CN109072253B - 包含GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物 - Google Patents
包含GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包含GM‑CSF基因、Flt3L‑TRAIL融合基因、抑制TGF‑β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物。
Description
技术领域
本发明涉及包含GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物。
背景技术
粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)以各种方式起作用，首先其用于聚集抗原提呈细胞，例如天然杀伤细胞或树突细胞。此外，已知GM-CSF刺激肿瘤周围的树突细胞，从而增加共刺激分子的表达，使得CD4+和CD8+T细胞增强免疫反应，并且除了促进树突细胞分化之外，在原代单核细胞中参与对MHC II类分子组成的分子的表达的调节[J.Immunol.171:2374by Hornell et al.,2003.Regulation of the class II MHC pathway in primaryhuman monocytes by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor]。此外，已知当GM-CSF在肿瘤中表达时，在肿瘤周围收集APC，并且通过有效治疗肿瘤抗原来强烈诱导抗癌免疫应答[Cancer Immunol.Immunother.53:17by Pan et al.,2004In siturecruitment of antigen-presenting cells by intratumoral GM-CSF genedelivery]。
通过共表达的Flt3-L和TRAIL，FLT3L-TRAIL具有双重功能，例如，对树突细胞从DC祖细胞增殖成DC的有效刺激(FLT3L)，和对癌细胞的凋亡的诱导(TRAIL)。当DC获得源自凋亡肿瘤体的抗原时，可以实现对肿瘤的有吸引力的疫苗接种。该方法可以触发广泛的CD4+和CD8+T细胞应答，而无需鉴定肿瘤特异性抗原表位。因此，无论HLA单倍型如何，该方法适用于所有癌症患者[Mol.Ther.3:368by Wu et al.,2001.Regression of human mammaryadenocarcinoma by systemic administration of a recombinant gene encoding thehFlex-TRAIL fusion protein.；Mol.Ther.9:674by Wu and Hui,2004.Induction ofpotent TRAIL-mediated tumoricidal activity by hFLEX/furin/TRAIL recombinantDNA construct]。
本发明人已经获得了关于抑制TGF-β1或TGF-β2和HSP27表达的shRNA的专利[韩国专利第1286053、1420564和1374585号]。
已经熟知的是，HSP27的免疫作用通过由于HSP27沉默而增加蛋白组学活性来增加由CD8+T细胞介导的肿瘤坏死和记忆应答。
在这点上，还没有通过使用GM-CSF和FLT3L-TRAIL来制备有机复合体从而将同时抑制TGF-β和HSP表达的shRNA应用于抗肿瘤治疗的研究。
发明内容
[技术问题]
因此，本发明人尝试开发一种抗肿瘤基因组合物，其具有通过同时增加肿瘤特异性细胞毒性作用和免疫活性以及肿瘤免疫原性而最大化的抗肿瘤活性，因此证实，当使用共表达抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)的基因递送系统来将该基因组合物转导到靶细胞时，与表达每种基因或甚至表达GM-CSF或Flt3L-TRAIL时比较，抗肿瘤效果得到较大改善，并且还证实，当使用共表达GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、shTGF-β和shHSP的基因递送系统将该基因组合物转导到靶细胞时，与表达每种基因特别是表达shTGF-β和shHSP时相比，显示出更高的抗肿瘤效果。由此，完成了本发明。
[技术方案]
为此，本发明指向提供共表达GM-CSF、FLT3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP-的基因递送系统以及包含所述基因递送系统的抗肿瘤组合物，所述基因递送系统包括GM-CSF基因、FLT3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
此外，本发明指向提供共表达shTGF-β和shHSP的基因递送系统以及包含所述基因递送系统的抗肿瘤组合物，所述基因递送系统包括抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
作为解决上述问题的手段，本发明提供一种共表达GM-CSF、FLT3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP的基因递送系统，其包括GM-CSF基因、flt3-L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
作为解决上述问题的另一种手段，本发明提供一种抗肿瘤药物组合物，其包含GM-CSF基因、FLT3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
作为解决上述问题的又另一种手段，本发明提供一种共表达shTGF-β和shHSP的基因递送系统，其包括抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
作为解决上述问题的再另一种手段，本发明提供一种抗肿瘤组合物，其包含抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
[有益效果]
在本发明中，由于使用shRNA介导的RNA干扰作用于TGF-β(其为导致疾病发作的一种蛋白质)肿瘤相关基因上，抑制TGF-β的表达，以限制诱导免疫耐受的因素并诱导由GM-CSF诱导的免疫加强应答，增强抗肿瘤作用，表达Flt3L-TRAIL，同时抑制TGF-β和HSP表达，从而显著增强癌症疾病动物模型的抗肿瘤效果。包括这些融合基因的总共四种单独基因的结合，而不是简单地具有抗肿瘤功能的基因随机组合，使得这些基因彼此紧密且有机地互相关联。
附图说明
图1展示根据本发明的包括在重组腺病毒载体中的四个基因的单独的作用方式；
图2展示本发明的四个基因具有有机和协同的关系而非其独立作用以显示抗癌作用；
图3示出根据本发明的二种型重组腺病毒载体和四种型重组腺病毒载体(YSC-02和YSC-01)；
图4A示出Flt3L-TRAIL插入具有SalI/BamHI的Adlox载体中；
图4B示出Flt3L-TRAIL插入具有XbaI和MfeI的pIRES载体中；
图4C示出Flt3L-TRAIL插入具有PmeI的pVAX1-3484-CMVp-△E1B(-E1R)穿梭载体中；
图4D示出表达人Flt3L-TRAIL的溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒通过以dl324-BstBI作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体进行同源重组制备而成；
图5A示出表达人shTGF-β的溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒通过以dl324-BstBI-U6-shTGF-β1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B作为穿梭载体进行同源重组制备而成；
图5B示出表达人shTGF-β的溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒通过以dl324-BstBI-U6-shTGF-β2作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B作为穿梭载体进行同源重组制备而成；
图6示出表达人shHSP27的溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒通过以dl324-BstBI-H1-shHSP27作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B作为穿梭载体进行同源重组制备而成；
图7示出通过用HSP25 shRNA转染BNL-HSP25细胞系，减少HSP25表达的效果，从而由pSP72-H1-mshHSP25-1、pSP72-H1-mshHSP25-2或者pSP72-H1-mshHSP25-3证实HSP25shRNA效果；
图8示出表达鼠shHSP25的溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒通过以dl324-IX作为骨架并且以pSP72-shHSP25-2作为穿梭载体进行同源重组制备而成；
图9示出表达鼠shHSP25的溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒通过以dl324-IX作为骨架并且以pSP72-shHSP25-3作为穿梭载体进行同源重组制备而成；
图10示出了降低来自图8或者9的表达HSP25 shRNA的每种腺病毒的表达的效果；
图11示出Flt3L-TRAIL基因插入pIRES-GM-CSF中，如使用限制酶所证实[泳道1：阴性DNA；泳道2、3：插入了Flt3L-TRAIL]；
图12A示出人GM-CSF-Flt3L-TRAIL基因插入pVAX1-3484-CMVp-ΔE1B-E1R中，如使用限制酶所证实；
图12B示出鼠GM-CSF-Flt3L-TRAIL基因插入pVAX1-3484-CMVp-ΔE1B-E1R中，如使用限制酶所证实，[亚克隆产物用PmeI剪切，以证实该插入片段和增加的载体大小]；
图13示出GM-CSF和Flt3L-TRAIL基因插入的有肿瘤选择性复制能力型腺病毒DNA的同源重组，如使用限制酶所证实，其中图13A示出人GM-CSF[所有泳道1、2、3和4均为阳性]，图13B示出鼠GM-CSF[泳道1和4为阳性]；
图14示出对GM-CSF和Flt3L-TRAIL基因进行亚克隆的过程，以及用于制造穿梭载体并产生可复制的腺病毒的同源重组的过程；
图15A示出ELISA结果，该ELISA结果证实人GM-CSF和人Flt3L-TRAIL基因插入的有肿瘤选择性复制能力型腺病毒表达GM-CSF和TRAIL蛋白；
图15B示出ELISA结果，该ELISA结果证实鼠GM-CSF和人Flt3L-TRAIL基因插入的有肿瘤选择性复制能力型腺病毒表达GM-CSF和TRAIL蛋白；
图16A示出TRAIL在GM-CSF和Flt3L-TRAIL基因插入的有肿瘤选择性复制能力型腺病毒中诱导凋亡，如通过聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)剪切所证实；
图16B示出GM-CSF和Flt3L-TRAIL基因插入的有肿瘤选择性复制能力型腺病毒表达Flt3L；
图17示出pSP72△E3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27或者pSP72△E3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1穿梭载体的制造过程；
图18示出以dl324-IX作为骨架并且以pSP72-ΔE3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27作为穿梭载体的同源重组；
图19示出以dl324-IX作为骨架并且以pSP72-ΔE3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1作为穿梭载体的同源重组；
图20示出以dl324-BstBI作为骨架并且以pSP72-ΔE3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1作为穿梭载体的同源重组；
图21示出以dl324-BstBI作为骨架，并且以pSP72-ΔE3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27作为穿梭载体的同源重组；
图22示出以dl324-BstBI-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1作为骨架，并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B作为穿梭载体的同源重组；
图23示出以dl324-BstBI-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27作为骨架，并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B作为穿梭载体的同源重组；
图24A示出H1-mshHSP25基因插入pSP72△E3-U6-mshTGF-β1中的克隆；
图24B示出以dl324-IX作为骨架并且以pSP72-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1作为穿梭载体的同源重组；
图25A示出以dl324-BstBI作为骨架并且以pSP72-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1作为穿梭载体的同源重组；
图25B示出以dl324-BstBI-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B作为穿梭载体的同源重组；
图26示出以dl324-BstBI-H1-shTGF-β1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达人GM-CSF、Flt3L-TRAIL和shTGF-β1的溶瘤腺病毒；
图27示出以dl324-BstBI-U6-mshTGFβ1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达鼠GM-CSF、Flt3L-TRAIL和mTGFβ1的溶瘤腺病毒；
图28示出以dl324-BstBI-mshHSP27作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达人GM-CSF、Flt3L-TRAIL和shHSP27的溶瘤腺病毒；
图29示出以(鼠源)dl324-BstBI-shHSP25作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达鼠GM-CSF、Flt3L-TRAIL和shHSP25的溶瘤腺病毒；
图30示出以dl324-BstBI-shHSP27-shTGFβ1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-hGMCSF作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达人GM-CSF、shTGFβ1和shHSP27的溶瘤腺病毒；
图31示出以dl324-BstBI-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GM-CSF作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达人GM-CSF、shTGFβ2和shHSP27的溶瘤腺病毒；
图32示出以dl324-BstBI-H1-mshHSP25-U6-mshTGFβ1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGM-CSF作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达鼠GMCSF、shTGFβ1和shHSP25的溶瘤腺病毒；
图33示出以dl324-BstBI-H1-shHSP27-U6-shTGF-β1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达Flt3L-TRAIL、shHSP27和shTGFβ1的溶瘤腺病毒；
图34示出以dl324-BstBI-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达Flt3L-TRAIL、shHSP27和shTGFβ2的溶瘤腺病毒；
图35示出以dl324-BstBI-H1-mshHSP25-U6-mshTGF-β1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出共表达Flt3L-TRAIL、shHSP25和shTGFβ1的溶瘤腺病毒；
图36示出以dl324-BstBI-△E3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27和pVAX1-3484-CMV-△E1B-GM-CSF-IRES-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出载有GM-CSF、Flt3L-TRAIL、shTGF-β2和shHSP27的溶瘤腺病毒(YSC-01)；
图37示出以dl324-BstBI-△E3-H1-shHSP27-U6-shTGF-β1和pVAX1-3484-CMV-△E1B-GM-CSF-IRES-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组，以证实制造出载有GM-CSF、Flt3L-TRAIL、shTGF-β1和shHSP27的溶瘤腺病毒(YSC-02)；
图38示出以dl324-BstBI-△E3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27作为骨架并且以pVAX1-3484-CMV-△E1B-GM-CSF-IRES-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组；
图39示出以dl324-BstBI-ΔE3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMV-△E1B-GM-CSF-IRES-Flt3LTRAIL作为穿梭载体的同源重组；
图40示出以dl324-BstBI-ΔE3-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMV-△E1B-GM-CSF-IRES-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体的同源重组(mYSC-02)；
图41示出当用mYSC-02感染源自鼠肝细胞癌细胞系的BNL-CAR-E1B55K-HSP25细胞时，病毒中载有的基因正常表达；
图42示出通过表达shTGF-β1和shHSP27中的每一个或所有的有肿瘤选择性复制能力型病毒而引发的抗肿瘤效果，如通过裸小鼠动物测试所证实；
图43示出TGF-β同型在存活潜力上的区别，如通过对各种癌细胞系进行的克隆形成实验所证实；
图44A示出在U251N、A549、Huh7和A375癌细胞系中细胞内的TGF-β1水平降低时，对细胞存活信号和SAPK相关信号的影响；
图44B示出当MiaPaCa-2、HPAC、Aspc-1和Capan-1癌细胞系中的细胞内TGF-β1水平降低时，对细胞存活信号和SAPK相关信号的影响；
图45A示出通过由DCF-DA氧化而产生的荧光强度测量在MDA-MB231-Her2癌细胞系中TGF-β1或者TGF-β2降低时的ROS产率；
图45B示出当MDA-MB231-Her2癌细胞系中的TGF-β1或者TGF-β2降低时，对细胞存活信号和SAPK相关信号的影响；
图45C示出通过由DCF-DA氧化而产生的荧光强度来测量在A549、A375、Hun7和U251N癌细胞系中TGF-β1或者TGF-β2降低时的ROS产率；
图46示出当各种癌细胞系中TGF-β1或者TGF-β2和HSP27降低时，对细胞存活信号和SAPK相关信号的影响；
图47示出当各种癌细胞系中HSP27降低时与肿瘤进展相关的各种标记信号的降低；
图48示出与在各种癌细胞系中只有HSP27降低时相比，当TGF-β1或者TGF-β2和HSP27同时降低时，与肿瘤进展相关的各种标记信号更明显地降低；
图49示出与在各种癌细胞系中只有HSP27降低时相比，当TGF-β1或者TGF-β2和HSP27同时降低时，存活率降低，如通过克隆形成实验所证实；
图50示出与在各种癌细胞系中只有HSP27降低时相比，当TGF-β1或者TGF-β2和HSP27同时降低时，会显示出TRAIL受体增加并且TRAIL抗性相关的CDK9降低；
图51A示出在乳腺癌、胶质瘤和黑色素瘤细胞系中TGF-β1和HSP27同时降低，并且TRAIL表达受到诱导时，对细胞存活信号和SAPK相关信号的影响；
图51B示出在胰腺癌和肝细胞癌细胞系中TGF-β1和HSP27同时降低，并且TRAIL表达受到诱导时，对细胞存活信号和与SAPK相关信号的影响；
图52示出通过YSC-01和YSC-02的病毒DNA碱基序列的分析，证实正常地插入了导入的基因[GM-CSF具有源自InvivoGen pORF-GM-CSF的全部氨基酸残基，Flt3L具有氨基酸残基1至181，并且TRAIL具有氨基酸残基95至281]。
图52A示出GM-CSF碱基序列插入YSC-01中；
图52B示出在YSC-01的Flt3L-TRAIL中鉴别出Flt3L碱基序列(与氨基酸1至181对应)；
图52C示出在YSC-01的Flt3L-TRAIL中鉴别出TRAIL碱基序列(与氨基酸95至281对应)[第3行右侧的TCT是TCC，但是该氨基酸同样是丝氨酸]；
图52D示出在YSC-01的shTGF-β2中鉴别出shTGF-β2碱基序列；
图52E示出在YSC-01的shHSP27中鉴别出shHSP27碱基序列；
图52F示出GM-CSF碱基序列插入YSC-02中；
图52G示出在YSC-02的Flt3L-TRAIL中鉴别出Flt3L碱基序列(与氨基酸1至181对应)；
图52H示出在YSC-02的Flt3L-TRAIL中鉴别出TRAIL碱基序列(与氨基酸95至281对应)[第3行右侧的TCT是TCC，但是该氨基酸同样是丝氨酸]；
图52I示出在YSC-02的shHSP27中鉴别出shHSP27碱基序列；
图52J示出在YSC-02的shTGF-β1中鉴别出shTGF-β1碱基序列；
图53示出当使用YSC-01和YSC-02以不同的MOI感染胰腺癌细胞系时引入的四个基因正常地表达或者在表达中被shRNA降解；
图53A示出通过YSC-01感染导致的GM-CSF和TRAIL的分泌；
图53B示出通过YSC-01感染对TGF-β2mRNA表达的抑制，并且还示出PARP剪切、Flt3L表达和对HSP27表达的抑制；
图53C示出通过YSC-02感染导致的GM-CSF和TRAIL的分泌；图53D示出通过YSC-02感染对TGF-β2mRNA表达的抑制，并且还示出PARP剪切、Flt3L表达和对HSP27表达的抑制；
图54A示出与表达GM-CSF和Flt3L-TRAIL的溶瘤腺病毒相比，包括p53突变型的若干种癌细胞系的存活潜力通过YSC-01或者YSC-02进一步降低，如通过克隆形成实验所证实；
图54B示出与表达GM-CSF和Flt3L-TRAIL的溶瘤腺病毒相比，p53野生型癌细胞系的存活潜力通过YSC-01或者YSC-02进一步降低，如通过克隆形成实验(左侧)所证实，并且比较YSC-01或者YSC-02、表达GM-CSF和Flt3L-TRAIL的溶瘤腺病毒、或者对照溶瘤腺病毒，正常细胞的存活潜力没有显著的区别，如通过克隆形成实验(右侧)所证实；
图55A通过根据在正常细胞和包括p53突变型的若干种癌细胞系中的YSC-02的MOI的增加证实存活信号和TRAIL相关信号来示出肿瘤选择性、对存活率的降低和溶瘤潜力的增加的诱导；
图55B通过根据在包括p53野生型的两种癌细胞系中的YSC-02的MOI的增加证实存活信号和TRAIL相关信号来示出肿瘤选择性、对存活率的降低和溶瘤潜力的增加的诱导；
图56示出通过对YSC-01或者YSC-02进行溶瘤试验，YSC-02在包括正常细胞的一些类型的癌细胞系中显示相对高的溶瘤潜力；
图57A示出，相对于表达GM-CSF和Flt3L-TRAIL的肿瘤选择性复制型病毒，YSC-01或者YSC-02(特别是YSC-02)在移植了人胰腺癌细胞系的免疫缺陷裸小鼠中显示抗肿瘤效果；
图57B示出，相对于表达GM-CSF和Flt3L-TRAIL的肿瘤选择性复制型病毒，YSC-01或者YSC-02(特别是YSC-02)在移植了人胰腺癌细胞系的免疫缺陷裸小鼠中显示更高的存活率；
图58示出通过将能够增强腺病毒的感染性和复制性的基因引入小鼠并选择克隆来表达插入基因的小鼠源肝细胞癌细胞系(BNL-CAR-E1B55K-HSP25)；
图59通过比较用于感染免疫活性小鼠的所有类型的病毒的抗肿瘤效果示出通过表达四种基因的腺病毒(YSC-01和YSC-02、GX-03)诱导的抗肿瘤效果，，以证实在小鼠基因和在人和小鼠中具有相容性的Flt3L-TRAIL之间的免疫因子的贡献；
图60示出与在大多数癌细胞系中大量出现GX-03相比较，在各种癌细胞系中当只有TGF-β1或者HSP27降低或者TGF-β1和HSP27同时降低时的降低存活率的效果，或者当用YSC-02感染该细胞时的降低存活率的效果，如克隆形成实验所证实；
图61示出用于感染免疫活性小鼠的包括YSC-01、YSC-02和GX-03的所有类型的病毒的CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫性的比较，以证实在鼠基因和在人和小鼠中具有相容性的Flt3L-TRAIL之间的免疫因子的贡献；
图62示出用于感染免疫活性小鼠的包括YSC-01、YSC-02和GX-03的所有类型的病毒的T调节细胞免疫性的比较，以证实在鼠基因和在人和小鼠中具有相容性的Flt3L-TRAIL之间的免疫因子的贡献；
图63示出用于感染免疫活性小鼠的包括YSC-01、02和GX-03的所有类型的病毒的DC免疫性的比较，以证实在鼠基因和在人和小鼠中具有相容性的Flt3L-TRAIL之间的免疫因子的贡献；
图63A示出PBS、对照溶瘤腺病毒、只表达鼠GM-CSF的溶瘤腺病毒、只表达Flt3L-TRAIL的溶瘤腺病毒的DC活性的比较；
图63B示出表达鼠GM-CSF和Flt3L-TRAIL的溶瘤腺病毒、表达鼠GM-CSF、Flt3L-TRAIL和小鼠型HSP25的shRNA的溶瘤腺病毒、表达小鼠型TGF-β1的shRNA、和小鼠型YSC-02的溶瘤腺病毒的DC活性的比较；以及
图63C示出小鼠型YSC-02与小鼠型GX-03的DC活性的比较。
具体实施方式
本发明涉及用于共表达hTGF-β和shHSP的基因递送系统(以下称为二种型基因递送系统)，该基因递送系统包括抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
另外，本发明涉及用于共表达GM-CSF、Flt3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP的基因递送系统(以下称为四种型基因递送系统)，该基因递送系统包括GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
与表达各个基因时或者甚至是表达GM-CSF和Flt3L-TRAIL时相比，当使用共表达抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)的基因递送系统将基因引入靶细胞时，证实抗肿瘤效果进一步提高。
当使用用于共表达GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、shTGF-β和shHSP的基因递送系统将基因引入靶细胞时，证实抗肿瘤效果优于表达各个基因时的抗肿瘤效果，并且特别地，优于表达shTGF-β和shHSP时的抗肿瘤效果。
特别地，发明人证实GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP27表达的shRNA(shHSP27)与凋亡、存活因子和免疫因子密切相关，它们以有效地调控这些因子的方式组合在一起，以克服在当前癌症治疗中的障碍，例如，细胞中不同的信号网络之间的串扰、在肿瘤细胞与免疫细胞之间的串扰、以及肿瘤内异质性，导致在广范的癌症类型中对癌症细胞的非常有效和根本的调控。
在此所使用的术语“GM-CSF”包括诱导免疫加强应答的所有GM-CSF同源物以及在实施例中所例举的GM-CSF。
鼠GM-CSF基因从欧萨利文博士(Dr.Gerald C.O’Sullivan)(科克癌症研究中心，Mercy大学医院和Leslie C.Quick Jnr.实验室，科克大学，科克，爱尔兰；Cork CancerResearch Centre,Mercy University Hospital and Leslie C.Quick Jnr.Laboratory,University College Cork,Cork,Ireland)处获得，并且碱基序列与在《癌症基因治疗》(Cancer Gene Therapy(2006)13,1061-10710)中所公开的一样，且由SEQ ID NO:1表示。
[SEQ ID NO:1]
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
cccacccgct cacccatcac tgtcacccgg ccttggaagc atgtagaggc catcaaagaa 120
gccctgaacc tcctggatga catgcctgtc acgttgaatg aagaggtaga agtcgtctct 180
aacgagttct ccttcaagaa gctaacatgt gtgcagaccc gcctgaagat attcgagcag 240
ggtctacggg gcaatttcac caaactcaag ggcgccttga acatgacagc cagctactac 300
cagacatact gccccccaac tccggaaacg gactgtgaaa cacaagttac cacctatgcg 360
gatttcatag acagccttaa aacctttctg actgatatcc cctttgaatg caaaaaacca 420
ggccaaaaat ga 432
人GM-CSF基因从InvivoGen获得，其碱基序列与在基因库M11220中所公开的一样，且由SEQ ID NO:2表示。
[SEQ ID NO:2]
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120
cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
ccagtccagg agtga 435
人Flt3L-TRAIL基因通过将亮氨酸拉链与编码FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)的氨基酸1至181的基因和编码肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的氨基酸95至281的基因融合制备而成，并且由SEQ ID NO:3表示，如在基因库U03858(Flt3L)和基因库B032722或者U57059(TRAIL))中所示。
[SEQ ID NO:3]
atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60
agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac 120
ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg 180
gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag 240
cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc 300
gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt 360
cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg 420
ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc 480
gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca 540
gccccggcta gcagaatgaa gcagatcgag gacaaaattg aggaaatcct gtccaaaatt 600
taccacatcg agaacgagat cgcccggatt aagaaactca ttggcgagag ggaattcacc 660
tctgaggaaa ccatttctac agttcaagaa aagcaacaaa atatttctcc cctagtgaga 720
gaaagaggtc ctcagagagt agcagctcac ataactggga ccagaggaag aagcaacaca 780
ttgtcttctc caaactccaa gaatgaaaag gctctgggcc gcaaaataaa ctcctgggaa 840
tcatcaagga gtgggcattc attcctgagc aacttgcact tgaggaatgg tgaactggtc 900
atccatgaaa aagggtttta ctacatctat tcccaaacat actttcgatt tcaggaggaa 960
ataaaagaaa acacaaagaa cgacaaacaa atggtccaat atatttacaa atacacaagt1020
tatcctgacc ctatattgtt gatgaaaagt gctagaaata gttgttggtc taaagatgca1080
gaatatggac tctattccat ctatcaaggg ggaatatttg agcttaagga aaatgacaga1140
atttttgttt ctgtaacaaa tgagcacttg atagacatgg accatgaagc cagttttttc1200
ggggcctttt tagttggcta a 1221
在Flt3L-TRAIL融合基因的情况，由于这样的人型基因甚至在小鼠中也具有活性，因此，使用人Flt3L-TRAIL融合基因时而不单独地制造小鼠Flt3L-TRAIL融合基因。
在此所使用的术语“抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)”，是指抑制TGF-β1表达的shRNA(shTGF-β1)或者抑制TGF-β2表达的shRNA(shTGF-β2)。
申请号为2013-0012095的未审查的韩国专利申请中公开了“抑制TGF-β1表达的shRNA(shTGF-β1)”(申请号为2013-0012095的未审查的韩国专利申请中公开的序列由RNA序列表示。如果该shTGF-β1表示为DNA，由于该RNA序列的U被T所替代，所以，由RNA序列表示的shTGF-β1与由DNA序列表示的shTGF-β1是一样的)。在鼠shRNA的情况中，shTGF-β1由SEQID NO:4表示，并且在人shRNA的情况中，shTGF-β1由SEQ ID NO:5表示。
[SEQ ID NO:4]
ccctctacaa ccaacacaac ccgggtctcc ccgggttgtg ttggttgtag aggg 54
[SEQ ID NO:5]
accagaaata cagcaacaat tcctguctct ccaggaattg ttgctggtat ttctggttt 59
申请号为2013-0088792的未审查的韩国专利申请中公开了“抑制TGF-β2表达的shRNA(shTGF-β2)”。在鼠shRNA的情况中，该shTGF-β2由SEQ ID NO:6表达，并且在人shRNA的情况中，该shTGF-β2由SEQ ID NO:7表达。(当该shTGF-β2表达为RNA时，该DNA序列的T被U所替代)。
[SEQ ID NO:6]
ggattgaact gtatcagatc cttaatctct taaggatctg atacagttca atcc 54
[SEQ ID NO:7]
ggattgagct atatcagatt ctcaatctct tgagaatctg atatagctca atcc 54
在此所使用的术语“抑制HSP表达的shRNA(shHSP)”可以包括与鼠shRNA对应的shHSP25或者与人shRNA对应的shHSP27，其中，该shHSP25由SEQ ID NO:8表示，并且申请号为2013-0123244的未审查的韩国专利申请中公开了shHSP27，且由SEQ ID NO:9表示(当该hHSP表示为RNA时，该DNA序列的T被U所替代)。
[SEQ ID NO:8]
gctac atctc tcggt gcttc a tctc t gaagc accga gagat gtagc
[SEQ ID NO:9]
gatccgacga gcatggctac atctcccggt tctcaccggg agatgtagcc atgctcgtct
为了制备本发明的基因递送系统，可以将shTGF-β和shHSP；或者GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL融合基因、shTGF-β和shHSP置入合适的表达构建体中。在该表达构建体中，这些基因可以可操作地连接于启动子。在此所使用的术语“可操作地连接”是指在基因表达调控序列(例如，启动子、信号序列、或者一系列转录调控因子结合位点)和不同的核酸序列之间的功能性结合，并且，该调控序列由此对该其他核酸序列的转录和/或翻译进行调控。在本发明中，结合至本发明的靶基因的启动子优选在动物细胞中，并且更优选地，在哺乳动物细胞中起作用，以调控核心蛋白聚糖(decorin)基因的转录，并且，该启动子包括源自哺乳动物病毒的启动子和源自哺乳动物细胞基因组的启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子以及人GM-CSF基因启动子，但是本发明不仅限于此。
优选地，本发明所使用的表达构建体包括多聚腺苷酸序列(例如，牛生长激素终止子和源自SV40的多聚腺苷酸化序列)。
本发明的基因递送系统可以构建成各种形式，例如，(i)重组裸DNA分子，(ii)质粒，(iii)病毒载体，以及(iv)包括重组裸DNA分子和质粒的脂质体或者类脂囊泡(niosome)。
GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL融合基因、shTGF-β(shTGF-β1或shTGF-β2)和/或shHSP可以应用于传统基因治疗中所使用的所有基因递送系统，并且优选地，应用于质粒、腺病毒(Lockett LJ,et al.,Clin.Cancer Res.3:2075-2080(1997))、腺相关病毒(AAV,LashfordLS.,et al.,Gene Therapy Technologies,Applications and RegulationsEd.A.Meager,1999)、逆转录病毒(Gunzburg WH,et al.,Retroviral vectors.GeneTherapy Technologies,Applications and Regulations Ed.A.Meager,1999)、慢病毒(Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))、单纯疱疹病毒(Chamber R.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:1411-1415(1995))、痘苗病毒(Puhlmann M.et al.,Human Gene Therapy 10:649-657(1999))、脂质体(Methods in Molecular Biology,Vol199,S.C.Basu and M.Basu(Eds.),Human Press 2002)或者类脂囊泡。更优选地，通过将GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、shTGF-β、和/或shHSP应用于腺病毒而构建本发明的基因递送系统。
i.腺病毒
由于基因组大小中等、操作简单、滴度高、靶细胞范围宽和感染性卓越，腺病毒被广泛用作基因递送载体。该基因组的两端均包括100～200bp的末端反向重复(ITR)，该末端反向重复是cis元件，主要用于DNA复制和包装。该基因组的E1区(E1A和E1B)编码调控转录和宿主细胞基因的转录的蛋白。E2区(E2A和E2B)编码参与病毒DNA复制的蛋白。在目前开发出的腺病毒载体中，已删除E1区的复制缺陷型腺病毒被广泛使用。然而，E3区从传统的腺病毒载体中移除，以提供外来基因插入位点(Thimmappaya,B.et al.,Cell,31:543-551(1982)；和Riordan,J.R.et al.,Science,245:1066-1073(1989))。
因此，根据本发明的shTGF-β(shTGF-β1或者shTGF-β2)和shHSP；或者GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、shTGF-β(shTGF-β1或者shTGF-β2)和shHSP可以插入该已删除的E1区(E1A区和/或E1B区，优选地，E1B区)或者E3区中。在说明书中，用于病毒基因组序列的方面的术语“删除”包括对应序列的部分删除，以及对应序列的全部删除。
另外，由于该腺病毒可以包装大约105％的野生型基因组，因而可以另外包装大约2kb的遗传信息(Ghosh-Choudhury et al.,EMBO J.,6:1733-1739(1987))。因此，上面所提及的插入该腺病毒中的外来序列可以另外结合至该腺病毒基因组。腺病毒具有42种不同的血清型和A至F亚组。在这些腺病毒中，包括在亚组C中的腺病毒5型是用于获得本发明的腺病毒载体的最合适的初始材料。该腺病毒5型的生物化学信息和遗传信息是众所周知的。通过该腺病毒递送的外来基因被以与附加体相同的方式复制，并且对宿主细胞具有非常低的遗传毒性。相应地，使用本发明的腺病毒基因递送系统的基因治疗被认为是非常安全的。
ii.逆转录病毒
因为逆转录病毒将它自己的基因插入宿主基因组中，所以被广泛用作基因递送载体，能够递送大量的外来遗传物质，并且能够感染广谱细胞。
为了构建逆转录病毒载体，通过将需要递送的靶核苷酸序列而不是逆转录病毒序列插入逆转录病毒基因组中而制成复制缺陷型病毒。为了制备病毒粒子，构建包装细胞系，该包装细胞系包括gag、pol和env基因，但不包括长末端重复(LTR)和Ψ序列(Mann et al.,Cell,33:153-159(1983))。在递送包括靶核苷酸序列的重组质粒时，LTR和Ψ序列被引入细胞系，该Ψ序列有利于该重组质粒的RNA转录物的产生。该转录物被包装入病毒中，并且该病毒释放至培养基中(Nicolas Flt3L-TRAIL fusion and Rubinstein“retroviralvectors,”In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez and Denhardt(eds.),Stoneham:Butterworth,494-513(1988))。收集并浓缩包含该重组逆转录病毒的培养基，并且由此，将该重组逆转录病毒用作基因递送系统。
使用二代逆转录病毒载体的基因递送已有报道。根据Kasahara等(Kasahara etal,Science,266:1373-1376(1994))，通过制备莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)突变型，并将促红细胞生成素(EPO)序列插入包膜位点，来生产具有新结合特性的嵌合蛋白。也可以根据这样的二代逆转录载体的构建策略，来制备本发明的基因递送系统。
iii.AAV载体
腺相关病毒(AAV)可以感染非分裂细胞，并且具有感染各种类型的细胞的能力，因而适合用作本发明的基因递送系统。专利号为5,139,941和4,797,368的美国专利公开了对AAV载体的构建和使用的详细描述。
LaFace et al,Virology,162:483486(1988)；Zhou et al.,Exp.Hematol.(NY),21:928-933(1993)；Walsh et al,J.Clin.Invest.,94:1440-1448(1994)和Flotte etal.,Gene Therapy,2:29-37(1995)公开了对作为基因递送系统的AAV的研究。最近，AAV载体作为囊性纤维化治疗剂实施于I期临床试验中。
典型地，通过同时转化包括靶基因序列的质粒(McLaughlin et al.,J.Virol.,62:1963-1973(1988)；Samulski et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989))和表达质粒(McCarty et al.,J.Virol.,65:2936-2945(1991))来制备AVV病毒，所述靶基因序列位于两个AVV末端重复旁边，该表达质粒包括不含末端重复的野生型AAV编码序列。
iv.其他病毒载体
其他病毒载体也可以用作本发明的基因递送系统。源自痘苗病毒(Puhlmann M.etal.,Human Gene Therapy 10:649-657(1999)；Ridgeway,“Mammalian expressionvectors,”In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and theiruses.Rodriguez and Denhardt,eds.Stoneham:Butterworth,467-492(1988)；Baichwaland Sugden,“Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses:Transient and stable expression of transferred genes,”In:Kucherlapati R,ed.Gene transfer.New York:Plenum Press,117-148(1986)和Coupar et al.,Gene,68:1-10(1988))、慢病毒(Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))或者单纯疱疹病毒(Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:1411-1415(1995))的载体也可以用作能够将待递送的靶核苷酸序列递送至细胞中的递送系统。
v.脂质体
脂质体通过分散在水相中的磷脂而自动形成。如下文献中公开了通过脂质体将外来DNA分子成功递送至细胞中的例子：Nicolau and Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)和Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176(1987)。同时，Lipofectamine(Gibco BRL)是最广泛用于通过脂质体转化动物细胞的试剂。包含待递送的靶核苷酸序列的脂质体与细胞通过机制比如内吞作用、对细胞表面的吸附或者与浆细胞膜融合相互作用，从而将待递送的靶核苷酸序列递送至细胞中。
根据本发明的一个示例性的实施例，本发明的基因递送系统是重组腺病毒载体。
根据本发明的一个更具示例性的实施例，本发明的重组腺病毒载体不具有E1B区和E3区，并且shTGF-β1或者shTGF-β2插入到E3区被删除的位点，且shHSP插入到E3区被删除的位点。另外，在引入四个基因的重组腺病毒载体中，GM-CSF编码核苷酸和Flt3L-TRAIL编码核苷酸插入到E1B区被删除的位点，并且shTGF-β1或者shTGF-β2和shHSP插入到E3区被删除的位点。
包括E1A活性基因的重组腺病毒可以具有可复制的特性，并且当E1B区被删除时，可以增强细胞凋亡潜力。在此用于病毒基因组序列方面的“删除”包括对应序列的部分删除，以及对应序列的全部删除。本发明的重组腺病毒可以包括非突变的E1A基因或者突变的E1A活性基因。
更优选地，本发明的重组腺病毒载体包括shTGF-β1或者shTGF-β2、和shHSP27，shTGF-β1或者shTGF-β2沿5’至3’的方向位于E3区被删除的位点，并且shHSP27沿5’至3’的方向位于E3区被删除的位点(图3)。
引入四种基因的本发明的重组腺病毒载体包括GM-CSF基因、内部核糖体进入位点(IRES)和Flt3L-TRAIL，以及shTGF-β2、shHSP27或者shHSP27和shTGF-β1，Flt3L-TRAIL沿3’至5’的方向位于E1区被删除的位点，并且shTGF-β2、shHSP27或者shHSP27和shTGF-β1沿5’至3’的方向位于E3区被删除的位点(图3)。
另外，本发明提供了一种抗肿瘤组合物，该抗肿瘤组合物包括用于表达shTGF-β和shHSP的基因递送系统，或者包括用于表达GM-CSF、Flt3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP的基因递送系统。
在此所使用的术语“抗肿瘤组合物”指的是要用于肿瘤治疗的药物组合物。
因为包括在本发明的抗肿瘤组合物中的作为活性成分的基因递送系统与上面所述的本发明的基因递送系统是相同的，所以针对该基因递送系统的详细描述也适用于本发明的组合物。所以，为了避免由于说明书中不必要的重复而造成的过度复杂性，省略了一般性的描述。
如上所述，由于包括在本发明的组合物中的重组腺病毒显示对各种肿瘤细胞的裂解效果，本发明的药物组合物可以用于治疗各种与肿瘤相关的疾病或者病症，例如，胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌和黑色素瘤。在此所使用的术语“治疗”指的是：(i)预防肿瘤细胞的形成；(ii)随着肿瘤细胞的去除，抑制与肿瘤相关的疾病或者病症；和(iii)随着肿瘤细胞的去除，减轻与肿瘤相关的疾病或者病症。相应地，在此所使用的“治疗有效量”是指足以实现药物效果的量。
包括在本发明的组合物中的药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且可以是但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或者矿物油。
除了上述组分，本发明的药物组合物还可以包括：润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮液和防腐剂。
本发明的药物组合物可以肠胃外给药，例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或局部给药。本发明的药物组合物可以腹膜内给药以治疗卵巢癌，并且经注射给药至门静脉内以治疗肝癌，并且可以直接注射到肿瘤块中以治疗乳腺癌，通过灌肠直接注射以治疗结肠癌，并直接地注入导管以治疗膀胱癌。
本发明的药物组合物的合适剂量可根据因素诸如制备方法、给药方法、患者年龄、患者体重和性别、疾病症状严重程度、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和反应灵敏度而变化，并且熟练的普通医生可以轻易地确定和规定所期望的治疗的有效剂量。通常，本发明的药物组合物包含1×105至1×1015pfu/ml的重组腺病毒，并且通常每两天注射1×108至1×1013pfu并持续两周。
本发明的药物组合物可以在根据本领域普通技术人员可以轻易实施的方法使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制之后通过单位剂量包装或多剂量包装来制备。在此本发明的药物组合物的剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液、提取物、粉末、颗粒剂、片剂或胶囊，并且本发明的药物组合物还可包括分散剂或稳定剂。
本发明的药物组合物可以单独使用或与其他常规化学或放射疗法组合使用，并且这种组合疗法可以更有效地用于癌症治疗。可与本发明组合物一起使用的化学治疗剂包括吉西他滨、索拉非尼、顺铂、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亚硝基脲、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉酚、反式铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶，长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤。可与本发明的组合物一起使用的放射疗法包括X射线辐射和γ射线辐射。
根据本发明的另外一个示例性实施例，本发明的组合物改善肿瘤凋亡、免疫活性和免疫原性。
另外，本发明提供一种抗肿瘤组合物，该抗肿瘤组合物包括抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
所有针对抗肿瘤组合物的描述也可以应用于或者在经过必要修改之后应用于本发明的基因群和/或抗肿瘤组合物。
特别地，制备本发明的组合物以通过将shTGF-β和/或shHSP引入一个或者多个基因递送系统中来共表达抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和/或抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
另外，本发明提供一种抗肿瘤组合物，该抗肿瘤组合物包括GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
所有针对抗肿瘤组合物的描述也可以应用于或者在经过必要修改之后应用于本发明的基因群和/或抗肿瘤组合物。
特别地，制备本发明的组合物以通过将GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL基因、shTGF-β和/或shHSP引入一个或者多个基因递送系统来共表达GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和/或抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
另外，本发明提供一种腺病毒，所述基因递送系统被引入该腺病毒中。
在本发明中，作为可用于转移RNAi的核苷酸分子的病毒(病毒载体)有腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和AAV，并且在这些病毒中，由于在诸如肿瘤中对临时诱导表达的需求，优选腺病毒。
另外，本发明包括一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括将治疗有效量的基因递送系统(2种型或者4种型)给药至对象，该基因递送系统包括抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)，或者GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL融合基因；抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。
另外，本发明包括一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括将治疗有效量的抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)给药至对象。
另外，本发明包括一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括将治疗有效量的GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)给药至对象。
所有针对治疗肿瘤方法的描述也可以应用于或者在经过必要修改之后应用于本发明的基因群和/或抗肿瘤组合物。
在此所使用的术语“对象”是指作为治疗、观察或者实验的目标的哺乳动物，并且优选为人。
在此所使用的术语“治疗有效量”为活性成分或者药物组合物在被研究人员、兽医、医生或其他临床医生所考虑的组织系统、动物或人类中诱导了生物学或医学反应的量，并且包括诱导减轻待治疗的疾病或病症症状的量。对于本领域普通技术人员显而易见的是，本发明活性成分的治疗有效量和给药频率将根据所需效果而变化。因此，本领域普通技术人员可以轻易确定待给药的最佳用量，并且最佳用量的范围根据疾病类型、疾病严重程度、活性成分和组合物中含有的其他成分的含量、剂型的类型、患者的体重、年龄、性别和健康状况、饮食、给药时间、给药方法、和排泄率。在本发明的治疗方法中，该组合物包含1x105至1x1015pfu/ml的重组腺病毒，并且通常每两天以1×108至1×1013pfu持续两周给药。
在本发明的治疗方法中，本发明的抗肿瘤组合物可以根据需要的方法而口服或肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部地)给药。
下文将参考本发明的实施例进一步地描述本发明，但是，本发明的范围不限于下面的实施例。
[实施例]
参考例1：制备GM-CSF基因
小鼠GM-CSF基因从欧萨利文博士(Dr.Gerald C.O’Sullivan)(科克癌症研究中心，Mercy大学医院和Leslie C.Quick Jnr.实验室，科克大学，科克，爱尔兰；Cork CancerResearch Centre,Mercy University Hospital and Leslie C.Quick Jnr.Laboratory,University College Cork,Cork,Ireland)处获得，并且其碱基序列Cancer Gene Therapy(2006)13,1061-10710中公开了其碱基序列，且该碱基序列由SEQ ID NO:1表示。
人GM-CSF基因从InvivoGen获得，其碱基序列与基因库M11220所示，且由SEQ IDNO:2表示。
申请号为2015-0044507的韩国专利申请中所使用的基因序列是指SEQ ID NO:2所示的碱基序列，与基因库M11220中实际所示的789bp碱基序列中的33至467bp对应。
制备例1：用于表达GM-CSF的腺病毒(复制缺陷型：dl324-GM-CSF，有复制能力的：dl324-3484-CMVp-△E1B-GM-CSF)的构建
以与专利号为2015-0044507的韩国专利中公开的制备例1相同的方式，并且使用专利号为2015-0044507的韩国专利中公开的同样的基因构建表达GM-CSF的腺病毒。
参考例2：Flt3L-TRAIL融合基因的制备
人Flt3L-TRAIL基因通过使用亮氨酸拉链将编码FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)的氨基酸1至181的基因和编码肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的氨基酸95至281的基因融合来制备而成，并且由SEQ ID NO:3表示，如基因库U03858(Flt3L)和基因库B032722或者U57059(TRAIL)中所示。
在Flt3L-TRAIL融合基因的情况，由于人型基因在小鼠中也具有活性，因此，使用了人Flt3L-TRAIL融合基因而不单独地构建小鼠Flt3L-TRAIL融合基因。
制备例2：载有Flt3L-TRAIL融合基因(Flt3L-TRAIL)的溶瘤腺病毒(dl324-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL)的构建
通过将FETZ(Flt3L-TRAIL融合基因；Flt 3L仅以可溶形式形成，并且TRAIL仅由细胞外结构域如95-281区组成，两者通过异亮氨酸拉链连接)转移到用Sal/BamHI剪切的Adlox载体来制备Adlox-FETZ(Flt3L-TRAIL)，所述FETZ通过用Sal/BamHI处理pFETZ来制备(Flt3L-TRAIL；Regression of human mammary adenocarcinoma by systemicadministration of a recombinant gene encoding the hFlex-TRAIL fusion proteinby Xiaofeng Wu et al.,Molecular Therapy vol.3 368-374,2001)(图4A)。
用BamHI剪切Adlox-FLT3L-TRAIL，并用NotI剪切pIRES，使其平齐化。
随后，用SalI剪切每个末端，然后连接。通过用XbaI和MfeI剪切先前获得的产物以鉴定插入物，来证实Flt3L-TRAIL的插入(图4B)。然后，为了将Flt3L-TRAIL基因插入pVAX1-3484-CMVp-△E1B(-E1R)穿梭载体(相同载体pVAX1-3484-CMVp-△E1B-E1R如申请号为2015-0044507的韩国专利申请图5中所示)。用SalI剪切pVAX1-3484-CMVp-△E1B(-E1R)，并且用FspI剪切pIRES-FLT3L-TRAIL，从而使载体平齐化。同样地，用BglII切割后，将从pIRES-Flt3L TRAIL切割下的Flt3L-TRAIL亚克隆到穿梭载体中。图4C通过用PmeI剪切显示插入物的存在。
为了产生病毒，用Bsp1191剪切病毒骨架dl324-BstBI，将所构建的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-FLT3L-TRAIL用PmeI线性化，并用于转化大肠杆菌BJ5183，从而产生同源重组DNA。结果，使用HindIII图谱和PacI剪切证实重组(图4D)。
通过如上所述的同源重组构建腺病毒dl324-3484-CMVp-△E1B-FLT3L-TRAIL。
参考例3：抑制TGF-β1表达的shRNA基因(shTGFβ1)的制备
如未审查的韩国专利申请公开第2013-0012095号所公开，制备由SEQ ID NO:4或5表示的抑制TGF-β1表达的shRNA(下文中称为shTGF-β1)。
在鼠shRNA的情况下，shTGF-β1由SEQ ID NO:4表示，在人shRNA的情况下，shTGF-β1由SEQ ID NO:5表示。
参考例4：抑制TGF-β2表达的shRNA基因(shTGFβ2)的制备
如未审查的韩国专利申请公开第2013-0088792号所公开，制备由SEQ ID NO:6或7表示的抑制TGF-β2表达的shRNA(下文称为shTGF-β2)。
在鼠shRNA的情况下，shTGF-β2由SEQ ID NO:6表示，在人shRNA的情况下，shTGF-β2由SEQ ID NO:7表示。
制备例3：载有shTGF-β的溶瘤腺病毒(dl324-3484-CMVp-△E1B-U6-shTGFβ1、dl324-3484-CMVp-△E1B-U6-shTGFβ2)的构建
基于未审查的韩国专利申请公开第2013-0088792号和第2013-0012095号，为了产生病毒，用Bsp1191剪切病毒骨架dl324-BstBI-U6-shTGF-β(β1或β2)，将pVAX1-3484-CMVp-△E1B用PmeI线性化，并用于转化大肠杆菌BJ5183，从而产生同源重组DNA。结果，使用HindIII图谱和PacI剪切证实重组(图5A和5B)
通过如上所述的同源重组来构建腺病毒dl324-3484-CMVp-△E1B-U6-shTGFβ1或dl324-3484-CMVp-△E1B-U6-shTGFβ2。
参考例5：抑制HSP27表达的shRNA基因(shHSP27)的制备
如韩国未审查专利申请公开第2013-0123244号所公开，制备由SEQ ID NO:9表示的抑制HSP27表达的shRNA(下文中称为shHSP27)。
制备例4：载有shHSP27的溶瘤腺病毒(dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP27)的构建
基于未审查的韩国专利申请公开第2013-0123244号，为了产生病毒，用Bsp1191剪切病毒骨架dl324-BstBI-H1-shHSP27，将pVAX1-3484-CMVp-△E1B用PmeI线性化，并用于转化大肠杆菌BJ5183，从而产生同源重组DNA。结果，使用HindIII图谱和PacI剪切证实重组(图6)。
通过如上所述的同源重组来构建腺病毒dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP27。
参考例6：抑制HSP25表达的shRNA基因(shHSP25)的制备
制备由SEQ ID NO:8表示的抑制HSP25表达的shRNA(shHSP25)。
为了制备抑制鼠HSP25表达的有效shHSP25，制备用于靶向shRNA候选物的三个碱基序列。
鼠靶序列：5’-gctac atctc tcggt gcttc a-3’
1.有义5’-GATCC gcctc ttcga tcaag ctttc g TCTC c gaaag cttga tcgaagaggc TTTT A-3’
反义5’-AGCTT AAAA gcctc ttcga tcaag ctttc g GAGA c gaaag cttga tcgaagaggc G-3’
2.有义5’-GATCC gctac atctc tcggt gcttc a TCTC t gaagc accga gagatgtagc TTTT A-3’
反义5’-AGCTT AAAA gctac atctc tcggt gcttc a GAGA t gaagc accga gagatgtagc G-3’
3.有义5’-GATCC ggaga tcacc attcc ggtta c TCTC g taacc ggaat ggtgatctcc TTTT A-3’
反义5’-AGCTT AAAA ggaga tcacc attcc ggtta c GAGA g taacc ggaat ggtgatctcc G-3’
对于pSP72△E3-H1-shHSP25亚克隆，用BamHI/HindIII剪切pSP72ΔE3-H1-hshTGFβ2(参考在韩国专利第2015-0044507号中公开的制备例5)，然后与三种退火shHSP25连接。为了证实来自如上所述获得的pSP72ΔE3-H1-mshHSP25-1、pSP72ΔE3-H1-mshHSP25-2或pSP72ΔE3-H1-mshHSP25-3的HSP25shRNA效果，用三种shHSP25转染BNL-HSP25细胞系以证实降低HSP25表达的效果(图7)，所述BNL-HSP25细胞系通过将HSP25稳定转染到BNL鼠肝细胞癌细胞系(BNL 1ME A.7R.1)中来获得。
制备例5：载有shHSP25的溶瘤腺病毒(dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP25)的构建
将如参考例5中所示的显示降低效果的pSP72△E3-H1-shHSP25-2或pSP72△E3-H1-shHSP25-3与dl324-IX进行同源重组。为了同源重组成dl324-IX-shHSP25-2，用DrdI剪切pSP72-shHSP25-2穿梭载体，用SpeI剪切骨架DNA dl324-IX以线性化，然后通过BJ5183转化来获得克隆，并使用HindIII图谱和PacI剪切来选择得到的片段(图8)。另一方面，为了同源重组成dl324-IX-shHSP25-3，用XmnI剪切pSP72-shHSP25-3穿梭载体，用SpeI剪切骨架DNA dl324-IX以线性化，然后通过BJ5183转化来获得克隆，并使用HindIII图谱和PacI剪切来选择得到的片段(图9)。从如上所述获得的构建体中表达HSP25shRNA的每种腺病毒证实降低表达的效果(图10)。因此，为了随后构建鼠shRNA HSP25，使用shHSP25-2序列[SEQ IDNO：8]。
制备例6：GM-CSF和Flt3L-TRAIL可复制型腺病毒(dl324-3484-CMVp-△E1B-GM-CSF-IRES-FLT3L-TRAIL)的构建
构建同时表达GM-CSF和FLT3L-TRAIL的有肿瘤选择性复制能力型腺病毒。
1)同时表达GM-CSF和Flt3L-TRAIL的载体的构建
①人
将GM-CSF基因插入到pIRES(Clontech)的多克隆位点(MCS)A中，并且将Flt3L-TRAIL基因插入MCS B中。
为了将人GM-CSF基因亚克隆到pIRES的MCS A位点，制备用于PCR的引物。制备在5'末端具有XhoI位点的5'-CCG CTCGAG ATGTGGCTGC AGAGCCTGCT G-3作为有义链'，制备在5'末端具有MluI的5'-CCGACGCGTTCACTCCTGGACTGGCTCCCA-3'作为反义链。使用pORF-GMCSF作为PCR模板，在以下条件下进行30个循环的PCR：95℃下2分钟(初始变性)；95℃下1分钟(变性)；55℃下1分钟(退火)；72℃下1分钟(延伸)。另外，最后的延伸在72℃下进行5分钟。
为了将人flt3-L-TRAIL基因亚克隆到pIRES的MCS B位点，用SalI/SmaII剪切pIRES-hGM-CSF，用SalI/SmaI剪切Adlox-Flt3L-TRAIL，然后将剪切的Flt3L-TRAIL插入中并与pIRES-GM-CSF连接，从而获得pIRES-GMCSF-Flt3L-TRAIL。
通过将hFlex-TRAIL(Flt3L-TRAIL融合基因：SEQ ID NO:3)转移到用Sal/BamHI切割的Adlox载体来制备Adlox-FLT3L-TRAIL，所述hFlex-TRAIL通过用SalI/BamHI剪切pFETZ(Flt3L-TRAIL；Regression of human mammary adenocarcinoma by systemicadministration of a recombinant gene encoding the hFlex-TRAIL fusion protein,Molecular Therapy vol.3 368-374,2001)来获得。
用SalI/HpaI剪切插入的flt3-L-TRAIL，将得到的片段插入泳道2和泳道3(图11)。
②小鼠
为了将鼠GM-CSF基因亚克隆到pIRES的MCS A位点，制备用于PCR的引物。制备在5'末端具有XhoI位点的5’-CCG CTCGAG ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCT-3’作为有义链，制备在5'末端具有MluI的5’-CCGACGCGT TCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGCA-3’作为反义链。使用pCA14-mGM-CSF作为PCR模板，在以下条件下进行30个循环的PCR：95℃下2分钟(初始变性)；95℃下1分钟(变性)；在55℃下1分钟(退火)；72℃下1分钟(延伸)。另外，最后的延伸在72℃下进行5分钟。
除了用鼠GM-CSF基因替换人GM-CSF基因，实验程序与过程①相同，而且因为人Flt3-L-TRAIL融合基因可以应用于小鼠，所以使用人Flt3-L-TRAIL融合基因。
2)制备GM-CSF和Flt3L-TRAIL插入的穿梭载体
根据下文进行克隆至溶瘤穿梭载体。
用于人类和小鼠的两种载体均通过相同的方法构建。
将pIRES-GM-CSF-Flt3L-TRAIL用FspI剪切(平齐化)，然后用BglII剪切，从而获得hGM-CSF(或mGM-CSF)和Flt3-L-TRAIL。将pVAX1-3484-CMVp-ΔE1B-E1R用SalI处理以平齐化，然后用BglII处理，然后与Bgl II和Fsp I片段连接。
用PmeI剪切亚克隆产物来证实具有两种不同大小的DNA片段，最终获得pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF(人或小鼠)-IRES-FLT3L-TRAIL(图12)。然后，通过与dl324-BstBI的同源重组，获得dl324-3484-CMVp-△E1B-人GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL或dl324-3484-CMVp-△E1B-鼠GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL(图13)。
3)表达GM-CSF和Flt3L-TRAIL的有肿瘤选择性复制能力型腺病毒的构建(对于人 和小鼠都相同)
为了产生病毒，用Bsp1191剪切病毒骨架DNA dl324-BstBI，将pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-FLT3L-TRAIL用PmeI线性化，然后插入到大肠杆菌BJ5183以转化，从而产生同源重组DNA。结果，使用HindIII图谱和PacI剪切证实成功重组(图13)。
为了证实表达了人GM-CSF和FLT3L-TRAIL蛋白，通过用病毒以不同的MOI感染DU-145人前列腺癌细胞来测量释放到培养基中的GM-CSF和TRAIL，24小时后，在更换培养基后，在新鲜无血清培养基中培养细胞1天。结果，进行ELISA证实GM-CSF和TRAIL正常表达(图15A)。
同样地，为了证实表达了鼠GM-CSF和FLT3L-TRAIL蛋白，通过用病毒以不同的MOI感染鼠肝细胞癌细胞(BNL)测定衍生的BNL-CAR-E1B55-HSP25细胞来测量释放到培养基中的GM-CSF和TRAIL，24小时后，在更换培养基后，在新鲜无血清培养基中培养细胞1天。结果，进行ELISA以证实GM-CSF和TRAIL正常表达(图15A)，并进行蛋白质免疫印迹以证实Flt3L表达(图16B)。
随后，对DU-145进行蛋白质免疫印迹以证实存在于病毒中的Flt3-L-TRAIL的TRAIL是否保持着凋亡功能。结果可以看出，由于增加的MOI(50MOI)显示高水平的PARP剪切，因而适当显示凋亡功能(图16A)。
将从已经证实同源重组的细菌克隆获得的DNA用PacI剪切，并引入293A细胞系(293人胚肾细胞系的亚克隆)以进行转染，从而产生腺病毒。使用Qbiogene(Carlsbad,CA,USA)开发的标准空斑测定试剂盒来分析纯化的腺病毒以估计滴度，所述纯化的腺病毒通过在293细胞系中增殖并根据CsCl浓度梯度通过超速离心和透析来分离而获得。最终的病毒滴度为1×1012至5×1012。
制备例7：同时表达shTGFβ和shHSP27的复制缺陷型腺病毒(人)(dl324-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1和dl324-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27)的构建
1)pSP72△E3-U6-shTGFβ1的构建
在pSP72△E3-U6-sh-阴性的U6启动子和poly A之间进行BamHI和HindIII剪切(与未审查的韩国专利申请第2013-0012095号中公开的实施例2中所描述的pSP72/△E3/si-阴性载体相同)，然后
上游链(5’-gatcc GCCAGAAATACAGCAACAATTCCTG tctctcCAGGAATTGTTGCTGTATTTCTGGT tttttt a-3’)和
下游链(5’-agctt aaaaaa ACCAGAAATACAGCAACAATTCCTG gagagaCAGGAATTGTTGCTGTATTTCTGGT g-3’)通过退火进行连接，从而构建pSP72△E3-U6-shTGFβ1(参照在未审查的韩国专利申请公开第2013-0012095号中公开的实施例1和2)。
2)pSP72△E3-U6-shTGFβ2的构建
在pSP72△E3-U6-sh-阴性的U6启动子和poly A之间进行BamHI和HindIII切割，然后
上游链(5’-gatcc GGATTGAGCTATATCAGATTCTCAA tctcTTGAGAATCTGATATAGCTCAATCC tttt a-3’)和
下游链(5’-agctt aaaa GGATTGAGCTATATCAGATTCTCAA gagaTTGAGAATCTGATATAGCTCAATCC g-3’)通过退火进行连接，由此构建pSP72△E3-U6-shTGFβ2(参照在未审查的韩国专利申请公开第2013-0088792号中公开的实施例2和图2)。
3)pSP72△E3-H1-shHSP27的构建
将韩国专利申请第2015-0044507号中公开的制备例5的pSP72△E3-H1-shTGFβ2用BamH/HindIII剪切，然后
上游链(5’-gatcc gacgagcatggctacatctcccggt tctcaccgggagatgtagccatgctcgtc tttttt a-3’)和
下游链(5’-agctt aaaa gacgagcatggctacatctcccggtgagaaccgggagatgtagccatgctcgtc g-3’)通过退火进行连接，由此构建pSP72△E3-H1-shHSP27(参照未审查的韩国专利申请公开第2013-0123244号中公开的实施例1和2)。
4)pSP72△E3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27和pSP72△E3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1穿 梭载体的构建
通过用HindIII使pSP72△E3-U6-shTGFβ2平齐化，用KpnI处理去除SV40poly A位点，用SphI使pSP72△E3-H1-shHSP27平齐化，通过KpnI处理去除H1启动子-shHSP27-SV40poly A，以及连接H1启动子-shHSP27-SV40 poly A与HindIII(平齐的)/KpnI处理的pSP72△E3-U6-shTGFβ2，构建pSP72△E3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27穿梭载体。
在另一方面，通过用HindIII使pSP72△E3-H1-shHSP27平齐化，通过KpnI处理去除SV40 poly A位点，用SphI使pSP72△E3-H1-shTGFβ1平齐化，用KpnI处理去除U6启动子-shTGF-β1-SV40 poly A，以及连接U6启动子-shTGF-β1-SV40 poly A与HindIII(平齐的)/KpnI处理的pSP72△E3-H1-shHSP27，构建pSP72△E3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1穿梭载体。
图17中示出了构建pSP72△E3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27或pSP72△E3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1的过程。
进行完整的pSP72-ΔE3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27和dl324-IX骨架的同源重组。在此，通过用XmnI剪切作为穿梭载体的pSP72-ΔE3-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27并用SpeI剪切骨架dl324-IX来进行同源重组(图18)。以如上所述的相同的方式，进行pSP72-ΔE3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1和dl324-IX骨架的同源重组。在此，通过用XmnI剪切作为穿梭载体的pSP72-ΔE3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1并用SpeI剪切骨架dl324-IX来进行同源重组(图19)。
将从已经鉴定同源重组的细菌克隆获得的DNA用PacI剪切，并引入293A细胞系(293人胚肾细胞系的亚克隆)中以进行转染，从而产生腺病毒。使用Qbiogene(Carlsbad,CA,USA)开发的标准空斑测定试剂盒来分析纯化的腺病毒以估计滴度，所述纯化的腺病毒通过在293细胞系中增殖并根据CsCl浓度梯度通过超速离心和透析来分离而获得。最终的病毒滴度为1×1010至5×1011。
制备例8：同时表达shTGFβ和shHSP25的复制缺陷型腺病毒(小鼠)(dl324-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1和dl324-U6-mshTGFβ2-H1-shHSP25)的构建
1)pSP72△E3-U6-鼠shTGFβ1的构建
除了用鼠shTGFβ1代替人shTGFβ1以外，通过与制备例7中1)所描述的相同的方法构建载体。
2)pSP72△E3-U6-鼠shTGFβ2的构建
除了用鼠shTGFβ2代替人shTGFβ2以外，通过与制备例7中2)所描述的相同的方法构建载体。
3)pSP72△E3-H1-shHSP25的构建
除了用鼠HSP25代替人shHSP275以外，通过与制备例7中3)所描述的相同的方法构建载体。
4)pSP72△E3-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1的亚克隆
通过用HindIII剪切pSP72△E3-U6鼠shTGFβ1和用SphI剪切pSP72ΔE3-H1-shHSP25，进行平齐化。另外，通过用KpnI剪切得到的产物并连接该切割产物，获得pSP72△E3-H1-mshHSP25-U6-mshTGFβ1(图24A)。
进行完整的pSP72-ΔE3-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1和dl324-IX骨架的同源重组。在此，通过用XmnI剪切作为穿梭载体的pSP72-ΔE3-H1-mshHSP25-U6-mshTGFβ1和用SpeI剪切骨架dl324-IX来进行同源重组(图24B)。
通过上述的同源重组，构建dl324-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1。
通过如上所述的相同的方法，进行pSP72-ΔE3-U6-mTGFβ2-H1-mHSP25和dl324-IX骨架的同源重组。在此，通过用XmnI剪切作为穿梭载体的pSP72-ΔE3-U6-TGFβ2-H1-HSP25和用SpeI剪切骨架dl324-IX来进行同源重组。
通过上述的同源重组，构建dl324-U6-mshTGFβ2-H1-shHSP25。
制备例9：同时表达shTGFβ和shHSP27的溶瘤腺病毒(人)(dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1和dl324-3484-CMVp-△E1B-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27)的构建
如下进行溶瘤腺病毒的构建。
首先，进行dl324-BstBI和pSP72△E3-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1的同源重组(图20)以及dl324-BstBI和pSP72ΔE3-U6-shTGFβ2-H1-HSP27的同源重组(图21)。
其次，在dl324-BstBI-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1(图20)或dl324-BstBI-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27(图21)与作为E1穿梭载体的pVAX1-3484-CMVp-△E1B之间再次进行同源重组，从而构建dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1(图22)或dl324-3484-CMVp-△E1B-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27(图23)。用PmeI剪切作为E1穿梭载体的pVAX1-3484-CMVp-△E1B以线性化，并且用Bsp1191剪切作为骨架DNA的dl324-BstBI-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1或dl324-BstBI-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27以线性化，然后针对通过用两种线性化DNA转化BJ5183获得的克隆，通过HindIII图谱和PacI剪切，由约2kb的带鉴定出同源重组DNA。
通过上述的同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1或dl324-3484-CMVp-△E1B-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27。
制备例10：同时表达shTGFβ1和shHSP25的溶瘤腺病毒(小鼠)(dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1)的构建
构建表达鼠型shRNA的肿瘤选择性腺病毒的dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1同源重组过程如下。
通过用XmnI剪切作为穿梭载体的制备例8中获得的pSP72ΔE3-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1并且用SpeI剪切骨架dl324-BstBI来进行同源重组，从而构建dl324-BstBI-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1(图25A)。然后，通过用PmeI剪切作为穿梭载体的pVAX1-3484-CMVp-△E1B和用Bsp1191剪切骨架dl324-BstBI-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1来进行同源重组，从而构建dl324-3484-CMVp-△E1B-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1(图25B)。
制备例11：载有GM-CSF、Flt3L-TRAIL和shTGF-β1的溶瘤腺病毒(人)(dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-FLT3L-TRAIL-U6-shTGF-β1)的构建
为了产生病毒，通过将制备例7中描述的pSP72△E3-U6-shTGFβ1与dl324-BstBI同源重组来获得病毒骨架dl324-BstBI-U6-shTGF-β1。通过用Bsp1191剪切dl324-BstBI-U6-shTGF-β1并用PmeI将制备例6中获得的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL线性化，经大肠杆菌BJ5183转化诱导同源重组。结果，用HindIII图谱和PacI剪切证实重组(图26)。
通过上述的同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL-U6-shTGF-β1。
制备例12：载有mGM-CSF、Flt3L-TRAIL和mshTGF-β1的溶瘤腺病毒(小鼠)(dl324-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL-U6-mshTGF-β1)的构建
为了产生病毒，通过将制备例8中描述的pSP72△E3-U6-mshTGFβ1与dl324-BstBI同源重组来获得病毒骨架dl324-BstBI-U6-mshTGF-β1。为了对由此获得的dl324-BstBI-U6-mshTGF-β1与制备例6中获得的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL进行同源重组，用PmeI剪切作为穿梭载体的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL(图12B)，并且用Bsp1191剪切骨架dl324-BstBI-U6-mshTGFβ1(图27)。
通过上述同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-FLT3L-TRAIL-U6-mshTGF-β1。
制备例13：载有mGM-CSF、FLT3L-TRAIL和shHSP27的溶瘤腺病毒(人)(dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL-H1-shHSP27)的构建
为了产生病毒，通过将制备例7中描述的pSP72△E3-H1-shHSP27与dl324-BstBI同源重组来获得病毒骨架dl324-BstBI-H1-shHSP27。通过用Bsp1191剪切由此获得的dl324-BstBI-H1-shHSP27并用PmeI将制备例6中获得的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL线性化，经大肠杆菌BJ5183转化诱导同源重组。结果，用HindIII图谱和PacI剪切证实了泳道1、2和3中的成功重组(图28)。
通过上述同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-FLT3L-TRAIL-H1-shHSP27。
制备例14：载有GMCSF、FLT3L-TRAIL和shHSP25的溶瘤腺病毒(小鼠)(dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-FLT3L-TRAIL-H1-shHSP25)的构建
为了产生病毒，通过将制备例8中描述的pSP72△E3-H1-shHSP25与dl324-BstBI同源重组来获得病毒骨架dl324-BstBI-H1-shHSP25。用Bsp1191剪切由此获得的dl324-BstBI-H1-shHSP25，为了与制备例6中获得的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL同源重组，用PmeI剪切作为穿梭载体的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL，并且用Bsp1191切割骨架dl324-BstBI-mshHSP25(图29)。
通过上述同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL-H1-shHSP25。
制备例15：载有GM-CSF、shHSP27和shTGF-β溶瘤腺病毒(人)(dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1和dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27)的构建
通过将插入物亚克隆到pVAX1-3484-CMVp-△E1B来构建pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF，所述插入物通过用BglII使pCA14-GMCSF平齐化并用SalI进行剪切来制备，所述pVAX1-3484-CMVp-△E1B通过用EcoRI剪切并用SalI进行剪切来平齐化(参考韩国专利第2015-0044507号中公开的制备例1)。
在通过用PmeI剪切使作为E1穿梭载体的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF线性化，并通过用Bsp1191剪切制备例9中的获得的作为骨架DNA的dl324-BstBI-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1之后，通过选择经BJ5183转化获得的克隆使用HindIII图谱和PacI剪切来鉴定同源重组成dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1(图30)。
在通过用PmeI剪切割使作为E1穿梭载体的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-hGMCSF线性化，并通过用Bsp1191剪切制备例9中的获得的作为骨架DNA的dl324-BstBI-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27之后，通过选择经BJ5183转化获得的克隆使用HindIII图谱和PacI切割来鉴定同源重组成dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27(图31)。
制备例16：载有GM-CSF、shHSP25和shTGF-β1的溶瘤腺病毒(小鼠)(dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1)的构建
在通过用PmeI剪切使作为E1穿梭载体的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF(在制备例1的基础上参考韩国专利第2015-0044507号)线性化，并通过用Bsp1191剪切使骨架DNAdl324-BstBI-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1线性化之后，通过选择经BJ5183转化获得的克隆使用HindIII图谱和PacI剪切来鉴定同源重组成dl324-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-shHSP25-mshTGFβ1(图32)，所述骨架DNA dl324-BstBI-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1通过制备例8中获得的pSP72-ΔE3-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1与dl324-BstBI同源重组而获得。
通过上述同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1。
制备例17：载有Flt3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP27的溶瘤腺病毒(人)(dl324-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1和dl324-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27)的构建
将制备例2中获得的穿梭载体(pVAX1-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL)与制备例9中获得的骨架dl324-BstB1-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1或dl324-BstB1-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27进行同源重组(图33和34)。
将从经鉴定同源重组的细菌克隆获得的DNA用PacI剪切，并引入293A细胞系(293人胚肾细胞系的亚克隆)中以进行转染，从而产生腺病毒。使用Qbiogene(Carlsbad,CA,USA)开发的标准空斑测定试剂盒来分析纯化的腺病毒以估计滴度，所述纯化的腺病毒通过在293细胞系中增殖并根据CsCl浓度梯度通过超速离心和透析来分离而获得。最终的病毒滴度为1×1012至5×1012。
制备例18：载有Flt3L-TRAIL、shHSP25和shTGF-β1的溶瘤腺病毒(小鼠)(dl324-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1)的构建
为了产生病毒，通过用Bsp1191剪切骨架DNAdl324-BstBI-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1(制备例9)并且用PmeI使制备例2中获得的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-Flt3L-TRAIL线性化，经大肠杆菌BJ5183转化产生同源重组，所述骨架DNAdl324-BstBI-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1通过作为病毒骨架的pSP72-ΔE3-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1(制备例8)与dl324-BstBI同源重组而获得。结果，用HindIII图谱和PacI剪切证实重组(图35)。
通过上述同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-FLT3L-TRAIL-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1。
制备例19：载有GM-CSF、Flt3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP27的溶瘤腺病毒(人)(dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-FLT3L-TRAIL-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1和dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27)的构建
通过实施例9中获得的dl324-BstBI-ΔE3-U6-TGF-β2-H1-HSP27或dl324-BstBI-ΔE3-H1-HSP27-U6-TGF-β1与制备例6中获得的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL的同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL-U6-shTGFβ2-H1-shHSP27(YSC-01)(图36和38)或dl324-3484-CMV-△E1B-GMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL-H1-shHSP27-U6-shTGFβ1(YSC-02)(图37和39)。
将从经证实同源重组的细菌克隆获得的DNA用PacI剪切，并引入293A细胞系(293人胚肾细胞系的亚克隆)以转染，从而产生腺病毒。使用Qbiogene(Carlsbad,CA,USA)开发的标准空斑测定试剂盒来分析纯化的腺病毒以估计滴度，所述纯化的腺病毒通过在293细胞系中增殖并根据CsCl浓度梯度通过超速离心和透析来分离而获得。最终的病毒滴度为1×1012至5×1012。
制备例20：载有GM-CSF、Flt3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP25的溶瘤腺病毒(小鼠)(dl324-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-Flt3L-TRAIL-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1)的构建
为了使制备例10中获得的dl324-BstBI-H1-mshHSP25-U6-mshTGFβ1和制备例6中获得的pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-Flt3L-TRAIL同源重组，用PmeI剪切穿梭载体pVAX1-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-Flt3L-TRAIL，并用Bsp1191剪切骨架DNA dl324-BstBI-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1，然后证实重组(图40和41)。
通过上述同源重组，构建dl324-3484-CMVp-△E1B-mGMCSF-IRES-FLT3L-TRAIL-H1-shHSP25-U6-mshTGFβ1。
实施例1：shTGF-β和shHSP27各自表达或均表达的有肿瘤选择性复制能力型病毒对裸鼠的体内抗肿瘤效果
将1×107个细胞/100μl的人MDAMB-231-Her2细胞系的细胞注射入腹壁，当肿瘤大小达到60mm3时，每两天三次(1×109pfu/50μl)经瘤内注射感染腺病毒(对照组：对照病毒、溶瘤NC、制备例3中的溶瘤shTGF-β1的一种型以及制备例4中的溶瘤shHSP27的一种型)、制备例7中的两种型(shTGF-β1+shHSP27)中的每一种。每个实验组使用6只小鼠。
结果，制备例7中注入两种基因的溶瘤腺病毒/shTGF-β1+shHSP27显示最优越的抗肿瘤效果(图42)。
实施例2：根据TGF-β同型的存活潜力的比较
在胰腺癌细胞系MiaPaCa-2、HPAC、BxPC3、AsPc-1和Capan-1，肝细胞癌细胞系SK-Hep1和Huh7，肺癌细胞系A549，前列腺癌细胞系DU-145，黑色素瘤细胞系A375，胶质瘤细胞系U251N，或乳腺癌细胞系MDAMB231中，将过表达Her2的细胞系以每孔2×105个细胞铺布到6孔板中，以100MOI感染缺陷型腺病毒/阴性对照(NC)、制备例3的腺病毒/shTGF-β1、或腺病毒/shTGF-β2，两天后，使细胞脱落并以1×105个细胞/孔的密度分配到6个孔中，然后培养基每两天用含5％FBS的培养基更换。10天后，移除培养基，将细胞用4％多聚甲醛固定，并用结晶紫染色，以观察细胞。
结果，在大多数癌细胞系中，因TGF-β1降低所导致的存活率降低的效果优于因TGF-β2降低所导致的存活率降低的效果并且在除了Capan-1之外的大多数胰腺癌细胞系中，降低TGF-β的效果相对微弱(图43)。研究降低细胞存活率的效果与存活相关信号及p38和HSP27磷酸化的结果是，存活率显著降低，而p38和HSP27磷酸化升高(图44)。另外，特别地，降低TGF-β1的效果也是由胞内ROS的过量分泌而导致的，从而导致细胞死亡(图45)，并且酶的磷酸化参与了细胞存活，例如pp65或pStat3会随着TGF-β的减少而降低(图44)。
实施例3：两种型基因递送系统对不同类型癌细胞系的效果的证实
为了检测除了shTGF-β1之外，shHSP27是否是MDAMB231-Her2所需要的，用缺陷型腺病毒/阴性对照(NC)、制备例3中的一种型(腺病毒/shTGF-β1)、或制备例7中的两种型(腺病毒/shTGFβ1-shHSP27)以100MOI感染细胞，然后进行蛋白质免疫印迹。
结果，没有发生Akt磷酸化的降低，除此之外，pSTAT3、pSrcHE和pEGFR均进一步降低(图46)，当仅HSP27降低时，参与癌症进展的N-钙粘素、β-连环素、stat3、波形蛋白和Akt显著降低(图47)。另外，TGF-β1或TGF-β2和HSP27同时降低使得参与进展的蛋白质的降低效果进一步最大化(图48)。通过克隆形成实验，比较通过单一降低TGF-β1或TGF-β2或通过同时降低TGF-β1或TGF-β2/HSP27来降低存活率的效果，结果显示通过同时降低两种物质显著降低存活率(图49)。
实施例4：三种型基因递送系统(在实施例3中增加了TRAIL)对各种类型的癌细胞系的效果的证实
一个特别的事件是，通过TRAIL增加细胞毒性的可能性提高，使得当TGF-β和HSP27同时降低时，TRAIL受体如DR4和DR5增加，而有助于TRAIL抗性的CDK9则降低。图50支持这种可能性。实际上，在TGF-β/HSP27减少和TRAIL表达的情况下，证实了存活相关信号进一步降低(图51)。
实施例5：YSC-01和YSC-02上载有的四种基因的插入和表达的证实
通过对病毒DNA测序，由YSC-01和YSC-02的病毒DNA证实四种外源基因正常插入到病毒中(图52)。
将胰腺癌细胞HPACs和MiaPaCa-2在6孔板中以每孔1×105个细胞接种，以100MOI用Ad-4384-NC(阴性对照溶瘤腺病毒)感染，同时分别以5、10、50或100MOI用YSC-01和YSC-02中的每种感染，随后培养2天，然后在最后24小时里，测量已分泌到无血清培养基中的GM-CSF和TRAIL的水平。通过ELISA证实了GM-CSF、TRAIL和TGF-β1的分泌，通过实时PCR证实了TGF-β2的mRNA降低，并且通过蛋白质免疫印迹证实在Flt3L-TRAIL中Flt3L表达和HSP27表达降低(图53)。通过在6孔板中以每孔1×105个细胞分配细胞，用Ad-3484-NC以100MOI和用YSC-01以5、10、50或100MOI感染细胞，并且在感染两天后分离RNA，进行实时PCR(RT-PCR)。用以证实对人TGF-β2的抑制的RT PCR引物是作为正向引物的5’-GCTGCCTACGTCCACTTTACAT-3’和作为反向引物的5’-ATATAAGCTCAGGACCCTGCTG-3’。使用ABpower SYBR Green RNA-to-Ct 1step试剂盒，通过将0.2μL的RT酶混合物(125×)、12.5μL的RT-PCR混合物(2×)、0.5μL的正向引物(100pM)、0.5μL的反向引物(100pM)、5μL的RNA(10ng/μL)和6.3μL的无核酸酶水混合成25μL的总体积，在以下反应条件下重复40个循环进行RT PCR：95℃酶激活10分钟；95℃变性15秒；60℃退火/延伸1分钟。
实施例6：通过针对Ad-3484-GM-CSF-Flt3LTRAIL、YSC-01和YSC-02的克隆形成实验证实体外肿瘤选择性抗癌活性
对包括p53突变型的一些细胞系(如MDA-MB231-Her2、MiaPaCa-2、A549、Huh7和DU145)、p53正常型癌细胞系(如A375和HPAC)、正常细胞系(如胰腺正常细胞和chang)进行克隆形成实验，以证实存活率。
对于实验，每种细胞系以4×105个细胞铺布在60mm皿中，第二天以1MOI的Ad-3484-NC(阴性对照，溶瘤腺病毒)、1MOI的制备例6中的Ad-3484-GM-CSF-Flt3L-TRAIL、或1MOI的制备例19的Ad3484-GM-CSF-Flt3L-TRAIL-shTGFβ2-shHSP27(YSC-01)感染。将培养基更换为含有5％FBS的DMEM。次日，将细胞以每孔1×105个细胞分配到6孔板中，在每两天更换培养基的同时，培养直到克隆形成。在克隆形成的适当时间点(10天内)，移除培养基，细胞通过4％多聚甲醛处理在室温下固定15分钟，用0.05％结晶紫染色1小时，然后用水洗涤，而后观察到克隆被染成紫色。结果是，通过克隆形成实验证实与制备例6中描述的表达GMCSF-Flt3L-TRAIL的溶瘤腺病毒相比，在p53正常型细胞系以及p53突变型细胞系中YSC-01和YSC-02进一步降低存活潜力(图54A)。然而，由于在正常细胞中没有降低存活潜力的效果，证实也存在肿瘤选择性(图54B)。为了证实这些实验结果，进行蛋白质免疫印迹，结果，与正常细胞系相比，无论p53类型如何，存活相关信号的降低，以及与TRAIL敏感性相关的信号的提高(DR4和DR5)或降低(CDK9)证实了YSC-02的溶瘤潜力(图55A和55B)。此外，肝细胞癌细胞系和胰腺癌细胞系的一些类型(MiaPaCa-2)的溶瘤实验的结果，证实YSC-02诱导的溶瘤活性优于比YSC-01诱导的溶瘤活性(图56)。
实施例7：在裸鼠体内共表达四种基因的肿瘤选择性腺病毒诱导的抗肿瘤效果
将8×106个细胞/100μL的MiaPaCa-2细胞系细胞注射入腹壁，然后当肿瘤大小达到60mm3时，每两天三次(1x109pfu/50μL)经瘤内注射感染腺病毒(阴性对照组：Ad-3484-NC)、制备例6中的两种型(Ad-3484-GM-CSF-Flt3L-TRAIL)、制备例19中的四种型(Ad-3484-GM-CSF-Flt3L-TRAIL-shTGFβ2-shHSP27(YSC-01)和Ad-3484-GM-CSF-Flt3L-TRAIL-shHSP27-shTGFβ1(YSC-02))中的每种。每个实验组使用6只小鼠。
结果，制备例19中的四基因插入的YSC-02显示出最高的抗肿瘤效果，制备例19中的YSC-01显示出第二高的抗肿瘤效果(图57A)。另外，在YSC-02的情况下，小鼠的存活率也是最高的(图57B)。
实施例8：在具有体内免疫力的小鼠中由共表达四种基因的肿瘤选择性腺病毒诱导的抗肿瘤效果的证实
为了比较鼠型YSC-02与数个比较组的抗肿瘤作用，制备了免疫活性小鼠模型。也就是说，构建了能够在免疫活性小鼠(Balb/c)中感染和复制腺病毒的鼠肝细胞癌细胞系(BNL-CAR-E1B55K-HSP25)。
为此，首先对BNL 1ME A.7R.1(BNL)鼠肝细胞癌细胞系在43℃下热激4小时，并在37℃下培养细胞24小时，然后进行实验以证实HSP25和HSP27的表达。之后，提取mRNA以合成cDNA，用PCR引物进行PCR以测量大小，然后克隆。本文使用的引物包括小鼠HSP25有义：(BamHI)5’-cgc ggatcc atg acc gag cgc cgc gtg cc-3’和反义：(XhoI)5’-ccg ctcgagctacttggctccagactgtt-3’。将克隆的DNA片段用BamHI/XhoI剪切并插入到用BamHI/XhoI剪切的pCDNA3.1中，从而获得pcDNA3.1-HSP25。用pcDNA3.1-HSP25转染BNL细胞，然后使用潮霉素B(250μg/ml)进行选择，以获得表达HSP25的克隆。为了产生表达E1B55KD或CAR的反转录病毒，使用pLNCX载体。对于E1B55KD克隆，加入HpaI和ClaI酶切位点，可以通过PCR从pcDNA3.1-E1B55KD中提取E1B55KD，然后插入pLNCX载体中。对于CAR克隆，加入HindIII和ClaI酶切位点，可以通过PCR从pCDNA3.1-CAR中提取CAR，并插入pLNCX载体中。用表达CAR或E1B55KD的反转录病毒共感染选择出的BNL-HSP25细胞，然后用G418(1mg/ml)来选择，从而得到BNL-CAR-E1b55KD-HSP25细胞系(图58)。
将1×107个细胞/100μl的BNL-CAR-E1B55KD-HSP25细胞系注射入腹壁，当肿瘤大小达到60mm3时，每两天三次(1x109pfu/50μl)经瘤内注射感染腺病毒(阴性对照组：Ad-3484-NC)、制备例1中的一种型(Ad-3484-mGM-CSF)、制备例2中的一种型(Ad-3484-Flt3L-TRAIL)、制备例6中的两种型(Ad-3484-mGMCSF-Flt3L-TRAIL)、制备例12和制备例14中的三种型(Ad-3484-mGMCSF-Flt3L-TRAIL-shHSP25和Ad-3484-mGMCSF-Flt3L-TRAIL-mshTGFβ1)、制备例20中的四种型(Ad-3484-mGMCSF-Flt3L-TRAIL-shHSP25-mshTGFβ1)以及未审查的韩国专利申请公开第2015-0044507号中公开的作为比较性对照组的制备例9中的鼠型溶瘤病毒4m(GMCSF+DCN+shFoxp3+shTGFβ2)[本文以下简称GX-03]。每个实验组使用6只小鼠。
结果，包括4种基因的鼠型YSC-02显示出最高的抗肿瘤效果，具有包含TGF-β1shRNA的三种基因的腺病毒显示出高于GX-03的第二高的抗肿瘤效果。GX-03显示出比其它三种更低的抗肿瘤效果。因此，证明了YSC-02明显优于GX-03。另外，YSC-02显示出大大高于GX-03以及单独的GM-CSF或单独的Flt3L-TRAIL的抗肿瘤效果(图59)，并且与GX以及单独的shTGF-β或shHSP27和shTGFβ-shHSP27复合体相比，显示出相对非常高的在体外减少凋亡的效果和存活潜力(图60)。最重要的是，在图55中，与包括GX-03的若干类比较性病毒相比，在YSC-02感染中，在分离脾细胞后，T细胞活性总体增加(图61)，但是Treg细胞没有增加(图62)，并且浸润到肿瘤组织的DC明显增加(图63)。
<110> 延世大学校 产学协力团
<120> 包含GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物
<130> X16U18C0265
<150> KR 10-2015-0173858
<151> 2015-12-08
<160> 9
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 432
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
cccacccgct cacccatcac tgtcacccgg ccttggaagc atgtagaggc catcaaagaa 120
gccctgaacc tcctggatga catgcctgtc acgttgaatg aagaggtaga agtcgtctct 180
aacgagttct ccttcaagaa gctaacatgt gtgcagaccc gcctgaagat attcgagcag 240
ggtctacggg gcaatttcac caaactcaag ggcgccttga acatgacagc cagctactac 300
cagacatact gccccccaac tccggaaacg gactgtgaaa cacaagttac cacctatgcg 360
gatttcatag acagccttaa aacctttctg actgatatcc cctttgaatg caaaaaacca 420
ggccaaaaat ga 432
<210> 2
<211> 435
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120
cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
ccagtccagg agtga 435
<210> 3
<211> 1221
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flt3L.TRAIL fusion gene
<400> 3
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agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac 120
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gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt 360
cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg 420
ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc 480
gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca 540
gccccggcta gcagaatgaa gcagatcgag gacaaaattg aggaaatcct gtccaaaatt 600
taccacatcg agaacgagat cgcccggatt aagaaactca ttggcgagag ggaattcacc 660
tctgaggaaa ccatttctac agttcaagaa aagcaacaaa atatttctcc cctagtgaga 720
gaaagaggtc ctcagagagt agcagctcac ataactggga ccagaggaag aagcaacaca 780
ttgtcttctc caaactccaa gaatgaaaag gctctgggcc gcaaaataaa ctcctgggaa 840
tcatcaagga gtgggcattc attcctgagc aacttgcact tgaggaatgg tgaactggtc 900
atccatgaaa aagggtttta ctacatctat tcccaaacat actttcgatt tcaggaggaa 960
ataaaagaaa acacaaagaa cgacaaacaa atggtccaat atatttacaa atacacaagt 1020
tatcctgacc ctatattgtt gatgaaaagt gctagaaata gttgttggtc taaagatgca 1080
gaatatggac tctattccat ctatcaaggg ggaatatttg agcttaagga aaatgacaga 1140
atttttgttt ctgtaacaaa tgagcacttg atagacatgg accatgaagc cagttttttc 1200
ggggcctttt tagttggcta a 1221
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse shTGF-beta1
<400> 4
ccctctacaa ccaacacaac ccgggtctcc ccgggttgtg ttggttgtag aggg 54
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> human shTGF-beta1
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accagaaata cagcaacaat tcctguctct ccaggaattg ttgctggtat ttctggttt 59
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<223> mouse shTGF-beta2
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ggattgaact gtatcagatc cttaatctct taaggatctg atacagttca atcc 54
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<223> human shTGF-beta2
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ggattgagct atatcagatt ctcaatctct tgagaatctg atatagctca atcc 54
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<223> shHSP25
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<212> DNA
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<223> shHSP27
<400> 9
gatccgacga gcatggctac atctcccggt tctcaccggg agatgtagcc atgctcgtct 60
60
Claims (7)
1.用于共表达粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、Flt3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP的基因递送系统，所述基因递送系统包括：
GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL融合基因；抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)；
其中所述GM-CSF基因由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2表示；
其中所述Flt3L-TRAIL融合基因由SEQ ID NO：3表示；
其中所述shTGF-β是shTGF-β1或shTGF-β2；
其中所述shTGF-β1由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5表示，且所述shTGF-β2由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7表示；
其中所述shHSP是shHSP25或shHSP27；和
其中所述shHSP25由SEQ ID NO：8表示且其中所述shHSP27由SEQ ID NO：9表示。
2.权利要求1所述的基因递送系统，其特征在于，所述基因递送系统是质粒、重组腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、脂质体或类脂囊泡。
3.权利要求2的基因递送系统，其特征在于，所述基因递送系统是重组腺病毒载体。
4.用于肿瘤治疗的药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的基因递送系统。
5.用于肿瘤治疗的药物组合物，包含：GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL融合基因；抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)；
其中所述GM-CSF基因由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2表示；
其中所述Flt3L-TRAIL融合基因由SEQ ID NO：3表示；
其中所述shTGF-β是shTGF-β1或shTGF-β2；
其中所述shTGF-β1由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5表示，且所述shTGF-β2由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7表示；
其中所述shHSP是shHSP25或shHSP27；和
其中所述shHSP25由SEQ ID NO：8表示且其中所述shHSP27由SEQ ID NO：9表示。
6.权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物改善免疫活性和免疫原性。
7.权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述基因或shRNA由一种或多种基因递送系统引入。
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