WO2021082784A1 - 一种基于腺病毒的基因编辑方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种重组腺病毒,其包含:目标表达框、位于目标表达框5'端的第一同源臂、位于目标表达框3'端的第二同源臂、一个或两个sgRNA靶标序列,其中sgRNA靶标序列位于第一同源臂的5'端或第二同源臂的3'端,或分别位于第一同源臂的5'端和第二同源臂的3'端。还提供了基于该重组腺病毒的基因编辑方法、制备基因编辑动物的方法、制备工程化T细胞的方法以及包含该重组腺病毒的系统、组合物和试剂盒。
Description
本发明涉及基因编辑的领域。具体地,本发明涉及一种基于腺病毒的基因编辑方法。
嵌合抗原受体T细胞(CART)是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一,其基本原理主要是提取患者自身的T细胞,并通过基因和细胞工程手段使其表达特异性嵌合抗原受体,使之能够识别和结合肿瘤细胞表面抗原,从而起到靶向杀伤肿瘤细胞的作用。目前,CAR-T细胞疗法已经被美国FDA批准用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)、以及复发性或难治性大B细胞淋巴瘤(LBCL)成人患者的治疗,包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发纵膈大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、高级别B细胞淋巴瘤(HGBL),以及转化滤泡性淋巴瘤(TFL)。
目前,CART制备一般采用慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或非病毒方式的转座子DNA载体(例如质粒)进行。然而,慢病毒或逆转录病毒在进入细胞之后,会随机地插入到基因组中,这可能会破坏细胞中的其他基因,从而导致细胞异常,甚至可能会让细胞转变成肿瘤细胞,进而引发肿瘤。因此,采用这些病毒技术来制备CART进行细胞免疫治疗会有引发肿瘤的风险。非病毒方式的转座子DNA载体可以降低随机插入的概率,但仍然存在随机插入的风险,而且利用这种方式将外源DNA转导入T细胞会造成一定的细胞毒性,同时其临床效果也尚未令人满意。采用腺相关病毒制备CART虽然可以定点插入目标基因以解决随机插入的问题,但其生产纯化工艺复杂,不能很好地进行临床推广。
因此,需要一种能够在细胞内进行定点基因编辑的方法和系统, 以克服上述技术的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于腺病毒的高效的定向基因编辑方法和系统,其能够解决随机插入的问题,并且适合工业化规模生产和临床应用。本发明的目的还在于提供所述基因编辑方法的用途,例如在治疗疾病中的用途。
因此,在第一个方面,本发明提供一种重组腺病毒,其包括:目标表达框、位于目标表达框5’端的第一同源臂、位于目标表达框3’端的第二同源臂、一个或两个sgRNA靶标序列,其中sgRNA靶标序列位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端,或分别位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端。
在一个实施方案中,目标表达框包含用于对细胞基因组进行改造的序列,例如嵌合抗原受体(CAR)的编码序列。
在一个实施方案中,第一同源臂和第二同源臂分别与细胞基因组的目标基因序列两端的300-3000bp的序列互补。在一个优选的实施方案中,第一同源臂和第二同源臂分别与细胞基因组的目标基因序列两端的400-2500bp,例如400bp、600bp、800bp、1000bp、1200bp、1400bp、1600bp、1800bp、2000bp、2200bp、2400bp或2500bp,或400-2500bp之间的任一长度的序列互补。第一同源臂和第二同源臂的长度可以相同或不同。
在一个实施方案中,本发明的重组腺病毒包括一个sgRNA靶标序列,其位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端。在另一个实施方案中,本发明的重组腺病毒包括两个sgRNA靶标序列,其分别位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端,并且所述两个sgRNA靶标序列可以相同或不同。
在一个实施方案中,本发明的重组腺病毒还包括启动子、反向末端重复序列(ITR)和/或包装信号。重组腺病毒的实例包括但不限于Ad5、Ad5F35、Ad35、Ad55、Ad2、Ad5F11、pAdBM5、pADCMV5等。
在一个实施方案中,重组腺病毒中的目标表达框、第一同源臂、第二同源臂和sgRNA靶标序列彼此可操作地连接。
在第二个方面,本发明提供一种基于腺病毒的基因编辑方法,包括:
(1)提供本发明的重组腺病毒;
(2)以所述重组腺病毒作为供体,在靶向细胞基因组目标基因序列的sgRNA、靶向sgRNA靶标序列的sgRNA存在下,通过CRISPR/Cas系统对细胞基因组进行基因编辑。
在一个实施方案中,所述细胞是哺乳动物细胞,优选是人细胞。在另一个实施方案中,所述细胞包括但不限于干细胞,例如胚胎干细胞、多能干细胞、成人干细胞等,或体细胞。在另一个实施方案中,所述细胞的实例包括但不限于造血干细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、单核细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞等。
在一个实施方案中,靶向细胞基因组的目标基因序列的sgRNA、靶向sgRNA靶标序列的sgRNA可以相同或不同。在一个实施方案中,所述sgRNA(包括靶向细胞基因组的目标基因序列的sgRNA和靶向一个或两个sgRNA靶标序列的一个或两个sgRNA)以RNA的形式提供,或以编码sgRNA的多核苷酸的形式提供。在以编码sgRNA的多核苷酸的形式提供的情况下,所述多核苷酸可以存在于一个或多个表达载体上。
在一个实施方案中,CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白酶是Cas9或Cpf1。Cas蛋白酶以编码其的mRNA的形式提供,或以编码其的多核苷酸的形式提供。当以编码多核苷酸的形式提供时,其可以存在于与提供sgRNA的表达载体相同或不同的表达载体。
在一个实施方案中,将重组腺病毒、sgRNA或提供sgRNA的表达载体、编码Cas蛋白酶的mRNA或提供Cas蛋白酶的表达载体一起或分别递送到细胞中。
在一个实施方案中,基因编辑包括但不限于插入、删除或替换基因片段、一个或多个碱基的突变、基因修饰等。
在一个实施方案中,所述插入、删除或替换的基因片段的长度可以为1bp-30kb,例如1bp(例如点突变)、100bp、1kb、5kb、10kb、15kb、20kb、25kb或30kb,或1bp-30kb之间的任意长度。
在一个实施方案中,本发明的基因编辑方法不以诊断或治疗疾病为目的。
在第三个方面,本发明提供一种用于基因编辑的系统、组合物或试剂盒,其包含本发明的重组腺病毒。
在一个优选的实施方案中,所述系统、组合物或试剂盒还包含靶向重组腺病毒中的一个或两个sgRNA靶标序列的一个或两个sgRNA或其编码多核苷酸。
在另一个优选的实施方案中,所述系统或试剂盒还包含编码Cas蛋白酶的mRNA或多核苷酸。在一个优选的实施方案中,Cas蛋白酶是Cas9或Cpf1。
在本发明中,当以多核苷酸的形式提供sgRNA或Cas蛋白酶时,所述多核苷酸可以存在于一个或多个表达载体中。
在第四个方面,本发明提供一种产生基因编辑动物的方法,包括使用本发明的基因编辑方法对动物受精卵进行基因编辑,并使所述受精卵发育,从而获得发生定向基因编辑的动物。
在一个优选的实施方案中,所述动物是小鼠、大鼠或斑马鱼。
在第五个方面,本发明提供一种制备工程化T细胞的方法,包括:
(1)提供本发明的重组腺病毒;
(2)将所述重组腺病毒、靶向T细胞基因组的目标基因序列的sgRNA或其编码多核苷酸、靶向sgRNA靶标序列的sgRNA或其编码多核苷酸、和编码Cas蛋白酶的mRNA或多核苷酸递送进T细胞,从而获得工程化T细胞。
在一个实施方案中,Cas蛋白酶是Cas9或Cpf1。
在一个实施方案中,所述T细胞来源于外周血单核细胞(PBMC)或脐带血。优选地,所述T细胞包括但不限于炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞,更优选CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
在一个实施方案中,编码靶向T细胞基因组目标基因序列的sgRNA的多核苷酸、编码靶向sgRNA靶标序列的sgRNA的多核苷酸、和编码Cas蛋白酶的多核苷酸存在于一个或多个表达载体上。
本发明还提供通过上述制备方法获得的工程化T细胞以及包含所述工程化T细胞的组合物。
在一个实施方案中,工程化T细胞是TCR T细胞或CART细胞。在一个实施方案中,所述CART细胞是通用型CART细胞。在另一个实施方案中,所述工程化T细胞可用于治疗疾病,例如癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
发明详述
定义
如在本文所用,术语“基因编辑”是指对生物体的基因进行精确修饰的技术。利用基因编辑技术可以将细胞内特定的基因进行突变、敲入和删除等,从而改变生物体的遗传特性。当前的基因编辑技术是利用某些方法在基因的特定位置上造成DNA损伤,从而激发细胞内的DNA损伤修复机制。
目前的DNA损伤修复机制主要包括非同源末端连接(Non-homologous End Joining,NHEJ)和同源重组(Homologous Recombination,HR)两个途径。在非同源末端连接途径中,细胞对DNA断裂处进行部分酶切,使之产生粘性末端,再将两个末端连接起来。该途径虽然迅速高效,但往往会造成部分碱基的缺失或插入,使得通过这种途径进行的基因编辑不够精确。
在同源重组途径中,向细胞内引入与DNA损伤位点同源性很高的另一条完整DNA,则损伤位点会以同源DNA为模板进行修复。若同源基因中引入了其它基因、元件或者点突变,则可实现细胞基因组的修改。因此以同源重组的方式对基因组DNA进行修复具有更高的可控性,可以完全产生预期的基因组改变,并且能够在适当的位置定向引入特定的外源基因。例如,可以在较为稳定的基因组位置上插入特定基因进行表达,这对于获得高效表达的重组蛋白细胞株尤其重要。然而,在例如通过CRISPR系统进行基因编辑的过程中,产生的NHEJ 的效率往往远高于HR,而这对于定向精确基因修复是不期望的。
如在本文所用,术语“腺病毒”具有本领域技术人员理解的一般含义,是指一种大分子双链无包膜DNA病毒。通过受体介导的内吞作用进入细胞后,腺病毒基因组转移至细胞核内,但保持在染色体外,并不整合进入宿主细胞的基因组中。腺病毒基因组包括两个反向末端重复区(ITR)、位于ITR内侧的病毒包装信号、在早期表达的与腺病毒复制相关的4个转录单元(E1-E4)和在晚期表达的编码结构蛋白的1个转录单元。目前已经发现了100多个血清型,其中人腺病毒有52种,分别命名为Ad1-Ad52。可用于本发明的腺病毒的实例包括但不限于Ad2、Ad5、Ad35等。其他嵌合型腺病毒,例如Ad5F35(在常规Ad5型腺病毒的基础上改造了受体结合的纤突区)、Ad5F11、Ad55、Ad5F11、pAdBM5、pADCMV5也可用于本发明。
如在本文所用,术语“重组腺病毒”是指通过基因工程产生的腺病毒,其中腺病毒基因组被改造以使其适于表达外源基因。一般而言,重组腺病毒缺失部分或全部天然基因。在本发明中,重组腺病毒E2区编码DNA结合蛋白的基因上进行了突变,以减少病毒蛋白表达引起的细胞免疫反应。例如,重组腺病毒可以缺失E1、E2、E3、E4基因中的一个或多个。或者,腺病毒也可以缺失全部或大部分的腺病毒基因,而仅保留ITR和包装信号序列。
如在本文所用,术语“目标表达框”是指用于与细胞基因组的目标基因序列进行基因替换的序列。在基因编辑完成后,该目标表达框的部分或全部替换目标基因序列,从而整合到细胞的基因组中。因此,目标表达框包含用于对细胞基因组进行改造的序列,例如待插入的外源基因、嵌合抗原受体(CAR)的编码序列等。
如在本文所用,术语“同源臂”是指与目标基因序列同源互补的一段序列。同源臂的长度可以为400-2500bp,例如400bp、600bp、800bp、1000bp、1200bp、1400bp、1600bp、1800bp、2000bp、2200bp、2400bp或2500bp,或400-2500bp之间的任一长度。
如在本文所用,术语“sgRNA”是指单向导RNA(single guide RNA),其包含crRNA和tracrRNA。sgRNA是基于目标基因序列上的特定靶 标位点设计,其序列足以与Cas9或Cpf1内切核酸酶协同作用,引导发生所述内切核酸酶介导的靶标位点上的DNA双链断裂。
如在本文所用,术语“sgRNA靶标序列”是指被sgRNA识别并与之结合的序列。
如在本文所用,术语“可操作地连接”是指两个或多个多核苷酸片段之间功能性的空间排列。例如,如果启动子刺激或调节DNA序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中的转录,则所述启动子可操作地连接到DNA序列。可以通过接头来连接两个或多个多核苷酸片段,使其实现可操作地连接关系。
如在本文所用,术语“CRISPR”是指成簇的规律间隔的短回文重复序列。CRISPR最初被描述为含有短重复碱基序列的原核DNA片段。在回文重复序列中,核苷酸的序列在两个方向上是相同的。每个重复序列之后是来自于先前暴露于外源DNA(例如病毒或质粒)的间隔区DNA短片段。CRISPR位点通常由以下组成:一组成簇的CRISPR-相关(Cas)基因和特征性的CRISPR阵列-由可变序列(间隔区)间隔的一系列重复序列(直接重复序列),所述可变序列对应于外源基因组元件中的序列(原间隔区)。当Cas基因翻译为蛋白质,大多数CRISPR阵列首先转录为单个RNA,其随后被加工成较短的CRISPR RNA(crRNA),所述crRNA引导某些Cas酶的核水解活性以降解靶标核酸。
如在本文所用,术语“CRISPR/Cas系统”是指赋予对外源基因组元件(例如质粒和噬菌体中存在的那些)抗性的原核免疫系统,其提供一种形式的获得性免疫。通常,CRISPR/Cas系统包含至少一个Cas内切核酸酶和向导RNA。携带间隔序列的RNA帮助Cas(CRISPR-相关)蛋白识别并切割外源DNA。因此,当Cas蛋白质是Cas9时,该系统称为CRISPR/Cas9系统;当Cas蛋白质是Cpf1时,该系统称为CRISPR/Cpf1系统。
如在本文所用,术语“Cas9”是指在化脓性链球菌中发现的一种Cas蛋白质。Cas9内切核酸酶是一个四组分系统,包括称为CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的两个小RNA 分子。
如在本文所用,术语“Cpf1”是指属于II类V-A亚型CRISPR系统的RNA引导的DNA内切核酸酶,获得自普雷沃菌和弗朗西丝菌1。Cpf1核酸内切酶包括保守的RuvC核酸酶结构域,已知其水解单链DNA(ssDNA)和第二催化结构域,其负责自身crRNA的独立加工。据报道,通过Cpf1的crRNA成熟不需要tracrRNA的辅助。
在一个实施方案中,本发明的Cas酶还包括它们的功能性变体。“功能性变体”是指具有生物活性的变体,即,其包含亲本蛋白的一个或多个功能特性。在本发明的上下文中,“功能性变体”与亲本蛋白的氨基酸序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。功能性变体可以通过野生型亲本蛋白的突变获得,所述突变导致一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。突变方法是本领域已知的,例如随机突变或定点突变。例如,dLbCpf1是LbCpf1的功能性变体,其包含D832A突变,导致失去其DNA内切核酸酶的催化活性。“功能性变体”还包括嵌合蛋白,其包含来自第一蛋白的第一片段和来自第二蛋白的第二片段,其中所述第一蛋白和第二蛋白不同。
如在本文所用,术语“CAR”或“嵌合抗原受体”是指将任意特异性移植到免疫效应细胞(T细胞)上的工程化受体。通常,这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。这些受体被称为嵌合体,因为它们由不同来源的部分组成。
如在本文所用,术语“CAR T细胞”或“嵌合抗原受体T细胞”是指具有嵌合抗原受体的工程化T细胞,其对所选靶标具有预定义的特异性。一旦遇到靶细胞,例如癌细胞,CAR T细胞通过例如以下机制破坏癌细胞:广泛刺激的细胞增殖、增加细胞对其他活细胞有毒的程度(即细胞毒性),和增加由免疫系统中的细胞分泌的因子的产生,这些因子对生物体内的其他细胞有影响。
如在本文所用,术语“通用型CART细胞”或“UCART细胞”可互换使用,是指将健康供者的T细胞通过基因编辑阻止其表达内 源性T细胞受体(TCR),避免在人类淋巴细胞抗原(HLA)非匹配受者中产生移植物抗宿主病(GVHD)以及移植排斥,从而在GMP实验室中获得可供临床应用的CAR-T细胞。通用型CART细胞是一种同种异体的、现成的T细胞产品。
重组腺病毒
本发明提供一种重组腺病毒,其包含:目标表达框、位于目标表达框5’端的第一同源臂、位于目标表达框3’端的第二同源臂,和一个或两个sgRNA靶标序列,其中sgRNA靶标序列位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端,或分别位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端。
在一个实施方案中,本发明的重组腺病毒包括一个sgRNA靶标序列,其位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端。在另一个实施方案中,本发明的重组腺病毒包括两个sgRNA靶标序列,其分别位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端,并且所述两个sgRNA靶标序列可以相同或不同。例如,可以将两个sgRNA靶标序列设计为相同的序列,则只需要一个sgRNA即可分别在第一同源臂5’端和第二同源臂的3’端形成缺口,使由目的表达框和两个同源臂组成的DNA片段通过第一同源臂与第二同源臂和目标基因序列两端的序列之间的互补配对插入到细胞基因组中,从而替换目标基因序列。
在一个实施方案中,目标表达框包含用于对细胞基因组进行改造的序列。例如,目标表达框可以包含与野生型基因序列相比发生基因片段的缺失或外源基因的插入、或一个或多个碱基的突变,使得当该目标表达框整合到细胞基因组之后,细胞基因组定向地发生基因片段的删除、外源基因的插入、点突变、基因修饰或基因序列替换。在一个优选的实施方案中,目标表达框包含例如报告基因、结构基因、功能性基因、或嵌合抗原受体(CAR)的编码序列。
在一个实施方案中,第一同源臂和第二同源臂分别与细胞基因组的目标基因序列两端的300-3000bp的序列互补。在一个优选的实施方案中,第一同源臂和第二同源臂分别与细胞基因组的目标基因序列两端的400-2500bp,例如400bp、600bp、800bp、1000bp、1200bp、1400bp、 1600bp、1800bp、2000bp、2200bp、2400bp或2500bp,或400-2500bp之间的任一长度的序列互补。第一同源臂和第二同源臂的长度可以相同或不同。
在一个实施方案中,本发明的重组腺病毒还包括启动子、反向末端重复序列(ITR)和/或包装信号序列。重组腺病毒的实例包括但不限于pAd5、pAd5F35、pAd35、Ad55、Ad2、Ad5F11、pAdBM5、pADCMV5等。
在一个实施方案中,重组腺病毒中的各个元件,例如目标表达框、第一同源臂、第二同源臂、sgRNA靶标序列、任选的启动子、ITR和包装信号序列彼此可操作地连接。
本领域技术人员熟知设计和合成重组腺病毒中各个元件(包括但不限于目标表达框、第一同源臂、第二同源臂、sgRNA靶标序列、任选的启动子)的原理和方法。根据需要进行基因编辑的细胞或物种的不同,本领域技术人员能够设计序列不同的元件,组成序列不同的腺病毒,以实现定向基因编辑的效果。
基因编辑方法及其应用
本发明提供一种基于腺病毒的基因编辑方法,包括:
(1)提供一种重组腺病毒,其包含:目标表达框、位于目标表达框5’端的第一同源臂、位于目标表达框3’端的第二同源臂,和一个或两个sgRNA靶标序列,其中sgRNA靶标序列位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端,或分别位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端;
(2)以所述重组腺病毒作为供体,在靶向细胞基因组的目标基因序列的sgRNA和靶向sgRNA靶标序列的sgRNA存在下,通过CRISPR/Cas系统对细胞基因组进行基因编辑。
本发明的方法基本上可以在任意的真核细胞中实施。因此,在一个实施方案中,细胞是动物细胞、植物细胞或微生物细胞。在一个优选的实施方案中,细胞是哺乳动物(例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、兔、猪、羊、马、牛等)细胞,优选是人细胞。在另一个实施方案中,所述细胞包括但不限于干细胞,例如胚胎干细胞、多能干细胞、 成人干细胞等,或体细胞。在另一个实施方案中,所述细胞的实例包括但不限于造血干细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、单核细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞等。
在一个实施方案中,靶向细胞基因组目标基因序列的sgRNA和靶向sgRNA靶标序列的sgRNA可以相同或不同。例如,可以将细胞基因组中的sgRNA靶标序列和腺病毒中的sgRNA靶标序列设计为相同或互补的序列,使得可以用同一个sgRNA对其进行切割,从而使操作更加简便。
在一个实施方案中,所述sgRNA(包括靶向细胞基因组的目标基因序列的sgRNA和靶向一个或两个sgRNA靶标序列的一个或两个sgRNA)以RNA的形式提供,或以编码sgRNA的多核苷酸的形式提供。在以编码sgRNA的多核苷酸的形式提供的情况下,所述多核苷酸可以存在于一个或多个表达载体上。
在一个实施方案中,CRISPR/Cas系统中的Cas酶可以是野生型蛋白酶或保留野生型蛋白酶的内切酶活性的功能性变体,例如功能性变体或嵌合蛋白。本领域技术人员可使用任何已知方法(例如定向或随机突变或DNA重组)获得功能性变体。所获得的功能性变体的效果可以通过众所周知的方法(例如DNA裂解分析)加以验证。
在一个实施方案中,Cas酶是Cas9或Cpf1。Cas9或CPf1以编码其的mRNA的形式提供,或以编码其的多核苷酸的形式提供。当以编码多核苷酸的形式提供时,其可以存在于与提供sgRNA的表达载体相同或不同的表达载体。
在一个实施方案中,将重组腺病毒、sgRNA或提供sgRNA的表达载体、Cas9或Cpf1mRNA或提供Cas9或Cpf1蛋白的表达载体一起或分别递送到细胞中。递送可以通过本领域技术人员熟知的任何方法进行,例如通过电穿孔、基因枪法、显微注射、脂质体、磷酸钙法、纳米粒子等方法。
在一个实施方案中,基因编辑包括但不限于插入、删除或替换基因片段、一个或多个碱基的突变、基因修饰等。具体地,通过设计特 定的目标表达框从而实现基因编辑的目的,例如与细胞基因组的目标基因序列相比,目标表达框被设计为还包括待插入的基因片段或缺失一定长度的基因片段,使得通过本发明的方法进行基因编辑后,细胞基因组的目标基因序列被目标表达框所替换,从而使细胞基因组定向地发生基因片段的插入或删除。目标表达框还可被设计为与细胞基因组的目标基因序列相比含有一个或多个碱基的突变,使得目标表达框替换目标基因序列后,细胞基因组定向地发生所述一个或多个碱基的突变。
在一个实施方案中,所述插入、删除或替换的基因片段的长度可以为1bp-30kb,例如1bp(例如点突变)、100bp、1kb、5kb、10kb、15kb、20kb、25kb或30kb,或1bp-30kb之间的任意长度。
在一个实施方案中,本发明的基因编辑方法不以诊断或治疗疾病为目的。
本发明还提供一种产生基因编辑动物的方法,包括使用本发明的基因编辑方法对动物受精卵进行基因编辑,并使所述受精卵发育,从而获得发生定向基因编辑的动物。这种基因编辑的动物可用作动物模型用于实验室或临床研究疾病发生机理、肿瘤进展机制、潜在的治疗手段或用于评估治疗的效果等。例如,可以通过本发明的基因编辑方法获得基因编辑的小鼠、大鼠、斑马鱼等。
本发明的编辑方法还可以用于制备工程化的T细胞以表达修饰的TCR(即,TCR疗法)或具有增强的抗原特异性的嵌合抗原受体(CAR)。
遗传修饰的TCR疗法是基于通过介导抗原识别过程的特定TCRα和β链的表达来改变T细胞的特异性。肿瘤特异性TCRα和β链被鉴定、分离并克隆到转导载体中,而T细胞的转导产生肿瘤抗原特异性T细胞。
嵌合抗原受体(CAR)结合了抗体样识别和T细胞激活功能。它们由通常衍生自抗体的抗原结合区、将CAR锚定至T细胞的跨膜结构域和一个或多个在转导的T细胞中诱导持久性、运输和效应子功能的细胞内信号结构域组成。用于定义CAR抗原靶向基序的序列通常来源于单克隆抗体,但也可以使用配体和其他受体。
因此,本发明还提供一种制备工程化T细胞的方法,包括:
(1)提供本发明的重组腺病毒;
(2)将所述重组腺病毒、靶向T细胞基因组的目标基因序列的sgRNA或其编码多核苷酸、靶向sgRNA靶标序列的sgRNA或其编码多核苷酸、和编码Cas9或Cpf1的mRNA或多核苷酸递送进T细胞,从而获得工程化T细胞。
在一个实施方案中,重组腺病毒、靶向T细胞基因组的目标基因序列的sgRNA或其编码多核苷酸、靶向sgRNA靶标序列的sgRNA或其编码多核苷酸、和编码Cas9或Cpf1的mRNA或多核苷酸可以一起或分别递送进T细胞。递送的方法是本领域技术人员熟知的。
在一个实施方案中,所述T细胞来源于外周血单核细胞(PBMC)或脐带血。优选地,所述T细胞包括但不限于炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞,更优选CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
在一个实施方案中,编码靶向T细胞基因组的目标基因序列的sgRNA的多核苷酸、编码靶向sgRNA靶标序列的sgRNA的多核苷酸、和编码Cas9或Cpf1的多核苷酸存在于一个或多个表达载体上。
本发明还提供通过上述制备方法获得的工程化T细胞以及包含所述工程化T细胞的组合物。
在一个实施方案中,所述工程化T细胞是TCR T细胞或CART细胞。在一个优选的实施方案中,所述CART细胞是通用型CART细胞。
根据本发明的工程化T细胞具有广泛用途,例如用作用于治疗或预防疾病诸如癌症、感染或自身免疫疾病的药物组合物产品的活性成分,理想地用作“现成”产品。
可以通过工程化T细胞治疗的病症包括但不限于癌症、感染或自身免疫疾病。可以用工程化T细胞治疗的癌症包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、转移性腺癌、肝转移瘤、肉瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、 间皮瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、恶性神经胶质瘤、肝细胞、非小细胞肺癌(NSCLC)、神经节细胞瘤、脑癌、肾癌和前列腺癌。可以用工程化T细胞治疗的感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。可以用工程化T细胞治疗的自身免疫疾病包括但不限于I型糖尿病、乳糜泻、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血和系统性红斑狼疮。
工程化T细胞通过识别特异性肿瘤抗原消除癌症。在本文中,肿瘤抗原选自:TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列素酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE A、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素和端粒酶、PCTA-l/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1,及其任意组合。
用于基因编辑的系统、组合物或试剂盒
本发明还提供用于基因编辑的系统、组合物或试剂盒,其包含本发明的重组腺病毒。
在一个优选的实施方案中,所述系统、组合物或试剂盒还包含:靶向重组腺病毒中的一个或两个sgRNA靶标序列的一个或两个sgRNA或其编码多核苷酸。
在另一个优选的实施方案中,所述系统或试剂盒还包含编码Cas蛋白酶的mRNA或多核苷酸,例如Cas9或Cpf1mRNA或其编码多核苷酸。
在本发明中,当以多核苷酸的形式提供sgRNA或Cas9或Cpf1时,所述多核苷酸可以存在于一个或多个表达载体中。
下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是,本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的,并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
图1:不同结构的腺病毒引起重组的示意图;A:重组腺病毒不包含sgRNA靶标序列。这种情况下,腺病毒基因组中的第一同源臂和第二同源臂通过与细胞基因组中的目标基因序列的两端序列互补配对插入到细胞基因组中,从而替换目标基因序列,但由于腺病毒基因组序列较大(约为40kb),这种插入的效率极低;B和C:重组腺病毒包含两个sgRNA靶标序列(本发明),分别位于第一同源臂的5’端(sgRNA-1target)和第二同源臂的3’端(sgRNA-2target)。通过加入靶向sgRNA靶标序列的sgRNA和靶向细胞基因组中目标基因序列的sgRNA,可以通过CRISPR系统在细胞基因组上形成双链断裂缺口的同时,将由第一同源臂、目的表达框和第二同源臂组成的DNA片段从腺病毒基因组中切割下来,该DNA片段既可以通过NHEJ途径插入细胞基因组中的缺口(B),也可以通过HR途径直接替换细胞基因组中的目标基因序列(C);D:重组腺病毒包含一个sgRNA靶标序列(本发明),位于第一同源臂的5’端(sgRNA-4target),这种 情况下,加入靶向细胞基因组中目标基因序列的sgRNA可以切割细胞基因组中的目标基因序列形成缺口,加入靶向sgRNA靶标序列的sgRNA可以切割重组腺病毒的基因组,使其线性化,然后腺病毒基因组中的第一同源臂和第二同源臂通过与细胞基因组中的目标基因序列的两端序列互补配对插入到细胞基因组中,从而替换目标基因序列。
图2:使用腺病毒载体在293T细胞中进行定点基因插入;1.转染pAd5F35-TRAC-CAR-HDR质粒并同时转染Cas9 mRNA和sgRNA;2.转染pAd5F35-TRAC-CAR-HDR质粒并转染Cas9 mRNA;3.转染pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR质粒并同时转染Cas9 mRNA和sgRNA;4.转染pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR质粒并转染Cas9 mRNA;5.仅转染Cas9 mRNA和sgRNA;6.仅转染Cas9 mRNA;箭头示出了目标条带。
图3:使用腺病毒在A549细胞中进行HR和NHEJ介导的定点基因插入;I-1至I-3:仅加入pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒,且I-1至I-3中腺病毒的MOI分别为5X10
3、2.5X10
3和1X10
3;I-4:完全空白对照(未转染Cas9 mRNA和sgRNA且未加入腺病毒);II-1至II-3:加入pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒并转染Cas9 mRNA,且II-1至II-3中腺病毒的MOI分别为5X10
3、2.5X10
3和1X10
3;II-4:仅转染Cas9 mRNA;III-1至III-3:加入pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒并同时转染Cas9 mRNA和sgRNA,且III-1至III-3中腺病毒的MOI分别为5X10
3、2.5X10
3和1X10
3;III-4:仅转染Cas9 mRNA和sgRNA;箭头示出了约1000bp大小和2000bp大小的目标条带。
图4:使用腺病毒在T细胞中进行HR介导的定点基因插入;1、加入pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒并同时转染Cas9 mRNA和sgRNA;2、加入pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒并转染Cas9 mRNA;3、完全空白对照(未转染Cas9 mRNA和sgRNA且未加入腺病毒);箭头示出了目标条带。
图5:分别在宿主基因组和腺病毒上单切可避免NHEJ介导的插入;1、加入pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒并同时转染Cas9 mRNA和基因组靶向sgRNA(TRAC-sgRNA);2、加入 pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒并同时转染Cas9 mRNA、基因组靶向sgRNA(TRAC-sgRNA)和腺病毒左臂单切sgRNA(sgRNA-4);箭头示出了目标条带。
图6:使用载体质粒和腺病毒转染A549细胞和293T细胞的结果;MFI:平均荧光强度;用Two-way ANOVA分析,并用T test进行统计学分析;**表示P值小于0.05,***表示P值小于0.01,达到显著水平;ns表示没有显著差异。
除非另有说明,下列实施例中的具体试验方法按照常规条件如科学出版社出版的J.萨姆布鲁克等编著的第三版《分子克隆指南》中所记载的条件,或按照制造厂商所建议的条件进行操作。
实施例1
构建腺病毒载体
1.构建穿梭载体
合成sgTRAC-CAR-HDR,其依次包含:TRAC sgRNA靶标序列(SEQ ID NO:1)、第一同源臂(SEQ ID NO:2)、目的基因CD19-CD22 CAR(SEQ ID NO:3)、第二同源臂(SEQ ID NO:4)和TRAC sgRNA靶标序列(SEQ ID NO:1)。合成TRAC-CAR-HDR,其依次包含:第一同源臂(SEQ ID NO:2)、目的基因TRAC(SEQ ID NO:3)和第二同源臂(SEQ ID NO:4)。将sgTRAC-CAR-HDR和TRAC-CAR-HDR通过酶切分别连接入pSIREN-Shuttle穿梭载体(Clontech,货号631527)。
2.构建腺病毒载体质粒
使用PI-SceI/I-CeuI内切酶分别将穿梭载体中的sgTRAC-CAR-HDR和TRAC-CAR-HDR序列克隆至pAd5F35腺病毒载体,获得pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR(图1B-C)和pAd5F35-TRAC-CAR-HDR(图1A)载体质粒。
实施例2
使用腺病毒载体质粒进行定点基因插入
将293T细胞使用0.05%Trypsin-EDTA(1x)(Gibco,货号25300-062)进行消化后,用opti-MEM(Gibco,货号31985070)洗涤两次,然后使用电穿孔的方式将20μg Cas9 mRNA(SEQ ID NO:6)转染进293T细胞。然后,将转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche,货号06366546001)与pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR或pAd5F35-TRAC-CAR-HDR载体质粒2:1(v/w)混匀,在室温静置15min后,缓慢加入至293T细胞中。1天后,用上述转染Cas9 mRNA相同的方式,将10μg靶向TRAC基因的sgRNA(SEQ ID NO:5)转染进已经感染载体质粒的293T细胞。用靶向TRAC基因的sgRNA和Cas9 mRNA,或单独的Cas9 mRNA转染未感染载体质粒的293T细胞作为对照。转染3天后,提取293T细胞的基因组DNA,通过PCR扩增验证基因插入情况。用于PCR扩增的引物为:位于基因组DNA上的PCR-F(SEQ ID NO:7)和位于载体质粒上的PCR-R(SEQ ID NO:8)。
将PCR扩增产物进行凝胶电泳,结果显示:无论是同时转染Cas9mRNA和sgRNA,还是转染单独的Cas9 mRNA,使用pAd5F35-TRAC-CAR-HDR载体质粒均不能获得目标条带。仅当同时转染Cas9 mRNA、sgRNA和pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR载体质粒时,获得目标条带扩增(图2)。对PCR扩增产物进行测序,结果证明CAR-HDR(即,目的基因CD19-CD22CAR和两个同源臂)被特异插入293T细胞基因组DNA中的TRAC位点。
以上结果表明,pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR载体质粒可有效介导位点特异性的定点基因插入。
实施例3
包装腺病毒
根据制造商的建议,使用
Xtra Midi Plus EF试剂盒(德国MN(MACHEREY-NAGEL),货号:740422.1)从菌液提取pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR和pAd5F35-TRAC-CAR-HDR载体质粒。
将60μg载体质粒与120μl转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche,货号06 366 546 001)在3ml opti-MEM (Gibco,货号31985070)培养液中混匀,室温放置15min后,逐滴加入293A细胞(50-70%的汇合度)。6h后,替换成新鲜的DMEM完全培养液。将细胞培养瓶放在显微镜下观察,观察到空斑形成后,将培养液在4℃、500g下离心10min,去除大部分上清,只留2ml上清液重悬细胞沉淀,存储于-80℃。将病毒反复冻融3次后,用上述方法再次感染293A细胞,在4℃、500g下离心10min后,获得细胞沉淀悬浮液,存储于-80℃。如此循环感染三次后,病毒得到大量扩增。之后,用腺病毒纯化试剂盒(Biomiga,货号V1160-01)对病毒进行体外纯化,获得pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒和pAd5F35-TRAC-CAR-HDR腺病毒。
实施例4
使用腺病毒进行定点基因插入
1.在A549细胞中的定点基因插入。
使用pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR和pAd5F35-TRAC-CAR-HDR腺病毒感染A549细胞。1天后,通过电穿孔的方式用靶向TRAC基因的sgRNA(SEQ ID NO:5)和Cas9 mRNA(SEQ ID NO:6),或仅用Cas9 mRNA转染感染的A549细胞。用靶向TRAC基因的sgRNA和Cas9 mRNA,或单独的Cas9 mRNA转染未感染腺病毒的A549细胞作为对照。转染3天后,提取A549细胞的基因组DNA,通过PCR扩增验证基因插入情况。用于PCR扩增的引物为:位于基因组DNA上的PCR-F(SEQ ID NO:7)和位于载体质粒上的PCR-R(SEQ ID NO:8)。
将PCR扩增产物进行凝胶电泳,结果显示:无论是同时转染Cas9mRNA和sgRNA,还是转染单独的Cas9 mRNA,使用pAd5F35-TRAC-CAR-HDR腺病毒均不能获得目标条带。仅当同时转染Cas9 mRNA、sgRNA和pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒时,获得长度分别为约1000bp和2000bp的两条目标条带(图3)。将两条目标条带进行测序,发现1000bp大小的目标条带是CAR-HDR特异性地正确插入A549细胞基因组DNA中的TRAC位点,是HR介导的定点基因插入的结果;而2000bp大小的目标条带则显示细胞将 CAR-HDR片段以不依赖于同源重组的方式整合入TRAC的编辑位点,由于CRISPR编辑出现不同的indel,因此Sanger测序显示CAR-HDR序列与基因组结合位置出现套峰,表明是由NHEJ介导的定点基因插入的结果。
以上结果表明,pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒可以有效介导目标基因的定点插入。
2.在T细胞中的定点基因插入
一般而言,与其他细胞相比,T细胞的基因定点插入难度更大。因此,我们也测试了用本发明方法在T细胞中进行定点插入的情况。
将用DynaBeads CD3/CD28 CTS
TM(Gibco,货号40203D)激活后的T细胞opti-MEM(Gibco,货号31985070)洗涤两次后,用pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒感染激活的T细胞。
1天后,通过电穿孔的方式用靶向TRAC基因的sgRNA(SEQ ID NO:5)和Cas9 mRNA(SEQ ID NO:6),或仅用Cas9 mRNA转染T细胞。用未转染的感染T细胞作为对照。转染3天后,提取T细胞的基因组DNA,通过PCR扩增验证基因插入情况。用于PCR扩增的引物为:位于基因组DNA上的PCR-F(SEQ ID NO:7)和位于载体质粒上的PCR-R(SEQ ID NO:8)。
将PCR扩增产物进行凝胶电泳,结果显示:仅当同时转染Cas9 mRNA、sgRNA和pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒时,获得目标条带扩增(图4)。对PCR扩增产物进行测序,结果证明CAR-HDR被特异插入T细胞基因组DNA中的TRAC位点。
以上结果表明,pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR腺病毒可有效介导位点特异性的定点基因插入T细胞。
实施例5
使用腺病毒进行定点基因插入
为了减少NHEJ介导的插入造成的基因组多样性,避免非HR介导插入的发生,我们使用仅含有一个sgRNA靶标序列的腺病毒。
具体地,如实施例1和3所述,制备pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR1腺病毒,其依次包含:sgRNA-4靶标序列(SEQ ID NO:9)、第一同 源臂(SEQ ID NO:2)、目的基因CD19-CD22CAR(SEQ ID NO:3)和第二同源臂(SEQ ID NO:4)。
然后,用电穿孔的方式将Cas9 mRNA(SEQ ID NO:6)转染进A549细胞,再用pAd5F35-sgTRAC-CAR-HDR1腺病毒进行感染。之后,用靶向宿主细胞基因组的TRAC-sgRNA(SEQ ID NO:5)和靶向sgRNA-4靶标序列的sgRNA(SEQ ID NO:10)共同转染A549细胞,或者仅用靶向A549宿主细胞基因组的TRAC-sgRNA(SEQ ID NO:5)转染A549细胞作为对照。转染3天后,提取A549细胞的基因组DNA,通过PCR扩增验证基因插入情况。用于PCR扩增的引物为:位于基因组DNA上的PCR-F(SEQ ID NO:7)和位于载体质粒上的PCR-R(SEQ ID NO:8)。
将PCR扩增产物进行凝胶电泳,结果显示:当用单个sgRNA靶标序列对腺病毒基因组进行切割,获得1000bp左右的条带,并且基本没有2000bp左右的条带(图5)。对PCR扩增产物进行测序,结果证明CAR-HDR被特异插入细胞基因组DNA中的TRAC位点。
以上结果表明,在腺病毒基因组上单切可以有效介导HR,同时避免NHEJ介导的插入。
实施例6
质粒和腺病毒转染效率的比较
为了比较质粒和腺病毒的转染效率,我们分别使用GFP质粒和pAd5F35-GFP腺病毒转染A549细胞和293T细胞,24小时后通过流式细胞术检测GFP的表达水平。结果显示,不管是对于A549细胞还是293T细胞,pAd5F35-GFP腺病毒感染细胞后,GFP表达水平(以平均荧光强度MFI表示)都显著高于GFP质粒转染的细胞,具有明显的统计学差异(图6)。
以上结果表明,与质粒相比,腺病毒能够显著提高转染细胞的效率。
需要说明的是,以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是,凡在本发明的精神和原则之内,所作 的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
- 一种重组腺病毒,其特征在于:包括目标表达框、位于目标表达框5’端的第一同源臂、位于目标表达框3’端的第二同源臂以及一个或两个sgRNA靶标序列。
- 根据权利要求1所述的一种重组腺病毒,其特征在于:包括一个sgRNA靶标序列,其位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端。
- 根据权利要求1所述的一种重组腺病毒,其特征在于:包括两个sgRNA靶标序列,其分别位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端。
- 根据权利要求1所述的一种重组腺病毒,其特征在于:还包括启动子、反向末端重复序列(ITR)和/或包装信号。
- 根据权利要求1所述的一种重组腺病毒,其中所述腺病毒是Ad5、Ad5F35、Ad35、Ad55、Ad2、Ad5F11、pAdBM5或pADCMV5。
- 一种基因编辑的方法,其特征在于,包括以下步骤:以权利要求1-5任一项所述的重组腺病毒作为供体,在靶向细胞基因组目标基因序列的sgRNA和靶向sgRNA靶标序列的sgRNA存在下,通过CRISPR/Cas系统对细胞基因组进行基因编辑。
- 根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述第一同源臂、第二同源臂分别与细胞基因组的目标基因序列两端的300-3000bp的序列互补。
- 根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述细胞为哺乳动物细胞、造血干细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞或者单核细胞。
- 根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述靶向细胞基因组目标基因序列的sgRNA以RNA的形式提供,或以编码sgRNA的多核苷酸的形式提供;所述靶向sgRNA靶标序列的sgRNA以RNA的形式提供,或以编码sgRNA的多核苷酸的形式提供。
- 根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述CRISPR/Cas 系统中的Cas酶为Cas9或Cpf1。
- 根据权利要求10所述的方法,其特征在于:所述Cas蛋白酶以编码所述Cas蛋白酶的mRNA的形式提供,或以编码所述Cas蛋白酶的多核苷酸的形式提供,或以蛋白形式提供。
- 一种利用权利要求1-5任一项所述的重组腺病毒在基因编辑的系统、组合物或试剂盒中的应用。
- 一种利用权利要求7-11任一项所述的基因编辑的方法在对动物受精卵进行基因编辑中的应用。
- 一种利用权利要求1-5任一项所述重组腺病毒在制备工程化T细胞及其组合物中的应用。
- 一种将权利要求14所制备的工程化T细胞及其组合物在制备用于治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的药物中的用途。
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2019
- 2019-10-31 CN CN201911053013.4A patent/CN110885799A/zh active Pending
-
2020
- 2020-09-16 WO PCT/CN2020/115644 patent/WO2021082784A1/zh active Application Filing
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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ZHANG, JP ET AL.: "Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage", GENOME BIOLOGY, vol. 18, 20 February 2017 (2017-02-20), XP055399694, ISSN: 1474-760X, DOI: 10.1186/s13059-017-1164-8 * |
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