KR101713407B1

KR101713407B1 - 아데노바이러스 감염 및 복제가 가능한 흑색종 세포주

Info

Publication number: KR101713407B1
Application number: KR1020150044519A
Authority: KR
Inventors: 송재진; 김주항; 강수진
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2015-03-30
Publication date: 2017-03-07
Also published as: KR20150113906A; KR20150113908A; KR101713873B1

Abstract

본 발명은 아데노바이러스 감염 및 복제가 가능한 흑색종 마우스 세포주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 흑색종 세포주는 아데노바이러스를 이용한 암 유전자 치료 마우스 모델로서의 기준이 될 것으로 기대된다.

Description

아데노바이러스 감염 및 복제가 가능한 흑색종 세포주{Melanoma cell line capable of adenoviral infection and replication}

본 발명은 아데노바이러스 감염 및 복제가 가능한 흑색종 마우스 세포주에 관한 것이다.

마우스 세포주에 대해서 아데노바이러스의 복제는 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 있다[비특허문헌 1,2]. 현재 아데노바이러스를 이용한 유전자 치료에 사용되는 대부분의 연구들은 면역결핍된 마우스에 사람의 종양세포를 이종 이식하는 형태로 이루어지고 있다[비특허문헌 3]. 이러한 접근방식은 면역결핍된 마우스는 숙주의 면역반응을 대표하지 못하며 아데노바이러스 투여 시 이미 존재하는 면역성이 결여되어 있거나 혹은 면역유전자를 탑재하는 아데노바이러스 벡터의 효력을 검증할 수 ?侍募? 근본적인 단점이 존재한다.

이에 대한 대안으로 최근에는 시리아 햄스터를 이용한 동물 종양 모델이 종양 아데노바이러스(oncolytic adenoviruss) 벡터를 이용한 유전자 치료 관련 연구에 사용되고 있다[비특허문헌 3~5].

그러나 현재까지 확립된 햄스터 세포주가 많음에도 불구하고 햄스터 특이적인 시약(reagent)들의 개발이 많이 부족한 실정이다. 그 결과, 면역능이 있는 마우스모델을 이용하여 사람의 아데노바이러스 벡터 시험하는 것이 현재까지 확립되고 있지 못하였다.

Blair, G.E. et al., Virus Res 14 (1989) 339-346 Ying, B et al., Cancer Gene Ther 16 (2009) 625-637 Thomas, M.A. et al., Methods Mol Med 130 (2007) 169-183 Dhar, D. et al., Methods Mol Biol 797 (2012) 53-63 Wold, W.S. et al., Adv Cancer Res 115 (2012) 69-92.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 아데노바이러스에 대한 감염능을 높임과 동시에 바이러스의 복제능을 부여하는데 필수적인 역할을 하는 유전자들의 동정과 동시발현 기술을 이용하여 흑색종 마우스 세포주를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 아데노바이러스 감염 및 복제가 가능한 흑색종 세포주를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 아데노바이러스 감염 및 복제가 가능한 흑색종 세포주를 제공한다.

본 발명은 재조합된 마우스 흑색종 세포를 사용하여 면역능이 있는 흑색종 마우스 모델에서 사람의 종양 아데노바이러스(oncolytic adenovirus)가 효과적으로 감염 및 복제가 증가하는 것을 관찰하고 실험적으로 이를 증명하였다. 이를 위하여 먼저 흑색종 세포주에 인간 유래의 CAR (Coxsackievirus and adenovirus receptor)와 아데노바이러스의 E1B55kD를 도입시켜 새로운 형태의 세포주를 제작하고 GFP 발현하는 아데노바이러스에 의해 감염율이 증가하고 종양살상형 아데노바이러스를 사용하여 바이러스 생산이 증가한 것을 확인하여 복제 향상을 확인하였다.

본 발명과 같이, 흑색종 세포주에 CAR와 E11B55KD의 도입에 의한 감염율과 복제율이 획기적으로 증가한 것은 간암, 폐암, 췌장암 및 유방암 등을 비롯한 다른 암종에 적용 확대할 수 있는 길이 열리게 된 것이다. 이는 지금까지 아데노바이러스를 이용한 유전자 치료에서 in vivo 모델에 주로 사용되어온 면역결핍 마우스를 대체할 수 있으므로 면역관련 유전자를 탑재한 아데노바이러스의 면역증강요소에 의한 항종양 효과 등을 매우 real하게 측정할 수 있다. 또한, 본 발명은 아데노바이러스를 이용한 암 유전자 치료 마우스모델로서의 기준이 될 것이며 multi-targets 유전자들의 효능확인 결과는 임상적용 가능성을 동물모델에서 정확히 예측하게 되는 첫 시발점이 될 것이다.

도 1은 클로닝된 CAR의 pDrive 도입 후 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 pDrive 클로닝 벡터 및 293A로부터 CAR 유전자가 증폭된 것이 pDrive 클로닝벡터에 삽입된 것을 제한효소로 잘라 CAR 유전자(화살표)가 삽입된 것을 나타낸 것이다
도 3은 pcDNA3.1 hygro의 HindIII/BamHI 부위에 CAR가 도입된 것을 확인한 것이고(좌), pcDNA3.1 hygro에 제한효소 HindIII/BamHI으로 double digestion하여 CAR 유전자가 도입된 것을 확인한 것이다(우).
도 4는 CAR의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 것이다[1~6:CAR가 발현되는 세포주 클론들을 선별하여 발현 수준을 조사].
도 5는 마우스 흑색종 세포주인 B16F10와 B16F10-CAR에서 각각 아데노바이러스의 감염율을 확인한 것이다.
도 6은 마우스 흑색종 세포주인 B16BL6와 B16BL6-CAR에서 각각 아데노바이러스의 감염율을 확인한 것이다.
도 7은 pIRES-CAR 벡터를 나타낸 것이다.
도 8은 pIRES-CAR 벡터의 서브클로닝(Subcloning) 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 클로닝된 CAR의 pIRES 도입 후 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 pIRES-CAR에 E1B55kDa가 삽입된 것을 PCR로 확인한 것이다
도 11은 pIRES-CAR에 삽입된 E1B55kD 염기서얼 분석 결과를 나타낸 것이다
도 12는 CAR와 E1B55KD PCR 산물이 제한효소 절단 후 pIRES에 삽입된 모식도이다.
도 13은 CAR와 E1B55kD가 동시에 발현되는 B16BL6 세포주 및 CAR만 발현되는 세포주의 바이러스 복제를 확인한 것이다.
도 14는 CAR와 E1B55kD가 동시에 발현되는 B16BL6 세포주에서 E1B55kD의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 것이다.
도 15는 바이러스 복제에 의한 세포용혈 현상을 확인한 것이다.

상기 흑색종 마우스 세포주는 CAR와 E1B55kD를 동시에 발현하는 것에 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 흑색종 마우스 세포주를 B16BL6/CAR-E1B55KD로 명명하였으며, 이를 한국세포주연구재단에 2014년 3월 27일자로 기탁하여 기탁번호 KCLRF-BP-00313를 부여받았다.

본 발명자들은 인간 아데노바이러스가 마우스 세포로의 감염능이 현저히 떨어지는 점을 감안하여, 감염능 및 복제율이 향상된 마우스 종양 세포주를 개발하였다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: B16BL6/ CAR - E1B55KD 흑색종 세포주[ KCLRF - BP00313 ] 제조

인간 아데노바이러스는 마우스 세포로의 감염능이 현저히 떨어진다는 점이다[Virus Res. 14: 339 by Blair et al., 1989]. 이에 감염능이 향상된 마우스 세포주를 제작하기 위하여 CAR(Coxsackievirus and adenovirus receptor)를 발현하는 pcDNA3.1 hygro 구조체를 제작하였다.

293A(Life technologies : R705-07)로부터 RNA를 추출하고 역전사 효소(reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 제작하였다.

CAR[서열번호 1]에 대한 프라이머(센스 프라이머: 5'-atggc gctcc tgctg tgcttc-3' [서열번호 6], 안티센스 프라이머: 5'-ctata ctata gaccc atccttg-3' [서열번호 7])를 사용하여 PCR을 실시하였다.

예열: 95℃ 5 min,

변성: 95℃ 30sec, 어닐링: 55℃ 30sec, 신장: 72℃ 1min 30 sec-> 34 cycles

최종 신장: 72℃ 5min.

PCR 산물[서열번호 2]을 Qiagen 클로닝 벡터인 pDrive(Qiagen, Valencia, CA, USA) 클로닝 벡터에 연결하였다(도 2).

그 다음 pcDNA3.1 hygro(Invitrogen, USA)에 서브클로닝은 5'-HindIII, 3'-BamHI으로 실시하여 pcDNA3.1 hygro/CAR 구조체를 얻었다(도 3). CAR의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 확인하고[도 4], 마우스 흑색종 세포주인 B16F10-CAR와 B16BL6-CAR 각각에서 B16F10과 B16BL6 보다 아데노바이러스의 감염율이 향상되었다(도 5 및 도 6).

CAR와 E1B55KDa를 동시에 발현하는 구조체(construct)의 제작은 pIRES 벡터(Clontech, USA)를 이용하였다.

CAR의 pIRES로의 도입은 앞서 언급한 cDNA를 주형(template)으로 하여 5'에 NheI, 3'에 EcoRI 부위를 넣은 프라이머를 제작하였다. 센스 프라이머: 5'-ATA GCT AGC ATG GCG CTC CTG CTG TGC TT 3' [서열번호 8], 안티센스 프라이머: 5'-GCG CGA ATT CCT ATA CTA TAG ACC CAT CC 3' [서열번호 9]으로 앞의 PCR 조건과 동일하게 실시하였다. 생성된 PCR 산물[서열번호 3]과 pIRES 벡터를 NheI, EcoRI로 잘라 연결하여 pIRES-CAR 벡터를 제작하였다[도 7]. 클로닝 결과는 도 8과 같으며, CAR 유전자가 레인 3과 6에서 제대로 서브클로닝됨을 알 수 있었다. 도 9는 pIRES에 들어간 CAR DNA 염기서열을 분석한 것이다.

상기 벡터와 별도로 E1B55KD을 클로닝하였다.

pBSKII-3484(Strategene)에 포함되어 있는 E1B55KDa 이용하였다.

E1B55KDa 역시 제한효소 부위(enzyme site)를 넣은 프라이머를 가지고 PCR을 실시하였다. 5'에는 SalI, 3'에는 NotI 인식염기서열을 삽입하였다. 즉, 센스 프라이머는 5' ACT GTC GAC ATG GAG CGA AGA AAC CCA TC 3' [서열번호 10]이고, 안티센스 프라이머는 5' ATA GCG GCC GCT CAA TCT GTA TCT TCA TCG 3' [서열번호 11]을 사용하여 앞서 사용한 PCR 조건과 동일하게 PCR을 실시한 후, PCR 산물[서열번호 5]과 pIRES-CAR 벡터를 SalI, NotI로 잘라 연결하였다 (pIRES-CAR-E1B55KD)[도 12]. 서브클로닝(Subcloning) 결과는 기술한 PCR 프라이머를 사용하여 PCR하여 삽입 여부를 확인하였다. 도 10에서 보듯이 1번을 제외한 나머지 전부 삽입된 것을 관찰하였다. 여기서, P는 pcDNA3-E1B55kD로서 양성 대조군(positive control)을 의미한다.

도 12는 CAR와 E1B55KD의 PCR 산물을 제한효소로 잘라 pIRES에 삽입한 모식도를 나타낸다.

CAR와 E1B55kD가 동시에 발현되는 B16BL6 세포주는 G418로 선별한 클론들 중에서 바이러스 생성량이 많은 클론 5번 세포주를 사용하여 복제율 증가실험을 실시하였다. 이 경우, CAR만 발현되는 B16BL6 세포주에 비해 약 100배 가량 바이러스 복제가 증가되는 것을 바이러스 감염 2일 후에 배지 및 세포 내에 있는 감염능이 있는 바이러스의 titration을 조사함으로써 확인하였다(도 13). B16BL6 세포주에서 E1B55kD가 발현되는 것을 E1B55kD에 대한 E1B55KD 단백질의 N-말단에서 유래한 25 mer 길이의 합성펩타이드 MERRNPSERGVPAGFSGHASVESGC [서열번호 12]로부터 E1B55kD에 대한 다클론항체(polyclonal antibody)를 제작하여 발현되는 것을 웨스턴 실험으로 확인하였다 (도 14).

뿐만 아니라 바이러스 복제에 의한 세포용혈 현상이 CAR와 E1B55kD가 동시에 발현되고 있는 세포주에서 매우 효과적으로 일어나고 있음을 관찰하였다 (세포주 #5번과 #9, 특히 #5번 세포주에서, 도 15의 좌측 도면). 이러한 현상은 우선적으로 아데노바이러스가 CAR가 발현되는 B16BL6에 매우 효과적으로 감염이 증가된 결과라는 것을 의미한다. 이의 확인을 위하여 GFP를 발현하는 종양선택적 복제가능 아데노바이러스(oncolytic adenovirus)를 MOI별로 감염시킨 후 2일이 지난 후에 B16BL6-CAR-E1B55KD에서의 감염율과 세포 용혈 현상을 조사하였다. 그 결과 MOI가 증가할수록 감염율은 증가하였으며 세포 용혈도 MOI가 증가할수록 증가하였다 (도 15의 우측 도면).

상기 #5번 세포주를 한국세포주연구재단에 2014년 3월 27일자로 기탁하여 기탁번호 KCLRF-BP-00313를 부여받았다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00313

20140327

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Melanoma cell line capable of adenoviral infection and replication <130> P15U18C0335 <150> KR 10-2014-0037835 <151> 2014-03-31 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1098 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 atggcgctcc tgctgtgctt cgtgctcctg tgcggagtag tggatttcgc cagaagtttg 60 agtatcacta ctcctgaaga gatgattgaa aaagccaaag gggaaactgc ctatctgccg 120 tgcaaattta cgcttagtcc cgaagaccag ggaccgctgg acatcgagtg gctgatatca 180 ccagctgata atcagaaggt ggatcaagtg attattttat attctggaga caaaatttat 240 gatgactact atccagatct gaaaggccga gtacatttta cgagtaatga tctcaaatct 300 ggtgatgcat caataaatgt aacgaattta caactgtcag atattggcac atatcagtgc 360 aaagtgaaaa aagctcctgg tgttgcaaat aagaagattc atctggtagt tcttgttaag 420 ccttcaggtg cgagatgtta cgttgatgga tctgaagaaa ttggaagtga ctttaagata 480 aaatgtgaac caaaagaagg ttcacttcca ttacagtatg agtggcaaaa attgtctgac 540 tcacagaaaa tgcccacttc atggttagca gaaatgactt catctgttat atctgtaaaa 600 aatgcctctt 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Claims

삭제
CAR(Coxsackievirus and Adenovirus Receptor)와 E1B55kD를 동시에 발현하며, 아데노바이러스 감염 및 복제가 가능한 흑색종 마우스 세포주.
제 2 항에 있어서,
B16BL6/CAR-E1B55KD로 명명된 흑색종 세포주[KCLRF-BP-00313].