CN108135977A - 包含同时表达IL-12和shVEGF的腺病毒的抗肿瘤免疫力增强组合物 - Google Patents

包含同时表达IL-12和shVEGF的腺病毒的抗肿瘤免疫力增强组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及同时表达白细胞介素‑12和shVEGF的溶瘤腺病毒，以及各自包含所述溶瘤腺病毒的抗肿瘤免疫增强组合物和抗癌作用促进组合物。本发明人在免疫学小鼠黑素瘤或肾癌模型中证实，VEGF抑制和IL‑12表达的同时发生诱导了免疫功能的恢复和对抗癌作用的促进。尤其是，通过发现了增强的抗癌作用涉及抗癌免疫力的提高、Th1细胞因子的增加以及肿瘤诱导的胸腺萎缩的预防，首次确立了同时表达IL‑2和shVEGF的基因载体在癌症基因治疗中的适用性。

Description

包含同时表达IL-12和shVEGF的腺病毒的抗肿瘤免疫力增强 组合物
技术领域
本发明涉及用于增强抗肿瘤免疫力的包含共表达IL-12和shVEGF的腺病毒的组合物。
背景技术
癌症患者中的免疫功能障碍是公知的[1]，临床上明显的是肿瘤有效地避免了抗癌免疫应答。虽然最近的抗癌治疗主要集中在外科手术、化学治疗和放射治疗，但它们都伴随有副作用[2,3]。为了克服这些障碍并提高抗癌治疗的效率，对免疫治疗的研究正在积极进行。在过去的几十年中，由于基础免疫学中的新发现和肿瘤抗原的分子发现，对用于预防和治疗癌症的免疫治疗的研究正在积极进行[4]。肿瘤细胞本身表达大量异常抗原，并且这些抗原通过免疫监视(immune surveillance)引起根除应答(eradication)。即使体内的免疫系统积极作用，肿瘤细胞也可以避开免疫监视[5,6]。鉴定出这种现象是由肿瘤细胞产生的多种因子(factor)介导的。肿瘤组织可以产生免疫抑制分子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤生长因子(TGF)-β和白细胞介素(IL)-10[7,8]。据报道，在免疫抑制的肿瘤中发生调节性T细胞的浸润[9-11]。这些在肿瘤组织中过表达的因子诱导免疫抑制微环境和肿瘤中的免疫耐受(immune tolerance)。因此，克服免疫监视是免疫治疗的关键策略。
IL-12是最有效和最有希望的抗癌细胞因子之一。IL-12是包含通过二硫键连接的40kDa和35kDa亚基的异二聚体(heterodimeric)蛋白，由活化的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和活性B淋巴细胞产生。IL-12可增强T辅助1(Th1)细胞免疫力[12]和细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性，并抑制血管生成。通常，IL-12激活T细胞和自然杀伤(NK)细胞的IFN-γ产生[13]。IL-12的局部表达允许肿瘤细胞灵敏地响应T细胞介导的细胞毒性，导致肿瘤生长抑制和全身免疫力(systemic immunity)的建立。然而，临床应用IL-12的一个缺点是可能会在全身出现细胞因子相关毒性，其限制了当施用时对于患者的可接受剂量[14-17]。此外，免疫效应的整体下调可导致反复施用IL-12。在患者血清中，由于IL-10表达的升高和IFN-γ和TNF-β表达的降低，发生IL-12从Th1到Th2免疫的极化，并且由于该原因，IL-12被反复施用[18,19]。这些临床结果显示了IL-12作为用于癌症治疗的单一治疗剂的局限性。
VEGF是由细胞产生的信号蛋白，刺激血管发生和血管生成[20]。特别是，VEGF影响骨髓中的T细胞前体，因此抑制T细胞和树突状细胞的增殖和成熟[21]。另外，VEGF在血管生成中发挥重要作用，并且代表了称为转移的副作用[22]。因此，VEGF是肿瘤生长的刺激因子，也充当了抗癌免疫力的抑制因子，预期由VEGF shRNA引起的VEGF下调可以恢复免疫应答并提高抗癌作用。这些研究表明与IL-12类似，由VEGF shRNA介导的治疗机制与增强的CTL或树突状细胞介导的免疫应答相关。
因此，本发明人提出了使用上述免疫治疗的组合来更有效地提高抗肿瘤免疫力的方法。
在整个说明书中引用了多篇论文和专利文献，并且指出了它们的引用。为了更清楚地描述本发明所属领域的标准和本发明的范围，引用的论文和专利文献的公开内容通过引用整体并入本文。
发明内容
[技术问题]
本发明人尝试开发免疫治疗以克服肿瘤使用肿瘤组织中产生的免疫抑制分子所进行的对免疫监视的逃避。结果，本发明人构建了共表达IL-12和shVEGF的腺病毒，并开发了包含腺病毒的用于改善免疫力的组合物和用于改善抗癌作用的组合物。此外，本发明人确定了通过将这种共表达IL-12和shVEGF的腺病毒(RdB/IL12/shVEGF)应用于癌症治疗可以增强治疗效果，从而完成了本发明。
因此，本发明旨在提供共表达IL-12和shVEGF的腺病毒和包含腺病毒的用于增强抗肿瘤免疫力的组合物。
本发明还旨在提供共表达IL-12和shVEGF的腺病毒用于增强抗肿瘤免疫力的用途。
本发明还旨在提供用于使用共表达IL-12和shVEGF的腺病毒增强抗肿瘤免疫力的方法。
本发明还旨在提供包含共表达IL-12和shVEGF的腺病毒的抗癌组合物，其用于治疗癌症的用途以及用于治疗癌症的方法，所述方法包括向对象施用所述组合物。
本发明还旨在提供用于预防或治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩的组合物，所述组合物包含共表达IL-12和shVEGF的腺病毒，其用于治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩的用途，以及用于治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩的方法，所述方法包括向对象施用所述组合物。
通过以下的发明详述、权利要求和附图，本发明的其他目的和优点将变得更加明显。
[技术方案]
根据本发明的一个方面，本发明提供了：重组腺病毒，其包含(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQ ID NO：2的序列中的至少一个的IL(interleukin)-12基因，以及(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF(vascular endothelial growth factor)mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；或者用于增强抗肿瘤免疫力(antitumor immunity)的组合物，其包含：(a)治疗有效量的重组腺病毒；以及(b)可药用载体。
在进行研究以开发免疫治疗来克服肿瘤使用肿瘤组织中产生的免疫抑制分子进行的对免疫监视的逃避中，本发明人构建了共表达IL-12和shVEGF的腺病毒，并开发了用于增强抗肿瘤免疫力的组合物和用于增强抗癌作用的组合物。本发明人确定了通过将这种共表达IL-12和shVEGF的腺病毒(RdB/IL12/shVEGF)应用于癌症的基因治疗可以改善治疗效果。
在过去的几十年里，癌症免疫原性疗法已经发展成为一种更有前途的方法。但是，为了逃避免疫监视系统，肿瘤还具有多种不同的策略。为了克服这些障碍并提高抗癌免疫效果，构建了共表达IL-12(RdB/IL12)和VEGF shRNA(short hairpin RNA)的系统(RdB/shVEGF)及其溶瘤性共表达腺病毒(RdB/IL12/shVEGF)系统，作为用于恢复免疫抑制并且提高抗癌免疫力的适当的治疗佐剂(adjuvant)。IL-12诱导Th1细胞分化并激活细胞毒性T淋巴细胞以及NK细胞的细胞毒性，从而提高抗癌免疫力。shVEGF对抑制VEGF表达非常有效，因此刺激T细胞和树突状细胞的增殖和成熟。这种效应进一步放大了IL-12的功能。然而，目前还没有关于肿瘤中由IL-2和shVEGF的共表达引起的治疗效果的研究。因此，本发明人首先研究了将共表达IL-2和shVEGF的腺病毒(RdB/IL12/shVEGF)注射到肿瘤中的免疫原性疗法的效果。在B16-F10鼠黑素瘤模型中，将RdB/IL12/shVEGF注射到肿瘤中极大地改善了抗癌作用。尽管在RdB/IL12/shVEGF处理组中IL-12和IFN-γ表达水平显著升高，但VEGF表达水平降低。另外，在脾细胞(splenocyte)和B16-F10共培养上清液中，T辅助细胞1/2型细胞因子的比率升高。在RdB/IL12/shVEGF注射小鼠中，癌症特异性免疫细胞的细胞毒性升高。像上述结果一样，RdB/IL12/shVEGF的原位递送导致CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和CD86+APC大量浸润到肿瘤坏死区周围组织中的现象。重要的是，共表达IL-12和shVEGF的腺病毒防止肿瘤诱导的胸腺萎缩，与细胞死亡减少相关，并提高了胸腺中的细胞增殖。共表达IL-12和shVEGF的溶瘤腺病毒可用作提高抗癌作用并增强抗肿瘤免疫力的佐剂。
本发明的重组腺病毒包含IL-12基因序列和血管内皮生长因子小发夹RNA(shVEGF)基因序列两者。IL-12基因序列包含由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的至少一个表示的核苷酸序列，shVEGF序列包含与由SEQ ID NO：3表示的核苷酸序列互补的序列。更具体地，IL-12基因序列包含IL-12A(p35)基因序列和IL-12B(p40)基因序列中的至少一个，并且根据本发明的示例性实施方案，IL-12基因序列包含IL-12A(p35)基因序列、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)序列和IL-12B(p40)基因序列(参见图1A，RdB/IL12和RdB/IL12/shVEGF)。
应该理解，本发明中使用的IL-12基因序列也包括与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中至少一个的序列具有显著同一性(substantial identity)或显著相似性(substantialsimilarity)的基因序列。显著同一性是指当随机序列与本发明序列以尽可能多的一致性比对并且使用本领域常规使用的算法分析比对序列时，具有至少80％同源性、更优选90％同源性，最优选95％同源性的序列。显著相似性涵盖IL-12基因序列中的所有变化(例如一个或更多个碱基的缺失或插入)，其不影响本发明的使与重组腺病毒载体的同源重组最小化的目的。因此，本发明的IL-12基因序列不限于上述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列，并且IL-12基因序列的所有实例应被解释为包括在本发明的范围内，只要序列不显著影响本发明期望的最终产物的活性即可。
在本发明中，小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)是具有发夹结构的人工RNA分子，并且用于通过RNA干扰来抑制靶基因表达。shRNA通常通过质粒、细菌或病毒载体递送到细胞中。shRNA具有相对低的降解和周转率(turnover)的优点。
本文使用的术语“shRNA分子”是指可介导RNA干扰(interference)或基因沉默的核酸分子。本发明中使用的shVEGF分子包含与VEGF mRNA互补的序列，本文使用的术语“互补”涵盖100％互补和足以通过RNA干扰机制抑制VEGF基因表达的不完全互补的程度，例如，优选90％互补，更优选98％互补，并且最优选100％互补。在说明书中，为了表示100％互补，将其特别描述为“完全互补(completely complementary)”。
根据本发明的示例性实施方案，包含在本发明的腺病毒中的shRNA序列包含SEQID NO：3(GenBank登录号gi:70608153)的序列或与其一部分互补的序列，并且优选地，与由SEQ ID NO：3的序列表示的VEGF-A mRNA序列的核苷酸92至112的序列互补的序列。根据本发明的特定示例性实施方案，shRNA序列是SEQ ID NO：4的序列和SEQ ID NO：5的序列。同时，SEQ ID NO：3的序列与SEQ ID NO：6的序列具有88％同源性，并且更特别地，与SEQ IDNO：6的序列的核苷酸17至438的序列具有88％同源性。
同时，本发明的重组腺病毒包含活性E1A基因和未活化的E1B 19基因、E1B 55基因或E1B 19/E1B 55基因。在说明书中，关于基因使用的术语“未活化”是指由于没有正常执行基因转录和/或翻译，由基因编码的正常蛋白质没有正确地发挥功能。例如，未活化的E1B19基因是由于基因中发生突变(替换、添加、部分缺失或完全缺失)而不产生活性E1B 19kDa蛋白质的基因。E1B 19缺失可导致提高的坏死能力，E1B 55基因的缺失导致肿瘤细胞特异性(参见专利申请No.2002-23760)。在说明书中，关于病毒基因组序列使用的术语“缺失”是指相应序列的部分缺失以及完全缺失。
根据本发明的一个示例性实施方案，重组腺病毒包含E1A区，并且包含E1B 19和55kDa的E1B区缺失(ΔE1B)，并且E3区缺失(ΔE3)。包含E1A基因的重组腺病毒具有可复制的特征。IL-12基因和shVEGF分别插入在E1和E3区缺失的腺病毒中(参见图1A)。然而，E1A区具有其中位于E1A基因序列中的编码Rb结合位点的核苷酸序列中残基45的Glu被Gly替换的变化，以及其中氨基酸121至127的序列完全被Gly替换的变化。
本发明中使用的重组腺病毒包含在动物细胞中、优选哺乳动物细胞中可操作的启动子。本发明适当的启动子包括来自哺乳动物病毒的启动子和来自哺乳动物细胞基因组的启动子，例如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、U6启动子、H1启动子、鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MLV)长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)启动子、腺病毒早期启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白(methallothionin)启动子、β肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子、人GM-CSF基因启动子、人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和存活蛋白(survivin)启动子，但是本发明不限于此。最优选地，本发明中的启动子是CMV启动子。
在本发明中使用的重组腺病毒中，IL-12基因序列和shVEGF序列与启动子可操作地连接。在说明书中，术语“可操作地连接”是指核酸表达调控序列(例如，启动子阵列、信号序列和转录调节因子结合位点)与不同核酸序列之间的功能性结合，因此调控序列调节不同核酸序列的转录和/或翻译。
本发明的重组腺病毒还可以包含抗生素抗性基因和作为选择标志物的报道基因(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶和β-葡糖醛酸糖苷酶)。抗生素抗性基因包括本领域常规使用的抗生素抗性基因，例如对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素有抗性的基因，并且优选抗新霉素基因。选择标志物甚至可以在通过单独的启动子或内部核糖体进入位点(IRES)连接的表达系统中表达，并且可用于本发明的IRES是在一些类型的病毒和细胞的RNA中发现的调控序列(McBratney等.Current Opinion in Cell Biology 5:961(1993))。
如在下文所述的实例中描述的，本发明的共表达IL-12和VEGF特异性shRNA的重组腺病毒通过提高IL-12表达和抑制VEGF表达来破坏肿瘤的免疫监视逃避机制。据报道，在多种小鼠和人恶性肿瘤的发展中已经发现从Th1向Th2细胞因子表达的转变，并且本发明的组合物通过抑制这种Th2免疫偏离现象而提高Th1/Th2细胞因子比率(参见图4A至图4C)。
在本发明的另一方面，本发明提供一种抗癌组合物，其包含(a)(i)包含SEQ IDNO：1的序列和SEQ ID NO：2的序列中的至少一个的IL-12基因，和(ii)治疗有效量的重组腺病毒，其包含与SEQ ID NO：3的序列的血管内皮生长因子(VEGF)mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及(b)可药用载体(carrier)。
本发明的抗癌组合物使用包含在上述组合物中的重组腺病毒用于增强抗肿瘤免疫力，并且将省略它们之间的共同细节以避免说明书中的过度复杂。
根据本发明的示例性实施方案，癌症包括胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌(例如神经胶质瘤)、前列腺癌、骨癌、头颈癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、肾癌、多倍体癌(polyploid carcinoma)、甲状腺癌、甲状旁腺癌和输尿管癌，但本发明不是限于此。
在本发明的另一方面，本发明提供了用于预防或治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩(tumor-induced thymic atrophy)的组合物，其包含(a)(i)包含SEQ ID NO：1的序列和SEQID NO：2的序列中的至少一个的IL-12基因，和(ii)治疗有效量的重组腺病毒，其包含与SEQID NO：3的序列的血管内皮生长因子(VEGF)mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及(b)可药用载体。
用于预防或治疗肿瘤诱导性胸腺萎缩的组合物使用包含在上述组合物中的重组腺病毒用于增强抗肿瘤免疫力，并且将省略它们之间的共同细节以避免说明书中的过度复杂。
通常在荷瘤小鼠中观察到胸腺萎缩，并导致宿主对于肿瘤的免疫力降低。本发明的组合物在肿瘤中共表达IL-12和shVEGF，从而预防或抑制由肿瘤发展引起的胸腺萎缩(参见图7A至7G)。
上述本发明的所有组合物均包含可药用载体。本文中使用的常用于制剂的可药用载体包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但本发明不限于此。除了上述组分之外，本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂(suspension)、防腐剂等。合适的可药用载体和药剂详细描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版，1995)中。
本发明的组合物可以经口施用或经胃肠外施用，例如经静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射或经皮施用，本发明组合物优选经肠胃外施用。根据本发明的示例性实施方案，优选地，本发明的用于增强抗肿瘤免疫力的组合物直接瘤内(intratumorally)施用。
药物组合物的合适剂量可以根据以下参数通过多种方式规定：例如，形成方法、施用方法、患者年龄、体重和性别、疾病症状的严重程度、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和反应灵敏度。本发明的药物组合物的日剂量为例如0.001至1000mg/kg。然而，活性成分的实际剂量可以通过考虑多种相关因素来确定，例如待分化和增殖的靶组织细胞的量、施用途径、患者体重、年龄和性别，因此剂量不以任何方式限制本发明的范围。
[有利效果]
本发明的特征和优点总结如下：
(a)本发明涉及共表达IL-12和shVEGF的溶瘤腺病毒，包含所述溶瘤腺病毒的用于增强抗肿瘤免疫力的组合物和用于增强抗癌作用的组合物。
(b)本发明人发现，当VEGF抑制和IL-12表达是在免疫活性小鼠黑素瘤模型中共表达时，恢复了免疫功能并且增强了抗癌作用。
(c)特别地，本发明人确定了这种抗癌作用的提高与抗癌免疫力的提高、Th1细胞因子的增加和肿瘤诱导的胸腺萎缩的预防有关，因此首先鉴定了共表达IL-12和shVEGF的基因递送系统在癌症基因治疗中的适用性。
附图说明
图1A至1E示出了共表达IL-12和VEGF shRNA的溶瘤腺病毒的特征。图1A示出了腺病毒RdB和RdB/IL12/shVEGF的基因组结构的示意图。RdB包含突变的E1A(空心星-Rb蛋白结合位点的突变体)，缺失E1B19,55kDa(ΔE1B)和E3(ΔE3)区；将鼠IL-12和鼠shVEGF插入腺病毒基因组的E1和E3区中。用RdB、RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF感染B16-F10细胞，并且检测IL-12(图1B)和VEGF(图1C)表达水平。感染后48小时，收集细胞培养上清液，并使用ELISA试剂盒定量IL-12和VEGF水平。参见图1D，通过与上述相同的方法，对根据MOI(5、10、20、50MOI)的IL-12水平进行定量。图1E表示鼠癌细胞系(BNL、B16-F10、LLC和CMT-93)和人癌细胞系(U87MG)中表达IL-12和/或shVEGF的溶瘤腺病毒的细胞病变效应。一式三份实验的数据表示为平均值±标准差(SD)，并且从至少三次独立实验获得类似结果。MOI，感染复数。1.PBS 2.RdB 3.RdB/IL12 4.RdB/shVEGF 5.RdB/IL12/shVEGF。
图2A至2C示出了荷癌小鼠中腺病毒的抗癌作用。图2A和2B示出了用PBS(空心菱形)、RdB(空心圆)、RdB/shVEGF(空心三角形)、RdB/IL12(实心菱形)或RdB/IL12/shVEGF(实心圆)处理的黑素瘤小鼠中的抗癌作用，并且图2A至2C示出了用PBS(空心菱形)、RdB/IL12(实心菱形)或RdB/IL12/shVEGF(实心圆)处理的肾癌小鼠中的抗癌作用。在第1天、第3天和第5天，将3×109VP(图2A；初始肿瘤体积：80-100mm3)或6×108VP的剂量的腺病毒；以及RdB/IL12和RdB/IL12/shVEGF(图2B；初始肿瘤体积：80-100mm3，图2C；初始肿瘤体积：100mm3)腺病毒施用到C57BL/6小鼠的肿瘤中。每天监测和记录肿瘤体积，直到研究结束。箭头表示腺病毒的注射时间。值表示为平均值±SD(n＝8)。**，P<0.01。
图3A至3C示出了IL-12、VEGF和IFN-γ的体内肿瘤内表达水平。最初病毒注射后7天，收集肿瘤组织，并通过ELISA测量IL-12(图3A)、VEGF(图3B)和IFN-γ(图3C)水平。实验重复三次，数据表示为平均值±SD。*，P<0.05或**，P<0.01；1.PBS 2.RdB 3.RdB/shVEGF4.RdB/IL125.RdB/IL12/shVEGF。
图4A至4C显示在脾细胞和B16-F10共培养上清液中Th1/Th2细胞因子比率升高。在最终病毒注射后的第7天，收集脾细胞并在重组人IL-2的存在下与经照射的B16-F10癌细胞培养3天。分析Th1/Th2/Th17CBA以测量上清液的Th1/Th2细胞因子比率。(图4A)IFN-γ值，(图4B)IL-6值，(图4C)IFN-γ/IL-6比率。一式三份实验后，数据表示为平均值±SD。**P<0.01；1.PBS 2.RdB 3.RdB/shVEGF 4.RdB/IL12 5.RdB/IL12/shVEGF。
图5示出了测量肿瘤特异性免疫力的结果。在最终病毒注射后的第7天，从用PBS、RdB或表达细胞因子的腺病毒处理的小鼠收集脾细胞，并与经照射的B16-F10细胞培养3天。随后，进行IFN-γELISPOT测定，并且在1×105IFN-γELISPOT的浓度下测量斑的数目。一式三份实验后，每个值表示为平均斑数±SD。**,P<0.01；1.PBS 2.RdB 3.RdB/shVEGF 4.RdB/IL12 5.RdB/IL12/shVEGF。
图6A至6E示出了用腺病毒处理的鼠肿瘤碎片的组织学和免疫组织化学分析的结果。在第1、3和5天处理腺病毒，并在第12天收集肿瘤，随后进行组织学分析。图6A显示对肿瘤组织的冷冻切片进行H&E染色。放大倍数：40×和400×。图6B显示用抗CD4或抗CD8单克隆抗体对肿瘤组织的冰冻切片染色。放大倍数：400×。图6C示出了使用图像分析软件半定量测量的CD4+T和CD8+T表达的提高(**p<0.01)。图6D示出了用抗CD11c、抗CD86单克隆抗体和DAPI染色的肿瘤组织的冷冻切片。放大倍数：400×。图6E显示了用抗NK1.1单克隆抗体和DAPI染色的肿瘤组织的冷冻切片。放大倍数：400×。1.PBS 2.RdB3.RdB/shVEGF 4.RdB/IL12 5.RdB/IL12/shVEGF。
图7A至7G示出了RdB/IL12/shVEGF腺病毒预防胸腺萎缩的效果。图7A示出了用PBS、RdB、RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF处理的小鼠的整个胸腺的图像。图7B示出了用溶瘤腺病毒处理的小鼠中胸腺的重量。数据表示为平均值±SD(*P<0.05，**P<0.01)。图7C示出了来自用H&E染色的石蜡块的切片。图7D示出了通过TUNEL测定检测的胸腺组织中的细胞凋亡。图7E示出了通过增殖细胞核抗原染色评估的胸腺细胞的增殖程度。图7F和7G示出了使用图像分析软件半定量测量的图7D和图7E的结果(**p<0.01)。1.PBS 2.RdB 3.RdB/shVEGF 4.RdB/IL12 5.RdB/IL12/shVEGF。
图8A和8B示出了在用重组腺病毒最终处理小鼠后第7天分离小鼠血清后通过ELISA测定获得的结果，以确认小鼠中剩余的IL-12和IFN-γ的含量。图7A示出了用PBS、RdB、RdB/shVEGF、RdB/IL12或RdB/IL12/shVEGF处理的鼠血清中的IL-12含量。图7B显示用PBS、RdB、RdB/shVEGF、RdB/IL12或RdB/IL12/shVEGF处理的鼠血清中的IFN-γ含量。
[发明模式]
在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。提供这些实施例仅是为了更全面地描述本发明，并且对于本领域的普通技术人员显而易见的是，本发明的范围不限于根据本发明的范围的这些实施例。
实施例
实验材料和实验方法
(1)细胞系和细胞培养
使用补充有10％胎牛血清(FBS；Gibco BRL)、L-谷氨酰胺(2mmol/L)、青霉素(100IU/mL)和链霉素(50mg/mL)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Gibco BRL,GrandIsland,NY)或Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI；Gibco BRL)作为细胞培养基。HEK293(表达腺病毒E1区的人胚胎肾细胞系)、U87MG(人神经胶质瘤细胞系)、BNL(鼠肝癌细胞系)、B16-F10(鼠黑素瘤细胞系)、LLC(鼠肺癌细胞系)、CMT-93(鼠多倍体癌细胞系)和Renca(鼠肾腺癌细胞系)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)。将所有细胞系在5％CO2潮湿环境中于37℃培养，并对其进行使用Hoeschst染料的支原体阴性测试、细胞培养和聚合酶链式反应(PCR)。大肠杆菌在37℃下在Luria Bertani培养基中培养。
(2)动物测试
六至八周龄的雄性C57BL/6小鼠购自Charles River LaboratoriesInternational,Inc.(Wilmington,MA)，并在无病原体条件下保持在层流柜中。所有测试均由实验动物评估和认证协会(Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care，AAALAC)批准，并根据汉阳大学制度动物护理和使用委员会(Hanyang University Institutional Animal Care and Use Committee)制定的指导方针进行。
(3)共表达IL-12和shVEGF的溶瘤腺病毒的制备
为了制备在E1和E3区中共表达IL-12和shVEGF的腺病毒，首先构建表达shVEGF的E3穿梭载体。使用从骨髓衍生的活性树突状细胞获得的总RNA通过RT-PCR克隆全长鼠shVEGF互补DNA。
使用以下引物组制备shVEGF互补DNA(National Center for BiotechnologyInformation L15435的核苷酸53-982)：有义引物(5’-gatcccggaaggagagcagaagtcccatgttcaagagacatgggacttctgctctcctt tttttttggaaa-3′)，反义引物(5′-tttccaaaaaaaaggagagcagaagtcccatgtctcttgaacatgggacttctgctctccttccgggatc-3’)。用BamHI/HindⅢ消化PCR产物，并将其克隆到经BamHI/HindⅢ处理的pSP72E3/CMV-polyA腺病毒E3穿梭载体中[29]，从而制备pSP72E3/shVEGF E3穿梭载体。对于同源重组，将pSP72E3/shVEGF与腺病毒总载体pdE1共转染到大肠杆菌BJ5183中，从而制备pdE1/shVEGF腺病毒质粒。重组载体的结构通过限制酶处理和PCR分析来确认。
为了构建表达IL-12的腺病毒E1穿梭载体，从pCA14/IL12[30]中切下鼠IL-12基因并将其亚克隆到pXC1RdB E1穿梭载体[23]中，从而制备pXC1RdB/IL12E1穿梭载体。为了进行同源重组，将pXC1RdB/IL12E1穿梭载体和pdE1/shVEGF共转染到大肠杆菌BJ5183中，从而制备pRdB/IL12/shVEGF腺病毒载体(图1A)。
所有病毒均使用HEK293细胞产生，并且如现有技术[31,32]中所述进行腺病毒的纯化、滴定和质量分析。
(4)用于IL-12和VEGF表达的酶联免疫吸附测定
在将3×105个B16-F10黑素瘤细胞接种到6孔板中后，用50MOI的RdB、RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF腺病毒感染。感染48小时后，收集上清液，并使用ELISA试剂盒(IL-12ELISA试剂盒:Endogen,Woburn,MA；VEGF ELISA试剂盒:R&D Systems,Minneapolis,MN)测量IL-12和shVEGF表达水平。
(5)细胞病变效应测定
细胞病变效应值与病毒复制程度相关，并且能够用于测量IL-12和shVEGF表达是否影响腺病毒的可复制性。将细胞接种到24孔板中以达到30％至80％汇合，并用1-500MOI的RdB、RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF腺病毒感染。使用显微镜目视监视病毒的凋亡效应。当在低MOI下病毒感染的细胞完全溶解时，去除死细胞，并用50％甲醇中的0.5％结晶紫染色。
(6)体内抗肿瘤作用
将B16-F10细胞(5 x 105)或RENCA细胞皮下注射到6至7周龄雄性C57BL/6小鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠分成具有类似肿瘤大小的组，并且每隔一天三次瘤内施用不同剂量的总体积为50μl的PBS稀释的腺病毒(3×109VP的RdB或RdB/shVEGF；6×108VP的RdB/IL-12或RdB/IL-12/shVEGF)。每天通过使用卡尺测量垂直肿瘤直径来监测肿瘤生长。使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝0.523L(W)2，其中L是长度，W是宽度。
(7)肿瘤组织中的细胞因子定量和Th1/Th2/Th17谱
最终病毒注射后7天，从腺病毒处理的小鼠组收集肿瘤组织。将肿瘤组织在添加蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St.Louis，MO)的RIPA缓冲液(Elipis Biotech，Taejeon，SouthKorea)中匀化。在将匀浆高速离心10分钟后，使用BSA ELISA试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测量总蛋白质水平。通过ELISA试剂盒(IL-12ELISA试剂盒:Endogen；VEGF ELISA试剂盒:R&D；IFN-γELISA试剂盒:Endogen)测量IL-12、VEGF和IFN-γ的水平。每个实验根据组别进行三次。使用Th1/Th2/Th17CBA试剂盒(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)测量肿瘤组织中的Th1/Th2/Th17型细胞因子表达谱。将ELISA和CBA结果相对于总蛋白质浓度归一化，结果示出为“pg/总蛋白质(mg)”值。
(8)脾细胞中的IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)测定
在最终病毒注射后第7天，从小鼠无菌收集脾脏，并制备单细胞脾细胞[30]。在重组人IL-2(100Uml-1；R&D Systems)的存在下，将脾细胞与经照射的B16-F10(5,000rad)肿瘤细胞一起培养3天。随后，进行IFN-γELISPOT测定[30]。使用基于计算机的免疫斑点系统(AID Elispot Reader System,3.4版；Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassberg,Germany)测量斑点。
(9)组织学和免疫组织化学分析
将肿瘤组织或胸腺固定在10％中性缓冲福尔马林中，制备石蜡块，然后切成4mm切片。用H&E对切片染色，并使用光学显微镜观察。为了检测淋巴细胞和树突状细胞，将肿瘤组织在OCT化合物(Sakura Finetec,Torrance,CA)中冷冻并切成10mm切片。将冷冻切片与作为一抗的大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)、大鼠抗小鼠CD8单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)、小鼠抗小鼠NK-1.1单克隆抗体(Biolegend,SanDiego,CA)或大鼠抗小鼠CD86单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)反应，并与作为二抗的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗大鼠IgG(BD Biosciences Pharmingen)或辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotech,Birmingham,AL)反应。使用二氨基联苯胺/过氧化氢酶(DAKO,Copenhagen,Denmark)作为显色底物。所有侧用Meyer的苏木精复染。为了检测增殖的细胞，将载玻片用二甲苯脱石蜡，并通过醇的处理脱水。使用3％过氧化氢抑制固有过氧化物酶活性。抗增殖细胞核抗原单克隆抗体PC10(DAKO)与二抗Real/Envision(DAKO)结合。将小鼠血清加入到一抗和二抗的复合物中以使分离的二抗与组织切片中发现的鼠免疫球蛋白之间的相互作用最小化。随后，使切片与一抗和二抗的复合物反应，随后与链霉亲和素-过氧化物酶反应。使用二氨基联苯胺/过氧化氢酶作为显色底物。使用图像分析软件(Universal Image Corp.,Buckinghamshire,UK)对CD4、CD8、NK-1.1、CD86和PCNA的表达水平进行半定量分析。结果表示为五个不同数字图像的平均光密度。
(10)提取胸腺
将B16-F10鼠黑素瘤细胞悬浮于100ml Hank平衡盐溶液中，然后注射到6至8周龄雄性C57BL/6小鼠的腹部。当肿瘤体积达到80至100mm3时(细胞植入后8-10天)，每隔一天三次用腺病毒(RdB或RdB/shVEGF，1×1010VP/50μl肿瘤细胞悬浮的PBS；RdB/IL-12或RdB/IL-12/shVEGF，5×109VP/50μl肿瘤细胞悬浮的PBS)处理小鼠。在最终病毒注射后第7天，提取所有胸腺组织并立即加入到RPMI 1640培养基中，并使用电子秤(Ohaus Corp.,FlorhamPark,NJ)称量每个胸腺。
(11)末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定
通过TUNEL测定观察凋亡的胸腺细胞群[33]。在5个随机选择的区中肉眼鉴定凋亡细胞，并以100×和400×的放大倍数拍照。使用图像分析软件对凋亡胸腺细胞的表达水平进行半定量分析。结果表示为五个不同数字图像的平均光密度。
(12)统计学分析
所有数据均表示为平均值±SD。使用Stat View软件(Abacus Concepts,Inc.,Berkeley,CA)和Mann-Whitney检验(非参数秩和检验)进行统计学比较。小于0.05的P值被认为是统计学显著的(*,P<0.05；**,P<0.01)。
实验结果
(1)溶瘤腺病毒介导的IL-12和shVEGF表达
为了产生有效抑制长期VEGF表达的溶瘤腺病毒，通过将鼠IL-12(p35、IRES和p40)和shVEGF基因插入腺病毒(RdB)的E1和E3区来制备共表达IL-12和shVEGF的溶瘤腺病毒[23](图1A)。在RdB/IL12/shVEGF中，测量IL-12表达水平，并且为了检查VEGF特异性shRNA是否抑制VEGF表达，使用RdB、RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF用50的感染复数(MOI)的腺病毒感染B16-F10黑素瘤细胞。感染后48小时，通过ELISA测量上清液中的IL-12或VEGF水平。如图1B和1C所示，用50MOI的RdB/IL12/shVEGF感染的细胞分泌的IL-12的水平为181.4±10.0pg/mL，但在RdB或RdB/shVEGF感染的细胞中几乎检测不到，在RdB/IL12感染的细胞中仅检测到35.6±4.0pg/mL。另外，RdB/IL12/shVEGF(MOI为50)感染的细胞中VEGF表达水平为338.0±6.1pg/mL，并且在RdB、RdB/IL12和RdB/shVEG感染的细胞中分别为552.1±10.3pg/mL、431.1±11.2pg/mL和384.6±19.4pg/mL。与RdB/IL12或RdB/shVEGF相比，这样的结果显示RdB/IL12/shVEGF使IL-12分泌提高5倍，并使VEGF分泌降低1.2倍。此外，作为测量根据MOI(5、10、20、50MOI)的IL-12分泌的变化的结果，如以上的结果，RdB/IL12/shVEGF中IL-12分泌的显著提高取决于病毒浓度，但在RdB或RdB/shVEGF感染的细胞中几乎检测不到IL-12分泌。在RdB/IL12的情况下，检测到IL-2，但是当引入RdB/IL12/shVEGF时，存在显著差异(图1D)。
为了检查IL-12、shVEGF或IL-12/shVEGF表达是否影响病毒复制和溶瘤能力，在具有不同组织学类型的小鼠细胞系(BNL、B16-F10、LLC和CMT-93)和人细胞系(U87MG)中，测量RdB/IL12、RdB/shVEGF和RdB/IL12/shVEGF诱导细胞病变效应的能力。与小鼠细胞相比，人U87MG细胞系对腺病毒感染具有更高敏感性，将人细胞系用于体外实验。用RdB(溶瘤腺病毒物种)、RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF感染细胞，然后用结晶紫染色以观察细胞裂解。如图1E中所示，RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF的细胞病变效应等于或高于RdB，并且IL-12和shVEGF的高表达不降低腺病毒的可复制性和溶瘤能力。
(2)在具有癌症的小鼠模型中的确认抗癌作用
当与RdB/IL-12或RdB/shVEGF的单次使用效果相比时，为了检测RdB/IL12/shVEGF的体内治疗效力，首先用RdB、RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF注射C57BL/6小鼠中的B16-F10黑素瘤。当肿瘤体积平均为80至100mm3时，开始病毒处理，并且每隔一天进行总共三次。处理含有3×109病毒颗粒(VP)的PBS溶液。PBS对照小鼠中的肿瘤迅速生长成巨大的肿瘤，直到最终处理后5天的平均肿瘤体积为3,000mm3或更大(图2A)。同时，RdB、RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF处理组肿瘤体积显著降低，平均肿瘤体积分别为1747.4±127.2mm3、207.7±35.2mm3、1381.2±194.7mm3或157.3±49.0mm3。与PBS对照相比，肿瘤生长抑制率为40％(RdB)、93％(RdB/IL12)、53％(RdB/shVEGF)和95％(RdB/IL12/shVEGF)。RdB/IL12和RdB/IL12/shVEGF处理组中8只小鼠中的5只显示完全缓解，而其他小鼠组(PBS、RdB和RdB/shVEGF)中没有小鼠显示完全缓解。然而，所有IL-12表达腺病毒(RdB/IL12和RdB/IL12/shVEGF)显示出相当大抗肿瘤效果，而在RdB/IL12和RdB/IL12/shVEGF处理的小鼠组之间的肿瘤抑制效果没有显著差异。因此，本发明人使用6×108VP以之前实验的1/5的剂量测量了RdB/IL12和RdB/IL12/shVEGF的抗肿瘤效果(图2B)。在第一次施用6×108VP后的第15天，在RdB/IL12处理组中，肿瘤已再生长至502.5±128.9mm3的体积，而在RdB/IL12/shVEGF处理组中，肿瘤生长仍然受到抑制，因此肿瘤体积为106.1±52.9mm3，表明与RdB/IL12组相比具有优良的肿瘤抑制效果(**，P<0.01)。另外，将6×108VP的RdB、RdB/IL12、RdB/IL12/shVEGF引入到C57BL/6小鼠的RENCA肾癌细胞中，并且检查其抗癌作用。如上所述，可以看出PBS对照小鼠在第7天或第8天由于肿瘤的快速生长而显示巨大肿瘤的生成，并且RdB/IL12/shVEGF相关小鼠组也显示出相当优异的肿瘤生长抑制效果(图2C)，当与RdB/IL12处理组相比，其具有显著的差异(**，P<0.01)。
这些结果推断，在B16-F10鼠黑素瘤或RENCA肾癌模型中，与RdB/IL12或RdB/shVEGF组相比，RdB/IL12/shVEGF具有优越的抗肿瘤活性。
(3)肿瘤组织中IL-12、VEGF和IFN-γ的提高的局部表达
为了测量RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF处理的小鼠中产生的IL-12和VEGF的水平，在最终病毒注射后7天收获肿瘤组织。如图3A所示，在PBS、RdB和RdB/shVEGF处理组的肿瘤中没有观察到IL-12的表达。然而，在RdB/IL12或RdB/IL12/shVEGF处理组的肿瘤中显示了高浓度的IL-12(分别为36.0±1.0pg/mL和43.0±6.0pg/mL；*,P<0.05)。此外，PBS，与PBS、RdB或RdB/IL12处理组相比(分别为823.2±26.2、796.3±6.7和320.6±8.0pg/mL；**，P<0.01)，RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF处理组中肿瘤表现出显著更低的VEGF水平(分别为242.5±22.5pg/mL和212.0±15.7pg/mL)(图3B)。这样的结果表明，与仅使用RdB/IL12或RdB/shVEGF组合物时相比，在使用混合组合物的处理中，IL-12表达进一步提高，并且VEGF表达进一步降低。
IL-12诱导的IFN-γ削减体内VEGF水平[24]。因此，测量了肿瘤组织中IFN-γ表达的水平。如图3C所示，RdB/IL12或RdB/IL12/shVEGF处理组显示出高IFN-γ水平，特别地，RdB/IL12/shVEGF共处理组表现出比仅施用RdB/IL12组显著更高的表达水平(21.0±3.0pg/mL:RdB/IL12,73.0±1.0pg/mL:RdB/IL12/shVEGF,**,P<0.01)，而在PBS、RdB和RdB/shVEGF处理组中没有检测到IFN-γ表达。也就是说，RdB/IL12/shVEGF处理组中的肿瘤显示出比其他组显著更高的IL-12和IFN-γ水平，以及更低的VEGF水平。
(4)提高的Th1/Th2细胞因子比率
据报道，在多种小鼠和人中显示出恶性肿瘤的生长中Th1向Th2细胞因子表达的转变，并且还报道了细胞因子水平与癌症治疗效力之间的相关性[25,26]。因此，本发明人研究了允许Th1细胞因子(例如IFN-γ)表达显著提高的RdB/IL12/shVEGF是否可以使脾细胞中的Th2免疫应答转变为Th1免疫应答。在最终病毒注射后7天收获小鼠的脾细胞，并在重组人IL-2的存在下，与经照射的B16-F10小鼠中的肿瘤细胞一起培养3天。之后，使用Th1/Th2/Th17细胞计数珠测定(CBA)试剂盒分析培养的上清液。从IFN-γ/IL-6比率计算Th1/Th2细胞因子比率。如图4A至4C所示，在PBS、RdB、RdB/IL12和RdB/shVEGF处理组中，B16-F10小鼠的RdB/IL12/shVEGF处理的脾细胞显示出最高的IFN-γ/IL-6比率(**,P<0.01)。未检测到IL-2、IL-4、IL-10和IL-17。这样的结果表明RdB/IL12/shVEGF抑制Th2细胞因子并增加Th1细胞因子，导致类型1模式的T细胞应答的偏差。
(5)肿瘤特异性免疫应答的发生
与表达IL-12和shVEGF之一的溶瘤腺病毒相比，RdB/IL12/shVEGF产生了有利于诱导肿瘤特异性免疫应答的肿瘤环境。因此，本发明人测量了表达IFN-γ(由活化的T细胞分泌的细胞因子)的免疫细胞的数量，并且进行体内实验以确定RdB/IL12/shVEGF是否提高抗肿瘤免疫应答。在最终病毒注射后7天获得小鼠脾细胞，并在重组人IL-2的存在下与经照射的B16-F10小鼠的肿瘤细胞一起培养24小时。之后，使用IFN-γELISPOT试剂盒在脾细胞中测量分泌IFN-γ的免疫细胞。如图5所示，RdB/IL12/shVEGF注射小鼠中IFN-γ分泌免疫细胞的频率显著高于RdB/IL12或RdB/shVEGF处理小鼠中的细胞。特别地，分离自RdB/IL12/shVEGF处理组的1×105个细胞的IFN-γ分泌免疫细胞的数目(27.3±1.1)比PBS、RdB、RdB/IL12-和RdB/IL12/shVEGF处理组中的那些高得多(0.3±0.5,1.6±0.5,9.0±2.0，和3.3±0.5,**,P<0.01)。这些结果表明，与RdB/IL12或RdB/shVEGF处理组相比，RdB/IL12/shVEGF处理组表现出更高的肿瘤特异性免疫应答。
(6)CD4+T细胞、CD8+T细胞和树突状细胞向RdB/IL12/shVEGF处理的肿瘤的浸润提高
为了检查RdB/IL12/shVEGF处理后显示的肿瘤组织的组织学特征，用苏木精和伊红(H&E)对肿瘤组织进行染色以用于分析。组织学分析显示与RdB/IL12和RdB/shVEGF处理组相比，施用RdB/IL12/shVEGF的小鼠的肿瘤组织中的肿瘤坏死增加。然而，RdB/IL12/shVEGF处理组中几乎所有的肿瘤细胞都死亡。使用CD4-、CD8-、CD11c和CD86-特异性抗体通过免疫组织化学分析来鉴定浸润到肿瘤组织中的免疫细胞。与RdB/IL12-或RdB/shVEGF处理组相比，在RdB/IL12/shVEGF处理组中，在中央和边界区的肿瘤中观察到高频率的CD4+T、CD8+T、CD86和CD11c(图6A、6B、6D和6E)。使用图像分析软件半定量测量提高的CD4+T和CD8+T表达(图6C)。
这些结果表明肿瘤组织中IL-12和shVEGF的共表达可诱导T细胞以及树突状细胞的强烈活化和募集。然而，IL-12和shVEGF单独表达不能有效地将T细胞和树突状细胞募集至肿瘤组织。结果，由于共表达IL-12和shVEGF的腺病毒的肿瘤内注射，肿瘤组织中显示最强的抗癌免疫应答。
(7)通过RdB/IL12/shVEGF处理预防肿瘤诱导的胸腺萎缩
通常在荷瘤小鼠中观察到胸腺萎缩，并且诱导针对肿瘤的宿主免疫的抑制[27,28]。此外，即使长期暴露于重组VEGF也会诱导体内胸腺萎缩[21]。结果是，预防胸腺萎缩对克服肿瘤诱导的免疫抑制很重要。因此，本发明人测量了腺病毒处理的小鼠的胸腺体积和重量的变化。如图7A所示，在RdB/IL12/shVEGF处理的小鼠中未观察到胸腺萎缩，而在PBS和RdB处理的小鼠中观察到胸腺萎缩，并且在最终病毒注射后第7天，荷瘤小鼠的胸腺重量显著降低。然而，在RdB/IL12-或RdB/shVEGF处理的小鼠组中，胸腺萎缩稍微缓解，其效果不明显。然而，RdB/IL12/shVEGF处理的小鼠组具有重得多的胸腺重量(图7B)，其与肿瘤体积成反比。这些结果表明胸腺萎缩是由肿瘤生长诱导的，并且可以通过在肿瘤中共表达IL-12和shVEGF来预防。
随后，为了检查溶瘤腺病毒处理的小鼠胸腺中的变化，对胸腺组织进行组织学和免疫组织化学染色。在胸腺组织中观察到正常形态，并且该结果表明，在最终注射RdB/IL12、RdB/shVEGF和RdB/IL12/shVEGF腺病毒后的第7天，小鼠的皮质和髓质区被清楚地分离(图7C)。然而，可以看到在最终注射PBS或RdB后第7天，小鼠胸腺结构被异常破坏。TUNEL分析结果显示，与经RdB/IL12、RdB/shVEGF或RdB/IL12/shVEGF处理的小鼠相比，在PBS或RdB处理的小鼠胸腺组织中观察到大量的细胞凋亡(图7D)。另外，证明RdB/IL12/shVEGF处理的小鼠在增殖细胞核抗原(PCNA)染色中显示为阳性，表明胸腺中胸腺细胞的活性增殖(图7E)。使用图像分析软件半定量地测量数据(**p<0.01)(图7F和7G)。这些结果表明RdB/IL12/shVEGF诱导胸腺中的细胞增殖并抑制细胞凋亡，从而防止荷瘤小鼠的胸腺萎缩。
(8)使用动物模型检查全身毒性
为了检查重组腺病毒(PBS、RdB、RdB/shVEGF、RdB/IL12或RdB/IL12/shVEGF)处理引起的全身毒性，特别是在重组腺病毒最终处理后7天，使用ELISA试剂盒定量小鼠血清中剩余的IL-12和IFN-γ的含量。结果，在RdB/shVEGF、RdB/IL12或RdB/IL12/shVEGF处理的小鼠以及PBS或RdB处理的小鼠的所有血清中，根本没有检测到IL-12和IFN-γ，表明根据本发明的重组腺病毒不会引起全身毒性。
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<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 648
<212> DNA
<213> 鼠IL-12 mRNA序列 - mIL-12 (p35)
<400> 1
atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60
ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg 120
ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc 180
actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc 240
tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc 300
acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt 360
ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt tccaggccat caacgcagca 420
cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat 480
gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga 540
gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc 600
cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct ccgcctga 648
<210> 2
<211> 1008
<212> DNA
<213> 鼠IL-12 mRNA序列 - mIL-12 (p40)
<400> 2
atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60
atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120
gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180
acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240
gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300
catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360
aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420
tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480
gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540
caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600
gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660
tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720
atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780
actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840
atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900
accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960
tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcctag 1008
<210> 3
<211> 441
<212> DNA
<213> 鼠VEGF mRNA序列
<400> 3
atgaactttc tgctctcttg ggtgcactgg accctggctt tactgctgta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccacgaca gaaggagagc agaagtccca tgaagtgatc 120
aagttcatgg atgtctacca gcgaagctac tgccgtccga ttgagaccct ggtggacatc 180
ttccaggagt accccgacga gatagagtac atcttcaagc cgtcctgtgt gccgctgatg 240
cgctgtgcag gctgctgtaa cgatgaagcc ctggagtgcg tgcccacgtc agagagcaac 300
atcaccatgc agatcatgcg gatcaaacct caccaaagcc agcacatagg agagatgagc 360
ttcctacagc acagcagatg tgaatgcaga ccaaagaaag acagaacaaa gccagaaaaa 420
tgtgacaagc caaggcggtg a 441
<210> 4
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shVEGF有义
<400> 4
gatcccggaa ggagagcaga agtcccatgt tcaagagaca tgggacttct gctctccttt 60
ttttttggaa a 71
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shVEGF反义
<400> 5
tttccaaaaa aaaaggagag cagaagtccc atgtctcttg aacatgggac ttctgctctc 60
cttccgggat c 71
<210> 6
<211> 640
<212> DNA
<213> 智人血管内皮生长因子(VEGF) mRNA
<400> 6
tcgggcctcc gaaaccatga actttctgct gtcttgggtg cattggagcc ttgccttgct 60
gctctacctc caccatgcca agtggtccca ggctgcaccc atggcagaag gaggggggca 120
gaatcatcac gaagtggtga agttcatgga tgtctatcag cgcagctact gccatccaat 180
cgagaccctg gtggacatct tccaggagta ccctgatgag atcgagtaca tcttcaagcc 240
atcctgtgtg cccctgatgc gatgcggggg ctgctgcaat gacgagggcc tggagtgtgt 300
gcccactgag gagtccaaca tcaccatgca gattatgcgg atcaaacctc accaaggcca 360
gcacatagga gagatgagct tcctacagca caacaaatgt gaatgcagac caaagaaaga 420
tagagcaaga caagaaaatc cctgtgggcc ttgctcagag cggagaaagc atttgtttgt 480
acaagatccg cagacgtgta aatgttcctg caaaaacaca gactcgcgtt gcaaggcgag 540
gcagcttgag ttaaacgaac gtacttgcag atgtgacaag ccgaggcggt gagccgggca 600
ggaggaagga gcctccctca gggtttcggg aaccagatct 640

Claims (13)

1.一种重组腺病毒，其包含：
(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQ ID NO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及
(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述IL-12基因和所述shVEGF基因分别插入在所述腺病毒的E1区和E3区。
3.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒具有E1A区，但不具有E1B区，其为缺失的。
4.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述IL-12基因包含IL-12A(p35)基因序列、内部核糖体进入位点(IRES)序列和IL-12B(p40)基因序列。
5.一种用于增强抗肿瘤免疫力的组合物，其包含：
(a)治疗有效量的重组腺病毒，所述重组腺病毒包含(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQID NO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及
(b)可药用载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述用于增强抗肿瘤免疫力的组合物是瘤内施用的。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物提高肿瘤中的Th1/Th2细胞因子比率。
8.一种抗癌组合物，其包含：
(a)治疗有效量的重组腺病毒，所述重组腺病毒包含(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQID NO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及
(b)可药用载体。
9.根据权利要求8所述的抗癌组合物，其中所述癌症为胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、头颈癌、皮肤癌、肾癌、多倍体癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌或输尿管癌。
10.一种用于预防或治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩的组合物，其包含：
(a)治疗有效量的重组腺病毒，所述重组腺病毒包含(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQID NO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及
(b)可药用载体。
11.一种用于增强抗肿瘤免疫力的方法，其包括：
向对象施用组合物，所述组合物包含：(a)治疗有效量的重组腺病毒，所述重组腺病毒包含(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQ ID NO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及(b)可药用载体。
12.一种用于治疗癌症的方法，其包括：
向对象施用组合物，所述组合物包含：(a)治疗有效量的重组腺病毒，所述重组腺病毒包含(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQ ID NO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及(b)可药用载体。
13.一种用于治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩的方法，其包括：
向对象施用组合物，所述组合物包含：(a)治疗有效量的重组腺病毒，所述重组腺病毒包含(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQ ID NO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及(b)可药用载体。
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