对PR8或HK68病毒进行测试。中和抗体滴度以几何平均滴度值表示。

统计分析

除非另有说明，否则单因素方差分析用于确定对WT或KO组内的细胞免疫反应幅度、细胞群图谱以及病毒载量的影响，而t检验用于在相同时间点的WT小鼠和KO小鼠之间的相同目的。通过GraphPad Prism分析基于体重减轻的生存曲线。对数秩检验用于比较组间的存活率。

结果

NAGT突变体可以保护小鼠免受致死性同源攻击

首先通过同源攻击对NAGT突变体的疫苗潜力进行了测试。兔RBC致敏的WT小鼠和KO小鼠在接种疫苗后第21天接受致死剂量的WT PR8病毒(10MLD₅₀)的攻击。所有模拟接种疫苗的WT小鼠和KO小鼠都如预期死于感染。所有接种疫苗的KO小鼠和94％的接种疫苗的WT小鼠分别从攻击中存活下来(图12A)，在接种疫苗的KO小鼠组中没有明显的体重减轻(图12B)。两个接种疫苗组在攻击后都对流感NP蛋白产生了良好的抗体反应(表 7)。尽管两个接种疫苗组相较于未接种疫苗的对照组都具有大大降低的病毒肺滴度，但接种疫苗的KO小鼠比接种疫苗的WT小鼠具有更快的病毒清除率(图12C)。

在攻击后第7天，测量处理的小鼠的呼吸道(支气管肺泡灌洗，BAL)和脾脏样品中疫苗诱导的流感特异性T细胞反应。在用PR8离体刺激后，通过IFN-γICS测定法测量流感特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。在BAL中， KO小鼠的CD8⁺T细胞反应远高于WT小鼠的反应(例如，IFN-γ⁺和TNF-α⁺) (图13B)。在脾脏中，来自WT小鼠的IFN-γ⁺CD4⁺T细胞和IFN-γ⁺CD8⁺T 细胞反应仅比KO小鼠稍好，但足够显著(图14A和图14B)。还在攻击后第 0、3和7天测定了肺和脾组织中DC、中性粒细胞和巨噬细胞图谱，但未检测到这些小鼠之间的显著差异。

表7.病毒攻击后第0、7和14天小鼠中的NP特异性抗体滴度^a。

^a通过ELISA测定研究了抗体水平。

简而言之，在接种疫苗的KO小鼠中观察到的快速病毒清除和高度强烈的CD8+T细胞反应表明，在抗Gal抗体存在下，NAGT突变体可以在该小鼠模型中诱导增强的免疫反应，该小鼠模型体内表达高水平的抗-α-Gal抗体。

NAGT突变体可以保护小鼠免受致死性异亚型H3N2攻击

为了确定NAGT突变体对异亚型感染的保护作用，在病毒攻击中使用了小鼠适应的A/HK/1/68 H3N2(HK68；10 10MLD₅₀)病毒。所有接种疫苗的 KO小鼠都存活，而38％的接种疫苗的WT小鼠和所有未接种疫苗的小鼠死于感染(图15A)。此外，与对照相比，接种疫苗的KO小鼠体重减轻较少(图 15B)，肺中病毒清除速度较快(图15C)。在攻击后第7天，可以在接种疫苗的KO小鼠中检测到强烈的H3N2病毒特异性中和抗体和NP特异性抗体反应，但在接种疫苗的WT小鼠中检测不到(图15D和表8)。此外，在攻击后第14天，存活的接种疫苗的WT小鼠比接种疫苗的KO小鼠具有少得多的 NP特异性抗体。这些结果表明，NAGT突变体可以在KO小鼠中产生针对 H3N2病毒的有效异亚型抗体反应。这种增强的异亚型保护被证实需要在KO 小鼠中存在抗-α-Gal抗体(参见下面的实施例4)。

为了确定在接种疫苗的KO小鼠中的保护机制，研究了在攻击后第7天接种疫苗的WT小鼠和KO小鼠中的CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。发现在接种疫苗的KO小鼠的肺和脾组织中的H3N2流感病毒特异性CD4+T细胞反应比接种疫苗的WT小鼠的要强得多(图16A和图17A)。相反，在这两个接种疫苗组的CD8+T细胞反应之间没有检测到差异(图16B和图17B)。

研究了受感染的肺和脾组织中的DC、中性粒细胞和巨噬细胞群。来自两个接种疫苗组的肺组织在攻击后具有增加的DC频率(图18A)并且这些主要是CD11b^高DC反应(图18B和图18C)。有趣的是，虽然接种疫苗的WT 小鼠和KO小鼠之间的CD11b^高DC水平相似，但在攻击后第7天，接种疫苗的KO小鼠组的CD11b^低/-DC水平显著高于接种疫苗的WT组(图18B和图18C)。在脾脏中，在所有接种疫苗组中未观察到攻击后DC群体的显著增加。受感染的WT小鼠和KO小鼠中的中性粒细胞或巨噬细胞图谱也相似。

表8.病毒攻击后第0、7和14天小鼠中的NP特异性抗体滴度^a。

^a通过ELISA测定研究了抗体水平。

NAGT突变体可以保护小鼠免受致死性高致病性H5N1病毒攻击

在小鼠模型(A/VN/1203/04；10MLD₅₀)中研究了NAGT突变体对高致病性H5N1禽流感病毒感染的保护作用。所有接种疫苗的KO小鼠在致死性病毒攻击中存活(图19A)，而接种疫苗的WT小鼠存活率显著降低(70％；p<0.05)。在攻击后第7天，这两个接种疫苗组之间的肺病毒滴度没有显著差异(图19B)。然而，在攻击后第2周，在接种疫苗的KO组中观察到更快的恢复(图19C)。

因此，这些结果与来自上述H3N2研究的结果一起表明，NAGT突变体可以引发针对第1组(H1和H5)和第2组(H3)流感病毒感染的强烈的广泛交叉反应性免疫反应。

仅通过一次鼻内疫苗接种，接种疫苗的KO小鼠在病毒攻击后就可以产生增强的体液和/或细胞介导的反应。接种疫苗的小鼠在攻击前没有可检测到的预先存在的针对H3N2病毒的中和抗体。来自H3病毒攻击模型的结果表明，接种疫苗的KO小鼠在攻击后可以产生针对病毒表面和内部蛋白质的迅速和强大的抗体反应(图15D和表8)。这些结果表明，NAGT致敏的KO小鼠对异亚型流感病毒具有有效的交叉反应性记忆反应，从而激活早期体液反应以控制感染。随着在小鼠模型中观察到增强的T细胞反应，增强的保护可能涉及T细胞区室和B细胞区室之间的相互作用。

在接种疫苗的KO小鼠中，同源攻击可以引发强烈的CD8⁺T细胞回忆反应(图13A和图13B)，而异亚型攻击可以诱导强烈的CD4⁺T细胞回忆反应(图16A和图16B)。这些小鼠的BAL中的许多T细胞是产生多功能细胞因子的T细胞(图21A和图21B)，这表明接种疫苗的KO小鼠比接种疫苗的 WT小鼠具有更好的T细胞反应以控制病毒感染。接种疫苗的KO小鼠中这些不同的CD4⁺和CD8⁺反应也表明NAGT突变体在研究的H1和H3模型中的保护机制是不同的。具体而言，在H3病毒攻击后，接种疫苗的KO小鼠的BAL和脾脏样品中CD4⁺T细胞回忆反应增强。记忆CD4⁺T细胞对于异亚型流感保护至关重要(Valkenburg等人，PNAS，111：5676-81(2014)；Richards 等人，J.Virol.，83:6566-77(2009))。在接种牛痘载体通用流感疫苗的小鼠中耗竭记忆CD4⁺T细胞可在异亚型攻击后增加死亡率、延迟抗体产生并减少 CD8⁺T细胞回忆反应(Valkenburg等人，Vaccine，36:4198-4206(2018))。H3 模型的结果证实了这些发现。

在异亚型攻击后，在接种疫苗的KO小鼠中观察到增加的CD11b^低/-DC 频率(图15C)。DC的门控策略也表明这些是经典的DC(cDC)。非淋巴cDC 有两个主要亚群：CD103⁺CD11b^-cDC和CD103^-CD11b⁺cDC。因此，本研究中的CD11b^低/-DC被认为是CD103⁺cDC(Condon等人,J.Leukoc.Biol.,90:883- 95(2011)；Desch等人,Immunologic Research,55:178-186(2013)；Heath和 Carbone,Nat.Immunol.,10:1237(2009)；Merad等人,AnnualRev.Immunol., 31:563-604(2013))。CD11b^高cDC和CD11b^低/-cDC具有不同的功能。简而言之，肺CD11b^高cDC是Th2和Th17对细胞外病原体产生反应的有效诱导剂(Mesnil等人,PLoSOne,7:e53242(2012)；Plantinga等人,Immunity,38:322- 335(2013))，CD103⁺cDC通过致敏CD4⁺T细胞并通过MHC I受体将可溶性和凋亡细胞相关抗原交叉呈递给CD8⁺T细胞来促进Th1反应(Desch等人, J.Exp.Med.,208:1789-1797(2011)；Furuhashi等人,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol., 46:165-72(2012))。此外，已知CD11b^低/-cDC在流感病毒清除中起关键作用 (GeurtsvanKessel等人,J.Exp.Med.,205:1621-34(2008))。该细胞群通过吞噬受感染细胞而不是通过感染获得流感抗原，它可以促进分化的T细胞到淋巴结的肺归巢能力(GeurtsvanKessel等人,J.Exp.Med.,205:1621-34(2008)；Kim 等人,Immunity,40:400-13(2014)；Helft等人,J.Clin.Invest.,122:4037-47 (2012))。NAGT增强CD11b^低/-cDC反应的能力因此可有益于抵抗流感病毒感染。对这种CD11b^低/-cDC群体的进一步表征可能有助于解释NAGT突变体诱导的异亚型保护。

实施例4.增强的异亚型保护涉及KO小鼠中的抗-α-Gal抗体。

材料和方法

为了证明在KO小鼠中上述增强的疫苗诱导的保护作用是由于抗-α-Gal 抗体识别α-Gal表位，使用与上述H3模型所用方案相同的方案对有或没有预先注射兔RBC的KO小鼠进行疫苗接种和攻击。

结果

未经RBC处理的小鼠在接种疫苗和病毒攻击之前没有可检测水平的抗- α-Gal抗体(表9)。在体内不存在抗-α-Gal抗体的情况下，NAGT突变体增强的异亚型保护作用消失(图20A，KO NR组)。该接种疫苗组的存活率(40％) 与在接种疫苗的WT小鼠中观察到的存活率(38％)相似(图15A)。此外，这组小鼠比完全保护组具有更严重的体重减轻(图20B)。这些结果表明，在没有预先注射过兔RBC的情况下，α-1,3-GT KO小鼠和WT小鼠对流感病毒感染具有相似的易感性。这些结果也证实了NAGT突变体增强的保护作用取决于体内抗-α-Gal抗体的存在。

表9.在接种疫苗和病毒攻击之前小鼠中的抗-α-Gal抗体滴度^a。

^a通过ELISA测定这些小鼠组的血清抗-α-Gal抗体滴度。

^b有(KO)或没有(KO NR)兔RBC刺激的KO小鼠在8周龄时接种疫苗。

^c模拟处理的KO小鼠(KO(-)NR)用作对照。

生成了含有α-1,3-GT基因以便在受感染的细胞中表达α-Gal表位的减毒流感病毒。疫苗接种后病毒RNA和病毒蛋白在感染细胞中的表达可以进一步增强疫苗诱导的免疫反应。结果表明，这种方法是很有前景的疫苗策略，可以诱导针对流感的异亚型保护。

使用NAGT突变体作为LAIV与在体外用α-Gal表位对抗原进行酶标记以制备实验性灭活疫苗相比具有几个优点。首先，感染细胞表达α-Gal表位可以避免上述酶标记及其下游纯化步骤。其次，通过呼吸途径施用NAGT突变体可以诱导粘膜免疫反应。第三，天然表达的抗-α-Gal抗体可以安全地控制NAGT病毒在人体内的复制程度。第四，抗-α-Gal抗体标记的感染细胞可以触发抗体介导的细胞免疫反应。最后，受感染细胞表达的多种病毒抗原更容易被专职的APC摄取用于抗原呈递，从而增强下游疫苗诱导的针对广谱病毒蛋白的反应。

其他参考文献列表：

Wu等人,Clin.Infect.Dis.,51:1184-91(2010)。

Tam等人,Paediatr.Child Health,23:31-34(2018)。

Misharin等人,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,49:503-10(2013)。

应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

公开了可以用做、可以结合用于、可以用于制备的材料、组合物和组分，或者是公开的方法和组合物的产物。这些材料和其他材料在本文中公开，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的每种不同的单独和集体组合和排列的具体参考，但每种都在本文中具体考虑和描述。例如，如果公开和讨论了一种病毒，并且讨论了可以对包括该病毒在内的多种病毒进行的多种修饰，则除非另有特别地相反指示，否则病毒的每一种组合和排列以及可能的修饰都被具体考虑。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F和组合分子A-D的实例，那么即使每个分子没有单独列举，每个分子也都单独和集体考虑。因此，在该示例中，A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C- F的组合中的每个都被具体考虑并且应该被认为从A、B和C；D、E和F；和示例组合A-D的公开中公开。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子组被具体考虑并且应该被认为从A、B和C；D、E和F；和示例组合A-D的公开中公开。此外，如上所考虑和公开的材料、组合物、组分等中的每一个也可以具体且独立地包括或排除在此类材料的任何组、子组、列表、集合等中。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个都可以通过所公开方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行，并且每个这样的组合都被具体考虑并且应该视为已公开。

必须注意的是，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种病毒”包括多种此类病毒，提及“该病毒”是提及一种或多种病毒及其本领域技术人员已知的等价物，等等。

在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包含”和词语的变体，例如“包括”和“含有”，意思是“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其他添加剂、成分、整数或步骤。

“任选”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或材料可能会或可能不会发生或存在，并且描述包括事件、情况或材料发生或存在的实例以及期不发生或不存在的实例。

除非上下文另有明确说明，否则“可以”一词的使用表示所指对象或条件的选项或能力。通常，以这种方式使用“可以”意味着肯定地陈述选项或能力，同时还保留选项或能力可能在所指对象或条件的其他形式或实施方案中不存在的开放性。除非上下文另有明确说明，否则使用“可能”一词表示所指对象或条件的选项或能力。通常，以这种方式使用“可能”意味着肯定地陈述选项或能力，同时还保留选项或能力可能在所指对象或条件的其他形式或实施方案中不存在的开放性。除非上下文另有明确说明，否则此处使用的“可能”并不指对象或条件的未知或可疑特征。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，除非上下文另有明确说明，否则还具体考虑和认为公开从一个特定值和/或到另一个特定值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个具体考虑的实施方案，除非上下文另有明确说明，否则该实施方案应被视为公开。将进一步理解，每个范围的端点都显著相关于另一个端点且独立于另一个端点，除非上下文另有明确说明。应当理解，包含在明确公开的范围内的所有单个值和值的子范围也被具体考虑并且应该被认为是公开的，除非上下文另有明确说明。最后，应当理解，所有范围都将所列举的范围称为范围和从并包括第一端点到并包括第二端点的各个数字的集合。在后一种情况下，应当理解，可以选择任何单个数字作为该范围所指的数量、值或特征的一种形式。以这种方式，范围描述了从(包括)第一端点到(包括)第二端点的一组数字或值，从中可以选择集合的单个成员(即单个数字)作为范围所指的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方案中的一些或全部，上述内容都适用。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本方法和组合物的实践或测试，但特别有用的方法、装置和材料如所述。本文引用的出版物及其所引用的材料在此通过引用具体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公开。不承认任何参考构成现有技术。参考文献的讨论说明了作者的主张，申请人保留质疑引用文件的准确性和相关性的权利。将清楚地理解，尽管本文提到了许多出版物，但这种参考并不构成承认这些文件中的任何一个构成本领域公知常识的一部分。

尽管对材料、组合物、成分、步骤、技术等的描述可以包括许多选项和替代方案，但这不应被解释为也不承认此类选项和替代方案彼此等价，尤其是显而易见的选择。因此，例如，不同病毒的列表并不表明列出的病毒彼此之间是显而易见的，也不是承认等效性或显而易见性。

本文公开的每种病毒都旨在并且应被视为在本文中具体公开。此外，可以在本公开中识别的每个子组旨在并且应该被视为在本文中具体公开。因此，具体考虑到任何病毒或病毒的亚群可以被具体包括或排除在使用之外，或者包括或排除在病毒列表中。

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的方法和组合物的具体实施方案的许多等效物。这些等效物旨在由以下权利要求所涵盖。

Claims (27)

1.包含编码α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-GT)的异源核酸片段的病毒，其中当所述病毒感染宿主细胞时，所述核酸片段表达α-1,3-GT，其中当所述病毒感染所述宿主细胞时，至少一种暴露在所述宿主细胞表面上的蛋白质包含α-1,3-半乳糖。

2.权利要求1的病毒，其中当所述病毒感染所述宿主细胞时，由所述病毒表达的至少一种病毒蛋白包含α-1,3-半乳糖。

3.权利要求1或2的病毒，其中所述病毒是活的和减毒的。

4.权利要求1-3中任一项的病毒，其中所述核酸片段引入所述病毒的基因组中。

5.权利要求1-4中任一项的病毒，其中所述核酸片段以框内方式引入所述病毒的病毒编码区的阅读框中。

6.权利要求5的病毒，其中所述核酸片段紧接在所述病毒的所述病毒编码区的所述阅读框的终止密码子之前引入。

7.权利要求6的病毒，其中所述病毒进一步包含在所述核酸片段和所述病毒的所述病毒编码区之间编码的蛋白酶切割位点。

8.权利要求1-7中任一项的病毒，其中所述病毒是流感病毒。

9.权利要求8的病毒，其中所述核酸片段以框内方式引入所述病毒的神经氨酸酶(NA)编码区的阅读框中。

10.权利要求9的病毒，其中所述核酸片段紧接在所述病毒的所述NA编码区的所述阅读框的终止密码子之前引入。

11.权利要求10的病毒，其中所述病毒进一步包含在所述核酸片段和所述病毒的所述NA编码区之间编码的蛋白酶切割位点。

12.权利要求7-11中任一项的病毒，其中所述蛋白酶切割位点包含在2A自切割肽中。

13.权利要求12的病毒，其中所述2A自切割肽衍生自猪捷申病毒-1。

14.权利要求12或13的病毒，其中所述2A自切割肽侧接短肽接头。

15.权利要求14的病毒，其中所述肽接头是GSG。

16.权利要求1-15中任一项的病毒，其中所述α-1,3-GT是哺乳动物α-1,3-GT。

17.权利要求1-16中任一项的病毒，其中所述α-1,3-GT是小鼠α-1,3-GT。

18.权利要求1-17中任一项的病毒，其中所述病毒通过以下方式减毒：在培养的细胞中连续传代、在异源宿主动物中连续传代、所述病毒中的基因缺失、所述病毒的定点诱变、改变所述病毒的密码子使用、选择冷适应突变体、使用来自异源宿主物种的相关病毒、使用天然存在的减毒病毒株、或其组合。

19.权利要求18的病毒，其中所述病毒通过在培养的细胞中连续传代而减毒，其中所述培养的细胞是Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。

20.权利要求1-19中任一项的病毒，其中所述病毒是流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人乳头瘤病毒、麻疹病毒、人免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、登革热病毒、东方马脑炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人疱疹病毒、人SARS冠状病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、里夫特裂谷热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、人嗜T淋巴细胞病毒或默克尔细胞多瘤病毒。

21.权利要求20的病毒，其中所述病毒是流感病毒。

22.包含权利要求1-21中任一项的病毒的疫苗，其中所述病毒是活的和减毒的。

23.包含由权利要求1-21中任一项的病毒表达的一种或多种病毒蛋白的疫苗，其中所述一种或多种病毒蛋白包含α-1,3-半乳糖。

24.疫苗接种方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求22或23的疫苗。

25.权利要求24的方法，其中所述疫苗经鼻内、肺内、经口、皮下、肌内、皮内或腹膜内施用。

26.制备权利要求23的疫苗的方法，所述方法包括用所述病毒感染细胞，由此产生所述一种或多种包含α-1,3-半乳糖的病毒蛋白。

27.权利要求26的方法，其进一步包括纯化所述一种或多种病毒蛋白。

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