JPWO2013018778A1 - ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている改変型核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞、当該細胞の製造方法、および当該核酸構築物 - Google Patents

ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている改変型核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞、当該細胞の製造方法、および当該核酸構築物 Download PDF

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Abstract

本発明の細胞は、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる細胞であって、核酸構築物が、ＷＴ１遺伝子産物の所望の断片をコードしている領域、および機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる。本発明によれば、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片の発現量を顕著に向上させた核酸構築物が導入された細胞を提供し得る。

Description

本発明は、ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物、ならびに当該核酸構築物が導入されており、当該産物またはその断片の発現量が顕著に増強されている細胞に関する。
これまでに知られているＮＫＴ細胞の抗腫瘍効果としては、腫瘍に対する直接効果および樹状細胞の成熟化を介した間接効果（アジュバント効果）が挙げられる。以前より、ＮＫＴ細胞を利用した免疫療法として、腫瘍抗原を提示させた樹状細胞を投与する免疫療法が知られており、当該免疫療法の臨床応用に関する検討が重ねられている（非特許文献１〜７）。また、腫瘍抗原をコードしているｍＲＮＡが導入されている樹状細胞を利用する抗原特異的な免疫療法は、既に確立されており、臨床応用されている（非特許文献８〜１５）。これらの免疫療法において、利用する細胞材料に免疫誘導用の抗原を導入する手法として、発現ベクターなどを使用することが簡便である。しかし、発現ベクターを細胞に導入した場合には、遺伝子治療とみなされ得るために、規制などを考慮すると利用範囲を狭めるおそれがある。そこで、樹状細胞に対してＲＮＡを導入する方法が考えられるが、ＲＮＡ導入効率、および樹状細胞における腫瘍抗原の発現量の低さが問題であるため、アジュバントとの組合せによって、これらの免疫療法の治療効果の改善が試みられている。
また、腫瘍に対する他の免疫療法としては、ウィルムス腫瘍遺伝子（Wilms tumor 1：ＷＴ１）によってコードされているＷＴ１タンパク質に含まれている複数のエピトープを利用したペプチド療法が挙げられる。
一方で、本発明者らも独自の免疫療法をこれまでに開発している（特許文献１および２など）。特許文献１に開示されているのは、ＮＫＴ細胞のリガンドを提示しているＣＤ１ｄが細胞表面に存在している、患者から単離された異常な細胞およびこれらの製造方法である（特許文献１）。当該細胞は、ＮＫＴ細胞の活性化および腫瘍特異的なＴ細胞免疫応答の両者を誘導可能である。特許文献２に開示されているのは、ＮＫＴ細胞のリガンドを提示しているＣＤ１ｄが細胞表面に存在しており、疾患特異的な抗原を発現している、患者由来の細胞ではないアロ細胞およびこれらの製造方法である。当該細胞は、特許文献１に記載の細胞と同種の免疫誘導能を、患者から単離することなく示し得る。これらの免疫療法は、白血病等の様々な抗腫瘍免疫療法などへの応用が期待されている。
国際公開公報「ＷＯ２００７／０９７３７０号（２００７年８月３０日公開）」 国際公開公報「ＷＯ２０１０／０６１９３０号（２０１０年６月３日公開）」
Nat. Immunol. 3, 867-874(2002). J. Immunol. Meth. 272, 147-159(2003). J. Exp. Med. 198, 267-279(2003). J. Exp. Med. 199, 1607-1618(2004). J. Immunol. 167, 3114-3122(2001). Int. J. Cancer 109, 402-11(2004). J. Immunol. 171, 5140-5147(2003). J. Clin. Invest. 114, 1800-11(2004). J. Exp. Med. 184:465-472(1996). Nat. Med. 2:1122-1128(1996). Nat. Med. 6:1011-1017(2000). J. Clin. Invest. 109:409-417(2002). J. Immunol. 174:3798-3807(2005). Br. J. Cancer 93:749-756(2005). Cancer Gene Ther. 13:905-918(2006).
本発明者らの開発した免疫療法では、従来と同様にアジュバントとの組合せによって治療効果の改善を図り得るが、投与される細胞自体が患者の免疫系による攻撃対象であるため、腫瘍抗原タンパク質の発現量の向上が免疫誘導の効率化に大きく寄与し得ることが見出された。腫瘍抗原タンパク質の発現量は、導入するＲＮＡの量を増加させることによって向上する。この場合の発現量の向上はＲＮＡの導入量と概ね比例する。しかし、細胞に導入可能なＲＮＡの総量には限界がある。よって、例えば、他のＲＮＡ（ＣＤ１ｄをコードしているＲＮＡなど）をさらに細胞に導入する場合、腫瘍抗原タンパク質の発現量を所望の程度に向上させ得ないことが考えられる。このため、導入するＲＮＡの量を可能な限り抑えつつも顕著に高い発現量を達成させることが望ましい。
本発明者らによって見出された上述の課題に鑑みて、本発明の目的は、腫瘍特異的な抗原タンパク質としてＷＴ１タンパク質を選択した場合に、発現ベクターなどに含まれている発現調節エレメントに依存せずに、ＷＴ１タンパク質の細胞における発現量を顕著に上昇させることである。すなわち、本願の目的は、ＷＴ１に由来するポリペプチドの発現量がＤＮＡ非依存的に向上している改変型のＷＴ１核酸構築物を含んでいる細胞、および当該細胞に導入するための改変型のＷＴ１核酸構築物を提供することである。
本発明者らは、公知の配列を有しているＷＴ１の核酸配列に変異を導入することによって、ＷＴ１に由来するポリペプチドの発現量が予想を遥かに超えて増強されることを見出した。かかる発現量の顕著な増強は、これまでの改変型のＷＴ１では知られていない。本発明者らは、これらの知見に基づいて研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。
ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞であって、上記核酸構築物は、配列番号１の１９４位から４９３位、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、および当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる、免疫治療用細胞。
本発明は、発現ベクターなどに含まれている発現調節エレメントに依存せずに、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片の発現量を顕著に向上させた核酸構築物が導入されている免疫治療用細胞、および当該核酸構築物を提供できるという効果を奏する。これらは遺伝子治療に依存しない、効果的な免疫療法に利用され得る。
本発明の核酸構築物からのタンパク質の発現量について試験した結果を示す図である。
〔本発明の免疫治療用細胞〕
本発明は、ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞（以下、単に本発明の細胞と記載）を提供する。上記核酸構築物は、配列番号１の１９４位から４９３位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、ならびに当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる。
上記核酸構築物は、後述する〔本発明の核酸構築物〕の項に説明するように、任意の細胞に導入されることによって、ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片の顕著に増強された発現を示す。したがって、本発明の免疫治療用細胞を用いれば、わずかな数の投与によって、大量または必要量のタンパク質を所望の生体に投与し得る。
本発明の細胞は、腫瘍抗原を提示させている樹状細胞の投与を包含している免疫療法を目的とする、投与対象である生体に由来する樹状細胞であり得る。樹状細胞を使用する免疫療法については種々の公知文献を参照すればよいので、本明細書では詳細な説明を省略する。
よってここでは、本発明の細胞として特に好ましい細胞について詳述する。当該細胞は、本発明者らによって開発された免疫療法（国際公開第２００７／０９７３７０号および国際公開第２０１０／０６１９３０号を参照）を目的として、ＣＤ１ｄをコードしているｍＲＮＡをさらに含んでいる。また、当該細胞は、ＮＫＴ細胞の抗原受容体によって認識される糖脂質が、細胞表面に存在する当該ＣＤ１ｄと結合していることが好ましい。本発明の細胞の表面にあるＣＤ１ｄによって上記糖脂質が提示されているので、当該細胞が生体に投与されると、ＮＫＴ細胞によって本発明の細胞は効率的に傷害を受ける。この傷害によって、本発明の核酸構築物から発現されたＷＴ１遺伝子産物またはその断片がペプチド断片に処理される。例えば、周辺の樹状細胞が当該ペプチド断片を取り込むと、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子とともに当該ペプチド断片をＴ細胞に提示し、Ｔ細胞が活性化される。これと同時に、本発明の細胞を傷害したＮＫＴ細胞は、上記ペプチド断片を取込んだ樹状細胞によって活性化される。つまり、本発明の細胞の投与によって、自然免疫および腫瘍特異的な抗原ペプチドに依存する獲得免疫が生じる。このようにして、本発明の細胞は、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片を大量に発現しているので、腫瘍に対する生体の免疫能を効率的に向上させ得る。
ＣＤ１ｄは、上述のように糖脂質を提示するＭＨＣ様分子である。ＣＤ１ｄは、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）および特定の組織（例えば腸管、肝臓）における上皮細胞、ならびに一部の腫瘍細胞（例えば固形腫瘍細胞、白血病細胞）およびウイルス感染細胞において発現している。
ＮＫＴ細胞の抗原受容体によって認識される糖脂質の例としては、α−ＧａｌＣｅｒ（α−ｇａｌａｃｔｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、α−Ｃ−ＧａｌＣｅｒ（α−Ｃ−ｇａｌａｃｔｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ｉＧＢ３（ｉｓｏｇｌｏｂｏｔｒｉｈｅｘｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ＧＤ３（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ３）、ＧＳＬ−１（α−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、およびＧＳＬ−１’ＳＡ（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられる。これらのうちα−ＧａｌＣｅｒまたはα−Ｃ−ＧａｌＣｅｒが好ましい。
また、本発明の細胞は樹立細胞系であることが好ましい。樹立細胞系は、生体から得られた細胞などと比べて増殖効率および遺伝子の導入効率が高く、安定して大量の細胞を調製することが可能である。樹立細胞系は哺乳類に由来する細胞であり得る。ヒトに対する臨床応用という観点から、ヒトの特に正常細胞に由来する細胞が好ましい。なお、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ）に対する用途には、投与対象の動物種に由来する細胞を使用し得るし、ヒトに対する用途と同様にヒト由来の細胞を使用し得る。
〔本発明の核酸構築物〕
また、本発明は、ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている、発現量が向上された核酸構築物を提供する。当該核酸構築物は、上述のように、配列番号１の１９４位から４９３位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、ならびに当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる。
本明細書に使用されるとき、“ウィルムス腫瘍遺伝子産物”または“その断片”という用語は、ウィルムス腫瘍遺伝子（Wilms tumor 1：ＷＴ１）にコードされている野生体のタンパク質と同じアミノ酸配列によって示されるポリペプチド（以下、野生体と同じポリペプチドと記載）、野生体のタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列によって示されるポリペプチド（以下、野生体と類似のポリペプチドと記載）、または腫瘍特異的な抗原ペプチドとして知られているＷＴ１由来のペプチドを含んでいるポリペプチド（以下、腫瘍特異的なポリペプチドと記載）を意味している。
ここで、野生体と同じポリペプチドは、公知のＷＴ１遺伝子のｃＤＮＡにコードされているポリペプチドである。ＷＴ１遺伝子には種々のバリアントが存在している。当該バリアントのうち最も全長の長いポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは配列番号３の配列（GenBnak# NM_024426）によって示される。この配列によって示されるものはＷＴ１のバリアントＤとして知られている。現在のところＷＴ１にはバリアントＡ〜Ｄ（Ａ：GenBank# NM 000378、Ｂ：GenBank# NM 024424、Ｃ：GenBank# NM 024425、Ｄ：GanBank# NM 024426）が存在することが知られている。本明細書において、野生体と同じポリペプチドは、例えば種々のバリアントと比較したときに見られる置換、欠失または付加が、配列番号３の配列の対応する箇所に対して任意に導入されている配列に示されるポリヌクレオチドにコードされているポリペプチドを意味している。なお、ＷＴ１遺伝子は長さの異なる２つのタンパク質を発現することが知られている。よって、野生体と同じポリペプチドは、上述のようなバリアントに見られる変異ありまたはなしの、長さの異なる２つのタンパク質と同じアミノ酸配列によって示されるものを包含している。
またここで、野生体と類似のポリペプチドは、野生体と同じポリペプチドのアミノ酸配列について比較したとき、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上のアミノ酸が一致しているポリペプチドである。さらに、野生体と類似のポリペプチドは、免疫誘導能を損なわないか、増強し得るか、または適用可能なヒト白血球型抗原の型を変更し得ることが知られている変異が、腫瘍特異的な抗原ペプチドの領域に対して導入されているポリペプチドである。
当該変異としては、例えば国際公開第０５／０４５０２７号に記載の変異が挙げられる。当該変異は、９アミノ酸残基からなるペプチド部分におけるＣ末端側から１、４、６または９番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換である。上記文献にしたがって、以下のように対応するアミノ酸残基が置換され得る。１番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、バリン、イソロイシン、ロイシンまたはメチオニンのいずれかに置換され得る。４番目のアミノ酸は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかに置換され得る。６番目のアミノ酸は、アスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジンまたはアスパラギン酸のいずれかに置換され得る。９番目のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはグルタミンのいずれかに置換され得る。
上記変異としては、例えば国際公開第号０５／０５３６１８号に記載の変異がさらに挙げられる。当該変異において、本願の配列番号３における７７０〜７９６番目の塩基に対応する塩基にコードされている９アミノ酸残基のうちの９番目がロイシンに置換されている。
上記変異としては、例えば国際公開第号０７／０１６４６６号に記載の変異がさらに挙げられる。当該変異において、本願の配列番号３における７７０〜７９６番目の塩基に対応する塩基にコードされている９アミノ酸残基のうちの９番目がメチオニンに置換されている。
上記変異としては、例えば欧州特許１１２７０６８号の意見書に記載の２つの変異がさらに挙げられる。１つ目の変異において、本願の配列番号３における７７０〜７９６番目の塩基に対応する塩基にコードされている９アミノ酸残基のうちの２番目がロイシンに置換されている。２つ目の変異において、本願の配列番号３における７７０〜７９６番目の塩基に対応する塩基にコードされている９アミノ酸残基のうちの２番目がロイシンに、９番目がバリンに置換されている。
またここで、腫瘍特異的なポリペプチドは、野生体と同じポリペプチドにおける抗原ペプチドを含んでいる領域のアミノ酸配列について比較したとき、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上のアミノ酸が一致しているポリペプチドである。さらに、野生体と類似のポリペプチドは、免疫誘導能を損なわないか、増強し得るか、または適用可能なヒト白血球型抗原の型を変更し得ることが知られている変異が、導入されているポリペプチドである。当該変異は上述の通りである。
以上のことから、本発明の核酸構築物は、野生体と同じポリペプチド、野生体と類似のポリペプチドまたは腫瘍特異的なペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。したがって、本発明の核酸構築物は、上述のようなＷＴ１遺伝子における変異に加えて、コードしているアミノ酸が変化しない保存的な変異を任意に有している。
なお、以下のような場合、本発明の核酸構築物には先頭のＡの５’末端側に１または２つの塩基を挿入する変異がさらに導入される：配列番号２の１９２位から７６９位の領域内または配列番号２に対応する配列における、当該領域と対応する領域内の任意の位置にＡＵＧによって表される塩基が、上述した変異のいずれかによって生成され、先頭のＡが１９１＋３ｎ位（ｎは１〜１９２の整数）以外に存在する場合。
本明細書に使用されるとき、配列番号２を参照している記載における“対応する配列”は、上述のようなＷＴ１遺伝子の種々のバリアントを表す公知のｃＤＮＡに対応するＲＮＡの配列を意味しており、これらのバリアントには、上述のように種々の変異が導入され得る。また、“対応する塩基”は、配列番号２のＸ位（Ｘは任意の整数）の塩基およびその周囲の塩基と比較して、上記“対応する配列”において特定される塩基を意味している。本明細書に接した当業者であれば、“対応する配列”および“対応する塩基”の意味を容易に理解し、適宜選択した配列番号２と“対応する配列”において、配列番号２のＸ位の塩基と“対応する塩基”を容易に見出し得る。よって、これ以降において、配列番号２を参照配列として、本明細書において本発明の核酸構築物について説明するが、すべての記載は、配列番号２と対応する配列における塩基の位置または領域を指すことが意図されている。
本発明の核酸構築物において、配列番号２の１９１位に対応する塩基は、例えばＡ、ＵまたはＧによって表される塩基に置換され得る。いずれの塩基に置換されていても、真核生物において開始コドンとして機能している場合が報告されているコドンを生成し得る。また、本発明の核酸構築物において、配列番号２の１９１位に対応する塩基から始まる連続する塩基であり、配列番号２における７６９位の塩基までの任意の塩基を欠失し得る。これによって、上述のようなこれまでに公知の腫瘍特異的な抗原ペプチドを含んでいるポリペプチドをコードしている核酸構築物を提供し得る。
本発明の核酸構築物において、ＡＵＧによって表される３塩基から始まる領域を生成する変異が導入されていることが好ましい。この変異によって、真核生物において最も多く見られる開始コドンが生成される。よって当該領域がコード領域として認識される精度が向上するので、本発明の核酸構築物にコードされているポリペプチドの発現量が向上する。このような変異が生成されている核酸構築物に含まれているＲＮＡの例として、以下の３つが挙げられる。
（１）配列番号２における１９１位の塩基がＡに置換されているＲＮＡ。（２）配列番号２における１９１位の塩基から始まる連続する２０４塩基が欠失しているＲＮＡ。（３）ＡＵＧによって表される３塩基、および３ｍ（ｍは、０または１〜２５０、より好ましくは１〜２００の整数）の任意の塩基の順に５’末端側から連続している領域、ならびに当該領域に続いて配列番号２における７７０位〜１６６３位の領域を含んでいるＲＮＡ。
上記（１）は、本発明の核酸構築物におけるＷＴ１ポリペプチドをコードしている領域の第１番目の塩基がＡによって表される塩基に置換されているＲＮＡである。上記（２）は、本発明の核酸構築物におけるＷＴ１ポリペプチドをコードしている領域において最初に現れるＡＵＧによって表される３塩基から始まっているＲＮＡである。上記（３）は、これまでに腫瘍特異的な抗原ペプチドをコードしていることが同定されている領域（配列番号２における７７０位〜１６６３位の領域）を含んでいるポリペプチド鎖のＣ末端側に、ＡＵＧに続いて０または３の倍数個の塩基が付加されているＲＮＡである。（１）〜（３）のいずれを採用しても、野生型と比べて発現量がはるかに向上したＲＮＡを得ることができる。
さらに、本発明の核酸構築物は、配列番号２の１位〜１００位まで、より好ましくは１５０位、さらに好ましくは１２０位まで、最も好ましくは１９０位までの塩基または対応する配列における、当該塩基に対応する塩基が欠失していることが好ましい。このような欠失を有している本発明の核酸構築物は、後述する転写用コンストラクトに挿入された場合に、プロモータから開始コドンまでの距離が適切に調節されているため、タンパク質をより適切に発現させる。
ここで、本発明の核酸構築物からのタンパク質の発現量は、野生型と比べて、少なくとも５倍以上であり、２５倍以上であることが好ましい。本発明の核酸構築物を細胞に導入して利用する場合に、少数の細胞を用いてタンパク質の必要な量を準備し得る。特にこのような細胞を生体に投与する場合、当該生体に所望の反応を誘導し得るタンパク質の量を、少ない細胞数によって生体に提供し得る。したがって、本発明の核酸構築物は、このような細胞を均質かつ大量に調製するときに生じる煩雑さを大きく軽減し、当該細胞の生体への投与を容易にする。後述の実施例に記載するように、本発明は、野生型と比較して最大で約５０倍以上にタンパク質の発現量が向上した核酸構築物を提供することができる。よって、本発明の核酸構築物は野生型と比べてはるかに取扱いが容易であり、非常に有用である。
本発明の核酸構築物は、実施例にその有効性が示されているように、配列番号４または配列番号５によって示される領域を含んでいることが好ましい。本発明の核酸構築物が当該領域を有していれば、タンパク質の発現量が野生型と比べて２５倍以上に増強され得る。
また、本発明の核酸構築物は５’キャップ構造をさらに有していることが好ましい。本発明の核酸構築物における５’キャップ構造は、インビトロまたはインビボにおいて付与され得る。精製および単離の容易さを考慮すると、ＷＴ１ポリペプチドをコードしている領域を含んでいるＲＮＡを用いてインビトロにおいて転写を行い、さらにインビトロにおいて５’キャップ構造を付与することが好ましい。インビトロにおける転写および５’キャップの付与は、当業者に公知の方法、市販の試薬または市販のキットなどを利用して容易に実施され得る。
また、ＲＮＡの安定性およびタンパク質の発現量を向上させるために、本発明の核酸構築物は、３’末端にポリアデニレーション（ポリＡ）鎖をさらに有していることが好ましい。ポリＡ鎖は、５’キャップ構造と同様にインビトロおよびインビボにおいて本発明の核酸構築物に付与され得るが、同様の理由から、インビトロにおいて付与されることが好ましい。ポリＡ鎖の付与も同様に、当業者に公知の方法、市販の試薬または市販のキットなどを利用して容易に実施され得る。
〔本発明の核酸構築物をコードしているポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを含んでいる転写用コンストラクト〕
本発明は、上述のような本発明の核酸構築物をコードしているポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片をコードしているＷＴ１遺伝子の領域を含んでいる。また、当該ポリヌクレオチドは、上述したような本発明の核酸構築物に導入されている変異と対応する変異が導入されている。本発明のポリヌクレオチドは本発明の核酸構築物の製造に特に適している。本発明の核酸構築物の製造に使用する場合、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の核酸構築物を転写するためのコンストラクトに組み込まれている。
上述のように、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含んでいる転写用コンストラクトを提供する。転写用コンストラクトは、当該ポリヌクレオチドからのＲＮＡの効率的な転写を実現し得る種々の要素をさらに含んでいる。上述のように、本発明の核酸構築物の転写がインビトロにおいて実施されることが好ましいので、転写用コンストラクトに含まれている上記要素は、インビトロにおける転写の方法またはキットなどに合わせて選択され得る。インビトロ転写用の市販のキットに適合させたコンストラクトの詳細を本発明の転写用コンストラクトの例として以下に説明する。
転写用コンストラクトは、上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結されているプロモータを含んでいる。当該プロモータは、インビトロにおいて上記ポリヌクレオチドからのＲＮＡの転写を促進し得るプロモータであればよく、その例としてはＴ７プロモータ、ＳＰ６プロモータおよびＴ３プロモータが挙げられる。また、転写用コンストラクトは、上記ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル（すなわちターミネータ配列）をさらに含み得る。当該ターミネータ配列としては、Ｔ７ターミネータ、ＳＰ６ターミネータおよびＴ３ターミネータが挙げられる。なお、上記ポリヌクレオチドの下流において転写用コンストラクトを制限酵素などによって切断して転写させる場合、転写終結シグナルは不要である。
転写用コンストラクトは、それ自体を増幅するために、ベクターとしての機能を有し得る。この場合、転写用コンストラクトは、転写用コンストラクトが導入されている細胞を選択するための選択マーカー遺伝子をさらに含み得る。選択マーカー遺伝子としては、従来公知の抗生物質に対して抵抗性を示す遺伝子、栄養要求性に関する変異を補う遺伝子、および試薬を用いた呈色反応を触媒する酵素を発現する遺伝子などが挙げられる。なお、転写用コンストラクトがこのような選択性を有していない場合には、例えばＰＣＲを利用して転写用コンストラクトを増幅し得る。したがって、転写用コンストラクトは、プラスミドＤＮＡに挿入されていない、ＰＣＲによって増幅された直鎖状のポリヌクレオチド鎖であり得る。この場合、プライマー対は、鋳型におけるＲＮＡのプロモータ領域を含めて増幅するように設計される。
なお、ＣＤ１ｄのｍＲＮＡをさらにコードしている転写用コンストラクトを生成する場合、当該転写用コンストラクトは、ポリシストロニックであるか、またはモノシストロニックである。転写用コンストラクトがポリシストロニックである場合、当該転写用コンストラクトは２つのコード領域の上流に１つのプロモータを含んでいる。転写用コンストラクトがモノシストロニックである場合、当該転写用コンストラクトはそれぞれのコード領域の上流にプロモータを１つずつ含んでいる。もちろん、２つの転写用コンストラクトを本発明の核酸構築物用とＣＤ１ｄのｍＲＮＡ用とに分けて作製し得る。これらの態様の他に、ＷＴ１遺伝子産物およびＣＤ１ｄを融合タンパク質として発現させる態様が挙げられる。この場合、例えば、ＷＴ１遺伝子産物とＣＤ１ｄとの間に、特異的なタンパク質分解シグナル配列（Ｔ２Ａ配列など）が挿入されるようなｍＲＮＡが生成される。当該ｍＲＮＡが導入された細胞において、上記融合タンパク質は、発現された後に、２つのタンパク質に分解されて個々のタンパク質としての活性を示し得る。
〔本発明の核酸構築物の製造方法〕
本発明の核酸構築物は、例えば当該核酸構築物をコードするポリヌクレオチドの増幅と当該ポリヌクレオチドのクローニングとインビトロ転写反応との組合せ、または化学合成などの公知技術によって製造される。本発明の核酸構築物の製造方法の一例について以下に説明する。
公知のＷＴ１遺伝子のｃＤＮＡに対して所望の変異を導入し得るプライマー対を設計する。当該プライマー対は、例えば野生体の配列のＮ末端を欠失するように設計される。このとき、通常は欠失させる塩基の数を調節する必要はない。〔本発明の核酸構築物〕の項において説明したような変異が生じない限り、インビトロ転写されるＲＮＡは、フレームシフト変異を起こさないからである。使用する鋳型のｃＤＮＡの配列を決定すれば、フレームシフト変異を起こしているか否かが分かるので、公知の方法にしたがって使用する前に鋳型ＤＮＡの配列決定を行い得る。
当該プライマー対および鋳型のｃＤＮＡを用いたＰＣＲによって、所望のポリヌクレオチドを増幅する。増幅されたポリヌクレオチドおよびクローニングに使用するベクターを同じ制限酵素を用いて消化する。リガーゼを用いて消化したベクターおよびポリヌクレオチドをライゲーションして、当該ポリヌクレオチドを含んでいるベクター（転写用コンストラクト）を得る。
本発明のポリヌクレオチドを含んでいるベクターを用いて、例えば適切な大腸菌を形質転換する。形質転換した大腸菌を適切な培地において増殖させる。当該ベクターは、例えば特定の抗生物質に対して耐性を示す遺伝子を含んでおりり、大腸菌の増殖に使用する培地は特定の抗生物質を含んでいる。市販のキットなどを用いて菌体からベクターを抽出する。
回収されたベクターを環状のままか、または直鎖状にしてから市販のキットを用いて、インビトロ転写反応に供する。転写産物が５’末端のキャップ構造または３’末端にポリＡ付加などの修飾を受けていない場合、いずれも市販のキットを利用して、転写産物の５’末端に対してキャップ構造を付与し、転写産物の３’末端にポリＡ配列を付与し得る。
ここでは、主にキットを利用して本発明の核酸構築物を製造する方法について簡単に説明した。しかし、当業者であれば、製造工程に使用する試薬の一部を自ら調製可能であることを理解する。したがって、当業者であれば、製造されるＲＮＡの性質にしたがって、市販のキットを部分的に改変すること、または試薬の一部を変更することによって、より適切なＲＮＡの製造が可能である。特に後述の実施例の記載を参照すれば、本発明の核酸構築物の製造にとって好適な手法、調製すべき試薬、選択すべきキット、およびこれらにおける変更すべき点を、当業者は十分に理解する。
〔本発明の免疫治療用細胞を製造するためのキット〕
また、本発明は、免疫治療用細胞を製造するためのキットを提供する。当該キットは、上述の核酸構築物またはポリヌクレオチドを含んでいる。当該キットに本発明の核酸構築物が含まれている場合、ユーザは、当該キットを用いて〔本発明の免疫治療用細胞〕に記載されている任意の細胞に核酸構築物を導入する。また、当該キットに本発明のポリヌクレオチド（転写用コンストラクトとして）が含まれている場合、ユーザは、インビトロまたはインビボにおいて本発明の核酸構築物を転写させ、当該核酸構築物を任意の細胞に導入する。キットは取扱説明書をさらに含み得る。当該取扱説明書には、例えば、本明細書におけるこれまでの記載から理解されるような、本発明の免疫治療用細胞（必要に応じて核酸構築物）の製造における必要な事項について記載されている。
以上をまとめると、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。
（１）ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞であって、上記核酸構築物は、配列番号１の１９４位から４９３位、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、および当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる、免疫治療用細胞、
（２）ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物が導入されている免疫治療用細胞であって、上記核酸構築物は、配列番号１の６９位から５１７位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域を含んでおり、配列番号２の１９１位から１９３位に示されているＣＵＧのうち、すべてを欠失しているか、もしくはＣからＡへの置換を有している、（１）に記載の免疫治療用細胞、
（３）上記核酸構築物から直接翻訳されるタンパク質の産生量が、配列番号２の１９１位から１７４１位に示されているコード領域を有しているＲＮＡから直接翻訳されるタンパク質の産生量の２５倍以上である、（１）または（２）に記載の免疫治療用細胞細胞、
（４）（１）〜（３）のいずれか１つに記載の細胞を製造するための上記核酸構築物であって、導入された細胞においてタンパク質に直接翻訳される、核酸構築物、
（５）配列番号４または配列番号５によって示される領域を含んでいる、核酸構築物、
（６）（４）または（５）に記載の核酸構築物を任意の細胞に導入する工程を包含している、免疫治療用細胞の製造方法、
（７）（４）または（５）に記載の核酸構築物をコードしている、ポリヌクレオチド、
（８）（４）もしくは（５）に記載の核酸構築物、または（７）に記載のポリヌクレオチドを含んでいる、免疫治療用細胞を製造するためのキット、
（９）ＣＤ１ｄをコードしているｍＲＮＡをさらに含んでおり、細胞表面に存在する当該ＣＤ１ｄに対して、ＮＫＴ細胞の抗原受容体によって認識される糖脂質が結合している、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の免疫治療用細胞。
以下に本発明に係るＲＮＡの調製方法の一例および調製されたＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を野生型と比較した結果について説明する。本実施例は、本発明を例証しているのみであり、本発明の範囲を限定しない。
〔本発明に係るＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドのクローニング〕
目的とするＷＴ１のポリヌクレオチド配列をＰＣＲによって得た。鋳型には、購入したヒトＷＴ１のバリアントＤをコードするｃＤＮＡ（#SC308799、Origene社、配列番号３）を挿入したプラスミドＤＮＡを用いた。ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼとして、KOD-Plus-Ver.2（#KOD-211、東洋紡）を使用した。オリゴヌクレオチドの各プライマー対の配列およびＰＣＲの反応条件は以下の通りである。
（ＡＴＧ−ＷＴ１用プライマー対）
フォワード：５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号６、３位〜８位：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列、９位〜１３位：コザック配列、１４位〜３４位：ＷＴ１の翻訳領域配列）；
リバース：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧ−３’（配列番号７、３位〜８位は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列、９位〜３１位：ＷＴ１の翻訳領域配列）
（ΔＮ-ＷＴ１用プライマー対）
フォワード：５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧＡ−３’（配列番号８、３位〜８位：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列、９位〜１３位：コザック配列、１４位〜３３位：ＷＴ１の翻訳領域配列）；
リバース：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧ−３’（配列番号９、３位〜８位は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列、９位〜３１位：ＷＴ１の翻訳領域配列）。
ＰＣＲによるＡＴＧ−ＷＴ１（配列番号３の１９１位（ｃからａに置換されている）から１７４１位に対応）の増幅産物の予想される鎖長は約１５８０塩基対であり、ΔＮ−ＷＴ１（配列番号３の３９５位から１７４１位に対応）のそれは約１３５０塩基対であり、アガロースゲル電気泳動を行って理論値と矛盾しないことを確認した。増幅産物のそれぞれをプラスミドｐｃＤＮＡ３にクローニングし、ｐｃＤＮＡ３−ＡＴＧ−ＷＴ１およびｐｃＤＮＡ３−ΔＮ−ＷＴ１とそれぞれを名づけた。
（本発明に係る合成ＲＮＡの生成）
上述のプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＡＴＧ−ＷＴ１およびｐｃＤＮＡ３−ΔＮ−ＷＴ１）を、制限酵素ＮｏｔＩ（認識配列はｐｃＤＮＡ３上にある）を用いて直鎖状にした。そして、直鎖状にしたプラスミドのそれぞれを、QIAquick PCR Purification Kit（#28106、Qiagen社）によって精製した後にＲＮＡ合成の鋳型として使用して、所望のＲＮＡを合成した。
（本発明に係る変異体ＲＮＡのからのタンパク質の発現量の確認）
２つの変異型のＷＴ１ ｍＲＮＡを、タンパク質の発現量について野生型のＷＴ１ ｍＲＮＡと以下のように比較した。
２つの変異型のＷＴ１ ｍＲＮＡおよび野生型のＷＴ１ ｍＲＮＡをそれぞれ同量ずつ用いて、３つのディッシュに分けて播いたＨＥＫ２９３（３×１０６個の細胞）を、リポフェクション法にしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションした各細胞を、ＣＯ２インキュベータ、３７℃においてインキュベートした。培養液を捨てた後に泳動用の溶解緩衝液を加えてから、セルスクレーパを用いてインキュベートした細胞を掻きとり、チューブに移した。チューブ内の細胞溶解物を超音波処理によってさらに破砕してサンプルを得た。
各サンプルを適宜希釈した上で１５μｌずつを電気泳動した（各サンプルの希釈率については後述）。ゲルを平衡化し、サンプルをゲルからメンブレンに転写した。サンプルが転写されたメンブレンを、ブロッキングした後に、ウサギ抗ＷＴ１抗体（SC-192、SantaCruz社）とともにインキュベートした。３回にわたってメンブレンを洗浄し、ＨＲＰ標識されているヤギ抗ウサギＩｇＧの二次抗体（#HAF008、R&D社）とともにメンブレンをインキュベートした。０．０５％のTween20を含有しているＴＢＳを用いて３回にわたってメンブレンを洗浄した後に、Immobilon Western（#WBKLS0500、Millipore社）を用いてメンブレンを処理して各バンドを検出した。
各バンドを検出した結果を図１に示す。各レーンの上に記載されている“×”の前の数値は、ポリアクリルアミドゲルにアプライされたサンプルが、元の細胞溶解物から何倍に希釈されているかを示している。野生型のＷＴ１のｍＲＮＡからは、全長のタンパク質（５１７アミノ酸）がメジャーバンドとして、全長より短いバンドがマイナーバンドとして検出された（ＣＴＧの１×および５×）。Ｎ末端の一部を欠失しているＷＴ１のＲＮＡからは、野生型のＷＴ１におけるマイナーバンドと同じ位置に約５０倍以上の強度のバンドとして検出された（ｄｅｌｔａの２５×、５０×）。コード領域の１塩基目がＡに置換されているＷＴ１のＲＮＡからも野生型のＷＴ１におけるメジャーバンドと同じ位置に約５０倍以上の強度のバンドとして検出された（ＡＴＧの２５×および５０×）。
また、ｓｔｄにおけるバンドは５０ｎｇのタンパク質によって検出されている。ｓｔｄにおけるバンドの強度との比較から、野生型のＷＴ１の検出量は１×において、少なくとも約５０ｎｇである。アプライされたサンプルは元のサンプルの１／１０に相当するので、１×１０６細胞当りの発現量は少なくとも約２５０ｎｇである。よって体重が約３ｋｇの動物における免疫を誘導するには、十分なタンパク質の量とは言えない。一方で、２つの変異体ＲＮＡ（ｄｅｌｔａおよびＡＵＧ）からのＷＴ１の発現量は、同様にそれぞれ少なくとも約５０倍以上であるので、１×１０６細胞当りの発現量は約３０μｇ以上である。
本発明は、生物学的分野および医学分野、特に腫瘍の治療などへの応用が期待される。

Claims (9)

  1. ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞であって、
    上記核酸構築物は、配列番号１の１９４位から４９３位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、ならびに当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる、免疫治療用細胞。
  2. ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物が導入されている免疫治療用細胞であって、
    上記核酸構築物は、配列番号１の６９位から５１７位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域を含んでおり、配列番号２の１９１位から１９３位に示されているＣＵＧのうち、すべてを欠失しているか、もしくはＣからＡへの置換を有している、請求項１に記載の免疫治療用細胞。
  3. 上記核酸構築物から直接翻訳されるタンパク質の産生量が、配列番号２の１９１位から１７４１位に示されているコード領域を有しているＲＮＡから直接翻訳されるタンパク質の産生量の２５倍以上である、請求項１または２に記載の免疫治療用細胞。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞を製造するための上記核酸構築物であって、導入された細胞においてタンパク質に直接翻訳される、核酸構築物。
  5. 配列番号４または配列番号５によって示される領域を含んでいる、請求項４に記載の核酸構築物。
  6. 請求項４または５に記載の核酸構築物を任意の細胞に導入する工程を包含している、免疫治療用細胞の製造方法。
  7. 請求項４または５に記載の核酸構築物をコードしている、ポリヌクレオチド。
  8. 請求項４もしくは５に記載の核酸構築物、または請求項７に記載のポリヌクレオチドを含んでいる、免疫治療用細胞を製造するためのキット。
  9. ＣＤ１ｄをコードしているｍＲＮＡをさらに含んでおり、細胞表面に存在する当該ＣＤ１ｄに対して、ＮＫＴ細胞の抗原受容体によって認識される糖脂質が結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫治療用細胞。
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