CN108697762A - 治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗癌症的组合物和方法。

Description

治疗癌症的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2015年11月20日提交的美国临时申请号62/257,945的优先权和权益，其内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明整体上涉及细胞免疫学，更具体地涉及通过经由MUC-1抑制来抑制PD-L1而治疗癌症的方法。
政府利益
本发明是在国立卫生研究院授予的资助号CA100707和CA078378下的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
发明背景
在健康中，PD-L1/PD-1途径在抗原提呈和效应细胞之间的复杂相互作用中提供关键的负性共刺激信号，充当反调节影响以防止T细胞的过度活化和免疫介导的损伤。癌细胞显著上调PD-L1表达，导致肿瘤微环境中的免疫抑制氛围。PD-1与T细胞上的PD-L1连接后引发耗尽的表型，其特征在于丧失了T细胞活化和扩增，而且钝化了效应物介导的对肿瘤细胞的靶向杀伤。最近的临床研究表明，在对细胞毒化学疗法不再响应的晚期实体瘤和血液恶性肿瘤患者中，抗体阻断PD-1或PD-L1得到了显著且持久的疾病响应。尽管在癌症治疗中作为关键靶标出现，但对于PD-L1表达的致癌调节知之甚少。
发明概述
本发明的特征在于通过向患者施用含有足以减少肿瘤PD-L1表达的量的MUC1抑制剂的组合物来治疗患者中的肿瘤的方法。任选地，向患者进一步施用检查点抑制剂。在各个方面中，患者已经接受了自体树突细胞/肿瘤细胞融合体(DC/肿瘤融合体)的群体。MUC1抑制剂是例如GO-203。
肿瘤是实体瘤或血液肿瘤。例如，实体瘤是肺肿瘤、乳腺肿瘤或肾肿瘤。血液肿瘤例如是急性骨髓性白血病(AML)或多发性骨髓瘤(MM)。
示例性的检查点抑制剂包括A2AR、B7-H3/CD276、B7-H4/VTCN1、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、CTLA-4、GITR、ICOS、IDO、KIR、LAG3、OX40、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA抑制剂。优选地，检查点抑制剂是A2AR、B7-H3/CD276、B7-H4/VTCN1、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、CTLA-4、GITR、ICOS、IDO、KIR、LAG3、OX40、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA抗体。
在各个方面中，该方法还包括向患者施用靶向作用于调节性T细胞的试剂、免疫调节剂或两者。免疫调节剂是来那度胺、泊马度胺(pomalinomide)或阿普斯特。
在其他方面中，向患者施用TLR激动剂、CPG ODN、polyIC或破伤风类毒素。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可用于实施本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献整体通过引用明确地并入。如果发生冲突，则将以本说明书(包括定义)为准。另外，本文描述的材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并不意在进行限制。本发明的其他特征和优点在以下的详细描述和权利要求书中会是明显的并且被涵盖。
附图说明
图1.MUC1-C通过控制miR-200c micro-RNA来调节PDL-1表达.a.通过qRT-PCR，对稳定表达对照shRNA(CshRNA)或MUC1shRNA(MUC1shRNA)的RPMI-8226多发性骨髓瘤(MM)癌细胞分析MUC1和PDL-1的mRNA水平。结果(3次测定的平均值±SD)表示为与表达MUC1shRNA的细胞相比的相对mRNA水平。用所示抗体对来自RPMI/CshRNA和RPMI/MUC1shRNA细胞的裂解物进行免疫印迹。b.分析稳定表达CshRNA或MUC1shRNA的U266多发性骨髓瘤细胞的(i)MUC1和PDL-1mRNA以及(ii)蛋白质。c.通过qRT-PCR，对稳定表达对照shRNA(CshRNA)或MUC1shRNA(MUC1shRNA)的RPMI-多发性骨髓瘤(MM)癌细胞分析miR200-c micro-RNA水平，和通过FACS分析PDL-1蛋白水平(左)和采用所示抗体进行免疫印迹(右)。结果(3次测定的平均值±SD)表示为与表达MUC1shRNA的细胞相比的相对mRNA水平。d.分析稳定表达CshRNA或MUC1shRNA的U266多发性骨髓瘤癌细胞的(i)miR-200cmircro-RNA和(ii)通过FACS分析PDL-1蛋白和(iii)采用所示抗体进行免疫印迹。
图2.miR-200c的异位表达下调PDL-1表达.a.指示miR-200c结合位点的PDL-1 3'UTR的示意图。用空3'UTR-海肾载体或PDL-1 3'UTR-海肾载体转染所示的RPMI(左)和U266(右)细胞。转染48小时后检测海肾萤光素酶活性。结果(3次测定的平均值±SD)表示为与表达对照-shRNA的细胞(赋值为1)相比的相对荧光素酶活性。b.所示的RPMI(左)和U266(右)细胞用所示抗体进行免疫印迹。
图3MUC1-C通过控制miR-200c micro-RNA来调节PDL-1的表达.
图4.SNAI-1(Snail)以MUC1依赖性方式占据miR-200c启动子.a.将来自稳定表达对照shRNA(CshRNA)或MUC1shRNA(MUC1shRNA)的RPMI细胞的可溶性染色质用抗SNAI-1(左)或对照IgG进行沉淀。b.将来自稳定表达对照shRNA(CshRNA)或MUC1shRNA(MUC1shRNA)的U266细胞的可溶性染色质用抗SNAI-1snail(右)或对照IgG进行沉淀。用与miR-200c启动子中snail结合位点配对的引物，通过qPCR扩增最终的DNA样品。结果(3次测定的平均值±SD)表示为与MUC1shRNA(赋值为1)相比的相对富集倍数。c.与采用IgG对照的Co-IP相比，在(i)RPMI或(ii)U266细胞中采用Snail抗体进行的Co-IP和采用MUC1-C进行的免疫印迹。
图5.MUC1-C沉默增加了细胞对非自体T细胞的敏感性.
图6.是PD1表达/抑制机制的示意图。
图7:对稳定表达对照shRNA(CshRNA)或MUC1shRNA(MUC1shRNA)的细胞分析MUC1和PDL-1mRNA。用指定的抗体对指定的A549(左)和H460(右)细胞进行免疫印迹。
图8:用指定的抗体对指定的A549(左)和H460(右)细胞进行免疫印迹。
图9:对稳定表达对照shRNA(CshRNA)或MUC1shRNA(MUC1shRNA)的细胞分析MUC1和PDL-1mRNA。用指定的抗体对指定的A549(左)和H460(右)细胞进行免疫印迹。
图10:对稳定表达对照shRNA(CshRNA)或MUC1shRNA(MUC1shRNA)的细胞分析MUC1和PDL-1mRNA。用指定的抗体对指定的A549(左)和H460(右)细胞进行免疫印迹。
图11:是柱状图。结果表示为与MUC1shRNA(赋值为1)相比的相对富集倍数。
图12:对稳定表达对照shRNA(CshRNA)或MUC1shRNA(MUC1shRNA)的细胞分析了PDL-1表达。结果表示为与MUC1shRNA(赋值为1)相比的相对萤光素酶活性。
发明详述
本发明是基于以下发现，即癌基因粘蛋白1(MUC1)控制肿瘤中的PD-L1表达。
PD-L1/PD-1途径是恶性肿瘤中免疫逃逸的关键介导者，并且已经成为基于免疫治疗的有希望的靶标。在一部分患有化疗耐药的疾病的患者中，抗体阻断导致持续的疾病消退。
如本文所述，已证实癌基因MUC1控制肿瘤中的PD-L1表达。使用MUC1特异性shRNA或CRISPR沉默MUC1的表达，使得多发性骨髓瘤(MM)和急性骨髓性白血病(AML)中PD-L1的表达接近终止。暴露于小分子MUC1抑制剂类似地也降低了MM和AML细胞对PDL1的表达，使其更易受CTL介导的裂解。
为了详细说明MUC1调节PDL1表达的机制，我们评估了其对非编码RNA家族，即与PDL1mRNA显示同源性的miR200的影响。已显示非编码RNA例如microRNA通过mRNA的选择性结合和降解以及蛋白表达的调控来调节肿瘤发生的关键方面。发现肿瘤细胞中的MUC1沉默导致miR-200c水平增加4倍。ChIP分析还显示，miR-200c表达的增加是通过MUC1伴随SNAIL，一种已知的转录调节因子，结合miR-200c启动子来实现。然后MiR-200c被证明通过与MM细胞系和患者衍生的肿瘤细胞中的PD-L1的3'UTR结合，在转录后降低PD-L1水平。
粘蛋白-1抑制剂
粘蛋白-1(MUC1)抑制剂是降低MUC1表达或活性的化合物。MUC1是一种致癌糖蛋白，在许多实体瘤和包括MM在内的血液恶性肿瘤中异常表达。MUC1发挥的重要作用在于支持恶性表型的关键方面，包括细胞增殖和自我更新、抗细胞毒性损伤和细胞凋亡以及迁移和组织侵袭的能力。MUC1包括N-末端和C-末端，N-末端释放入循环系统，C-末端在激活后经历同源二聚化，易位至细胞核并与下游效应子(包括Wnt/B连环蛋白、NFKB和JAK/STAT途径)相互作用。
MUC1抑制剂降低MUC1的表达或活性。MUC1活性的降低定义为MUC1的生物学功能的降低。例如，MUC1表达或生物活性的降低或减小是指与对照相比，MUC1表达或活性降低至少1％，2％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。
MUC1抑制剂的生物学活性包括例如miR-200c的上调。
通过使用本领域已知的标准方法如RT-PCR、微阵列和采用MUC1特异性抗体的免疫印迹或免疫组化，检测MUC1转录物或蛋白，以测定MUC1表达。例如，MUC1表达的降低是指MUC1mRNA或MUC1蛋白水平降低至少1％，2％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。
MUC1抑制剂是对MUC1具有特异性的抗体或其片段。用于设计和生产特异性抗体的方法是本领域众所周知的。在具体的实施方式中，MUC1抑制剂是双特异性抗体。例如，所述双特异性抗体对MUC1和A2AR、B7-H3/CD276、B7-H4/VTCN1、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、CTLA-4、GITR、ICOS、IDO、KIR、LAG3、OX40、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA具有特异性。
MUC1抑制剂也可以是小分子。如本文所用的“小分子”意指分子量范围小于约5kD至50道尔顿，例如小于约4kD，小于约3.5kD，小于约3kD，小于约2.5kD，小于约2kD，小于约1.5kD，小于约1kD，小于750道尔顿，小于500道尔顿，小于约450道尔顿，小于约400道尔顿，小于约350道尔顿，小于300道尔顿，小于250道尔顿，小于约200道尔顿，小于约150道尔顿，小于约100道尔顿的组合物。小分子可以是例如核酸，肽，多肽，肽模拟物，碳水化合物、脂质或其他有机或无机分子。化学和/或生物混合物如真菌、细菌或藻类提取物的文库是本领域已知的，并且可以用本发明的任何测定进行筛选。例如，MUC1抑制剂是G0-203。
或者，MUC1抑制剂是例如反义MUC1核酸、MUC1特异性短干扰RNA或MUC1特异性核酶。术语“siRNA”是指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA引入细胞的标准技术，包括那些从DNA模板转录siRNA的技术。siRNA包括正义MUC1核酸序列、反义MUC1核酸序列或两者。任选地，构建siRNA使得单个转录物具有来自靶基因的正义和互补反义序列，例如发夹(shRNA)。本文实施例中公开了siRNA和shRNA的实例。
靶细胞中siRNA与MUC1转录物的结合导致细胞产生的MUC1减少。寡核苷酸的长度至少为10个核苷酸，并且可以与天然产生的MUC1转录物一样长。优选地，寡核苷酸的长度为19-25个核苷酸。最优选地，寡核苷酸的长度小于75、50、25个核苷酸。
治疗方法
在各个方面中，本发明提供了在受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括向受试者施用抑制MUC1表达或活性的化合物。
细胞直接与化合物接触。或者，所述化合物为全身施用。
受试者将接受、已接受或正在接受检查点抑制剂治疗。检查点抑制剂的施用是与MUC1抑制剂同时、在施用MUC1抑制剂之前或在施用MUC1抑制剂之后。
检查点抑制剂是指该化合物抑制在检查点信号通路中的蛋白质。检查点信号通路中的蛋白包括例如A2AR、B7-H3/CD276、B7-H4/VTCN1、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、CTLA-4、GITR、ICOS、IDO、KIR、LAG3、OX40、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA。
检查点抑制剂是本领域已知的。例如，检查点抑制剂可以是小分子。如本文所用的“小分子”意指分子量范围小于约5kD至50道尔顿，例如小于约4kD，小于约3.5kD，小于约3kD，小于约2.5kD，小于约2kD，小于约1.5kD，小于约1kD，小于750道尔顿，小于500道尔顿，小于约450道尔顿，小于约400道尔顿，小于约350道尔顿，小于300道尔顿，小于250道尔顿，小于约200道尔顿，小于约150道尔顿，小于约100道尔顿的组合物。小分子可以是例如核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质或其他有机或无机分子。
或者，检查点抑制剂是抗体或其片段。例如，抗体或其片段对于检查点信号通路中的蛋白质是特异性的，所述蛋白质例如A2AR、B7-H3/CD276、B7-H4/VTCN1、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、CTLA-4、GITR、ICOS、IDO、KIR、LAG3、OX40、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA。
受试者将接受、已接受或正在接受由自体树突细胞(DC)和肿瘤细胞之间的融合体(DC细胞融合体)组成的肿瘤疫苗。DC细胞融合体的施用是与MUC1抑制剂同时、在施用MUC1抑制剂之前或施用MUC1抑制剂之后。
任选地，患者可接受免疫调节剂的同时治疗。这些调节剂包括来那度胺、泊马度胺(pomalinomide)或阿普斯特。来那度胺已显示出提高针对感染性疾病的疫苗的应答，并且在临床前研究中增强T细胞对DC细胞融合疫苗的应答。
本文所述的方法可用于缓解各种癌症的症状。任何表现出化疗耐药性或PD-L1表达增加的癌症都适合采用本发明的方法进行治疗。所述癌症是实体瘤或血液肿瘤。实体瘤例如是肺肿瘤、乳腺肿瘤或肾肿瘤。血液肿瘤是例如急性骨髓性白血病(AML)或多发性骨髓瘤(MM)。
如果治疗导致临床益处，例如受试者中肿瘤的大小、患病率或转移潜能下降，则治疗是有效的。当预防性施用治疗时，“有效”意指所述治疗延缓或防止肿瘤形成，或者预防或缓解肿瘤临床症状中的一项症状。与任何已知的用于诊断或治疗特定肿瘤类型的方法联用来确定有效性。
治疗施用
本发明包括向受试者施用包含MUC1抑制剂的组合物。
有效量的治疗化合物优选为约0.1mg/kg至约150mg/kg。如本领域技术人员所知，有效剂量可以变化，取决于施用途径、赋形剂的使用以及与其他治疗性疗法的共同施用，包括使用用于治疗、预防或缓解癌症症状的其他抗增殖剂或治疗剂。通过使用标准方法鉴定哺乳动物，例如患有癌症的人类患者，来进行治疗方案。
剂量可以施用一次或不止一次。在一些实施方式中，治疗性化合物优选每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每周七次施用，用于预定的持续时间。预定的持续时间可以是1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或多至1年。
使用本领域已知的方法将药物化合物施用于这样的个体。优选地，所述化合物经口、直肠、经鼻、局部或肠胃外施用，例如皮下、腹膜内、肌肉内和静脉内施用。任选地，将抑制剂配制成治疗药物混合物的组分以治疗癌症。适用于肠胃外施用的制剂的实例包括在等渗盐溶液、5％葡萄糖溶液或另一种标准的药学上可接受的赋形剂中的活性剂的水溶液。标准增溶剂如PVP或环糊精也用作递送治疗化合物的药物赋形剂。
使用常规方法将本文所述的治疗化合物配制成用于其他施用途径的组合物。例如，将治疗性化合物配制成胶囊或片剂用于口服施用。胶囊可以含有任何标准的药学上可接受的材料，例如明胶或纤维素。片剂可以按照常规方法通过压缩治疗化合物与固体载体和润滑剂的混合物来配制。固体载体的实例包括淀粉和糖膨润土。所述化合物以含有粘合剂(例如乳糖或甘露醇)、常规填充剂和压片剂的硬壳片剂或胶囊的形式施用。其他制剂包括软膏剂、栓剂、糊剂、喷雾剂、贴剂、乳膏剂、凝胶剂、可吸收海绵剂或泡沫剂。使用本领域公知的方法生产这样的制剂。
在将治疗性化合物与受影响的组织直接接触时，该化合物是有效的。因此，所述化合物为局部施用。或者，所述治疗性化合物为全身施用。例如，化合物通过吸入施用。以来自加压容器或分配器或喷雾器的气溶胶喷雾的形式递送化合物，所述分配器含有合适的推进剂，例如气体如二氧化碳。
另外，通过植入(直接植入器官或皮下植入)固体或可吸收的基质来施用化合物，所述基质将化合物缓慢释放到受试者的相邻和周围组织中。
在一些实施方式中，优选将本文所述的治疗化合物与另一种治疗剂如化疗剂、放射治疗或抗有丝分裂剂组合施用。在一些方面，在施用本发明的治疗性化合物之前施用抗有丝分裂剂，以诱导附加的染色体不稳定性，从而增加本发明靶向癌细胞的功效。抗有丝分裂剂的实例包括紫杉烷(即紫杉醇、多西他赛)和长春花生物碱(即长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)。
筛选测定
本发明还提供了通过测量血清中的miR-200c水平来预测PD-L1体内表达的方法。
所述方法包括检测受试者样品中miR-200c的表达水平，其中与正常对照细胞相比，miR-200c表达的降低表明受试者的肿瘤正在表达PD-L1，并将从PD-1或PDL-1疗法中获益。
定义
除非另有说明，否则本发明的实践采用了本领域技术内的分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。参见例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL，第2版(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等编，(1987))；METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.)：PCR2：A PRACTICAL APPROACH(Mi.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))和ANIMAL CELL CULTURE(Rd.Freshney编(1987))的系列方法。
如本文所用，某些术语具有以下定义的含义。如说明书和权利要求中所用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
“治疗”是为了预防病症的发展或者改变病症的病理或症状而进行的干预。因此，“治疗”既指治疗性治疗，也指预防或预防性措施。需要治疗的患者包括已经患有该病症的患者以及需要预防该病症的患者。在肿瘤(例如癌症)治疗中，治疗剂可以直接降低肿瘤细胞的病理学，或使肿瘤细胞对其他治疗剂(例如放射和/或化学治疗)的治疗更敏感。如本文所用，“改善的”或“治疗”是指接近标准化值(例如在健康患者或个体中获得的值)的症状，例如与标准化值相比差异小于50％，优选地，与标准化值相比差异小于约25％，更优选地，与标准化值相比差异小于10％，并且仍更优选地，与使用常规统计测试所确定的标准化值没有显著差异。
因此，治疗可以包括压制、抑制、预防、治疗或其组合。治疗尤其是指增加持续进展的时间、加速缓解、诱导缓解、增加缓解、加速恢复、增加替代治疗剂的功效或减少对替代治疗剂的抗性或其组合。“压制”或“抑制”尤其指延迟症状发作、预防疾病复发、减少复发的次数或频率、增加症状发作之间的潜伏期，减少症状的严重程度、减少急性发作的严重程度、减少症状的数目、减少疾病相关症状的发生率、减少症状的潜伏期、改善症状、减少继发性症状、减少继发性感染、延长患者存活或其组合。症状是原发性的，而在另一个实施方式中，症状是继发性的。“原发性”是指作为增殖性病症的直接结果的症状，而继发性是指由原发性原因引起或随之而来的症状。症状可以是疾病或病理状况的任何表现。
“治疗癌症或肿瘤细胞”是指整个说明书中描述的能够引起一种或多种以下效果的一定量的肽或核酸：(1)抑制肿瘤生长，包括(i)减缓和(ii)完全生长停滞；(2)减少肿瘤细胞的数量；(3)维持肿瘤大小；(4)减小肿瘤大小；(5)抑制，包括(i)减少、(ii)减缓或(iii)完全预防肿瘤细胞浸润到外周器官中；(6)抑制，包括(i)减少、(ii)减缓或(iii)完全预防转移；(7)增强抗肿瘤免疫应答，其可导致(i)维持肿瘤大小、(ii)减小肿瘤大小、(iii)减缓肿瘤生长、(iv)减少、减缓或防止侵袭和/或(8)在一定程度上缓解与该病症相关的一种或多种症状的严重程度或数量。
如本文所用，“改善的症状”或“治疗的症状”是指接近标准化值的症状，例如与标准化值相比差异小于50％，优选地，与标准化值相比差异小于约25％，更优选地，与标准化值相比差异小于10％，并且仍更优选地，与使用常规统计测试所确定的标准化值没有显著差异。
术语“患者”或“个体”在本文中可互换使用，并且指待治疗的哺乳动物受试者，其中人类患者是优选的。在一些情况下，本发明的方法可用于实验动物、兽医应用以及疾病动物模型的开发，所述动物模型包括但不限于包括小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿动物；和灵长类动物。
术语“调节”是指任何提及的活动例如被增加、增强、增加、加强、激动(充当激动剂)、促进、减少、减小、抑制、受阻、或拮抗(充当拮抗剂)。与基线值相比，调节可以使活性增加超过1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍等。调节也可以将其活性降低到基线值以下。
如本文所用，术语“向细胞施用”(例如，表达载体、核酸、递送载体、试剂等)是指采用分子转导、转染、显微注射、电穿孔或射击细胞。在一些方面，通过使靶细胞与递送细胞接触(例如，通过细胞融合或通过在递送细胞接近靶细胞时裂解递送细胞)将分子导入靶细胞。
树突细胞(DC)是有效的APC。DC是各种免疫器官如脾、胸腺、淋巴结、表皮和外周血中的少数组分。例如，DC仅代表脾的粗品中(参见Steinman等(1979)J.Exp.Med 149:1)或表皮细胞悬液(参见Schuler等(1985)J.Exp.Med 161:526；Romani等J.Invest.Dermatol(1989)93：600)中的约1％和外周血中单核细胞的0.1-1％(参见Freudenthal等，Proc.NatlAcad Sci USA(1990)87：7698)。从外周血或骨髓祖细胞分离DC的方法是本领域已知的(参见Inaba等(1992)J.Exp.Med175:1157；Inaba等(1992)J.Exp,Med 176:1693-1702；Romani等(1994)J.Exp.Med.180:83-93；Sallusto等(1994)J.Exp.Med 179:1109-1118))。Bender等(1996)J.Immun.Meth.196:121-135和Romani等(1996)J.Immun.Meth 196:137-151中描述了分离和培养DC的优选方法。
因此，术语“细胞因子”是指对细胞发挥各种作用的多种因子中的任意因子，所述作用例如诱导生长或增殖。细胞因子的非限制性实例包括IL-2、干细胞因子(SCF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、G-CSF、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、MIP-1α、LIF、c-kit配体、TPO和flt3配体。细胞因子可以从若干供应商，例如Genzyme Corp.(弗雷明汉，马萨诸塞州)、Genentech(南圣弗朗西斯科，加利福尼亚州)、Amgen(千橡市，加利福尼亚州)和Immunex(西雅图，华盛顿州)商购获得。尽管不总是明确指出，但与野生型或纯化细胞因子具有相似生物活性的分子(例如，重组产生的细胞因子)都意在本发明的精神和范围内使用，因此它们是野生型或纯化细胞因子的替代物。
“共刺激分子”涉及抗原提呈细胞和T细胞表面上表达的受体-配体对之间的相互作用。一种示例性的受体-配体对是DC表面上的B7共刺激分子及其T细胞上的反受体CD28或CTLA-4(参见Freeman等(1993)Science 262:909-911；Young等(1992)J.Clin.Invest 90:229；Nabavi等Nature 360:266))。其他重要的共刺激分子包括例如CD40、CD54、CD80和CD86。这些可从上述供应商处商购获得。
“杂交”细胞是指具有抗原提呈能力并且还表达一种或多种特异性抗原的细胞。在一个实施方式中，通过在体外将APC与已知表达一种或多种感兴趣抗原的细胞融合来形成这些杂交细胞。如本文所用，术语“杂交”细胞和“融合”细胞可互换使用。
“对照”细胞是指不表达与抗原表达细胞群体相同的抗原的细胞。
术语“培养”是指细胞或生物体在各种培养基上或培养基中的体外增殖，应理解，培养物中生长的细胞的子代30可能与亲本细胞不完全相同(即形态上、遗传上、或表型上)。“扩增”是指细胞的任何增殖或分裂。
“有效量”是足以产生有益或期望的结果的量。有效量可以以一次或多次施用、应用或剂量施用。为了本发明的目的，杂交细胞的有效量是促进抗原特异性免疫效应细胞(例如T细胞)扩增的量。
“分离的”细胞群体是“基本上不含”实质上与之相关的细胞和材料。“基本上不含”或“基本上纯”是指至少50％的群体是所需的细胞类型，优选地，至少70％，更优选地，至少80％，甚至更优选地，至少90％。“富集”细胞群体为至少5％的融合细胞。优选地，富集群体含有至少10％，更优选地，至少20％，最优选地，至少25％的融合细胞。
如本文所用，术语“自体发生的”或“自体的”表示细胞的起源。因此，如果细胞来源于个体(“供体”)或遗传上相同的个体(即个体的同卵双胞胎)，则施用于个体(“受体”)的细胞是自体的。自体细胞也可以是自体细胞的后代。该术语还指示不同细胞类型的细胞来自相同的供体或遗传上相同的供体。因此，如果效应细胞和抗原提呈细胞来自相同的供体或来自与供体遗传上相同的个体，或者如果它们是源自相同的供体的或源自与供体遗传上相同的个体的细胞的后代，则称其为自体的。
类似地，如本文所用，术语“同种异体的”指示细胞的起源。因此，如果细胞来自不与受体在遗传上相同的个体，则施用于个体(“受体”)的细胞是同种异体的。特别地，该术语涉及表达的MHC分子中的非同一性。同种异体细胞也可以是同种异体细胞的后代。该术语还指示不同细胞类型的细胞来源于遗传上不相同的供体，或者如果它们是源自遗传上不同的供体的细胞的后代。例如，如果APC来源于遗传上不相同的供体，那么称其对效应细胞是同种异体的。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。
如本文所用，“遗传修饰”是指对细胞内源核苷酸的任何添加、删除或破坏。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含要在体内、离体或体外递送到宿主细胞内的多核苷酸。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在由逆转录病毒载体介导的基因转移这方面，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其部分以及治疗基因的多核苷酸。
如本文所用，术语“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的含义，并且是指由于病毒进入细胞并将其基因组整合到宿主细胞基因组中，而将基因或核酸序列稳定转移到宿主细胞中的过程。病毒可以通过其正常的感染机制进入宿主细胞，或者被修饰以使其结合不同的宿主细胞表面受体或配体以进入细胞。
逆转录病毒以RNA的形式携带其遗传信息。然而，一旦病毒感染细胞，RNA就被逆转录成DNA形式并整合到感染细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式被称为前病毒。
在由DNA病毒载体如腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)介导的基因转移这方面，载体构建体是指包含病毒基因组或其部分以及治疗基因的多核苷酸。腺病毒(Ad)是一群相对较好表征的同源病毒，包括超过50种血清型(参见例如WO 95/27071)。Ad很容易生长，不会整合到宿主细胞基因组中。也构建了重组Ad衍生的载体，特别是那些降低野生型病毒重组和产生潜力的载体(参见WO 95/00655；WO 95/11984)。野生型AAV具有高度的整合到宿主细胞基因组中的感染性和特异性(参见Hermonat和Muzyczka(1984)PNAS USA 81:6466-6470；Lebkowski等，(1988)Mol Cell Biol8:3988-3996)。
本领域中公知含有启动子和克隆位点的载体，其中可以将多核苷酸可操作地连接到克隆位点中。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，并且可以从诸如Stratagene(拉由拉市，加利福尼亚州)和Promega Biotech(麦迪逊，威斯康辛州)的来源商购获得。为了优化表达和/或体外转录，可能需要除去、添加或改变克隆的5'和/或3'非翻译部分，以消除额外的、可能不适当的其他翻译起始密码子或者可能在转录或翻译水平上干扰或降低表达的其他序列。或者，可以在起始密码子的5'端紧接着插入共有核糖体结合位点以增强表达。合适的载体的例子是病毒，例如杆状病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和本领域中通常使用的其他重组载体，其已被描述用于在各种真核和原核宿主中表达，并且可用于基因治疗以及简单的蛋白质表达。
在这些当中有一些非病毒载体，包括DNA/脂质体复合物和靶向病毒蛋白质DNA复合物。为了提高到细胞的递送，本发明的核酸或蛋白质可以缀合至结合细胞表面抗原的抗体或其结合片段，所述抗原例如TCR、CD3或CD4。包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本发明的方法中。本发明还提供了用于本文公开的方法中的靶向复合物。
使用本领域公知的方法将多核苷酸插入载体基因组中。例如，插入片段和载体DNA可以在合适的条件下与限制酶接触以在每个分子上产生互补末端，该分子可以彼此配对并且通过连接酶连接在一起。或者，合成的核酸接头可以连接到限制性多核苷酸的末端。这些合成的接头含有对应于载体DNA中特定限制性位点的核酸序列。此外，可以将含有终止密码子和合适限制性位点的寡核苷酸连接以插入载体中，所述载体含有例如一些或全部以下成分：选择性标记基因，例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的即刻早期基因的增强子/启动子序列；用于稳定mRNA的来自SV40的转录终止和RNA处理信号；用于在适当的附加体中复制的SV40多瘤复制起点和ColEI；多功能多克隆位点；和用于体外转录正义和反义RNA的T7和SP6RNA启动子。其他手段在本领域中是公知的和可用的。
如本文所用，“表达”是指将多核苷酸转录成mRNA并翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可以包括mRNA的剪接，如果选择了适当的真核宿主的话。表达所需的调节元件包括结合RNA聚合酶的启动子序列和用于核糖体结合的转录起始序列。例如，细菌表达载体包括启动子例如lac启动子和用于转录起始位点的Shine-Dalgarno序列和起始密码子AUG(Sambrook等(1989)，同上)。类似地，真核表达载体包括用于RNA聚合酶II的异源或同源启动子，下游多聚腺苷酸化信号，起始密码子AUG和用于使核糖体脱离的终止密码子。这样的载体可以商购获得或通过本领域公知的方法中描述的序列组装获得，所述方法例如是通常用于构建载体的上述方法。
术语“主要组织相容性复合物”或“MHC”是指编码细胞表面分子的基因的复合物，所述细胞表面分子在抗原提呈至免疫效应细胞如T细胞以及快速移植排斥中是必需的。在人中，MHC复合物也被称为HLA复合物。由MHC复合物编码的蛋白质被称为“MHC分子”，并被分类为I类和II类MHC分子。I类MHC分子包括膜异源二聚体蛋白质，其由在MHC中编码的α链与β2-微球蛋白非共价缔合而成。I类MHC分子几乎被所有有核细胞表达，并且已显示其在抗原提呈至CD8+T细胞中起作用。I类分子包括人中的HLA-A、-B和-C。II类MHC分子也包括膜异源二聚体蛋白质，由非共价缔合的J3链组成。已知II类MHC在CD4+T细胞中起作用，并且在人中包括HLA-DP、-DQ和DR。术语“MHC限制”是指T细胞的特征，其允许它们仅在抗原被处理以后并且所得到的抗原肽与I类或II类MHC分子结合展示后才能识别抗原。鉴定和比较MHC的方法是本领域众所周知的，并描述于Allen M.等(1994)Human Imm.40:25-32；Santamaria P.等(1993)Human Imm.37:39-50；和Hurley C.K.等(1997)Tissue Antigens 50:401-415中。
术语“序列基序”是指存在于一组15个分子(例如，氨基酸或核苷酸)中的模式。例如，在一个实施方式中，本发明提供了从抗原里存在的肽中鉴定序列基序。在该实施方式中，典型的模式可以通过特征氨基酸残基(如疏水性、亲水性、碱性、酸性等)来鉴定。
术语“肽”以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一个实施方式中，亚基可以通过其它键连接，例如，酯，醚等。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然的和/或25个非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链较短，则三个或更多个氨基酸的肽通常被称为寡肽。如果肽链较长，则该肽通常被称为多肽或蛋白质。
如本文所用，“固相支持物”用作“载体”的实例，并且不限于特定类型的支持物。相反，大量的载体是可以使用的并且是本领域普通技术人员已知的。固相支持物包括硅胶、树脂、衍生化塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠和氧化铝凝胶。基于期望的最终用途和各种合成方案的适用性，可以选择合适的固相支持物。例如，对于肽合成，固相支持物可以指树脂，例如聚苯乙烯(例如，从Bachem Inc.，半岛实验室等获得的PAM-树脂)、树脂(从Aminotech，加拿大获得)、聚酰胺树脂(从半岛实验室获得)、用聚乙二醇接枝的聚苯乙烯树脂(Rapp Polymere，图宾根，德国)或聚二甲基丙烯酰胺树脂(从MilligenlBiosearch，加利福尼亚获得)。在肽合成的优选实施方式中，固相支持物是指聚二甲基丙烯酰胺树脂。
术语“异常表达的”是指当与别的细胞或组织相比时(不论是否相同的组织类型，即，肺组织比肺癌组织)，在细胞或组织中差异表达(过表达或低表达)的多核苷酸序列。
“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括任何个体细胞或细胞培养物，其可以是或已经接受了载体或并入了外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质。它也旨在包括单细胞的后代，并且由于自然的、偶然的或故意的突变，该后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上，或在基因组或总体DNA互补上)。细胞可以是原核细胞或真核细胞，并且包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、动物细胞和哺乳动物细胞，例如鼠类、大鼠、猿猴或人类。
“抗体”是能够结合抗原的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的免疫球蛋白分子，还包括包含具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的抗独特型抗体、突变体、片段、融合蛋白、人源化蛋白和修饰。
“抗体复合物”是抗体及其结合配偶体或配体的组合。
“天然抗原”是在受试者中诱导免疫应答的多肽，蛋白质或含有表位的片段。
术语“分离的”是指多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段与其在自然界中通常在一起的组分、细胞或其他物质相分离。对于本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以将其与天然存在的对应物区分开来。此外，“浓缩的”，“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段与其天然存在的对应物的可区别之处在于，与其天然存在的对应物相比每体积的分子浓度或数量大于“浓缩的”或小于“分离的”。如果多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在一级序列上或者例如在其糖基化模式上不同于其天然存在的对应物，那么则不需要以分离形式存在，因为它可以与其天然存在的对应物通过其一级序列，或者通过另一种特征如糖基化模式而区分开。虽然对于本文公开的每个发明没有明确说明，但应当理解的是，本发明提供了以下公开的每种组合物在适当条件下的所有上述实施方式。因此，非天然存在的多核苷酸与分离的天然存在的多核苷酸作为单独的实施方式提供。在细菌细胞中产生的蛋白质与天然产生的真核细胞中分离出来的天然存在的蛋白质作为单独的实施方式提供。
“组合物”旨在表示活性剂和惰性(例如，可检测试剂、载体、固体支持物或标记)或活性(例如佐剂)的另一种化合物或组合物的组合。
“药物组合物”旨在包括活性剂与惰性或活性载体的组合，使组合物适用于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”涵盖了任何标准的药学载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳剂，例如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂。该组合物还可以包含稳定剂和防腐剂。有关载体、稳定剂和佐剂的实例，请参见Martin，REMINGTON’SPHARM.SCI，第15版(Mack Publ.Co.,Easton(1975))。
如本文所用，术语“在受试者中诱导免疫应答”是本领域中公知的术语，并且意指将抗原(或表位)引入受试者之后，相比于将抗原(或表位)引入受试者之前的免疫应答(如果有的话)，可检测(测量)的对抗原(或表位)的免疫应答增加至少约2倍，更优选地，至少约5倍，更优选地，至少约10倍，更优选地，至少约100倍，甚至更优选地，至少约500倍，甚至更优选地，至少约1000倍或更多。对抗原(或表位)的免疫应答包括但不限于，产生抗原特异性(或表位特异性)的抗体，以及产生免疫细胞在其表面表达特异性结合抗原(或表位)的分子。确定对给定抗原(或表位)的免疫应答是否已被诱导的方法是本领域公知的。例如，可以使用本领域已知的多种免疫测定法中的任何一种来检测抗原特异性抗体，所述免疫测定法包括但不限于ELISA，其中例如样品中的抗体与固定的抗原(或表位)的结合用可检测标记的第二抗体(例如酶标记的小鼠抗人Ig抗体)来检测。可以使用本领域技术人员已知的多种测定法中的任何一种来检测抗原特异性的免疫效应细胞，所述测定法包括但不限于FACS，或者在CTL的情况下，51CR-释放测定或3H-胸苷摄取测定。
基本上不含内毒素意指每剂细胞融合物中的内毒素的量少于FDA对于生物制剂所允许的量，即总内毒素为每天5EU/kg体重。
基本上无支原体和微生物污染是指，在本领域技术人员已知的通常被接受的测试中的阴性读数。例如，通过在肉汤培养基中传代培养细胞样品，并在第1、3、7和14天在37℃和适当的阳性和阴性对照下涂布于琼脂平板上来测定支原体污染。通过显微镜在100x下将产品样品外观与阳性和阴性对照的外观相比较。此外，接种指示细胞培养物，培养3和5天，并通过使用DNA结合的荧光染料用落射荧光显微镜在600x下检测支原体的存在。如果琼脂和/或肉汤培养基程序和指示细胞培养程序显示没有支原体污染的证据，则认为该产品是令人满意的。
确定产品没有微生物污染的无菌测试是基于美国药典的直接转移法。该程序要求将收获前培养基流出物和预浓缩样品接种到含有胰蛋白酶大豆肉汤培养基和巯基乙酸盐液体培养基的管中。定期观察这些管的浑浊外观(浊度)，持续14天培养期。如果任何一天在任何一种培养基上出现浑浊的外观则表明有污染，而澄清的外观(无生长)测试则基本上无污染。
实施例
实施例:通用方法
多发性骨髓瘤细胞系的制备
人多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226和U266细胞获自ATCC。在含有10％热灭活FBS、2mM/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养细胞系。在存在4-8ug/ml聚凝胺(sigma)的情况下，用表达MUC1shRNA(Sigma)或杂乱对照shRNA(CshRNA，sigma)载体的慢病毒载体转导细胞系。使用嘌呤霉素(2μg/ml)选择转导的细胞。或者，用表达具有GFP选择标记或pHR-GFP(对照)的miR-200c的慢病毒载体稳定转导RPMI和U266癌细胞。通过流式细胞术分选GFP阳性细胞来选择转导的细胞。还用MUC1-C抑制肽GO-203(2.5uM)和对照肽(CP-2)处理RPMI和U266细胞。
免疫印迹
使用含有蛋白酶抑制剂混合物(Thermo scientific)的NP-40裂解缓冲液裂解细胞。使用抗MUC1-C(LabVision)、抗PDL1(Cell Signaling Technology)、抗SNAIL(SantaCruz Biotechnology)和抗β-肌动蛋白(Sigma)抗体对可溶性蛋白进行免疫印迹。使用辣根过氧化物酶缀合的二抗和增强化学发光(GE Healthcare)检测系统实现免疫复合物的检测。
FACS分析
通过多通道流式细胞术分析分析RPMI和U266细胞的MUC1表达和PD-L1表达。将细胞与单克隆抗体(mAb)DF3(抗MUC1-N)、抗PD-L1(细胞信号传导)或对照小鼠IgG1孵育30分钟，然后用藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗小鼠IgG对细胞进行二次标记另外30分钟。然后将细胞固定在2％多聚甲醛中。使用FACScan和CellQuest Pro软件(BD Biosciences)通过流式细胞术分析染色的细胞。
定量RT-PCR
对于qRT-PCR，使用Thermoscript RT-PCR系统(Invitrogen)以1μg总RNA进行互补DNA(cDNA)合成。使用SYBR green qPCR测定试剂盒(Applied Biosystems)，每个样品采用1μl稀释的cDNA并用ABI prism 7000序列检测器(ABI)扩增。附表S1中列出了MUC1、PDL1和GAPDH的qPCR的正向和反向引物。通过学生t检验确定统计学显著性。
CTL测定
MUC1下调后，在标准CTL荧光测定中评估同种异体T细胞对MM细胞的裂解。
miR-200c表达分析
使用RNeasy总RNA分离试剂盒(Qiagen)从细胞中分离总RNA。使用小RNA特异性的cDNA合成试剂盒(System Biosciences)从1ug总RNA制备cDNA。采用通用反向引物和miR-200c特异性的正向引物通过qPCR评估miR-200c的表达。使用人U6小RNA作为对照。对于qPCR，将SYBR green qPCR测定试剂盒(Applied Biosystems)与1ul稀释的cDNA样品一起使用，并用ABI Prism 7000序列检测器(Applied Biosystems)分析。按照描述计算富集倍数[Wang Q，Mol.Cell，2005]。
PDL-1 3’UTR报告基因测定
用空载体或含有miR-200c结合位点的PDL1-3'UTR报告基因(Active Motif)转染在6孔板中培养的细胞。在superfect转染试剂(Qiagen)的存在下用细胞转染质粒并再孵育48小时。在孵育期结束时，用来自供应商的试剂盒(Active Motif)中提供的裂解底物缓冲液裂解细胞，并使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega)进行分析。
ChIP测定
如前所述制备可溶染色质，并用抗SNAIL或对照非免疫免疫球蛋白IgG进行免疫沉淀。对于实时ChIP qPCR，将来自50μl DNA提取物的2μl与SYBR green master mix(AppliedBiosystems)一起使用，并用ABI Prism 7000序列检测器(Applied Biosystems)扩增样品。用于PDL1和作为对照区的GAPDH启动子的ChIP-qPCR的引物列于附表SII中。按照描述计算相对富集倍数[Wang Q，Mol.Cell，2005]。
实施例2：MUC1癌蛋白调节多发性骨髓瘤细胞中的PD-L1表达
如通过流式细胞术分析所测定的，多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226和U266显示出高水平的MUC1和PDL-1表达(图1A)。为了评估MUC1在调节PD-L1表达中的作用，通过用MUC1特异性shRNA进行慢病毒转染，在RPMI8226和U266人骨髓瘤细胞系中沉默MUC1表达(图1B)。如通过二维流式细胞术测定的，MUC1表达的抑制与RPMI细胞的PD-L1水平的急剧降低相关。通过Western印迹分析证实了用MUC1特异性shRNA进行慢病毒转染后PD-L1表达减少(图1C，左图)。通过使用CRISPR技术改变编码MUC1-C亚基的基因序列，证实了抑制MUC1对PD-L1表达的影响。令人感兴趣的是，与PD-L1蛋白的转录后调节一致，在MUC1-C表达沉默的RPMI细胞中PD-L1的mRNA水平未改变(数据未显示)。
接下来，在从疾病活跃的患者中获得的骨髓抽吸物中分离原代MM细胞，在其中探究MUC1信号传导对PD-L1的影响。GO-203是带有CQC基序的细胞穿透肽，其插入质膜处的MUC1-C亚基并且阻止核易位和下游信号传导所必需的同源二聚化。值得注意的是，GO-203不会改变MUC1表达。将骨髓瘤细胞系和原代骨髓瘤细胞体外暴露于亚致死剂量的GO-203导致PD-L1表达的剂量依赖性降低。这些发现集中表明，MUC1癌基因经由MUC1信号传导和与下游效应子的相互作用，是PD-L1表达的关键介导者。
实施例3：在多发性骨髓瘤中PD-L1 3'UTR具有MIR-200C结合位点并响应MIR-200C的过表达。
人们越来越了解到非编码RNA在调节细胞信号传导中以及作为肿瘤发生关键方面的介质发挥着重要作用。Micro-RNA通过直接结合候选mRNA的3'UTR来阻止翻译和蛋白质产生，从而调节靶基因的表达。PD-L1 3'UTR的序列分析揭示了miR-200c结合位点的存在(图2A)。最近在肺癌模型中注意到miR-200c和PD-L1之间的相互作用。先前已经在实体瘤模型中证明了MUC1调节miR-200c的表达。随后我们证实了MM模型中miR200c和PDL1mRNA的相互作用。使用RPMI细胞的染色质免疫沉淀(ChIP)分析证实了miR200c和PDL1mRNA的结合。
我们随后检测了miR-200c对MM细胞中PD-L1表达的影响。使用具有GFP标签的慢病毒载体，将表达miR-200c的病毒颗粒转导入RPMI细胞。通过二维流式细胞术分析注意到GFP阳性细胞中PD-L1蛋白表达的显著降低(图2B)。此外，在GFP+群体的流式细胞分选后，通过来自这些细胞的全细胞裂解物的western免疫印迹的蛋白质分析，揭示了miR-200c高群体中PD-L1蛋白表达的明显减少(图2C)。为了扩展这种分析，对U266多发性骨髓瘤细胞进行类似的研究。通过FACS(图2D)和western印迹(图2E)所测定，U266细胞中miR-200c的异位表达导致PD-L1表达的降低。为了检测MUC1表达对MM中miR200c水平的影响，通过慢病毒向RPMI和U266细胞中转染具有MUC1特异性shRNA，评估MUC1沉默的效果。MUC1表达的下调导致miR200c水平的相应增加，在用对照载体进行慢病毒转染后没有观察到该结果。
实施例4：MUC1-C通过SNAIL依赖性机制抑制microRNA MIR-200C。
我们接下来试图阐明MUC1调节miR-200c表达的机制。先前在乳腺上皮细胞中的研究证明，ZEB1转录抑制子结合于miR-200c启动子上富含GC的E盒元件(CACGTG)(Rajabi等)，从而下调miR-200c的表达。尽管ZEB1在MM细胞中未被发现，但是另一种表观遗传调节蛋白SNAIL也已经显示在恶性细胞中结合富含GC的E盒元件(参考Can cell-FBP1)。与其在阻断miR-200c转录中的作用一致，我们证明，通过shRNA的慢病毒转染沉默SNAIL导致RPMI细胞中miR-200c的水平显著增加(图3B，左)。RPMI细胞的ChIP分析证明，miR-200c启动子上SNAIL以MUC1依赖性方式占据(图3A左)。通过shRNA转染沉默MUC1导致SNAIL与miR200c启动子结合的显著降低。有趣的是，MUC1的沉默对这些细胞中SNAIL蛋白的表达没有影响(图3A右)。在U266人骨髓瘤细胞系的研究中观察到类似的发现。这些发现一致表明，MUC1的作用在于稳定SNAIL和miR-200c启动子的相互作用，而不是直接影响SNAIL的产生。
实施例5：MUC1癌蛋白调节AML细胞中的PD-L1表达
我们已经证明MUC1是AML细胞上PDL1表达的关键调节物。据记录，用MUC1特异性shRNA进行慢病毒转染后，或在CRISPR介导的MUC1翻译破坏后，MUC1表达被沉默。如通过流式细胞术和western印迹分析所确定，MUC1沉默导致人AML细胞系MOLM-14和THP1的MUC1表达几乎消失。如通过基于荧光染料的CTL测定所确定的，MOLM14和THP1AML细胞上MUC1-C的沉默导致对T细胞介导的裂解的敏感性增加2倍。
实施例6：MUC1-C沉默对体内PD-L1表达的影响
为了评估MUC1-C沉默对体内PD-L1表达的影响，用100,000个GFP转染的TIB-49鼠AML细胞攻击C57BL/6J小鼠，其中使用针对MUC1-C的慢病毒shRNA发夹对MUC1-C进行沉默。在白血病建立后，从骨髓和脾中分离出TIB-49GFP+细胞，并测定白血病细胞上的PD-L1表达。与用对照载体转导的TIB-49细胞接种的小鼠相比，植入MUC1沉默的AML细胞的小鼠的TIB-49GFP+细胞表现出显著更低的PD-L1表达(18％对3％；n＝4)。与接种对照AML细胞的小鼠的T细胞相比，用沉默的MUC1-C的AML接种的小鼠的骨髓分离的T细胞显示当用自体肿瘤裂解物离体刺激时INF-γ产生增加三倍(n＝4)。我们小组开发了一种肽抑制剂药物(G0-203)，其为一种与MUC1-C CQC基序结合，破坏MUC1-C与下游效应子的相互作用的细胞穿透肽。正如在MUC1沉默后观察到的，从G0203处理的小鼠中分离的骨髓来源的CD4+和CD8+T细胞显示，与离体暴露于AML裂解物的对照小鼠相比，细胞内IFN-γ产生增加了两倍(n＝4)。
实施例7：PD-L1 3'UTR具有MIR-200C结合位点并响应AML中的MIR-200C过表达。
为了研究MUC1调节PDL1表达的机制，我们检测了已显示为致癌调节效应子的非编码RNA的作用。microRNA(miRNA)是一类保守的小RNA，其通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'UTR)相互作用而在转录后调节基因表达。PD-L1基因的3'UTR含有microRNA的miR-200家族的推定结合位点，这支持了miR-200在调节PDL1表达中发挥作用的假说。
在本研究中，我们评估了对MUC1-C介导的信号传导进行干扰后，对mir200c水平、PD-L1的表达以及白血病原始细胞对免疫介导的靶向作用的敏感性的影响。如通过qPCR所证明的，MUC1-C沉默的MOLM-14细胞表现出miR-200c表达增加2倍，并且与PD-L1表达从77％降低至13％相关。这些数据在THP1细胞中被证实，在MUC1-C沉默后，PD-L1表达从95％降低至40％。如通过流式细胞术分析所证明，在MOLM14细胞中通过慢病毒过表达miR200c导致PD-L1表达从90％减少至2％，佐证了观察到的miR200C参与PD-L1表达的调节。
其它实施方式
虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (13)

1.一种治疗患者中的肿瘤的方法，其包括向所述患者施用包含MUC1抑制剂的组合物，所述MUC1抑制剂的量足以降低肿瘤PD-L1表达。
2.权利要求1所述的方法，还包括施用检查点抑制剂。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述患者已接受自体树突细胞/肿瘤细胞融合体(DC/肿瘤融合体)的群体。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MUC1抑制剂是GO-203。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤或血液肿瘤。
6.权利要求5所述的方法，其中所述实体瘤是肺肿瘤、乳腺肿瘤或肾肿瘤。
7.权利要求5所述的方法，其中所述血液肿瘤是急性骨髓性白血病(AML)或多发性骨髓瘤(MM)。
8.权利要求1所述的方法，其中所述检查点抑制剂是A2AR、B7-H3/CD276、B7-H4/VTCN1、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、CTLA-4、GITR、ICOS、IDO、KIR、LAG3、OX40、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA抑制剂。
9.权利要求6所述的方法，其中所述检查点抑制剂是A2AR、B7-H3/CD276、B7-H4/VTCN1、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、CTLA-4、GITR、ICOS、IDO、KIR、LAG3、OX40、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA抗体。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用靶向调节性T细胞的试剂。
11.前述权利要求中任一项所述的方法，还包括向所述患者施用免疫调节剂。
12.权利要求11所述的方法，其中所述免疫调节剂是来那度胺、泊马度胺(pomalinomide)或阿普斯特。
13.前述权利要求中任一项所述的方法，还包括向所述患者施用TLR激动剂、CPG ODN、polyIC或破伤风类毒素。
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