CN106062199B

CN106062199B - 制造腺病毒和相应质粒的方法

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Publication number: CN106062199B
Application number: CN201480074534.7A
Authority: CN
Inventors: A·C·N·布朗; T·尼科尔森
Original assignee: Psioxus Therapeutics Ltd
Current assignee: Arcamis Biology
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2034-12-23
Also published as: CN106062199A; AU2014372562A1; KR20160102024A; IL246235A0; JP2021040651A; US20160319304A1; AU2014372562B2; US10472648B2; CA2934015A1; WO2015097220A1; JP2017501695A; JP6804133B2; JP7104994B2; SG11201604801WA; IL246235B; GB201322851D0

Abstract

本公开涉及制造包含一部分或全部的腺病毒基因组和一个或多个允许所述腺病毒基因组的快速和灵活操纵的原始限制性位点的腺病毒质粒的方法，和制备例如包含转基因的腺病毒构建体的方法。本公开还扩展至在所述方法中使用和由所述方法产生的新型中间体，所述方法的质粒和穿梭载体以及可从所述质粒和/或方法获得的腺病毒或腺病毒载体。本公开还涉及例如从本文公开的方法获得的病毒或载体在疗法中的用途，例如在癌症治疗中的用途。

Description

制造腺病毒和相应质粒的方法

技术领域

背景技术

出于许多原因希望将转基因插入腺病毒中，例如，使用有复制能力的病毒或复制缺陷型病毒载体来武装治疗性病毒以增加治疗效果或将基因递送至靶细胞。

通常，为了将转基因插入病毒基因组中，产生包含腺病毒基因组的质粒，然后例如使用同源重组将所述转基因插入所述质粒中，然后从所述质粒切除病毒基因组。然而，出于本文中所述的原因，可以用于有复制能力的病毒和复制缺陷型病毒载体并且例如可以在已知和可预测的位置接受大的转基因的柔性质粒并不总是容易得到的，特别是如果所述转基因被插入不寻常的位置(例如E1或E3区外部)的话。

与出于治疗和诊断目的将转基因插入腺病毒中相关的问题分为3个主要类别。首先，并非所有的腺病毒都是治疗和诊断应用的理想候选物，例如，Ad5(C亚群腺病毒)免疫性在人类群体中是普遍的并且因此所述病毒在其施用后被免疫系统迅速清除。为了克服这个问题，已经利用了存在较小普遍免疫性的腺病毒。然而，迄今为止大部分的基因组工作都是关于Ad5。因此，用于替代腺病毒的材料和资源往往不可用。

其次，并非所有的腺病毒都可以接受大的转基因并且保持其作为活病毒的稳定性。此外，腺病毒基因组较大并且在不影响病毒功能的情况下插入额外遗传物质的空间很小，例如将病毒包装到病毒衣壳中的功能可能受到不利影响，这又可能影响病毒的感染性。

为了克服这个问题，已经对基因组作出缺失。这种策略特别适合于复制缺陷型病毒载体，因为一个或多个复制所必需的基因被除去。这既限制了载体在体内复制的能力并且又在基因组中产生空间，从而允许插入大的转基因。这些转基因可以在体内表达，而与病毒载体不能复制无关。最频繁的是E1基因已经缺失。现有技术系统，例如ADEASY系统(Agilent Technologies)，允许将转基因插入E1区。在一些情况下，部分或全部的E3区缺失，参见例如WO2011/0123564，并且所述基因可被插入缺失区域中。

因此，通常将转基因插入发生缺失的相同位置中。因此，转基因插入位点已经在很大程度上局限于早期基因的位置，这可能是有问题的，因为它更可能会影响病毒基因表达、病毒生命周期和/或复制速度。特别是，缺失E1区不适于有复制能力的腺病毒并且如所讨论的，它可能可用于插入转基因以使得它不在早期基因位置中以确保对病毒生命周期的影响被最小化。

第三，腺病毒基因组不容易操纵，因为所述基因组是密集的并且具有很少的可在其中安全插入转基因而不影响病毒生命周期和/或功能(例如转录)的基因间物质。此外，在基因间区域中存在很少的(如果有的话)限制性位点并且甚至更少，即在基因组中仅出现一次。后者是相关的，因为当限制性位点在病毒基因组中出现一次以上时，则使用所述限制性位点在一个位置中选择性插入转基因的能力严重受阻。

因此，希望提供可以用于操纵有复制能力的病毒并且其中转基因可被插入从早期基因除去的位置中的质粒。

有复制能力的病毒可以利用的一种策略是使用非偏向性插入转座子以将转基因插入基因组中(如Jin等,2004中所述)。所述转座子可被插入晚期基因中并且因此这种技术不会具有上述系统的缺点。Jin等假设，基因插入位置的位点受到所插入基因类型影响，并且同时可在插入后置换一些基因，在一些情况下这难以置换所插入的基因或者将置换基因插入不同的定向。转座子插入的随机特性提供了许多可能的插入位点。因此，结果是可能会损害插入的可预测性和再现性。此外，所述转座子本身与转基因一起插入基因组中并且在理论上可在稍后日期“移动”所述基因在病毒基因组中的位置。然而，尽管随机插入转座子是用于研究病毒基因组的奇妙工具，但这种方法的最大缺点在于它不允许病毒构建体的合理设计。

因此，希望提供可以用于操纵有复制能力的病毒并且其中转基因可重现地插入从早期基因除去的位置中的质粒。

本发明人着手于通过产生具有限制性位点组合的质粒来克服一种或多种上述问题，所述限制性位点可用于选择性地将转基因特异性插入并非早期基因位点的位置中。

本发明人已经开发了在L5基因附近包含原始限制性位点的腺病毒质粒。本公开的质粒允许产生在非早期基因位点的位置中具有限制性位点/转基因的病毒，例如对于E1区完整的有复制能力的腺病毒或者例如E1和/或E3缺失或中断的复制缺陷型腺病毒。

发明内容

在一个方面，提供制备包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的穿梭载体的方法，所述腺病毒基因组包含5'ITR、3'ITR、L5基因，所述方法包括如下步骤：

a)制备包含连接相等比例的以下三个片段的腺病毒穿梭载体：

i)包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的载体片段，其中所述载体片段的5'端起始于第一限制性酶位点并且在所述载体片段的3'端终止于第二限制性酶位点，

ii)包含所述腺病毒基因组的5'端的5'臂(包括所述5'ITR)，其中所述5'臂的5'端起始于第二限制性酶位点并且在所述5'臂的3'端终止于第三限制性酶位点，

iii)包含所述腺病毒基因组的3'端的3'臂(包括所述3'ITR和所述L5基因)，其中所述3'臂的5'端起始于第三限制性酶位点并且在所述3'臂的3'端终止于第一限制性酶位点，

和进行一步三元连接以：

在所述第一限制性酶位点将所述3'臂(片段iii)的3'端接合至所述载体片段(片段i)的5'端，

在所述第二限制性酶位点将所述载体片段(片段i)的3'端接合至所述5'臂(片段ii)的5'端，和

在所述第三限制性酶位点(至少L5基因)将所述5'臂(片段ii)的3'端接合至所述3'臂(片段iii)的5'端，

以形成布置成如下的环化穿梭载体：第一限制性酶位点，接着是载体片段，接着是第二限制性酶位点，接着是5'臂，接着是第三限制性酶位点，接着是3'臂，

b)将至少一个原始限制性位点和/或转基因引入所述穿梭载体中介于所述L5基因与选自包含(或由以下组成)E3位点、E4位点或所述位点两者的群组的位点之间的位置中。

在一个实施方案中，所述方法包括另一个步骤c)：

c)在步骤a)或步骤b)的穿梭载体与所述腺病毒基因组之间进行同源重组以形成质粒。

在一个方面，提供制备包含腺病毒基因组、选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的腺病毒质粒的方法，所述腺病毒基因组包含5'ITR、3'ITR、L5基因、E3位点和E4位点，所述方法包括如下步骤：

和进行一步三元连接以：

在所述第三限制性酶位点将所述5'臂(片段ii)的3'端接合至所述3'臂(片段iii)的5'端，

b)将至少一个原始限制性位点引入所述穿梭载体中介于所述L5基因与选自包含(或由以下组成)E3位点、E4位点和所述位点两者的群组的位点之间的位置中，和

在一个实施方案中，步骤b)是在步骤a)之前进行的。

在一个实施方案中，步骤b)是在步骤a)之后进行的。

在一个实施方案中，所述5'臂包含约2.4至4.7kb的腺病毒基因组的5'端。

在一个实施方案中，所述3'臂包含约3.3至4.8kb的腺病毒基因组的3'端。

在一个实施方案中，进行一步三元连接的时期是至少50分钟，例如1小时或更长，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。

在一个实施方案中，所述一步三元连接是在约10至40℃的温度范围中、例如20至25℃、例如在大约室温/环境温度下进行的。

在一个实施方案中，所述腺病毒是人类腺病毒，例如B型亚群，例如选自EnAd、OvAd1、OvAd2、Ad3、Ad5(它是C群病毒)和Ad11的病毒。在一个实施方案中，所述腺病毒不是Ad5。在一个实施方案中，所述腺病毒不是A群病毒。在一个实施方案中，所述腺病毒不是C群病毒。

在一个实施方案中，所述腺病毒是能够复制或有复制能力的，例如有复制能力的。在一个实施方案中，所述腺病毒不是条件性复制病毒。在一个实施方案中，所述腺病毒是复制缺陷型的。

在一个实施方案中，原始限制性位点独立地选自FseI、NotI、SbfI和SgfI，例如NotI或SbfI和SgfI或FseI和NotI和SbfI和SgfI。

在一个实施方案中，所述载体片段中的第一限制性位点和所述3'臂中的第一限制性位点是相同的。在一个实施方案中，所述载体片段中的第二限制性位点和所述5'臂中的第二限制性位点是相同的。在一个实施方案中，所述5'臂中的第三限制性位点和所述3'臂中的第三限制性位点是相同的。

在一个实施方案中，所述第一限制性位点和所述第二限制性位点是相同的。

在一个实施方案中，所述载体片段在连接之前被脱磷酸化。

在一个实施方案中，所述复制起点是p15A。

在一个实施方案中，所述选择标记基因是KanR或AmpR，例如KanR。

在一个实施方案中，步骤c)是在步骤a)或b)的穿梭载体与腺病毒基因组分别为3.5份:1.5份的比率下，例如在电感受态BJ5183细胞中进行的。

在一个实施方案中，所述方法包括将至少一种转基因插入例如除早期基因位置之外的位置(例如与纤维L5相关)中的另一个步骤。在一个实施方案中，所述转基因呈盒形式，例如其包含剪接受体序列。

在一个实施方案中，所述转基因在内源腺病毒启动子、例如主要晚期启动子的控制下。在一个实施方案中，位于L5后的一个或多个基因在主要晚期启动子或E4启动子的控制下。在一个实施方案中，位于L5之前的一个或多个基因在主要晚期启动子或E3启动子的控制下。直接位于L5起始密码子之前的基因可能在主要晚期启动子的控制下并且通常将需要含有允许L5表达的调节元件。

在一个实施方案中，位于L5之后的一个或多个基因在外源启动子的控制下。

在一个实施方案中，所述方法还包括从质粒切除腺病毒基因组和形成病毒或病毒载体的步骤。

因此，本公开的方法提供本公开的质粒和中间体如穿梭载体。

在实施方案中，所述方法包括制备病毒或病毒载体的药物制剂的另一个步骤。

在一个实施方案中，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的病毒或病毒载体或药物组合物的另一个步骤。

在一个实施方案中，提供一种腺病毒质粒，其包含：

a)包含L5基因、E3位点和E4位点的腺病毒基因组，

b)在介于L5基因与选自E3位点、E4位点以及E3和E4位点中的每个的位点之间的位置中的至少一个原始限制性位点，

c)低拷贝细菌复制起点，和

d)选择标记基因。

在一个实施方案中，所述质粒还包含转基因，例如呈转基因盒形式。

在一个实施方案中，所述转基因选自包含以下的群组：编码治疗蛋白的相关治疗基因、肽或RNA如抗体或抗体结构域、前药转化酶、免疫调节剂、酶、siRNA、转录因子、细胞内信号传导或表面膜蛋白、抗原；和报道基因或成像剂，例如荧光素酶或eGFP。

有利的是，所述方法提供产生新型腺病毒质粒和中间体穿梭载体的灵活手段，其中例如在步骤b)中引入原始限制性位点允许在调节早期基因表达的区域外部操纵腺病毒基因组。

附图说明

图1示出ColoAd1基因组的示意图。早期基因(E1、E2、E3和E4)以深灰色显示并且晚期基因(L1、L2、L3、L4和L5)以浅灰色显示。

图2示出ColoAd质粒-ColoAd2.0、ColoAd2.1和ColoAd2.4的示意图。

图3示出ColoAd2.0、ColoAd2.1和Colo2.4质粒中的ColoAd1基因组序列的特定变异。以黑色示出的所有碱基对都是ColoAd1基因组序列额外的。示出特定限制性酶的序列和名称。

图4示出显示ColoAd1基因组中的PspOMI限制性位点位置的示意图。

图5示出ColoAd质粒构建的概述。

图6示出ColoAd1穿梭载体的限制性位点图谱。

图7示出用于插入ColoAd2.4质粒或ColoAd2.4穿梭载体中的通用转基因盒设计。

图8示出具有p15A复制起点、卡那霉素抗性基因、ColoAd1的ITR、E1A、E1B基因、部分E2B基因、部分E3基因、纤维基因和E4基因的12kb ColoAd1穿梭载体。

图9示出详述了PspOMI和AclI限制性位点的ColoAd1图谱。

图10示出：

A-5'臂PCR扩增产物。含有由5'AscI和3'PspOMI限制性位点侧接的ColoAd1 5'ITR、E1A、E1B和部分E2B基因的约4.6kb片段。

B-3'臂PCR扩增产物。含有由5'PspOMI和3'AscI限制性位点侧接的ColoAd1的E3、纤维、E4和3'ITR的约4.5kb片段。

C-p15A-KanR载体片段PCR产物。含有5'和3'AscI限制性位点的约2.9kb片段。

图11示出：

A-5'臂、3'臂和p15a KAN载体片段的PCR产物。产物分别是4.6kb、4.5kb和3kb。

B-5'臂和3'臂的PCR产物。

图12示出AscI和AscI/PsPOMI消化的p15A-Kan载体片段以及5'和3'臂。消化产物以黑色框突出显示。

图13示出显示引物结合区和每个PCR扩增的预期产物的示意图。

图14示出显示代表性筛选克隆的PCR产物的凝胶。构建体13、14和16显示适当尺寸的PCR产物。这些构建体是在1:1:1(5'臂:3'臂:p15a载体片段)下的三向连接反应后产生的。使用1:1:6或1:1:12连接比率的构建体都不显示适当尺寸的PCR产物。

图15示出利用所选构建体的PspOMI或AscI/PspOMI的限制性分析。在1:1:1比率下的三向连接后产生的构建体13和16显示适当尺寸的消化产物。样品编号16(maxi)对应于已经从构建体16产生的消化maxi prep。

图16示出显示来自使用制造ColoAd1穿梭载体的两步骤连接方法产生的构建体的PCR产物的凝胶。所筛选的构建体都不显示适当的PCR产物。

图17示出ColoAd2.4穿梭载体。所述穿梭载体含有纤维基因下游的SgfI和SbfI原始限制性位点。

图18示出侧接PsPOMI和AclI限制性位点的ColoAd2.4合成片段的示意图。

图19示出假定ColoAd2.4穿梭载体构建体的限制性分析。所有5种构建体都显示对应于ColoAd2.4穿梭载体的适当尺寸的谱带；在EcoRV和SbfI消化后的3kb和9kb谱带。

图20示出ColoAd2.0穿梭载体。所述穿梭载体含有纤维(L5)基因上游的原始FseI位点和2个polyA序列以及纤维(L5)基因下游的原始SgfI、NotI、SbfI位点。

图21示出侧接PspOMI和AclI限制性位点的ColoAd2.0合成片段的示意图。

图22示出利用酶FseI、AscI、SbfI或PspOMI进行的假定ColoAd2.0穿梭载体构建体的限制性分析。所有五种构建体都显示对应于ColoAd2.0穿梭载体的适当尺寸的谱带。

图23示出ColoAd2.1穿梭载体。所述穿梭载体含有纤维(L5)基因上游的原始NotI位点。

图24是用于构建用于插入ColoAd1穿梭载体中以产生ColoAd2.1穿梭载体的DNA片段(C)的PCR 1(A)和PCR 2(B)产物的示意图。

图25示出假定ColoAd2.1穿梭载体构建体的限制性分析。所有5种构建体都显示对应于ColoAd2.1穿梭载体的适当尺寸的谱带；在AscI和NotI消化后的3kb、4kb和5kb谱带。

图26示出重组ColoAd2.4质粒。所述重组体含有p15A复制起点、卡那霉素抗性和具有纤维下游的原始SgfI和SbfI限制性位点的ColoAd1基因组。

图27示出：

A-铺有电穿孔的BJ5183细胞的LB+卡那霉素板。左侧板是阴性对照并且右侧板是ColoAd1+线性化ColoAd2.4穿梭载体重组。

B-限制性消化的ColoAd2.4重组体。用EcoRV和SbfI(E+S)消化候选重组体。重组体3、8和10显示22kb、5.5kb、4.7kb和2.8kb的谱带，指示适当形成的重组体。重组体此外用PspOMI(P)消化，得到16kb、12kb和7kb的谱带。

图28示出假定ColoAd2.4重组体的限制性分析。重组体4在PspOMI消化(P)时显示16kb、12kb和7kb的适当尺寸的谱带并且在SbfI和EcoRV消化(E+S)时显示22kb、4.7kb、5.5kb和2.8kb的谱带。消化证实仅在#4中存在重组体ColoAd2.4。

图29示出：

A-在5'臂-3'臂连接后的PCR扩增产物。使用0198(1)或0199(2)引物，在低体积连接后的PCR产生约9.1kb片段。在高体积连接后的PCR并不高效。

B-AscI消化的低体积5'臂-3'臂连接产物(约9.1kb，泳道1和2)和AscI消化的p15A-Kan载体片段(约3kb，泳道3)。

图30示出质粒pNG-62的图谱。这是从质粒ColoAd2.4产生的并且含有p15A复制起点、卡那霉素抗性盒和具有插入原始SgfI和SbfI限制性位点之间的GFP报道基因转基因盒的ColoAd1基因组。

图31是pNG-62质粒中存在的转基因盒的示意图。所述盒含有分支剪接受体序列(bSA)、KOZAK序列、绿色荧光蛋白(GFP)cDNA和SV40晚期polyA序列。所述盒被用于插入ColoAd2.4载体中的SgfI和SbfI限制性位点侧接。

图32是含有pNG-62转基因盒的限制性消化构建体。所有五种构建体都含有适当尺寸的盒。

图33A–示出用酶NheI和EcoRV消化的pNG-62质粒的初步限制性分析。来自1.5:1连接比率的编号为1、2和3的构建体和来自2:1连接比率的编号为1、2和4的构建体显示对应于pNG-62质粒的适当谱带模式。

B–示出两种pNG-62构建体利用酶BglII或酶NheI和EcoRV的诊断限制性消化和用于构建pNG-62的质粒ColoAd2.4。DNA片段的谱带模式证实pNG-62质粒的构建。

图34A–感染从转染NG-62基因组DNA的Hek293细胞收集的NG-62病毒粒子24小时(上图)或48小时(下图)的AD293细胞的明场显微镜图像。

B–对应于A中的明场图像的荧光显微镜图像，其示出感染NG-62病毒粒子24小时(上图)或48小时(下图)的AD293细胞中的GFP表达。

具体实施方式

如本文所用的载体是指用作人工运载遗传物质到另一个构建体或细胞(例如它可以在其中复制和/或表达)中的运载体的DNA分子。制备穿梭载体的方法和所述穿梭载体本身已允许本发明人构建含有所有必要功能性以允许腺病毒基因组操纵的质粒。

如本文所用的穿梭载体是指例如可以在两种类型的宿主细胞(通常是细菌和哺乳动物细胞)中繁殖的载体。

现有技术穿梭载体通常在3'臂中仅含有最少量的腺病毒基因组DNA，例如约100个碱基对的反向末端重复(ITR)序列。这个3'片段足以允许重组，但不允许基因组在E4、E3和L5基因定位在其中的3'端的任何操纵。通常使用PCR方法和两个DNA片段的简单连接向小型穿梭载体组装短的3'臂。然而，产生较大穿梭载体(其中可以操纵多个腺病毒基因)的连接变得更困难和不可预测，这是因为使用了具有显著尺寸的三个DNA片段。

通常，在根据本公开的方法中使用的3'臂(片段iii)适当时包括E3位点和/或E4位点。在一个实施方案中，所述3'臂包含3'ITR、L5和E3位点，例如作为病毒基因组的片段，即其中遗传元件具有对应于病毒中所通常存在的位置(并且例如所述片段不包含E4位点)。在一个实施方案中，所述3'臂包含3'ITR、L5和E4位点，例如作为病毒基因组的片段，即其中遗传元件具有对应于病毒中所天然存在的位置(并且例如所述片段不包含E3位点)。在一个实施方案中，所述3'臂包含3'ITR、L5、E3位点和E4位点，例如作为病毒基因组的片段，即其中遗传元件具有对应于病毒中所天然存在的位置。

一般来说在现有技术中，当连接三段DNA以形成穿梭载体时，使用两步骤连接，其中在第一步骤中连接两段并且然后在第二步骤中连接第三段。这是因为将大的DNA段连接在一起是低效过程。令人惊讶的是，常用方法不能成功地产生所需尺寸的腺病毒穿梭载体和质粒。因此，在本发明人手中工作几个月之后，使用PCR方法和通过两步骤连接方法连接两个DNA片段不产生任何腺病毒穿梭载体。

本发明人通过使用本发明的一步三元连接方法克服了所述问题。令人惊讶的是，在各种条件下进行若干实验后，最终鉴别出稳固和有效的一步三元连接。三向连接中的DNA组分的比例在成功连接中似乎是重要的。所述单步骤方法有一点与直觉相反，因为在理论上同时组装三个DNA区段相比于同时组装两个DNA区段更困难。然而，本发明人已证实本文公开的方法起作用，从而允许制备所需尺寸的穿梭载体和质粒。

一旦产生包含E3位点、L5基因和E4位点的穿梭载体，本发明人就能够将原始限制性位点引入穿梭载体中并且然后产生含有完全基因组的质粒，其中新型的原始限制性位点在从可引入转基因的早期基因中除去的位置中。在这个实施方案中，在步骤a)之后进行步骤b)，即引入限制性位点。可选方法是例如制备已经含有限制性位点和或转基因的3'臂(片段ii)。实现此举的一种方式是通过在进行连接步骤之前合成具有所有所需结构和功能的3'臂片段。在稍后实施方案中，在步骤a)之前进行步骤b)。如果需要可以反复不断地使用的克隆平台，则使用限制性位点。如果仅需要一种特异性病毒构建体，则可简单地仅插入转基因和使其起作用所需的机构。因此，在本公开的一个可选方面，不插入限制性位点，而是在所需位置中直接插入一个或多个转基因。

显然，还可制备(例如合成)具有所需元件、序列和/或功能性的5'臂片段。

当使用合成腺病毒片段时，它们可组装以提供完全起作用的病毒或病毒载体。

如本文所用的DNA构建体是指穿梭载体或质粒。

如本文所用的病毒构建体是指根据本公开的能够复制的病毒或复制缺陷型病毒。

腺病毒

本公开可广泛应用于所有类型的腺病毒并且特别适合于例如如表1中所示的人类腺病毒，例如B亚群腺病毒并且特别适合于嵌合腺病毒EnAd(Enadenotucirev)、OvAd1和OvAd2。

除非上下文另有说明，否则如本文所用的腺病毒是提及任何来源、血清型的腺病毒的一般术语并且包括病毒载体。除非上下文另有说明，否则如本文所用的腺病毒基因组是指整个腺病毒的遗传DNA。

基因组DNA是来自腺病毒基因组的部分或全部的DNA。

腺病毒是具有约34至48千碱基对(Kb)的线性基因组的无包膜二十面体双链DNA病毒。由于基因组的尺寸，所述病毒可合并约另外10％的外来DNA的基因组而对其稳定性或其感染性无显著影响。因此较长序列的引入通常需要除去一些病毒基因。

在一个实施方案中，所述腺病毒是人类腺病毒。如本文所用，人类腺病毒是指可以指定为超过50种目前已知的腺病毒血清型中的任一种的任何腺病毒，它们基于包括其血凝特性的各种属性而被分成A-F亚群(参见Shenk 2001)，并且进一步延伸到任何迄今为止尚未鉴别或未分类的腺病毒血清型。参见例如Strauss,"Adenovirus infections inhumans,"《腺病毒(The Adenoviruses)》,Ginsberg,Plenum Press,New York,NY,第451-596页(1984)；和Shenk,"Adenoviridae:The Viruses and Their Replication,"《病毒学领域(Fields Virology)》,第2卷,第四版,Knipe,35ea.,Lippincott Williams&Wilkins,第2265-2267页(2001)，如表1中所示：

亚群	腺病毒血清型
		A	12、18、31
B	3、7、11、14、16、21、34、35、51
		C	1、2、5、6
D	8-10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39、42-49、50
		E	4
F	40、41

迄今为止研究的所有人类腺病毒基因组都具有相同的一般结构，即编码特定功能的基因位于病毒基因组中的相同位置。病毒基因组的每个末端都具有被称为反向末端重复(或ITR)的短序列，这是病毒复制所需的。所述病毒基因组含有五个早期转录单元(E1A、E1B、E2、E3和E4)、三个延迟早期单元(IX、IVa2和E2晚期)和一个晚期单元(主要晚期)，其被加工以产生五个晚期mRNA家族(L1-L5)。由早期基因编码的蛋白质主要牵涉于复制和宿主细胞对感染反应的调节中，而晚期基因编码病毒结构蛋白。早期基因带有前缀字母E并且晚期基因带有前缀字母L。

基因在Ad11基因组中的位置的总结提供于实施例中。

ITR是所有已知腺病毒共有的。反向末端重复(ITR)序列由于其对称性而被如此命名，并且是病毒染色体复制起点。这些序列的另一个特性是其形成发夹的能力。如本文所用的5'ITR是指在基因组的5'端的ITR。如本文所用的3'ITR是指在基因组的3'端的ITR。

如本文所用的L5基因是指纤维基因。所述纤维基因编码作为腺病毒的主要衣壳组分的纤维蛋白。所述纤维在受体识别中起作用并且促进腺病毒选择性结合和感染细胞的能力。所述纤维基因可例如包含具有986个碱基对的区域。在一个实施方案中，所述纤维由基因组(例如Ad11基因组)的位置30811-31788限定，特别是如以引用的方式并入本文中的US7,459,153的SEQ ID NO:1中所限定或通过参考病毒保存Genbank登录号：AY598970。

非人类腺病毒包括牛、猪、狗和黑猩猩病毒。

在一个实施方案中，所述腺病毒基因组是B亚群腺病毒基因组。如本文所用的B亚群是指B血清型腺病毒。B亚群腺病毒包括Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad51。最广泛研究的腺病毒Ad5是C亚群腺病毒。Ad5免疫性是人类群体中常见的，这使其成为疗法的不良候选物，因为所述病毒可能被快速的免疫反应中和。

在一个实施方案中，所述腺病毒选自EnAd(Enadenotucirev SEQ ID NO:1，也称为ColoAd1，有复制能力的溶瘤嵌合腺病毒，参见WO2005/118825)、OvAd1(参见WO2008080003-其中的SEQ ID NO:1并且以引用的方式并入本文中)、OvAd2(参见WO2008080003-其中的SEQID NO:2并且以引用的方式并入本文中)、Ad3(Genbank登录号：DQ086466)、Ad11如Ad11p(Genbank登录号：AY598970)和Ad5，例如EnAd(SEQ ID NO.1)、OvAd1或OvAd2，特别是EnAd。

在一个实施方案中，在本公开的方法中使用的腺病毒基因组与EnAd(SEQ ID NO:1)具有至少95％序列同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述腺病毒基因组与OvAd1(WO2008080003的SEQ ID NO:1)具有至少95％序列同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述腺病毒基因组与OvAd2(WO2008080003的SEQ ID NO.2)具有至少95％序列同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述腺病毒基因组与Ad3(Genbank登录号：DQ086466)具有至少95％序列同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述腺病毒基因组与Ad11p(Genbank登录号：AY598970)具有至少95％序列同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

有利的是，EnAd具有野生型Ad11p衣壳，源自Ad3和Ad11的嵌合E2B区域以及E3和E4区域中的缺失(特别是缺失整个E3和缺失E4orf4)。这些结构变化在用于插入表达例如治疗剂或免疫调节剂的转基因盒的ColoAd1基因组中提供额外‘空间’。此外，因为它是B亚群腺病毒，所以在人类中预先存在的免疫性相比于Ad5是不太常见的。

EnAd中的结构变化产生比Ad11p小约3.5kb的基因组，从而为插入转基因盒提供额外“空间”。EnAd是适于递送广泛多种治疗蛋白的运载体，例如其增强EnAd的有效抗癌活性或与其协同作用。OvAd1和OvAd2也是与ColoAd1类似的嵌合腺病毒，其也在基因组中具有额外“空间”(参见WO2008/080003)。

如本文所用的序列同一性是指两个多聚核苷酸或氨基酸序列在比较窗上，例如在其全长上是相同的(即，在核苷酸-核苷酸或残基-残基基础上)。术语“序列同一性百分比”是通过如下计算的：在比较窗上比较两个最佳比对序列，测定两个序列中出现的相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或残基的位置数以得到匹配位置数，将所述匹配位置数除以比较窗(即，窗口大小)中的总位置数，以及将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

如本文所用的术语“基本同一性”指示多聚核苷酸或氨基酸序列的特性，其中所述多聚核苷酸或氨基酸包含在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗上，通常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口上，相比于参考序列具有至少85％序列同一性、例如至少90％至95％序列同一性、特别是至少99％序列同一性的序列，其中所述序列同一性百分比是通过在比较窗上比较参考序列与所述序列来计算的，所述序列可包括参考序列的总共20％或更小的缺失或添加。所述参考序列可能是较大序列的子集。

当用于描述多肽时，术语“相似性”是通过比较一个多肽的氨基酸序列和保守氨基酸替代物与第二多肽的序列来确定的。

当用于描述多聚核苷酸时，术语“同源”指示两个多聚核苷酸或其指定序列当最佳比对和比较时是相同的，其中在至少70％的核苷酸、通常约75％至99％、并且特别是至少约98％至99％的核苷酸中具有适当的核苷酸插入或缺失。在一个实施方案中，在给定序列的全长上进行比较。

在一个实施方案中，所述腺病毒基因组具有嵌合E2B区，例如重组嵌合腺病毒或者其变体或衍生物，其具有包含E2B区的基因组，其中所述E2B区包含源自第一腺病毒血清型的核酸序列和源自第二腺病毒血清型的核酸序列；其中所述第一血清型和第二血清型各自独立地选自B、C、D、E或F亚群腺病毒并且彼此不同；并且其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的并且显示肿瘤细胞的增强治疗指数，特别是如以引用的方式并入本文中的WO2005/118825中所公开。

在一个实施方案中，所述腺病毒基因组的部分或全部的E3区缺失或突变，例如E3区突变。在一个实施方案中，所述腺病毒基因组的部分或全部的E4区缺失或突变，例如E4orf4缺失。

复制缺陷型和能够复制型

在一个实施方案中，所用的腺病毒基因组是来自能够复制、特别是有复制能力的腺病毒。在一个实施方案中，本公开的病毒或病毒构建体是能够复制的，特别是有复制能力的。在一个实施方案中，EnAd能够复制。

如本文所用的能够复制通常是指能够复制的病毒，例如无需包装细胞系。它们在本文中也被称为病毒、有复制能力的病毒(它是能够复制的病毒的亚群)，和条件性复制病毒(也是能够复制的病毒的亚群)或活病毒。因此，如本文所用的能够复制的病毒是指条件性复制病毒和有复制能力的病毒。

如本文所用的条件性复制病毒是指可以在细胞、例如癌细胞中复制的病毒，其表达或过度表达或不足表达特定基因，例如不足表达p53基因的细胞。

有复制能力的病毒是具有例如在体内和/或离体复制的所有必要机构而无需辅助病毒或补充性/包装细胞系的辅助的病毒。

除非上下文另有说明，否则如本文所用的“病毒”(相对于上文定义的腺病毒)是指能够复制、例如有复制能力的病毒。因此，在一个实施方案中，如本文所用的病毒通常是指有复制能力的病毒，例如治疗性病毒，例如溶瘤病毒。

在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的腺病毒基因组是来自不能够复制的腺病毒载体。在一个实施方案中，本公开的病毒或病毒构建体是非复制型的(也称为复制缺陷型)。非复制型腺病毒、例如病毒载体(用作用于递送转基因的运载体，例如疫苗抗原、抗体的细胞内递送等)通常已除去复制所必需的一个或多个基因。除非另有说明，否则如本文所用的病毒载体是指复制缺陷型。

复制缺陷型腺病毒是需要辅助病毒或补充性/包装细胞系来复制的那些腺病毒。通常需要包装细胞系来复制的腺病毒(例如包含转基因的那些)被称为病毒载体。在一个实施方案中，例如通过缺失部分或全部的E1区而使EnAd成为复制缺陷型。

用于除去一个或多个复制必需基因的原因有两重。首先，考虑到所述载体由于其不能在体内复制而具有简化的安全性概况。其次，基因缺失允许通过在基因组中产生空间而插入大的转基因。这些转基因可以在体内表达，而与病毒载体不能复制无关。在一个实施方案中，在病毒载体的产生中从病毒缺失E1基因，并且可选地或另外在一些情况下，部分或全部的E3区缺失。

包装细胞系是已经制备以向所讨论的病毒补充其中缺失的基因的重组细胞系。如本文所用的包装细胞是指能够提供病毒复制的必要元件的细胞，其中所述病毒在所述元件中是缺失的。包装细胞系的实例包括PerC6细胞系。在一个实施方案中，所述包装细胞系是HEK细胞。

病毒基因

E1在病毒复制中起作用。通过缺失或突变E1区，病毒不能在没有特定“包装”细胞系的帮助下复制。

在一个实施方案中，本公开的病毒载体的基因组中的E1区是完全或部分缺失的。在一个实施方案中，E1位点是E1区缺失或者其片段在5'臂中缺失。

如本文所用的E1位点是指E1区的位置，而不考虑全部、部分或无区域是缺失还是置换。术语“E1位点”包括其中E1是突变的，部分缺失的，完全缺失的或完全完整的和非突变的。当片段或序列在E1区之后起始或在E1区之前终止时，所述E1位点可能不存在，例如包括在与E1相关的任何非编码区域之后起始，例如在E2区中起始的序列。在一个实施方案中，所述E1位点由E1区或其功能片段或突变组成。在一个实施方案中，存在E1并且是完全的和/或功能性的。

E3编码对于调节宿主细胞对病毒感染的反应来说重要的蛋白。

如本文所用的E3位点是指腺病毒基因组中存在E3基因或区域或者将预期存在E3基因或区域的位置。所述E3基因可完全存在，以片段形式存在或完全不存在，部分或完全突变。因此，如本文所用的E3位点是指E3区的位置，而不考虑全部、部分或无区域是缺失还是置换。假定腺病毒的基因组结构在所有已知人类腺病毒之间是均一的(参见图1)，本领域技术人员能够鉴别存在或缺失基因的E3位点。当所关注的片段或序列在E3区之外起始或在E3区之前终止，例如包括与E3相关的任何非编码区域，例如所述序列在L5区中起始时，所述E3位点实际上可能不存在。

如本文所用的E4位点是指腺病毒基因组中存在E4基因或区域或者将预期存在E4基因或区域的位置。所述E4基因可完全存在，以片段形式存在或完全不存在，部分或完全突变。因此，如本文所用的E4位点是指E4区的位置，而不考虑全部、部分或无区域是缺失还是置换。假定腺病毒的基因组结构在所有已知人类腺病毒之间是均一的(参见图1)，本领域技术人员能够鉴别存在或缺失基因的E4位点。当所关注的片段或序列在E4区之外起始或在E4区之前终止，例如包括与E4相关的任何非编码区域，例如所述序列在L5区中起始时，所述E4位点实际上可能不存在。

L5基因编码晚期表达的衣壳蛋白纤维。

在一个实施方案中，L5区是全长序列或其功能片段，例如保持50％或更多、例如60％、70％、80％、90％或100％的野生型基因的活性的片段，特别是在体外测定法中。在一个实施方案中，L5包含80％或更多的L5基因的基因组DNA，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一个实施方案中，部分或全部的E3、E4或L5基因独立地突变。

如本文所用的突变的是指相关基因中的修饰，例如点突变、缺失突变、添加突变、正向突变、取代突变和/或移码突变。在一个或多个实施方案中，突变的遗传物质的量是相关序列的10％或更少。在必要基因例如L5(纤维基因)中，所述基因的功能在突变基因中得以维持，例如50、60、70、80、90或100的功能得以保持，或者功能增加，即大于未突变基因的100％。

限制性位点

如本文所用的限制性位点是被限制性酶特异性识别和切断的短DNA序列。

如本文所用的合适的限制性位点是指可(结合适当的限制性酶)用于特异性裂解给定位置中、例如并非早期基因的DNA区域中的病毒的基因组DNA的位点。在一个实施方案中，所述DNA被裂解以促进转基因的插入。在一个实施方案中，合适的位点通常存在于基因组的5'端和/或病毒基因组的3'端或3'臂片段和/或5'臂片段中的相应位置附近，这允许DNA被线性化和操纵，例如如附图中所示。

在一个实施方案中，合适的限制性位点位于距3'和/或5'ITRS的末端约4-5Kb以使得穿梭载体将具有约4-5Kb 3'和/或5'臂。有利的是，这允许穿梭载体与腺病毒基因组之间的有效同源重组。这种设计也允许穿梭载体含有E1基因(例如在5'臂中)和纤维和E4基因(例如在3'臂中)以使得围绕这些基因的任何区域可被操纵以进行转基因盒插入。

在一个实施方案中，所述穿梭载体包含1、2或3个另外的合适/原始限制性位点。在一个实施方案中，合适的限制性位点不是插入在穿梭载体中的任何其他位置。在一个实施方案中，限制性位点并入在至少一个早期基因或其部分(例如独立地选自E1、E2、E3和E4)周围，以向本领域技术人员提供操纵基因组的其他选择。

合适的限制性限制通常将是原始限制性位点。在限制性位点上下文中的原始、新型、独特在本文中可互换使用，并且旨在是指可以特异性切断的限制性位点。当限制性位点或在一些情况下一对限制性位点仅出现在希望切断的位置中时，它们可被特异性切断。因此，如果限制性位点仅出现一次或者一对限制性位点在病毒基因组或基因组DNA中仅出现一次时，则这种或这些限制性位点(在一对的情况下)可以被适当的酶特异性切断。因此，在一个实施方案中，原始、新型或独特是指引入在病毒基因组或相关基因组DNA中任何地方先前不存在的一个限制性位点或一对限制性位点。因此，在一个实施方案中，合适的限制性位点对于腺病毒基因组是非天然的(外源的)。在一个实施方案中，所述原始限制性位点或一对限制性位点在病毒基因组或基因组DNA中仅出现一次。在一个实施方案中，合适的限制性位点将产生粘性端。在一个实施方案中，合适的限制性位点将通过适当的市售限制性酶裂解。

因此，限制性位点是DNA序列中可被限制性酶、通常是序列特异性酶切断的位置。在一个实施方案中，所述限制性位点包含3至22个碱基对，例如4至22个、例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碱基对。

如本文所用的引入的或引入通常是指插入在天然、野生型或起始腺病毒基因组中不存在的限制性位点。

在一个实施方案中，如本文所用的原始限制性位点是指在质粒中或在病毒构建体中仅出现一次的限制性位点。这允许如下确定性：给定限制性酶将在仅一个已知位置中切断质粒。在本公开的上下文中，原始限制性位点通常是已经引入基因组中并且没有天然存在者。

在一个实施方案中，如本文所用的原始限制性位点是指通过重组体技术引入腺病毒基因组中的限制性位点，特别是其中引入的限制性位点并非天然存在于病毒中并且从而当使用给定限制性酶时在切断基因组的病毒位置中提供特异性。

因此，在另一个实施方案中，如本文所用的原始限制性位点是指在质粒、病毒或穿梭载体中仅出现一次的限制性位点。这允许如下确定性：给定限制性酶将在仅一个已知位置中切断质粒。

特别是，所述原始限制性位点允许转基因盒在例如从早期基因除去的位置处插入基因组中。

所述方法可广泛地应用于腺病毒并且可提供用于构建穿梭载体的适当5'和3'臂的合适限制性位点已经在ColoAd1、OvAd1、OvAd2、Ad3、Ad11和Ad5中鉴别。

因此，本公开的方法可用作起始点以产生具有通过例如引入转基因赋予的增强活性的治疗性病毒。

在一个实施方案中，所述原始限制性位点独立地选自FseI、NotI、SbfI和SgfI，例如NotI或SbfI和SgfI或FseI和NotI和SbfI和SgfI。在相同序列处切断的其他限制性酶是可互换的。

如本文所用的FseI是指在以下序列-GGCCGG/CC-被限制性酶切断的限制性位点。在相同序列处切断的其他限制性酶是可互换的。

如本文所用的NotI是指在以下序列-GC/GGCCGC-被限制性酶切断的限制性位点。在相同序列处切断的其他限制性酶是可互换的。

如本文所用的SbfI是指在以下序列-CCTGCA/GG-被限制性酶切断的限制性位点。在相同序列处切断的其他限制性酶是可互换的。

如本文所用的SgfI是指在以下序列-GCGAT/CGC-被限制性酶切断的限制性位点。在相同序列处切断的其他限制性酶是可互换的。

在一个实施方案中，两个或更多个原始限制性位点被插入在基因组中的给定位置。

在一个实施方案中，所述原始限制性位点是在L5基因与E3位点之间的位置中的单一原始限制性位点。例如引入L5基因与E3位点之间的位置中的单一原始限制性位点，例如NotI。在一个实施方案中，这种单一原始限制性位点是引入质粒或病毒构建体中的唯一原始限制性位点。

在一个实施方案中，所述原始限制性位点是在L5基因与E4位点之间的位置中的一个或两个(例如两个)原始限制性位点，例如引入L5基因与E4位点之间的位置中的两个原始限制性位点，例如一个SbfI位点和一个SgfI位点。在一个实施方案中，仅存在两个引入穿梭载体、质粒或病毒构建体中的原始限制性位点。

在一个实施方案中，所述原始限制性位点是在L5基因与E3位点之间的位置中的单一原始限制性位点和在L5基因与E4位点之间的位置中的三个原始限制性位点，例如引入在L5基因与E3位点之间的位置中的单一原始限制性位点，例如一个FseI位点，和引入L5基因与E4位点之间的位置中的三个原始限制性位点，例如一个NotI位点、一个SlbfI位点和一个SgfI位点。在一个实施方案中，仅存在四个引入穿梭载体、质粒或病毒构建体中的原始限制性位点。

在一个实施方案中，FseI是适合引入选自群组ColoAd1、Ad11、Ad3、OvAd1和OvAd2的腺病毒基因组的原始限制性位点。RigI是与FseI在相同序列处切断的已知限制性酶，因此FseI限制性位点也被称为RigI限制性位点。

在一个实施方案中，NotI是适合引入选自群组ColoAd1和Ad11的腺病毒基因组的原始限制性位点。CciNI是与NotI在相同序列处切断的已知限制性酶，因此NotI限制性位点也被称为CciNI限制性位点。

在一个实施方案中，SbfI是适合引入选自群组ColoAd1、Ad11、Ad3、OvAd1和OvAd2的腺病毒基因组的原始限制性位点。SdaI和Sse83871是与SbfI在相同序列处切断的已知限制性位点，因此SbfI限制性位点也被称为SdaI限制性位点或Sse83871限制性位点。

在一个实施方案中，SgfI是适合引入选自群组ColoAd1、Ad11、Ad3、OvAd1和OvAd2的腺病毒基因组的原始限制性位点。AsiSI、RgaI和SfaAI是与SgfI在相同序列处切断的已知限制性位点，因此SgfI限制性位点也被称为AsiSI限制性位点、RgaI限制性位点或SfaAI限制性位点。

在一个实施方案中，ClaI是适合引入Ad5腺病毒基因组的原始限制性位点。如本文所用的ClaI是指在以下序列-AT/CGAT-被限制性酶切断的限制性位点。BspDI、ZhoI、BspDI、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BsiXI、Bsp106I、BspXI、Bsu15I和BsuTUI是与ClaI在相同序列处切断的已知限制性位点，因此ClaI限制性位点也被称为BspDI限制性位点、ZhoI限制性位点、BspDI限制性位点、BanIII限制性位点、Bsa29I限制性位点、BseCI限制性位点、BshVI限制性位点、BsiXI限制性位点、Bsp106I限制性位点、BspXI限制性位点、Bsu15I限制性位点或BsuTUI限制性位点。

在一个实施方案中，PacI是适合引入Ad5腺病毒基因组的原始限制性位点。如本文所用的PacI是指在以下序列-TTAAT/TAA-被限制性酶切断的限制性位点。

在一个实施方案中，MluI是适合引入选自群组Ad3和OvAd2的腺病毒基因组的原始限制性位点。如本文所用的MluI是指在以下序列-A/CGCGT-被限制性酶切断的限制性位点。

在一个实施方案中，BstBI是适合引入Ad5腺病毒基因组的原始限制性位点。如本文所用的BstBI是指在以下序列-TT/CGAA-被限制性酶切断的限制性位点。SfuI、AsuII、Bpu14I、BsiCI、Bsp119I、BspT104I、Csp45I和NspV是与BstBI在相同序列被切断的已知限制性位点，因此BstBI限制性位点也被称为SfuI限制性位点、AsuII限制性位点、Bpu14I限制性位点、BsiCI限制性位点、Bsp119I限制性位点、BspT104I限制性位点、Csp45I限制性位点或NspV限制性位点。

在一个实施方案中，BclI是适合引入选自群组ColoAd1、Ad11、Ad3、Ad5、OvAd1和OvAd2的腺病毒基因组的原始限制性位点。如本文所用的BclI是指在以下序列-T/GATCA-被限制性酶切断的限制性位点。BsiQI、FbaI和Ksp221是与BclI在相同序列被切断的已知限制性位点，因此BclI限制性位点也被称为BsiQI限制性位点、FbaI限制性位点或Ksp221限制性位点。这些限制性位点通常不是优选的。

在一个实施方案中，钝切限制性酶位点被用作原始限制性位点，例如PmeI、SrfI和SwaI。

在一个实施方案中，PmeI是适合引入选自群组ColoAd1、Ad11、OvAd1和OvAd2的腺病毒基因组的原始限制性位点。如本文所用的PmeI是指在以下序列-GTTT/AAAC-被限制性酶切断的限制性位点。

在一个实施方案中，SrfII是适合引入选自群组ColoAd1、Ad11、Ad3、Ad5、OvAd1和OvAd2的腺病毒基因组的原始限制性位点。如本文所用的SrfII是指在以下序列-GCCC/GGGC-被限制性酶切断的限制性位点。

在一个实施方案中，SwaI是适合引入选自群组ColoAd1、Ad11、Ad3、Ad5、OvAd1和OvAd2的腺病毒基因组的原始限制性位点。如本文所用的SwaI是指在以下序列-ATTT/AAAT-被限制性酶切断的限制性位点。

在一个实施方案中，除NotI之外的原始限制性位点是在L5基因与E3位点之间的位置中。在一个实施方案中，在L5基因与E4位点之间的位置中存在两个原始限制性位点，例如一个SbfI和一个SgfI。

在一个实施方案中，存在4个原始限制性位点，其中一个原始限制性位点在L5基因与E3位点之间的位置中并且其中三个原始限制性位点在L5基因与E4位点之间的位置中。例如其中一个原始限制性位点是FseI并且三个原始限制性位点是SbfI、SgfI和NotI中的每一个。

在一个实施方案中，包含一个或多个原始限制性位点的腺病毒基因组具有序列SEQ ID NO.32。在一个实施方案中，包含一个或多个原始限制性位点的腺病毒基因组具有序列SEQ ID NO.33。在一个实施方案中，包含一个或多个原始限制性位点的腺病毒基因组具有序列SEQ ID NO.34。

在一个实施方案中，包含一个或多个原始限制性位点的腺病毒与SEQ ID NO.32具有至少95％序列同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个实施方案中，包含一个或多个原始限制性位点的腺病毒与SEQ ID NO.33具有至少95％序列同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个实施方案中，包含一个或多个原始限制性位点的腺病毒与SEQ ID NO.34具有至少95％序列同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％同一性。

所制备的质粒和穿梭载体具有位于腺病毒基因组周围的原始限制性位点的新型组合。这些然后可以被选择并用于对操纵部分腺病毒基因组提供控制。

所述原始限制性位点被策略性地引入以按需要允许例如转基因插入在一个限制性位点的位置或者可选地用于在两个所选限制性位点之间缺失的基因组部分。

在一个实施方案中，所述质粒还包含至少一个E1原始限制性位点。如本文所用的E1原始限制性位点是指引入腺病毒基因组的E1区中的限制性位点。在一些实施方案中，所述E1基因存在，但被所引入的E1原始限制性位点中断，在其他实施方案中，所述E1基因缺失并且被所引入的E1原始限制性位点置换，在其他实施方案中，所述E1基因存在，但其功能并未被所引入的E1原始限制性位点改变。

在一个实施方案中，所述一个或多个限制性位点独立地选自：

●被NotI和CciNI切断的序列GCGGCCGC，留下5'-GGCC悬端，

●被FseI和RigI切断的序列GGCCGGCC，留下3'-CCGG悬端，

●被AsiSI、RgaI、SgfI和SfaAI切断的序列GCGATCGC，留下3'-AT悬端

●被SbfI、SdaI和Sse83871切断的序列CCTGCAGG，留下3'-TGCA悬端

●被BclI、FbaI、Ksp221和BsiQ1切断的序列TGATCA，留下5'-GATC悬端

●被I-Cre1切断的序列CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG[SEQ ID NO:41]，留下3'-GTGA悬端

●被I-CeuI切断的序列TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA[SEQ ID NO:42]，留下3'CTAA悬端

●被I-Sce1切断的序列TAGGGATAACAGGGTAAT[SEQ ID NO:43]，留下3'ATAA悬端

●被SrfI切断的序列GCCCGGGC，留下钝端

●被MssI、PmeI切断的序列GTTTAAAC，留下钝端

●被SwaI、SmiI切断的序列ATTTAAAT，留下钝端

●被AscI、PalA1和SgsI切断的序列GGCGCGCC，留下5'CGCG悬端

切断相同识别位点的其他限制性酶也可能是合适的。

在一个实施方案中，在3'臂和载体片段中存在的第一限制性位点是相同的限制性位点(即通过相同限制性酶切断的位点)。这促进载体片段的5'端与3'臂的3'端的接合。

在一个实施方案中，在5'臂和载体片段中存在的第二限制性位点是相同的限制性位点(即通过相同限制性酶切断的位点)。这促进载体片段的3'端与5'臂的5'端的接合。

在一个实施方案中，第一限制性酶位点和第二限制性酶位点独立地选自群组FseI、RigI、NotI、CciNI、SbfI、SdaI、Sse83871、SgfI、AsiSI、RgaI、SfaAI、ClaI、BspDI、ZhoI、BspDI、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BsiXI、Bsp106I、BspXI、Bsu15I、BsuTUI、PacI、MluI、BstBI、SfuI、AsuII、Bpu14I、BsiCI、Bsp119I、BspT104I、Csp45I、NspV、BclI、BsiQI、fbaI、Ksp221、PmeI、SrfI和SwaI。

在一个实施方案中，所述第一限制性位点是AscI。在一个实施方案中，所述第二限制性酶位点是AscI。如本文所用的AscI是指在以下序列-GG/CGCGCC-被限制性酶切断的限制性位点。在相同序列下切断的其他限制性酶是可互换的。在一个实施方案中，所述第一限制性位点和第二限制性位点是相同的。在一个实施方案中，所述第一限制性酶位点和第二限制性酶位点各自是AscI。

在其中限制性酶位点被用作第一和/或第二或第三限制性酶位点的一个实施方案中，基因组DNA将在一个以上的位置中被切断。

在一个实施方案中，腺病毒基因组或基因组DNA(例如5'臂)中的限制性位点包含限制性位点PspOMI，例如其位于基因组的位置4628、20891和27840或与其相应的位置。在一个实施方案中，所述腺病毒是EnAd或者基因组DNA是源自其。

在一个实施方案中，所述第三限制性位点是指一种类型的限制性位点，例如PspOMI。因此，在一个实施方案中，3'臂和5'臂中的第三限制性位点是相同的。当3'臂和5'臂中的第三限制性位点的序列相同时，这促进在制备穿梭质粒时的5'臂的3'端与3'臂的5'端的接合。此外，穿梭载体可稍后在这个位点裂解以线性化序列并促进与包含腺病毒基因组的质粒的同源重组，参见例如图5。

在一个实施方案中，第一位点和最后位点用于产生穿梭载体，例如如附图中所示。

在一个实施方案中，限制性位点被设计成接近病毒基因组(例如EnAd基因组)的5'端以及病毒基因组的3'端，特别是距3'和5'ITRS的末端约4-5kb以使得所述穿梭载体具有约4-5kb 3'和5'臂，如图4中所示。因此，在一个实施方案中，PspOMI是5'臂和/或3'臂中的“第三限制性位点”。这对限制性位点允许基因组DNA被线性化并与病毒基因组(例如EnAd基因组)重组以形成质粒，而不向基因组序列引入任何不希望的改变。

这种DNA量允许穿梭载体与病毒基因组(例如EnAd基因组)之间的有效同源重组。这些设计标准也确保了穿梭载体含有E1基因以及纤维和E4基因以使得这些基因和围绕这些基因的区域可按需要被操纵用于转基因盒插入。

在一个实施方案中，所述第一限制性位点和第二限制性位点是相同限制性酶的底物并且第三限制性位点是不同限制性酶的底物。

在一个实施方案中，所述第一限制性位点是与第二限制性位点不同的限制性酶的底物并且所述第三限制性位点是与第一限制性位点和第二限制性位点各自不同的限制性酶的底物。

本发明人已经进一步鉴别出其他腺病毒基因组中的以下合适的限制性位点。

在Ad5中，可使用酶SphI(-GCATG/C-)。所述限制性位点位于Ad5基因组中的位置3661和31220。这些位点是在E1B基因的末端和在纤维基因的起点并且产生PCR片段以用于3.6kb和4.7kb的穿梭载体构建。这些位点因此允许构建其中可将转基因插入E1区中或纤维基因附近的穿梭载体。

在Ad3、OvAd1和OvAd2中，可使用位点AseI(-AT/TAAT-)。所述限制性位点位于Ad3基因组中的位置2469和31940，OvAd1基因组中的位置2488和31724，和OvAd2基因组中的位置2483和31949。对于所有基因组，这些位点位于E1B中和纤维基因内部并且产生PCR片段以用于2.5kb和3.4kb的穿梭载体构建。这些位点因此允许构建其中可将转基因插入E1区中或纤维基因附近的穿梭载体。

在Ad11中，可使用PsiI(-TTA/TAA-)。不同于PspOMI、SphI和AseI，这种酶是钝切物。所述PsiI限制性位点位于Ad11基因组中的位置2648和30890。这些位点在E1B基因中和纤维基因的起点并且产生PCR片段以用于2.6kb和4kb的穿梭载体构建。如上述，这些位点因此允许构建其中可将原始限制性位点插入E1区中或纤维基因附近的穿梭载体。

在扩增基因组的5'和3'端以产生3'臂和5'臂的过程中，通常将在PCR期间使用合适的引物来添加连接限制性位点。在扩增期间将相同的连接限制性位点插入含有细菌复制起点和选择标记基因的载体片段中。这种连接限制性位点被设计成允许腺病毒基因组与含有细菌复制起点和选择标记基因的载体片段接合。第一限制性酶位点、第二限制性酶位点和第三限制性酶位点都是连接限制性位点的实例。

在一个实施方案中，3'臂和5'臂中的第三限制性位点是在含有腺病毒DNA的质粒中的相应位置中。在一个实施方案中，5'臂具有在5'ITR上游引入的连接限制性位点并且3'臂具有在3'ITR下游引入的连接限制性位点。所述限制性位点允许切除包含细菌复制起点和选择标记基因的载体片段。这些限制性位点(可选地被称为第一限制性酶位点和第二限制性酶位点)允许从质粒切除腺病毒基因组。

在一个实施方案中，连接限制性位点是AscI。在相同序列下切断的其他限制性酶是可互换的。

片段

在制造穿梭载体的方法的上下文中的载体片段是指包含复制起点和选择标记的DNA片段。在一个实施方案中，所述载体片段是在2至4Kb长度的区域中。所述载体片段起始于载体片段的5'端，其中第一限制性酶位点被布置成允许与3'臂的3'端连接。其进一步包含低拷贝细菌复制起点和选择标记基因并且在载体片段的3'端终止于第二限制性酶位点，所述第二限制性酶位点被布置成允许与5'臂的5'端连接。在一个实施方案中，所述载体片段不大于3Kb。这足以包括复制起点和选择标记基因。

如本文所用的5'臂是指例如距腺病毒基因组的5'端几千碱基对的DNA片段，其包括5'ITR(反向末端重复)。所述臂的精确长度是通过合适的限制性位点的位置来确定的。在一个实施方案中，所述5'臂在约2至5Kb长度、例如约2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9kb长度的区域中，并且含有E1位点，例如整个E1基因或已经缺失或部分缺失E1基因的位点。在一个实施方案中，所述5'臂长度是例如距EnAd基因组的5'端为4627个碱基对。

所述5'臂在5'端起始于第二限制性位点(如上文所讨论被布置成允许与载体片段的3'端连接)，包含5'ITR并且在5'臂的3'端终止于第三限制性位点(被布置成允许与3'臂的5'端连接)。

在一个实施方案中，所述5'臂包括非突变E1区并且因此可以用于制备有复制能力的病毒。

在一个实施方案中，5'臂中的腺病毒基因组DNA量是最小的，例如ITR。在一个实施方案中，5'臂中的腺病毒基因组DNA量在100bp至5kb范围内。

如本文所用的3'臂是指例如距腺病毒基因组的3'端为几千碱基对的DNA片段，其包括3'ITR(反向末端重复)。所述臂的精确长度是通过合适的限制性位点的位置来确定的。在一个实施方案中，所述3'臂在约3至5kb长、例如约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9kb长的区域中，并且含有整个纤维(L5)基因。在一个实施方案中，所述3'臂长度是例如距EnAd的3'端为4482个碱基对。

所述3'臂在3'臂的5'端起始于第三限制性位点(例如被布置成允许与5'臂的3'端连接)，包含L5基因和3'ITR并且在3'端终止于第一限制性酶位点(例如被布置成允许与载体片段的5'端连接)。

在一个实施方案中，所述3'臂含有纤维基因(也称为L5)。有利的是，在3'臂中包括纤维基因允许操纵晚期基因和在病毒工程改造中的更多灵活性。

如本文所用的“在……之间的位置中”是指被指定区域邻接或夹合，例如一个指定区域(例如E3位点)的最后核酸与第二指定区域(例如L5基因)的第一核酸之间的任何位置。在本上下文中的第一核酸包括相关基因/区域的片段的第一核酸(即不限于全长基因的字面第一核酸，而是指指定为给定构建体中的基因的第一存在核酸)。在一个实施方案中，当在5'至3'方向上行进时，所述位置在L5基因的最后核酸与E4位点的第一核酸之间。

在如本文所用的L5基因附近是指E3位点与L5基因之间的位置和/或L5基因与E4位点之间的位置。在一个实施方案中，一个或多个限制性位点独立地位于或插入非编码区中。在一个实施方案中，所插入的遗传物质不改变或中断L5基因的功能。

特别有利的是将一个或多个转基因插入腺病毒基因组中的L5基因附近，因为在这个位置中的转基因不太可能干扰病毒稳定性和复制。在一个实施方案中，位于L5之后的基因可在主要晚期启动子的控制下或在E4启动子的控制下。在一个实施方案中，位于L5之后的基因可在外源启动子的控制下。在一个实施方案中，位于L5之前的基因可在主要晚期启动子或E3启动子的控制下。在一个实施方案中，直接位于L5起始密码子之前的基因可在主要晚期启动子的控制下并且通常将需要含有允许L5表达的调节元件。

在一些情况下，插入与纤维基因邻接的转基因，例如其中所述转基因与L5基因直接相邻或在几个碱基内，可为有利的。在一个实施方案中，与基因组的E3侧上的L5基因邻接，并且例如允许相比于纤维后位点不同水平的转基因表达。

在一个实施方案中，将转基因定位于与L5基因相邻的基因也允许调节纤维蛋白的表达，这又允许病毒活性的调节。

因此，在一个实施方案中，转基因被插入在与纤维基因邻接的位置中，例如在基因组的E3侧上，在基因组的E4侧上或两者。

在一个实施方案中，一个或多个转基因被独立地插入与基因组DNA相同的方向中。在一个实施方案中，所述一个或多个转基因被独立地插入与基因组DNA相反的方向中。

在一个实施方案中，所述3'臂在5'至3'方向上包含：纤维基因；接着是E4位点，例如E4区或其片段；和又接着是ITR(反向重复区域)。

在一个实施方案中，所述3'臂在5'至3'方向上包含：E3位点，例如E3区、其片段或其中缺失E3区的E3位点；接着是纤维基因；又接着是E4区或其片段(也称为E4位点)，又接着是ITR。在一个实施方案中，3'臂在2Kb至5Kb范围内。在一个实施方案中，与纤维基因相邻的是限制性位点，例如FseI，特别是在纤维的E3侧上。在一个实施方案中，与纤维基因相邻的是限制性位点，例如Sgfl和/或Sbf1，例如在纤维基因的E4侧上。在一个实施方案中，所述纤维基因被两个限制性位点(例如FseI)夹合，特别是在纤维的E3侧上并且Sgfl和/或Sbf1例如位于纤维基因的E4侧上。

在一个实施方案中，所述E4位点还包含AcII位点，例如在本文附图、实施例和/或序列中所公开的位置。

在一个实施方案中，5'臂和3'臂各自具有足够长度以促进有效同源重组，例如约2Kb至5Kb长。

所述5'臂和/或所述3'臂可能是合成的。有利的是，使用合成5'和/或3'臂允许在连接之前将原始限制性位点引入臂中以形成穿梭载体。

在一个实施方案中，在根据本公开的穿梭载体(例如EnAd穿梭载体)中，PspOMI是第三限制性酶位点。如本文所用的PspOMI是指在以下序列-G/GGCCC-被限制性酶切断的限制性位点。在相同序列下切断的其他限制性酶如ApaI和Bsp120I是可互换的。

在一个实施方案中，提供将一个或多个原始限制性位点引入腺病毒穿梭载体中的方法，其包括如下步骤：

a)鉴别所述穿梭载体中的两个切除限制性位点和所述位点之间的DNA序列，

b)在步骤a)中鉴别的所述切除限制性位点消化所述穿梭载体以切除DNA区段，

c)合成DNA片段，其中所述DNA片段与还包含一个或多个原始限制性位点的来自步骤b)的穿梭载体的切除区段基本上相同，

d)纯化来自步骤b)的消化穿梭载体和来自步骤c)的DNA片段，

e)连接来自步骤d)的DNA片段和来自步骤d)的穿梭载体，和

f)通过用连接的穿梭载体转化细胞来鉴别适当组装的穿梭载体，在选择性培养基上生长和筛选菌落。

在一个实施方案中，所述切除限制性位点是AclI。在相同序列切断的其他限制性酶是可互换的。如本文所用的AclI是指在以下序列-AA/CGTT-被限制性酶切断的限制性位点。

AclI与PspOMI一起使用以将原始限制性位点引入ColoAd1穿梭载体中，因为它们侧接纤维基因，从而允许切除这个区域和插入与所切除区域基本上相同的DNA片段。

连接

如本文所用的一步三元连接是指三个DNA序列在单个步骤中连接在一起以形成环状DNA。在一个实施方案中，进行筛选以建立在适当定向上由所有三个序列构成的DNA穿梭载体。

如本文所用的适当定向旨在是指适用于重新组装/构建根据本公开的腺病毒的定向。

如本文所用的相等比例是指所用DNA片段(序列)的比率是大致相同的，即使其中整个体积或浓度改变。在一个实施方案中，相等比例是指1:1:1比率的载体片段、5'臂和3'臂。如本文所用的连接比率是指提供连接DNA片段的比率或比例。

在一个实施方案中，其中在每个片段中使用的第一限制性酶和第二限制性酶是相同的，并且载体片段在一步三元连接之前被脱磷酸化。

如本文所用的脱磷酸化是指通过水解从DNA除去磷酸根(PO₄ ^3-)基团。有利的是，脱磷酸化增加了DNA片段的5'端和3'端保持自由以与不同DNA片段(其通常未脱磷酸化)相对于彼此连接的可能性。在一个实施方案中，脱磷酸化增加了后续连接步骤的成功性。

如本文所用的连接是指例如使用连接酶将DNA分子的两端共价连接。

在一个实施方案中，所述一步三元连接使用2份DNA连接酶、4份连接酶缓冲液和各2份的5'臂、3'臂和载体片段。

如本文所用的份数是指用量例如体积，其绝对量可以改变，条件是混合物中的总比例保持相同，例如仅其中1份是10ml，则将使用20ml的DNA连接酶、40ml的连接酶缓冲液和20ml的5'臂和20ml的3'臂。

在一个实施方案中，约2μl洗脱DNA含有约40ng DNA。在一个实施方案中，连接约120ng的DNA。在一个实施方案中，120ng的连接DNA由各约40ng的5'臂、3'臂和载体片段组成。

如本文所用的DNA连接酶是指通过催化磷酸二酯键的形成来连接DNA分子(促进其接合)的酶。在一个实施方案中，所述DNA酶是T4DNA连接酶。T4DNA连接酶是源自噬菌体T4的酶。

如本文所用的连接酶缓冲液是指例如含有氯化镁和ATP、例如50mM Tris-Hcl、10mM MgCl₂和1mM ATP的缓冲溶液。

如本文所用的环化或环状是指线性DNA段的末端接合以形成圆或环。

在一个实施方案中，一步三元连接进行至少30分钟，例如至少50分钟，例如约1小时，更具体地51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70分钟。

在一个实施方案中，在大约室温，例如约15至25℃，例如16、17、18、19、20、21、22、23或24℃，优选地16至24℃下进行一步三元连接。

在一个实施方案中，制造腺病毒穿梭载体的方法包括如下步骤：

a)鉴别腺病毒基因组中的合适的限制性位点，

b)产生5'PCR臂和3'PCR臂，例如通过扩增基因组的5'端和3'端和在其中ITR上游的每个末端插入连接限制性位点，

c)选择和扩增具有低拷贝细菌复制起点和选择标记基因和末端连接限制性位点的载体片段并终止于允许与5'臂和3'臂连接的连接限制性位点，

d)在约37℃下将来自步骤b)的5'PCR臂和3'PCR臂双重消化约2小时，其中所述双重消化发生在缓冲液、限制性酶和不含核酸酶的水中，接着在约65℃下热灭活约20分钟以获得5'臂和3'臂，

e)在约37℃下将来自步骤b)的载体片段单消化约2小时，其中所述单消化发生在缓冲液、限制性酶和不含核酸酶的水中，接着在约37℃下用碱性小牛磷酸酶处理约1小时，

f)将全部体积的步骤d)和e)的消化产物在约0.8％琼脂糖凝胶上分离，凝胶纯化并在洗脱缓冲液中洗脱，

g)在室温下在1:1:1连接比率的5'臂、3'臂和载体片段下使用DNA连接酶和连接酶缓冲液在一步三元连接中将来自步骤f)的消化3'臂、5'臂和载体片段连接约1小时，和

h)通过用连接穿梭载体转化细胞来鉴别适当组装的穿梭载体，在选择性培养基上生长和筛选菌落。

在一个实施方案中，上述方法中的步骤a)是任选的并且用所需限制性位点和/或转基因合成3'臂和/5'臂。

在一个实施方案中，制造EnAd穿梭载体的方法包括如下步骤：

a)鉴别腺病毒基因组中的合适的限制性位点，

b)通过扩增基因组的5'端和3'端和在ITR上游的每个末端插入连接限制性位点来产生5'PCR臂和3'PCR臂，

d)在37℃下使用20μl来自步骤b)的DNA、4μl缓冲液4、2μl AscI、2μl PspOM1和8μl不含核酸酶的水或其等效物将5'PCR臂和3'PCR臂双重消化2小时，接着在65℃下热灭活20分钟以获得5'臂和3'臂，

e)在37℃下在20μl来自步骤b)的DNA、4μl缓冲液4、2μl AscI和8μl不含核酸酶的水或其等效物的浓度下将载体片段单消化2小时，接着在37℃下用1μl碱性小牛磷酸酶处理1小时，

f)将全部体积的步骤d)和e)的消化产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，凝胶纯化并在40μl洗脱缓冲液或其等效物中洗脱，

g)在室温下在1:1:1连接比率下在各2μl的5'臂、3'臂和载体下使用2μl T4DNA连接酶和4μl连接酶缓冲液在一步三元连接中将来自步骤f)的消化3'臂、5'臂和载体片段连接1小时，和

本领域技术人员应理解，可使用替代缓冲液、连接酶和体积并且比例是重要的而非绝对体积。

如本文所用的扩增是指通常使用PCR增加单个或几个拷贝的DNA段(例如在几个数量级上)，产生数千至数百万拷贝的特定DNA序列的过程。

如本文所用的单消化是指用已知靶向DNA序列中的给定位点的单一限制性酶消化所述DNA。

如本文所用的双重消化是指用已知靶向DNA序列中的不同位点的两种不同限制性酶消化所述DNA。

如本文所用的适当组装是指DNA段已经按照预期在适当定向和位置中连接以提供所需穿梭载体。

如本文所用的转化是指由周围的外源遗传物质(外源DNA)的直接摄取、并入和表达产生的细胞的遗传变异。

如本文所用的生长是指如本领域技术人员所通常理解的培养。

如本文所用的筛选是指鉴别具有所需特性的细胞和/或DNA构建体。所用的典型方法包括(但不限于)使用跨越限制性位点的引物的PCR、限制性消化、DNA测序。

如本文所用的上游是指在阅读方向(即5'至3')上之前。如本文所用的下游是指在阅读方向(即5'至3')上之后。

如本文所用的切除是指除去。

在一个实施方案中，所述质粒或穿梭载体还包含已经引入DNA构建体的一个或多个多聚腺苷酸化序列。

如本文所用的合成是指例如DNA片段是通过合成化学技术制得的，例如在自动化合成中。

如本文所用的DNA片段是指在通过本文公开的方法操纵后获得的DNA段、特别是一部分腺病毒基因组DNA或DNA序列。在一个实施方案中，沉默碱基变化是容许的。

如本文所用的沉默碱基变化是指由于遗传密码冗余性不影响编码的氨基酸序列的核苷酸变化。

如本文所用的基本上相同是指DNA片段与为添加一个或多个新型限制性位点而省去的穿梭载体段相同。

如本文所用的纯化是指例如通过除去并非关注的DNA来净化所关注的DNA。

在一个实施方案中，所述方法包括增殖本公开的穿梭载体例如以获得更大量的穿梭载体的另一个步骤。

在一个实施方案中，将连接DNA转化到一个或多个细菌细胞中，例如约120ng的连接DNA被转化。在一个实施方案中，细菌细胞是超级感受态细菌细胞，例如获自Agilent的XL-10。可选地，通过与穿梭载体同源重组而制备的质粒可在例如大肠杆菌中复制，并且因此避免了重复穿梭载体的组装的需要。

在穿梭载体中置换DNA片段

在一个实施方案中，所述方法包括将DNA片段连接到穿梭载体中，例如在切除其一部分后，特别是引入限制性位点和/或转基因的步骤。在一个实施方案中，所用的比率是DNA片段与穿梭载体连接分别是3:1。如本文所用的3:1的片段与穿梭载体连接比率是指3份DNA片段与1份穿梭载体。

在一个实施方案中，所述DNA片段是合成的或PCR产物。如本文所用的PCR产物是指使用PCR制造DNA片段。

修饰穿梭载体的其他细节提供于实施例和附图中。

因此，本公开首次提供腺病毒穿梭载体和质粒，其基本上是模块化的并且允许本领域技术人员随意地操纵腺病毒基因组。

制备质粒

如本文所用的质粒是指在物理上与细胞内的染色体DNA分离并且可以独立于细胞内的染色体DNA进行复制的小DNA分子。对于本公开的目的，质粒是通常包含基本上所有与包含细菌复制起点和选择标记基因的载体片段接合的腺病毒基因组的环状DNA载体(参见图2)。

通常，根据本公开的质粒是通过线性化穿梭载体与腺病毒基因组的同源重组来制备的。在本上下文中的腺病毒基因组是指所有或几乎所有的腺病毒基因组。本领域技术人员应知道，这个步骤是重新组装腺病毒的一部分并且通常是实现本公开的腺病毒构建体的前体。因此，在重组步骤中使用的腺病毒基因组通常包含所有功能元件，其中例外或许是将在最终腺病毒中的转基因。

在一个实施方案中，进行同源重组的方法包括如下步骤：

a)通过在第三限制性酶位点消化来线性化穿梭载体，

b)在电感受态细胞中在线性化穿梭载体与腺病毒基因组之间进行同源重组，

c)通过使细胞在选择性培养基上生长并筛选菌落来鉴别适当重组的质粒。

如本文所用的线性化是指通常通过用单一限制性酶消化DNA构建体而使环状DNA成为线性DNA的过程。

在一个实施方案中，在3.5:1.5的穿梭载体与基因组比率下进行同源重组。

如本文所用的电感受态是指借助于电穿孔转化的细胞。合适的电感受态细胞包括(但不限于)BJ5183细胞。

如本文所用的适当重组是指已经历同源重组的质粒已经获得所需DNA序列。

在一个实施方案中，所述方法包括将转基因盒引入质粒中相关限制性位点的其他步骤。相关限制性位点是指鉴别为存在于基因组中可用于插入转基因盒的位置的位点。通常，相关限制性位点是通过本文公开的方法引入穿梭载体和/或质粒中的原始限制性位点。

在一个实施方案中，将转基因盒引入质粒中的步骤包括进行线性化质粒与转基因盒之间的连接。

在一个实施方案中，将转基因盒引入质粒中的步骤包括：

-将质粒和转基因盒线性化，

-分离所述线性化DNA，

-纯化分离的线性化DNA，

-连接质粒和转基因盒，

-将所连接的DNA转化到例如大肠杆菌中，和

-选择适当转化的菌落。

如本文所用的转基因盒是指例如任选地含有启动子的DNA区段，它是将决定转基因何地何时具活性的调节序列，或作为当mRNA分子将由剪接体裂解时决定的调节序列、蛋白质编码序列(即转基因)的剪接位点，通常源自相关蛋白的cDNA，任选地含有polyA序列和终止序列。图7表示通用转基因盒。

在一个实施方案中，所述转基因盒包含外源启动子，例如哺乳动物启动子。

在一个实施方案中，所述转基因盒包含调节元件，例如内部核糖体进入序列。

在一个实施方案中，所述转基因盒包含polyA序列。

在一个实施方案中，可以通过在序列的3'和5'端用限制性酶切断基因组以切除包含复制起点和选择标记基因的载体片段DNA而从质粒回收病毒或病毒载体。在一个实施方案中，同一限制性酶切断两个位点。然后可以将线性化DNA插入合适的宿主细胞例如HEK293细胞中以产生最终病毒或病毒载体。

转基因

在一个实施方案中，转基因盒中的一个或多个转基因选自：

编码治疗蛋白的相关治疗基因、肽或RNA如抗体或抗体结构域、前药转化酶、免疫调节剂、酶、siRNA、转录因子、细胞内信号传导或表面膜蛋白、或抗原。

如本文所用的抗体是指由免疫系统使用的B细胞产生以鉴别和中和外来病原体如细菌和病毒的大的Y形蛋白。所述抗体识别外来抗原的独特部分。可使用广泛多种不同形式的抗体，包括单克隆抗体、多克隆抗体、双功能抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性和三特异性抗体、骆驼科动物抗体、Fab片段、Fc片段和Fv分子，包括单链Fv(ScFv)抗体。

如本文所用的前药是指以非活性(或小于完全活性)衍生物形式施用且随后通常通过正常代谢过程或通过使用适当的酶而在体内转化成活性药理学剂的分子。因此，前药充当预期药物的一类前体。前药转化酶充当将前药转化成其药理学活性形式的酶。在一个实施方案中，根据本公开的病毒构建体在体内编码并表达前药和适当的转化酶。

如本文所用的免疫调节剂是指免疫反应调节剂。免疫调节剂用于在所需方向上或在所需程度上调节免疫反应的质量和数量，如在免疫增强、免疫抑制或免疫耐受诱导中。在一个实施方案中，所述免疫调节剂是免疫刺激剂，例如佐剂，例如富含CpG的DNA序列。

如本文所用的酶是指适合催化特定化学反应，例如调节化学反应进行的速率而自身在过程中无改变的蛋白质。在一个实施方案中，所述酶能够催化活生物体中的反应。

如本文所用的报道基因是指产生容易在真核细胞中检测到的产物并且可以用作标志物以测定相关基因的存在或活性的基因。在一个实施方案中，报道基因DNA与相关DNA序列紧密连接或组合。在一个实施方案中，报道基因例如是荧光素酶和荧光蛋白如GFP。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码报道基因以进行体外成像和定位，例如(但不限于)：钠碘转运体(NIS)、细胞内金属蛋白(例如铁蛋白、酪氨酸酶)、单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-tk)、GFP和其他荧光团、荧光素酶、雌激素受体和其他可诱导报道基因。

在一个实施方案中，所述转基因不是报道基因或成像剂，例如荧光素酶或eGFP。

如本文所用的外源哺乳动物启动子是指调节基因转录的DNA元件，通常位于相关基因上游。

如本文所用的调节元件是指允许使用内源启动子如主要晚期启动子的DNA序列，或调节表达、例如多种基因的表达的其他DNA序列，例如多顺反子序列。

如本文所用的内部核糖体进入序列(IRES)是指允许在信使RNA(mRNA)序列中部起始翻译的核苷酸序列。

如本文所用的polyA序列是指通常含有AATAAA位点的DNA序列，其一旦被转录就可以被裂解并多聚腺苷酸化新生mRNA分子的多蛋白复合物识别。

如本文所用的相关(治疗)基因是指适合产生药理学作用(通常是有益的药理学作用)的基因，例如在表达后，特别是所述活性可增强本公开的DNA构建体或腺病毒的效用或疗法，例如溶瘤病毒活性。

设想多种不同类型的转基因(和其组合)，其编码本身用于调节肿瘤或免疫反应并治疗性地作用的分子，或者是直接或间接地抑制、激活或增强治疗分子的活性的药剂。可编码的分子包括蛋白配体或配体的活性结合片段，抗体(例如，全长或片段，例如Fv、ScFv、Fab、F(ab)'2或较小的特异性结合片段)，或其他靶标特异性结合蛋白或肽(例如可通过例如噬菌体展示等技术来选择)，天然或合成结合受体、配体或片段，调节编码靶标的基因的转录或翻译的特异性分子例如siRNA或shRNA分子，转录因子等。分子可呈与其他肽序列的融合蛋白形式，例如以增强其活性、稳定性、特异性等。在一个实施方案中，配体可与免疫球蛋白Fc区融合以形成二聚体并增强稳定性或提供效应功能。在一个实施方案中，所述转基因可编码例如与实体的融合蛋白，所述实体与对抗原呈递细胞如树突状细胞具特异性的抗体或抗体片段例如抗DEC-205、抗甘露糖受体、抗dectin融合。

在一个实施方案中，插入物还可编码可以例如用于检测感染根据本发明的腺病毒或腺病毒载体的细胞、肿瘤成像或引流淋巴和淋巴结等的报道基因。

在一个实施方案中，所编码的蛋白质是下文列出的分子的人类、例如人类抗体或天然配体，或靶向其的siRNA分子，或肿瘤抗原。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码T细胞共刺激受体或其配体，例如(但不限于)：OX40、OX40配体、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40配体(CD40L)、CD137、GITR、4-1BB、ICOS、ICOS配体。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码T细胞共抑制分子或其配体(检查点抑制受体和配体)，例如(但不限于)：细胞毒性T淋巴细胞相关性抗原-4(CTLA-4)，程序性细胞死亡-1(PD-1)，PD-配体-1(PD-L1，也称为B7-H1)，PD-配体-2(PD-L2，也称为B7-DC)，其他B7受体超家族如B7-H3、B7-H4，疱疹病毒进入介体(HVEM)，抑制性受体Ig样转录物-3(ILT-2)、ILT-3、ILT-4，T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)，淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)，B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，LIGHT(与淋巴毒素同源，展现可诱导表达，并且与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒进入介体，通过T淋巴细胞表达的受体)，CD160。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码由调节T细胞(天然和诱导的Tregs、Tr1等)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)和其他免疫抑制性免疫细胞表达的分子，例如(但不限于)：CD16、CD25、CD33、CD332、CD127、CD31、CD43、CD44、CD162、CD301a、CD301b和半乳糖凝集素-3。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码树突状细胞(和其他抗原呈递细胞)受体或其配体，例如(但不限于)：Fms相关酪氨酸激酶3(FLT-3)、FLT-3配体、Toll样受体(TLR)和其配体(例如TLR-9、作为TLR-5配体的鞭毛蛋白)、CCR7(CD197)、CD1a、CD1c(BDCA-1)、CD11b、CD11c、CD80(B7-1)、CD83、CD86(B7-2)、CD123(IL-3Rα)、CD172a(SIRPα)、CD205(DEC205)、CD207(Langerin)、CD209(DC-SIGN)、CD273(B7-DC)、CD281(TLR1)、CD283(TLR3)、CD286(TLR6)、CD289(TLR9)、CD287(TLR7)、CXCR4(CD184)、GITR配体、IFN-α2、IL-12、IL-23、ILT1(CD85h)、ILT2(CD85j)、ILT3(CD85k)、ILT4(CD85d)、27D6 5148、42D1 5149、ILT5(CD85a)、ILT7(CD85g)、TSLP受体、CD141(BDCA-3)、CD303(CLEC4c、BDCA-2)、CADM1(NECL2)、CLEC9a、XCR1、CD304(神经纤毛蛋白-1、BDCA-4)。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码抗原加工和呈递介体，例如(但不限于)：MHC II类反式激活子(CTIIA)、γ-IFN可诱导溶酶体硫醇还原酶(GILT)。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码细胞因子或其受体，例如(但不限于)：白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-33、IL-35、白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-25、IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)、干扰素-α(IFNα)、干扰素-β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、转化生长因子-β(TGFβ-不同亚型)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码趋化因子或趋化因子受体，例如(但不限于)：白细胞介素8(IL-8)、CCL5(RANTES)、CCL17、CCL22、CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CRTH2。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码转录因子或其他转录调节子，例如(但不限于)：STAT3、STAT1、STAT4、STAT6、CTIIA、MyD88、NFκB家族成员。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码前药转化酶或其他酶，例如(但不限于)：胞嘧啶脱氨酶和酪氨酸激酶。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码细胞内运输分子或细胞功能调节剂，例如(但不限于)：热休克蛋白-70(HSp70)、细胞存活和死亡的调节剂(例如存活蛋白)。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码肿瘤细胞或肿瘤微环境受体和产物，例如(但不限于)：EGF配体和受体：双调蛋白(amphiregulin)、β细胞素(betacelluin)(BTC)、神经调节素-1a(NRG1a)、NRG1b、NRG3、转化生长因子-a(TGFa)、LRIG1(富含亮氨酸的重复序列和含Ig样结构域1)、LRIG3、EGF、EGF-L6、Epigen、HB-EGF、EGFR(ErbB1)、Her2(ErbB2、Her3(ErbB3)、Her4(ErbB4)。

在一个实施方案中，所述转基因或基因是如下分子家族的配体和受体，例如(但不限于)：刺猬蛋白(hedgehog)、FGF、IGF、Wnt、VEGF、TNF、TGFb、PDGF、Notch。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码细胞内肿瘤细胞酶，例如(但不限于)：吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码用于被免疫细胞识别的抗原，例如(但不限于)：作为抗原(例如巨细胞病毒抗原、流感抗原、乙型肝炎表面和核心抗原、白喉类毒素、Crm197、破伤风类毒素)的来自传染性生物体的外来免疫原性蛋白，源自这些抗原的肽(其是已知T细胞或抗体表位)，或这些抗原的遗传工程改造的复合物或多聚体。

在一个实施方案中，所述转基因或基因编码作为抗原的肿瘤源蛋白、源自这些抗原的肽(其是已知T细胞或抗体表位)，或这些抗原的遗传工程改造的复合物或多聚体。这些抗原可包括例如WT1、MUC1、LMP2、独特型、HPV E6和E7、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGE A3、p53非突变体、p53突变体、NY-ESO-1、GD2、PSMA、PCSA、PSA、gp100、CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活蛋白、PSA、hTERT、肉瘤易位断裂点、EphA2PAPML-IAP AFP EpCAM、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期素B1、聚唾液酸、MYCN、Rhoc、TRP-2、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、Fos相关抗原1(Cheever等,2009)。

如本文所用，pNG-62是指包含ColoAd2.4基因组的质粒和包含编码GFP的基因的转基因盒(参见SEQ ID NO:35，图30)。

制备腺病毒

本公开此外提供产生重组体腺病毒的方法，其中早期基因，例如病毒复制所必需的那些，特别是E1和/或E3可以保持完整，或其中根据预期目的缺失病毒复制所必需的基因的腺病毒载体。因此，本公开促进活的溶瘤病毒的遗传工程改造，例如在先前不可能的区域中向其武装治疗蛋白的能力。

可提供根据本公开的最终腺病毒，其利用适当的限制性酶从质粒切除基因组DNA，接着例如进行连接步骤以完成、环化基因组。因此，可通过在序列的3'和5'端利用限制性酶切断基因组以切除包含复制起点和选择标记基因的载体片段DNA而从质粒回收病毒或病毒载体。在一个实施方案中，同一限制性酶切断两个位点。然后可以将线性化DNA插入合适的宿主细胞例如HEK293细胞中以产生最终病毒或病毒载体。

穿梭载体、质粒和腺病毒

在一个实施方案中，提供例如可从本公开的方法以中间体形式获得的腺病毒穿梭载体。

本公开的穿梭载体包含含有病毒纤维基因的3'臂。上文关于所述方法给出的穿梭载体的细节也与穿梭载体本身实施方案相关。本公开的穿梭载体含有相对大量的腺病毒基因组DNA，例如在约9Kb至约11.9Kb范围内。在一个实施方案中，50％或更多、例如60％、70％、75％或80％的穿梭载体是腺病毒基因组DNA。在一个实施方案中，所述穿梭载体总计为约15Kb或更小，例如14、13或12Kb。相比之下，现有技术载体的主要部分是转基因和调节元件。

在一个方面，提供一种穿梭载体，其包含：

a)包含复制起点、选择标记的载体片段，

b)至少包含纤维基因(L5)和任选地还包含E3位点、E4或所述位点两者的3'臂。

在一个实施方案中，所述穿梭载体不包含转基因和/或与转基因相关的任何调节元件，例如启动子、IRES序列是类似的。这是因为相对于简单地将一个转基因引入病毒中，如本公开中所用的穿梭载体被开发用于将机构引入病毒基因组中以促进病毒的灵活遗传工程改造。

在一个实施方案中，所述穿梭载体是包含通过合适的限制性位点(上文描述为第三限制性酶位点)将腺病毒基因组的5'臂直接连接至腺病毒基因组的3'臂以使得所述腺病毒基因组的“中间序列”不存在的环状DNA穿梭载体。3'臂和5'臂一起在本文被称为穿梭载体的主要片段。主要片段的3'和5'端又通过连接限制性位点接合至含有低拷贝细菌复制起点和选择标记基因的载体片段(参见图6和图8)。

可选地，如上文所讨论，所述穿梭载体可包含一个或多个转基因，例如在穿梭载体的3'臂中。

在一个实施方案中，所述穿梭载体还包含5'臂。所述穿梭载体中使用的5'臂与其他地方定义的相关组分相同，例如描述于所述方法的上下文中。

在一个实施方案中，所述穿梭载体包含至少一个原始限制性位点，例如已经使用本领域技术人员所熟悉的标准技术引入至基因组。

在一个实施方案中，所述穿梭载体具有序列SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，所述穿梭载体具有序列SEQ ID NO:15。在一个实施方案中，所述穿梭载体具有序列SEQ IDNO:17。在一个实施方案中，所述穿梭载体具有序列SEQ ID NO:26。

在一个实施方案中，提供可通过本发明的方法获得的腺病毒质粒。

在另一个方面，提供一种质粒，其包含：

a)包含L5基因、E3位点和E4位点的腺病毒基因组，

b)在所述L5基因与选自所述E3位点、所述E4位点以及所述E3位点和所述E4位点中的每一个的位点之间的位置中的至少一个原始限制性位点，

c)低拷贝细菌复制起点，和

d)选择标记基因。

有利的是，新质粒提供在晚期表达的L5纤维基因附近的新型原始限制性位点。将转基因插入这个位置中不太可能干扰病毒稳定性和复制。在一个实施方案中，所述质粒包含已经使用本领域技术人员所熟悉的标准技术引入至基因组的至少一个原始限制性位点。在一个实施方案中，所述质粒还包含转基因盒。在一个实施方案中，所述质粒具有序列SEQID NO:28。在一个实施方案中，所述质粒具有序列SEQ ID NO:30。在一个实施方案中，所述质粒具有序列SEQ ID NO:31。

在另一个方面，提供可从根据本发明的质粒获得的腺病毒或腺病毒载体。

在一个实施方案中，腺病毒或病毒载体含有例如能够在不缺失任何基因组的情况下被插入的小的转基因。在一个实施方案中，腺病毒或腺病毒载体可含有能够在不缺失任何基因组(例如总共为4.5kb或更小的一个或多个基因)的情况下被插入的小的转基因。

在一个实施方案中，可通过所述方法或从根据本公开的质粒获得的腺病毒或病毒载体可含有较大的转基因。在一个实施方案中，有复制能力的腺病毒在基因组中具有额外空间(例如EnAd)，例如因为除去了复制不必需的基因，例如部分或全部的E3和/或E4orf4区缺失。在一个实施方案中，提供条件性复制的腺病毒，其中基因组中的空间已经通过缺失例如部分或全部的E3和/或E4orf4区而产生。

在一个实施方案中，非复制腺病毒(即需要包装细胞系来复制的那些)具有一个或多个基因，例如早期基因缺失，例如部分或全部的一个或多个基因独立地选自E1、E2、E3和E4(例如E4orf4)。

在一个实施方案中，所述工程改造的病毒是活的有复制能力的病毒。

在一个实施方案中，所述工程改造的病毒是复制缺陷型病毒载体。在一个实施方案中，本公开的病毒载体中的E1基因缺失。在一个实施方案中，如本文所用的病毒载体是指用作将遗传物质(例如转基因)人工运载至可以在其中复制和/或表达的另一个细胞(例如哺乳动物细胞)中的运载体的DNA分子。

在一个实施方案中，本公开的工程改造的腺病毒构建体包含一个或多个转基因。

在一个实施方案中，在根据本公开的病毒或病毒载体中缺失部分或全部的E4基因，例如缺失基因的E4orf4区段。

在一个实施方案中，在根据本公开的病毒或病毒载体中缺失部分或全部的E3基因。

在一个实施方案中，在根据本公开的病毒或病毒载体中缺失E3基因和部分或全部的E4基因。

在一个实施方案中，在根据本公开的病毒或病毒载体中缺失部分或全部的L5基因。在本公开的病毒中，允许L5的部分缺失，只要保持L5功能即可，因为这种功能是病毒复制所必需的。

在一个实施方案中，在根据本公开的病毒或病毒载体中缺失部分或全部的E2区。

在一个实施方案中，提供例如可从本公开的腺病毒质粒获得的本公开的腺病毒或腺病毒载体。

在一个实施方案中，提供例如可从根据本发明的质粒获得的本公开的腺病毒或腺病毒载体在治疗中的用途。在另一个方面，提供可从根据本发明的质粒获得的腺病毒或腺病毒载体在治疗中的用途。

本领域技术人员应理解，从本发明的质粒产生的腺病毒或腺病毒载体可以用作治疗剂(例如溶瘤剂)或用作疫苗，或用作其中病毒在没有包装细胞的辅助下不能复制的基因递送载体。

在另一个方面，提供例如可从根据本发明的质粒获得的本公开的腺病毒或腺病毒载体在癌症治疗中的用途。

在另一个方面，提供例如可从根据本发明的质粒获得的本公开的腺病毒或腺病毒载体在疫苗疗法中的用途。

如本文所用的可通过……获得是指具有利用本公开的方法产生的实体的特性的任何质粒或腺病毒。在实施方案中，如本文所用的可从……获得是指可以从本发明的质粒切除的腺病毒基因组产生的任何腺病毒。

在一个实施方案中，本公开的腺病毒或腺病毒载体可含有能够在不缺失任何基因组(例如总共为4.5kb或更小的一个或多个基因)的情况下被插入的小的转基因。

在一个实施方案中，提供例如可从根据本发明的质粒获得的本公开的腺病毒或腺病毒载体在治疗中的用途。

制剂和治疗方法

在另一个方面，提供一种包含例如可从根据本发明的质粒获得的本公开的腺病毒或腺病毒载体和药学上可接受的赋形剂的组合物。

本领域技术人员应理解，从本发明的质粒产生的腺病毒可以用作治疗剂(例如溶瘤剂)或疫苗，或用作其中病毒在没有包装细胞的辅助下不能复制的基因递送载体(即是病毒载体)。

在一个实施方案中，提供可从根据本发明的质粒获得的腺病毒或腺病毒载体在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

如本文所用的基于疫苗的疗法是指包含编码一种或多种抗原的转基因的本发明的腺病毒载体的递送(例如肌内、皮下、皮内、局部、舌下、鼻内、口服、经引道或经直肠)或一系列这样的递送，以诱导免疫反应或者针对治疗益处定量地和/或定性地修改已建立的抗原免疫反应。由此每种递送可利用如本领域技术人员将理解的免疫调节剂(例如佐剂、免疫调节肽、蛋白质或小分子)配制或伴随着其的递送。

在一个实施方案中，提供有效剂量的可从根据本公开的质粒获得的腺病毒或腺病毒载体和药学上可接受的赋形剂。

所述药学上可接受的赋形剂或载体本身不应诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体的产生并且不应该具毒性。合适的载体可以是大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒粒子。

可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。

治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质如润湿或乳化剂或pH缓冲物质可存在于这些组合物中。这样的载体能够使药物组合物配制成被患者摄取的片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和混悬液。

合适的施用形式包括适合肠胃外施用，例如通过注射或输注，例如通过快速推注或连续输注的形式。当产品是用于注射或输注时，其可采用于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液形式并且其可含有配制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，所述病毒可呈无水形式，以在使用前用适当的无菌液体重新配制。

一旦被配制，本发明的组合物可以直接施用至受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，所述组合物适于施用至人类受试者。

适宜地，在根据本公开的制剂中，最终制剂的pH与病毒的等电点值是不相似的，例如如果制剂的pH是7，则8-9或更高的pH可能是适当的。虽然不希望受理论束缚，但人们认为这可能最终提供具有改进稳定性的最终制剂，例如病毒保持在溶液中。

本发明的药物组合物可通过任何数目的途径来施用，包括(但不限于)口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。还可使用无针注射器(Hypospray)来施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可制备成注射剂形式，即液体溶液或混悬液形式。还可制备适合在注射前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。

所述组合物的直接递送通常将通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射来实现，或者递送至组织的间隙空间。所述组合物还可以施用至病灶中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。

应理解，所述组合物中的活性成分将是病毒。因而，它将容易在胃肠道中降解。因此，如果所述组合物是通过使用胃肠道的途径来施用，则所述组合物将需要含有保护病毒免于降解但一旦其已经从胃肠道吸收就释放病毒的试剂。

药学上可接受的载体的详尽讨论可在《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》(Mack Publishing Company,N.J.1991)中提供。

在一个实施方案中，所述制剂以用于局部施用(包括吸入)的制剂形式提供。

合适的可吸入制剂包括可吸入粉末、含有推进剂气体的计量气雾剂或不含推进剂气体的可吸入溶液。含有活性物质的根据本公开的可吸入粉末可仅由上述活性物质组成或由上述活性物质与生理学上可接受的赋形剂的混合物组成。

这些可吸入粉末可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如右旋糖苷)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些物质彼此的混合物。适宜使用单糖或二糖，乳糖或葡萄糖的使用特别地但不排他地呈其水合物形式。

在肺中沉积的粒子需要小于10微米、例如1-9微米、例如0.1至5μm、特别是1至5μm的粒度。活性成分(例如病毒)的粒度是最重要的。

可用于制备可吸入气雾剂的推进剂气体是本领域中已知的。合适的推进剂气体选自烃类如正丙烷、正丁烷或异丁烷，和卤代烃如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推进剂气体可独立地或以其混合物形式使用。

特别合适的推进剂气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)和其混合物是特别合适的。

含推进剂气体的可吸入气雾剂还可含有其他成分，例如共溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活化剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的装置。所有这些成分都是本领域中已知的。

根据本发明的含推进剂气体的可吸入气雾剂可含有至多5重量％的活性物质。根据本发明的气雾剂含有例如0.002重量％至5重量％、0.01重量％至3重量％、0.015重量％至2重量％、0.1重量％至2重量％、0.5重量％至2重量％或0.5重量％至1重量％的活性成分。

可选地，向肺部的局部施用还可以通过液体溶液或混悬液制剂的施用，例如使用诸如喷雾器的装置，例如，连接至压缩机的喷雾器(例如，连接至Pari Master(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器，由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造)。

本发明的病毒可以分散在溶剂中，例如以溶液或混悬液形式递送。其可以悬浮在适当的生理溶液、例如盐水或其他药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域中已知的缓冲溶液可含有以每1ml水计0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠以达到约4.0至5.0的pH。混悬液可使用例如利用无菌等渗载体当场稀释的冻干病毒。

治疗性混悬液或溶液制剂还可含有一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域中熟知的并且包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇和甘油。溶液或混悬液可以封装在脂质体或可生物降解的微球中。所述制剂通常将以基本上无菌形式提供。

无菌制造过程可包括病毒的产生和通过过滤用于制剂的缓冲溶剂/溶液来灭菌，将病毒无菌悬浮在无菌缓冲溶剂溶液中，和通过本领域普通技术人员所熟悉的方法将所述制剂分配到无菌容器中。

包括用于喷雾、肠胃外、局部和口服剂量的根据本公开的制剂可例如以单剂量单位(例如呈密封塑料容器或小瓶形式)提供。在一个实施方案中，每个小瓶含有溶剂/溶液缓冲液体积(例如2mL体积)的单位剂量。

除非上下文另有说明，否则溶剂、溶液、载体等在本文中可互换使用。

在一个实施方案中，根据本公开的制剂(包括单位剂量制剂)被包装在箔包膜中。

在一个实施方案中，用于治疗中的根据本公开的病毒构建体、制剂是经肠胃外施用的。在一个实施方案中，根据本公开的病毒构建体、制剂是局部地(例如经鼻内)施用至结肠、肺部、眼睛或类似物。在一个实施方案中，根据本公开的病毒构建体、制剂是经口施用的。

在一个实施方案中，本文公开的病毒可适于经由喷雾递送。

因此，提供本公开的腺病毒或包含其的组合物用于治疗例如癌症的用途，特别是通过向有需要的患者施用治疗有效量。此外提供本公开的腺病毒用于制造药物的用途。

在本说明书的上下文中，“包含”应理解为“包括”。

包含某些元件的本发明的方面也旨在扩展至“由相关元件组成”或“基本上由相关元件组成”的替代实施方案。

在技术上适当时，本发明的实施方案可以组合。

技术参考如专利和申请以引用的方式并入本文中。

本文中特定和明确叙述的任何实施方案可单独地或与一种或多种其他实施方案组合构成免责声明的基础。

本公开的方面在序列和附图中描述，其可构成修正的基础。附图和序列的公开内容一般适用于本公开的教导，而不旨在简单地视为非常具体的特征组合。申请GB1322851.5的优先权以引用的方式并入本文中，PCT申请PCT/EP2014/072919(包括其序列表)的内容也是如此。

实施例

Ad11基因组：

实施例1ColoAd1穿梭载体的构建

构建11978bp穿梭载体(被称为‘ColoAd1穿梭载体’)，其含有p15A细菌复制起点、卡那霉素抗性盒和通过PspOMI第三限制性酶位点接合的ColoAd1的5'和3'臂(参见图6)。

通过PCR合成三个DNA片段：

1)对应于具有5'AscI限制性位点和3'PspOMI限制性位点的5'4627bp的ColoAd1的“ColoAd1的5'臂”，

2)对应于具有5'PspOMI限制性位点和3'AscI限制性位点的3'4482bp的ColoAd1基因组的“ColoAd1的3'臂”，和

3)含有被AscI限制性位点侧接的低拷贝p15A复制起点和卡那霉素抗性盒的载体片段。

5'臂和3'臂中的PspOMI第三限制性位点被选择为合适的限制性位点以允许穿梭载体被线性化并与ColoAd1基因组重组以形成质粒，而不向基因组序列引入任何不希望的变异。

所述限制性位点被设计成接近ColoAd1基因组的5'端以及基因组的3'端，特别是距3'和5'ITRS的末端约4-5kb以使得所述穿梭载体具有约4-5kb 3'和5'臂，如图4中所示。

通过PCR合成片段的细节

用于PCR扩增的引物列于表1中：

1)5'臂的产生

为了扩增ColoAd1的E1A、E1B和E2B区和5'端，使用引物0198(SEQ ID NO.5)和0200(SEQ ID NO.7)在天然ColoAd1上进行PCR。将50μl反应体积用于根据下表2的PCR反应，并且PCR产物的示意图示于图10A中。

表2

2)3'臂的产生

为了扩增ColoAd1的E3、纤维和E4区和3'端，使用引物0198(SEQ ID NO.5)和0201(SEQ ID NO.8)在天然ColoAd1上进行PCR。将50μl反应体积用于下表3中所详述的PCR反应并且PCR产物的示意图示于图10B中。

表3：

3)载体片段的产生

使用引物0196(SEQ ID NO.3)和0197(SEQ ID NO.4)在载体片段上进行第三PCR以产生含有具有5'和3'AscI限制性位点的p15A起点和卡那霉素抗性基因的约3kb片段(图10C)。将50μl反应体积用于如表4中所详述的PCR反应：

所有PCR扩增都使用以下方案。表5：

步骤编号	阶段	温度()	时间(秒)
				步骤1	初始变性	98	60
步骤2	变性	98	8
				步骤3	退火	60	20
步骤4	延伸	72	90
				步骤5	最终延伸	72	300
步骤6	保持	4	保持

进行30个循环的扩增：[步骤1]×1，[步骤2、步骤3、步骤4]×30，[步骤5]×1。

然后将1μl的各PCR产物在1％琼脂糖凝胶上在150V下操作1小时(图11A)。根据制造商的方案通过离心柱方法(Spin Column Method)纯化整个体积的每种PCR产物并洗脱到40μl洗脱缓冲液中。

重复5'和3'臂的PCR以获得更高的扩增产率。如先前所详述使用相同的程序和混合物并且将1μl产物在0.8％凝胶上在150V下操作1小时(图11B)。通过从0.8％琼脂糖凝胶进行凝胶提取来纯化整个体积的每种PCR产物并且在40μl洗脱缓冲液中洗脱。

在PCR扩增后，尝试众多方法来将三个PCR片段‘粘结’在一起以形成ColoAd1穿梭载体。一种方法尝试使用两步骤反应来连接PCR产物。这种方法是不成功的，其首先将5'臂连接至3'臂，接着进行第二连接反应以连接载体(细节参见下文)。

第二种方法尝试在一步三元连接中将三种PCR产物连接在一起。为了确定使用这种方法成功连接的条件，DNA总量、DNA片段的比率、连接时间和温度以及载体的磷酸化状态改变。若干组合尝试是不成功的，直至达到起作用的方法。

形成ColoAd1穿梭载体的一步三元连接

根据下表，使用PspOMI和AscI将5'臂和3'臂(约4.6kb和约4.5kb)的PCR产物双重消化(参见表6)并且仅用AscI消化p15a-KAN载体(约3kb)的PCR产物(参见表7)，在37℃下持续2小时。

5'臂或3'臂表6：

p15A-Kan载体表7：

将5'和3'臂消化物在65℃下热灭活20分钟。在37℃下用1μl碱性小牛磷酸酶(CIP)处理p15A-Kan载体片段1小时。

将1μl的所有处理的限制性消化物在0.8％琼脂糖凝胶上操作(图12)。将整个体积的消化产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，凝胶纯化并在40μl洗脱缓冲液中洗脱。

在室温下利用使用2μl T4DNA连接酶和4μl连接酶缓冲液的纯化消化产物进行一步三元连接1小时：按照表8，具有不同比率的片段。

利用XL-10Gold超级感受态细胞通过在冰上温育30分钟而将整个连接混合物转化到细菌中，接着在42℃下热休克30秒。将500μl的每种转化培养物铺在LB+Kan板上并在37℃下温育过夜。将利用2μl T4DNA连接酶使用6μl脱磷酸化p15A-kan载体的对照铺在LB+Kan板上。在温育过夜后，菌落存在于除对照板之外的所有板上。

菌落的诊断PCR筛选和限制性消化

从每个板挑取4个菌落并在250rpm、37℃下在4ml LB肉汤中培养过夜。

通过miniprep纯化DNA，其涉及根据制造商的miniprep方案通过碱性裂解从细菌收集DNA和在DNA结合柱上纯化DNA。将所述DNA在40μl缓冲液中洗脱。

在12种纯化的DNA样品上进行诊断PCR以确定是否存在约12kb ColoAd1穿梭载体产物并且在适当定向上含有5'和3'臂(图13)。使用跨越应该已经发生连接的接点的引物，对于每种构建体使用三种独立的PCR。反应中使用的引物的序列示于下表9中。

参考编号	引物名称	序列
			0202(SEQ ID NO:9)	Kanr 5'臂FWD	ATCGCCTTCTATCGCCTTC
0203(SEQ ID NO:10)	Kanr 5'臂REV	AGCAGTGCAAATCACAGTC
			0204(SEQ ID NO:11)	5'3'臂FWD	CAAACTGAGTCTGCTGTCG
0205(SEQ ID NO:12)	5'3'臂REV	ATAAAGGGGTGTTGGGAGG
			0206(SEQ ID NO:13)	3'臂p15A FWD	CCCTCGTAAAACCTGTCATC
0207(SEQ ID NO:14)	3'臂p15A REV	CCCATTCGTCTCTCCATTC

表9

根据下表10-12中详述的混合物来设置PCR反应：

表10混合物1：

反应	体积(μl)
		Taq PCR混合物	25
引物202(SEQ ID NO:9)	1
		引物203(SEQ ID NO:10)	1
不含核酸酶的水	22
		DNA	1

表11混合物2：

反应	体积(μl)
		Taq PCR混合物	25
引物204(SEQ ID NO:11)	1
		引物205(SEQ ID NO:12)	1
不含核酸酶的水	22
		DNA	1

表12混合物3：

根据制造商对于TAQ聚合酶PCR混合物(Qiagen#201443)的说明书设置PCR程序。

将1μl的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上在150V下操作1小时(图14)。

对于适当尺寸和定向的构建体，如图13中的示意图所详述预期1.3kb、1.4kb和1.1kb的3种PCR产物。仅样品13、14和16(图14)显示适当尺寸的产物。这些构建体都是使用1:1:1连接比率产生的。使用1:1:6和1:1:12比率的构建体未产生适当尺寸的片段(图14#17-24)。为了证实12kb ColoAd1穿梭载体在1:1:1连接样品中的存在，在37℃下在构建体选择上进行利用PspOMI的限制性消化或利用PspOMI和AscI的双重消化持续1小时。所用的消化反应详述于表13和表14中。

表13单消化：

表14双重消化：

将1μl的每种消化物在0.8％凝胶上在150V下操作1小时(图15)。

对于适当尺寸和定向的构建体，PspOMI消化物将预期得到单个约12kb谱带并且PspOMI/AscI消化将预期得到约3kb谱带和约4.7kb谱带。对于双重消化，由于存在这个尺寸的5'和3'臂，约4.7kb谱带将预期具有约3kb谱带的大约两倍强度。构建体13和16显示对应于ColoAd1穿梭载体的适当消化谱带模式(图8)。

然后对构建体编号16测序，其证实ColoAd1穿梭载体SEQ ID NO:2的成功构建。

实施例2ColoAd2.4穿梭载体的构建

在实施例1中产生的ColoAd1穿梭载体含有仅在基因组中出现一次的11个独特(天然)限制性位点，其允许在穿梭载体中存在的ColoAd1基因组的任何区域的修饰(例如，E1区的修饰)。显示穿梭载体中存在的位点位置和ColoAd1基因的限制性图谱提供于图6中。

两个独特(天然)限制性位点(PspOMI和AclI)分别在ColoAd1穿梭载体中的位置4634和6851侧接纤维(L5)基因。这些对应于原始PspOMI和AclI，其在ColoAd1基因组中的位置27839和30065侧接纤维(L5)基因(图9)。在ColoAd1穿梭载体中，这些位点允许这个区域中的DNA序列被切除并用修饰或不同的序列置换，或具有作为简单添加插入它们内的DNA序列。

通过用合成DNA片段置换PspOMI与AclI限制性位点之间的DNA序列，从ColoAd1穿梭载体产生ColoAd2.4穿梭载体。所述合成DNA片段序列与其在ColoAd1穿梭载体中置换的序列相同，不同之处在于它含有纤维基因下游的另外19bp(GCGATCGCTACCCTGCAGG-SEQ IDNO.29，图3)。这些另外的碱基包括新的原始SgfI和SbfI限制性位点(图17)。

被PspOMI和AclI位点侧接的合成DNA片段定购自MWG Eurofins(图18，SEQ IDNO.27)。所述合成片段提供于5.17kb AmpR pBluescript II SK质粒中。

将ColoAd1穿梭载体和含有所述合成片段的pBluescript质粒在37℃下在表15中详述的反应中消化1小时：

将消化的穿梭载体和合成片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离并且将适当尺寸的片段进行凝胶纯化并在40μl的不含核酸酶的水中洗脱。

在室温下在10μl反应中使用3:1连接比率的插入物与穿梭载体在3μl:1μl的体积下利用1×连接酶缓冲液和1μl T4DNA连接酶将合成片段连接到ColoAd1穿梭载体中持续1小时。

根据制造商的方案，通过在42℃下热休克将2μl的连接混合物转化到XL-1Blue细胞中。在转化后，从LB卡那霉素板挑取5个菌落并且在250rpm、37℃下在含有卡那霉素的3mlLB肉汤中培养过夜。根据制造商的方案对每种培养物进行Minipreps并且将纯化的DNA在40μl缓冲液中洗脱。

为了证实含有原始限制性位点的ColoAd2.4穿梭载体的构建，对于5种样品中的每一种进行SbfI和SgfI限制性酶分析。如下表16中所详述来设置利用EcoRV和SbfI的限制性消化：

所有5种消化物都产生适当尺寸的片段：3kb和9kb的谱带(图19)。

在细菌中从甘油储备液扩增假定ColoAd2.4穿梭载体#5并且通过maxiprep收集并纯化DNA。对这种构建体#5测序，证实ColoAd2.4穿梭载体(SEQ ID No.26)的成功构建。

实施例3ColoAd2.0穿梭载体的构建

从实施例1中构建的ColoAd1穿梭载体产生ColoAd2.0穿梭载体(SEQ ID NO:15，图20)。用于产生ColoAd2.0穿梭载体的方法与用于产生ColoAd2.4穿梭载体的方法相同；使用实施例2中详述的PspOMI与AclI限制性位点之间的合成DNA片段的连接。

用于构建ColoAd2.0穿梭载体的合成DNA片段序列与其在ColoAd1穿梭载体中置换的序列类似，不同之处在于它含有纤维(L5)基因上游的另外9bp，包含FseI原始限制性位点，和纤维基因下游的另外123bp，包含两个多聚腺苷酸化序列以及SgfI、NotI和SbfI原始限制性位点(SEQ ID NO:16，图21)。

如由表17中的混合物所详述，通过利用酶FseI、AscI、NotI、SbfI或PspOMI在37℃下1小时的多种限制性消化来证实ColoAd2.0穿梭载体的构建：

将2μl的每种消化物在1％琼脂糖凝胶上分离。所有构建体都显示每种消化物的适当谱带模式(图22)。选择ColoAd2.0穿梭载体构建体#4并测序，其证实ColoAd2.0穿梭载体(SEQ ID NO:15)的成功构建。

实施例4.ColoAd2.1穿梭载体的构建

通过用由两个PCR反应产生的DNA片段(SEQ ID NO:18)置换PspOMI与AclI限制性位点之间的DNA序列而从ColoAd1穿梭载体(在实施例中产生)产生ColoAd2.1穿梭载体(SEQID NO:17，图23)。所产生的DNA片段与其在ColoAd1穿梭载体中置换的序列相同，不同之处在于它含有纤维基因上游的另外9bp(AGCGGCCGC-SEQ ID NO:19，图3)。这些另外的碱基包括原始NotI限制性位点(图24C)。

为了通过PCR将NotI限制性位点引入PspOMI-AclI侧接序列中，需要2个PCR反应。一种PCR(PCR 1)产生包括5'PspOMI限制性位点和所引入的3'NotI位点的片段(图24A)并且第二(PCR 2)产生包括所引入的5'NotI位点和3'AclI位点的片段(图24B)。在NotI位点连接这些PCR产物产生用于ColoAd2.0穿梭载体构建的ColoAd2.0DNA片段(图24C)。

用于两种PCR反应的引物示于表18中：

引物参考编号	引物名称	序列
			0274(SEQ ID NO.20)	Bam-Not A Fwd	TTCGGATCCGGGCCCATACTAGTCTTGC
0275(SEQ ID NO.21)	Bam-Not A Rev	CATGCGGCCGCTCTGGGAAGAAAGACATGAAGA
			0276(SEQ ID NO.22)	Not-EcoRI A Fwd	TATGCGGCCGCATGACCAAGAGAGTCCG
0277(SEQ ID NO.23)	Not-EcoRI A Rev	TGCGAATTCAACGTTGTCCATGGTACAGAC

PCR 1是使用引物0274(SEQ ID NO:20)和0275(SEQ ID NO:21)在ColoAd1基因组模板DNA上进行的。根据下表19，将50μl反应体积用于PCR 1反应，并且PCR 1产物的示意图示于图24A中(SEQ ID NO:24)。

表19

PCR 2是使用引物0276(SEQ ID NO:22)和0277(SEQ ID NO.23)在ColoAd1基因组模板DNA上进行的。根据下表20，将50μl反应体积用于PCR 2反应，并且PCR 2产物的示意图示于图24B中(SEQ ID NO:25)。

表20

所述PCR反应都是根据表21中详述的程序进行的：

根据制造商的方案通过离心柱方法纯化整个体积的PCR产物并洗脱到40μl洗脱缓冲液中。

然后用BamHI和NotI消化PCR 1产物(表22)并且此外在37℃下使用BglII和NotI(参见表23)消化克隆载体1小时。

表22PCR产物：

表23载体：

将消化载体和PCR 1产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离并且将适当尺寸的片段进行凝胶纯化并在40μl不含核酸酶的水中洗脱。

在室温下使用3:1连接比率的插入物与载体在10μl:1μl的体积下利用1×连接酶缓冲液和1μl T4DNA连接酶在20μl反应物中将所述PCR 1产物连接至载体中持续1小时。

根据制造商的方案通过在42℃下热休克将6μl的连接混合物转化至XL-1Blue细胞中。在转化后，从LB卡那霉素板挑取5个菌落并在250rpm、37℃下在含有卡那霉素的3ml LB肉汤中培养过夜。根据制造商的方案对于每个培养物进行Minipreps并且在40μl缓冲液中洗脱纯化DNA。

为了证实载体含有PCR 1产物，对于5个样品中的每一个进行限制性酶分析。如表24中所详述在37℃下设置利用SpeI和AscI的限制性消化持续1小时：

所有5种消化物都产生适当尺寸的片段：1.5kb和4kb的谱带。

如表25中所详述，在37℃下利用NotI和EcoRI将PCR 2产物和含有PCR 1产物的新近产生的载体消化1小时：

将含有PCR 1片段的消化载体和PCR 2产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离并且将适当尺寸的片段进行凝胶纯化并在40μl不含核酸酶的水中洗脱。

在室温下使用3:1连接比率的插入物与载体在10μl:1μl的体积下利用1×连接酶缓冲液和1μl T4DNA连接酶在20μl反应物中将所述PCR 2产物连接至载体中持续1小时。

为了证实载体含有由PCR1和PCR2产物组成的DNA片段，对于5个样品中的每一个进行限制性酶分析。如表26中所详述在37℃下设置利用PspOMI和AclI的限制性消化持续1小时：

所有5种消化物都产生适当尺寸的片段：2.3kb和3.15kb的谱带。为了证实载体中PspOMI与AclI位点之间的DNA片段的序列是正确的，对样品#5进行测序(SEQ ID NO.18)。

然后从实施例1中构建的ColoAd1穿梭载体产生ColoAd2.1穿梭载体。用于将通过2个PCR反应产生的DNA片段连接至ColoAd1穿梭载体中的方法与实施例2中连接合成DNA片段以产生ColoAd2.4穿梭载体的方法相同。

通过如表27中的混合物所详述在37℃下利用酶NotI和AscI进行限制性消化1小时来证实ColoAd2.1穿梭载体的构建：

将2μl的每种消化物在1％琼脂糖凝胶上分离，所有构建体都显示对应于ColoAd2.1穿梭载体的适当谱带模式(图25)。选择ColoAd2.1穿梭载体样品#4并测序，证实ColoAd2.1穿梭载体(SEQ ID NO.17)的成功构建。

实施例5通过同源重组构建ColoAd2.4、ColoAd2.0或ColoAd2.1质粒

通过同源重组从ColoAd2.0、ColoAd2.4和ColoAd2.1穿梭载体产生ColoAd2.0(SEQID NO.30)、ColoAd2.4(SEQ ID NO.28)和ColoAd2.1(SEQ ID NO.31)质粒。所述方法的示意图概述提供于图5中。

ColoAd2.0、ColoAd2.4和ColoAd2.1穿梭载体中的PspOMI位点允许所述穿梭载体被线性化以与电感受态大肠杆菌中的ColoAd1基因组进行同源重组。

使用以下反应物在37℃下利用PspOMI将ColoAd2.4穿梭载体(SEQ ID NO.26)(68.6ng/μl)消化1小时：

在37℃下用1μl CIP(小牛碱性磷酸酶)处理50μl消化物1小时。

将消化物汇集并在用40μl NFW洗脱的Sigma Genelute Miniprep柱上纯化。

利用3.5μl(23.4ng/μl)ColoAd2.4穿梭载体和1.5μl(36ng/μl)ColoAd1在40μl的电感受态BJ5183细胞(Agi lent)中进行重组。此外利用3.5μl的线性化载体(ColoAd2.4载体)在40μl BJ5183细胞中进行阴性对照。根据制造商的方案(#200154Agilent)通过电穿孔进行重组。

将5μl培养物稀释并铺在LB琼脂+卡那霉素上并在37℃下温育过夜。

所述阴性对照显示在LB+Kan板上存在很少正常尺寸的菌落，而重组板显示许多微小菌落和一些大型或中等菌落(图27A)。从实验板挑取48个菌落并在37℃、250rpm下接种到3ml LB肉汤+Kan中过夜。

根据制造商的方案通过miniprep从细菌纯化DNA并在40μl不含核酸酶的水中洗脱。

为了确定DNA样品中的重组体的存在，使用以下反应物利用EcoRV和SbfI消化候选物。表29：

将消化物在0.8％琼脂糖凝胶上在150V下操作1小时(图27B)。

重组体#3、#8和#10显示在EcoRV/SbfI消化后的适当谱带并且根据制造商的方案将2μl的各物质转化到50μl XL-1Blue细胞中。将50μl细胞铺在LB和卡那霉素板上并在37℃下温育过夜。

从#8板挑取7个菌落并在37℃、220rpm下在具有卡那霉素的3ml LB肉汤中生长过夜。根据制造商的方案在重组体克隆上进行Minipreps并且在40μl NFW中洗脱DNA。使用以下消化反应在37℃下设置诊断性限制性酶消化1小时。表30：

表31

将消化物在0.8％琼脂糖凝胶上操作(图28)。

在所消化的构建体中，重组体ColoAd2.4#4质粒具有适当的限制性模式。这种质粒因此从甘油储备液扩增并且通过maxiprep纯化DNA并测序(SEQ ID NO.28)。这证实了ColoAd2.4质粒的成功产生(图26)。

图2中所示的ColoAd2.0(SEQ ID NO.30)、ColoAd2.4(SEQ ID NO.28)和ColoAd2.1(SEQ ID NO.31)质粒都是使用上述方法成功构建的。

对所有质粒进行测序以确定在ColoAd1基因组序列中没有出现不希望的变化。

实施例6穿梭载体的失败的两步骤连接

如下表32中所详述，在37℃下通过PspOMI消化在实施例1中描述的20μl的ColoAd15'臂和3'臂PCR产物持续2小时：

将消化物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，凝胶纯化并在30μl洗脱缓冲液中洗脱。将整个体积的洗脱产物用于连接反应。

在室温下使用10μl(低)或25μl(高)的体积在1:1比率下连接5'臂和3'臂(约4.6kb和约4.5kb)片段持续2.5小时。表33：

将连接反应在70℃下热灭活5分钟并且在使用引物0199(SEQ ID NO.6)或引物0198(SEQ ID NO.5)的每组连接上进行两个PCR以扩增约9.1kb片段。

将1μl的每种PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上操作(图29A)。

将低体积连接后的PCR产物的总体积在0.8％琼脂糖凝胶上分离，凝胶纯化并洗脱到40μl洗脱缓冲液中。

使用以下混合物，将连接的PCR 9kb产物和先前PCR扩增的约3kb p15A-Kan载体利用酶AscI在37℃下限制性消化2小时：

表34

将AscI消化的约9kb片段在65℃下热灭活20分钟并且在37℃下用1μl CIP处理AscI消化的p15a KAN载体1小时。

将1μl消化产物在1％琼脂糖凝胶上操作以评估相对DNA浓度(图29B)。

然后通过离心柱方法纯化整个体积的每种产物并在40μl洗脱缓冲液中洗脱。

在室温下使用2μl的T4DNA连接酶和4μl连接酶缓冲液在以下比率下进行约9kb片段(5'臂-3'臂)与p15A-Kan载体之间的连接持续1.5小时：

1:1(5μl)；1:2(2μl:4μl)；1:3(2μl:6μl)；1:3(4μl:12μl)；和1:3(3μl:9μl)

根据制造商的方案(Stratagene#200314)通过热休克将整个体积的每种连接混合物转化到50μl的XL-10Gold超级感受态细胞中。

将500μl的每种培养物铺在LB+卡那霉素板上并在37℃下温育过夜。菌落存在于板上并且在37℃、250rpm下在LB肉汤中扩增。根据制造商的方案，通过miniprep从细菌纯化DNA。

通过与实施例1中所详述那些相同的诊断PCR和限制性消化方法对纯化DNA分析ColoAd1穿梭载体的存在。

对于适当尺寸和定向的构建体，诊断PCR预期产生1.3kb、1.4kb和1.1kb谱带并且限制性消化预期产生单个约12kb谱带(对于PspOMI)和约3kb谱带和约4.7kb谱带(对于PspOMI/AscI)。根据任一诊断方法，所有样品都不显示适当的谱带(图16)。

实施例7含有报道转基因盒(pNG-62)的ColoAd2.4质粒的构建

使用实施例5中产生的ColoAd2.4质粒来构建称为pNG-62的质粒(SEQ ID NO.35，图30)，其在ColoAd2.4质粒独特限制性位点SgfI与SbfI之间含有报道基因转基因盒。所述转基因盒由分支剪接受体序列(bSA)、荧光报道基因、绿色荧光蛋白(GFP)和SV40晚期polyA序列(PA)组成。

1)转基因盒的构建

将含有具有3'SV40晚期polyA序列(mpSF-CMV-GFP-PA)的GFP序列的克隆载体用作用于构建转基因盒的PCR模板。

通过PCR将分支剪接受体(bSA)和KOZAK序列5'-TGCTAATCTTCCTTTCTCTCTTCAGGCCGCC-3'(SEQ ID NO.36)添加至GFP基因的5'端。PCR引物也在bSA序列起始之前引入5'SgfI位点和在SV40polyA序列之后引入3'SbfI位点以得到转基因盒PCR产物(图31，SEQ ID NO.37)。用于扩增PCR产物的PCR引物详述于表35中：

将50μl反应体积用于表36中详述的PCR反应：

根据表37中的程序进行PCR扩增：

通过在40μl NFW中洗脱的离心柱来纯化PCR产物。在37℃下利用酶SgfI和SbfI(表38)消化所述PCR产物和含有SgfI和SbfI限制性位点的亚克隆载体持续1小时。

表38

将消化产物在1％琼脂糖凝胶上分离并且将适当尺寸的片段进行凝胶纯化并在40μl不含核酸酶的水中洗脱。

在室温下使用3:1连接比率的插入物与载体在3μl:1μl的体积下利用1×连接酶缓冲液和1μl T4DNA连接酶在10μl反应物中将消化的纯化PCR产物连接至线性化载体中持续1小时。

将1μl的连接反应物转化到50μl XL Gold细胞中并且将100μl铺在LB+氨苄青霉素(100μg/ml)板上。在生长过夜后，在培养板上存在>50个菌落。挑取5个菌落并在含有氨苄青霉素的3ml LB肉汤中培养过夜。通过miniprep纯化DNA并在40μl缓冲液中洗脱。

为了确定转基因盒在载体中的存在，利用SgfI和SbfI限制性酶诊断性消化构建体。表39：

所有5种构建体都从消化产生适当尺寸的片段：1.1kb和4.7kb的谱带(图32)。因此对构建体#1测序并证实GFP转基因盒的成功构建(图31，SEQ ID NO.37)。

2)质粒NG-62的构建

使用表40中所示的反应物在37℃下利用SgfI和SbfI消化含有GFP转基因盒(576ng/μl)和ColoAd2.4质粒(583ng/μl)的构建体#1持续2小时：

将消化物在0.8％琼脂糖凝胶上分离并且从所述凝胶切除适当尺寸的片段。然后使用QIAEX II试剂盒(QIAGEN)纯化ColoAd2.4质粒并且使用快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化GFP转基因盒。

使用1.5:1连接比率的插入物与载体(2.25μl:3.7μl)或2:1连接比率(3μl:4μl)将转基因盒(40ng/μl)连接至ColoAd2.4质粒(18ng/μl)中。在10μl反应体积中利用1×连接酶缓冲液和1μl T4DNA连接酶进行反应。在16℃下进行连接16小时。

根据制造商的方案(Agilent)将4μl连接混合物转化至50μl XL-Blue细胞中并且将整个转化体积铺在含有卡那霉素的LB琼脂板上。在生长过夜后，从板挑取所有菌落并且在250rpm、37℃下在含有卡那霉素的3ml LB肉汤中培养过夜。

通过miniprep纯化DNA并在40μl缓冲液中洗脱。

为了确定是否已经产生pNG-62质粒，使用如表41中所详述的酶NheI和EcoRV通过限制性消化筛选构建体：

试剂	体积(μl)	供应商
			DNA	2
NheI	0.6	NEB R0131S
			EcoRV-HF	0.4	NEB R3159S
缓冲液4	2	NEB R0558S
			BSA	2	NEB B9001S
不含核酸酶的水	13	Fisher Scientific(BPE 2484-100)

将消化产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离。在所筛选的构建体中，来自1.5:1比率连接的编号1、2和3以及来自2:1比率连接的编号1、2和4显示对应于12.3kb、9.7kb、5.5kb和3.1kb的质粒pNG-62的预期模式的谱带尺寸(图33A)。

利用酶BglII或酶NheI和EcoRV对假定pNG-62构建体#2(1.5:1)和#1(2:1)进行进一步诊断性限制性消化(图33B)并且然后测序。这证实质粒pNG-62(SEQ ID NO 35，图30)的成功构建。

实施例8NG-62病毒产生和转基因表达

将实施例7中产生的质粒pNG-62线性化并用于产生含有ColoAd1基因组的活ColoAd1病毒粒子，所述ColoAd1基因组具有插入所引入的SgfI与SbfI限制性位点之间的纤维(L5)基因下游的报道基因(GFP)转基因盒。

通过用酶AscI进行限制性消化，将质粒pNG-62(685ng/μl)线性化以产生NG-62病毒基因组(SEQ ID NO.38)。根据表42设置限制性消化反应并在37℃下进行2小时。

表42

将消化的pNG-62DNA用50μl不含核酸酶的水稀释并且然后通过苯酚/氯仿提取来纯化。然后将所提取的NG-62DNA在-20℃下在300μl>95％分子生物级乙醇和10μl 3M乙酸钠中沉淀16小时。

通过在14000rpm下离心5分钟使沉淀的DNA形成团块并且在500μl70％乙醇中洗涤，然后再次在14000rpm下离心5分钟。将清洁的DNA团块风干，再次悬浮在含有15μl脂转染胺转染试剂的500μl OptiMEM中并在室温下温育30分钟。然后将转染混合物逐滴添加至含有Hek293细胞的T-25烧瓶中，生长至70％汇合。在37℃、5％CO₂下用转染混合物温育细胞2小时后，将4ml细胞培养基(补充有2％FBS的具有谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM)添加至细胞并且将烧瓶在37℃、5％CO₂下温育。

每24小时监测转染的Hek293细胞并且每48-72小时补充额外的培养基。通过在细胞单层中观测显著细胞病变效应(CPE)来监测病毒的产生。一旦观测到CPE，就通过三次冷冻-解冻循环从Hek293细胞收集病毒。将收集的NG-62病毒用于感染AD293细胞并通过在感染后24小时和48小时观测细胞单层中的显著CPE来证实活病毒产生(图34A)。此外通过免疫荧光成像在感染的AD293细胞中确定来自病毒的GFP转基因的高效表达(图34B)。

参考文献

Shenk,(2001)"Adenoviridae:The Viruses and Their Replication,"inFields Virology,Vol.2,Fourth Edition,Knipe,ea.,Lippincott,Williams&Wi lkins,pp.2265-2267

Jin et al(2004)“Identification of novel insertion sites in theAd5genome that utilize the Ad splicing machinery for therapeutic geneexpression”Molecular Therapy Vol.12(6)pp1052-63.

Cheever M.J.et al,The prioritization of cancer antigens:a NationalCancer Institute pilot project for the acceleration of translationalresearch.Clin Cancer Res 2009；15:5323-5337

Claims

1.一种制备包含选择标记基因、低拷贝细菌复制起点和腺病毒基因组的穿梭载体的方法，所述腺病毒基因组包含5'ITR、3'ITR和L5基因，所述方法包括如下步骤：

a)制备包含相等比例的以下三个片段的腺病毒穿梭载体：

ii)包含所述腺病毒基因组的5'端的5'臂，所述腺病毒基因组包括所述5'ITR，其中所述5'臂的所述5'端起始于第二限制性酶位点并且在所述5'臂的所述3'端终止于第三限制性酶位点，

iii)包含所述腺病毒基因组的3'端的3'臂，所述腺病毒基因组包括所述3'ITR和所述L5基因，其中所述3'臂的所述5'端起始于第三限制性酶位点并且在所述3'臂的所述3'端终止于第一限制性酶位点，

和进行一步三元连接以：

在所述第一限制性酶位点将所述3'臂的所述3'端接合至所述载体片段的所述5'端，

在所述第二限制性酶位点将所述载体片段的所述3'端接合至所述5'臂的所述5'端，和

在所述第三限制性酶位点——至少所述L5基因，将所述5'臂的所述3'端接合至所述3'臂的所述5'端，

b)将至少一个原始限制性位点和/或转基因引入所述穿梭载体中介于所述L5基因与选自包含E3位点、E4位点或所述位点两者的群组的位点之间的位置中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述5'臂包含约2.4至4.7kb的腺病毒基因组的5'端。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述3'臂包含约3.3至4.8kb的腺病毒基因组的3'端。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述3元连接是对于片段i)、ii)和iii)以1:1:1的比率进行的。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一步三元连接进行至少50分钟。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一步三元连接是在大约室温，例如20至25℃下进行的。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述原始限制性位点独立地选自FseI、NotI、SbfI和SgfI，例如NotI或SbfI和SgfI或FseI和NotI和SbfI和SgfI。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一限制性酶位点和第二限制性酶位点是相同的。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述载体片段是脱磷酸化的。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述复制起点是p15A。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述选择标记基因是KanR。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述腺病毒基因组是来自能够复制的腺病毒。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括步骤c)：在步骤a)或步骤b)的穿梭载体与腺病毒基因组之间进行同源重组以形成质粒。

14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤c)是在3.5:1.5的比率下进行的。

15.根据权利要求13所述的方法，其中步骤c)是在电感受态BJ5183细胞中进行的。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述腺病毒基因组选自EnAd1、OvAd1、OvAd2、Ad3、Ad5和Ad11。

17.根据权利要求13所述的方法，其包括产生腺病毒，例如能够复制的腺病毒或复制缺陷型腺病毒载体的另一个步骤。

18.根据权利要求17所述的方法，其包括将腺病毒配制成药物组合物的另一个步骤。

19.一种穿梭载体、质粒、腺病毒或药物组合物，其可从根据权利要求1至18中的任一项所述的方法获得。

20.一种腺病毒质粒，其包含：

a)包含L5基因、E3位点和/或E4位点的腺病毒基因组，

b)在介于所述L5基因与选自包含所述E3位点、所述E4位点以及所述E3位点和所述E4位点中的每个的群组的位点之间的位置中的至少一个原始限制性位点，

c)低拷贝细菌复制起点，

d)选择标记基因；和

e)在介于E3位点与L5基因之间和/或L5基因与E4位点之间的位置中的一个或多个转基因和/或转基因盒。

21.根据权利要求20所述的腺病毒质粒，其中所述腺病毒基因组是B亚群腺病毒基因组，例如EnAd、OvAd1、OvAd2、Ad3、Ad11和Ad5，例如EnAd。

22.根据权利要求20或21所述的腺病毒质粒，其中所述原始限制性位点独立地选自FseI、NotI、SbfI和SgfI。

23.根据权利要求20或21所述的腺病毒质粒，其中所述原始限制性位点在所述L5基因与所述E3位点之间的位置中，例如其中所述原始限制性位点是NotI。

24.根据权利要求20或21所述的腺病毒质粒，其中在所述L5基因与所述E4位点之间的位置中存在至少两个原始限制性位点，例如其中所述两个原始限制性位点是SbfI和SgfI。

25.根据权利要求24所述的腺病毒质粒，其中在所述L5基因与所述E4位点之间的位置中存在三个原始限制性位点。

26.根据权利要求25所述的腺病毒质粒，其中所述三个原始限制性位点是SbfI、SgfI和FseI中的每一个。

27.根据权利要求20或21所述的腺病毒质粒，其还包含至少一个原始E1限制性位点。

28.根据权利要求20或21所述的腺病毒质粒，其中所述一个或多个转基因独立地选自：编码治疗蛋白的相关治疗基因、肽或RNA如抗体或抗体结构域、前药转化酶、免疫调节剂、酶、siRNA、转录因子、细胞内信号传导或表面膜蛋白、或抗原；和报道基因或成像剂，例如荧光素酶或eGFP。

29.腺病毒或包含根据权利要求20或21所述的腺病毒的药物组合物在制造用于治疗的药物中的用途。