KR101253276B1

KR101253276B1 - 복합 유전자 치료용 항종양 조성물

Info

Publication number: KR101253276B1
Application number: KR1020100072185A
Authority: KR
Inventors: 윤채옥; 김지성
Original assignee: 윤채옥
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2013-04-10
Also published as: KR20120010697A

Abstract

본 발명은 IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK 공동발현용 유전자 전달체(gene delivery system) 또는 여기에 GCV(ganciclovir)를 추가적으로 포함하는 항종양 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 종양 특이적 면역활성과 종양의 면역원성을 증가시킴으로써 항종양 활성이 극대화된 유전자 항암 치료 조성물로써 유용하게 이용될 수 있으며, 나아가 HSV-TK 유전자가 이입되지 않은 암세포에서도 인산화된 GCV가 세포 사이의 간극 결합(gap junction)을 통해 들어가 세포사를 일으키는 bystander effect를 통하여, 현재 암의 유전자 치료요법의 가장 큰 제한인 모든 암세포에 치료유전자를 이입할 수 없다는 결점을 크게 개선한다.

Description

복합 유전자 치료용 항종양 조성물{Anti-tumor Compositions for Combined Gene Therapy}

본 발명은 복합 유전자 치료용 항종양 조성물에 관한 것이다.

암 치료제의 급속한 발전에도 불구하고, 암은 여전히 전 세계적으로 사망률이 높은 질환 중의 하나이다. 기존의 임상적으로 사용되고 있는 주요 암 치료 방법은 외과적 수술, 방사선 치료, 항암제 치료 방법으로 또는 이를 병행하는 치료로서 최대한 암세포를 환자에게서 제거해 내는 방법들이다. 하지만, 이러한 치료는 비교적 초기 암으로 전이가 되지 않은 상황에서 암세포를 완전히 제거했을 때 치료효과를 보이며, 빠르게 분열하는 다른 정상적인 세포들도 죽여 여러 부작용을 일으킬 수 있다는 단점이 있다. 따라서 최근에는 면역치료 방법으로 우리 몸의 종양 특이적 면역활성을 유도하여 암을 치료하고자 많은 연구가 이루어지고 있다.^1-4

그러나, 암은 종양 내 면역억제 환경(immunosuppressive tumor microenvironment)을 유도함으로써 다양한 숙주 면역반응을 교묘히 회피하고 파괴하여, 결과적으로 종양의 생존을 지속적으로 촉진할 뿐만 아니라, 면역 체계가 활성화되었더라도 활성화된 항종양 면역 반응으로부터 도피할 수 있는 능력을 가진다는 점에서 면역치료 역시 그 한계가 제기되고 있는 실정이다.^5-6 따라서 종양 내 면역 억제환경을 개선하여 암세포에 대한 면역반응을 증진 시키고자 인터루킨 IL-12, IL-18, IL-23, IFN-γ(interferon-gamma), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), TNF(tumor necrosis factor)와 같은 사이토카인 유전자, B7분자와 같은 동 자극 유발 인자, 직접적으로 APC(antigen presenting cell)의 역할을 하는 수지상세포(DC), 종양항원으로 활성화시킨 T 세포, NK(Natural killer) 세포등을 이용하여 증진된 항암 면역치료 효과를 얻고자 하는 다양한 연구가 진행되고 있다.^7-9 특히, IL-12는 주로 단핵세포(monocytes), 대식세포(macrophages), 그리고 DC 등과 같은 APC로부터 분비되며 암세포를 효과적으로 제거할 수 있는 CTL(cytotoxic T lymphocyte)과 NK 세포에 직접 작용하여 이들을 활성화 시키고 IFN-γ의 분비를 유도할 뿐만 아니라 암 세포에 대한 살상 능력 또한 증강시키는 것으로 알려져 있으며¹⁰, 또한 나이브(naive) CD4⁺ 림프구에 작용하여 Th1(T helper 1) 세포로의 분화를 촉진시켜 결국 항암 면역 반응에 중추적인 역할을 하는 세포 매개 면역 반응(cell-mediated immune response)을 유도하고 증강시킴으로써 항암 면역 반응을 활성화시키는데 중요한 역할을 한다.^11-14 한편, GM-CSF는 DC을 자극하여 APC로의 분화를 촉진시켜 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포들의 면역반응을 강화시켜 주는 역할을 하며, 또한 1차 단핵세포(primary monocyte)에서 MHC class Ⅱ를 구성하는 분자들의 발현 조절에도 관여한다.¹⁵ 더불어, 종양 내에 GM-CSF의 발현을 통한 효과로 종양 주변으로 많은 APC들이 모이게 유도함으로써, 종양 항원을 효과적으로 프로세싱하여 강한 항암 면역반응을 유도함이 보고되었다¹⁶ ^-17. 이를 바탕으로, 본 연구실에서도 E1B 55kDa 유전자가 소실된 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 YKL-1(Ad-ΔE1B55)를 이용하여 IL-12의 항종양 효과를 보고한 바 있으며¹⁸, E1B 유전자의 소실과 E1A의 Rb 결합부위가 변이되어 이보다 종양 선택적 살상능이 증진된 RdB 아데노 바이러스를 이용하여 GM-CSF의 항종양 효과 또한 보고한바 있다¹⁹. 하지만, 종양 내 면역 억제 환경이 개선될지라도, 종양의 낮은 면역원성으로 인하여 여전히 면역 치료법으로 암을 완전히 치료하기에는 많은 한계점들을 드러내고 있다.

HSV-TK는 DNA 합성시 회수 경로(salvage pathway)에 이용되는 효소로 독성이 없는 전약제인 갠싸이클로비어(ganciclovir, GCV)를 인산화시켜 활성화된 갠싸이클로비어 트리포스페이트 형태로 전환된다. 이렇게 인산화된 GCV는 뉴클레오타이드 유사체로서 작용하여 DNA 합성시 DNA 사슬에 삽입된 뒤 DNA사슬의 형성을 중단시켜고, 결과적으로 DNA합성을 억제하게 된다. 즉, 정상세포에는 독성을 일으키지 않는 전약제인 GCV를 전신적으로 투여하였을 때, HSV-TK를 발현하는 종양 특이적 바이러스에 감염된 암세포에서만 GCV의 인산화가 유도되어 암세포를 사멸시킬 수 있게 된다(Oliver Wildner, et al., Cancer Res. 59(20):5233-8(1999); Jennifer S. Cannon, et al., J Virol. 73(6):4786-93(1999); Haberkorn U, et al., Nucl Med Biol 25(4):367-73(1998)). 또한 HSV-TK가 이입되지 않은 암세포에서도 인산화된 GCV가 세포 사이의 간극 결합(gap junction)을 통해 들어가 세포사를 일으키는 bystander effect를 통하여, 극대화된 세포살상을 유도할 수 있으며²⁴, 이것은 현재 암 치료를 위한 유전자 요법의 가장 큰 제한인 모든 암세포에 치료유전자를 이입할 수 없다는 결점을 부분적으로 보안 할 수 있다는 점에서 중요한 의미를 갖는다.

이러한 연구들을 바탕으로, 본 발명에서는 종양 특이성과 살상능이 보다 개선된 RdB 아데노바이러스 E1부위에 IL-12, E3부위에 GM-CSF를 각각 도입하여, 바이러스의 증식에 따른 종양 특이적 세포 살상과 종양 내 사이토카인의 지속적 발현을 통한 면역억제를 개선시켜, 종양 특이적 면역 체계의 활성화와 항종양 효과 증대를 유도하고자 한다. 더불어 약제 감수성 유전자인 HSV-TK 유전자를 아데노바이러스 E3부위에 동시에 도입함으로써, GCV의 병용 투여를 통한 “bystander effect”로 극대화된 세포 살상을 유도하여 암세포에 면역원성을 부여하고, APC의 항원제시 능력을 강화시킴으로써, 결과적으로 증대된 항종양 효과를 가지는 항암조성물을 개발하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 종양 특이적 면역활성과 종양의 면역원성을 증가시킴으로써 항종양 활성이 극대화된 유전자 항암 치료 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK를 공동 발현하는 유전자 전달체를 이용하여 대상세포에 형질도입시킬 경우, IL-12 또는 IL-12 및 GM-CSF을 발현하는 유전자 전달체에 비하여 IL-12의 발현량이 크게 증가하고, 숙주의 면역체계 활성을 비약적으로 향상시키며 종양의 면역원성을 증가시킨다는 사실을 발견함으써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 IL(interlukin)-12, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 및 HSV-TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 공동발현용 유전자 전달체(gene delivery system)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 본 발명의 유전자 전달체의 치료학적 유효량; (b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 여기에 GCV(ganciclovir)를 추가적으로 포함하는 항종양 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 IL(interlukin)-12-인코딩 뉴클레오타이드 서열, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 HSV-TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK 공동발현용 유전자 전달체(gene delivery system)로서, 상기 유전자 전달체는 IL-12-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 GM-CSF-인코딩 뉴클레오타이드 서열만 있는 유전자 전달체와 비교하여 IL-12를 고발현하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체를 제공한다.

본 발명자들은 종양 특이적 면역활성과 종양의 면역원성을 증가시킴으로써 항종양 활성이 극대화된 유전자 항암 치료 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK를 공동발현하는 유전자 전달체를 이용하여 대상세포에 형질도입시킬 경우, IL-12 또는 IL-12 및 GM-CSF을 발현하는 유전자 전달체에 비하여 IL-12의 발현량이 크게 증가함으로써 숙주의 면역체계 활성을 비약적으로 향상시킨다는 사실을 발견하였다.

IL-12는 주로 활성화된 단핵구세포(monocytes), 대식세포(macrophages), 그리고 수지상 세포(dendritic cell)등과 같은 항원제시세포(APC)로부터 분비되며 암 세포를 효과적으로 제거할 수 있는 세포독성 T 림프구(CTL)와 NK(natural killer) 세포에 직접 작용하여 이들을 활성화 시키고 IFN-γ의 분비를 유도할 뿐만 아니라 암 세포에 대한 살상 능력 또한 증강시키는 것으로 알려져 있다. 한편, GM-CSF는 수지상세포를 자극하여 APC로의 분화를 촉진시키며, 1차 단핵세포(primary monocyte)에서 MHC class Ⅱ를 구성하는 분자들의 발현 조절에도 관여하고, 종양 주변으로 많은 APC들이 모이게 함으로써 강한 항암 면역반응을 유도한다. 또한 놀랍게도, 본 발명자들은 약제 감수성 유전자인 HSV-TK를 함께 발현시킴으로서 IL-12의 발현을 6배 이상 증가시킬 수 있다는 사실을 확인하였다(도 2a). 이러한 IL-12의 극적인 발현량 증가는 종래에는 전혀 예측할 수 없었던 것으로, 본 발명의 유전자 조합을 통해 항암 면역반응을 크게 향상시킴으로써 국소적인 암의 치료는 물론 암의 전이 및 재발 억제에도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 보인다.

본 발명의 IL(interlukin)-12-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열(p 35 서브유닛) 및 제 2 서열(p 40 서브유닛)에 기재되어 있으며, GM-CSF-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열목록 제 4 서열 및 제 5 서열에 기재되어 있다.

본 명세서에서 용어“고발현”은 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 단백질의 발현량이 대조군 세포에 비하여 유의하게 높은 경우를 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 단백질의 발현량이 대조군 세포의 200% 이상인 경우를 의미한다.

본 발명의 유전자 전달 시스템을 제조하기 위해, IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 상기 유전자들은 프로모터에 작동적으로 결합되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 상기 목적 유전자들에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 데코린 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다 (예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).

본 발명의 유전자 전달 시스템은 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.

IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin . Cancer Res . 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 아데노바이러스에 적용하여 제조된다.

ⅰ. 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.

현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어,“결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.

ⅱ. 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors : A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt(eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(MMLV)의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

ⅲ. AAV 벡터

아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp . Hematol . (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin . Invest ., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al., J. Virol ., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol ., 65:2936-2945( 1991))를 동시 형질전환시켜 제조된다.

ⅳ. 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 백시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors : A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, 데코린 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

ⅴ. 리포좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim . Biophys . Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol ., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 리포펙타민(Lipofectamine, Gibco BRL)이 있다. 데코린 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 데코린 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스 벡터이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 E1B 및 E3 영역이 결실된 것이고, 상기 IL-12-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 E1B 영역에 삽입되며, 상기 GM-CSF-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 E3 영역에 삽입된다.

활성의 E1A 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 복제 가능한 특성을 갖게 되고, E1B 영역이 결실되는 경우에는 세포 고사능을 증대시킬 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어“결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 변이되지 않은 E1A 유전자를 포함하거나 또는 변이된 활성의 E1A 유전자를 포함할 수 있다. 여기서 변이된 활성의 E1A 유전자는 Rb(retinoblastoma 단백질) 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중에서 45번째 Glu 잔기가 Gly으로 치환된 변이 및 121-127번째 아미노산 서열이 전체적으로 Gly으로 치환된 변이를 갖는다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 결실된 E3 영역에 5’에서 3’방향으로 GM-CSF-인코딩 뉴클레오타이드 서열, IRES(internal ribosome entry site) 서열 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다(도 1).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 유전자 전달체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 유전자 전달체는 상술한 본 발명의 유전자 전달체와 동일한 것이므로, 유전자 전달체에 대한 상세한 설명은 본 발명의 약제학적 조성물에도 그대로 적용된다. 따라서, 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어“치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 10⁵- 1 × 10¹⁵ pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 × 10¹⁰ pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 GCV(ganciclovir)를 추가적으로 포함한다.

GCV는 CMV(cytomegalovirus) 감염의 예방 및 치료를 위한 항바이러스제로 사용되는 퓨린계 화합물로서, HSV-TK에 의하여 인산화됨으로써 활성화된 갠싸이클로비어 트리포스페이트 형태로 전환된다. 이러한 인산화된 GCV는 뉴클레오타이드 유사체로서 작용하여 DNA 합성시 DNA 사슬에 삽입됨으로써 DNA합성을 억제하게 된다. 따라서, 본 발명의 조성물을 GCV와 함께 병용투여할 경우, HSV-TK를 발현하는 종양 특이적 바이러스에 감염된 암세포에서만 GCV의 인산화가 유도되어 암세포를 사멸시킬 수 있게 된다. 또한 HSV-TK가 이입되지 않은 암세포에서도 인산화된 GCV가 세포 사이의 간극 결합(gap junction)을 통해 들어가 세포사를 일으키는 bystander effect를 통해 극대화된 세포살상을 유도할 수 있으므로 매우 극대화된 항종양 활성을 가지는 항암 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 유전자 전달체와 GCV를 동시에 포함함으로서 하나의 제제로 구성될 수도 있으며, 또한 유전자 전달체 조성물과 GCV가 각각 별도의 제제로써 병용투여될 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 종양의 면역활성 및 면역원성을 증대시킨다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK 공동발현용 유전자 전달체(gene delivery system) 또는 여기에 GCV(ganciclovir)를 추가적으로 포함하는 항종양 조성물을 제공하는데 있다.

(b) 본 발명은 종양 특이적 면역활성과 종양의 면역원성을 증가시킴으로써 항종양 활성이 극대화된 유전자 항암 치료 조성물로써 유용하게 이용될 수 있다.

(c) 본 발명은 또한 HSV-TK 유전자가 이입되지 않은 암세포에서도 인산화된 GCV가 세포 사이의 간극 결합(gap junction)을 통해 들어가 세포사를 일으키는 bystander effect를 통하여, 현재 암의 유전자 치료요법의 가장 큰 제한인 모든 암세포에 치료유전자를 이입할 수 없다는 결점을 크게 개선한다.

도 1은 IL-12, GM-CSF 또는 plus HSV-TK를 발현하는 종양 선택적 아데노바이러스의 모식도를 나타낸 그림이다. RdB는 변이 E1A 또는 야생형 E1A를 가지며, E1B가 삭제되었다. RdB/IL12/GMCSF 또는 RdB/IL12/GMCSF-TK는 RdB의 E1 및 E3 부위에 존재하는 IL-12 및 GMCSF 또는 IL-12 및 GMCSF-IRES-TK 유전자로 각각 이루어져있다(★: 변이).
도 2는 아데노바이러스에 감염된 A549 세포에 의해 분비되는 IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. A549 세포를 1, 5 MOIs 범위의 RdB/IL12/GMCSF 및 RdB/IL12/GMCSF-TK 아데노바이러스로 감염시켰다(도 2a). 배양 상등액에서 IL-12 및 GM-CSF의 농도를 감염 48시간 후에 ELISA 분석으로 측정하였다. IL12 및 GMCSF 수준이 용량 의존적으로 선형으로 증가하였다. A549 세포를 RdB/IL12/GMCSF 및 RdB/IL12/GMCSF-TK 아데노바이러스를 5, 10 및 50MOIs 범위로 감염시켰다. 세포 파쇄물에서 HSV-TK 농도를 감염 48시간 뒤에 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다. HSV-TK 농도는 용량 의존적으로 증가하였다.
도 3은 IL-12, GMCSF 또는 plus HSV-TK을 발현하는 아데노바이러스에 대한 CPE 분석결과를 나타낸 그림이다. 24-웰 플레이트의 세포 단일층을 0.1-100 MOIs 범위의 dE1, RdB, RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 및 Ad-WT로 감염시켰다. p.i 4-10일 후에, 감염된 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
도 4는 HSV-TK를 발현하는 재조합 아데노바이러스와 GCV를 병행처리할 경우의 인 비트로 세포독성 측정결과를 나타낸 그림이다. 암세포 단일층을 다양한 범위의 RdB, RdB/IL12/GMCSF 및 RdB/IL12/GMCSF-TK로 감염시켰다. 감염 다음날, 암세포를 다양한 농도의 GCV로 처리하고 4-7일 간 배양하였다. 세포의 생존성은 MTT 분석을 통해 측정하였다. 각각 두 번씩 반복한 둘 이상의 실험들의 평균값 및 표준오차를 나타냈다.
도 5는 RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 또는 RdB/IL12/GMCSF-TK+GCV의 항종양 효과(도 5a) 및 생존률(도 5b)을 나타낸 그림이다. LLC 세포를 피하 주입하여 종양이 생긴 C57BL/6 마우스에 1 x 10⁸ PFU/30 ㎕ 의 RdB/IL12/GMCSF 또는 RdB/IL12/GMCSF-TK 아데노바이러스를 1, 3 및 5일째 종양내 3번 주입하고 GCV를 7번 복강주사 하였다. 이후 실험 종료시까지 이틀 간격으로 종양의 성장을 모니터링 하였다.
도 6은 RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 또는 여기에 GCV를 병용투여한 경우의 국소적인 IL-12, GM-CSF 또는 IFN-γ의 발현증가를 나타낸 그림이다. PBS, RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 또는 여기에 병행하여 GCV를 C57BL/6 마우스의 LLC 종양에 주입한 후에, 종양 균질물에서의 GM-CSF, IL-12, IFN-γ 또는 TGF-b의 발현량을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. RdB/IL12/GMCSF-TK 또는 여기에 GCV를 병용처리한 종양에서 IL-12, GM-CSF 또는 IFN-γ의 분비가 증가하였다.
도 7은 아데노바이러스에 감염된 마우스의 종양 절개면에 대한 조직학적 분석을 나타낸 그림이다. 아데노바이러스를 1, 3 및 5일째에 주입하고 GCV를 2, 4 및 6일째에 처리하였다. 8일째에 조직학적 분석을 위하여 종양을 채집하였다. 종양의 파라핀 절개면을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 배율은 x 40 및 x 400이다. PBS, RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 및 RdB/IL12/GMCSF-TK+GCV로 처리한 마우스의 종양 내에서의 CD4⁺및 CD8⁺ T 세포의 침윤을 나타내었다. 종양 조직의 냉각된 절단면을 항-CD4 또는 항-CD8 단클론 항체로 염색하였다. 종양의 파라핀 절단면을 TUNEL 분석을 통해 염색함으로써 종양조직에서 아폽토시스를 일으킨 세포를 검출하였다(메틸 그린 카운터 염색). RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 및 RdB/IL12/GMCSF-TK+GCV를 처리한 종양에서 핵이 응축된 아폽토시스를 일으킨 많은 수의 세포들이 관찰되었다. H & E 염색을 통해 네크로시스를 일으킨 것으로 확인된 부위와 아폽토시스를 일으킨 부위간 유사성이 있었다. 배율: x40 및 x400

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

대상 세포주 및 세포 배양

실험에 사용된 세포주들은 인간 뇌암 세포주(U343), 인간 간암 세포주(Huh7), 마우스 간암 세포주(BNL), 인간 폐암 세포주(A549, H358, H460) 마우스 폐암 세포주(LLC, CMT64) 및 아데노바이러스 초기 발현 유전자인 E1 부위가 숙주유전체내에 내재되어 있는 293 세포주이며, 이들 세포주들은 모두 ATCC(America Type Culture Collection. Manassas, UA, USA)에서 구입하였고, H460(10% 우태아 혈청이 함유된 RPMI 1640 배지)를 제외한 모든 세포주는 5% 또는 10%의 우태아 혈청(Terracell)이 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Thermo) 배양액으로 항생제 페니실린/스트렙토마이신(invirogen)을 첨가하여 5% CO₂의 조건에서 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다.

실험동물

생체 내 항종양 실험은 6-8주령 된 체중 20-25g 내외의 C57BL/6 수컷 생쥐를 SLC(Japan SLC, Inc., Japan)에서 구입하여 시행하였다. 동물 사육실의 온도는 22±2℃, 습도는 55-60% 로 유지시켰으며, 명암 순환이 12 시간 단위로 조절되게 하였고, 방사선 조사로 멸균한 고형사료(중앙 실험동물, Seoul, Korea)와 멸균된 급수를 자유로이 섭취하게 하였다.

재조합 아데노바이러스의 제작 및 생산

pcDNA3.1-IRES(Invitrogen, Carlsbad, CA)벡터를 EcoRI 제한효소로 처리하여 수득한 800 bp 크기의 IRES 유전자를 pcDNA3.1-p35 벡터(Cytokine Bank, Chonbuk University, Chunju, South Korea)의 p35 유전자 바로 뒤의 EcoRI 제한효소를 이용하여 삽입시킴으로써 pcDNA3.1-p35/IRES 벡터를 제작하였다. 그리고 pcDNA3.1-p40(Cytokine Bank, Chonbuk University, Chunju, South Korea)을 PmeI과 XhoI 제한효소로 처리하여 수득한 1007 bp 크기의 p40 유전자를 pcDNA3.1-p35/IRES 벡터의 IRES 바로 뒤의 EcoRV 제한효소를 이용하여 삽입시켜 pcDNA3.1-IL12 벡터를 제작하였다. pcDNA3.1-IL12 벡터를 PmeI과 XhoI 제한효소로 다시 처리하여 나온 약 2.5 kb 크기의 IL-12(p35/IRES/p40)을 EcoRV과 SalI 제한효소로 처리된 pCA14(Microbix, Ontario, Canada)벡터에 삽입시켜 pCA14/IL-12(p35-IRES-p40) 셔틀벡터를 제작하였다.

IL-12와 GMCSF를 동시에 발현하는 아데노바이러스를 제작하기 위하여 pCA14/IL12 벡터에 삽입되어 있는 뮤린 IL-12를 SnaBI과 SalI 제한효소를 처리하여 2.4Kb의 DNA절편을 얻은 뒤 pXC1/IL12 셔틀벡터를 제작하였다. 또한, pGL3 basic 클로닝 벡터에 삽입되어있는 뮤린 GMCSF를 HindIII 제한효소로 처리하여 약 800 bp의 DNA 절편을 획득한 뒤, pSP72dE3/GMCSF 셔틀벡터에 삽입한 후, pvdmldl324BstB 토탈벡터(S.B. Verca, University of Fribourg, Switzerland)와 함께 대장균 BJ5183에 형질 전환시켜 상동재조합을 유도하여 dl324/GMCSF 토탈벡터를 제작하였다. 이렇게 제작된 dl324/GMCSF 토탈벡터를 pXC1/IL12 셔틀 벡터를 함께 대장균 BJ5183에 형질 전환시켜 RdB/IL12/GMCSF 바이러스를 제작하였다. 또한, RdB/IL12/GMCSF-TK 아데노바이러스를 제작하기 위하여 GM-CSF-IRES(사이토카인 은행, 전북대학교) 를 주형으로 센스 프라이머(5’-acggatccaccatgtggctgcagaatttacttttc-3’)와 안티센스 프라이머(5’caagatctttatcatcgtgtttttcaaaggaaaa3’)를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. 생성된 PCR 산물을 BamH, BglII 로 절단한 후 상기 단편을 BamHI 으로 절단하여 얻은 pSP72dE3/CMV에 삽입하여 GMCSF, IRES유전자가 삽입된 E3 셔틀벡터인 pSP72dE3/CMV/GMCSF-IRES를 제작하였다. 여기에 HSV-TK 유전자를 삽입하기 위해 pSP72dE3/CMV-TK polA를 BamHI으로 절단하여 얻은 TK 유전자를 BglII 로 미리 절단한 pEGFP-N1 벡터에 삽입하고 이를 다시 HindIII로 절단하여 HindIII로 절단한 pSP72dE3/CMV/GMCSF-IRES 에 삽입하여 GMCSF와 HSV-TK가 동시에 발현되는 셔틀벡터인 pSP72dE3/CMV/GMCSF-IRES-TK를 제작하였다. 이를 PvuI으로 절단한 후 BstBI 제한효소로 단일가닥이 된 아데노바이러스 vmdl324Bst 와 함께 대장균 BJ5183에서 동시 형질 전환시켜 유전자 상동재조합(homologous recombination)을 유도하였다. BJ5183에서 획득한 DNA는 다시 DH5α 대장균에 형질 전환시켜 증폭시키고 이를 HindIII 제한효소로 처리하여 재조합된 아데노바이러스 유전체들을 선별하였다. dl324dE3/GMCSF-TK 아데노바이러스 DNA를 BstBI으로 절단하고 pXC1RdB/IL12을 NdeI으로 절단하여 단일 가닥으로 만든 뒤 대장균 BJ5183에 동시 형질 전환시켜 유전자 상동재조합을 유도하였다. 이를 다시 DH5α 대장균에 형질 전환시켜 DNA를 증폭시키고, 복제 불능 아데노바이러스와 같은 방법으로 확인하여 재조합된 최종 DNA를 얻었다. 재조합이 확인된 이들 DNA는 293 세포주에 형질 전환시켜 RdB/IL12/GMCSF-TK 재조합바이러스를 생산, 증식하였으며, 제한 적정 분석(limiting titration assay) 방법으로 바이러스의 역가를 결정하고, CsCl 증감을 이용하여 농축 및 분리하였다.

IL -12와 GM - CSF 단백질 발현 양상 규명

A549 인간 폐암 세포주(3 x 10⁵)를 6-웰 플레이트에 분주한 다음날 재조합 아데노바이러스 RdB/IL12/GMCSF(1,5 MOI), RdB/IL12/GMCSFTK(1,5 MOI)를 각각의 역가로 감염시키고 48시간 후 배양 배지를 회수하여 IL-12와 GM-CSF의 발현을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 확인하였다.

ELISA의 전 과정은 마우스 IL-12 ELISA kit(e-bioscience), 마우스 GMCSF ELISA kit(MBL, Nagoya, Japan)의 설명서에 따라 상기에 서술된 동일한 방법으로 시행하였다.

HSV - TK 단백질 발현 측정을 위한 면역블롯팅

A549에 재조합 아데노바이러스 RdB/IL12/GMCSF(5,10 MOI)), RdB/IL12/GMCSFTK(5, 10, 50 MOI)를 각각의 역가로 감염시키고 48시간 후 감염된 세포를 회수하여 감염시킨 바이러스 역가의 증가에 따른 TK의 발현 증가여부를 웨스턴 블롯팅 방법으로 관찰하였다.

Cytopathic effect ( CPE ) 분석

IL-12와 GMCSF 및 HSV-TK의 발현 여부가 아데노바이러스의 복제에 어떠한 영향을 미치는지 검증하기 위하여, 바이러스의 복제 결과로 나타나는 CPE를 비교하였다. 다양한 인체 종양 세포주를 24-웰 플레이트에 분주하고 24시간 후 dE1, RdB, RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 및 Ad-WT 0.1-100 MOI 역가의 아데노바이러스들을 각각 처리하였다. 실험에 사용된 바이러스들 중 어느 한 바이러스가 가장 낮은 역가에서 세포를 거의 사멸시킨 시점에 모든 배지를 제거하고 50% 메탄올에 용해된 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색한 후 분석하였다.

MTT assay 에 따른 세포 생존율 검사

IL-12, GMCSF 및 HSV-TK를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 감염에 따른 세포 살상능을 정량화하기 위해 암세포주를 48 웰 플레이트에 30~50% 컨플루언시(confluency)로 분주하고 24시간 배양 후 RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 바이러스들을 감염시켰다. 바이러스 감염 24시간 후에 GCV(F.Hoffman-LaRoche Ltd, Basel, Swizerland)를 0-1000 ㎍/ml의 농도로 처리하고, GCV 처리 2~3일 후에 MTT를 2 ㎎/㎖의 농도로 PBS(phosphate buffer saline)에 녹여 150 ㎕씩 웰에 첨가하고 4 시간 동안 37℃ 에서 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 각각의 웰에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 500 ㎕ 씩 첨가하고 37℃에서 15분간 포르마잔(formazan)을 녹인 후, 각 웰의 용액을 96 웰 플레이트에 200 ㎕씩 옮기고 멀티-웰 ELISA 자동 분광 판독기(Behring ELISA ProcessorⅡ, Germany)를 이용하여 540 nm 파장에서 광학밀도를 측정한 후 대조군의 광학밀도와 비교하여 세포 생존율을 산출하였다.

생체내 항종양 효과와 생존율 검증

생후 7-8주 정도의 C57BL/6 마우스에 LLC 세포(2 x 10⁶)를 50 ㎕ HBSS(Hanks' Balanced salt solution)로 부유하여 마우스의 복부 피하에 주사하였다. 종양세포 이식 후 약 7일경, 종양의 크기가 약 100 mm³ 정도 성장하였을 때 RdB/IL12/GMCSF와 RdB/IL12/GMCSF-TK를 1 X 10⁸PFU(plaque-forming unit)/50 ㎕ 용량으로 2일에 한번씩 3회 종양 내로 투여하였다. 마지막 바이러스 투여 3일 후 RdB/IL12/GMCSF-TK 그룹은 GCV를 100 mg/kg 용량으로 이틀 간격 7회 복강주사 하였다. 음성 대조 군으로 PBS를 종양 내 주사하고, 종양의 용적은 종양의 단축과 장축을 각각 측정하여 다음과 같은 공식으로 산출하였다.

종양의 용적(㎣) = 단축 ² x 장축 x 0.523

마우스 생체내의 비장 세포의 조제

C57BL/6 생쥐의 복벽에 형성된 종양에 상기 실시예“생체내 항종양 효과 및 생존율 검증”과 동일한 방법으로 아데노바이러스를 각각 투여한 뒤, 마지막 바이러스 주사 후 3-5일경에 마우스를 경추 탈골시키고 복부를 절개하여 비장을 무균적으로 적출한 뒤, 멸균된 슬라이드의 거친 부분을 이용하여 균질화하였다. 균질화된 비장세포를 10% 우태아 혈청이 들어있는 RPMI 1640 배지로 부유시킨 후 2000 rpm 으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액을 제거하고, 적혈구 용혈액(ACK lysing buffer; 0.15 M NH₄Cl, 1 mM KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA, pH 7.2)을 넣어 4℃에서 5 분간 방치하여 적혈구를 제거하였다. 이 후 2000 rpm 으로 10 분간 원심분리 한 뒤 세포 침전물을 10% 우태아 혈청이 들어있는 RPMI 1640 배지로 2회 세척하고 트리판 블루(trypan blue, Gibco BRL)로 세포를 희석하여 세포수를 측정하였다.

CTL 활성 측정

아데노바이러스를 투여한 마우스에서 종양세포 특이적 T 세포 활성도를 검증하기 위한 CTL 활성 실험은 4 시간 ⁵¹Cr 유리법을 이용하였다. 상기 실시예 “마우스 생체내의 비장 세포의 조제”방법에서 제조된 비장 세포를 1.5 x 10⁶ cells/㎖이 되도록 배지로 희석한 후 IL-2(100 U/㎖)와 방사선이 조사된 LLC 세포주와 함께 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3~5일 동안 배양 하였다. 배양 후 3~5일경에 원심 분리하여 세포를 침전 시키고, 10% 우태아 혈청이 들어있는 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 표적 세포(T; LLC)를 ⁵¹Cr로 표지(labeling)시키기 위해서는, Na₂CrO₄(150 μCi)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 60 분간 배양한 뒤, 1000 rpm에서 10 분간 원심 분리한 후 10% 우태아 혈청이 들어있는 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 상기에서 준비한 비장세포(E)와 ⁵¹Cr으로 표지된 표적세포를 100:1, 30:1, 10:1 (E:T)의 비율로 섞은 뒤 v-bottomed 96-웰 마이크로플레이트(Corning, New York, USA)에 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후 1,000rpm에서 10 분간 원심 분리하고 상층액을 100 ㎕씩 취해 감마 카운터(γ-counter)로 상층액에 유리된 ⁵¹Cr에 의한 γ선의 강도를 측정하여 세포독성을 산출하였다. 각 실험은 3배수(triplicate)로 하였으며, 다음의 공식에 의해 세포 독성을 산출하였다.

% Cytotoxicity = (E-S)/(M-S) × 100

E : Experimental release count

S : Spontaneous release count

M : Maximum incorporation count

IFN -γ ELISpot 분석

아데노바이러스를 투여한 마우스에서 종양세포 특이적 면역 세포 활성도를 검증하기 위하여, ELISpot(enzyme-linked immune spot) 분석을 수행하였다. 각각의 아데노바이러스를 투여한 마우스의 비장세포를 상기의 방법으로 분리하였다. 어세이 플레이트는 항-IFN-γ 항체로 24시간 코팅하고, 다음 날 1× 10⁵ 및 5× 10⁵개의 비장세포를 플레이트에 분주하고 24시간 반응시켰다. 이후 바이오틴화 항-IFN-γ 항체를 넣고 2시간 동안 반응시키고 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제 접합체를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 기질로 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC) 용액을 넣고 반응을 지속시킨 다음, 각각의 IFN-γ를 분비하는 세포들(붉은빛 색깔)의 개수를 입체 현미경을 사용하여 측정하였다.

IL -12, GM - CSF , 또는 IFN -γ의 종양조직 내 발현량 측정

마우스의 피하에 형성된 종양 내로 각각의 바이러스를 투여하고 2일 뒤 종양을 적출하였다. 적출한 종양을 액체 질소에 담근 후 막자사발로 분쇄하고 단백질분해효소 억제제 칵테일(proteinase inhibitor cocktail, Sigma)이 첨가된 PBS에 부유하였다. 종양 조직을 보다 미세하게 분쇄하기 위하여 균질기(ART-MICCRA D-8, ART moderne Labortechnik, Munchen, Germany)로 균질화한 후, 3000 rpm에서 10분 원심분리한 뒤 상층액만 수득하여 IL-12, GM-CSF 또는 IFN-γ 단백질의 발현정도를 ELISA로 분석하였다. IFN-γ의 ELISA 전 과정은 IFN-γ kit(ENDOGEN, Woburn, MA, USA)를 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 수행하였으며, IL-12와 GM-CSF의 ELISA는 상기 실시예 “RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 아데노바이러스의 단백질 발현 양상 규명”과 같은 방법으로 수행하였다.

유세포 분석에 의한 마우스 비장세포의 특성 변화관찰

마우스의 비장 세포를 적출하여 단세포 부유물로 만든 다음, FITC-접합 햄스터 항-마우스 CD3e 단클론 항체(DiNonA, Seoul, Korea), PE-접합 래트 항-마우스 CD4/L3T4 단클론 항체(DiNonA) 또는 PE-접합 래트 항-마우스 CD8/Lyt-2 단클론 항체(DiNonA)를 각각 처리하여, 4℃에서 45 분간 반응 시킨 후 PBS로 3번 세척하고 유세포 분석을 수행하였다.

IL -12와 GM - CSF 및 HSV - TK 를 발현하는 종양 특이적 살상 아데노바이러스와 전약제 GCV 투여에 따른 종양 조직의 변화 관찰

C57BL/6 마우스의 복벽에 형성된 마우스 종양에 바이러스와 GCV를 교대로 3번씩 상기 실시예“생체내 항종양 효과와 생존율 검증”과 동일한 방법으로 각각 투여한 뒤, 마지막 바이러스 주사 후 2일에 종양을 적출하였다. 그리고 O.C.T. 컴파운드로 동결 박편한 뒤 9-10 μm 두께로 절단하여 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스 위에 부착하여 조직 면역염색을 실시하였다. CD4 슬라이드에 부착된 조직을 0.3% H₂O₂ 용액에서 10분 간 반응시켜 내인성 과산화 효소의 작용을 차단시킨 후 일차 항체인 래트 항-마우스 CD4 단클론 항체(PharMingen) 또는 래트 항-마우스 CD8 단클론 항체(PharMingen)를 넣어 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이 후 HRP가 결합된 이차 항체인 고트 항-래트 IgG-HRP 항체를 넣어 실온에서 1 시간 동안 반응 시키고, DAB를 첨가하여 발색 정도를 지켜본 후 100%, 90% 및 70% 에탄올과 자일렌 용액에 침전시키고 커버 글라스를 덮어 관찰하였다. 또한 종양조직의 세포고사를 관찰하기 위하여 ApopTag Kit(Intergen, Purchase, NY)을 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) 분석을 시행하였다. 발색여부를 확인하기 위해 퍼옥시다제와 결합된 아비딘을 사용하여 DAB(3,3’diaminobenzine, Dako, Carpinteria, CA)과 반응시킨 후 세포들이 갈색으로 변하는 것이 육안으로 확인되면 0.5% 메틸 그린으로 10 분간 염색하고 현미경으로 관찰하였다.

실험결과

IL -12와 GM - CSF 및 HSV - TK 를 발현하는 아데노바이러스의 제작 및 IL -12, GM - CSF 와 HSV - TK 의 발현 양상 규명

IL-12와 GM-CSF 및 HSV-TK유전자의 동시 발현에 따른 항종양 효과의 개선여부를 비교 분석하고자, 아데노바이러스의 초기 유전자인 E1B 유전자가 소실되고, E1A 유전자가 변이된 암세포 특이적 살상 아데노바이러스에 IL-12와 GM-CSF 유전자가 아데노바이러스의 E1, E3 부위에 각각 삽입된 아데노바이러스인 RdB/IL12/GMCSF와, IL-12와 GM-CSF 및 HSV-TK 유전자가 IRES로 연결되어 E1, E3 부위에 각각 삽입된 아데노바이러스인 RdB/IL12/GMCSF-TK을 각각 제작하였다(도 1). 제작된 아데노바이러스들에 의한 IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK의 발현 정도를 알아보기 위하여, A549 인간 폐암 세포주에 아데노바이러스 (RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK)를 1, 5 MOI씩 각각 감염시키고, 48시간 후에 배지 및 세포를 회수하여 ELISA(IL-12, GM-CSF) 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 감염시킨 바이러스의 역가가 증가함에 따라 IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK의 발현량이 용량 의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 한편, 같은 바이러스 역가에서 비교해보았을 때, IL-12 발현량이 RdB/IL12/GMCSF에 비해 RdB/IL12/GMCSF-TK바이러스를 처리하였을 때 6배 이상 높게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. IL-12, GM-CSF 및 HSV-TK 유전자의 조합을 통한 이러한 IL-12의 극적인 발현량 증가는 종래에는 전혀 예측할 수 없었던 것으로, 매우 효율적으로 숙주 면역체계 활성화를 유도함으로써 항암활성을 크게 향상시킬 것으로 보인다.

IL -12, GM - CSF 또는 HSV - TK 유전자 발현에 따른 아데노바이러스 복제능 영향 분석

IL-12, GM-CSF 또는 HSV-TK유전자 발현이 아데노바이러스의 복제에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 아데노바이러스의 복제에 따른 세포 사멸 정도를 CPE 분석으로 관찰하였다. 여러 종류의 암세포주들(H358, Huh7 및 U343)을 dE1, RdB, RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 또는 Ad-WT아데노바이러스로 각각 0.1-100 MOI로 감염시키고 잔류 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 세포 사멸 정도를 관찰하였다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 음성 대조군인 dE1 아데노바이러스로 감염된 세포들에서는 아데노바이러스가 복제되지 않기 때문에 세포 살상효과가 나타나지 않았으나, 복제가능 아데노바이러스인 RdB, RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK 또는 Ad-WT아데노바이러스로 감염된 경우는 처리된 바이러스의 양이 증가함에 따라 세포 살상효과가 증가되었다. 또한, 본 연구에서 사용된 모든 세포주들에서 RdB/IL12/GMCSF-TK 아데노바이러스의 세포 사멸능이 대조군 바이러스인 RdB, RdB/IL12/GMCSF에 의한 세포 사멸능과 비슷한 경향성으로 나타났다. 이러한 결과를 통하여, IL12, GM-CSF, TK가 발현되더라도 아데노바이러스의 복제에 의한 암세포 살상능이 저해되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

MTT assay 에 따른 세포 생존율 검사

증식 가능 아데노바이러스와 전약제인 GCV의 병용 처리에 의한 암세포 살상능을 정량화 하기 위하여 인체 간암 세포주(Huh7), 인체 폐암세포주(H460), 마우스 폐암 세포주(LLC), 마우스 간암 세포주(BNL)에 RdB, RdB/IL12/GMCSF 및 RdB/IL12/GMCSF-TK로 각각 감염시킨 후, GCV를 0-500ug/mL의 농도로 처리 한 뒤 4-7일 후에 살아남은 세포의 생존율을 측정하였다. 또한, 전약제인 GCV에 의한 암세포주의 독성을 알아보기 위하여 암세포주에 바이러스를 감염시키지 않고 GCV만을 0-500ug/mL 농도로 처리하였으며, 각 바이러스 감염에 따른 세포 생존율은 각각의 세포주에 바이러스 또는 GCV를 처리하지 않은 경우의 세포 생존율을 100%로 환산하여 상대 비교하였다. 아데노바이러스를 처리하지 않고 GCV만 처리한 세포주에서는 세포의 생존율이 거의 90-100% 정도로 GCV만으로의 세포 독성이 거의 나타나지 않음을 검증하였으며, 마우스 세포주인 LLC와 BNL의 경우 각 바이러스를 100 MOI, 그리고 HSV-TK를 발현하는 RdB/IL12/GMCSF-TK의 경우엔 100 MOI 에서 300 MOI까지 높여 감염한 후, 다양한 GCV 농도에서 비교해본 결과, 도 4a에서 나타난 바와 같이 GCV농도가 0 μg/mL에서는 같은 바이러스 역가로 처리한 경우 세포생존율이 비슷하게 나타나거나, RdB바이러스에 비해 RdB/IL12/GMCSF와RdB/IL12/GMCSF-TK를 처리한 실험군에서 조금 더 낮은 세포생존율을 보였다. 하지만, GCV 처리농도가 증가함에 따라 HSV-TK를 발현하는 RdB/IL12/GMCSF-TK 바이러스를 처리한 실험군에서 세포생존율이 현저하게 감소함을 관찰하였다. 또한, 인간 세포주인 Huh7과 H460을 이용하여 도 4b에서 보는 바와 같이 다양한 낮은 역가의 바이러스를 감염시킨 후 세포생존율을 비교해본 결과, 마우스 세포주와 마찬가지로 GCV농도가 0μg/mL에서는 각 역가에 따른 바이러스 만의 세포 살상능을 확인할 수 있었으며, GCV의 농도가 증가함에 따라 HSV-TK를 발현하는 RdB/IL12/GMCSF-TK 바이러스를 처리한 실험군에서 세포 생존율이 확연히 감소됨을 확인하였다. 특히, GCV 농도가 증가함에 따라 다른 대조군보다 더 낮은 역가의 바이러스를 처리한 실험군에서도 세포의 생존율이 다른 대조군의 3배(H460), 10배(Huh7) 높은 역가의 바이러스와 비교해 보았을 때도 현저히 감소되는 것을 확인하였다.

생체내 항종양 효과와 생존율 검증

IL-12와 GM-CSF를 발현하는 종양 특이적 살상 바이러스인 RdB/IL12/GMCSF와 IL-12, GM-CSF와 HSV-TK를 동시에 발현하는 종양 선택적 살상 바이러스 그리고 GCV를 이용하여 병합 치료하였을 때, 생체 내 항종양 효과를 비교 검증하기 위하여, LLC마우스 폐암 세포주를 C57BL/6 마우스의 피하에 주사한 후 형성된 종양에 각각의 바이러스를 1 × 10⁸PFU/30㎕로 이틀 간격 3회 종양 내로 주사하고 GCV 100 mg/kg를 이틀 간격 7일 동안 복강 내 주사한 후 종양의 성장을 관찰하였다. 음성대조군으로서 PBS를 투여한 마우스의 경우 종양이 급속한 속도로 성장하여 16일 이후 생존한 마우스는 없었으며, IL-12와 GM-CSF를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 RdB/IL12/GMCSF 을 투여한 마우스 대조군의 경우에는 처음 12일간은 종양의 성장이 억제된 경향을 보였으나 그 이후에는 종양이 점차적으로 성장하여 바이러스 투여 후 19일경에는 종양의 크기가 2945 ± 433.68 mm³로 크게 증가하였다. 그리고 RdB/IL12/GMCSF-TK를 투여한 실험군에서는 바이러스 투여 후 21일째에 종양의 크기가 1996.7±535.82로서 RdB/IL12/GMCSF에 비해 RdB/IL12/GMCSF-TK가 처리된 실험군에서의 종양의 성장이 현저히 억제됨을 관찰하였다. 또한 RdB/IL12/GMCSF-TK바이러스와GCV를 병용 투여한 실험군에서는 21일째 46.2743±32.4 mm³으로 바이러스 단독을 처리한 다른 대조군에 비하여 더욱 향상된 항종양 효과를 확인할 수 있었다(도 5a). 또한, 마우스의 생존율을 조사한 결과, 도 6b에서 볼 수 있듯이 PBS 또는 RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK을 투여한 마우스들이 각각 15 일, 20 일 및 31일 이후에 모두 죽은 반면, RdB/IL12/GMCSF-TK+GCV를 투여한 마우스들은 각각 5마리중 2마리만 38일, 40일에 각각 죽었으며, 나머지 3마리는 완전히 종양이 사라지는 것을 관찰할 수 있었으며, 60일 후에도 재성장이 되지 않는 것을 관찰하였다. 즉, 대조군인 PBS 또는 RdB/IL12/GMCSF, RdB/IL12/GMCSF-TK에 비해 생존율이 월등히 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 5b). 이와 같이 마우스 항종양 효과에서와 마찬가지로 RdB/IL12/GMCSF-TK아데노바이러스와 GCV를 병용 투여한 경우, 마우스 생존율에서도 뚜렷한 개선 효과를 확인 할 수 있었다.

IL -12, GM - CSF , 또는 IFN -γ의 종양내 발현량 측정

바이러스가 투여된 종양 조직 내에서의 IL-12, GM-CSF, 또는 IFN-γ의 발현량을 알아보고자, 바이러스가 투여된 마우스로부터 종양조직을 적출하여 미세하게 분쇄한 뒤 IL-12, GM-CSF, 또는 IFN-γ ELISA 분석을 각각 시행하였다. IL-12의 ELISA 분석에서는 PBS, RdB/IL12/GMCSF를 처리한 실험군에서는 각각 52.5 pg/mg, 240 pg/mg 만이 검출된 반면, RdB/IL12/GMCSF-TK 또는 GCV를 함께 처리한 실험군에서는 1920 pg/mg, 1810 pg/mg으로서 다른 대조군에 비해 8배 이상 IL-12가 검출되는 것을 확인하였다(도 6a). 생체 외 실험과 마찬가지로, IL-12와 GM-CSF만을 발현하는 RdB/IL12/GMCSF를 투여한 경우에 비해, TK를 함께 발현하는 RdB/IL12/GMCSF-TK를 투여한 종양 조직에서, IL-12가 현저히 고농도로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 종양 조직 내 GM-CSF 발현량의 경우, PBS, RdB/IL12/GMCSF를 처리한 실험군에서는 43.75 pg/mg, 525 pg/mg의 GM-CSF만이 검출된 반면, RdB/IL12/GMCSF-TK 또는 GCV를 함께 처리한 실험군에서는 1632.5 pg/mg, 1925 pg/mg의 GM-CSF이 검출됨을 확인할 수 있었다(도 6b). 생체 외 실험에서는 IL-12와 GM-CSF만을 발현하는 RdB/IL12/GMCSF를 감염시킨 경우와 TK를 함께 발현하는 RdB/IL12/GMCSF-TK를 감염시킨 경우 모두 비슷한 정도의 GM-CSF를 발현시킨 것에 비해, 종양 조직에서는 RdB/IL12/GMCSF-TK를 투여한 경우에, 고농도로 발현된 IL-12의 암세포 특이적 면역반응에 의해 이차적으로 GM-CSF의 발현을 증가시켜, RdB/IL12/GMCSF를 투여한 경우에 비해, 현저히 높은 양의 GM-CSF가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

이로서 암 조직 내에서 선택적으로 증식할 수 있는 아데노바이러스에 의해 IL-12와 GM-CSF이 종양조직 내에서 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라 RdB/IL12/GMCSF에 비해 RdB/IL12/GMCSF-TK에서 더 높은 사이토카인 발현이 검출된 것은 실제 인 비트로상에서 확인한 IL-12 발현의 증가가 인 비보내에서도 확실히 증가됨을 다시 확인할 수 있었으며, 종양 내의 증가된 IL-12의 발현은 면역세포의 활성을 증대시켜 결과적으로, GM-CSF발현에도 영향을 미침을 확인할 수 있었다. 또한, IFN-γ의 종양 조직내 발현량의 경우에서도 RdB/IL12/GMCSF-TK와 GCV를 병용 처리한 종양조직에서 5790 pg/mg으로 매우 높게 검출되어, PBS(445 pg/mg RdB/IL12/GMCSF(2242.5 pg/mg)을 투여한 경우 뿐만 아니라 RdB/IL12/GMCSF-TK (4895 pg/mg)를 투여한 경우에 비해서도 발현 정도가 확연히 높은 것을 확인할 수 있었다(도 6c).

IL -12와 GM - CSF 을 발현하는 복제가능 아데노바이러스 투여에 따른 종양조직의 변화 관찰

IL-12와 GM-CSF 발현에 따른 종양조직 내의 변화를 알아보고자 각각의 바이러스 또는 PBS를 투여한 종양조직을 H&E 염색한 결과, PBS를 제외한 RdB/IL12/GMCSF 또는 RdB/IL12/GMCSF-TK를 투여한 실험군과 GCV를 병합 투여한 치료 실험 군에서는 종양 주위로의 림프구의 침윤을 확인할 수 있었으며, 또한, RdB/IL12/GMCSF 또는 RdB/IL12/GMCSF-TK에 비해 RdB/IL12/GMCSF-TK와 GCV를 병합 투여한 종양 조직의 경우에서는 종양 주위뿐만 아니라 종양 조직 내부에도 많은 림프구가 침윤된 것을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, 대부분의 암세포들이 괴사되어 있음을 관찰하였다(도 7). 종양 조직내 침윤된 림프구의 세포군을 보다 면밀히 조사하기 위하여 CD4⁺와 CD8⁺ T 림프구를 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 사용하여 IHC를 시행한 결과, RdB/IL12/GMCSF 또는 RdB/IL12/GMCSF-TK에 비해 RdB/IL12/GMCSF-TK와 GCV를 병합 투여한 종양 조직에서 현저하게 증가된 CD4⁺과 CD8⁺ T 림프구를 종양조직 내부와 주위에서뿐만 아니라 종양 조직 내부에서도 전반적으로 관찰할 수 있었다(도 7).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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musculus <400> 2 atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60 atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120 gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180 acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240 gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300 catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360 aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420 tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480 gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540 caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600 gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660 tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720 atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780 actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840 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Claims

IL(interlukin)-12-인코딩 뉴클레오타이드 서열, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 HSV-TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IL-12 및 GM-CSF 고발현용 재조합 아데노바이러스 벡터로서, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 IL-12-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 GM-CSF-인코딩 뉴클레오타이드 서열만 있는 재조합 아데노바이러스 벡터와 비교하여 IL-12 및 GM-CSF를 고발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
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제 1 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 E1B 및 E3 영역이 결실된 것이고, 상기 IL-12-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 E1B 영역에 삽입되며, 상기 GM-CSF-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 E3 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
제 4 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 결실된 E3 영역에 5’에서 3’방향으로 GM-CSF-인코딩 뉴클레오타이드 서열, IRES(internal ribosome entry site) 서열 및 HSV-TK-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
(a) 제 1 항, 제 4 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스 벡터의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항종양 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 유효성분으로서 GCV(ganciclovir)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항종양 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 종양의 면역활성 및 면역원성을 증대시키는 것을 특징으로 하는 항종양 조성물.