KR102046941B1 - ＩＬ­12 및 ｓｈＶＥＧＦ 동시발현 아데노바이러스를 포함하는 항종양 면역성 증진 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터루킨-12 및 shVEGF의 동시발현 종양살상 아데노바이러스 및 이를 포함하는 항종양 면역 증진용 조성물 및 항암효과 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 면역성 마우스 흑색종 또는 신장암 모델에서 VEGF 억제 및 IL-12의 발현이 동시에 나타나는 경우, 면역 기능이 회복되고 항암 효과가 증진됨을 확인하였다. 특히, 이러한 항암효과 증가가 항암 면역성의 증가, Th1 사이토카인의 증가 및 종양-유도 흉선 위축(thymic atrophy)의 예방과 연관이 있음을 밝힘으로써, 암 유전자 치료에 있어 IL-12 및 shVEGF 동시발현 유전자 전달체의 활용가능성을 최초로 규명하였다.

Description

ＩＬ­12 및 ｓｈＶＥＧＦ 동시발현 아데노바이러스를 포함하는 항종양 면역성 증진 조성물{Compositions for enhancing antitumor immunity comprising an oncolytic adenovirus co-expressing interleukin-12 and shVEGF}
본 발명은 IL-12 및 shVEGF 동시발현 아데노바이러스를 포함하는 항종양 면역성 증진 조성물에 관한 것이다.
암 환자의 면역기능저하는 잘 알려진 사실이며[1], 임상적으로도 종양이 항암 면역반응을 효과적으로 회피하는 것은 명백하다. 최근 항암 치료는 주로 외과적 수술, 화학요법 및 방사선 요법에 집중되어 있지만, 이들은 모두 부작용을 동반한다[2,3]. 이러한 장애를 극복하고 항암 치료의 효율성을 높이기 위해 면역치료 요법이 활발히 연구 중이다. 지난 수십 년 동안, 기초 면역학에서의 새로운 발견 및 종양 항원의 분자적 발견으로 인하여 암 예방 및 치료를 위한 면역 치료요법에 대한 연구가 활발히 이루어졌다[4]. 종양 세포는 그들 스스로 많은 비정상적인 항원을 발현시키는데, 이들 항원은 면역감시(immune surveillance)를 통하여 제거(eradication)반응을 일으킨다. 체내의 면역 시스템이 활발히 작용하더라도, 종양세포가 면역감시를 회피하도록 하는 것이다[5,6]. 이러한 현상은 종양 세포가 생산하는 다양한 인자(factors)에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다. 종양 조직은 혈관 내피 성장인자(VEGF), 종양증식인자(TGF)-β 및 인터루킨(IL)-10과 같은 면역억제 분자를 생산할 수 있다[7,8]. 또한, 면역 억제된 종양에서 조절 T 세포의 침투가 나타나는 것으로 보고되었다[9-11]. 종양조직에서 과발현되는 이러한 인자들은 종양 내의 면역억제 미세환경 및 면역관용(immune tolerance)을 유도한다. 결과적으로, 면역감시회피를 극복하는 것이 면역치료요법의 주요 전략이다.
인터루킨(IL)-12는 가장 효과적이고 유망한 항암 사이토카인 중의 하나이다. IL-12는 이황화결합으로 연결된 40 kDa 및 35 kDa 서브유닛을 포함하는 헤테로다이머(heterodimeric) 단백질이며, 활성화된 대식세포, 단핵구, 수지상세포 및 활성 B 림프구에 의해 생성된다. IL-12는 T-helper 1 세포 면역을 증진시킬 수 있고[12], 세포성 T-림프구의 세포독성을 증가시키며, 혈관신생을 억제시킬 수 있다. 일반적으로 IL-12는 T 세포 및 NK 세포의 IFN-γ 생산을 활성화시킨다[13]. IL-12의 국소적 발현은 종양세포가 T-세포 매개 세포독성에 민감하게 반응하도록 하며, 결과적으로 종양 성장 억제 및 체액성 면역(systemic immunity)의 구축을 가져온다. 그러나, IL-12의 임상 적용에 있어서의 단점은 투여 시 환자가 받아들일 수 있는 용량을 제한하는 사이토카인-연관 독성이 전신에 나타날 수 있다는 점이다[14-17]. 또한, 면역 효과의 전반적인 하향조절이 IL-12의 반복 투여를 가져올 수 있다. 환자의 혈청에서, IL-10 발현 증가 및 IFN-γ 및 TNF-β 발현감소에 의한 Th1에서 Th2 면역으로의 IL-12 분극화현상이 나타나며, 이 때문에 반복적으로 IL-12를 투여하게 된다[18,19]. 이러한 임상결과는 암의 치료를 위한 단일치료제로서의 IL-12의 한계를 보여준다.
VEGF는 혈관형성 및 혈관신생을 촉진시키는 세포에 의해 생산되는 신호단백질이다[20]. 특히, VEGF는 골수에서 T 세포 전구체에 영향을 주어 T 세포 및 수지상 세포의 증식 및 성숙을 억제한다[21]. 또한, VEGF는 혈관신생에서 중요한 기능을 하여 암전이라는 부작용을 나타낸다[22]. 따라서 VEGF는 종양 성장의 촉진 인자일 뿐만 아니라 항암면역에서의 억제인자로도 작용하며, VEGF shRNA에 의한 VEGF 하향조절로 인해 면역반응이 회복되고 항암 효과가 증가될 것으로 예상된다. 이러한 연구들은 VEGF shRNA에 의해 매개되는 치료 메커니즘이, IL-12와 유사하게, CTL 또는 수지상 세포활성세포-매개 면역 반응 증진과 연관 있는지 보여준다.
이에 본 발명자들은 상술한 면역 치료법들을 병용함으로써 보다 효과적으로 항종양 면역성을 증가시키는 방법을 제안한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 종양 조직에서 생산되는 면역 억제분자를 이용하여 종양의 면역감시(immune surveillance) 회피를 극복하기 위한 면역치료요법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인터루킨-12 및 shVEGF를 동시발현하는 아데노바이러스를 구축하고 이를 포함하는 면역증진조성물 및 항암효과 증진 조성물을 개발하였다. 또한, 암 유전자 치료에 이러한 IL-12 및 shVEGF 동시발현 아데노바이러스(RdB/IL12/shVEGF)를 활용하여 치료효과를 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 IL-12 및 shVEGF 동시발현 아데노바이러스 및 이를 포함하는 항종양 면역성 증진 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 IL-12 및 shVEGF 동시발현 아데노바이러스를 포함하는 항암 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 IL-12 및 shVEGF 동시발현 아데노바이러스를 포함하는 종양-유도성 흉선위축증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열, 또는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열을 포함하는 IL-12 (interleukin 12) 유전자, 및 (ⅱ) 서열목록 제3서열의 VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA에 상보적이며, VEGF 유전자의 발현을 억제하는 shRNA (small hairpin RNA) 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 또는 (a) 치료학적 유효량의 상기 재조합 아데노바이스; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 항종양 면역성(antitumor immunity) 증진 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 종양 조직에서 생산되는 면역 억제분자를 이용하여 종양의 면역감시(immune surveillance) 회피를 극복하기 위한 면역치료요법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인터루킨-12 및 shVEGF를 동시발현하는 아데노바이러스를 구축하고 이를 이용한 항종양 면역성 증진용 조성물 및 항암효과 증진용 조성물을 개발하였다. 본 발명자들은 암 유전자 치료에 이러한 IL-12 및 shVEGF 동시발현 아데노바이러스(RdB/IL12/shVEGF)를 활용하여 치료효과를 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
암의 면역유전자 치료법은 지난 수십 년 동안 보다 유망한 접근법으로서 발전해왔다. 그러나 종양 또한 면역 감시체계를 피하기 위하여 수많은 다른 전략을 만들어 왔다. 이러한 장애를 극복하고 항암면역의 효과를 증진시키기 위하여, 면역 억제를 회복하고 항암면역을 증가시키기 위한 적절한 치료 어쥬번드(adjuvant)로서 인터루킨(IL)-12 (RdB/IL12) 및 혈관내피성장인자(VEGF) shRNA (short hairpin RNA) 발현시스템 (RdB/shVEGF) 및 이의 동시발현 종양살상 아데노바이러스(RdB/IL12/shVEGF) 시스템을 구축하였다. IL-12는 T helper 1 세포의 분화를 유도하고 세포독성 T 림프구 및 자연살상 세포의 세포독성을 활성화시킴으로써 항암면역을 증가시킨다. shVEGF는 VEGF 발현을 억제시키는데 매우 효과적이며, 이로써 T 세포 및 수지상세포의 증식 및 성숙을 촉진한다. 이러한 효과는 IL-12 기능을 더욱 증폭시킨다. 그러나 종양 내 IL-2 및 shVEGF의 동시 발현에 의한 치료효과는 아직 연구된 바 없다. 따라서 본 발명자들은 최초로 종양 내에 IL-2 및 shVEGF 동시 발현 아데노바이러스(RdB/IL12/shVEGF)를 주입하는 면역 유전자 치료의 효과를 연구하였다. B16-F10 마우스 흑색종 모델에서, 종양 내 RdB/IL12/shVEGF 의 주입은 항암효과를 크게 향상시켰다. RdB/IL12/shVEGF-처치군에서 IL-12 및 IFN-γ의 발현 레벨이 현저히 증가하였으며, 반면 VEGF 발현 레벨은 감소하였다. 또한 지라세포(splenocyte) 및 B16-F10 공동배양한 상층액에서 T-helper 타입 1/2 사이토카인의 비율이 증가하였다. RdB/IL12/shVEGF를 주입한 마우스에서는 암-특이적 면역 세포의 세포독성이 증가하였다. 이러한 결과와 동일하게, RdB/IL12/shVEGF in situ delivery 실험에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포 및 CD86+ APCs 세포가 종양의 괴사성 부분 주위의 조직으로 대량 침윤되는 현상이 나타났다. 중요한 것은, IL-12 및 shVEGF 동시발현 아데노바이러스가 종양-유도성 흉선 위축증을 예방하고, 세포사멸 감소와 연관 있으며, 흉선에서 세포증식을 증가시킨다는 것이다. IL-12 및 shVEGF 동시발현 종양살상 아데노바이러스는 항암효과를 상승시키며 항종양 면역성 증진을 위한 어쥬번트로서 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 IL-12 (interleukin 12) 유전자 서열 및 shVEGF (vascular endothelial growth factor small hairpin RNA) 유전자 서열을 모두 포함하는 것을 특징으로 한다. IL-12 유전자 서열은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열, 또는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, shVEGF 서열은 서열목록 제3서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 보다 상세하게는 IL-12 유전자 서열은 IL-12A (p35) 유전자 서열, IL-12B (p40) 유전자 서열, 또는 IL-12A (p35) 유전자 서열 및 IL-12B (p40) 유전자 서열을 포함하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-12 유전자 서열은 IL-12A (p35) 유전자 서열, IRES (internal ribosome entry site) 서열 및 IL-12B (p40) 유전자 서열을 포함한다(도 1a, RdB/IL12 및 RdB/IL12/shVEGF 참조).
본 발명에서 사용하는 IL-12 유전자 서열은 상기 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 또는 서열목록 제 1 서열 및 서열목록 제 2 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity) 또는 실질적인 유사성(substantial similarity)을 나타내는 유전자 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 상기의 실질적인 유사성은, 하나 이상의 염기의 결손 또는 삽입과 같은 IL-12 유전자 서열의 변화가 재조합 아데노바이러스 벡터와의 상동성 재조합을 최소화하는 본 발명의 목적에 영향을 미치지 않는 변화를 총칭한다. 따라서, 본 발명의 IL-12 유전자 서열은 예시된 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열에 한정되지 않으며, 본 발명이 목적하는 최종 생성물의 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 한 본 발명의 권리범위에 포함된다고 해석된다.
본 발명에서 shRNA (small hairpin RNA or short hairpin RNA)는 헤어핀 구조를 가지는 인공 RNA 분자로서, RNA 간섭(RNA interference)을 통하여 타겟 유전자의 발현을 억제하는데 사용된다. shRNA는 주로 플라스미드, 박테리아 또는 바이러스 벡터를 통하여 세포 내로 운반된다. shRNA는 분해 및 전환(turnover) 비율이 비교적 낮다는 이점이 있다.
본 명세서에서 용어 “shRNA 분자”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용되는 shVEGF 분자는 VEGF mRNA에 상보적인 서열을 포함하는데, 용어 “상보적”은 100% 상보적인 경우뿐만 아니라, RNA 방해 (interference) 기전을 통해 VEGF 유전자의 발현을 억제할 수 있을 정도의 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성, 보다 바람직하게는 98%의 상보성, 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. 본 명세서에서 100% 상보성을 표현하는 경우에는 “완전 상보적 (completely complementary)"으로 특별하게 기재된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스에 포함되는 shRNA 서열은 서열목록 제3서열(GenBank accession number gi: 70608153) 또는 그의 일부에 상보적인 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열목록 제3서열의 VEGF-A mRNA 서열 중 92 번째 - 112 번째 뉴클레오타이드서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 shRNA 서열은 서열목록 제4서열 및 서열목록 제5서열이다. 한편, 상기 서열목록 제3서열은 서열목록 제6서열과 88% 상동성을 나타내며, 보다 상세하게는 서열목록 제6서열의 17번째 - 438번째 뉴클레오타이드 서열과 88% 상동성을 나타낸다.
한편, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자 및 비활성화된 E1B 19 유전자, E1B 55 유전자 또는 E1B 19/E1B 55 유전자를 갖는 포함한다. 본 명세서에서, 유전자와 관련하여 사용되는 용어 “비활성화”는 그 유전자의 전사 및/또는 해독이 정상적으로 이루어지지 아니하여, 그 유전자에 의해 코딩되는 정상적인 단백질의 기능이 나타나지 않는 것을 의미한다. 예컨대, 비활성화 E1B 19 유전자는 그 유전자에 변이 (치환, 부가, 부분적 결실 또는 전체적 결실)가 발생되어 활성의 E1B 19 kDa 단백질을 생성하지 못하는 유전자이다. E1B 19가 결실되는 경우에는 세포고사능을 증가시킬 수 있고, E1B 55 유전자가 결실된 경우에는 종양세포 특이성을 갖게 한다 (참조: 특허출원 제2002-23760호). 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 E1A 부위를 포함하고, E1B 부위, 즉 E1B 19 및 55 kDa (ΔE1B)이 결실되어 있으며, E3 부위(ΔE3)가 결실되어 있다. E1A 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 복제 가능한 특성을 갖게 된다. 상기 IL-12 유전자 및 shVEGF 는 각각 아데노바이러스의 결실된 E1 및 E3 부위에 삽입된다(도 1a 참조). 한편, 상기 E1A 부위는 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중에서 45번째 Glu 잔기가 Gly으로 치환된 변이 및 121-127번째 아미노산 서열이 전체적으로 Gly으로 치환된 변이를 갖는다.
본 발명에서 이용되는 재조합 아데노바이러스는 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 본 발명에 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, U6 프로모터 및 H1 프로모터, MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터 및 설바이빈 (Survivin) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, CMV 프로모터이다.
본 발명에서 이용되는 재조합 아데노바이러스에서 IL-12 유전자 서열 및 shVEGF 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 선택표지로서 항생제 내성 유전자 및 리포터 유전자(예컨대, GFP(green fluorescence protein), 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있고, 바람직하게는 네오마이신 내성 유전자이다. 상기의 선택표지는 별도의 프로모터 또는 IRES(internal ribosome entry site)에 의해 연결된 발현 시스템에 의해서도 발현될 수 있으며, 본 발명에서 이용될 수 있는 IRES는 몇 종의 바이러스 및 세포의 RNAs에서 발견되는 조절 서열이다(McBratney et. al. Current Opinion in Cell Biology 5:961(1993)).
하기의 실시예에 기재된 바와 같이, IL-12 및 VEGF 특이적 shRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 IL-12 발현을 증가시키고 VEGF의 발현을 저해하여 종양의 면역감시회피 기전을 방해한다. Th1에서 Th2 사이토카인으로의 발현이동은 다양한 마우스 및 인간의 악성 종양의 성장과정에서 나타나는 것으로 보고되었는데, 본 발명의 조성물은 이러한 Th2 면역 편향현상을 억제하여 Th1/Th2 사이토카인 비율을 증가시킨다(도 4a 내지 도 4c 참조).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (ⅰ) 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열, 또는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열을 포함하는 IL-12 (interleukin 12) 유전자, 및 (ⅱ) 서열목록 제3서열의 VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA에 상보적이며, VEGF 유전자의 발현을 억제하는 shRNA (small hairpin RNA) 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항암 조성물은 상술한 항종양 면역성 증진 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암(신경교종 등), 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암(흑색종 등), 신장암, 배수성암(polyploid carcinoma), 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (ⅰ) 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열, 또는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열을 포함하는 IL-12 (interleukin 12) 유전자, 및 (ⅱ) 서열목록 제3서열의 VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA에 상보적이며, VEGF 유전자의 발현을 억제하는 shRNA (small hairpin RNA) 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 종양-유도성 흉선위축증(tumor-induced thymic atrophy)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 종양-유도성 흉선위축증 예방 또는 치료용 조성물은 상술한 항종양 면역성 증진 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
흉선위축증(Thymic atrophy)은 종양이 있는 마우스에서 주로 관찰되었으며, 종양에 대한 숙주 면역성의 저하를 나타낸다. 본 발명의 조성물은 종양 내에서 IL-12 및 shVEGF를 동시발현시킴으로써 종양성장에 의한 흉선위축증을 예방 또는 억제할 수 있다(도 7a 내지 도 7g 참조).
상술한 본 발명의 모든 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명에 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항종양 면역성 증진 조성물은 바람직하게는 종양 내에(intratumorally) 직접적으로 투여된다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-1000 ㎎/㎏이다. 그러나, 유효 성분의 실제 투여량은 분화 및 증식하고자 하는 대상조직 세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있으며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 인터루킨-12 및 shVEGF의 동시발현 종양살상 아데노바이러스 및 이를 포함하는 항종양 면역 증진 조성물 및 항암효과 증진 조성물에 관한 것이다.
(b) 본 발명자들은 면역성 마우스 흑색종 모델에서 VEGF 억제 및 IL-12의 발현이 동시에 나타나는 경우 면역 기능이 회복되고 항암 효과가 증진됨을 확인하였다.
(c) 특히 이러한 항암효과 증가가 항암 면역성의 증가, Th1 사이토카인의 증가 및 종양-유도 흉선 위축(thymic atrophy)의 예방과 연관이 있음을 밝힘으로써, 암 유전자 치료에 있어 IL-12 및 shVEGF 동시발현 유전자 전달체의 활용가능성을 최초로 규명하였다.
도 1a 내지 도 1e는 IL-12 및 VEGF shRNA를 동시발현하는 종양살상 아데노바이러스의 특징을 나타낸다. (1a) 아데노바이러스 RdB 및 RdB/IL12/shVEGF의 유전적 구조 모식도를 나타낸다. RdB 는 변이된 E1A (open star - Rb 단백질 결합부위의 돌연변이)를 포함하고 있으며, E1B 19 및 55 kDa (ΔE1B), 및 E3 부위(ΔE3)가 결실되어 있고; 마우스 IL-12 및 마우스 shVEGF 는 아데노바이러스 지놈의 E1 및 E3 부위에 각각 삽입되었다. B16-F10 세포를 RdB, RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF 로 감염시킨 후, IL-12 (1b) 및 VEGF (1c) 발현 레벨을 확인하였다. 감염 48시간 후, 세포 배양 상층액을 수거하여 ELISA 키트를 이용하여 IL-12 및 VEGF 레벨을 정량하였다. (1d) 상기와 동일한 방법으로, MOIs (5, 10, 20, 50 MOI)에 따른 IL-12의 레벨을 정량화하였다. (1e) 마우스 암세포주(BNL, B16-F10, LLC, 및 CMT-93) 및 인간 암세포주(U87MG)에서 IL-12 및/또는 shVEGF 를 발현하는 종양살상 아데노바이러스의 세포병변효과를 나타낸다. 3회 실험 데이터는 평균±표준오차로 나타내었고, 적어도 3번의 별개 시험에서 유사한 결과를 얻었다. MOI, multiplicity of infection. 1. PBS 2. RdB 3. RdB/shVEGF 4. RdB/IL12 5. RdB/IL12/shVEGF.
도 2a 내지 도 2c는 암을 가진 마우스에서의 아데노바이러스의 항암효과를 나타낸다. 도 2a 내지 도 2b는 PBS (open diamonds), RdB (open circles), RdB/shVEGF (open triangles), RdB/IL12 (filled diamonds), 또는 RdB/IL12/shVEGF (filled circles)를 투여한 흑색종 마우스에서의 항암효과를 나타낸 것이며, 도 2는 PBS (open diamonds), RdB/IL12 (filled diamonds), 또는 RdB/IL12/shVEGF (filled circles)를 투여한 신장암 마우스에서의 항암효과를 나타낸 것이다. C57BL/6 마우스의 종양 내에 Ad 3 × 109 VP (도 2a; 초기 종양부피: 80-100 mm3) 또는 6 × 108 VP; RdB/IL12 및 RdB/IL12/shVEGF (도 2b; 초기 종양부피: 80-100 mm3, 도 2c; 초기 종양부피: 100 mm3) 아데노바이러스를 1일, 3일 및 5일 째에 투여하였다. 종양부피는 실험종료시까지 매일 모니터링하여 기록하였다. 화살표는 아데노바이러스 주입시기를 나타낸다. 평균 ± 표준오차 (그룹 당 8 마리). **, P<0.01.
도 3a 내지 도 3c는 인 비보에서 IL-12, VEGF, 및 IFN-γ의 종양조직내 발현량을 나타낸다. 최초 바이러스투여 7일 후, 종양 조직을 수거하여 ELISA로 IL-12 (3a), VEGF (3b), 및 IFN-γ (3c) 레벨을 측정하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 각 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다. *, P<0.05 또는 **, P<0.01; 1. PBS 2. RdB 3. RdB/shVEGF 4. RdB/IL12 5. RdB/IL12/shVEGF.
도 4a 내지 도 4c는 지라세포 및 B16-F10 세포 동시배양 상등액에서 Th1/Th2 사이토카인 비율이 증가되었음을 보여준다. 최종 바이러스 투여 후 7일째에 지라세포를 수거하여 방사능처리된 B16-F10 암세포와 함께 재조합 인간 IL-2의 존재 하에서 3일간 배양하였다. Th1/Th2/Th17 CBA 분석을 실시하여 상기 상등액의 Th1/Th2 사이토카인 비율을 측정하였다. (4a) IFN-γ value. (4b) IL-6 value. (4c) IFN-γ/IL-6 비율. 3번 반복수행 후 각 데이터를 평균±표준오차로 나타내었다. ** P<0.01; 1. PBS 2. RdB 3. RdB/shVEGF 4. RdB/IL12 5. RdB/IL12/shVEGF.
도 5는 종양특이적 면역성을 측정한 결과이다. 최종 바이러스 투여 후 7일 째에, PBS-, RdB-, 또는 사이토카인-발현 아데노바이러스를 투여한 마우스로부터 지라세포를 수거하여 방사선 처리된 B16-F10 세포와 함께 3일간 배양하였다. 이어, IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하였으며 스팟의 수는 1 × 105 IFN-γ ELISPOT의 농도에서 계수하였다. 3번 반복수행 후 각 측정값을 평균 스팟수 ± 표준오차로 나타내었다. **, P<0.01; 1. PBS 2. RdB 3. RdB/shVEGF 4. RdB/IL12 5. RdB/IL12/shVEGF.
도 6a 내지 6e는 아데노바이러스 투여한 마우스의 종양 단편의 조직학적 분석 및 면역조직화학 분석결과이다. 아데노바이러스를 1일, 3일 및 5일째에 투여하였으며, 12일 째에 종양을 수거하여 조직학적 분석을 실시하였다. (6a) 종양 조직의 냉동단편을 H&E 염색하였다. 배율: ×40 and ×400. (6b) 종양 조직의 냉동단편을 항-CD4, 항-CD8 단일클론항체로 염색하였다. 배율: ×400. (6c) CD4+ T, CD8+ T 발현증가는 MetaMorph®이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 반정량적으로 측정되었다 (**p<0.01). (6d) 종양 조직의 냉동단편을 항-CD11c, 항-CD86 단일클론항체 및 DAPI로 염색하였다. 배율: ×400. (6e) 항-NK1.1 단일클론항체 및 DAPI로 염색하였다. 배율: ×400. 1. PBS 2. RdB 3. RdB/shVEGF 4. RdB/IL12 5. RdB/IL12/shVEGF.
도 7a 내지 도 7g 는 RdB/IL12/shVEGF 아데노바이러스의 흉선위축증 예방효과를 보여준다. (7a) PBS-, RdB-, RdB/IL12-, RdB/shVEGF- 또는 RdB/IL12/shVEGF 투여 마우스의 전체 흉선 이미지를 나타낸다. (7b) 종양살상 아데노바이러스를 투여한 마우스의 흉선 무게를 나타낸다. 각 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었다(* P<0.05, ** P<0.01). (7c) 파라핀 블록의 단편을 H&E 염색하였다. (7d) TUNEL 분석을 통하여 흉선 조직의 세포사멸정도를 관찰하였다. (7e) 증식성 세포 핵 항원 염색을 통하여 흉선세포의 증식도를 평가하였다. (7f 및 7g) 도 7d 및 도 7e의 결과를 MetaMorph®이미지 분석 소프트웨어로 반정량적으로 측정하여 나타내었다 (**p<0.01). 1. PBS 2. RdB 3. RdB/shVEGF 4. RdB/IL12 5. RdB/IL12/shVEGF.
도 8a 및 도 8b는 마우스에 재조합 아데노바이러스를 마지막으로 투여한 후 7일째, 마우스내 잔존하는 IL-12 및 IFN-γ의 함량을 확인 하기 위하여, 마우스의 혈청을 분리하여 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다. (7a) PBS, RdB, RdB/shVEGF, RdB/IL12, 또는 RdB/IL12/shVEGF 투여 마우스의 혈청 내 IL-12의 함량을 나타낸다. (7b) PBS, RdB, RdB/shVEGF, RdB/IL12, 또는 RdB/IL12/shVEGF 투여 마우스의 혈청 내 IFN-γ의 함량을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실험재료 및 실험방법
(1) 세포주 및 세포배양
세포배양배지로서, 10% 소태아혈청 (FBS; Gibco BRL), L-글루타민 (2 mmol/L), 페니실린 (100 IU/mL), 및 스트렙토마이신 (50 mg/mL)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s 배지 (DMEM; Gibco BRL, Grand Island, NY) 또는 Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI; Gibco BRL)를 사용하였다. HEK293 (아데노바이러스 E1 부위를 발현, human embryonic kidney cell line), U87MG (human glioma cell line), BNL (murine liver cancer cell line), B16-F10 (murine melanoma cell line), LLC (murine lung cancer cell line), CMT-93 (murine polyploid carcinoma cell line), 및 Renca (murine renal adenocarcinoma cell line)는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA)에서 구입하였다. 모든 세포주는 37℃, 5% CO2 습윤환경 하에서 배양하였으며, Hoeschst 염료, 세포배양 및 PCR을 이용하여 마이코플라즈마 음성테스트를 하였다. 대장균(Escherichia coli)은 37℃, Luria Bertani 배지에서 배양하였다.
(2) 동물실험
Charles River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA)로부터 6주-8주령의 웅성 C57BL/6 마우스를 구입하여, 무균상태인 라미나 에어 플로우 캐비넷에서 사육하였다. 모든 동물실험은 AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 승인 하에 수행되었으며, 한양대학교 동물 관리 및 이용 위원회(University of Hanyang Institutional Animal Care and Use Committee)의 가이드 라인에 따라 이루어졌다.
(3) IL-12 및 shVEGF 동시발현 종양살상 아데노바이러스의 제작
E1 및 E3 부위에서 각각 IL-12 및 shVEGF를 발현하는 아데노바이러스(Ad)를 제작하기 위하여, 우선 shVEGF 발현 E3 셔틀벡터를 구축하였다. 골수-유래 활성 수지상세포로부터 얻은 전체 RNA를 이용하여, 전장(full-length) 마우스 shVEGF 상보적 DNA를 RT-PCR로 클로닝하였다.
shVEGF 상보적 DNA (53-982 nucleotides of National Center for Biotechnology Information L15435)는 다음의 프라이머 세트를 이용하여 제작하였다: sense (5’-gatcccggaaggagagcagaagtcccatgttcaagagacatgggacttctgctctcctt tttttttggaaa-3'), antisense (5'-tttccaaaaaaa aaggagagcagaagtcccatgtctcttgaacatgggacttctgctctccttccgggatc-3’) 상기 PCR 생성물을 BamHI/HindⅢ로 자른 후, BamHI/HindⅢ 처리한 pSP72 E3/CMV-polA Ad E3 셔틀 벡터 [29]에 클로닝하여, pSP72 E3/shVEGF E3 셔틀 벡터를 제작하였다. 상동재조합을 위하여 상기 pSP72 E3/shVEGF 와 아데노바이러스 전체 벡터인 pdE1를 대장균 BJ5183에 동시 형질전환시켜, pdE1/shVEGF Ad 플라스미드를 제작하였다. 재조합된 벡터의 구조는 제한효소처리 및 PCR 분석으로 확인하였다.
IL-12를 발현하는 Ad E1 셔틀벡터를 구축하기 위하여, pCA14/IL12 [30]로부터 마우스 IL-12 유전자를 잘라내어 pXC1RdB E1 셔틀벡터 [23]에 서브클로닝하여, pXC1RdB/IL12 E1 셔틀벡터를 제작하였다. 상동재조합을 위하여 상기 pXC1RdB/IL12 E1 셔틀벡터와 pdE1/shVEGF 를 대장균 BJ5183에 동시 형질전환시켰으며, 이로써 pRdB/IL12/shVEGF Ad 벡터를 제작하였다(도 1a). 모든 바이러스는 293 세포를 이용하여 제작하였으며, 아데노바이러스의 정제, 적정(titration) 및 품질분석은 선행기술에 따라 수행하였다[31, 32].
(4) IL-12 및 VEGF 발현의 효소면역측정
B16-F10 흑색종 세포를 6-웰 플레이트에 3 × 105 개 분주한 후, 50 MOI 의 RdB, RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF 아데노바이러스를 세포에 감염시켰다. 감염 48시간 후 상층액을 수거하여 ELISA 키트를 이용하여 IL-12 및 shVEGF 발현 레벨을 측정하였다(IL-12 ELISA 키트: Endogen, Woburn, MA; VEGF ELISA kit: R&D Systems, Minneapolis, MN).
(5) 세포병변 효과 (Cytopathic effect assay)
세포병변 효과값은 바이러스 복제정도와 관련있으며, IL-12 및 shVEGF 발현이 아데노바이러스의 복제능에 영향을 미치는지 여부를 측정하는데 사용할 수 있다. 세포를 24웰 플레이트에 약 30-80% 분주한 다음, 1-500 MOI의 RdB, RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF 아데노바이러스로 감염시켰다. 현미경을 이용하여 매일 바이러스의 세포 사멸효과를 육안으로 모니터링하였다. 낮은 MOI에서 바이러스 감염 세포가 완전히 용해되었을 때, 죽은 세포를 제거하고, 50% 메탄올 하 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하였다.
(6) 인 비보 항암효과
B16-F10 세포 (5 x 105) 또는 RENCA 세포를 6-7주령 웅성 C57BL/6 마우스의 오른쪽 복부 피하에 주입하였다. 종양 부피가 약 100 mm3으로 자랐을 때, 유사한 종양 크기를 가지는 그룹으로 분류하고, PBS로 희석시킨 전체 부피 50 μl의 아데노바이러스(RdB 또는 RdB/shVEGF 3 ×109 VP; RdB/IL-12 또는 RdB/IL-12/shVEGF 6 × 108 VP)를 서로 다른 용량으로, 2일에 한 번씩 총 3회 종양 내에 투여하였다. 칼리퍼를 이용하여 종양의 수직 직경을 측정함으로써 종양 성장을 매일 모니터링하였다. 종양 부피는 다음의 공식으로 계산하였다: volume = 0.523L(W)2, L은 길이(length) W는 폭(width)을 나타낸다.
(7) 사이토카인 정량 및 종양조직에서의 Th1/Th2/Th17 프로파일
최종 바이러스 투여 7일 후 아데노바이러스 투여 마우스군에서 종양 조직을 수집하였다. 단백질분해효소 억제제 칵테일(Sigma, St. Louis, MO)을 첨가한 RIPA 버퍼 (Elipis Biotech, Taejeon, South Korea)에서 종양조직을 분쇄하였다(homogenized). 분쇄물을 10분간 고속 원심분리한 후, BSA 단백질 분석 시약 키트(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 전체 단백질 양을 측정하였다. IL-12, VEGF, 및 IFN-γ 레벨은 ELISA 키트(IL-12 ELISA kit: Endogen; VEGF ELISA kit: R&D; IFN-γ ELISA kit: Endogen)로 측정하였다. 각 실험은 그룹별로 3회씩 수행하였다. 종양 조직의 Th1/Th2/Th17 타입 사이토카인 발현 프로파일은 Th1/Th2/Th17 CBA 키트 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)를 이용하여 측정하였다. ELISA 및 CBA 결과는 전체 단백질 농도에 대하여 정규화하였으며, 전체 단백질(mg) 당 값(pg)으로 계산하였다.
(8) 지라세포의 IFN-γ ELISPOT (enzyme-linked immune spot) 분석
최종 바이러스 투여 후 7일 째에 무균상태에서 마우스로부터 지라를 수거하여 단세포성 지라세포로 준비하였다[30]. 상기 지라세포를 방사선 조사된(irradiated) B16-F10 (5,000 rad) 종양세포와 함께 재조합 인간 IL-2 (100 Uml-1; R&D systems)존재 하에서 3일간 배양하였다. 이어 IFN-γELISPOT 분석을 실시하였다[30]. 스팟(spot)은 컴퓨터기반 이뮤노스팟 시스템으로 측정하였다(AID Elispot Reader System, version 3.4; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany).
(9) 조직학 및 면역조직화학적 분석
종양 조직 또는 흉선을 10% 중성 버퍼 포르말린에서 고정시키고 파라핀 블록을 제작한 후 4-mm 단편으로 잘랐다. 단편을 H&E 염색한 후, 광학현미경으로 관찰하였다. 림프구 및 수지상세포 관찰을 위해 종양조직을 OCT 화합물(Sakura Finetec, Torrance, CA)로 냉동시키고, 10 mm 단편으로 잘랐다. 상기 동결단편(cryosection)을 1차 항체인 래트 항마우스 CD4 단일클론 항체(BD Biosciences Pharmingen), 래트 항마우스 CD8 단일클론 항체 (BD Biosciences Pharmingen), 마우스 항마우스 NK-1.1 단일클론 항체 (Biolegend, San Diego, CA), 또는 래트 항마우스 CD86 단일클론 항체 (BD Biosciences Pharmingen)와 반응시킨 후, 2차 항체인 홀스래디쉬 페록시다아제-컨쥬게이트 고트 안티래트 IgG (BD Biosciences Pharmingen) 또는 홀스래디쉬 페록시다아제-컨쥬게이트 고트 안티마우스 IgG (Southern Biotech, Birmingham, AL)와 반응시켰다. 디아미노벤지딘/하이드로젠 페록시다아제 (DAKO, Copenhagen, Denmark)를 발색 기질로 사용하였다. 모든 슬라이드는 Meyer’s 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 증식 세포를 검출하기 위하여 자일렌으로 슬라이드의 파라핀을 제거하고, 알코올을 처리하여 탈수시켰다. 3% 과산화수소를 이용하여 내재성 페록시다아제 활성을 억제시켰다. 항증식성 세포 핵 항원 단일클론항체인 PC10 (DAKO)로써 2차 항체인 Real/Envision (DAKO)가 결합되도록 하였다. 마우스 혈청을 1차 항체 및 2차 항체의 복합체에 추가하여 조직 단편에서 나타나는 유리된 2차 항체 및 마우스 면역글로불린 간의 상호작용을 최소화하였다. 이어 상기 단편을 1차 항체 및 2차 항체의 복합체와 반응시킨 후, 스트렙타비딘-페록시다아제와 반응시켰다. 디아미노벤지딘/하이드로젠 페록시다아제를 발색 기질로 사용하였다. CD4, CD8, NK-1.1, CD86, 및 PCNA의 발현레벨은 MetaMorph®이미지 분석 소프트웨어 (Universal Image Corp., Buckinghamshire, UK)를 이용하여 반정량적으로(semi-quantitatively) 분석하였다. 결과는 5가지 다른 디지털 이미지의 평균 광학 밀도로 나타내었다.
(10) 흉선 추출
B16-F10 마우스 흑색종 세포를 100 ml Hank’s balanced salt 용액에 현탁시켜 6-8주령 웅성 C57BL/6 마우스의 복부에 주입하였다. 종양의 크기가 80100 mm3 부피로 자랐을 때(세포 이식 후 8-10일 후), 마우스에게 2일에 한 번씩 모두 3회 아데노바이러스(RdB 또는 RdB/shVEGF 1 × 1010 VP / 종양세포 현탁된 PBS 50 μl; RdB/IL-12 또는 RdB/IL-12/shVEGF 5 × 109 VP / 종양세포 현탁된 PBS 50 μl)를 투여하였다. 최종 바이러스 투여 후 7일째에, 모든 흉선 조직을 추출하여 즉시 RPMI 1640 배지에 넣은 후, 전자저울(Ohaus Corp., Florham Park, NJ)로 각 흉선의 무게를 측정하였다.
(11) TUNEL 분석( Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling assay)
TUNEL 분석법을 이용하여 사멸된 흉선세포 집단을 관찰하였다[33]. 무작위적으로 선택한 5개 부위에서 사멸된 세포를 관찰하였으며, ×100 및 ×400 배율에서 사진촬영하였다. 사멸된 흉성세포의 발현레벨은 MetaMorph®이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 반정량적으로(semi-quantitatively) 분석하였다. 결과는 5가지 다른 디지털 이미지의 평균 광학 밀도로 나타내었다.
(12) 통계분석
모든 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다. Stat View software (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) 및 the Mann-Whitney test (non-parametric rank sum test) 를 이용하여 통계비교하였다. 0.05 이하의 P value 는 통계적으로 유의성 있음을 나타낸다(*, P<0.05; **, P<0.01).
실험결과
(1) 종양살상 Ad-매개 IL-12 및 shVEGF 발현
장기간 VEGF 발현을 효율적으로 억제할 수 있는 종양살상 아데노바이러스를 만들기 위해, 아데노바이러스(RdB)의 E1 및 E3 부위에 각각 마우스 IL-12 (p35, IRES, 및 p40) 및 shVEGF 유전자를 삽입하여, IL-12 및 shVEGF를 동시에 발현하는 종양살상 아데노바이러스를 제작하였다[23] (도 1a). RdB/IL12/shVEGF에서, IL-12 발현 레벨을 측정하고, VEGF-특이적 shRNA가 VEGF 발현을 억제하는지 알아보기 위하여, B16-F10 흑색종(melanoma) 세포에 RdB, RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF를 이용하여 MOIs (multiplicity of infections) 50으로 감염시켰다. 감염 48 시간 이후, 세포 상층액에 있는 IL-12 또는 VEGF 레벨을 ELISA로 측정하였다. 도 1b 및 1c에 나타난 바와 같이, RdB/IL12/shVEGF 50 MOI로 감염된 세포에서 분비되는 IL-12 레벨은 181.4 ± 10.0 pg/mL 였으나, RdB, RdB/shVEGF로 감염된 세포에서는 거의 검출되지 않았고, RdB/IL12로 감염된 세포에서는 35.6 ± 4.0 pg/mL에 불과하였다. 또한, RdB/IL12/shVEGF 50 MOI로 감염된 세포의 VEGF 발현 레벨은 338.0 ± 6.1 pg/mL 였고, RdB, RdB/IL12, 및 RdB/shVEGF 감염 세포에서는 각각 552.1 ± 10.3 pg/mL, 431.1 ± 11.2 pg/mL, 및 384.6 ± 19.4 pg/mL로 나타났다. 이러한 결과들은 RdB/IL12 또는 RdB/shVEGF와 비교했을 때, RdB/IL12/shVEGF가 IL-12 분비를 5배 증가시키고 VEGF 분비를 1.2배 감소시켰음을 보여준다. 또한, MOIs (5, 10, 20, 50 MOI)에 따른 IL-12의 분비량 변화를 측정한 결과, 상기의 결과와 마찬가지로, RdB/IL12/shVEGF에서 IL-12의 분비는 바이러스 농도 의존적으로 현저하게 증가되었던 반면, RdB, RdB/shVEGF로 감염된 세포에서는 거의 검출되지 않았으며, RdB/IL12를 이용한 경우, IL-2가 검출되었으나, RdB/IL12/shVEGF을 도입한 경우와 큰 차이를 보였다 (도 1d).
IL-12, shVEGF, 또는 IL-12/shVEGF 발현이 바이러스 복제 및 종양살상능에 영향을 주는지 알아보기 위하여, 조직학적 유형이 다양한 마우스 세포주(BNL, B16-F10, LLC, 및 CMT-93) 및 인간 세포주(U87MG)에서 RdB/IL12, RdB/shVEGF, 및 RdB/IL12/shVEGF의 바이러스 세포병변효과(cytopathic effect) 유도 능력을 측정하였다. 인간 U87MG 세포주가 마우스 세포보다 아데노바이러스 감염에 대하여 높은 민감도(sensitivity)를 나타내어, 인간 세포주를 인 비트로 실험에 사용하였다. 세포를 RdB (종양살상 아데노바이러스종), RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF로 감염시킨 후, 세포 용해정도를 관찰하기 위해 크리스탈 바이올렛을 처리하였다. 도 1e에서와 같이, RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF의 세포병변효과는 RdB와 동등하거나 높았으며, IL-12 및 shVEGF의 고발현은 아데노바이러스의 복제능 및 종양살상능을 감소시키지 않았다.
(2) 암 유발 마우스 모델에서의 항암효과 확인
인 비보에서 RdB/IL-12 또는 RdB/shVEGF 의 단독효과와 비교했을 때, RdB/IL12/shVEGF의 치료효능을 알아보기 위하여, 우선, RdB, RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF 을 C57BL/6 마우스의 B16-F10 흑색종 내에 주입하였다. 종양 크기가 평균 80-100 mm3일 때, 바이러스 투여를 시작하였으며, 2일에 한 번씩 총 3회 바이러스를 투여하였다. 바이러스 입자(virus particle, VP) 3 × 109 개를 포함하는 PBS 용액을 투여하였다. PBS 대조군 마우스는 급격히 종양이 성장하여 거대 종양을 형성하였으며, 최종 투여 후 5일째까지의 평균 종양부피는 3,000 mm3 이상인 것으로 나타났다(도 2a). 한편, RdB-, RdB/IL12-, RdB/shVEGF-, 또는 RdB/IL12/shVEGF-처치군은 종양크기가 현저히 감소하였고, 종양의 평균부피는 각각 1747.4 ± 127.2 mm3, 207.7 ± 35.2 mm3, 1381.2 ± 194.7 mm3, 및 157.3 ± 49.0 mm3 였다. PBS 대조군과 비교한 종양성장 억제율은 각각 40% (RdB), 93% (RdB/IL12), 53% (RdB/shVEGF), 및 95% (RdB/IL12/shVEGF)로 나타났다. RdB/IL12- 및 RdB/IL12/shVEGF-처치군의 8마리 마우스 중 5마리는 완전 관해(complete remission)를 나타내었으나, 다른 마우스군(PBS, RdB, 및 RdB/shVEGF)에서는 완전 관해가 나타나지 않았다. 한편, 모든 IL-12 발현 아데노바이러스(RdB/IL12와 RdB/IL12/shVEGF)는 현저한 향종양 효과를 나타내었지만, RdB/IL12 또는 RdB/IL12/shVEGF 처치 마우스군 간의 종양 억제효과에 있어 현저한 차이를 나타내지 못하였다. 따라서, 본 발명자들은 6 × 108 VP를 이용한 이전실험보다 5배 더 낮은 용량에서의 RdB/IL12 및 RdB/IL12/shVEGF 의 항종양 효과를 측정하였다 (도 2b). 최초 6 × 108 VP 투여후 15일째에 RdB/IL12 처치군에서 종양이 다시 성장하여 502.5 ± 128.9 mm3로 나타났으나, RdB/IL12/shVEGF 처치군에서는 종양성장이 억제된 상태를 유지하여 106.1 ± 52.9 mm3로 나타났으며, 이는 RdB/IL12 군과 비교하였을 때 우수한 종양 억제효과가 있음을 보여준다(**, P<0.01). 또한, 6 × 108 VP의 RdB, RdB/IL12, RdB/IL12/shVEGF를 C57BL/6 마우스의 RENCA 신장암 세포에 도입하여 항암 효과를 확인한 결과, 상기와 마찬가지로, PBS 대조군 마우스는 약 7일-8일째, 종양이 급격하게 성장하여 거대 종양을 형성하였고, RdB/IL12/shVEGF 처치 마우스군의 종양성장 억제 효과가 현저하게 우수함을 확인할 수 있었으며 (도 2c), RdB/IL12 처치군과 유의적인 차이를 보였다 (**, P<0.01).
이러한 결과들은 B16-F10 마우스 흑색종 또는 RENCA 신장암 모델에서, RdB/IL12 또는 RdB/shVEGF 군과 비교했을 때 RdB/IL12/shVEGF가 우수한 항종양 활성이 있음을 의미한다.
(3) 종양 조직 내 IL-12, VEGF, 및 IFN-γ의 국소적 발현 증가
RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF 처치 마우스에서 IL-12 및 VEGF 생성량을 측정하기 위하여, 최종 바이러스 투여 7일 후 종양 조직을 수거하였다. 도 3a에서와 같이, PBS, RdB, 및 RdB/shVEGF 처치군의 종양에서 IL-12 발현이 관찰되지 않았다. 반면, RdB/IL12 또는 RdB/IL12/shVEGF 처치군의 종양에서는 높은 농도의 IL-12가 측정되었다(각각 36.0 ± 1.0 pg/mL 및 43.0 ± 6.0 pg/mL, *, P<0.05). 또한, PBS, RdB, 또는 RdB/IL12군과 비교하여(각각 823.2 ± 26.2, 796.3 ± 6.7, 및 320.6 ± 8.0 pg/mL, **, P<0.01), RdB/shVEGF- 또는 RdB/IL12/shVEGF 처치군의 종양은 VEGF 레벨이 현저히 감소되었다(각각 242.5 ± 22.5 pg/mL 및 212.0 ± 15.7 pg/mL)(도 3b). 이러한 결과는 RdB/IL12 또는 RdB/shVEGF 단독 조성물을 이용한 경우보다, 혼합 조성물을 이용한 치료시 IL-12의 발현이 더 증가하고 VEGF 발현은 더 감소됨을 보여준다.
인 비보에서 IL-12-유도성 IFN-γ는 VEGF 레벨 감소에 영향을 준다[24]. 이에 종양 조직에서 IFN-γ의 발현레벨을 측정하였다. 도 3c에서 볼 수 있듯이, RdB/IL12- 또는 RdB/IL12/shVEGF 투여군은 높은 IFN-γ 레벨을 나타내었고, 특히 RdB/IL12 단독 투여군과 비교하여 RdB/IL12/shVEGF 병용투여군에서 현저히 높은 발현레벨을 나타내었고(21.0 ± 3.0 pg/mL: RdB/IL12, 73.0 ± 1.0 pg/mL: RdB/IL12/shVEGF, **, P<0.01), 반면 PBS, RdB, and RdB/shVEGF 투여군에서는 IFN-γ 발현을 관찰할 수 없었다. 즉, 다른 군과 비교하여 RdB/IL12/shVEGF 처치군 종양에서 IL-12 및 IFN-γ가 현저히 높게 나타나고, VEGF가 더 낮게 나타났다.
(4) Th1/Th2 사이토카인 비율의 증가
Th1에서 Th2 사이토카인으로의 발현이동은 다양한 마우스 및 인간의 악성 종양의 성장과정에서 나타나는 것으로 보고되었으며, 이러한 사이토카인 레벨 및 암 치료 효율성간의 연관성 또한 보고되었다[25, 26]. 따라서, 본 발명자들은 Th1 사이토카인 (예컨대, IFN-γ) 발현을 현저히 증가시키는 RdB/IL12/shVEGF으로 인해, 지라(spleen)에서 Th2 면역이 Th1 면역으로 전환될 수 있는지 실험하였다. 최종 바이러스 투여 7일 후, 마우스의 지라세포를 수득하여 방사선 조사된(irradiated) B16-F10 마우스의 종양세포와 함께 재조합 인간 IL-2 존재 하에서 3일 동안 배양하였다. 이후 Th1/Th2/Th17 cytometric bead assay (CBA) 키트를 이용하여 배양 상층액을 분석하였다. Th1/Th2 사이토카인 비율은 IFN-γ/IL-6 비율로부터 계산하였다. 도 4a 내지 4c에서와 같이, B16-F10 마우스의 RdB/IL12/shVEGF 처치된 지라세포는 PBS-, RdB-, RdB/IL12- 또는 RdB/shVEGF 처치군과 비교하여 IFN-γ/IL-6 비율이 가장 높게 나타났다(**, P<0.01). IL-2, IL-4, IL-10, 및 IL-17는 검출되지 않았다. 이러한 결과들은 RdB/IL12/shVEGF 가 Th2 사이토카인을 억제하고 Th1 사이토카인을 증가킴으로써 타입 1 패턴의 편향된 T 세포 반응을 나타냄을 의미한다.
(5) 종양 특이적 면역반응의 발생
IL-12 또는 shVEGF를 단독으로 발현하는 종양살상 아데노바이러스와 비교했을 때, RdB/IL12/shVEGF는 종양 특이적 면역반응을 유도하는데 유리한 종양 환경을 형성한다. 이에 본 발명자들은 활성화된 T 세포에서 분비되는 사이토카인인 IFN-γ를 발현하는 면역세포수를 측정함으로써, RdB/IL12/shVEGF가 인 비보에서 항종양 면역반응을 증가시키는지 실험하였다. 최종 바이러스 투여 7일 후, 마우스의 지라세포를 수득하여 방사선 조사된(irradiated) B16-F10 마우스의 종양세포와 함께 재조합 인간 IL-2 존재 하에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 IFN-γ ELISPOT 키트를 이용하여 지라세포에서 IFN-γ-분비 면역세포를 측정하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, RdB/IL12/shVEGF 주입한 마우스에서의 IFN-γ 분비 면역세포의 빈도는 RdB/IL12 또는 RdB/shVEGF 투여 마우스의 세포보다 현저히 높게 나타났다. 특히, 1 × 105 개의 세포 중, RdB/IL12/shVEGF 처치군에서 분리된 IFN-γ 분비 면역세포의 수(27.3 ± 1.1)가 PBS-, RdB-, RdB/IL12-, 또는 RdB/IL12/shVEGF 처치군 보다 더 많았다(0.3 ± 0.5, 1.6 ± 0.5, 9.0 ± 2.0, 및 3.3 ± 0.5, **, P<0.01). 상기 결과로서, RdB/IL12/shVEGF 처치군은 RdB/IL12 또는 RdB/shVEGF 처치군 보다 더 높은 종양특이적 적응면역을 나타냄을 의미한다.
(6) RdB /IL12/ shVEGF 처치군 종양에서의 CD4 + T세포 , CD8 + T세포 및 수지상세포의 침윤증가
RdB/IL12/shVEGF 처리 후 나타나는 종양조직의 조직학적 특성을 알아보기 위하여, 종양 조직을 H&E (hematoxylin and eosin) 염색하여 분석하였다. 조직학적 분석결과, RdB/IL12 및 RdB/shVEGF 투여군 보다 RdB/IL12/shVEGF 투여 마우스의 종양 조직에서 종양괴사가 증가하였다. 한편, RdB/IL12/shVEGF 투여군에서는 거의 모든 종양 세포가 사멸하였다. CD4-, CD8-, CD11c, 및 CD86 특이적 항체를 이용한 면역조직화학 분석을 통하여, 종양조직에 침윤하는 면역세포를 동정하였다. RdB/IL12- 또는 RdB/shVEGF 투여군과 비교하였을 때 RdB/IL12/shVEGF 투여군에서 CD4+ T, CD8+ T, CD86, 및 CD11c가 종양의 중심부 및 경계부위에서 높은 빈도로 관찰되었다(도 6a, 6b, 6d, 6e). CD4+ T, CD8+ T의 발현증가는 MetaMorph®이미지 분석 소프트웨어로서 반정량적으로 측정하였다(도 6c).
상기 결과들은 종양조직에서 IL-12- 및 shVEGF를 동시발현시킬 경우, 수지상 세포 뿐만 아니라 T 세포의 활성화 및 동원(recruitment)을 강력하게 유도할 수 있음을 의미한다. 반면, IL-12- 및 shVEGF- 단독발현은 종양 조직에서 T 세포 및 수지상 세포의 동원하는데 비효율적이다. 결과적으로, IL-12 및 shVEGF 동시발현 아데노바이러스의 종양 내 주입에 의해 종양조직 내에서 강력한 항암 면역 반응이 나타난다.
(7) RdB/IL12/shVEGF 처리에 의한 종양-유도성 흉선위축증의 예방
흉선위축증(Thymic atrophy)은 종양이 있는 마우스에서 주로 관찰되며, 종양에 대한 숙주 면역성의 저하를 나타낸다[27, 28]. 또한 인 비보에서 재조합 VEGF에 장기간 노출된 경우에도 흉선위축증이 발생하였다[21]. 따라서, 흉선위축증의 예방은 종양-유도성 면역억제의 극복에 있어 중요하다. 이에 본 발명자들은 아데노바이러스 처치를 받은 마우스에서 흉선부피 및 무게의 변화를 측정하였다. 도 7a에서 볼 수 있듯이, RdB/IL12/shVEGF 투여된 마우스에서 흉선위축증이 관찰되지 않았으며, PBS 및 RdB 투여된 마우스에서는 흉선위축증이 관찰되어 바이러스 최종 투여 후 7일째 종양 마우스에서 흉선의 무게는 현저히 감소하였다. 하지만, RdB/IL12 또는 RdB/shVEGF 투여된 마우스군은 흉선위축증이 조금 회복되었으나, 효과는 미미하였다. 반면 RdB/IL12/shVEGF 투여된 마우스군은 흉선의 무게가 훨씬 무거웠으며(도 7b), 흉선의 무게는 종양 부피와 역비례관계를 나타내었다. 이러한 결과들은 종양성장에 의해 흉선위축증이 유도되며, 이는 종양 내에서 IL-12 및 shVEGF를 동시발현시킴으로써 예방할 수 있음을 나타낸다.
이어, 종양살상 아데노바이러스가 투여된 마우스에서 흉선의 변화를 관찰하기 위하여, 흉선 조직의 조직학적 및 면역조직학적 염색을 실시하였다. 흉선 조직에서 정상적인 형태(morphology)를 관찰하였으며, 이는 RdB/IL12-, RdB/shVEGF-, 및 RdB/IL12/shVEGF 아데노바이러스 최종 투여 7일 째에, 마우스의 피질(cortex) 및 수질(medulla) 부위가 명백히 분리되어 있음이 관찰되었다(도 7c). 그러나, PBS 또는 RdB 의 마지막 투여 후 7일 째의 마우스 흉선구조는 비정상적으로 붕괴되었음을 알수 있었다. TUNEL 분석결과, RdB/IL12, RdB/shVEGF, 또는 RdB/IL12/shVEGF 를 투여한 마우스보다 PBS 또는 RdB를 투여한 마우스의 흉선조직에서 보다 광범위한 세포사멸이 관찰되었다(도 7d). 또한, RdB/IL12/shVEGF 를 투여한 마우스에서는 PCNA (proliferating cell nuclear antigen) 염색시 양성으로 나타나 흉선에서 흉선 세포가 활발하게 증식함이 증명되었다(도 7e). 상기 데이터는 MetaMorph®이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 이러한 반정량적적으로 측정되었다(**p<0.01) (도 7f 및 7g). 이러한 결과들은 RdB/IL12/shVEGF가 흉선에서 세포증식을 유도하고 세포사멸을 억제함으로써 종양 마우스에서 흉선위축증을 예방할 수 있음을 나타낸다.
(8) 동물 모델을 이용한 전신 독성 확인
재조합 아데노바이러스 등 (PBS, RdB, RdB/shVEGF, RdB/IL12, 또는 RdB/IL12/shVEGF)의 투여에 의한 전신 독성 여부를 확인하고자 하였으며, 구체적으로, 상기 재조합 아데노바이러스 등의 마지막 투여로부터 7일 경과 후, 마우스 혈청 내 잔존하는 IL-12 및 IFN-γ의 함량을 ELISA 키트를 이용하여 정량화하였다. 그 결과, PBS 또는 RdB를 투여한 마우스뿐만 아니라, RdB/shVEGF, RdB/IL12, 또는 RdB/IL12/shVEGF를 투여한 마우스의 혈청 모두에서, IL-12 및 IFN-γ이 전혀 검출되지 않았는바, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 전신 독성을 야기하지 않음을 나타낸다.
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Claims (10)

  1. (a) (ⅰ) IL-12A (p35) 및 IL-12B (p40) 유전자 서열을 포함하는 IL-12 (interleukin 12) 유전자 및 (ⅱ) VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA에 상보적이며, VEGF 유전자의 발현을 억제하는 shRNA (small hairpin RNA) 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 (carrier)를 포함하는 항종양 면역성(antitumor immunity) 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항종양 면역성 증진 조성물은 종양 내 (intratumorally)에 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 종양 내 Th1/Th2 사이토카인 비율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. (a) (ⅰ) IL-12A (p35) 및 IL-12B (p40) 유전자 서열을 포함하는 IL-12 (interleukin 12) 유전자 및 (ⅱ) VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA에 상보적이며, VEGF 유전자의 발현을 억제하는 shRNA (small hairpin RNA) 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 (carrier)를 포함하는 항암용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 신장암, 배수성암(polyploid carcinoma), 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  6. (a) (ⅰ) IL-12A (p35) 및 IL-12B (p40) 유전자 서열을 포함하는 IL-12 (interleukin 12) 유전자 및 (ⅱ) VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA에 상보적이며, VEGF 유전자의 발현을 억제하는 shRNA (small hairpin RNA) 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 (carrier)를 포함하는, 종양-유도성 흉선위축증 (tumor-induced thymic atrophy)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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