TWI432731B - 篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑之方法 - Google Patents

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篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑之方法
本發明係有關一種藥物篩選之技術。詳言之，本發明係關於篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑之方法。
肺癌在世界各國都是主要之死因，即使手術切除後，其預後非常不佳(Jemal等人，2009，CA Cancer J. Clin. 59:225-249)。當常規治療已發揮最大優勢或不再有效消除癌症時，免疫治療被視為可能一種有效的治療策略。樹突細胞(dentritic cell，DC)在先天和適應性免疫反應之引發上扮演舉足輕重之角色，而此等免疫反應係負責抗腫瘤免疫反應之誘導(Robson等人，2010，Curr. Opin. Immunol. 22:137-144)。累積之證據還表明，耐受性DC之出現亦負責腫瘤介導的免疫反應低下。自動物和人類癌症患者分離出之DC顯現出表型畸變和功能喪失(Liu等人，2009，J. Immunol. 182:6207-6216；Bluth等人，2009，J. Invest. Dermatol. 129:2451-2462)。此外，位於腫瘤微環境中之DC不只抑制以T細胞為基礎之抗癌免疫反應，還進一步促進腫瘤的生長、侵襲和血管新生(Curiel等人，2004，Cancer Res. 64:5535-5538；Wilcox等人，2009，Blood. 114:2936-2944；Dhodapkar等人，2008，Cell Death Differ. 15:39-50)。然而，儘管這些結果皆顯示一致之結論，但腫瘤細胞逃避免疫監視而介導免疫抑制之機制仍然難以捉摸，而阻礙了有效免疫治療策略之制定。
蛋白-聚醣間之交互作用在許多包含癌症發展之生物過程具有至關重要之作用，如癌症轉型、生長、轉移、血管生成和免疫監視(Rek等人，2009，Br J Pharmacol. 157:686-694；Ilarregui等人，2010，Neuroimmunomodulation. 17:157-160)。半乳糖凝集素(Galectin)為一種醣結合蛋白，其對細胞表面醣蛋白或醣脂之N或O-聚醣上之N-乙醯乳糖胺(N-acetyllactosamine)序列具高親和性。半乳糖凝集素-1為此家族中首先發現之蛋白質，已發現可向上調節許多癌症，包括星形細胞瘤、黑色素瘤、口腔、結腸、膀胱癌和卵巢癌。半乳糖凝集素-1在腫瘤中之過度表現也被證實與這些腫瘤之侵略性和轉移之發展相關(Demydenko等人，2009，Exp. Oncol. 31:74-79；Ding等人，2009，Oncol. Rep. 21:983-987；Cindolo等人，1999，Int. J. Cancer. 84:39-43；Wu等人，2009，Mol. Cancer Res. 7:311-318)。
然而，針對樹突狀細胞對腫瘤反應低下之機制目前仍不清楚，其與肺癌之潛在關連亦仍是未知，無法針對此等機制開發合宜之治療藥物，因此本技藝中亟需一種因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑之方法，以治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下。
發明概述
本發明證實肺癌細胞可分泌高量之半乳糖凝集素-1，並發揮抑制DC反應之作用。根據本發明，半乳糖凝集素-1改變源自單核細胞之樹突細胞(monocyte-derived dendritic cell，MdDC)中受自泌激素介白素(interleukin，IL)-10影響之功能，此功能呈現DNA結合抑制因子3(Inhibitor of DNA binding 3，Id3)依賴性。根據本發明，小鼠和人類患者之腫瘤組織可發現DC之浸潤，並表現高含量之IL-10，因此，半乳糖凝集素-1係介導腫瘤之免疫抑制，可作為一潛在之治療目標，以加強免疫監視並進一步治療肺癌。
本發明提供一種篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑之方法，其包含檢測一待測物是否可抑制經半乳糖凝集素-1所介導之DNA結合抑制因子3/介白素-10訊號傳遞鏈之活化因子活性；或是檢測該待測物是否可活化經半乳糖凝集素-1所介導之DNA結合抑制因子3/介白素-10訊號傳遞鏈之抑制因子活性；其中該活化因子係選自由半乳糖凝集素-1、DNA結合抑制因子3、介白素-10、介白素-4、介白素-13、介白素-27、轉化生長因子(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)、DNA結合抑制因子3與E2A之交互作用、磷脂醯肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)及AKT所組成之群；及該抑制因子係選自由介白素-12、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor)α、干擾素(Interferon，IFN)γ、E2A、Jak 2及泛蛋白質激酶C(pan-protein kinase C，pan-PKC)所組成之群。
本發明又提供一種篩選治療因肺癌所引起之免疫抑制之候選藥物之方法，其包含前述之方法，以篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑。
本發明再提供一種篩選肺癌候選藥物之方法，其包含前述之方法，以篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑。
發 明詳細說明
本發明基於經肺癌引起免疫抑制之分子機制，而提出重要之分子標記，並藉由觀察此等分子標記之活性以篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑。
因此本發明提供一種篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑之方法，其包含檢測一待測物是否可抑制經半乳糖凝集素-1所介導之DNA結合抑制因子3/介白素-10訊號傳遞鏈之活化因子活性；或是檢測該待測物是否可活化經半乳糖凝集素-1所介導之DNA結合抑制因子3/介白素-10訊號傳遞鏈之抑制因子活性；其中該活化因子係選自由半乳糖凝集素-1、DNA結合抑制因子3、介白素-10、介白素-4、介白素-13、介白素-27、轉化生長因子、DNA結合抑制因子3與E2A之交互作用、磷脂醯肌醇-3-激酶及AKT所組成之群；及該抑制因子係選自由介白素-12、腫瘤壞死因子α、干擾素γ、E2A、Jak 2及泛蛋白質激酶C所組成之群。
本發明所言之「因肺癌所引起樹突細胞功能低下」係指因肺癌細胞所誘導而引發之免疫抑制現象，特別是樹突細胞功能低下現象。於活體內可意指罹患肺癌個體中所產生之樹突細胞功能低下現象或是免疫抑制；於活體外可意指肺癌細胞培養物或由肺癌病患血清所誘發之樹突細胞功能低下現象或是免疫抑制。本文中所言之「樹突細胞功能低下」係包含樹突細胞之分化、呈現抗原及樹突細胞之成熟等功能之低下；較佳地，其係指單核細胞分化為樹突細胞之功能低下、樹突細胞呈現抗原之功能低下或樹突細胞成熟為T細胞之功能低下。
本發明所言之「候選劑」係指經初步篩選而得可能具有治療功能之物質。根據本發明之方法係提供一初步且快速之篩選平台，以篩選可能具有治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下功能之物質，俾利進行後續更進一步之動物模式或是臨床確認。
根據本發明之檢測一待測物是否可治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者可決定者，於本發明之一較佳具體實施例中，該方法包含下列步驟：
(a)提供一測試細胞培養物；
(b)於該測試細胞培養物中添加該待測物；及
(c)檢測該測試細胞之該活化因子活性是否因添加該待測物而減少；或是該抑制因子活性是否因添加該待測物而增加。
根據本發明之方法，較佳係於一測試細胞中檢測待測物是否可影響經半乳糖凝集素-1所介導之DNA結合抑制因子3/介白素-10訊號傳遞鏈相關因子之活性，於本發明之一較佳具體實施例中，該測試細胞包含外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell)；另一方面，該測試細胞培養物包含以一條件培養基(conditioned medium，CM)培養該測試細胞。較佳地，該條件培養基包含肺癌細胞培養基、取自肺癌病患之血清或半乳糖凝集素-1。該以條件培養基培養之外周血單核細胞係模擬活體內經肺癌影響之環境，以提供一與活體較相似之模型。於下述之實例中，藉由肺癌細胞株A549及H460或肺癌病患或荷瘤小鼠血清所得之條件培養基及外周血單核細胞，以觀察樹突細胞功能。
根據實例之結果，不論是A549或H460等肺癌細胞株，其細胞培養基中半乳糖凝集素-1比正常支氣管上皮細胞都高，進一步從肺癌病患中發現半乳糖凝集素-1 mRNA表現量在腫瘤切塊比非腫瘤切塊高，而且肺癌病患血液中之半乳糖凝集素-1亦比健康捐贈者高。為了解半乳糖凝集素-1是否抑制免疫反應，發現加入A549或H460之肺癌細胞株的細胞培養基或重製半乳糖凝集素-1，都會抑制單核細胞分化成樹突細胞，而這過程會被乳糖所阻斷，證明了肺癌藉分泌半乳糖凝集素-1以抑制單核細胞分化成樹突細胞，再者，肺癌病患之血液亦抑制單核細胞分化成樹突細胞。
進一步探討肺癌細胞所分泌之半乳糖凝集素-1對MdDC功能及T細胞反應之影響，結果發現當用LPS刺激時，MdDC之成熟的標記包括CD1a、CD83及CD86會增加，但肺癌細胞株的細胞培養基及重製半乳糖凝集素-1則抑制此作用，且更進一步抑制其所分泌的發炎前驅細胞激素例如IL-12及TNF-α，但增加免疫抑制之細胞激素IL-10。DC之主要功能是呈現抗原給T細胞、誘導T細胞增生與活化，但肺癌細胞株的細胞培養基及重製半乳糖凝集素-1會抑制CD4+ T細胞之增生，其不僅降低趨向Th1之細胞激素(例如IFN-γ與TNF-α)的分泌量，更誘導IL-10之分泌，更甚者，肺癌細胞株的細胞培養基及重製半乳糖凝集素-1會促進MdDC分泌IL-27與TGF-β，促使處女型CD4+ T細胞走向CD4+ CD25+ FOXP3+ Treg。過去的研究報導腫瘤所分泌之IL-10會抑制單核細胞分化成樹突細胞，然而根據本發明，不論是A549或H460之肺癌細胞株的細胞培養基內都未偵測到IL-10，反而是用A549或H460之肺癌細胞株的細胞培養基及重製半乳糖凝集素-1加入CD14+ 單核細胞會發現IL-10 mRNA及蛋白質之表現增加，此過程不僅會被乳糖所阻斷，亦因A549敲除而降低。另外，重製的IL-10(rhIL-10)會抑制單核細胞分化成樹突細胞，而此作用與肺癌細胞株的細胞培養基及重製半乳糖凝集素-1之結果一致。更深入探究發現，若先將CD14+ 單核細胞之IL-10敲除，則逆轉了肺癌細胞株的細胞培養基及重製半乳糖凝集素-1抑制單核細胞分化成樹突細胞的作用。
更進一步，根據本發明，肺癌細胞株之條件培養基及重製半乳糖凝集素-1會增加CD14+ 單核細胞中Id3的表現，亦增加Id3與E2A連結之交互作用，如果先將CD14+ 單核細胞的Id3敲除，則逆轉了肺癌細胞株之條件培養基及重製半乳糖凝集素-1抑制單核細胞分化成樹突細胞的作用。A549或H460之肺癌細胞株之條件培養基及重製半乳糖凝集素-1加入CD14+ 單核細胞會發現Id3 mRNA的表現增加，此過程可被乳糖阻斷，也因半乳糖凝集素-1之敲除而降低，所以半乳糖凝集素-1誘導了CD14+ 單核細胞中Id3的表現。為進一步了解Id3與IL-10的關係，先將CD14+ 單核細胞的Id3敲除，則發現阻斷了肺癌細胞株之條件培養基及重製半乳糖凝集素-1所誘導CD14+ 單核細胞中IL-10的表現；相對的，將Id3的質體轉殖至CD14+ 單核細胞使其過度表現則會增加IL-10的表現，此外，肺癌細胞株之條件培養基及重製半乳糖凝集素-1加入CD14+ 單核細胞會誘導IL-10啟動子活性，而Id3的質體轉殖至CD14+ 單核細胞亦有此作用。當將敲除CD14+ 單核細胞的IL-10亦阻斷肺癌細胞株之條件培養基及重製半乳糖凝集素-1所誘導CD14+ 單核細胞中Id3之mRNA表現，而重製的IL-10(rhIL-10)會誘導CD14+ 單核細胞中Id3之表現，而這機制主要透過PI3K/AKT途徑。
進一步免疫螢光染色病患腫瘤組織，發現在腫瘤組織區域中浸潤的CD11c+ DC明顯發現IL-10，且從病患腫瘤組織中分離的CD11c+ DC有較高的IL-10表現量，但是在肺癌病患與健康捐贈者的血清中，其IL-10的表現無明顯差異。接續將小鼠的肺癌細胞株LLC以尾靜脈注射打進小鼠體內，與對照組比較，LLC組表現較高的半乳糖凝集素-1，且用LLC的細胞培養基及重製半乳糖凝集素-1加至小鼠的骨髓細胞，則會誘導IL-10的表現，此結果與先前人的肺癌細胞株之結果一致。用免疫螢光染色發現在小鼠腫瘤組織區域中浸潤的CD11c+ DC明顯發現IL-10，且從腫瘤組織中分離的CD11c+ DC有較高的IL-10 mRNA與蛋白質表現量。將半乳糖凝集素-1敲除之LLC，以尾靜脈注射小鼠體內，半乳糖凝集素-1敲除組中，其腫瘤組織分離的CD11c+ DC之IL-10蛋白質表現量降低，免疫螢光染色亦有相同之結果。更甚者，從動物實驗結果發現半乳糖凝集素-1敲除可降低肺癌發生率。
根據本發明之方法，因子活性之檢測係為本發明所屬技術領域中具通常知識者可實施者，例如下述實例中使用商用抗體檢測其活性，較佳地，該因子活性之檢測係利用針對該因子特異之抗體進行酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)。
本發明亦提供一種篩選治療因肺癌所引起之免疫抑制之候選藥物之方法，其包含前述之方法，以篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑。
本發明再提供一種篩選肺癌候選藥物之方法，其包含前述之方法，以篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑。
茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯其並不意謂本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。
實例
材料與方法
肺癌細胞條件培養基：
人類肺癌細胞A549和NCI-H460及小鼠Lewis肺癌細胞(LLC)係自生物資源保存及研究中心(新竹，台灣)獲得。人類支氣管上皮細胞(HBEC)均購自Lonza(沃金厄姆，英國)。條件培養基之製備係將細胞接種在2×106 細胞/10 mm盤並培養24小時，再經48小時之培養後，更換培養基並收穫其上清液。
肺癌患者血清樣本：
自高雄醫學大學附設醫院(KMUH，高雄，台灣)胸腔暨重症醫學科之40例肺癌患者和15健康捐贈者取得術前血液樣本。經離心分離得血清並冷凍於-80℃。自2006至2010年在KHMH收集十五對腫瘤和鄰近非腫瘤性肺組織以進行即時PCR和免疫螢光分析，並分離浸潤CD11c+ 細胞，且經病理學家證實。所有患者之臨床特徵示於下表1。這些研究係經獲得機構審查委員會(IRB)批准，並按照赫爾辛基宣言告知KMUH和所有患者。
CD14 + 單核細胞之分離及MdDC之分化：
採用Ficoll-Hypaque梯度(GE Healthcare Bio-Sciences，小查爾方特，英國)自健康捐贈者血液樣品中分離單核細胞。單核細胞CD14+ 細胞係利用CD14+ 單株抗體偶聯磁珠(MACS MicroBeads，Miltenyi Biotec)根據製造商之指示純化。
MdDC之生產係將CD14+ 單核細胞培養於含10%胎牛血清、20 ng/mL之GM-CSF和10 ng/mL之IL-4(R & D System，明尼阿波利斯，明尼蘇達州)之RPMI 1640培養基(Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)中5天。第3天更換含GM-CSF和IL-4之新鮮培養基。為使MdDC成熟，在以干擾素-γ啟動3小時後，再以LPS刺激(100 ng/mL)。
流式細胞儀：
MdDC之各特徵係以螢光標記的單株抗體標籤(CD1a-FITC或PE、CD80-PE、CD40-APC、CD209-FITC、CD11b-PE、CD11c-APC、CD1b-FITC、HLA-ABC-PE、CD14-APC或FITC、CD83-FITC及CD86-APC，全購自BD PharMingen，聖地牙哥，加利福尼亞州)採用BD FACSArray生物分析儀分析。收集資料，並使用CellQuest軟體(Becton Dickinson)分析10,000事件。
異體混合淋巴細胞反應(Mixed lymphocyte reaction，MLR)：
根據製造商之指示，使用免疫磁性CD4處女型T細胞(MACS microBeads，Miltenyi Biotec)自健康捐贈者之PBMC純化人類T細胞。將激活MdDC(104 細胞/孔)於96孔盤中與處女型CD4 T細胞(105 細胞/孔)一起培養一組的天數(細胞增殖測定：4天，細胞激素測定：1天；調節性T細胞(Treg細胞)分析：7天)，並進行MLR。在某些情況下，於培養後第3天使用10μM的溴(BrdU)標記CD4+ T細胞(Millipore)，然後第4天用ELISA基礎之方法分析增殖。
分泌因子之測量：
從DC或T細胞收集上清液，並使用細胞激素微珠陣列進行多重細胞激素分析，以測試樣品中之IL-2、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-5、IL-12、IL-17和干擾素γ(CBA：Becton Dickinson)。TGF-β和IL-27含量則根據製造商之指示，使用DuoSet ELISA Development System(R & D System)定量。半乳糖凝集素-1之含量如前所述利用以ELISA基礎之方法進行評估。
即時RT-PCR：
RNA分離係使用TRIzol試劑(Invitrogen)進行，並使用基因寡核苷酸(dT)引子和逆轉錄酶(Takara，滋賀，日本)依標準程序製備cDNA。即時PCR技術係應用SYBR Green技術，並在ABI 7500即時PCR系統(Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亞，美國)進行。每個PCR反應混合物包含：引子各為200 nM、10 μL的2xSYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亞，美國)5 μL的cDNA和無RNase的水，總體積為20 μL。PCR反應為進行一次變性95℃ 10分鐘，然後40個循環之95℃ 15秒和60℃ 1分鐘。全部PCR進行三次重複，並使用甘油三磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA作為內部對照，並用2-△△CT 方法表示相對表現量。
免疫墨點/免疫沈澱：
將細胞以M-PER裂解試劑(Pierce，美國)於冰上裂解15分鐘，再將細胞裂解液離心14,000×g 15分鐘，收集上清液進行免疫墨點分析。對應數額的蛋白質以SDS-PAGE(8-12%)解析，並轉移至PVDF膜。於含5%脫脂牛奶之Tris緩衝液阻斷1小時後，將膜與所需之初級抗體培育1至16小時，然後以適當過氧化酶標記之二級抗體處理，並使用化學發光套組(Millipore)根據製造商之指示檢測免疫化之蛋白。免疫沈澱則根據製造商之指示使用Profound IP套組進行。
IL-10啟動子分析：
質體pIL-10-Luc之建構係將近端啟動子序列插入(-895-+121 bp，相對於轉錄起始位點)人類IL-10基因，以製備成pTL-Luc質體(Panomics；弗里蒙特，加利福尼亞州)，並經DNA定序證實。海腎(Renilla )螢光酵素載體(Promega，麥迪遜，威斯康星州)也與pIL-20-Luc以電穿孔(Amaxa Nucleofector II System)共轉染，以作為內部對照。細胞萃取物中之啟動子活性測定係使用雙螢光酵素報告基因分析系統(Promega，麥迪遜，威斯康星州)進行，並以螢光酵素(螢光酵素活性/海腎活性)相對於對照組表示。
基因的siRNA敲除：
將單核細胞根據製造商之指示，以1 μmol/L之非目標、Id3或IL-10 Accell siRNA池(Dharmacon)在Accell傳遞介質(B-005000)轉染，並使用陽性對照Accell GAPDH siRNA和爭奪(scrambled)Accell siRNA池。轉染72小時後，將培養基改為全培養基。Id3和IL-10之變化係由前述之即時PCR測定。A549中半乳糖凝集素-1之敲除係由慢病毒(lentiviral)表現系統(由National RNAi Core Facility，台北，台灣提供)進行，其中慢病毒係以pLKO-AS2或pLKO-AS2-LGALS1 shRNA與兩個包裝質體(pCMVVDR8.91和pMD.G)共轉染HEK293T。在Lewis肺癌細胞(LLC)中之半乳糖凝集素-1敲除係使用半乳糖凝集素-1之shRNA(m)慢病毒顆粒(Santa Cruz，加利福尼亞州)按照製造商的指示進行。單核細胞以0.5 μg的Id3表現質體或GFP表現質體進行核染(nucleofected，Amaxa)，在24小時轉染後，將單核細胞接種於24孔盤，並收集培養基進行IL-10之ELISA檢測。
動物模型和從肺部分離CD11c + 細胞：
將LLC細胞自尾靜脈移植C57BL/6小鼠。於注射後14天收集肺組織，然後剁碎並培養於37℃含膠原蛋白酶1型(400 U/mL)(Worthington Biochemicals)之RPMI 1640培養基1小時。消化後之組織以70 μm細胞過濾器過濾，並以RPMI 1640培養基洗滌。利用CD11c磁珠(Miltenyi)自懸浮液分離CD11c+ DC。自小鼠之四肢長骨收穫骨髓細胞，並放置在帶或不帶小鼠半乳糖凝集素-1或LLC之含有小鼠GM-CSF和小鼠IL-4(20 ng/mL，R & D System)的RPMI 1640(20 ng/mL)培養48小時。各種基因的表現測定採用即時PCR進行。
免疫螢光：
將從人和小鼠獲得之非癌和癌變肺組織嵌入在OCT和冷凍液態氮。將切片(3-5 μm)在-20℃以丙酮固定，然後使用抗半乳糖凝集素-1抗體(R & D System)染色或以抗CD11c抗體和抗IL-10抗體(1:10，Abcam，英國)共同染色。用含0.1% Tween-20(PBST)之PBS洗滌後，將載玻片以Dylight 488或Dylight 549標記的二級抗體(Rockland，吉爾伯茨，PA)及含或不含DAPI在室溫下孵育1小時。用共聚焦激光掃描顯微鏡(Fluoview FV500，Olympus，東京，日本)對數據進行分析。
統計分析：
數據以平均值±標準差表示。結果之統計比較係使用方差分析(ANOVA)進行。兩個試驗組之明顯差異(p <0.05)係採Student'st 檢驗。
結果
半乳糖凝集素-1在肺癌細胞株和肺癌患者之表現不同：
相對於正常支氣管上皮細胞(HBEC)，幾個編碼已知免疫調節劑之基因表現顯著提高，其中在兩個肺腫瘤細胞株A549和NCI-H460培養基中發現(圖1A)半乳糖凝集素-1具高表現量，同時由即時PCR分析，半乳糖凝集素-1 mRNA在腫瘤切塊之表現亦明顯高於非腫瘤切塊由(n=15，p =0.00026)(圖2A)。此外，半乳糖凝集素-1在40例肺癌患者血清中之含量對比於取自15名健康捐贈者(圖1B)亦升高。
MdDC在存在半乳糖凝集素-1和肺癌細胞-CM之表型變化：
存在IL-4和GM-CSF下培養單核細胞，可分化成未成熟MdDC並表現特有之標記，包括CD209和CD11c，但單核細胞標記CD14的表現則丟失(圖2B)。然而，CD1a和CD14表現模式之大量改變可在含有肺癌-CM或半乳糖凝集素-1之細胞培養基中培養時觀察到。與對照組MdDC相比，CD1a表現明顯低於以A549-C、NCI-H460-CM及半乳糖凝集素-1處理之MdDC，這些細胞之次族群仍顯著CD14的表現(圖2B)。CD80和CD1b之相對表現量在A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1處理之MdDC中較低(圖2B)。重要的是，除了添加一個眾所周知之半乳糖凝集素-1阻滯劑，糖乳糖，以防止半乳糖凝集素-1結合至醣化蛋白質，可扭轉A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1對MdDC之調節活性(圖2C和圖1C)。作為比較者，在肺癌細胞株中細胞激素包括CXCL1、CXCL5和IL-8之過度表現對MdDC之表型並無明顯的調節作用(圖1D)。
此外，在從每個20例肺癌患者獲得之15%血清存在下培養單核細胞，相比在健康捐贈者血清存在下培養MdDC，亦發現CD1a和CD14模式有類似之改變。CD1a、CD1b、CD40和CD8之減量表現亦在含病患血清之細胞培養中觀察到。同樣地，CD14仍居高不下地表現在一個存在於肺癌病患血清培養基的MdDC次族群中(圖2D和圖1E)。
肺癌-CM和半乳糖凝集素-1修改MdDC功能和T細胞反應：
將MdDC暴露於LPS可增加MdDC所有的成熟標記，包括CD1a、CD83和CD86；相反地，A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1則抑制在LPS刺激下，MdDC中CD1a、CD83和CD86表現之向上調節(圖3A)。此外，A549-CM，NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1也降低MdDC產生可增加免疫抑制IL-10分泌之發炎前驅細胞激素IL-12和TNF-α之能力(圖3B)。
於測試肺癌-CM及半乳糖凝集素-1處理之MdDC在調節適應T細胞反應時，相較於在正常條件之培養，經肺癌-CM或半乳糖凝集素-1處理之MdDC顯示其誘導處女型CD4+ T細胞增殖之能力受損(圖3C)。值得注意的是，與以無條件培養MdDC刺激CD4+ T細胞相比，共同培養處女型CD4+ T細胞與A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1處理之MdDC中，Th1細胞激素(干擾素-γ和TNF-α)分泌之顯著降低及IL-10增加。此外，在CD4+ T細胞中，IL-4與IL-13之Th2細胞激素和IL-17A之表現經與肺癌-CM或半乳糖凝集素-1處理之MdDC共培養後增強(表2)。
此外，在與肺癌-CM和半乳糖凝集素-1處理之MdDC共培養之CD4+ T細胞中，自然發生的CD4+ CD25+ FOXP3+ Treg頻率顯著提高(圖3D)。有趣的是，經處理之MdDC對Treg細胞生成之影響證實A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1刺激MdDC生產IL-27和TGF-β(圖4A和B)，IL-27和TGF-β兩者都可刺激CD4+ CD25+ FOXP3+ ，並從處女型T細胞產生Treg細胞。
肺癌-CM和半乳糖凝集素-1增加IL-10表現，並通過自分泌作用改變MdDC之表型：
結果顯示，A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1增加CD14+ 單核細胞IL-10之mRNA和蛋白質生產(圖5A和圖6A)。此外，rhIL-10可中和CD1a、CD80和CD1b之刺激，並扭轉了由GM-CSF和IL-4造成的CD14下降(圖5B)。此抑制模式與肺癌細胞-CM和半乳糖凝集素-1對MdDC之抑制相符。乳糖之添加降低了A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1對IL-10之向上調節(圖5C)。再者，半乳糖凝集素-1敲除之A549-CM則失去對IL-10之向上調節活性(圖6B)。為了評估IL-10於肺癌-CM和半乳糖凝集素-1對MdDC分化抑制之貢獻，進一步以siRNA轉染以干預IL-10之效果，結果顯示相對於非目標性之siRNA轉染CD14+ 單核細胞，IL-10之siRNA有效減少CD14+ 單核細胞之IL-10表現達85%(圖6C)。以siRNA敲除之IL-10 CD14+ 單核細胞足以扭轉肺癌-CM和半乳糖凝集素-1對DC之分化效果(圖5D)。
肺癌細胞-CM和半乳糖凝集素-1之介導能力係經修改Id3和E2A蛋白的表現及交互作用：
結果顯示肺癌-CM或半乳糖凝集素-1並不改變Id1、Id2和E2-2的表現(數據未顯示)，但可增加Id3於CD14+ 單核細胞中的表現。此外，A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1亦降低E2A之表現(圖7A)。再者，兩種肺癌-CM和半乳糖凝集素-1也增加Id3和E2A在CD14+ 單核細胞中之交互作用，並呈時間依賴性(圖7B)。
為更了解Id3之角色，使用的siRNA敲除Id3，結果表明，與對照siRNA轉染相比較，Id3之siRNA減少CD14+ 單核細胞中Id3的表現(圖8A)。Id3表現之特異性敲除可逆轉A549-CM和NCI-H460-CM對CD14+ 單核細胞從MdDC分化之抑制作用(圖7C)。有趣的是，如果以siRNA敲除Id3，CD14+ 單核細胞之細胞活力在以半乳糖凝集素-1處理48小時後降低。然而，半乳糖凝集素-1對CD14含量之影響在Id3敲除24小時後逆轉(圖7C)。再者，乳糖之添加抑制了A549-CM和半乳糖凝集素-1對Id3之向上調節，表明半乳糖凝集素-1參與肺癌介導之Id3向上調節(圖7D和圖8B)。
為確定是否IL-10之向上調節係受Id3所控制，進一步評估單核細胞中經歷Id3敲除或Id3過度表現之IL-10含量。Id3敲除廢除了A549-CM、NCI-H460-CM和半乳糖凝集素-1所介導之IL-10向上調節(圖9A)，而Id3的過度表現增強CD14+ 單核細胞中IL-10之生產(圖10A)。此外，存在A459CM、NCI-H460-CM或半乳糖凝集素-1時，CD14+ 單核細胞中IL-10啟動子活性顯著提高(圖9B)。過度表現Id3之細胞中也觀察到IL-10啟動子活性增加(圖10B)。有趣的是，IL-10敲除也降低了由肺癌-CM和半乳糖凝集素-1對CD14+ 單核細胞中之Id3向上調節(圖9C)，而另外在培養中添加rhIL-10處理12和24小時也增加CD14+ 單核細胞中Id3的表現(圖10C)，顯示Id3和IL-10調節之間存在正向回饋。進一步評估IL-10對Id3調節之分子機制，使用不同的激酶抑制劑(MEK1/2、p38、JNK、PI3K/Akt、pan-PKC、PKCδ和Jak2抑制劑)。結果表明，只有PI3K/Akt抑制劑可降低IL-10對Id3向上調節之表現；相反地，Jak2與pan-PKC抑制劑則增加IL-10對Id3之增強(圖9D)。免疫墨點分析還透露rhIL-10增加了磷酸化的AKT(Thr308和Ser473)(圖10D)。這些數據表明，激活AKT可能參與IL-10介導之Id3向上調節。
肺癌荷瘤小鼠和人肺癌患者腫瘤切塊之CD11c + DC中發現高量IL-10：
免疫螢光染色病患肺癌的邊際區域揭示許多CD11c+ DC已經浸潤到腫瘤周圍區域，這些區域與非腫瘤區域相比表現出較高含量之IL-10(圖11A)。與非腫瘤區域之CD11c+ DC相比，在24小時培養後，自新鮮肺癌分離之CD11c+ DC顯示出更強的IL-10生產能力(圖11B)。但是，肺癌患者血清和健康捐助者的血清中，IL-10並不存在統計差異(圖12)，顯示IL-10之改變僅在受影響的肺。
最後，用動物實驗確定活體內肺癌是否增加DC之IL-10表現，及半乳糖凝集素-1是否為免疫細胞中IL-10向上調節之主要的調節劑。將小鼠肺癌細胞株LLC注射入小鼠體內，並讓腫瘤發展14天。相較於小鼠正常肺組織，LLC表現高含量的半乳糖凝集素-1(圖13A)。於存在IL-4和GM-CSF時，LLC-CM和小鼠半乳糖凝集素-1(mgalectin-1)也增加小鼠骨髓細胞中IL-10之生產(圖13B)。這些數據與人類肺癌的數據相吻合。免疫螢光數據顯示CD11c+ DC在LLC荷瘤小鼠肺部產生浸潤，亦表明與對照組相比，腫瘤區域之IL-10含量較高(圖14A)。此外，肺腫瘤浸潤之CD11c+ DC顯示出了較高含量之IL-10基因表現和蛋白質分泌(圖14B)。
進一步使用半乳糖凝集素-1的siRNA調查腫瘤源性半乳糖凝集素-1和DC之交互作用。以半乳糖凝集素-1之siRNA轉染LLC細胞可降低半乳糖凝集素-1之基底含量60%(圖13C)。正如所料，自半乳糖凝集素-1敲除之LLC荷瘤小鼠肺腫瘤分離之CD11c+ DC中，IL-10含量顯著低於自siRNA轉染LLC荷瘤小鼠肺組織獲得之CD11c+ DC中之含量(圖14C)。免疫螢光分析也顯出了類似的結果(圖14D)。更進一步，注射半乳糖凝集素-1敲除之LLC細胞之發病小鼠的肺腫瘤發病率低於接收模擬對照轉染LLC之小鼠(表3)。
上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。
圖1顯示肺癌藉分泌半乳糖凝集素-1改變MdDC表面標記。(A)半乳糖凝集素-1在HBEC-CM、A549-CM和NCI-H460-CM之含量。以ELISA評估各種條件下半乳糖凝集素-1之含量。(B)肺癌患者血清之半乳糖凝集素-1平均含量。用ELISA法評估肺癌患者(40例)和健康捐助者血清(15例)之半乳糖凝集素-1含量。半乳糖凝集素-1於肺癌患者血清之含量為3.07±0.78 ng/mL(範圍：1.46-4.12 ng/mL)，而半乳糖凝集素-1在健康捐贈者含量為1.22±0.76 ng/mL(範圍：0.25-2.46 ng/mL，p 值=0.00018)。(C)乳糖對MdDC表型影響之流式細胞儀直方圖。(D)CXCL1、CXCL5和IL-8在肺癌-CM之高量呈現不影響CD14+ 單核細胞分化為MdDC。以RPMI1640、CXCL1(20 ng/mL)、CXCL5(20 ng/mL)或IL-8(20 ng/mL)，在GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(20 ng/mL)存在下處理CD14+ 單核細胞5天。以流式細胞儀分析各種細胞表面抗原。(E)每個患者和健康捐贈者的MdDC表型之流式細胞儀直方圖。在GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(20 ng/mL)存在下，與正常人與肺癌患者(n=20肺癌患者，10例為健康人)血清(15%)培養CD14+ 單核細胞5天。以流式細胞儀分析各種細胞表面標記，並指示陽性細胞的百分比和MFIs(括號內)。窄線表示以同位素相符初級抗體螢光染色之陰性對照。數據代表至少四個獨立實驗之結果。
圖2顯示肺癌分泌半乳糖凝集素-1改變MdDC表型。(A)正常和癌變的肺切塊中半乳糖凝集素-1之表現。半乳糖凝集素-1在正常和腫瘤切塊之含量由即時聚合酶鏈反應(n=15)測定。(B)肺癌-CM和半乳糖凝集素-1對MdDC表面標記之影響。(C)乳糖逆轉肺癌-CM和半乳糖凝集素-1對MdDC表型之影響。以存在GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(20 ng/mL)及有或無乳糖(50 mg/mL)之RPMI、A549-CM(20%)、NCI-H460-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)培養CD14+ 單核細胞5天。各種表面標記表現以流式細胞儀分析，並指示陽性細胞的百分比和MFIs(括號內)。(D)肺癌患者血清改變MdDC之表型。在GM-CSF和IL-4存在下，與正常人與肺癌患者血清(15%)培養CD14+ 單核細胞5天。數據代表至少四個獨立實驗之結果，水平短線表示平均值，星號指示兩測試群間以ANOVA進行Student'st 檢驗之顯著差異(*，p <0.05)。
圖3顯示肺癌-CM和半乳糖凝集素-1損害MdDC功能。肺癌-CM和半乳糖凝集素-1改變了MdDC之成熟(A)和細胞激素之產生(B)。以存在GM-CSF和IL-4之RPMI 1640、A549-CM(20%)、NCI-H460-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)培養CD14+ 單核細胞5天。這些細胞以IFN-γ啟動2小時，再以LPS(100 ng/mL)活化另2天。在7天之最後，以流式細胞儀分析各種表面標記之表現。細胞激素係以CBA進行評估。(C)處女型T細胞增殖。(D)CD4+ CD25+ FOXP3+ Treg之族群。將LPS刺激之MdDC與異體處女型CD4+ T細胞培養，MdDC/T細胞比例為1：10、1：20和1：50(1：10為Treg分析)。以BrdU併入評估T細胞之增殖。各種表面標記表現以流式細胞儀分析，星號指示兩對照組與肺癌-CM或半乳糖凝集素-1間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(**，p <0.01)。
圖4顯示TGF-β(A)和IL-27(B)在MdDC之含量。以存在GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(20 ng/mL)之RPMI 1640、A549-CM(20%)、NCI-H460-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)培養CD14+ 單核細胞5天。以ELISA套組測定TGF-β和IL-27於細胞上清液之含量。數據代表至少三次獨立實驗之結果。星號指示與對照組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(*，p <0.05)。
圖5顯示肺癌源性-CM和半乳糖凝集素-1增加CD14+ 單核細胞中IL-10之表現。(A)CD14+ 單核細胞之IL-10 mRNA含量。(B)rhIL-10改變MdDC之表型。(C)乳糖對IL-10向上調節之影響。以存在GM-CSF和IL-4及有或無乳糖(50 mg/mL)之RPMI 1640、A549-CM(20%)、NCI-H460-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)培養CD14+ 單核細胞指定之期間(5天表面標記分析；1天乳糖阻斷分析)。測定mRNA含量和不同的細胞表面標記物。(D)IL-10敲除逆轉肺癌-CM和半乳糖凝集素-1對MdDC表型之改變。siRNA轉染存在GM-CSF和IL-4之RPMI 1640、肺癌-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)培養5天之CD14+ 單核細胞。表面標記以流式細胞儀測定。數據代表至少三次獨立實驗之結果。星號指示兩測試組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(*，p <0.05；**，p <0.01)。
圖6顯示半乳糖凝集素-1在肺癌介導之IL-1向上調節所扮演的角色。(A)IL-10蛋白在CD14+ 單核細胞之含量。以存在GM-CSF和IL-4之RPMI 1640、A549-CM(20%)、NCI-H460-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)培養CD14+ 單核細胞指定之期間，並以ELISA套組檢測IL-10之含量。(B)自半乳糖凝集素-1敲除之A549細胞獲得的條件培養基失去I-10的向上調節活性。半乳糖凝集素-1敲除之A549細胞是由pLKO-AS2-LGALS1 shRNA慢病毒表現系統製得。條件培養基係在A549細胞穩定複製建立後收集。以pLKO-AS2轉染A549-CM或半乳糖凝集素-1敲除之A549-CM培養之MdDC中IL-10含量係於1天處理後，以ELISA法進行評估。(C)IL-10 siRNA之轉染降低IL-10的mRNA含量。IL-10敲除的單核細胞是由Acell siRNA之1 μM爭奪濃度或IL-10之siRNA進行。轉染72小時後，使用Q-PCR檢測IL-10之mRNA。數據代表至少三次獨立實驗之結果。星號指示與對照組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(*，p <0.05；**，p <0.01)。
圖7顯示肺癌-CM和半乳糖凝集素-1改變Id3和E2A蛋白之表現和交互作用之變化。(A)Id3和E2A蛋白之含量。(B)Id3和E2A之交互作用。以存在GM-CSF和IL-4之RPMI 1640、A549-CM(20%)、NCI-H460-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)培養CD14+ 單核細胞指定之期間，並以免疫墨點和免疫沈澱分別檢測蛋白含量和Id3/E2A交互作用。(C)Id3敲除扭轉了肺癌-CM和半乳糖凝集素-1對MdDC之改變。Id3之敲除是由Acell爭奪或Id3的siRNA(1 μM)進行。72小時後基因轉染後，siRNA轉染之CD14+ 單核細胞以RPMI 1640、A549-CM(20%)、NCI-H460-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)處理5天(肺癌-CM)或1天(半乳糖凝集素-1)，其表面標記以流式細胞儀進行評估。(D)乳糖抑制肺癌-CM和半乳糖凝集素-1介導之Id3向上調節。數據代表至少三次獨立實驗之結果。星號指示兩測試組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(*，p <0.05；**，p <0.01)。
圖8顯示Id3對肺癌介導免疫抑制之角色。(A)Id3的siRNA轉染降低Id3的mRNA含量。單核細胞的Id3敲除是由Acell siRNA之1 μM爭奪濃度或Id3之siRNA進行。轉染72小時後，以Q-PCR檢測Id3之表現。(B)自半乳糖凝集素-1敲除之A549細胞獲得的條件培養基失去Id3向上調節的活性。半乳糖凝集素-1敲除之A549細胞是由pLKO-AS2-LGALS1 shRNA慢病毒表現系統製得。pLKO-AS2轉染A549-CM或半乳糖凝集素-1敲除A549-CM之MdDC中Id3含量係於1天處理後，以Q-PCR法進行了評估。數據代表至少三次獨立實驗之結果。星號指示與對照組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(*，p <0.05；**，p <0.01)。
圖9顯示Id3和IL-10之交互作用。(Q)Id3之敲除減少IL-10表現。siRNA轉染之CD14+ 單核細胞以RPMI 1640、肺癌-CM(20%)或半乳糖凝集素-1(2 μg/mL)處理1天，並以Q-PCR檢測其IL-10含量。(B)肺癌-CM和半乳糖凝集素-1增加IL-10的啟動子活性。質體pIL-10-Luc或pTL-Luc載體以電穿孔轉染CD14+ 單核細胞，分別以RPMI 1640、肺癌-CM或半乳糖凝集素-1處理細胞24小時，啟動子活性測定則採用雙螢光酵素報告基因分析系統進行。(C)IL-10之敲除降低Id3的向上調節。IL-10 siRNA轉染之CD14+ 單核細胞以RPMI 1640、肺癌-CM或半乳糖凝集素-1處理1天，其Id3 mRNA以Q-PCR進行評估。(D)各種化學抑制劑對IL-10介導Id3向上調節之影響。CD14+ 單核細胞以各種抑制劑(200 nM JNK抑制劑II；5 μM之PD98059；20 μM之SB203580；10 μM之LY294002；500 nM之AG490；10μM的bisindolymaleimine；500 nM之Go6983)前處理1小時，然後加入20 ng/mL之rhIL-10處理24小時。Id3之表現以Q-PCR檢測。數據代表至少三次獨立實驗之結果。星號指示兩測試組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(*，p <0.05；**，p <0.01)。
圖10顯示Id3和IL-10間之交互作用。(A)Id3過度表現增加IL-10的生產。由Id3的GFP之質體進行電穿孔以過度表現Id3，並轉染24小時後收集上清後。以ELISA測定IL-10之含量。(B)Id3過度表現增加IL-10之啟動子活性。質體pIL-10-Luc及pTL-Luc載體以電穿孔轉染CD14+ 單核細胞。轉染24小時後評估IL-10之啟動子活性。(C)rhIL-10增加Id3表現。(D)rhIL-10增加AKT的磷酸化。以rhIL-10(20 ng/mL)處理CD14+ 單核細胞指定期間(12小時和24小時測定Id3的表現)。以Q-PCR檢測Id3 mRNA之表現。AKT和磷酸化AKT含量係採用免疫墨點分析。數據代表至少三次獨立實驗之結果。星號指示對照組與肺癌-CM或半乳糖凝集素-1處理組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(**，p <0.01)。
圖11顯示肺癌症患者腫瘤區域之CD11c+ DC之高量IL-10。(A)IL-10high CD11c+ DC浸潤人類肺癌區域。(B)自肺腫瘤和非腫瘤區域分離之CD11c+ DC中IL-10含量。切下非腫瘤和腫瘤區域(15例)，並染色，以共聚焦顯微鏡(10倍和40倍)進行樣品分析。以膠原酶消化非腫瘤和腫瘤區域(4例)，並經70 μM的細胞過濾器過濾。從細胞懸浮液分離CD11c+ DC，並培養在RPMI 1640。經過24小時，以ELISA套組評估細胞上清液之IL-10含量。數據代表至少三次獨立實驗之結果。水平短線代表平均值。
圖12顯示肺癌患者血清中IL-10之含量。在肺癌患者和健康捐贈者(40例病患，15例為健康捐贈者)血清之IL-10含量係使用IL-10之ELISA試劑盒進行評估。數據代表至少三次獨立實驗之結果。水平短線代表平均值。p 值為以ANOVA進行Student'st 事後檢驗。
圖13顯示(A)半乳糖凝集素-1 mRNA在小鼠肺組織和LLC中之含量。(B)LLC-CM和rmgalectin-1增加骨髓細胞中IL-10之表現。以存在rmGM-CSF(20 ng/mL)和rmIL-4(20 ng/mL)之RPMI 1640、LLC-CM(20%)或rmgalectin-1(2 μg/mL)培養小鼠骨髓細胞1天。收集培養基，並以ELISA套組評估IL-10含量。(C)半乳糖凝集素-1的siRNA降低LLC中半乳糖凝集素-1之表現。在LLC中敲除半乳糖凝集素-1係使用半乳糖凝集素-1 shRNA慢病毒顆粒進行。以Q-PCR檢測半乳糖凝集素-1之mRNA。數據代表至少三次獨立實驗之結果。星號指示與對照組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(**，p <0.01)。
圖14顯示肺癌荷瘤小鼠腫瘤區域之CD11c+ DC中高含量的IL-10。(A)IL-10high CD11c+ DC浸潤肺癌區域。(B)自肺癌荷瘤小鼠及對照小鼠之肺分離之CD11c+ DC中IL-10含量。(C)半乳糖凝集素-1敲除降低了浸潤癌部位之CD11c+ DC中IL-10之生產。(D)LLC荷瘤小鼠之半乳糖凝集素-1野生型和敲除型之肺代表切片。LLC、爭奪的shRNA和半乳糖凝集素-1之shRNA轉染LLC經尾靜脈注入小鼠。經過14天，收穫肺部之非腫瘤及腫瘤區域。從新鮮肺或腫瘤組織分離CD11c+ DC，並於培養24小時後收集培養基。以ELISA評估培養基中IL-10含量，並以Q-PCR檢測IL-10之mRNA。切下非腫瘤和腫瘤區域並染色，以共聚焦顯微鏡(10倍和40倍)進行樣品分析。數據代表至少三次獨立實驗之結果(對照組n=8；LLC組n=6；爭奪siRNA組n=6-8；半乳糖凝集素-1敲除組n=6-8)。星號指示與對照組間以ANOVA進行Student'st 事後檢驗之顯著差異(**，p <0.01)。
(無元件符號說明)

Claims (7)

  1. 一種篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑之方法，該方法包含下列步驟：(a)提供一測試細胞培養物，其係以條件培養基培養一測試細胞而得該測試細胞培養物，其中該測試細胞係為CD14+ 單核細胞或源自單核細胞之樹突細胞(MdDC)；該條件培養基包含肺癌細胞培養基或取自肺癌病患之血清；(b)於該測試細胞培養物中添加一待測物；及(c)檢測該待測物是否可抑制CD14+ 單核細胞之DNA結合抑制因子3活性、抑制CD14+ 單核細胞之介白素-10活性、抑制CD14+ 單核細胞之介白素-4活性、抑制CD14+ 單核細胞之介白素-13活性、抑制源自單核細胞之樹突細胞之介白素-27活性、抑制源自單核細胞之樹突細胞之轉化生長因子(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)活性、抑制CD14+ 單核細胞之DNA結合抑制因子3與E2A之交互作用、抑制CD14+ 單核細胞之磷脂醯肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)活性或抑制CD14+ 單核細胞之AKT活性；或活化源自單核細胞之樹突細胞之介白素-12活性、活化源自單核細胞之樹突細胞之腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor)α活性、活化源自單核細胞之樹突細胞之干擾素(interferon)γ活性、活化CD14+ 單核細胞之E2A活性、活化CD14+ 單核細胞之Jak 2活性、或活化CD14+ 單核細胞 之泛蛋白質激酶C(pan-protein kinase C，pan-PKC)活性。
  2. 根據請求項1之方法，樹突細胞功能低下係為單核細胞分化為樹突細胞功能低下。
  3. 根據請求項1之方法，樹突細胞功能低下係為樹突細胞呈現抗原功能低下。
  4. 根據請求項1之方法，樹突細胞功能低下係為樹突細胞成熟為T細胞功能低下。
  5. 根據請求項1之方法，其中步驟(c)包含檢測該待測物是否可抑制CD14+ 單核細胞之DNA結合抑制因子3活性、抑制CD14+ 單核細胞之介白素-10活性、抑制CD14+ 單核細胞之介白素-4活性、抑制CD14+ 單核細胞之介白素-13活性、抑制源自單核細胞之樹突細胞之介白素-27活性、抑制源自單核細胞之樹突細胞之轉化生長因子活性、抑制CD14+ 單核細胞之DNA結合抑制因子3與E2A之交互作用、抑制CD14+ 單核細胞之磷脂醯肌醇-3-激酶活性、抑制CD14+ 單核細胞之AKT之活性、活化源自單核細胞之樹突細胞之介白素-12活性、活化源自單核細胞之樹突細胞之腫瘤壞死因子α活性、活化源自單核細胞之樹突細胞之干擾素γ活性、活化CD14+ 單核細胞之E2A活性、活化CD14+ 單核細胞之Jak 2活性及活化CD14+ 單核細胞之泛蛋白質激酶C活性。
  6. 一種篩選治療因肺癌所引起之免疫抑制之候選藥物之方法，其包含請求項1至5任一項之方法，以篩選治療因肺 癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑。
  7. 一種篩選肺癌候選藥物之方法，其包含請求項1至5任一項之方法，以篩選治療因肺癌所引起樹突細胞功能低下之候選劑。
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