KR20160102024A - 아데노바이러스 및 상응하는 플라스미드의 제조 방법 - Google Patents

아데노바이러스 및 상응하는 플라스미드의 제조 방법 Download PDF

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알리스 클레어 노엘 브라운
타마라 니콜슨
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싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디.
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Abstract

본 발명의 개시내용은 모든 또는 일부 아데노바이러스 게놈 및 상기 아데노바이러스 게놈의 신속하고 유동성 있는 조작을 가능하게 하는 하나 이상의 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스 플라스미드를 제조하는 방법, 및 예를 들어, 전이유전자를 포함하는 아데노바이러스 작제물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개시내용은 또한 상기 방법에 사용되고 생성되는 신규 중간체, 상기 방법의 플라스미드 및 셔틀 벡터, 및 상기 플라스미드 및/또는 방법으로부터 수득가능한 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터까지 확대된다. 본 발명의 개시내용은 추가로 예를 들어, 암의 치료에서의 용도와 같은 치료요법에서 본원에 개시된 방법으로부터 수득된 바이러스 또는 벡터의 용도에 관한 것이다.

Description

아데노바이러스 및 상응하는 플라스미드의 제조 방법{A METHOD OF MAKING ADENOVIRUS AND CORRESPONDING PLASMIDS}
본 발명의 개시내용은 일부 또는 모든 아데노바이러스 게놈 및 상기 아데노바이러스 게놈의 신속하고 유연한 조작을 가능하게 하는 하나 이상의 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스 플라스미드를 제조하는 방법, 및 예를 들어, 전이유전자를 포함하는 아데노바이러스 작제물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개시내용은 또한 상기 방법에 사용되고 생성되는 신규 중간체, 상기 방법의 플라스미드 및 셔틀 벡터 및 상기 플라스미드 및/또는 방법으로부터 수득가능한 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터까지 확대된다. 본 발명의 개시내용은 추가로 예를 들어, 암의 치료에서의 용도와 같은 치료요법에서 본원에 개시된 방법으로부터 수득된 바이러스 또는 벡터의 용도에 관한 것이다.
많은 이유 때문에 전이유전자를 아데노바이러스로 삽입하는 것이 요구될 수 있고, 예를 들어, 치료학적 영향을 증가시키거나 복제 적격(competent) 바이러스 또는 복제 결핍 바이러스 벡터를 사용하여 유전자들을 표적 세포로 전달하기 위해 아암 치료학적 바이러스로 삽입하는 것이 요구될 수 있다.
전형적으로, 전이유전자를 바이러스 게놈으로 삽입하기 위해, 상기 아데노바이러스 게놈을 포함하는 플라스미드를 제조하고, 이어서 상기 전이유전자를 예를 들어, 상동성 재조합을 사용하여 상기 플라스미드에 삽입하고, 이어서 상기 바이러스 게놈을 상기 플라스미드로부터 절단해 낸다. 그러나, 본원에 기재된 이유 때문에, 복제 적격 바이러스 및 복제 결핍 바이러스 벡터 둘 다를 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, 공지되고 예측가능한 위치에 대형 전이유전자를 수용할 수 있는 유동성 플라스미드는, 전이유전자가 특히 E1 또는 E3 영역 외부와 같은 비통상적 위치에 삽입되어야만 하는 경우 항상 용이하게 이용할 수 있는 것은 아니다.
전이유전자를 치료학적 및 진단학적 목적을 위해 아데노바이러스로 삽입하는 것과 관련된 문제점은 3가지 주요 카테고리에 속한다. 첫째로, 모든 아데노바이러스가 치료학적 및 진단학적 적용을 위해 이상적인 후보물은 아니고 예를 들어, Ad5 (서브그룹 C 아데노바이러스) 면역력은 인간 집단에 만연되어 있고 결과적으로 상기 바이러스는 이것이 투여된 후 면역계에 의해 신속하게 제거된다. 상기 문제점을 극복하기 위해, 덜 만연된 면역력이 있는 아데노바이러스를 활용하였다. 그러나, 지금까지의 많은 게놈 연구는 Ad5에 대해 수행되었다. 따라서, 대안적 아데노바이러스에 대한 재료 및 공급원은 흔히 이용할 수 있는 것은 아니다.
둘째로, 모든 아데노바이러스가 대형 전이유전자를 수용하면서 생존 바이러스로서의 이들의 안정성을 유지할 수 있는 것은 아니다. 추가로, 상기 아데노바이러스 게놈은 대형이고 바이러스의 기능에 영향을 주는 것 없이 추가의 유전학적 물질을 삽입할 공간이 거의 없고 예를 들어, 바이러스를 바이러스 캡시드로 팩키징하는 기능은 안좋은 영향을 받을 수 있고, 이는 이어서 바이러스의 감염성에 영향을 미칠 가능성이 있다.
상기 문제점을 극복하기 위해, 상기 게놈을 결실시켰다. 상기 전략은 복제에 필수적인 하나 이상의 유전자들이 제거되기 때문에 복제 결여 바이러스 벡터에 특히 적합하다. 이 둘 다는 생체내 복제하는 벡터의 능력을 제한하고 게놈 내에 공간을 형성시켜 대형 전이유전자의 삽입을 가능하게 한다. 이들 전이유전자는 바이러스 벡터가 복제할 능력과는 상관 없이 생체내 발현될 수 있다. 대부분 흔하게, E1 유전자가 결실되었다. ADEASY 시스템 (Agilent Technologies)과 같은 선행 기술 시스템이 전이유전자의 E1 영역으로의 삽입을 가능하게 한다. 일부 경우에서, E3 영역의 일부 또는 전부가 결실되고(예를 들어, WO2011/0123564 참조한다) 상기 유전자는 결실된 영역에 삽입될 수 있다.
따라서, 전형적으로 전이유전자는 결실이 일어난 동일한 위치에 삽입된다. 따라서, 전이유전자 삽입 부위는 대부분 바이러스 유전자 발현, 바이러스 생활 주기 및/또는 복제 속도에 영향을 미칠 가능성이 더 크기 때문에 문제가 될 수 있는 어얼리 유전자의 위치로 제한되었다. 특히, E1 영역의 결실은 복제 적격 아데노바이러스에 적당하지 않고 논의된 바와 같이 이것이 바이러스 생활 주기에 대한 영향이 최소화되도록 보장하기 위해 어얼리 유전자의 위치에 있지 않도록 전이유전자를 삽입하기 위해 유용할 수 있다.
셋째로, 아데노바이러스 게놈은, 게놈이 조밀하게 팩킹되어 있고 전이유전자가 바이러스 생활 주기 및/또는 기능, 예를 들어, 전사에 영향을 주는 것 없이 안전하게 삽입될 수 있는 유전자간 물질이 매우 적기 때문에, 조작하기가 용이하지 않다. 추가로, 있다 하더라도, 유전자간 영역 내에 제한 부위가 적고 심지어 게놈에서 단지 1회 존재할 정도로 극히 적다. 후자는 제한 부위가 바이러스 게놈 내에 1회 이상 존재하는 경우 제한 부위를 사용하여 전이유전자를 하나의 위치에 선택적으로 삽입하는 능력은 심하게 방해받기 때문에 적절하다.
따라서, 복제 적격 바이러스를 조작하기 위해 사용될 수 있고 전이유전자가 어얼리 유전자로부터 제거된 위치에 삽입될 수 있는 플라스미드를 제공하는 것이 요구될 수 있다.
복제 적격 바이러스와 함께 활용될 수 있는 하나의 전략은 전이유전자를 게놈으로 삽입하기 위해 비-편중 삽입 트랜스포존을 사용하는 것이다(문헌(Jin et al 2004)에 기재된 바와 같음). 트랜스포존은 레이트 유전자에 삽입될 수 있고 따라서 상기 기술은 상기된 시스템의 단점이 없다. 문헌(Jin et al)은 유전자의 삽입 위치의 부위가, 삽입되는 유전자의 유형에 의해 영향을 받고 삽입 후 일부 유전자를 대체하는 것이 가능했지만, 일부 경우에는 삽입된 일부 유전자를 대체하는 것이 어렵거나 대체 유전자가 상이한 배향으로 삽입되는 것으로 추정하였다. 트랜스포존 삽입의 무작위 특성은 많은 가능한 삽입 부위를 제공한다. 따라서, 결과로서 삽입의 예측성 및 재현능이 손상될 수 있다. 추가로, 트랜스포존은 그 자체를 전이유전자와 함께 게놈으로 삽입하고 이론적으로 훗날에 유전자의 위치를 바이러스 게놈 내에서 이동시킬 수 있다. 그러나, 무작위로 삽입한 트랜스포존은 바이러스 게놈을 연구하기 위해 훌륭한 도구이지만 상기 방법의 가장 큰 단점은 바이러스 작제물의 이상적인 디자인을 허용하지 않는다는 것이다.
따라서, 복제 적격 바이러스를 조작하기 위해 사용될 수 있고 전이유전자가 재현적으로 어얼리 유전자로부터 제거된 위치에 삽입될 수 있는 플라스미드를 제공하는 것이 요구될 수 있다. 본 발명자는 전이유전자를 특이적으로 어얼리 유전자 부위가 아닌 위치로 선택적으로 삽입하기 위해 사용될 수 있는 제한 부위의 조합으로 플라스미드를 제조함에 의해 상기된 하나 이상의 문제점을 극복하였다.
본 발명자는 L5 유전자에 인접하게 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스 플라스미드를 개발하였다. 본 발명의 개시내용의 플라스미드는 예를 들어, 온전한 E1 영역을 갖는 복제 적격 아데노바이러스 또는 E1 및/또는 E3이 결실되거나 차단된 복제 결핍 아데노바이러스에 대해 어얼리(early) 유전자 부위가 아닌 다른 위치에서 제한 부위/전이유전자와 함께 바이러스의 생성을 가능하게 한다.
하나의 측면에서, 선택 마커 유전자 및 낮은 카피의 세균 복제 오리진을 포함하는 셔틀 벡터를 제조하는 방법이 제공되고, 아데노바이러스 게놈은 5' ITR, 3' ITR, L5 유전자를 포함하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 하기의 3개의 단편들:
i) 벡터 단편의 5' 말단이 제1 제한 효소 부위로 개시하고 상기 벡터 단편의 3' 말단에서 제2 제한 효소 부위로 종결되는, 선택 마커 유전자 및 낮은 카피의 세균 복제 오리진을 포함하는 벡터 단편,
ii) 5' 아암의 5' 말단이 제2 제한 효소 부위로 개시하고 상기 5' 아암의 3' 말단에서 제3 제한 효소 부위로 종결되는, 5' ITR을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 5' 말단을 포함하는 5'-아암,
iii) 3' 아암의 5' 말단이 제3 제한 효소 부위로 개시하고 3' 아암의 3' 말단에서 제1 제한 효소 부위로 종결되는, 3' ITR 및 L5 유전자를 포함하는 아데노바이러스 게놈의 3' 말단을 포함하는 3'-아암
을 동등한 비율로 연결시키고,
1-단계 3-방식 연결을 수행하여:
3' 아암(단편 iii)의 3' 말단을 제1 제한 효소 부위에서 벡터 단편(단편 i)의 5' 말단으로 연결하고,
벡터 단편(단편 i)의 3' 말단을 제2 제한 효소 부위에서 5' 아암(단편 ii)의 5' 말단으로 연결하고,
5' 아암(단편 ii)의 3' 말단을 적어도 L5 유전자의 제3 제한 효소 부위에서 3' 아암(단편 iii)의 5' 말단으로 연결하여, 제1 제한 효소 부위, 이어서 벡터 단편, 이어서 제2 제한 효소 부위, 이어서 5' 아암, 이어서 제3 제한 효소 부위, 이어서 3' 아암으로 배열된 환형화된 셔틀 벡터를 형성함을 포함하는, 아데노바이러스 셔틀 벡터를 제조하는 단계,
b) 적어도 하나의 본래의 제한 부위 및/또는 전이유전자를 L5 유전자와 E3 부위, E4 부위 또는 상기 2개의 부위를 포함하는 (또는 이로 이루어진) 그룹으로부터 선택된 부위 사이의 위치에서 상기 셔틀 벡터로 도입하는 단계.
하나의 양태에서, 상기 방법은 단계 c)를 추가로 포함한다:
c) 단계 a) 또는 단계 b)의 셔틀 벡터와 아데노바이러스 게놈 간의 상동성 재조합을 수행하여 플라스미드를 형성하는 단계.
하나의 측면에서, 아데노바이러스 게놈, 선택 마커 유전자 및 낮은 카피의 세균 복제 오리진을 포함하는 아데노바이러스 플라스미드를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 아데노바이러스 게놈은 5' ITR, 3' ITR, L5 유전자, E3 부위 및 E4 부위를 포함하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 하기의 3개의 단편들:
i) 벡터 단편의 5' 말단이 제1 제한 효소 부위로 개시하고 상기 벡터 단편의 3' 말단에서 제2 제한 효소 부위로 종결되는, 선택 마커 유전자 및 낮은 카피의 세균 복제 오리진을 포함하는 벡터 단편,
ii) 5' 아암의 5' 말단이 제2 제한 효소 부위로 개시하고 상기 5' 아암의 3' 말단에서 제3 제한 효소 부위로 종결되는, 5' ITR을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 5' 말단을 포함하는 5'-아암,
iii) 3' 아암의 5' 말단이 제3 제한 효소 부위로 개시하고 3' 아암의 3' 말단에서 제1 제한 효소 부위로 종결되는, 3' ITR 및 L5 유전자를 포함하는 아데노바이러스 게놈의 3' 말단을 포함하는 3'-아암
을 동등한 비율로 연결시키고,
1-단계 3-방식 연결을 수행하여:
3' 아암(단편 iii)의 3' 말단을 제1 제한 효소 부위에서 벡터 단편(단편 i)의 5' 말단으로 연결하고,
벡터 단편(단편 i)의 3' 말단을 제2 제한 효소 부위에서 5' 아암(단편 ii)의 5' 말단으로 연결하고,
5' 아암(단편 ii)의 3' 말단을 제3 제한 효소 부위에서 3' 아암(단편 iii)의 5' 말단으로 연결하여, 제1 제한 효소 부위, 이어서 벡터 단편, 이어서 제2 제한 효소 부위, 이어서 5' 아암, 이어서 제3 제한 효소 부위, 이어서 3' 아암으로 배열된 환형화된 셔틀 벡터를 형성함을 포함하는, 아데노바이러스 셔틀 벡터를 제조하는 단계,
b) 적어도 하나의 본래의 제한 부위를 L5 유전자와 E3 부위, E4 부위 또는 상기 2개의 부위를 포함하는 (또는 이로 이루어진) 그룹으로부터 선택된 부위 사이의 위치에서 상기 셔틀 벡터로 도입하는 단계, 및
c) 단계 a) 또는 단계 b)의 셔틀 벡터와 아데노바이러스 게놈 간의 상동성 재조합을 수행하여 플라스미드를 형성하는 단계.
하나의 양태에서, 단계 b)는 단계 a) 전에 수행된다.
하나의 양태에서, 단계 b)는 단계 a) 후에 수행된다.
하나의 양태에서, 5' 아암은 아데노바이러스 게놈의 5' 말단의 약 2.4 내지 4.7 kb를 포함한다. 하나의 양태에서, 3' 아암은 아데노바이러스 게놈의 3' 말단의 약 3.3 내지 4.8 kb를 포함한다. 하나의 양태에서, 1-단계 3-방식 연결이 수행되는 기간은 적어도 50분, 예를 들어, 1시간 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간이다.
하나의 양태에서, 1-단계 3-방식 연결은 약 10 내지 40 ℃, 예를 들어, 20 내지 25 ℃, 예를 들어, 대략 실온/주위 온도의 온도 범위에서 수행된다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스, 예를 들어, B형 서브그룹, 예를 들어, EnAd, OvAd1, OvAd2, Ad3, Ad5 (C 그룹 바이러스인) 및 Ad11로부터 선택되는 바이러스이다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스는 Ad5가 아니다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스는 A 그룹 바이러스가 아니다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스는 C 그룹 바이러스가 아니다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스는 복제할 수 있거나 적격이고, 예를 들어, 복제 적격이다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스는 조건적으로 복제하는 바이러스가 아니다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스는 복제 결핍이다.
하나의 양태에서, 본래의 제한 부위는 독립적으로 Fsel, Notl, Sbfl 및 Sgfl로부터 선택되고, 예를 들어, Notl 또는 Sbfl 및 Sgfl 또는 Fsel 및 Notl 및 Sbfl 및 Sgfl이다.
하나의 양태에서, 벡터 단편에서 제1 제한 부위 및 3'-아암에서 제1 제한 부위는 동일하다. 하나의 양태에서, 벡터 단편에서 제2 제한 부위 및 5'-아암에서 제2 제한 부위는 동일하다. 하나의 양태에서, 5'-아암에서 제3 제한 부위 및 3'-아암에서 제3 제한 부위는 동일하다.
하나의 양태에서, 제1 및 제2 제한 부위는 동일하다.
하나의 양태에서, 벡터 단편은 연결 전에 탈인산화된다.
하나의 양태에서, 복제 오리진은 p15A이다.
하나의 양태에서, 선택 마커 유전자는 KanR 또는 AmpR이고, 예를 들어, KanR이다.
하나의 양태에서, 단계 c)는 예를 들어, 전기컴피턴트(electrocompetent) BJ5183 세포에서 각각 아데노바이러스 게놈에 대해 단계 a) 또는 b)의 셔틀 벡터 3.5부:1.5부의 비율로 수행된다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 예를 들어, 섬유 L5와 연합된 것과 같은 어얼리 유전자의 위치 이외의 다른 위치에서 적어도 하나의 전이유전자를 삽입하는 추가의 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, 전이유전자는 예를 들어, 스플라이스 수용체 서열을 포함하는 카세트 형태로 있다.
하나의 양태에서, 전이유전자는 내인성 아데노바이러스 프로모터, 예를 들어, 메이져 레이트 프로모터의 제어하에 있다. 하나의 양태에서, L5 이후에 위치한 유전자 또는 유전자들은 메이져 레이트 프로모터의 제어하에 또는 E4 프로모터 하에 있다. 하나의 양태에서, L5 앞에 위치한 유전자 또는 유전자들은 메이져 레이트 프로모터의 제어하게 또는 E3 프로모터의 제어하에 있다. L5 직전에 위치한 유전자들은 메이져 레이터 프로모터의 제어하에 있을 수 있고 일반적으로 L5의 발현을 가능하게 하는 조절 요소를 함유할 필요가 있다.
하나의 양태에서, L5 이후에 위치한 유전자 또는 유전자들은 외인성 프로모터의 제어하에 있다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 플라스미드로부터 아데노바이러스 게놈을 절단하고 바이러스 또는 바이러스 벡터를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명의 개시내용의 방법은 본 발명의 개시내용의 플라스미드 및 셔틀 벡터와 같은 중간체를 제공한다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 바이러스 또는 바이러스 벡터의 약제학적 제형을 제조하는 추가의 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 개시내용에 따른 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 추가의 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는 아데노바이러스 플라스미드가 제공된다:
a) L5 유전자, E3 부위 및 E4 부위를 포함하는 아데노바이러스 게놈,
b) L5 유전자와 E3 부위, E4 부위 및 E3 및 E4 부위 각각으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 부위 사이의 위치에서 적어도 하나의 본래의 제한 부위,
c) 낮은 카피의 세균 복제 오리진 및
d) 선택 마커 유전자.
하나의 양태에서, 플라스미드는 예를 들어, 전이유전자 카세트 형태로 전이유전자를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 전이유전자는 치료학적 단백질, 펩타이드 또는 RNA, 예를 들어, 항체 또는 항체 도메인, 프로드럭 전환 효소, 면역조절제, 효소, siRNA, 전사 인자, 세포내 시그날 전달 또는 표면 막 단백질, 항원; 및 리포터 유전자 또는 이미지화제, 예를 들어, 루시퍼라제 또는 eGFP를 암호화하는 관심 치료학적 유전자를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
유리하게, 상기 방법은 신규 아데노바이러스 플라스미드 및 중간체 셔틀 벡터를 제조하는 유동성 수단을 제공하고, 여기서, 예를 들어, 단계 b)에서 본래의 제한 부위의 도입은 어얼리 유전자 발현을 조절하는 영역의 외부에서 아데노바이러스 게놈의 조작을 가능하게 한다.
도 1은 ColoAd1 게놈의 도식을 보여준다. 어얼리 유전자들(E1, E2, E3 및 E4)은 암회색으로 나타내고 레이트 유전자들(L1, L2, L3, L4 및 L5)은 담회색으로 나타낸다.
도 2는 ColoAd 플라스미드 - ColoAd2.0, ColoAd2.1 및 ColoAd2.4의 도식을 보여준다.
도 3은 ColoAd2.0, ColoAd2.1 및 Colo2.4 플라스미드에서 ColoAd1 게놈 서열에서 특정 변형을 보여준다. 검정으로 나타낸 모든 염기쌍은 ColoAd1 게놈 서열에 추가적이다. 특정 제한 효소의 서열 및 명칭이 지적된다.
도 4는 ColoAd1 게놈에서 PspOMI 제한 부위 위치를 보여주는 도식을 나타낸다.
도 5는 ColoAd 플라스미드 작제의 개요를 보여준다.
도 6은 ColoAd1 셔틀 벡터의 제한 부위 맵을 보여준다.
도 7은 ColoAd2.4 플라스미드 또는 ColoAd2.4 셔틀 벡터로의 삽입을 위한 포괄적 전이유전자 카세트 디자인을 보여준다.
도 8은 ColoAd1의 p15A 복제 오리진, 가나마이신 내성 유전자, ITR, E1A, E1B 유전자, 부분적 E2B 유전자, 부분적 E3 유전자, 섬유 유전자 및 E4 유전자를 갖는 12 kb의 ColoAd1 셔틀 벡터를 보여준다.
도 9는 PspOMI 및 Acll 제한 부위를 구체화하는 ColoAd1의 맵을 보여준다.
도 10은 다음을 보여준다:
A - 5' 아암 PCR 증폭 생성물. 5' Asc1 및 3' PspOMI 제한 부위에 의해 플랭킹된 ColoAd1 5' ITR, E1A, E1B 및 부분적 E2B 유전자를 함유하는 ~4.6 kb 단편.
B - 3' 아암 PCR 증폭 생성물. 5' PspOMI 및 3' Ascl 제한 부위에 의해 플랭킹된 ColoAd1의 E3, 섬유, E4 및 3' ITR을 함유하는 ~4.5 kb 단편.
C - p15A-KanR 벡터 단편 PCR 생성물. 5' 및 3' Ascl 제한 부위를 함유하는 ~2.9kb 단편.
도 11은 다음을 보여준다:
A - 5' 아암, 3' 아암 및 p15A KAN 벡터 단편의 PCR 생성물. 생성물은 각각 4.6 kb, 4.5 kb 및 3 kb이다.
B - 5' 아암 및 3' 아암의 PCR 생성물이다.
도 12는 Ascl 및 Ascl/PsPOMI 분해된 p15A-Kan 벡터 단편 및 5' 및 3' 아암을 보여준다. 분해 생성물은 검정 박스로 강조한다.
도 13은 프라이머 결합 영역과 각각의 PCR 증폭을 위해 예상되는 생성물을 보여주는 도식을 보여준다.
도 14는 대표적 스크리닝된 클론으로부터의 PCR 생성물을 보여주는 겔을 보여준다. 작제물 13, 14 및 16은 올바르게 크기별 PCR 생성물을 보여주었다. 이들 작제물은 1:1:1(5' 아암: 3' 아암: p15A 벡터 단편)로 3-방식 연결 반응 후 제조되었다. 1:1:6 또는 1:1:12 연결 비율을 사용하는 작제물 중 어떠한 것도 올바르게 크기별 PCR 생성물을 보여주지 않았다.
도 15는 선택된 작제물의 PspOMI 또는 Ascl/PspOMI를 사용한 제한 분석을 보여준다. 1:1:1의 비율로 3-방식 연결 후 생성된 작제물 13 및 16은 올바르게 크기별분해 생성물을 보여주었다. 샘플 번호 16(maxi)은 작제물 16으로부터 생성되었던 분해된 maxi 제조물에 상응한다.
도 16은 ColoAd1 셔틀 벡터를 제조하기 위한 2-단계 연결 방법을 사용하여 생성된 작제물로부터의 PCR 생성물을 보여주는 겔을 보여준다. 스크리닝된 작제물의 어떠한 것도 올바른 PCR 생성물을 보여주지 않았다.
도 17은 ColoAd2.4 셔틀 벡터를 보여준다. 상기 셔틀 벡터는 섬유 유전자의 다운스트림에 Sgfl 및 Sbfl 본래의 제한 부위를 함유한다.
도 18은 플랭킹 PsPOMI 및 Acll 제한 부위를 갖는 ColoAd2.4 합성 단편의 도식을 보여준다.
도 19는 추정 ColoAd2.4 셔틀 벡터 작제물의 제한 분석을 보여준다. 모든 5개의 작제물은 ColoAd2.4 셔틀 벡터에 상응하는 올바르게 크기별 밴드; EcoRV 및 Sbfl 분해 후 3 kb 및 9 kb 밴드를 보여주었다.
도 20은 ColoAd2.0 셔틀 벡터를 보여준다. 상기 셔틀 벡터는 섬유 (L5) 유전자 및 2 폴리A 서열의 업스트림에 본래의 Fsel 부위, 및 섬유 (L5) 유전자의 다운스트림에 본래의 Sgfl, Notl, Sbfl 부위를 함유한다.
도 21은 플랭킹 PspOMI 및 Acll 제한 부위를 갖는 ColoAd2.0 합성 단편의 도식을 보여준다.
도 22는 효소 Fsel, Ascl, Sbfl 또는 PspOMI를 갖는 추정 ColoAd2.0 셔틀 벡터 작제물의 제한 분석을 보여준다. 모든 5개의 작제물은 ColoAd2.0 셔틀 벡터에 상응하는 올바르게 크기별 밴드를 보여준다.
도 23은 ColoAd2.1 셔틀 벡터를 보여준다. 상기 셔틀 벡터는 섬유 (L5) 유전자의 업스트림에 본래의 Notl 부위를 함유한다.
도 24는 ColoAd2.1 셔틀 벡터를 제조하기 위해 ColoAd1 셔틀 벡터로의 삽입을 위한 DNA 단편(C)을 작제하는데 사용되는 PCR 1(A) 및 PCR 2(B)의 도식을 보여준다.
도 25는 추정 ColoAd2.1 셔틀 벡터 작제물의 제한 분석을 보여준다. 모든 5개의 작제물은 ColoAd2.1 셔틀 벡터에 상응하는 올바르게 크기별 밴드; Ascl 및 Notl 분해 후 3 kb, 4 kb 및 5 kb 밴드를 보여주었다.
도 26은 재조합 ColoAd2.4 플라스미드를 보여준다. 재조합체는 p15A 복제 오리진, 가나마이신 내성, 및 섬유의 다운스트림에 본래의 Sgfl 및 Sbfl 제한 부위를 갖는 ColoAd1 게놈을 함유한다.
도 27은 다음을 보여준다:
A - 전기천공된 BJ5183 세포가 분배된 LB + 가나마이신 플레이트. 좌측 플레이트는 음성 대조군이고 우측 플레이트는 ColoAd1 + 선형화된 ColoAd2.4 셔틀 벡터 재조합이다.
B - 제한 분해된 ColoAd2.4 재조합체. 후보물 재조합체는 EcoRV 및 Sbfl (E+S)로 분해하였다. 재조합체 3, 8 및 10은 올바르게 형성된 재조합체를 나타내는 22 kb, 5.5 kb, 4.7 kb 및 2.8 kb의 밴드를 보여주었다. 재조합체는 또한 PspOMI(P)로 분해하였고 16 kb, 12 kb 및 7 kb의 밴드를 생성한다
도 28은 추정 ColoAd2.4 재조합체의 제한 분석을 보여준다. 재조합체 4는 PspOMI 분해(P) 상에 16 kb, 12 kb 및 7 kb의 올바른 크기의 밴드, 및 Sbfl 및 EcoRV 분해(E+S) 상에 22 kb, 4.7 kb, 5.5 kb 및 2.8 kb의 밴드를 보여주었다. 상기 분해물은 단지 #4에서 재조합체 ColoAd2.4의 존재를 확인시켰다.
도 29는 다음을 보여준다:
A - 5' 아암-3' 아암 연결 후 PCR 증폭 생성물. 낮은 용적의 연결 후 PCR은 0198(1) 또는 0199(2) 프라이머를 사용하여 ~ 9.1 kb 단편을 생성시켰다. 높은 용적의 연결 후 PCR은 효율적이지 못했다.
B - Ascl 분해된 낮은 용적 5' 아암-3' 아암 연결 생성물(~9.1 kb, 레인 1 & 2) 및 Ascl 분해된 p15A-Kan 벡터 단편(~3 kb, 레인 3).
도 30은 플라스미드 pNG-62의 맵을 보여준다. 이것은 플라스미드 ColoAd2.4로부터 생성되었고 p15A 복제 오리진, 가나마이신 내성 카세트 및 본래의 Sgfl 및 Sbfl 제한 부위 사이에 삽입된 GFP 리포터 유전자 전이유전자 카세트를 갖는 ColoAd1 게놈을 함유한다.
도 31은 pNG-62 플라스미드에 존재하는 전이유전자 카세트의 도식이다. 상기 카세트는 분지된 스플라이스 수용체 서열(bSA), KOZAK 서열, 녹색 형광 단백질(GFP) cDNA 및 SV40 레이트 폴리A 서열을 함유한다. 상기 카세트는 ColoAd2.4 백터에 삽입하기 위한 Sgfl 및 Sbfl 제한 부위에 의해 플랭킹된다.
도 32의 제한 분해된 작제물은 pNG-62 전이유전자 카세트를 함유한다. 모든 5개의 작제물은 올바르게 크기별 카세트를 함유한다.
도 33은 다음을 보여준다.
A - 효소 Nhel 및 EcoRV로 분해된 pNG-62 플라스미드의 예비 제한 분석을 보여준다. 1.5:1 연결 비율로부터 1, 2 및 3번, 및 2:1 연결 비율로부터 1, 2 및 4번의 작제물은 pNG-62 플라스미드에 상응하는 올바른 밴드 패턴을 보여주었다.
B - 이로부터 pNG-62가 작제되는 2개의 pNG-62 작제물 및 플라스미드의 효소 Bglll 또는 효소 Nhel 및 EcoRV를 사용한 진단학적 제한 분해물, ColoAd2.4를 보여준다. DNA 단편의 밴드 패턴은 pNG-62 플라스미드의 작제를 확인시켰다.
도 34는 다음을 보여준다:
A - NG-62 게놈 DNA로 형질감염된 HeK293 세포로부터 수거된 NG-62 바이러스입자로 24시간(상부 패널) 또는 48시간(하부 패널) 동안 감염된 AD293 세포의 명시야 현미경 이미지
B - NG-62 바이러스 입자로 24시간(상부 패널) 또는 48시간(하부 패널) 동안감염된 AD293 세포에서 GFP 발현을 보여주는, A에서 명시야 이미지에 상응하는 형광 현미경 이미지
본원에 사용된 바와 같은 벡터는 유전학적 물질을 예를 들어, 이것이 복제되고/되거나 발현될 수 있는 또 다른 작제물 또는 세포로 인위적으로 운반하기 위한 비히클로서 사용되는 DNA 분자를 말한다. 셔틀 벡터를 제조하는 방법 및 셔틀 벡터 자체는 본 발명자가 아데노바이러스 게놈의 조작을 가능하게 하는데 필요한 모든 기능을 함유하는 플라스미드를 작제가능하게 하였다.
본원에 사용된 바와 같은 셔틀 벡터는 예를 들어, 2가지 유형의 숙주 세포, 전형적으로 세균 및 포유동물 세포에서 증식할 수 있는 벡터를 말한다.
선행 기술 분야의 셔틀 벡터는 일반적으로 약 100개 염기쌍의 역위 말단 반복체(ITR) 서열과 같은, 3' 아암에서 단지 최소량의 아데노바이러스 게놈 DNA를 함유한다. 상기 3' 단편은 재조합을 허용하기에 충분하지만 E4, E3 및 L5 유전자들이 위치한 3' 말단에서 게놈의 임의의 조작을 허용하지 않는다. 짧은 3' 아암을 갖는 작은 셔틀 벡터의 어셈블링은 일반적으로 PCR 방법 및 2개의 DNA 단편의 단순한 연결을 사용하여 수행된다. 그러나, 다수의 아데노바이러스 유전자들이 조작될 수 있는 보다 큰 셔틀 벡터를 제조하기 위한 연결은 상당한 크기의 3개의 DNA 단편이 사용되기 때문에 보다 어렵게 되고 예측가능하지 않게 되었다.
일반적으로, 본 발명의 개시내용에 따른 방법에 사용되는 3'-아암(단편 iii)은 적절하게 E3 부위 및/또는 E4 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 3'-아암은 예를 들어, 바이러스 게놈의 단편으로서, 즉, 유전학적 요소들이 바이러스에서 천연적으로 발견되는 바와 같은 상응하는 위치를 갖는(및 예를 들어, 상기 단편은 E4 부위를 포함하지 않는다) 3' ITR, L5 및 E3 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 3'-아암은 예를 들어, 바이러스 게놈의 단편으로서, 즉, 상기 유전학적 요소들이 바이러스에서 천연적으로 발견되는 바와 같은 상응하는 위치를 갖는(및 예를 들어, 상기 단편은 E3 부위를 포함하지 않는다) 3' ITR, L5 및 E4 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 3'-아암은 예를 들어, 바이러스 게놈의 단편으로서, 즉 상기 유전학적 요소들이 바이러스에서 천연적으로 발견되는 바와 같은 상응하는 위치를 갖는 3' ITR, L5, E3 부위 및 E4 부위를 포함한다.
일반적으로, 선행 기술 분야에서, 3개 조각의 DNA를 연결하여 셔틀 벡터를 형성하는 경우, 2-단계 연결이 사용되고, 여기서, 2개 조각들은 제1 단계에서 연결되고 이어서 3번째 조각은 제2 단계에서 연결된다. 이것은 대형 조각의 DNA를 함께 연결하는 것은 비효율적 공정이기 때문이다. 놀랍게도, 통상적인 방법은 요구되는 크기의 아데노바이러스 셔틀 벡터 및 플라스미드를 성공적으로 제조하지 못하였다. 따라서, PCR 방법의 사용 및 2단계 연결 방법을 통한 2개 DNA 단편의 연결은 본 발명자들의 수개월 수작업 후에도 어떤 아데노바이러스 셔틀 벡터도 제조하지 못하였다.
본 발명자는 본 발명의 1단계 3개-방식 연결 방법을 사용함에 의해 상기 문제점을 극복하였다. 놀랍게도, 양호하고 효율적인 1단계 3개-방식 연결이 다양한 조건하에서 여러 실험을 수행한 후 결국 확인되었다. 3개 방식 연결에서 DNA 성분들의 비율은 성공적인 연결을 위해 중요한 것으로 나타난다. 1단계 방법은 이론적으로 2개의 DNA 분절을 동시에 어셈블리하는 것보다 3개의 DNA 분절을 어셈블리하기가 보다 어렵기 때문에 약간 직관에 반대된다. 그러나, 본 발명에 개시된 방법은 작동하여 요구되는 크기의 셔틀 벡터 및 플라스미드의 제조를 가능하게 함을 본 발명자에 의해 밝혀졌다.
E3 부위, L5 유전자 및 E4 부위를 포함하는 셔틀 벡터가 제조되면, 본 발명자는 본래의 제한 부위를 셔틀 벡터에 도입하여 전이유전자들이 도입될 수 있는 어얼리 유전자들로부터 제거된 위치에서 신규한 본래의 제한 부위를 갖는 완전한 게놈을 함유하는 플라스미드를 생성시킬 수 있었다. 상기 양태에서, 제한 부위들을 도입하는 단계 b)는, 단계 a) 후에 수행하였다. 또 다른 방법은 예를 들어, 제한 부위 및/또는 전이유전자를 이미 함유하는 3' 아암(단편 ii)을 제조하는 것이다. 이를 성취하기 위한 한가지 방법은 연결 단계를 수행하기 전에 모든 목적하는 구조 및 기능을 갖도록 3' 아암 단편을 합성함에 의한 것이다. 후자 양태에서, 단계 b)는 단계 a) 전에 수행한다. 계속 반복적으로 사용될 수 있는 클로닝 플랫폼이 요구되는 경우, 제한 부위가 사용된다. 단지 하나의 특이적 바이러스 작제물이 요구되는 경우 동일한 기능을 위해 필요한 전이유전자 및 기구만을 단순히 삽입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시내용의 하나의 대안적 측면에서, 어떠한 제한 부위도 삽입되지 않고 차라리 전이유전자 또는 전이유전자들이 요구되는 위치에 직접 삽입된다.
명백하게, 5' 아암 단편이 또한, 요구되는 요소들, 서열 및/또는 기능을 사용하여 제조될 수 있고, 예를 들어, 합성될 수 있다.
합성 아데노바이러스 단편들이 사용되는 경우, 이들은 어셈블리하여 완전하게 기능하는 바이러스 또는 바이러스 벡터를 제공할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 DNA 작제물(construct)은 셔틀 벡터 또는 플라스미드를 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 바이러스 작제물은 본 발명의 개시내용에 따른 복제가능한 바이러스 또는 복제 결핍 바이러스를 말한다.
아데노바이러스
본 발명의 개시내용은 모든 유형의 아데노바이러스에 광범위하게 적용될 수 있고 예를 들어, 표 1에 보여지는 바와 같은 인간 아데노바이러스, 예를 들어, 서브그룹 B 아데노바이러스에 특히 적합하고 키메라 아데노바이러스 EnAd(에나데노투시레브), OvAd1 및 OvAd2에 특이적으로 적용될 수 있다.
달리 언급되는 않는 경우, 본원에 사용된 바와 같은 아데노바이러스는 임의의 기원, 혈청형의 아데노바이러스를 언급하고 바이러스 벡터를 포함하여 언급하는 포괄적 용어이다. 달리 언급되지 않는 경우, 본원에 사용된 바와 같은 아데노바이러스 게놈은 아데노바이러스의 유전학적 DNA의 전체를 의미한다.
게놈 DNA는 아데노바이러스 게놈 기원의 모든 DNA 또는 일부 DNA이다.
아데노바이러스는 대략 34 내지 48 킬로베이스 쌍(Kb)의 선형 게놈을 갖는 비-외피 20면체 이중가닥 DNA 바이러스이다. 게놈의 크기로 인해, 상기 바이러스는 이의 안정성 또는 이의 감염성에 상당한 영향 없이 게놈에 외래 DNA의 약 10 %를 추가로 혼입할 수 있다. 따라서, 보다 긴 서열의 도입은 일반적으로 바이러스 유전자의 일부 제거를 필요로 한다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스이다. 본원에 사용된 바와 같이, 인간 아데노바이러스는 이들의 혈구응집반응 성질(문헌참조: Shenk 2001)을 포함하는 다양한 특성을 기반으로 서브그룹 A-F로 분류되는 현재 50개 이상의 공지된 아데노바이러스 혈청형 중 임의의 혈청형에 할당될 수 있고 아직 동정되지 않았거나 분류되지 않은 임의의 아데노바이러스 혈청형까지 추가로 확대되는 임의의 아데노바이러스를 말한다. 예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같이 문헌[Strauss, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg, Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984) and Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication," in Fields Virology, Vol.2, Fourth Edition, Knipe, 35ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)]을 참조한다:
[표 1]
Figure pct00001
지금까지 조사된 모든 인간 아데노바이러스 게놈은 동일한 일반적 구성을 갖고, 즉, 특이적 기능을 암호화하는 유전자들은 바이러스 게놈에서 동일한 위치에 위치한다. 바이러스 게놈의 각각의 말단은 바이러스 복제를 위해 요구되는 역위 말단 반복체(또는 ITR)로서 공지된 짧은 서열을 갖는다. 상기 바이러스 게놈은 5개의 어얼리 전사 유니트(E1A, E1B, E2, E3, 및 E4), 3개의 지연된 어얼리 유니트 (IX, IVa2 및 E2 레이트) 및 레이트 mRNA의 5개 계열(L1-L5)을 생성하도록 가공되는 하나의 레이트 유니트(메이져 레이트)를 함유한다. 어얼리 유전자에 의해 암호화된 단백질은 주로 복제 및 감염에 대한 숙주 세포 반응의 조절에 관여하는 반면, 레이트 유전자들은 바이러스 구조 단백질을 암호화한다. 어얼리 유전자들은 문자 E를 접두어로 하고 레이트 유전자들은 문자 L을 접두어로 한다.
Ad11 게놈에서 유전자들 위치의 개요는 실시예에서 제공된다.
ITR은 모든 공지된 아데노바이러스에 공통된다. 역위 말단 반복체(ITR) 서열은 이들의 대칭 때문에 호칭되었고 바이러스 염색체의 복제 오리진이다. 이들 서열의 또 다른 성질은 헤어핀을 형성하는 이들의 능력이다. 본원에 사용된 바와 같은 5' ITR은 게놈의 5' 말단에서 ITR을 말한다. 본원에 사용된 바와 같은 3' ITR은 게놈의 3' 말단에서 ITR을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 L5 유전자는 섬유 유전자를 의미한다. 섬유 유전자는 아데노바이러스의 메이져 캡시드 성분인 섬유 단백질을 암호화한다. 섬유는 수용체를 인지하는 기능을 하고 세포에 선택적으로 결합하고 이를 감염시키는 아데노바이러스의 능력에 기여한다. 섬유 유전자는 예를 들어, 986개 염기쌍 영역을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 섬유는 게놈, 예를 들어, Ad11 게놈의 위치 30811-31788에 의해 한정되고, 특히, 본원에 참조로 인용되는 US7,459,153의 서열번호 1에 의해 한정되거나 바이러스 기탁 GenBank 승인번호: AY598970에 의해 한정된다.
비-인간 아데노바이러스는 양, 돼지, 개 및 침팬지 바이러스를 포함한다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈은 서브그룹 B 아데노바이러스 게놈이다. 본원에 사용된 바와 같은 서브그룹 B는 혈청형 B 아데노바이러스를 의미한다. 서브그룹 B 아데노바이러스는 Ad3, Ad7, Ad11, Adl4, Adl6, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51을 포함한다. 가장 광범위하게 연구된 아데노바이러스인 Ad5는 서브그룹 C 아데노바이러스이다. Ad5 면역력은 인간 집단에서 통상적이이서 바이러스가 신속한 면역 반응에 의해 중화될 가능성이 있기 때문에 치료요법에 대해서는 불량한 후보가 되게 한다.
하나의 양태에서, 상기 아데노바이러스는 EnAd(에나데노투시레브(Enadenotucirev) 서열번호 1, 또한 ColoAd1 복제 적격 암세포 분해 키메라 아데노바이러스로서 공지됨 - WO2005/118825를 참조한다), OvAd1(WO2008080003 참조 - 여기에서 서열번호 1 및 본원에 참조로 인용됨), OvAd2(WO2008080003 참조 - 여기에서 서열번호 2 및 본원에 참조로 인용됨), Ad3(Genbank 승인번호: DQ086466), Ad11, 예를 들어, Ad11p(Genbank 승인번호: AY598970) 및 Ad5, 예를 들어 EnAd(서열번호 1), OvAd1 또는 OvAd2, 특히 EnAd로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용의 방법에 사용되는 아데노바이러스 게놈은 EnAd(서열번호 1)와 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 서열 동일성을 갖는다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈은 OvAd1(WO2008080003의 서열번호 1)과 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 서열 동일성을 갖는다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈은 OvAd2(WO2008080003의 서열번호 2)와 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 서열 동일성을 갖는다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈은 Ad3(Genbank 승인번호: DQ086466)과 적어도 95 %의 서열 동일성, 예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 서열 동일성을 갖는다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈은 Ad11p(Genbank 승인번호: AY598970)와 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 서열 동일성을 갖는다.
유리하게, EnAd는 야생형 Ad11p 캡시드, Ad3 및 Ad11 둘 다로부터 유래된 키메라 E2B 영역 및 E3 및 E4 영역에서의 결실(특히, E3 전체가 결실되어 있고 E4 또는 f4가 결실되어 있다)을 갖는다. 이들 구조적 변화는 예를 들어, 치료학적 또는 면역조절제를 발현하는 전이유전자 카세트 발현의 삽입을 위한 ColoAd1 게놈내 추가적 '공간'을 제공한다. 추가로, 이것은 서브그룹 B 아데노바이러스이기 때문에, 인간에서 선재 면역력은 Ad5에 비해 덜 통상적이다.
EnAd에서 구조적 변화는 Ad11p보다 작은 대략 3.5 kb인 게놈을 유도하여 전이유전자 카세트의 삽입을 위한 추가적 "공간"을 제공한다. EnAd는 예를 들어, EnAd의 잠재적인 항암 활성을 증강시키거나 상승작용하는 광범위한 범위의 치료학적 단백질을 전달하기에 적합한 비히클이다. OvAd1 및 OvAd2는 또한 게놈내 추가적 "공간"을 또한 갖는 ColoAd1과 유사한 키메라 아데노바이러스이다(문헌참조: WO2008/080003).
본원에 사용된 바와 같은 서열 동일성은 예를 들어, 이들의 전장 길이를 따라 비교 윈도우 상에 대해 동일한(즉, 뉴클레오타이드 별로 또는 잔기 별로 기준으로 하여) 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 말한다. 상기 용어 "서열 동일성 % "는 비교 윈도우 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U, 또는 I) 또는 잔기가 양 서열에 존재하여 매칭되는 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우에서 위치의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 산출함에 의해 계산한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적 동일성"은 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 특징을 지칭하고, 여기서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산은 적어도 18개 뉴클레오타이드(6개 아미노산) 위치의 비교 윈도우 상에서, 흔히 적어도 24-48개 뉴클레오타이드(8 내지 16개 아미노산) 위치의 윈도우 상에 표준 서열과 비교하여 적어도 85 %의 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 90 내지 95 % 서열 동일성, 특히, 적어도 99 % 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 여기서, 서열 동일성의 %는 비교 윈도우 상에서 표준 서열의 총 20 % 이하의 결실 또는 부가를 포함할 수 있는 서열과 표준 서열을 비교함에 의해 계산된다. 표준 서열은 보다 큰 서열의 서브세트일 수 있다.
폴리펩타이드를 기재하기 위해 사용되는 경우 용어 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 보존된 아미노산 치환을 제2 폴리펩타이드의 서열과 비교함에 의해 결정된다.
폴리뉴클레오타이드를 기재하기 위해 사용되는 경우 용어 "상동성"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교되는 경우, 적정한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실과 뉴클레오타이드의 적어도 70 %, 일반적으로 약 75 % 내지 99 % 및 특히 뉴클레오타이드의 적어도 약 98 % 내지 99 %로 동일함을 나타낸다. 하나의 양태에서, 상기 비교는 소정의 서열의 전장에 걸쳐 수행된다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈은 키메라 E2B 영역, 예를 들어, E2B 영역을 포함하는 게놈을 갖는 재조합체 키메라 아데노바이러스, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 갖고, 여기서, 상기 E2B 영역은 제1 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 핵산 서열 및 제2 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 상기 제1 및 제2 혈청형은 각각 독립적으로 아데노바이러스 서브그룹 B, C, D, E, 또는 F로부터 선택되고 서로로부터 구분되고; 여기서, 상기 키메라 아데노바이러스는 암세포 파괴성이고 특히, 본원에 참조로 인용되는 WO2005/118825에 기재된 바와 같은 종양 세포에 대한 증진된 치료학적 지수를 입증한다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈은 결실되거나 돌연변이된 일부 또는 모든 E3 영역을 갖고, 예를 들어, E3 영역은 돌연변이된다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈은 결실되거나 돌연변이된 일부 또는 모든 E4 영역을 갖고, 예를 들어, E4 또는 f4가 결실된다.
복제 결핍 및 복제 가능
하나의 양태에서, 사용되는 아데노바이러스 게놈은 복제할 수 있는, 특히 복제 적격의 아데노바이러스로부터 기원한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용의 바이러스 또는 바이러스 작제물은 복제 가능하고, 특히 복제 적격이다. 하나의 양태에서, EnAd는 복제 가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 복제 가능한 이란, 일반적으로 예를 들어, 팩키징 세포주 필요 없이 복제 가능한 바이러스를 말한다. 이들은 또한 본원에서 바이러스, 복제 적격 바이러스(복제 가능한 바이러스의 서브그룹인) 및 조건적으로 복제하는 바이러스(또한 복제 가능한 바이러스의 서브그룹) 또는 생존 바이러스로서 언급된다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 복제 가능한 바이러스는 조건적으로 복제하는 바이러스 및 복제 적격 바이러스를 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 조건적으로 복제하는 바이러스는 세포, 예를 들어, 특정 유전자를 발현하거나 과발현하거나 저발현하는 암 세포, 예를 들어, p53 유전자를 저발현하는 세포에서 복제할 수 있는 바이러스를 말한다.
복제 적격 바이러스는 원조 바이러스 또는 상보적/팩키징 세포주의 원조 없이 예를 들어, 생체내 및/또는 생체외 복제를 위해 필요한 모든 기구를 갖는 바이러스이다.
달리 언급되지 않는 경우, 본원에 사용된 바와 같은 "바이러스" (상기 정의된 아데노바이러스와 반대로)는 복제 가능한, 예를 들어, 복제 적격 바이러스를 말한다. 따라서, 하나의 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 바이러스는 일반적으로 암세포 파괴 바이러스와 같은 치료학적 바이러스와 같은 복제 적격 바이러스를 말한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용에 따른 방법에 사용되는 아데노바이러스 게놈은 복제가능하지 않은 아데노바이러스 벡터로부터 기원한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용의 바이러스 또는 바이러스 작제물은 비-복제(또한 복제 결핍으로서 언급되는)이다. 비-복제 아데노바이러스, 예를 들어, 바이러스 벡터(전이유전자, 예를 들어, 백신 항원을 전달하기 위한, 항체 등의 세포내 전달을 위한 비히클로서 사용되는)는 일반적으로 복제에 필수적인 제거된 하나 이상의 유전자를 갖는다. 달리 언급되지 않는 경우, 본원에 사용된 바와 같은 바이러스 벡터는 복제 결핍을 말한다.
복제 결핍 아데노바이러스는 복제하기 위해 헬퍼 바이러스 또는 상보적/팩키징 세포주를 필요로 하는 것들이다. 일반적으로, 복제하기 위해 팩키징 세포주를 필요로 하는 아데노바이러스(예를 들어, 전이유전자를 포함하는 것들)은 바이러스 벡터로서 언급된다. 하나의 양태에서, EnAd는 예를 들어, E1 영역의 부분 또는 모두가 결실되어 복제 결핍이 된다.
복제-필수 유전자 또는 유전자들을 제거하는 이유는 2가지 이유이다. 첫째로, 벡터가 생체내 복제하지 못하는 이들의 무능력으로 인해 단순화된 안정성 프로필을 갖게 하는 것으로 고려된다. 둘째로, 유전자들의 결실은 게놈에서 공간을 생성함에 의해 대형 전이유전자의 삽입을 가능하게 한다. 이들 전이유전자는 복제하지 못하는 바이러스 벡터의 무능력과는 상관없이 생체내에서 발현될 수 있다. 하나의 양태에서, E1 유전자는 바이러스 벡터의 제조에서 바이러스로부터 제거되고 일부 경우에 대안적으로 또는 추가로 E3 영역의 일부 또는 전부가 결실된다.
팩키징 세포주는 미지의 바이러스에 결핍된 유전자들을 보충하기 위해 제조된 재조합 세포주이다. 본원에 사용된 바와 같은 팩키징 세포는 복제를 위한 필수 요소가 결핍된 바이러스의 상기 요소를 제공할 수 있는 세포를 의미한다. 팩키징 세포주의 예는 PerC6 세포주를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 팩키징 세포주는 HEK 세포이다.
바이러스 유전자
El은 바이러스 복제 역할을 수행한다. E1 영역이 결실되거나 돌연변이되어 바이러스는 특정 "팩키징" 세포주의 도움 없이는 복제할 수 없다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용의 바이러스 벡터의 게놈에서 El 영역은 전반적으로 또는 부분적으로 결실된다. 하나의 양태에서, El 부위는 E1 영역의 결실이거나 이의 단편은 5' 아암에서 결실된다.
본원에 사용된 바와 같은 El 부위는 영역의 전체 또는 일부가 결실되거나 대체되든 어떠한 것도 결실되거나 대체되지 않든 상관없이 E1 영역의 위치를 말한다. 용어 "El 부위"는 E1이 돌연변이되거나, 부분적으로 결실되거나, 전체 결실되거나 전체 온전하고 비-돌연변이된 경우를 포함한다. El 부위는 단편 또는 서열이 E1 영역 후 개시하거나 전에 종료되는 경우 부재일 수 있고, 예를 들어, E2 영역에서 서열 개시와 같이, E1과 관련된 임의의 비-암호화 영역 후 개시함을 포함한다. 하나의 양태에서, El 부위는 El 영역 또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이로 이루어진다. 하나의 양태에서, El은 존재하고 완전하고/하거나 기능성이다.
E3은 바이러스 감염에 대한 숙주 세포의 반응을 조절하기 위해 중요한 단백질을 암호화한다.
본원에 사용된 바와 같은 E3 부위는 상기 E3 유전자 또는 영역이 발견되거나 발견될 것으로 예측되는 아데노바이러스 게놈내 위치를 말한다. E3 유전자는 전반적으로 존재할 수 있거나 단편으로 존재할 수 있거나 완전히 부재이거나 부분적으로 또는 완전히 돌연변이된 것일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 E3 부위는 전부 또는 일부 영역이 결실되거나 대체되든 어떠한 것도 결실되거나 대체되지 않든 상관 없이 E3 영역의 위치를 말한다. 아데노바이러스의 게놈 구조가 모든 공지된 인간 아데노바이러스 간에 균일하다면(도 1 참조), 당업자는 유전자가 존재하거나 결실되었는지를 E3 부위를 동정할 수 있다. E3 부위는 사실 관련된 단편 또는 서열이 E3 영역 뒤에서 개시하거나 E3 영역 앞에서 종료되는 경우 부재일 수 있고, 예를 들어, L5 영역 내에서 개시 서열과 같은 E3과 관련된 임의의 비-암호화 영역을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 E4 부위는 E4 유전자 또는 영역이 발견되거나 발견될것으로 예측되는 아데노바이러스 게놈내 위치를 말한다. 상기 E4 유전자는 전체가 존재하거나 단편으로부터 존재하거나 전체가 부재이거나 부분적으로 또는 완전히 돌연변이될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 E4 부위는 전체 또는 일부의 영역이 결실되거나 대체되든 또는 어떠한 것도 결실되거나 대체되지 않든 상관없이 E4 영역의 위치를 말한다. 아데노바이러스의 게놈 구조가 모든 공지된 인간 아데노바이러스 간에 균일하다면(도 1 참조), 당업자는 유전자가 존재하거나 결실되었는지를 E4 부위를 확인할 수 있다. E4 부위는 사실 관련된 단편 또는 서열이 E4 영역 뒤에서 개시하거나 E4 영역 앞에서 종료하는 경우 부재일 수 있고, 예를 들어, L5 영역내 서열 개시와 같은 E4와 관련된 임의의 비-암호화 영역을 포함한다.
L5 유전자는 레이트 발현된 캡시드 단백질 섬유를 암호화한다.
하나의 양태에서, L5 영역은 전장 서열 또는 이의 기능성 단편, 예를 들어, 특히, 시험관내 검정에서 야생형 유전자의 활성의 60, 70, 80, 90 또는 100 %와 같이 50 % 이상을 보유하는 단편이다. 하나의 양태에서, L5는 게놈 DNA의 80 % 이상을 차지하고 L5 유전자는 예를 들어 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 %이다.
하나의 양태에서, 일부 또는 모든 E3, E4 또는 L5 유전자는 독립적으로 돌연변이된다.
본원에 사용된 바와 같은 돌연변이된 이란, 관련 유전자에서의 변형, 예를 들어, 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 부가 돌연변이, 정배향 돌연변이, 치환 돌연변이 및/또는 프레임쉬프트 돌연변이를 말한다. 하나 이상의 양태에서, 돌연변이된 유전학적 물질의 양은 관련 서열의 10 % 이하이다. 필수 유전자, 예를 들어, L5(섬유 유전자)에서, 상기 유전자의 기능은 돌연변이된 유전자에서 유지되고, 예를 들어, 기능의 50, 60, 70, 80, 90 또는 100은 보유되거나 상기 기능은 증가되고, 즉 돌연변이되지 않은 유전자의 100 % 초과이다.
제한 부위
본원에 사용된 바와 같은 제한 부위는 제한 효소에 의해 특이적으로 인지되거나 절단되는 짧은 DNA 서열이다.
본원에 사용된 바와 같은 적합한 제한 부위는 소정의 위치, 예를 들어, 어얼리 유전자가 아닌 DNA의 영역에서 바이러스의 게놈 DNA를 특이적으로 절단하기 위해 사용될 수 있는(적당한 제한 효소와 연계된) 부위를 의미한다. 하나의 양태에서, DNA는 전이유전자의 삽입을 촉진시키기 위해 절단된다. 하나의 양태에서, 적합한 부위는 전형적으로 게놈의 5' 말단 근처 및/또는 바이러스 게놈의 3' 말단 근처 또는 3' 아암 단편 및/또는 5' 아암 단편에서 상응하는 위치 근처에 존재하고, 이것은 DNA가 예를 들어, 도면에 보여지는 바와 같이 선형화되고 조작되도록 한다.
하나의 양태에서, 적합한 제한 부위는 3' 및/또는 5' ITRS의 말단으로부터 대략 4 내지 5 kb에 위치하여 셔틀 벡터는 대략 4-5 Kb 3' 및/또는 5' 아암을 갖는다. 유리하게, 이것은 셔틀 벡터와 아데노바이러스 게놈 간에 효율적인 상동성 재조합이 되게 한다. 이러한 디자인은 또한 셔틀 벡터가 E1 유전자(예를 들어, 5' 아암에서) 및 섬유 및 E4 유전자(예를 들어, 3' 아암에서)를 함유하도록 하여 이들 유전자 주변의 임의의 영역들은 전이유전자 카세트 삽입을 위해 조작될 수 있다.
하나의 양태에서, 셔틀 벡터는 1, 2, 또는 3개의 추가의 적합한/본래의 제한 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 적합한 제한 부위는 셔틀 벡터에서 임의의 다른 위치에 삽입되지 않는다. 하나의 양태에서, 제한 부위는 당업자가 게놈을 조작하도록 하기 위한 추가의 옵션을 제공하기 위해 예를 들어, E1, E2, E3 및 E4로부터 독립적으로 선택된 적어도 하나의 어얼리 유전자 또는 이의 일부 주변에 혼입된다.
적합한 제한은 일반적으로 본래의 제한 부위이다. 본래, 신규, 단독의 제한 부위가 본원에서 상호교환적으로 사용되고/되거나 특이적으로 절단될 수 있는 제한 부위를 언급하기 위해 의도된다. 제한 부위 또는 일부 경우에 제한 부위 쌍은 이들이 단지 절단이 요구될 수 있는 위치에 존재하는 경우 특이적으로 절단될 수 있다. 따라서, 제한 부위가 단지 1회 존재하거나 제한 부위 쌍이 바이러스 게놈 또는 게놈 DNA에 1회 존재하는 경우, 상기 제한 부위 또는 부위들(쌍의 경우에)은 적당한 효소에 의해 특이적으로 절단될 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본래, 신규 또는 단독은 바이러스 게놈 또는 적절한 게놈 DNA내 어디에서도 이전에 존재하지 않았던 제한 부위 또는 제한 부위들 쌍의 도입을 말한다. 따라서, 하나의 양태에서, 적합한 제한 부위는 아데노바이러스 게놈에 비-천연(외인성)이다. 하나의 양태에서, 본래의 제한 부위 또는 제한 부위들의 쌍은 바이러스 게놈 또는 게놈 DNA에 단지 1회 존재한다. 하나의 양태에서, 적합한 제한 부위는 점성 말단을 생성한다. 하나의 양태에서, 적합한 제한 부위는 적절히 상업적으로 시판되는 제한 효소에 의해 절단된다.
따라서, 제한 부위는 제한 효소, 일반적으로 상기 서열에 특이적인 효소에 의해 절단될 수 있는 DNA 서열내 위치이다. 하나의 양태에서, 제한 부위는 3 내지 22개 염기쌍, 예를 들어, 4 내지 22개, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 염기쌍을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 도입된 또는 도입하는은 일반적으로 천연, 야생형 또는 개시 아데노바이러스 게놈에서 발견되지 않는 제한 부위를 삽입하는 것으로 말한다.
하나의 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 본래의 제한 부위는 플라스미드또는 바이러스 작제물에서 단지 1회 존재하는 제한 부위를 의미한다. 이것은 소정의 제한 효소가 단지 하나의 공지된 위치에서 플라스미드를 확실히 절단하도록 한다. 본 발명의 개시내용과 관련하여, 본래의 제한 부위는 전형적으로 게놈으로 도입되고 천연적으로 존재하지 않는 부위이다.
하나의 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 본래의 제한 부위는 재조합 기술에 의해 아데노바이러스 게놈으로 도입되는 제한 부위를 언급하고, 특히 상기 도입된 제한 부위는 바이러스내 천연적으로 존재하지 않아 바이러스의 위치에 특이성을 부여하고 소정의 제한 효소가 사용되는 경우 절단된다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 본래의 제한 부위는 플라스미드, 바이러스 또는 셔틀 벡터에서 단지 1회 존재하는 제한 부위를 의미한다. 이것은 소정의 제한 효소가 단지 하나의 공지된 위치에서 플라스미드를 확실히 절단하도록 한다.
특히, 본래의 제한 부위는 전이유전자 카세트가 예를 들어, 어얼리 유전자로부터 제거된 위치에서 게놈 내로 삽입되도록 한다.
상기 방법은 이로부터 셔틀 벡터를 제조하기 위해 ColoAd1, OvAd1, OvAd2, Ad3, Ad11 및 Ad5에서 동정된 적당한 5' 및 3' 아암을 제공할 수 있는 아데노바이러스 및 적합한 제한 부위에 광범위하게 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 개시내용의 방법은 예를 들어, 전이유전자의 도입에 의해 부여되는 증진된 활성을 갖는 치료학적 바이러스를 제조하기 위한 개시점으로서 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본래의 제한 부위는 Fsel, Notl, Sbfl 및 Sgfl로부터 독립적으로 선택되고, 예를 들어, Notl 또는 Sbfl 및 Sgfl 또는 Fsel 및 Notl 및 Sbfl 및 Sgfl이다. 동일한 서열에서 절단하는 다른 제한 효소는 상호교환 가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 Fsel은 하기의 서열 -GGCCGG/CC-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 언급한다. 동일한 서열에서 절단하는 다른 제한 효소는 상호교환가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 Notl은 하기의 서열 -GC/GGCCGC-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 말한다. 동일한 서열에서 절단하는 다른 제한 효소는 상호교환가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 Sbfl은 하기의 서열 -CCTGCA/GG-에서 제한 효소에 의해 절단되는 제한 부위를 말한다. 동일한 서열에서 절단하는 다른 제한 효소는 상호교환가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 Sgfl은 하기의 서열 -GCGAT/CGC-에서 제한 효소에 의해 절단되는 제한 부위를 말한다. 동일한 서열에서 절단하는 다른 제한 효소는상호교환가능하다.
하나의 양태에서, 2개 이상의 본래의 제한 부위는 게놈내 소정의 부위에 삽입된다.
하나의 양태에서, 본래의 제한 부위는 L5 유전자와 E3 부위 사이의 위치에서의 단일 본래의 제한 부위이다. 예를 들어, 단일 본래의 제한 부위는 Notl과 같이 L5 유전자와 E3 부위 사이의 위치에 도입된다. 하나의 양태에서, 상기 단일 본래의 제한 부위는 플라스미드 또는 바이러스 작제물로 도입되는 유일한 본래의 제한 부위이다.
하나의 양태에서, 본래의 제한 부위는 L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치에서 1개 또는 2개(예를 들어, 2개)의 본래의 제한 부위, 예를 들어, L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치에 도입된 2개의 본래의 제한 부위, 예를 들어, 하나의 Sbf1 부위 및 하나의 Sgf1 부위이다. 하나의 양태에서, 이들은 셔틀 벡터, 플라스미드 또는 바이러스 작제물에 도입되는 단지 2개의 본래의 제한 부위이다.
하나의 양태에서, 본래의 제한 부위는 L5 유전자와 E3 부위 사이의 위치에서 단일 본래의 제한 부위 및 L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치에서 3개의 본래의 제한 부위, 예를 들어, L5 유전자와 E3 부위 사이의 위치에 도입된 단일 본래의 제한 부위, 예를 들어, 하나의 Fsel 부위, 및 L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치에서 도입된 3개의 본래의 제한 부위, 예를 들어, 하나의 Notl 부위, 하나의 Slbfl 부위 및 하나의 Sgfl 부위이다. 하나의 양태에서, 이들은 셔틀 벡터, 플라스미드 또는 바이러스 작제물로 도입되는 단지 4개의 본래의 제한 부위이다.
하나의 양태에서, Fsel은 그룹 ColoAd1, Ad11, Ad3, OvAd1 및 OvAd2로부터 선택된 아데노바이러스 게놈으로 도입을 위해 적합한 본래의 제한 부위이다. Rigl은 Fsel과 동일한 서열에서 절단하는 공지된 제한 효소이고, 따라서, Fsel 제한 부위는 또한 Rigl 제한 부위로서 공지되어 있다.
하나의 양태에서, Notl은 그룹 ColoAd1 및 Ad11로부터 선택되는 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. CciNI는 Notl과 동일한 서열에서 절단하는 공지된 제한 부위이고, 따라서, Notl 제한 부위는 또한 CciNI 제한 부위로서 공지되어 있다. 하나의 양태에서, Sbfl은 그룹 ColoAd1, Ad11, Ad3, OvAd1 및 OvAd2로부터 선택되는 아데노바이러스 게놈으로 도입을 위해 적합한 본래의 제한 부위이다. Sdal 및 Sse83871은 Sbfl과 동일한 서열에서 절단하는 공지된 제한 부위이고, 따라서 Sbfl 제한 부위는 또한 Sdal 제한 부위 또는 Sse83871 제한 부위로서 공지되어 있다.
하나의 양태에서, Sgfl은 그룹 ColoAd1, Ad11, Ad3, OvAd1 및 OvAd2로부터 선택되는 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. AsiSI, Rgal 및 SfaAI는 Sgfl과 동일한 서열에서 절단하는 공지된 제한 부위이고, 따라서 Sgfl 제한 부위는 또한 AsiSI 제한 부위, Rgal 제한 부위 또는 SfaAI 제한 부위로서 공지되어 있다.
하나의 양태에서, Clal은 Ad5 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 Clal은 하기의 서열 - AT/CGAT -에서 제한 효소에 의해 절단되는 제한 부위를 의미한다. BspDI, Zhol, BspDI, Banlll, Bsa29l, BseCI, BshVI, BsiXI, Bsp106l, BspXI, Bsu15l 및 BsuTUI는 Clal과 동일한 서열에서 절단되는 공지된 제한 부위이고, 따라서, Clal 제한 부위는 또한 BspDI 제한 부위, Zhol 제한 부위, BspDI 제한 부위, Banlll 제한 부위, Bsa29l 제한 부위, BseCI 제한 부위, BshVI 제한 부위, BsiXI 제한 부위, Bsp106l 제한 부위, BspXI 제한 부위, Bsu15l 제한 부위 또는 BsuTUI 제한 부위로서 공지되어 있다. 하나의 양태에서, Pacl은 Ad5 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 Pacl은 하기의 서열 -TTAAT/TAA-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 의미한다.
하나의 양태에서, Mlul은 그룹 Ad3 및 OvAd2로부터 선택된 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 Mlul은 하기의 서열 -A/CGCGT-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 의미한다.
하나의 양태에서, BstBI는 Ad5 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 BstBI는 하기의 서열 -TT/CGAA-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 의미한다. Sful, Asull, Bpu14l, BsiCI, Bsp119l, BspT104l, Csp45l 및 NspV는 BstBI와 동일한 서열에서 절단하는 공지된 제한 부위이고, 따라서 BstBI 제한 부위는 또한 Sful 제한 부위, Asull 제한 부위, Bpu14l 제한 부위, BsiCI 제한 부위, Bsp119l 제한 부위, BspT104l 제한 부위, Csp45l 제한 부위 또는 NspV 제한 부위로서 공지되어 있다.
하나의 양태에서, Bcll은 그룹 ColoAd1, Ad11, Ad3, Ad5, OvAd1 및 OvAd2로부터 선택된 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 Bcll은 하기 서열 -T/GATCA-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 의미한다. BsiQI, Fbal 및 Ksp221은 Bcll과 동일한 서열에서 절단되는 공지된 제한 부위이고, 따라서, Bcll 제한 부위는 또한 BsiQI 제한 부위, Fbal 제한 부위 또는 Ksp221 제한 부위로서 공지되어 있다. 이들 제한 부위는 일반적으로 바람직하지 않다.
하나의 양태에서, 평활 절단 제한 효소 부위는 본래의 제한 부위, 예를 들어, Pmel, Srfl 및 Swal로서 사용된다.
하나의 양태에서, Pmel은 그룹 ColoAd1, Ad11, OvAd1 및 OvAd2로부터 선택된 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 Pmel은 하기 서열 -GTTT/AAAC-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 의미한다.
하나의 양태에서, Srfll은 그룹 ColoAd1, Ad11, Ad3, Ad5, OvAd1 및 OvAd2로부터 선택된 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 Srfll은 하기의 서열 -GCCC/GGGC-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 의미한다.
하나의 양태에서, Swal은 그룹 ColoAd1, Ad11, Ad3, Ad5, OvAd1 및 OvAd2로부터 선택된 아데노바이러스 게놈으로 도입하기에 적합한 본래의 제한 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 Swal은 하기의 서열 -ATTT/AAAT-에서 제한 효소에 의해 절단되는 제한 부위를 의미한다. 하나의 양태에서, Not1 이외의 다른 본래의 제한 부위는 L5 유전자와 E3 부위 사이의 위치에 있다. 하나의 양태에서, L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치에 2개의 본래의 제한 부위, 예를 들어, 하나의 Sbfl 및 하나의 Sgfl이 있다.
하나의 양태에서, 4개의 본래의 제한 부위가 있고, 여기서, 하나의 본래의 제한 부위는 L5 유전자와 E3 부위 사이의 위치에 있고 3개의 본래의 제한 부위는 L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치에 있다. 예를 들어, 하나의 본래의 제한 부위는 Fsel이고 3개의 본래의 제한 부위는 Sbfl, Sgfl 및 Notl의 각각 하나이다.
하나의 양태에서, 하나 이상의 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스 게놈은 서열번호 32의 서열을 갖는다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스 게놈은 서열번호 33의 서열을 갖는다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스 게놈은 서열번호 34의 서열을 갖는다.
하나의 양태에서, 하나 이상의 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스는 서열번호 32와 적어도 95 %의 서열 동일성, 예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 동일성을 갖는다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스는 서열번호 33과 적어도 95 %의 서열 동일성, 예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 동일성을 갖는다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 본래의 제한 부위를 포함하는 아데노바이러스는 서열번호 34와 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어 96, 97, 98, 99 또는 100 % 동일성을 갖는다.
제조된 플라스미드 및 셔틀 벡터는 아데노바이러스의 게놈 주변에 위치된 신규 조합의 본래의 제한 부위를 갖는다. 이들은 이어서 조작될 아데노바이러스 게놈의 어느 부위 상에 제어를 하기 위해 선택되고 사용될 수 있다.
본래의 제한 부위는 예를 들어, 전이유전자가 하나의 제한 부위의 위치에 삽입되도록 또는 대안적으로 게놈의 절편이 요구되는 만큼 2개의 선택된 제한 부위 사이에서 삽입되도록 전향적으로 도입된다.
하나의 양태에서, 상기 플라스미드는 적어도 하나의 E1 본래의 제한 부위를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 El 본래의 제한 부위는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역으로 도입되는 제한 부위를 말한다. 일부 양태에서, 상기 E1 유전자는 존재하지만 도입된 E1 본래의 제한 부위에 의해 방해받고, 다른 양태에서, E1 유전자는 결실되고 도입된 E1 본래의 제한 부위에 의해 대체되고, 또 다른 양태에서, E1 유전자는 존재하지만 이의 기능은 도입된 E1 본래의 제한 부위에 의해 변형되지 않는다.
하나의 양태에서, 제한 부위 또는 부위들은 하기 서열로부터 독립적으로 선택된다:
ㆍ 5'-GGCC 오버행을 잔류시키는 Not1 및 CciNI에 의해 절단되는 서열 GCGGCCGC,
ㆍ 3'-CCGG 오버행을 잔류시키는 Fsel 및 Rigl에 의해 절단되는 서열 GGCCGGCC,
ㆍ 3'-AT 오버행을 잔류시키는 AsiSI, Rgal, Sgfl 및 SfaAI에 의해 절단되는 서열 GCGATCGC
ㆍ 3'-TGCA 오버행을 잔류시키는 Sbfl, Sdal 및 Sse83871에 의해 절단되는 서열 CCTGCAGG
ㆍ 5'-GATC 오버행을 잔류시키는 Bcll, Fbal, Ksp221 및 BsiQI에 의해 절단되는 서열 TGATCA
ㆍ 3'-TGA 오버행을 잔류시키는 l-Crel에 의해 절단되는 서열 CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG [서열번호 41]
ㆍ 3' CTAA 오버행을 잔류시키는 l-Ceul에 의해 절단되는 서열 TAACTATAACG GTCCTAAGGTAGCGAA [서열번호 42]
ㆍ 3' ATAA 오버행을 잔류시키는 l-Scel에 의해 절단되는 서열 TAGGGATAACAGGGTAAT [서열번호 43]
ㆍ 평활 말단을 잔류시키는 Srf1에 의해 절단되는 서열 GCCCGGGC
ㆍ 평활 말단을 잔류시키는 Mssl, Pmel에 의해 절단되는 서열 GTTTAAAC
ㆍ 평활 말단을 잔류시키는 Swal, Smil에 의해 절단되는 서열 ATTTAAAT
ㆍ 5' CGCG 오버행을 잔류시키는 Ascl, PalA1 및 Sgsl에 의해 절단되는 서열 GGCGCGCC
동일한 인지 부위를 절단하는 다른 제한 효소가 또한 적합할 수 있다.
하나의 양태에서, 3' 아암 및 벡터 단편에서 발견되는 제1 제한 부위는 동일한 제한 부위(즉, 동일한 제한 효소에 의해 절단되는 부위)이다. 이것은 벡터 단편의 5' 말단의 3' 아암의 3' 말단의 연결을 촉진시킨다.
하나의 양태에서, 5' 아암 및 벡터 단편에서 발견되는 제2 제한 부위는 동일한 제한 부위(즉, 동일한 제한 효소에 의해 절단되는 부위)이다. 이것은 벡터 단편의 3' 말단의 5' 아암의 5' 말단으로의 연결을 촉진시킨다.
하나의 양태에서, 제1 및 제2 제한 효소 부위는 그룹 Fsel, Rigl, Notl, CciNI, Sbfl, Sdal, Sse83871, Sgfl, AsiSI, Rgal, SfaAI, Clal, BspDI, Zhol, BspDI, Banlll, Bsa29l, BseCI, BshVI, BsiXI, Bsp106l, BspXI, Bsu15l, BsuTUI, Pacl, MIul, BstBI, Sful, Asull, Bpu14l, BsiCI, Bsp119l, BspT104l, Csp45l, NspV, Bcll, BsiQI, fbal, Ksp221, Pmel, Srfl 및 Swal로부터 독립적으로 선택된다.
하나의 양태에서, 제1 제한 부위는 Ascl이다. 하나의 양태에서, 제2 제한 효소 부위는 Ascl이다. 본원에 사용된 바와 같은 Ascl은 하기 서열 -GG/CGCGCC-에서 제한 효소에 의해 절단되는 제한 부위를 의미한다. 동일한 서열에서 절단하는 다른 제한 효소가 상호교환될 수 있다. 하나의 양태에서, 제1 및 제2 제한 부위는 동일하다. 하나의 양태에서, 제1 및 제2 제한 효소 부위는 각각 Ascl이다.
제한 효소 부위가 제1 및/또는 제2 또는 제3 제한 효소 부위로서 사용되는 하나의 양태에서, 게놈 DNA는 하나 이상의 위치에서 절단된다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스 게놈 또는 게놈 DNA(예를 들어, 5' 아암)에서 제한 부위는 예를 들어, 게놈의 위치 4628, 20891 및 27840 또는 이에 상응하는 위치에 위치하는 제한 부위 PspOMI를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 아데노바이러스는 EnAd이거나 게놈 DNA는 이로부터 유래한다.
하나의 양태에서, 제3 제한 부위는 하나의 유형의 제한 부위, 예를 들어, PspOMI를 말한다. 따라서, 하나의 양태에서, 3' 아암 및 5' 아암에서 제3 제한 부위는 동일하다. 3' 아암 및 5' 아암에서 제3 제한 부위의 서열이 동일한 경우, 이것은 셔틀 플라스미드를 제조하는 경우 5' 아암의 3' 말단의 3' 아암의 5' 말단으로의 연결을 촉진시킨다. 추가로, 셔틀 벡터는 이후에 상기 부위에서 절단되어 서열이 선형화될 수 있고 아데노바이러스 게놈을 포함하는 플라스미드와의 상동성 재조합을 촉진시키고, 예를 들어, 도 5를 참조한다.
하나의 양태에서, 제1 및 마지막 부위는 예를 들어, 도면에서 보여지는 바와 같이 셔틀 벡터를 제조하는데 활용된다.
하나의 양태에서, 제한 부위는 바이러스 게놈(예를 들어, EnAd 게놈)의 5' 말단 근처 및 또한 바이러스 게놈의 3' 말단 근처, 특히 3' 및 5' ITRS의 말단으로부터 약 4 내지 5 kb에 있도록 디자인되어 도 4에 보여지는 바와 같이 셔틀 벡터가 약 4 내지 5 kb의 3' 및 5' 아암을 갖도록 한다. 따라서, 하나의 양태에서, PspOMI는 5' 아암 및/또는 3' 아암에서 "제3 제한 부위"이다. 상기 쌍의 제한 부위는 게놈 DNA가 선형화되고 바이러스 게놈(예를 들어, EnAd 게놈)과 재조합되도록 하여 임의의 목적하지 않은 변형이 상기 게놈 서열에 도입되는 것 없이 플라스미드를 형성한다.
상기 양의 DNA는 셔틀 벡터와 바이러스 게놈, 예를 들어, EnAd 게놈 간에 효율적인 상동성 재조합을 가능하게 한다. 이들 디자인 기준은 또한 셔틀 벡터가 E1 유전자들 및 섬유 및 E4 유전자들을 함유하도록 보장하여 이들 유전자들 및 이들 유전자들 주변 영역들은 목적하는 바와 같이 전이유전자 카세트 삽입을 위해 조작될 수 있다.
하나의 양태에서, 제1 및 제2 제한 부위는 동일한 제한 효소에 대한 기질이고 제3 제한 부위는 상이한 제한 효소에 대한 기질이다.
하나의 양태에서, 제1 제한 부위는 제2 제한 부위와 상이한 제한 효소에 대한 기질이고 제3 제한 부위는 제1 및 제2 제한 부위들 각각과 상이한 제한 효소에 대한 기질이다.
본 발명자는 다른 아데노바이러스 게놈에서 하기의 적합한 제한 부위를 추가로 동정하였다.
Ad5에서, 효소 Sphl(-GCATG/C-)이 사용될 수 있다. 상기 제한 부위는 Ad5 게놈에서 위치 3661 및 31220에 위치한다. 이들 부위들은 E1B 유전자의 말단에 및 섬유 유전자의 개시부에 있고 셔틀 벡터 작제용의 3.6 kb 및 4.7 kb의 PCR 단편을 생성한다. 따라서, 이들 부위는 전이유전자가 E1 유전자로 또는 섬유 유전자에 인접하게 삽입될 수 있는 셔틀 벡터의 작제를 가능하게 한다.
Ad3, OvAd1 및 OvAd2에서, 부위 Asel(-AT/TAAT-)이 사용될 수 있다. 제한 부위는 Ad3 게놈내 위치 2469 및 31940에, OvAd1 게놈내 위치 2488 및 31724 및 OvAd2 게놈내 위치 2483 및 31949에 위치한다. 모든 게놈에 대해, 이들 부위들은 E1B 내 및 섬유 유전자 내부에 위치하고 셔틀 벡터 작제용의 2.5 kb 및 3.4 kb의 PCR 단편을 생성한다. 따라서, 이들 부위들은 전이유전자가 E1 영역으로 또는 섬유 유전자에 인접하게 삽입될 수 있는 셔틀 벡터의 작제를 가능하게 한다.
Ad11에서, Psil(-TTA/TAA-)이 사용될 수 있다. PspOMI, Sphl 및 Asel과 같지 않게, 상기 효소는 평활 컷터이다. Psil 제한 부위들은 Ad11 게놈에서 위치 2648 및 30890에 있다. 이들 부위들은 E1B 유전자내 및 섬유 유전자의 개시부에 있고 셔틀 벡터 작제용의 2.6 kb 및 4 kb의 PCR 단편을 생성한다. 상기와 같이, 따라서 이들 부위들은 본래의 제한 부위가 E1 영역내 또는 섬유 유전자에 인접하게 삽입될 수 있는 셔틀 벡터의 작제를 가능하게 한다.
3' 아암 및 5' 아암을 생성하기 위해 게놈의 5' 및 3' 말단을 증폭시키는 과정에서, 전형적으로 연결 제한 부위는 PCR 동안에 적합한 프라이머를 사용하여 첨가된다. 상기 동일한 연결 제한 부위는 증폭 동안에 세균 복제 오리진 및 선별 마커 유전자를 함유하는 벡터 단편으로 삽입된다. 상기 연결 제한 부위는 아데노바이러스 게놈의 세균 복제 오리진 및 선별 마커 유전자를 함유하는 벡터 단편으로의 연결을 허용하기 위해 디자인된다. 제1 제한 효소 부위, 제2 제한 효소 부위 및 제3 제한 효소 부위는 연결 제한 부위의 모든 예이다.
하나의 양태에서, 3' 아암 및 5' 아암에서 제3 제한 부위는 아데노바이러스 DNA를 함유하는 플라스미드에서 상응하는 위치에 있다. 하나의 양태에서, 5' 아암은 5' ITR의 업스트림에 도입된 연결 제한 부위를 갖고 3' 아암은 3' ITR의 다운스트림에 도입된 연결 제한 부위를 갖는다. 상기 제한 부위는 세균 복제 오리진 및 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터 단편의 절단을 가능하게 한다. 대안적으로 제1 및 제2 제한 효소 부위로서 공지된 이들 제한 부위는 플라스미드로부터 아데노바이러스 게놈의 절단을 가능하게 한다.
하나의 양태에서, 연결 제한 부위는 Asel이다. 동일한 서열에서 절단하는 다른 제한 효소는 상호교환가능하다.
단편
셔틀 벡터를 제조하기 위한 방법과 관련된 벡터 단편은 복제 오리진 및 선별 마커를 포함하는 DNA의 단편을 말한다. 하나의 양태에서, 벡터 단편은 2 내지 4 kb 영역의 길이이다. 벡터 단편은 3' 아암의 3' 말단과 연결되도록 정렬된 제1 제한 효소 부위를 갖는 벡터 단편의 5' 말단에서 개시한다. 이것은 추가로 낮은 카피의 세균 복제 오리진 및 선별 마커 유전자를 추가로 포함하고, 5' 아암의 5' 말단과 연결되도록 정렬된 제2 제한 효소를 갖는 벡터 단편의 3' 말단에서 종결된다. 하나의 양태에서, 상기 벡터 단편은 3 kb 이하이다. 이것은 복제 오리진 및 선별 마커 유전자를 포함시키기에 충분하다.
본원에 사용된 바와 같은 5' 아암은 예를 들어, 5' ITR(역위 말단 반복체)을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 5' 말단으로부터 수천개 염기쌍의 DNA 단편을 말한다. 아암의 정확한 길이는 적합한 제한 부위의 위치에 의해 결정된다. 하나의 양태에서, 5' 아암은 약 2 내지 5 kb 길이, 예를 들어, 약 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8 또는 4.9 kb 길이 영역에 있고, E1 부위, 예를 들어, 전체 E1 유전자 또는 E1 유전자가 결실되어 있거나 부분적으로 결실되어 있는 부위를 함유한다. 하나의 양태에서, 5' 아암은 예를 들어, EnAd 게놈의 5' 말단으로부터 4627개 염기쌍 길이이다.
상기 5' 아암은 (벡터 단편의 3' 말단과 연결되도록 상기 논의된 바와 같이 정렬된) 제2 제한 부위를 갖는 5' 말단에서 개시하고 5' ITR을 포함하고 (3' 아암의 5' 말단과 연결되도록 정렬된) 제3 제한 부위를 갖는 5' 아암의 3' 말단에서 종료한다.
하나의 양태에서, 5' 아암은 비-돌연변이된 E1 영역을 포함하고 따라서 복제 적격 바이러스의 제조에 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 5' 아암에서 아데노바이러스 게놈 DNA의 양은 ITR과 같이 최소이다. 하나의 양태에서, 5' 아암에서 아데노바이러스 게놈 DNA의 양은 100bp 내지 5 kb 범위에 있다. 본원에 사용된 바와 같은 3' 아암은 DNA 단편, 예를 들어, 3' ITR(역위 말단 반복체)을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 3' 말단으로부터 수천개 염기쌍을 말한다. 아암의 정확한 길이는 적합한 제한 부위의 위치에 의해 결정된다. 하나의 양태에서, 3' 아암은 약 3 내지 5 kb 길이, 예를 들어, 약 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8 또는 4.9 kb 길이 영역에 있고, 전체 섬유(L5) 유전자를 함유한다. 하나의 양태에서, 3' 아암은 예를 들어, EnAd의 3' 말단으로부터 4482개 염기쌍 길이이다.
3' 아암은 (예를 들어, 5' 아암의 3' 말단과 연결되도록 정렬된) 제3 제한 부위를 갖는 3' 아암의 5' 말단에서 개시하고 L5 유전자 및 3' ITR을 포함하고 (예를 들어, 벡터 단편의 5' 말단과 연결되도록 정렬된) 제1 제한 효소 부위를 갖는 3' 말단에서 종료한다.
하나의 양태에서, 3' 아암은 또한 L5로서 공지된 섬유 유전자를 함유한다. 유리하게 3' 아암에서 섬유 유전자를 함유하는 것이 레이트 유전자들의 조작을 가능하게 하고 바이러스의 가공에서 보다 유동성 있게 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "사이의 위치에서"는 특정 영역, 예를 들어, 하나의 특정 영역의 마지막 핵산 사이의 임의의 위치, 예를 들어, E3 부위, 및 L5 유전자와 같은 제2 특정 영역의 제1 핵산에 의한 경계되는 부분 또는 샌드위치되는 부분을 말한다. 이와 관련하여 제1 핵산은 관련 유전자/영역의 단편의 제1 핵산을 포함한다(즉, 전장 유전자의 제1 핵산으로 제한되지 않지만 차라리 소정의 작제물에서 유전자에 할당된 제1 존재하는 핵산을 언급한다). 하나의 양태에서, 상기 위치는 5'에서 3'의 방향으로 진행하는 경우 L5 유전자의 마지막 핵산과 E4 부위의 제1 핵산 사이에 있다.
본원에 사용된 바와 같은 L5 유전자와 인접한이란, E3 부위와 L5 유전자 사이의 위치 및/또는 L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치를 말한다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 제한 부위는 비-암호화 영역에 독립적으로 위치하거나 삽입된다. 하나의 양태에서, 삽입된 유전학적 물질은 L5 유전자의 기능을 변화시키지 않거나 차단하지 않는다.
L5 유전자와 인접하게 아데노바이러스 게놈으로 하나 이상의 전이유전자를 삽입하는 것이 특히 유리한데, 이는 상기 위치에서의 전이유전자가 바이러스 안정성 및 복제를 차단할 가능성이 적기 때문이다. 하나의 양태에서, L5 이후 위치한 유전자들은 메이져 레이트 프로모터의 제어 또는 E4 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 하나의 양태에서, L5 이후에 위치한 유전자들은 외인성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 하나의 양태에서, L5 앞에 위치한 유전자들은 메이져 레이트 프로모터 또는 E3 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 하나의 양태에서, L5 개시 코돈 직전에 위치한 유전자들은 메이져 레이트 프로모터의 제어하에 있을 수 있고 일반적으로 L5의 발현을 가능하게 하는 조절 요소를 함유할 필요가 있다.
일부 상황에서, 예를 들어, 전이유전자가 L5 유전자의 몇 개의 염기에 바로 인접하게 또는 이내에 있는, 섬유 유전자에 인접한 전이유전자의 삽입이 유리할 수 있다. 하나의 양태에서, 게놈의 E3 측면 상의 L5에 인접하게 있고 예를 들어, 섬유 후 부위와 비교하여 상이한 수준의 전이유전자 발현을 가능하게 한다.
하나의 양태에서, L5 유전자에 인접하게 전이유전자를 위치시키는 것은 또한 섬유 단백질의 발현의 조절을 가능하게 하고 이는 이어서 바이러스 활성의 조절을 가능하게 한다.
따라서, 하나의 양태에서, 상기 전이유전자는 예를 들어, 게놈의 E3 측면 상에, 게놈의 E4 측면 상에 또는 이 둘 다에서 섬유 유전자와 인접하게 위치하도록 삽입된다.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 전이유전자들은 게놈 DNA와 동일한 방향으로 독립적으로 삽입된다. 하나의 양태에서, 전이유전자 또는 전이유전자들은 독립적으로 게놈 DNA와 반대 방향으로 삽입된다.
하나의 양태에서, 3' 아암은 5'에서 3' 방향으로 섬유 유전자, 이어서 E4 부위, 예를 들어, E4 영역 또는 이의 단편; 및 이어서 ITR(역위 반복체 영역)을 포함한다.
하나의 양태에서, 3' 아암은 5'에서 3' 방향으로 E3 부위, 예를 들어, E3 영역, 이의 단편 또는 E3 부위(여기서, E3 영역은 결실되어 있다); 이어서 섬유 유전자; 이어서 E4 영역 또는 E4 부위로서 공지된 이의 단편, 이어서, ITR을 포함한다. 하나의 양태에서, 3' 아암은 2 kb 내지 5 kb의 범위에 있다. 하나의 양태에서, 특히 섬유의 E3 측면 상에 제한 부위, 예를 들어, Fsel 섬유 유전자에 인접하게 있다. 하나의 양태에서, 예를 들어, 섬유 유전자의 E4 측면 상에, 제한 부위, 예를 들어, Sgfl 및/또는 Sbfl이 섬유 유전자에 인접하게 있다. 하나의 양태에서, 섬유 유전자는 특히, 섬유의 E3 부위 상에 2개의 제한 부위, 예를 들어, Fsel에 의해 샌드위치되어 있고 Sgfl 및/또는 Sbfl은 예를 들어, 섬유 유전자의 E4 측면 상에 위치한다.
하나의 양태에서, E4 부위는 예를 들어, 본원의 도면, 실시예 및/또는 서열에서 개시된 위치에서 Acll 부위를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 5' 아암 및 3' 아암은 각각 대략 2 kb 내지 5 kb 길이와 같이 효율적인 상동성 재조합을 촉진시키기에 충분한 길이이다.
5' 아암 및/또는 3' 아암은 합성일 수 있다. 유리하게, 합성 5' 및/또는 3' 아암을 사용하여 본래의 제한 부위를 연결 전에 아암으로 도입하여 셔틀 벡터를 형성한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용에 따른 셔틀 벡터(예를 들어, EnAd 셔틀 벡터)에서, PspOMI는 제3 제한 효소 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은 PspOMI는 하기의 서열 -G/GGCCC-에서 제한 효소에 의해 절단되는 제한 부위를 말한다. 동일한 서열에서 절단하는 Apal 및 Bsp1201과 같은 다른 제한 효소는 상호교환가능하다.
하나의 양태에서, 하나 이상의 본래의 제한 부위를 아데노바이러스 셔틀 벡터로 도입하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 셔틀 벡터에서 2개의 절단 제한 부위 및 상기 부위들 사이의 DNA를 동정하는 단계,
b) 단계 a)에서 동정된 절단 제한 부위에서 셔틀 벡터를 분해하여 DNA의 분절을 절단하는 단계,
c) 하나 이상의 본래의 제한 부위를 추가로 포함하는, 단계 b)로부터 절단된 셔틀 벡터 분절과 실질적으로 동일한 DNA 단편을 합성하는 단계,
d) 단계 b)로부터 분해된 셔틀 벡터 및 단계 c)로부터의 DNA 단편을 정제하는 단계,
e) 단계 d)로부터의 DNA 단편과 단계 d)로부터의 셔틀 벡터를 연결시키는 단계 및
f) 선택 배지상에서 성장하는 세포를 상기 연결된 셔틀 벡터로 형질전환시키고 상기 콜로니를 스크리닝함에 의해 올바르게 어셈블리된 셔틀 벡터를 동정하는 단계.
하나의 양태에서, 절단 제한 부위는 Acll이다. 동일한 서열에 절단하는 다른 제한 효소는 상호교환가능하다. 본원에 사용된 바와 같은 Acll은 하기의 서열 -AA/CGTT-에서 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 의미한다.
Acll은 PspOMI와 함께 사용하여 본래의 제한 부위를 ColoAd1 셔틀 벡터에 삽입시키는데 그 이유는 이들이 섬유 유전자를 플랭킹하여 상기 영역의 절단 및 절단된 영역과 실질적으로 동일한 DNA 단편의 삽입을 가능하게 하기 때문이다.
연결
본원에 사용된 바와 같은 1-단계 3개-방식 연결은 단일 단계에서 함께 연결되어 환형 DNA를 형성하는 3개의 DNA 서열을 말한다. 하나의 양태에서, 스크리닝은 적당한 배향으로 모든 3개의 서열로 구성된 DNA 셔틀 벡터를 확립하기 위해 수행된다.
본원에 사용된 바와 같은 적당한 배향은 본 발명에 따른 아데노바이러스를 재어셈블리하고/작제하는데 사용하기에 적합한 배향을 언급하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 동등 비율은 사용되는 DNA 단편(서열)의 비율이 전체 용적 또는 농도가 다양한 경우에도 대략 동일함을 말한다. 하나의 양태에서, 동등한 비율은 벡터 단편, 5' 아암 및 3' 아암의 1:1:1 비율을 말한다. 본원에 사용된 바와 같은 연결 비율은 연결될 DNA 단편들이 제공되는 비율 또는 비를 의미한다.
하나의 양태에서, 단편 각각에 사용되는 제1 및 제2 제한 효소가 동일하고 벡터 단편은 1단계 3개-방식 연결 전에 탈인산화된다.
본원에 사용된 바와 같은 탈인산화된은 포스페이트(P04 3 ~) 그룹이 가수분해에 의해 DNA로부터 제거됨을 말한다. 유리하게, 탈인산화는 서로 연결되는 것과는 반대로 상이한 DNA 단편(전형적으로 탈인산화되지 않은)과 연결되도록 자유로운 상태로 있는 DNA 단편의 5' 말단 및 3' 말단의 가능성을 증가시킨다. 하나의 양태에서, 탈인산화는 후속적 연결 단계의 성공을 증가시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 연결 또는 연결하는은 예를 들어, 리가제 효소를 사용한 DNA 분자의 2개 말단의 공유 결합을 말한다.
하나의 양태에서 1단계 3개-방식 연결은 2부 DNA 리가제, 4부 리가제 완충제 및 5' 아암, 3' 아암 및 벡터 단편 각각 2부를 사용한다.
본원에 사용된 바와 같은 부는 이의 절대량이 다양할 수 있는 용적과 같은 양이 혼합물 중 전체 비율로 제공되는 경우 동일한 상태로 남아 있음을 언급하고, 예를 들어, 여기서, 1부는 10ml에 이어서 20ml의 DNA 리가제, 40mls의 리가제 완충제 및 20ml의 5' 아암 및 20ml의 3' 아암이 사용된다.
하나의 양태에서, 약 2 ㎕의 용출된 DNA는 약 40 ng의 DNA를 함유한다. 하나의 양태에서, 약 120 ng의 DNA가 연결된다. 하나의 양태에서, 연결된 120 ng의 DNA는 5' 아암, 3' 아암 및 벡터 단편 각각 약 40 ng으로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은 DNA 리가제는 포스포디에스테르 결합의 형성을 촉매함에 의해 DNA 분자를 연결하는(연결을 촉진시키는) 효소를 말한다. 하나의 양태에서, DNA 리가제는 T4 DNA 리가제이다. T4 DNA 리가제는 박테리오파아지 T4로부터 유래된 효소이다.
본원에 사용된 바와 같은 리가제 완충액은 완충 용액, 예를 들어, 염화마그네슘 및 ATP, 예를 들어, 50 mM Tris-Hcl, l0 mM MgCl2　및 1 mM ATP를 함유하는 완충 용액을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 환형화된 또는 환형은 DNA의 선형 조각의 말단이 환형 또는 루프를 형성하기 위해 연결되어 있음을 말한다.
하나의 양태에서, 1단계 3개-방식 연결은 적어도 30분 동안, 예를 들어, 적어도 50분 동안, 예를 들어, 약 1시간, 보다 구체적으로 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70분 동안 수행된다.
하나의 양태에서, 1단계 3개-방식 연결은 대략적으로 실온에서, 예를 들어, 약 15 내지 25 ℃, 예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 ℃에서 수행되고, 바람직하게는 16 내지 24 ℃이다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스 셔틀 벡터를 제조하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 아데노바이러스 게놈에서 적합한 제한 부위를 동정하는 단계,
b) 예를 들어, 게놈의 5' 말단 및 3' 말단을 증폭시키고 여기에 ITR의 업스트림에 각각의 말단에서 연결 제한 부위를 삽입함에 의해 5' PCR 아암 및 3' PCR 아암을 생성시키는 단계,
c) 낮은 카피의 세균 복제 오리진 및 선택 마커 유전자 및 종결 연결 제한 부위를 갖는 벡터 단편을 선택하고 증폭시키고 5' 아암 및 3' 아암으로의 연결을 가능하게 하는 연결 제한 부위에서 종결시키는 단계,
d) 약 37 ℃에서 약 2시간 동안 단계 b)로부터 5' PCR 아암 및 3' PCR 아암을 이중 분해시키는 단계(여기서, 상기 이중 분해는 완충액, 제한 효소 및 뉴클레아제가 없는 물에서 일어나고 이어서 약 20분 동안 약 65 ℃에서 열 불활성화시켜 5' 아암 및 3' 아암을 수득한다),
e) 약 37 ℃에서 약 2시간 동안 단계 b)로부터 벡터 단편을 단일 분해시키는 단계(여기서, 상기 단일 분해는 완충액, 제한 효소 및 뉴클레아제가 없는 물에서 일어나고 이어서 약 1시간 동안 약 37 ℃에서 알칼린 소 포스파타제로 처리한다),
f) 약 0.8 % 아가로스 겔 상에서 단계 d) 및 e)의 분해 생성물의 전체 용적을 분리시키고, 겔 정제하고 용출 완충액 중에서 용출시키는 단계,
g) 5' 아암, 3' 아암 및 벡터 단편의 1:1:1 연결 비율로 실온에서 약 1시간 동안 DNA 리가제 및 리가제 완충액을 사용한 1단계 3개-방식 연결에서 단계 f)로부터 분해된 3' 아암, 5' 아암 및 벡터 단편을 연결시키는 단계, 및
h) 선택 배지 상에서 성장하는 세포를 연결된 셔틀 벡터로 형질전환시키고 콜로니를 스크리닝함에 의해 올바르게 어셈블리된 셔틀 벡터를 동정하는 단계.
하나의 양태에서, 상기 방법에서의 단계 a)는 임의적이고 3' 아암 및/또는 5' 아암이 요구되는 제한 부위 및/또는 전이유전자와 함께 합성된다.
하나의 양태에서, EnAd 셔틀 벡터를 제조하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 아데노바이러스 게놈에서 적합한 제한 부위를 동정하는 단계,
b) 게놈의 5' 말단 및 3' 말단을 증폭시켜 5' PCR 아암 및 3' PCR 아암을 생성하고 ITR의 각각의 말단 업스트립에 연결 제한 부위를 삽입하는 단계,
c) 낮은 카피의 세균 복제 오리진 및 선택 마커 유전자 및 말단 연결 제한 부위를 갖는 벡터 단편을 선택하고 증폭시키고 5' 아암 및 3' 아암으로의 연결을 허용하는 연결 제한 부위에서 종료시키는 단계,
d) 단계 b)로부터의 20 ㎕의 DNA, 4 ㎕의 완충액 4, 2 ㎕의 Ascl, 2 ㎕의 PspOM1 및 8 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물 또는 이의 등가물을 사용하여 37 ℃에서 2시간 동안 5' PCR 아암 및 3' PCR 아암을 이중 분해시킴에 이어서 20분 동안 65 ℃에서 열 불활성화하여 5' 아암 및 3' 아암을 수득하는 단계,
e) 단계 b)로부터의 20 ㎕ DNA, 4 ㎕의 완충액 4, 2 ㎕의 Ascl 및 8 ㎕ 뉴클레아제가 없는 물 또는 이의 등가물의 농도에서 37 ℃에서 2시간 동안 벡터 단편을 단일 분해시킴에 이어서 1시간 동안 37 ℃에서 1 ㎕의 알칼린 소 포스파타제로 처리하는 단계,
f) 0.8 % 아가로스 겔 상에서 단계 d) 및 e)의 분해 생성물의 전체 용적을 분리하고 겔 정제하고 40 ㎕의 용출 완충액 또는 이의 등물에서 용출시키는 단계,
g) 5' 아암, 3' 아암 및 벡터 각각 2 ㎕에서 1:1:1 연결 비율로 실온에서 1시간 동안 2 ㎕의 T4 DNA 리가제 및 4 ㎕의 리가제 완충액을 사용하여 1 단계 3개-방식 연결로 분해된 3' 아암, 5' 아암 및 단계 f)로부터의 벡터 단편을 연결시키는 단계, 및
h) 선택 배지 상에서 성장하는 세포를 상기 연결된 셔틀 벡터로 형질전환시키고 콜로니를 스크리닝함에 의해 올바르게 어셈블리된 셔틀 벡터를 동정하는 단계.
하나의 양태에서, 상기 방법에서 단계 a)는 임의적이고 3' 아암 및/또는 5' 아암은 요구되는 제한 부위 및/또는 전이유전자와 함께 합성된다.
당업자는 또 다른 완충액, 리가제 및 용적이 사용될 수 있고 상기 비가 절대 용적보다 중요함을 인지할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 증폭시킴은 전형적으로 PCR을 사용하여 예를 들어, 여러 크기 정도에 걸쳐 단일 또는 여러 카피의 DNA 조각을 증가시켜 수천 내지 수백만 카피의 특정 DNA 서열을 생성시키는 공정을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 단일 분해는 DNA 서열내 소정의 부위를 표적화하는 것으로 공지된 단일 제한 효소로 상기 DNA를 분해시킴을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 이중 분해는 DNA 서열내 상이한 부위를 표적화하는 것으로 공지된 2개의 상이한 제한 효소로 DNA를 분해시킴을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 올바르게 어셈블리된은 DNA 조각들이 목적하는 셔틀 벡터를 제공하도록 의도된 바와 같은 올바른 배향 및 위치로 연결되어 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 형질전환은 이의 주변으로부터 외인성 유전학적 물질(외인성 DNA)의 직접적인 취득, 혼입 및 발현으로부터 비롯된 세포의 유전학적 변형을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 성장은 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 배양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 스크리닝은 목적하는 성질을 갖는 세포 및/또는 DNA 작제물을 동정함을 의미한다. 사용된 전형적인 방법은 제한 부위들에 걸친 프라이머, 제한 분해물들, DNA 서열분석을 사용한 PCR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 업스트림은 판독 방향(즉, 5'에서 3'로)에서 이전을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 다운스트림은 판독 방향(즉, 5'에서 3'로)에서 이후를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 절단은 제거를 의미한다.
하나의 양태에서, 상기 플라스미드 또는 셔틀 벡터는 DNA 작제물에 도입된 하나 이상의 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 합성은 예를 들어, DNA 단편이 자동화 합성에서와 같은 합성 화학 기술에 의해 제조됨을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 DNA 단편은 본원에 개시된 방법에 의한 조작 후 수득된 DNA 조각, 특히 아데노바이러스 게놈 DNA 또는 DNA 서열의 일부를 말한다. 하나의 양태에서, 사일런트 염기 변화는 내성이다.
본원에 사용된 바와 같은 사일런트 염기 변화는 유전학적 코드의 중복으로 인해 암호화된 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드 변화를 말한다.
후속적으로, 본원에 사용된 바와 같은 동일한 이란, DNA 단편이 하나 이상의 신규 제한 부위의 첨가를 위한 셔틀 벡터 세이브 조각과 동일함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 정제는 예를 들어, 목적하지 않은 DNA를 제거함에의해 목적하는 DNA를 오염 제거시킴을 말한다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 예를 들어, 이의 보다 큰 양을 수득하기 위해 본 발명의 개시내용의 셔틀 벡터를 증폭시키는 추가의 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 연결된 DNA로 세균 세포 또는 세포들을 형질전환시키고, 예를 들어, 약 120 ng의 연결된 DNA로 형질전환시킨다. 하나의 양태에서, 세균 세포는 울트라적격 세균 세포, 예를 들어, 제조원(Agilent)로부터 가용한 XL-10이다. 대안적으로, 셔틀 벡터와의 상동성 재조합에 의해 제조된 플라스미드는 예를 들어, 이. 콜리에서 복제될 수 있고 따라서, 셔틀 벡터의 어셈블리를 반복할 필요성이 회피된다.
셔틀 벡터내 DNA 단편의 대체
하나의 양태에서, 상기 방법은 예를 들어, 특히 제한 부위 및/또는 전이유전자를 도입하기 위해 동일한 절편의 절단 후 DNA 단편을 셔틀 벡터로 연결시키는 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, 사용되는 비율은 각각 3:1의 DNA 단편 대 셔틀 벡터 연결이다. 본원에 사용된 바와 같은 3:1의 단편 대 셔틀 벡터 연결 비율은 DNA 단편 3부 대 셔틀 벡터 1부를 의미한다.
하나의 양태에서, 상기 DNA 단편은 합성 또는 PCR 생성물이다. 본원에 사용된 바와 같은 PCR 생성물은 DNA 단편이 PCR을 사용하여 제조됨을 의미한다.
셔틀 벡터를 변형시키는 추가의 세부 사항은 실시예 및 도면에 나타낸다.
따라서, 본 발명의 개시내용은 필수적으로 모듈러이고 당업자가 원하는대로 아데노바이러스 게놈을 조작할 수 있게 하는 아데노바이러스 셔틀 벡터 및 플라스미드를 처음으로 제공한다.
플라스미드의 제조
본원에 사용된 바와 같은 플라스미드는 세포 내에서 염색체 DNA와는 물리적으로 분리되어 있고 이로부터 독립적으로 복제할 수 있는 작은 DNA 분자를 말한다. 본 발명의 개시내용의 목적을 위해, 플라스미드는 일반적으로 세균 복제 오리진 및 선택 마커 유전자를 포함하는 벡터 단편으로 연결된 실질적으로 모든 아데노바이러스 게놈을 포함하는 환형 DNA 벡터이다(도 2 참조).
일반적으로, 본 발명의 개시내용에 따른 플라스미드는 선형화된 셔틀 벡터와 아데노바이러스 게놈과의 상동성 재조합에 의해 제조된다. 이와 관련하여 아데노바이러스 게놈은 모든 또는 거의 모든 아데노바이러스 게놈을 말한다. 당업자는 상기 단계가 아데노바이러스를 재어셈블리하는 부분이고 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 작제물을 실현하기 위한 전구 단계임을 알 것이다. 따라서, 재조합 단계에서 사용되는 아데노바이러스 게놈은 일반적으로 아마도 최종 아데노바이러스에 있는 전이유전자를 제외하고는 모든 기능성 요소들을 포함한다. 하나의 양태에서, 상동성 재조합을 수행하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 제3 제한 효소 부위에서 분해시킴에 의해 셔틀 벡터를 선형화시키는 단계,
b) 전기컴피턴트 세포에서 선형화된 셔틀 벡터와 아데노바이러스 게놈과의 상동성 재조합을 수행하는 단계,
c) 세포를 선택 배지상에서 성장시키고 콜로니를 스크리닝함에 의해 올바르게 재조합된 플라스미드를 동정하는 단계.
본원에 사용된 바와 같은 선형화는 전형적으로 단일 제한 효소로 DNA 작제물을 분해시킴에 의해 환형 DNA를 선형 DNA로 제조하는 공정을 말한다.
하나의 양태에서, 상동성 재조합은 3.5:1.5 셔틀 벡터 대 게놈 비율로 수행한다.
본원에 사용된 바와 같은 전기컴피턴트는 전기천공에 의해 형질전환된 세포를 의미한다. 적합한 전기컴피턴트 세포는 BJ5183 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 올바르게 재조합된은 상동성 재조합을 진행한 플라스미드가 목적하는 DNA 서열을 수득함을 의미한다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 목적하는 제한 부위에서 전이유전자 카세트를 플라스미드로 도입하는 추가의 단계를 포함한다. 목적하는 제한 부위는 전이유전자 카세트의 삽입이 용이한 위치에서 게놈 내에 존재하는 것으로 동정된 부위를 말한다. 전형적으로 목적하는 제한 부위는 본원에 개시된 방법에 의해 셔틀 벡터 및/또는 플라스미드로 도입된 본래의 제한 부위이다.
하나의 양태에서, 전이유전자 카세트의 플라스미드로 도입하는 단계는 선형화된 플라스미드와 전이유전자 카세트 간의 연결을 수행함을 포함한다.
하나의 양태에서, 전이유전자 카세트를 플라스미드로 도입하는 단계는:
- 플라스미드 및 전이유전자 카세트를 선형화시키고,
- 상기 선형화된 DNA를 분리하고,
- 상기 분리된 선형화된 DNA를 정제하고,
- 상기 플라스미드 및 전이유전자 카세트를 연결하고,
- 상기 연결된 DNA를 예를 들어, 이. 콜라이로 형질전환시키고,
- 올바르게 형질전환된 콜로니를 선택하는 단계를 포함한다.
본워에 사용된 바와 같은 전이유전자 카세트는 예를 들어, 전이유전자가 어디서 언제 활성인지를 결정할 조절 서열인 프로모터, 또는 mRNA 분자가 스플라이스좀에 의해 언제 절단되는지를 결정하는 조절 서열인 스플라이스 부위, 일반적으로 폴리A 서열 및 종료 서열을 임의로 함유하는 목적하는 단백질에 대한 cDNA로부터 유래되는 단백질 암호화 서열(즉, 전이유전자)을 임의로 함유하는 DNA 분절을 말한다. 도 7은 포괄적 전이유전자 카세트를 나타낸다.
하나의 양태에서, 전이유전자 카세트는 외인성 프로모터, 예를 들어, 포유동물 프로모터를 포함한다.
하나의 양태에서, 전이유전자 카세트는 내부 리보솜 진입 서열과 같은 조절 요소를 포함한다.
하나의 양태에서, 전이유전자 카세트는 폴리A 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 바이러스 또는 바이러스 벡터는 복제 오리진 및 선택 마커 유전자를 포함하는 벡터 단편 DNA를 절단하기 위해 서열의 3' 및 5' 말단에서 제한 효소로 게놈을 절단시킴에 의해 플라스미드로부터 회수될 수 있다. 하나의 양태에서, 동일한 제한 효소가 양쪽 부위를 절단한다. 선형화된 DNA는 이어서 HEK293 세포와 같은 적합한 숙주 세포로 삽입되어 최종 바이러스 또는 바이러스 벡터를 제조할 수 있다.
전이유전자
하나의 양태에서, 전이유전자 카세트내 하나 이상의 전이유전자들은 하기로부터 선택된다:
치료학적 단백질, 펩타이드 또는 RNA, 예를 들어, 항체 또는 항체 도메인, 프로-드럭 전환 효소, 면역조절제, 효소, siRNA, 전사 인자, 세포내 시그날 전달 또는 표면 막 단백질 또는 항원을 암호화하는 목적하는 치료학적 유전자.
본원에 사용된 바와 같은 항체는 세균 및 바이러스와 같은 외래 병원체를 동정하고 중화시키기 위해 면역계에 의해 사용되는 B-세포에 의해 제조되는 대형 Y형 단백질을 의미한다. 상기 항체는 외래 항원의 특정 부분을 인지한다. 광범위한 상이한 형태의 항체가 사용될 수 있고 모노크로날 항체, 폴리클로날 항체, 디아바디, 키메라 항체, 인간화된 항체, 이- 및 삼-특이적 항체, 낙타 항체, Fab 단편, Fc 단편 및 단일쇄 Fv(ScFv) 항체를 포함하는 Fv 분자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 프로-드럭은 체내에서 흔히 정상 대사 과정 또는 적당한 효소의 사용에 의해 활성 생리학적 제제로 후속적으로 전환되는 불활성(또는 완전한 활성 미만인 활성) 유도체로서 투여되는 분자를 말한다. 따라서, 프로-드럭은 의도된 약물의 전구체 유형으로서 작용한다. 프로-드럭 전환 효소는 프로-드럭을 이의 생리학적 활성 형태로 전환시키는 효소로서 작용한다. 하나의 양태에서 본 발명의 개시내용에 따른 바이러스 작제물은 프로-드럭 및 적당한 전환 효소를 암호화하고 생체내 발현한다.
본원에 사용된 바와 같은 면역조절제는 면역 반응의 조절제를 의미한다. 면역조절제는 면역강화, 면역억제 또는 면역학적 내성의 유도에서와 같이 목적하는 방향 또는 목적하는 수준으로 면역 반응의 질 및 양을 조정하는 기능을 한다. 하나의 양태에서, 면역조절제는 면역자극제, 예를 들어, 보강제, 예를 들어, CpG가 풍부한 DNA 서열이다.
본원에 사용된 바와 같은 효소는 특이적 화학 반응을 촉매하기에 적합한 단백질을 언급하고, 예를 들어, 그 자체가 공정에서 변형되는 것 없이 화학적 반응이 진행되는 속도를 조절한다. 하나의 양태에서, 효소는 생존 유기체에서 반응을 촉매할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 리포터 유전자는 진핵 세포에서 용이하게 검출되는 생성물을 생성하고 목적하는 유전자의 존재 또는 활성을 결정하기 위해 마커로서 사용될 수 있는 유전자를 말한다. 하나의 양태에서, 리포터 유전자 DNA는 목적하는 DNA 서열과 밀접하게 연결되거나 조합된다. 하나의 양태에서, 리포터 유전자는 예를 들어, 루시퍼라제 및 GFP와 같은 형광 단백질이다.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 예를 들어, 다음과 같지만 이에 제한되지 않는 시험관내 이미지화 및 위치화에 대한 리포터 유전자를 암호화한다: 요오드화나트륨 심포터(NIS), 세포내 금속단백질(예를 들어, 페리틴, 티로시나제), 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 티미딘 키나제(HSVl-tk), GFP 및 다른 형광단, 루시퍼라제, 에스트로겐 수용체 및 다른 유도가능한 리포터 유전자.
하나의 양태에서, 전이유전자는 루시퍼라제 또는 eGFP와 같은 리포터 유전자 또는 이미지화제가 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 외인성 포유동물 프로모터는 일반적으로 유전자의전사를 조절하는, 목적하는 유전자의 업스트림에 위치한 DNA 요소를 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 조절 요소는 메이져 레이트 프로모터와 같은 내인성 프로모터의 사용을 허용하는 DNA 서열, 또는 발현, 예를 들어, 다중 유전자의 발현을 조절하는 다른 DNA 서열, 예를 들어, 폴리시스트론 서열을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 내부 리보솜 진입 서열(IRES)은 전령 RNA(mRNA) 서열의 중앙에서 해독 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 폴리A 서열은 일반적으로 일단 전사되면 순수 mRNA 분자를 절단하고 폴리아데닐화시키는 다중단백질 복합체에 의해 인지될 수 있는 AATAAA 부위를 함유하는 DNA 서열을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 목적하는 (치료학적) 유전자는 예를 들어, 발현 후 약리학적 효과(일반적으로 이로운 생리학적 효과)를 생성시키기 위해 적합한 유전자를 의미하고, 특히 상기 활성은 암세포 용해 바이러스 활성과 같이 본 발명의 개시내용의 DNA 작제물 또는 아데노바이러스의 용도 또는 치료요법을 증진시킬 수 있다.
상이한 범위 유형의 전이유전자(및 이의 조합)가 고려되고 이는 이들 자체가 종양 또는 면역 반응을 조절하는 작용을 하고 치료학적으로 작용하거나 치료학적 분자의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하거나 활성화하거나 증진시키는 제제인 분자를 암호화하는 것으로 고려된다. 암호화될 수 있는 분자들은 단백질 리간드 또는 리간드의 활성 결합 단편, 항체(예를 들어, 전장 또는 단편, 예를 들어, Fv, ScFv, Fab, F(ab)'2 또는 보다 작은 특이적 결합 단편), 또는 다른 표적-특이적 결합 단백질 또는 펩타이드(예를 들어, 파아지 디스플레이 등과 같은 기술에 의해 선택될 수 있는 것과 같이), 천연 또는 합성 결합 수용체, 리간드 또는 단편, 표적물을 암호화하는 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 특이적 분자, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA 분자, 전사 인자 등을 포함한다. 분자는 예를 들어, 이들의 활성, 안정성, 특이성 등을 증진시키기 위해 다른 펩타이드 서열과 융합 단백질 형태일 수 있다. 하나의 양태에서, 리간드는 이량체를 형성하고 안정성을 증진시키거나 이펙터 기능을 제공하기 위해 면역글로불린 Fc 영역과 융합될 수 있다. 하나의 양태에서, 전이유전자는 수지상 세포와 같은 항원 제공 세포에 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-DEC-205, 항-만노스 수용체, 항-덱틴과 융합된 실체를 갖는 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 하나의 양태에서, 삽입체는 또한 예를 들어, 본 발명에 따른 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터로 감염된 세포를 검출하거나, 종양을 이미지화하거나 림프구 및 림프절 등을 인출하는데 사용될 수 있는 리포터 유전자를 암호화할 수 있다.
하나의 양태에서, 암호화된 단백질은 인간, 예를 들어, 하기 열거된 분자에 대한 인간 항체 또는 천연 리간드, 또는 이들을 표적화하는 siRNA 분자, 또는 종양 항원이다.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 T-세포 동시작극 수용체 또는 이들의 리간드를 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: OX40, OX40 리간드, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 리간드(CD40L), CD137, GITR, 4-1BB, ICOS, ICOS 리간드.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 T-세포 동시-억제 분자 또는 이들의 리간드(체크포인트 억제 수용체 및 리간드)를 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: 세포독성 T 림프구 관련 항원-4(CTLA-4), 프로그램화된 세포사-1(PD-1), PD-리간드-1(PD-L1, 또한 B7-H1로서 공지된), PD-리간드-2(PD-L2, 또한 B7-DC로서 공지된), 다른 B7 수용체 슈퍼패밀리 구성원, 예를 들어, B7-H3, B7-H4, 헤르페스 바이러스 진입 매개체(HVEM), 억제 수용체 Ig-형 전사체-3(ILT-2), ILT-3, ILT-4, T-세포 면역글로불린 뮤신 단백질-3(TIM-3), 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3), B 및 T 림프구 역독화인자(BTLA), LIGHT(림프구독소에 상동성이고 유도성 발현을 나타내고 T 림프구에 의해 발현되는 수용체인 헤르페스 바이러스 진입 매개체에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁한다), CD160.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같이 조절 T-세포(천연 및 유도된 Tregs, Tr1 등), 골수 유래 서프레서 세포(MDSCs) 및 다른 면역억제 면역 세포에 의해 발현되는 분자를 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b, 및 갈렉틴 -3.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 수지상 세포(및 다른 항원-제공 세포) 수용체 또는 이들의 리간드를 암호화지만 이에 제한되지 않는다: Fms-관련된 티로신 키나제 3(FLT-3), FLT-3 리간드, 톨형 수용체(TLR) 및 이들의 리간드(예를 들어, TLR-9, TLR-5에 대한 리간드로서 플라겔린), CCR7 (CD197), CDla, CD1c(BDCA-1), CD11b, CD11c, CD80(B7-1), CD83, CD86(B7-2), CD123(IL-3Rα), CD172a(SIRPα), CD205(DEC205), CD207(랑게린), CD209(DC-SIGN), CD273(B7-DC), CD281(TLR1), CD283(TLR3), CD286(TLR6), CD289(TLR9), CD287(TLR7), CXCR4(CD184), GITR 리간드, IFN-α2, IL-12, IL-23, ILT1 (CD85h), ILT2(CD85j), ILT3(CD85k), ILT4(CD85d), 27D6 5148, 42D1 5149, ILT5(CD85a), ILT7(CD85g), TSLP 수용체, CD141(BDCA-3), CD303(CLEC4c, BDCA-2), CADM1(NECL2), CLEC9a, XCR1, CD304(뉴로필린-1, BDCA-4).
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 항원 프로세싱 및 제공 매개체를 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: MHC 부류 II 트랜스활성화인자(CTIIA), 감마-IFN-유도성 리소좀 티올 리덕타제(GILT).
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 사이토킨 또는 이들의 수용체를 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: 인터류킨-1α(IL-1α), IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35. 인터류킨-2(IL-2), IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1 수용체 길항제(IL-1RA), 인퍼페론-α(IFNα), 인터페론-β (IFNP), 인터페론 γ(IFN γ), 종양 괴사 인자-α(TNFα), 형질전환 성장 인자-β(TGFp-상이한 서브타입), 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 인자(GM-CSF).
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 케목킨 또는 케목킨 수용체를 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: 인터류킨-8(IL-8), CCL5 (RANTES), CCL17, CCL22, CCL20, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CRTH2.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 전사 인자 또는 다른 전사 조절인자들을 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: STAT3, STATl, STAT4, STAT6, CTI IA, MyD88, NFκB 패밀리 구성원.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 프로-드럭 전환 효소 또는 다른 효소를 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: 사이토신 데아미나제 및 티로신 키나제.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 세포내 트래픽킹 분자 또는 세포 기능의 조절인자를 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: 열 쇼크 단백질-70(HSp70), 세포 생존 및 사멸의 조절인자(예를 들어, 수르비빈).
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 종양 세포 또는 종양 미세환경 수용체 및 생성물을 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: EGF 리간드 & 수용체: 암피레굴린, 베타셀루인(BTC), 뉴로레굴린-1a(NRG1a), NRG1b, NRG3, 형질전환 성장 인자-α(TGFα), LRIG1(류신 풍부 반복체 및 Ig-형 도메인-함유-1), LRIG3, EGF, EGF-L6, 에피겐(Epigen), HB-EGF, EGFR(ErbBl), Her2(ErbB2), Her3(ErbB3), Her4(ErbB4).
하나의 양태에서, 다음과 같은 분자의 패밀리에 대한 리간드 및 수용체이지만 이에 제한되지 않는다: 헤지호그, FGF, IGF, Wnt, VEGF, TNF, TGFb, PDGF, Notch.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 세포내 종양 세포 효소를 암호화지만 이에 제한되지 않는다: 인돌아민 2,3 디옥시게나제(IDO).
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 다음과 같은 면역 세포에 의한 인지를 위한 항원들을 암호화하지만 이에 제한되지 않는다: 항원(예를 들어, 사이토메갈로바이러스 항원, 인플루엔자 항원, B형 간염 표면 및 코어 항원, 디프테리아 독소, Crml97, 파상풍 독소)으로서, 감염성 유기체 기원의 외래 면역원성 단백질, 공지된 T-세포 또는 항체 에피토프인 상기 항원으로부터 유래된 펩타이드 또는 상기 항원들의 유전학적으로 가공된 혼성물 또는 다량체.
하나의 양태에서, 전이유전자 또는 유전자들은 항원으로서 종양-유래된 단백질, 공지된 T-세포 또는 항체 에피토프인 상기 항원으로부터 유래된 펩타이드. 또는 상기 항원의 유전학적으로 가공된 혼성물 또는 다량체를 암호화한다. 상기 항원은 예를 들어, WT1, MUC1, LMP2, 유전자형, HPV E6&E7, EGFRvlll, HER-2/neu, MAGE A3, p53 비돌연변이체, p53 돌연변이체, NY-ESO-1, GD2, PSMA, PCSA, PSA, gp100, CEA, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, 프로테이나제 3(PR1), bcr-abl, 티로시나제, 수르비빈, PSA, hTERT, 육종 전위 브렉포인트, EphA2 PAP ML-IAP AFP EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, TRP-2, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔린, PSCA, MAGE A1, sLe(a), CYP1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 카보닉 언하이드라제 IX, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-β, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1을 포함할 수 있다(Cheever et al 2009).
본원에 사용된 바와 같은 pNG-62는 ColoAd2.4 게놈 및 GFP 암호화 유전자를 포함하는 전이유전자 카세트를 포함하는 플라스미드를 의미한다(참조: 서열번호 35, 도 30 참조).
아데노바이러스의 제조
본 발명의 개시내용은 또한 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서, 어얼리 유전자들, 예를 들어, 바이러스 복제를 위해 필수적인 것들, 특히, E1 및/또는 E3은 바이러스 복제에 필수적인 유전자들이 의도된 목적에 따라 결실된 온전하거나 아데노바이러스 벡터를 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시내용은 생 암세포 용해 바이러스의 유전학적 가공을 촉진시키고, 예를 들어, 이전에 가능하지 않았던 영역에서 이들에게 치료학적 단백질을 무장시키는 능력을 촉진시킨다. 본 발명의 개시내용에 따른 최종 아데노바이러스는 적당한 제한 효소로 플라스미드로부터 게놈 DNA를 절단함에 이어서, 예를 들어, 연결 단계에 의해 게놈을 완성하고 환형화시켜 제공될 수 있다. 따라서, 복제 오리진 및 선택 마커 유전자를 포함하는 벡터 단편 DNA를 절단하기 위해 서열의 3' 및 5' 말단에서 제한 효소로 게놈을 절단시킴에 의해 플라스미드로부터 회수될 수 있다. 하나의 양태에서, 동일한 제한 효소는 양쪽 부위를 절단한다. 이어서 선형화된 DNA는 최종 바이러스 또는 바이러스 벡터를 제조하기 위해 HEK293 세포와 같은 적합한 숙주 세포로 삽입될 수 있다.
셔틀 벡터, 플라스미드 및 아데노바이러스
하나의 양태에서, 예를 들어, 개시내용의 방법으로부터 기원하는 중간체로서 수득할 수 있는 아데노바이러스 셔틀 벡터가 제공된다.
본 발명의 개시내용의 셔틀 벡터는 바이러스 섬유 유전자를 함유하는 3' 아암을 포함한다. 상기 방법과 관련하여 상기 제공된 셔틀 벡터의 세부사항은 또한 셔틀 벡터 자체의 양태와 관련된다. 본 발명의 개시내용의 셔틀 벡터는 예를 들어, 약 9 Kb 내지 약 11.9 Kb의 범위의 상대적으로 대량의 아데노바이러스 게놈 DNA를 함유한다. 하나의 양태에서, 50 % 이상, 예를 들어, 60, 70, 75 또는 80 %의 셔틀 벡터는 아데노바이러스 게놈 DNA이다. 하나의 양태에서, 전체적으로 셔틀 벡터는 약 15 kb 이하, 예를 들어 14, 13 또는 12 kb이다. 대조적으로, 선행 기술 벡터의 주요 부분은 전이유전자 및 조절 요소들이다.
하나의 측면에서, 하기를 포함하는 셔틀 벡터가 제공된다:
a) 복제 오리진, 선택 마커를 포함하는 벡터 단편,
b) 적어도 섬유 유전자(L5)를 포함하고 임의로 E3 부위, E4 또는 양쪽 상기 부위를 추가로 포함하는 3' 아암.
하나의 양태에서, 셔틀 벡터는 전이유전자 및/또는 전이유전자와 관련된 임의의 조절 요소들, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않고, IRES 서열은 유사하다. 이것은 본 발명의 개시내용에 사용된 바와 같은 셔틀 벡터가 단순히 하나의 전이유전자를 바이러스로 도입하는 것과는 반대로, 바이러스의 유동성 유전학적 가공을 촉진시키기 위해 기작을 바이러스 게놈으로 도입하기 위해 개발되었기 때문이다.
하나의 양태에서, 상기 셔틀 벡터는 적합한 제한 부위(제3 제한 효소 부위로서 상기된)를 통해 아데노바이러스 게놈의 3' 아암에 직접 연결된 아데노바이러스 게놈의 5' 아암을 포함하는 환형 DNA 셔틀 벡터이고 아데노바이러스 게놈의 "중앙 서열"은 부재이다. 3' 아암 및 5' 아암은 함께 셔틀 벡터의 주요 단편으로서 본원에서 언급된다. 주요 단편의 3' 및 5' 말단은 연결 제한 부위를 통해 낮은 카피의 세균 복제 오리진 및 선택 마커 유전자를 함유하는 벡터 단편에 연결된다(도 6 및 8 참조).
대안적으로, 상기 논의된 바와 같은 셔틀 벡터는 예를 들어, 셔틀 벡터의 3' 아암에서 하나 이상의 전이유전자를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 셔틀 벡터는 5' 아암을 추가로 포함한다. 셔틀 벡터에 사용되는 5' 아암은 예를 들어, 상기 방법과 관련하여 기재된 기타 다른 곳에서 정의된 관련 성분들과 동일하다.
하나의 양태에서, 셔틀 벡터는 예를 들어, 당업자가 유사한 표준 기술을 사용하여 게놈으로 도입된 적어도 하나의 본래의 제한 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 셔틀 벡터는 서열번호 2의 서열을 갖는다. 하나의 양태에서, 셔틀 벡터는 서열번호 15의 서열을 갖는다. 하나의 양태에서, 셔틀 벡터는 서열번호 17의 서열을 갖는다. 하나의 양태에서, 셔틀 벡터는 서열번호 26의 서열을 갖는다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 아데노바이러스 플라스미드가 제공된다.
추가의 측면에서, 하기를 포함하는 플라스미드가 제공된다:
a) L5 유전자, E3 부위 및 E4 부위를 포함하는 아데노바이러스 게놈,
b) L5 유전자와 E3 부위, E4 부위 및 E3 부위 및 E4 부위 각각으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 부위 사이의 위치에서 적어도 하나의 본래의 제한 부위,
c) 낮은 카피의 세균 복제오리진 및
d) 선택 마커 유전자.
유리하게, 새로운 플라스미드는 레이트-발현되는 L5 섬유 유전자와 인접하게 있는 신규한 본래의 제한 부위를 제공한다. 상기 위치에서 전이유전자의 삽입은 바이러스 안정성 및 복제를 방해할 가능성이 적다. 하나의 양태에서, 상기 플라스미드는 당업자가 친숙한 표준 기술을 사용하여 게놈으로 도입된 적어도 하나의 본래의 제한 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 플라스미드는 전이유전자 카세트를 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 플라스미드는 서열번호 28의 서열을 갖는다. 하나의 양태에서, 상기 플라스미드는 서열번호 30의 서열을 갖는다. 하나의 양태에서, 상기 플라스미드는 서열번호 31의 서열을 갖는다.
또 다른 추가의 측면에서, 본 발명에 따른 플라스미드로부터 수득될 수 있는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 제공된다.
하나의 양태에서, 아데노바이러스 또는 바이러스 벡터는 예를 들어, 게놈 중 어느 것을 결실키는 것 없이 삽입될 수 있는 작은 전이유전자를 함유한다. 하나의 양태에서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 게놈의 어느 하나도 결실시키는 것 없이 삽입될 수 있는 작은 전이유전자들, 예를 들어, 총 4.5 kb 이하인 하나 이상의 유전자들을 함유할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용에 따른 방법에 의해 또는 플라스미드로부터 수득된 아데노바이러스 또는 바이러스 벡터는 보다 큰 전이유전자들을 함유할 수 있다. 하나의 양태에서, 복제 적격 아데노바이러스는 예를 들어, 게놈내 추가의 공간(예를 들어, EnAd)을 갖는데 그 이유는 복제에 비필수적 유전자 제거되기 때문이고 예를 들어, E3 및/또는 E4 또는 f4 영역의 일부 또는 전부가 결실된다. 하나의 양태에서, 게놈내 공간이 예를 들어 E3 및/또는 E4 또는 f4 영역의 일부 또는 전부를 결실시킴에 의해 생성된 조건적으로 복제하는 아데노바이러스가 제공된다.
하나의 양태에서, 비-복제 아데노바이러스(즉, 복제할 팩키징 세포주를 필요로 하는 것들)는 하나 이상의 유전자를 갖고, 예를 들어, 어얼리 유전자들은 결실되어 있고 예를 들어, E1, E2, E3 및 E4(예를 들어, E4 또는 f4)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 유전자들의 일부 또는 전부를 갖는다.
하나의 양태에서, 가공된 바이러스는 생존 복제 적격 바이러스이다.
하나의 양태에서, 가공된 바이러스는 복제 결핍 바이러스 벡터이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용의 바이러스 벡터에서 E1 유전자는 결실되어 있다. 하나의 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 바이러스 벡터는 유전학적 물질, 예를 들어, 전이유전자를 이것이 복제될 수 있고/있거나 발현될 수 있는 포유동물 세포와 같은 또 다른 세포로 인공적으로 운반하는 비히클로서 사용된 DNA 분자를 말한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용의 가공된 아데노바이러스 작제물은 하나 이상의 전이유전자를 포함한다.
하나의 양태에서, E4 유전자의 일부 또는 전부는 본 발명의 개시내용에 따른 바이러스 또는 바이러스 벡터에서 결실되어 있고, 예를 들어, 유전자의 E4 또는 f4 절편은 결실되어 있다.
하나의 양태에서, E3 유전자의 일부 또는 전부는 본 발명의 개시내용에 따른 바이러스 또는바이러스 벡터에서 결실되어 있다.
하나의 양태에서, E3 유전자, 및 E4 유전자의 일부 또는 전부는 본 발명의 개시내용에 따른 바이러스 또는 바이러스 벡터에서 결실되어 있다.
하나의 양태에서, L5 유전자의 일부 또는 전부는 본 발명의 개시내용에 따른 바이러스 또는 바이러스 벡터에서 결실되어 있다. 본 발명의 개시내용의 바이러스에서, L5의 부분적 결실은 L5 기능이 바이러스 복제에 필수적이기 때문에 상기 기능이 유지되는 경우 허용된다.
하나의 양태에서, E2 유전자의 일부 또는 전부는 본 발명의 개시내용에 따른 바이러스 또는 바이러스 벡터에서 결실되어 있다.
하나의 양태에서, 예를 들어, 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 플라스미드로부터 수득가능한 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 제공된다.
하나의 양태에서, 예를 들어, 치료에서 본 발명에 따른 플라스미드로부터 수득가능한 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 용도가 제공된다. 또 다른 측면에서, 치료에서 본 발명에 따른 플라스미드로부터 수득가능한 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 용도가 제공된다.
당업자는 본 발명의 플라스미드로부터 생성된 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 치료제로서, 예를 들어, 암세포 용해제 또는 백신으로서 또는 바이러스가 팩키징 세포의 도움 없이는 복제할 수 없는 유전자 전달 벡터로서 사용될 수 있는 것으로 인지할 것이다.
추가의 측면에서, 예를 들어, 암의 치료에서 본 발명에 따른 플라스미드로부터 수득가능한 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 용도가 제공된다. 또 다른 측면에서, 예를 들어, 백신 치료요법에서 본 발명에 따른 플라스미드로부터 수득가능한 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 용도가 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은 에 의해 수득가능한이란, 본 발명의 개시내용의 방법을 사용하여 생성된 실체의 특성을 갖는 임의의 플라스미드 또는 아데노바이러스를 의미한다. 한 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 로부터 수득가능한이란, 본 발명의 플라스미드로부터 절단된 아데노바이러스 게놈으로부터 생성될 수 있는 임의의 아데노바이러스를 의미한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 게놈의 어느 하나를 결실시키는 것 없이 삽입될 수 있는 작은 전이유전자, 예를 들어, 총 4.5 kb 이하인 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다.
하나의 양태에서, 예를 들어, 치료에서 본 발명에 따른 플라스미드로부터 수득가능한 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 용도가 제공된다.
치료 제형 및 방법
추가의 측면에서, 예를 들어, 본 발명에 따른 플라스미드로부터 수득가능한 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
당업자는 본 발명의 플라스미드로부터 생성된 아데노바이러스가 치료제로서, 예를 들어, 암세포 용해제 또는 백신으로서, 또는 바이러스가 팩지징 세포의 도움 없이는 복제할 수 없는 유전자 전달 벡터로서, 즉 바이러스 벡터로서 사용될 수 있는 것으로 인지할 것이다.
하나의 양태에서, 암의 치료를 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 플라스미드로부터 수득가능한 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 용도가 제공된다. 본원에 사용된 바와 같은 백신-기반 치료요법은 면역 반응을 유도하기 위해 또는 치료학적 이득을 위한 항원에 대해 확립된 면역 반응을 정량적으로 및/또는 정성적으로 변형시키기 위해 하나 이상의 항원을 암호화하는 전이유전자를 포함하는 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 전달(예를 들어, 근육내, 피하, 경피, 국소, 설하, 경구, 질내 또는 직장) 또는 일련의 상기 전달을 의미한다. 이에 의해 각각의 전달은 면역조절제, 예를 들어, 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 보강제, 면역조절 펩타이드, 단백질 또는 작은 분자와 함께 제형화되거나 이의 전달을 수반할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용에 따른 플라스미드로부터 수득가능한 유효량의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용되는 부형제가 제공된다.
약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체는 그 자체가 조성물을 투여받은 개체에게 해로운 항체의 생성을 유도하지 말아야 하고 독성이 아니어야 한다. 적합한 담체는 대형의 서서히 대사되는 거대분자, 예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 무기산 염, 예를 들어, 염화수소, 브롬화수소, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산 염, 예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 사용될 수 있다.
치료학적 조성물에서 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조 물질은 상기 조성물에 존재할 수 있다. 상기 담체는 약제학적 조성물이 환자 섭취용으로서 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로서 제형화되도록 할 수 있다.
투여를 위해 적합한 형태는 비경구 투여를 위해 적합한 형태, 예를 들어, 주사 또는 주입, 예를 들어, 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 유제 형태를 취할 수 있고 이것은 제형화제, 예를 들어, 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 바이러스는 사용 전에 적당한 멸균 액체와 재구성하기 위한 무수 형태일 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 양태에서, 상기 조성물은 인간 대상체 투여용으로 채택된다.
본 발명의 개시내용에 따른 제형에 적합하게, 최종 제형의 pH는 바이러스의 등전점의 값과 유사하지 않고, 예를 들어, 제형의 pH가 7인 경우, 8 내지 9 또는 그 이상의 pH가 적당할 수 있다. 이론에 국한되지 않으면서, 이것은 궁극적으로 개선된 안정성을 갖는 최종 제형을 제공할 수 있는 것으로 사료되고 예를 들어, 상기 바이러스는 용액 중에 유지된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척추강내, 심실내, 경피, 경피성(예를 들어, WO98/20734 참조), 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이는 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 것으로 제조될 수 있다. 용액, 또는 현탁액을 위해 적합한 고체 형태에 대해 주사 전에 액체 비히클이 또한 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사에 의해 피하내, 복강내, 정맥내 또는 근육내로 성취될 수 있거나 조직의 간질 공간으로 전달된다. 상기 조성물은 또한 병변으로 투여될 수 있다. 투여 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다.
조성물 중 활성 성분은 바이러스인 것으로 인지된다. 그와 같이, 위장관내 분해에 민감할 수 있다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용한 경로에 의해 투여되어야만 하는 경우, 상기 조성물은 분해로부터 바이러스를 보호하지만 일단 이것이 위장관으로부터 흡수되면 바이러스를 방출하는 제제를 함유할 필요가 있다.
약제학적으로 허용되는 담체의 완전 논의는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 가용하다.
하나의 양태에서, 상기 제형은 흡입을 포함하는 국소 투여를 위한 제형으로서 제공된다.
적합한 흡입용 제제는 흡입용 분말, 추진 가스를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진 가스가 없는 흡입용 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 개시내용에 따른 흡입용 분말은 상기 언급된 활성 물질 또는 상기 언급된 활성 물질과 생리학적으로 허용되는 부형제의 혼합물로 유일하게 이루어질 수 있다.
이들 흡입용 분말은 모노사카라이드(예를 들어, 글루코스 또는 아라비노스), 디사카라이드(예를 들어, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고- 및 폴리사카라이드(예를 들어, 덱스트란), 또는 폴리알콜(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨), 염(예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들 서로간의 혼합물을 포함할 수 이다. 모노- 또는 디사카라이드는 적합하게 사용되고 락토스 또는 글루코스의 사용일 수 있지만 특히 배타적으로 이들의 수화물 형태가 아니다.
폐에 침적을 위한 입자는 10 마이크론 미만, 예를 들어, 1 내지 9 마이크론, 예를 들어, 0.1 내지 5 ㎛, 특히 1 내지 5 ㎛의 입자 크기를 요구한다. 활성 성분(예를 들어, 바이러스)의 입자 크기는 제일 중요하다.
흡입용 에어로졸을 제조하기 위해 사용될 수 있는 추진 가스는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 추진 가스는 탄화수소, 예를 들어, n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예를 들어, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 염소화되고/되거나 불소화된 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 추진 가스는 이들 자체가 또는 이의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227로부터 선택된 할로겐화된 알칸이다. 상기 언급된 할로겐화된 탄화수소 중에서, TG134a(1,1,1,2-테트라프루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이의 혼합물이 특히 적합하다.
추진-가스-함유-흡입용 에어로졸은 또한 조용매, 안정화제, 표면-활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH를 조정하기 위한 수단을 함유할 수 있다. 모든 이들 성분은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진-가스-함유-흡입용 에어로졸은 5중량% 이하의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들어, 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국소 투여는 또한 예를 들어 분무기, 예를 들어, 컴프레서에 연결된 분무기(예를 들어, 제조원(Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.)에 의해 제조된 파리 마스터(Pari Master)(R) 컴프레서에 연결된 파리 LC-제트 플러스(R) 분무기)와 같은 장치를 사용하는 액체 용액 또는 현탁액 제형의 투여에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 바이러스는 예를 들어, 용액 또는 현탁액 형태로 용매 중에 분산되어 전달될 수 있다. 적당한 생리학적 용맥, 예를 들어, 식염수 또는 다른 약리학적으로 허용되는 용매 또는 완충 용액 중에 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 성취하기 위해 물 1 ml 당 0.05 mg 내지 0.15 mg의 이나트륨 에데테이트, 8.0 mg 내지 9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg의 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg 나트륨 시트레이트를 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 멸균 등장성 담체와 부위 상에서 희석된 동결건조된 바이러스를 사용할 수 있다.
치료학적 현탁액 또는 용액 제형은 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있고 완충액(예를 들어, 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액 및 중탄산 완충액), 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 나트륨 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨, 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해가능한 미소구에 캡슐화될 수 있다. 상기 제형은 일반적으로 실질적으로 멸균 형태로 제공된다.
멸균 제조 과정은 바이러스의 생산 및 멸균 완충 용매 용액에서 바이러스의 무균 현탁제인 제형을 위해 사용되는 완충 용매/용액의 여과에 의한 멸균 및 당업자에게 친숙한 방법에 의해 제형의 멸균 용기로의 분배를 포함할 수 있다.
본 발명의 개시내용에 따른 제형은 분무, 비경구, 국소 및 경구용 용량을 포함하고 예를 들어, 단일 투여 단위(예를 들어, 밀봉된 플라스틱 컨테이너 또는 바이엘 형태)로서 제공될 수 있다. 하나의 양태에서, 각각의 바이엘은 용매/용액 완충액 용적, 예를 들어, 2 ml 용적에서 단위 용량을 함유한다.
용매, 용액, 담체 등은 달리 언급되지 않는 경우 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용에 따른 제형은 단위 용량 제형을 포함하고 포일 외피에 팩킹된다.
하나의 양태에서, 치료에 사용하기 위한 본 발명의 개시내용에 따른 제형인 바이러스 작제물은 비경구로 투여된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용에 따른 제형인 바이러스 작제물은 국소적으로 예를 들어, 결장, 폐, 눈 또는 유사하게 비강내로 투여된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용에 따른 제형인 바이러스 작제물은 경구로 투여된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개시내용에 개시된 바이러스는 분무를 통한 전달을 위해 적합할 수 있다.
따라서, 치료에서, 예를 들어, 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스 또는 이를 포함하는 조성물의 용도가 제공되고, 특히 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함에 의한 용도가 제공된다. 또한, 약물의 제조를 위한 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스의 용도가 제공된다.
본 명세서의 기재내용에서 "포함하는"은 "함유하는" 것으로서 해석되어야만 한다.
특정 요소들을 포함하는 본 발명의 측면은 또한, 또 다른 양태, 관련 요소들 "로 이루어진" 또는 "필수적으로 이루어진"으로 확대된다.
기술적으로 적당한 경우, 본 발명의 양태는 조합될 수 있다.
특허 및 출원 문헌과 같은 기술적 참조문헌은 본원에 참조로 인용된다. 본원에 특이적으로 및 명백하게 언급된 임의의 양태는 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 양태와 조합되어 포기의 근거를 형성할 수 있다.
본 발명의 개시내용의 측면들은 서열 및 도면으로 기재하고 보정의 기초를 형성할 수 있다. 도면 및 서열의 개시내용은 본 발명의 개시내용의 교시에 대한 일반 적용을 갖고 특징의 단순히 매우 특이적 조합으로서 고려되는 것으로 의도되지 않는다. 출원된 우선권 GB1322851.5는 이의 서열 목록을 포함하는 PCT 출원 PCT/EP2014/072919의 내용으로서 본원에 참조로 인용된다.
실시예
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 1 ColoAd1 셔틀 벡터의 작제
PspOMI 제3 제한 효소 부위에 의해 연결된 p15A 세균 복제 오리진, 가나마이신 내성 카세트 및 ColoAd1의 5' 및 3' 아암을 함유하는 'ColoAd1 셔틀 벡터'로서 언급되는 11978bp의 셔틀 벡터룰 작제하였다(도 6 참조).
3개의 DNA 단편은 PCR에 의해 합성하였다:
1) 5' Ascl 제한 부위 및 3' PspOMI 제한 부위를 갖는 ColoAd1의 5' 4627bp에 상응하는 "ColoAd1의 5' 아암",
2) 5' PspOMI 제한 부위 및 3' Ascl 제한 부위를 갖는 ColoAd1 게놈의 3' 4482bp에 상응하는 "ColoAd1의 3' 아암" 및
3) Ascl 제한 부위에 의해 플랭킹된 낮은 카피의 p15A 복제 오리진 및 가나마이신 내성 카세트를 함유하는 벡터 단편
5' 아암 및 3' 아암에서 PspOMI 제3 제한 부위는 셔틀 벡터가 선형화되고 ColoAd1 게놈과 재조합되어 게놈 서열에 임의의 목적하지 않은 변형을 도입하는 것 없이 플라스미드를 형성하기 위한 적합한 제한 부위로서 선택하였다.
제한 부위는 ColoAd1 게놈의 5' 말단 및 또한 상기 게놈의 3' 말단 근처에 있도록 디자인하였고, 특히 3' 및 5' ITR의 말단으로부터 약 4-5 kb에 있도록 하여 상기 셔틀 벡터는 도 4에 보여지는 바와 같이 약 4-5 kb 3' 및 5' 아암을 가졌다.
PCR에 의한 단편 합성의 세부사항
PCR 증폭을 위해 사용되는 프라이머는 표 1에 열거한다:
Figure pct00004
1) 5' 아암의 생성
E1A, E1B 및 E2B 영역 및 ColoAd1의 5' 말단을 증폭시키기 위해, PCR은 프라이머 0198(서열번호 5) 및 0200(서열번호 7)을 사용하여 천연 ColoAd1에 대해서 수행하였다. 50 ㎕의 반응 용적을 하기 표 2에 따라, PCR 반응을 위해 사용하였고, PCR 생성물의 도식은 도 10a에 나타낸다.
Figure pct00005
E3, 섬유 및 E4 영역 및 ColoAd1의 3' 말단을 증폭시키기 위해, PCR은 프라이머 0198(서열번호 5) 및 0201(서열번호 8)을 사용하여 천연 ColoAd1에 대해서 수행하였다. 50 ㎕의 반응 용적을 하기 표 3에 상세히 기재된 바와 같은 PCR 반응을 위해 사용하였고, PCR 생성물의 도식은 도 10b에 나타낸다.
Figure pct00006
제3 PCR은 p15A 오리진 및 5' 및 3' Ascl 제한 부위를 갖는 가나마이신 내성 유전자를 함유하는 ~3 kb 단편을 제조하기 위해 프라이머 0196(서열번호 3) 및 0197(서열번호 4)을 사용하여 벡터 단편에 대해서 수행하였다(도 10c). 50 ㎕의 반응 용적은 표 4에 상세히 기재된 바와 같은 PCR 반응을 위해 사용하였다:
Figure pct00007
모든 PCR 증폭은 표 5의 하기 프로토콜을 사용하였다:
Figure pct00008
30 주기의 증폭을 수행하였다: [단계 1] x 1, [단계 2, 단계 3, 단계 4] x 30, [단계 5] x 1.
이어서 1 ㎕의 각각의 PCR 생성물을 1시간 동안 150 V에서 1 % 아가로스 겔 상에서 전개하였다(도 11a). 각각의 PCR 생성물의 전체 용적은 제조업자의 프로토콜에 따라 스핀 칼럼 방법에 의해 정제하고 40 ㎕의 용출 완충액으로 용출시켰다.
5' 및 3' 아암을 위한 PCR은 보다 높은 증폭 수율을 수득하기 위해 반복하였다. 동일한 프로그램 및 혼합물은 이전에 상세히 기재된 바와 같이 사용하고 1 ㎕의 생성물을 1시간 동안 150 V에서 0.8 % 겔 상에서 전개하였다(도 11b). 각각의 PCR 생성물에 대한 전체 용적은 0.8 % 아가로스 겔로부터 겔 추출에 의해 정제하고 40 ㎕의 용출 완충액 중에 용출시켰다.
PCR 증폭 후, 다수의 방법을 시도하여 3개의 PCR 단편들을 함께 스틱킹하여 ColoAd1 셔틀 벡터를 형성한다. 하나의 방법을 시도하여 2단계 반응을 사용하여 PCR 생성물을 연결시켰다. 5' 아암을 3' 아암으로 먼저 연결하고, 이어서 제2 연결 반응으로 벡터를 연결하는 상기 방법은 성공적이지 못하였다(세부 사항에 대해 하기를 참조한다).
제2 방법을 시도하여 1단계 3개-방식 연결로 3개의 PCR 생성물을 함께 연결하였다. 상기 방법을 사용한 성공적 연결을 위한 조건을 결정하기 위해, DNA의 총량, DNA 단편의 비율, 연결 시간 및 온도 및 벡터의 인산화 상태를 다양화하였다. 여러 조합을 시도하였으나 기능적 방법이 성취될 때까지 성공적이지 못하였다.
ColoAd1 셔틀 벡터를 형성하기 위한 1단계 3개-방식 연결
5' 아암 및 3' 아암(~4.6 kb 및 ~4.5 kb)의 PCR 생성물은 PspOMI 및 Ascl(표 6 참조)을 사용하여 이중으로 분해하고 p15a-KAN 벡터(~3 kb)의 PCR 생성물은 하기 표에 따라 37 ℃에서 2시간 동안 Ascl로만 분해하였다(표 7 참조):
[표 6]
5' 아암 또는 3' 아암
Figure pct00009
[표 7]
p15a-Kan 벡터
Figure pct00010
5' 및 3' 아암 분해물은 65 ℃에서 20분 동안 열 불활성화시켰다. p15a-Kan 벡터 단편은 1 ㎕의 알칼린 소 포스파타제(CIP)로 37 ℃에서 1시간 동안 처리하였다.
1 ㎕의 모든 처리된 제한 분해물은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 전개하였다(도 12). 분해 생성물의 전체 용적은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 분리하고, 겔 정제하고 40 ㎕의 용출 완충액 중에 용출시켰다.
1단계 3개-방식 연결은 표 8에서와 같이 다양한 단편의 비율로 실온에서 1시간 동안 2 ㎕의 T4 DNA 리가제 및 4 ㎕의 리가제 완충액을 사용하여 정제된 분해 생성물과 함께 수행하였다:
Figure pct00011
전체 연결 혼합물은 XL-10 골드 울트라컴피턴트 세포와 30분 동안 빙상에서 항온처리함에 이어서 42도에서 30초 열 쇼크시켜 세균으로 형질전환시켰다. 500 ㎕의 각각의 형질전환된 배양물은 LB + Kan 플레이트에 분배하고 37 ℃에서 밤새 항온처리하였다. 2 ㎕의 T4 DNA 리가제와 함께 6 ㎕의 탈인산화된 p15a-kan 벡터를 사용한 대조군은 LB + Kan 플레이트 상에 분배하였다. 밤새 항온처리 후, 콜로니는 대조군 플레이트를 제외한 모든 플레이트 상에 존재하였다.
진단학적 PCR 스크리닝 및 콜로니의 제한 분해
4개 콜로니를 각각의 플레이트로부터 집어내고 250 rpm, 37 ℃에서 4 ml의 LB 브로쓰에 밤새 배양하였다. DNA를 미니프렙(miniprep)에 의해 정제하고, 이는 제조업자의 미니프렙 프로토콜에 따라 DNA 결합 칼럼 상에서 DNA의 알칼린 용해 및 정제에 의해 DNA를 세균으로부터 수거함을 포함하였다. DNA는 40 ㎕의 완충액으로 용출시켰다.
진단학적 PCR은 ~12 kb ColoAd1 셔틀 벡터 생성물이 존재하고 올바른 배향으로 5' 및 3' 아암 둘 다를 함유하는지를 결정하기 위해 12개 정제된 DNA 샘플에 대해 수행하였다(도 13). 3개의 별도의 PCR은 연결되어야만 하는 연결점에 걸친 프라이머를 사용하여 각각의 작제물에 대해 사용하였다. 반응에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 9에 나타낸다.
Figure pct00012
PCR 반응은 하기 표 10-12에 상세히 기재된 혼합물에 따라 설정하였다:
[표 10]
Mix 1:
Figure pct00013
[표 11]
Mix 2:
Figure pct00014
[표 12]
Mix 3:
Figure pct00015
PCR 프로그램은 TAQ 폴리머라제 PCR mix(Qiagen #201443)에 대한 제조업자의 지침에 따라 설정하였다.
1 ㎕의 PCR 생성물은 150 V에서 1시간 동안 1 % 아가로스 상에서 전개하였다(도 14)
올바른 크기별 배향된 작제물에 대해, 1.3 kb, 1.4 kb 및 1.1 kb의 3개의 PCR 생성물이 도 13의 도식에서 상세히 기재된 바와 같이 예상되었다. 단지 샘플 13, 14 및 16(도 14)은 올바른 크기별 생성물을 보여주었다. 이들 작제물은 모두 1:1:1 연결 비율을 사용하여 제조되었다. 1:1:6 및 1:1:12 비율을 사용하는 작제물은 올바른 크기별 단편을 생성시키지 못했다(도 14 #17-24). PspOMI를 사용한 1:1:1 연결 샘플 제한 분해물 또는 PspOMI 및 AscI를 사용한 이중 분해물에서 12 kb ColoAd1 셔틀 벡터의 존재를 확인하기 위해 37 ℃에서 1시간 동안 작제물의 선택에 대해 수행하였다. 상기 분해 반응은 표 13 및 표 14에 상세히 기재되어 있다.
[표 13]
단일 분해:
Figure pct00016
[표 14]
이중 분해:
Figure pct00017
1 ㎕의 각각의 분해물은 150 V에서 1시간 동안 0.8 % 겔 상에서 전개하였다(도 15).
올바른 크기별 배향된 작제물에 대해, PspOMI 분해물은 단일 ~12 kb 밴드를 생성하는 것으로 예측되고 PspOMI/Ascl 분해물은 ~3 kb 밴드 및 ~4.7 kb 밴드를 생성하는 것으로 예측된다. 이중 분해물에 대해, 상기 ~4.7 kb 밴드는 상기 크기에서 5' 아암 및 3' 아암 둘 다의 존재로 인해 ~3 kb 밴드의 ~2배 강도를 갖는 것으로 예측된다. 작제물 13 및 16은 ColoAd1 셔틀 벡터에 상응하는 올바른 분해물 밴드 패턴을 보여주었다(도 8).
작제물 16번을 이어서 서열분석하고 ColoAd1 셔틀 벡터 서열번호 2의 성공적인 작제를 확인하였다.
실시예 2 ColoAd2 .4 셔틀 벡터의 작제
실시예 1에서 생성된 ColoAd1 셔틀 벡터는 셔틀 벡터에 존재하는 ColoAd1 게놈의 임의의 영역의 변형(예를 들어, E1 영역의 변형)을 허용하는 게놈에서 단지 1회 존재하는 11개 단일(본래의) 제한 부위를 함유하였다. 셔틀 벡터에 존재하는 부위들 및 ColoAd1 유전자들의 위치를 보여주는 제한 맵이 도 6에 제공되어 있다.
2개의 단일(본래의) 제한 부위(PspOMI 및 Acll)는 각각 ColoAd1 셔틀 벡터에서 각각 위치 4634 및 6851에서 섬유(L5) 유전자를 플랭킹한다. 이들은 위치 27839 및 30065에서 ColoAd1 게놈에서 섬유(L5) 유전자를 플랭킹하는 본래의 PspOMI 및 Acll에 상응한다(도 9). ColoAd1 셔틀 벡터에서, 이들 부위는 상기 영역에서 DNA 서열이 절단되고 변형되거나 상이한 서열로 대체되도록 하거나 DNA 서열이 이들 내에 단순한 부가로서 삽입되도록 한다.
ColoAd2.4 셔틀 벡터는 PspOMI와 Acll 제한 부위 사이의 DNA 서열을 합성 DNA 단편으로 대체함에 의해 ColoAd1 셔틀 벡터로부터 제조하였다. 상기 합성 DNA 단편 서열은 이것이 섬유 유전자(GCGATCGCTACCCTGCAGG-서열번호 29, 도 3)의 다운스트림에 19bp를 추가로 함유하는 것을 제외하고는 ColoAd1 셔틀 벡터에서 대체하는 서열과 동일하였다. 이들 추가의 염기들은 새로운 본래의 Sgfl 및 Sbfl 제한 부위를 포함하였다(도 17).
PspOMI 및 Acll 부위에 의해 플랭킹된 합성 DNA 단편은 제조원[MWG Eurofins]으로 구매하였다(도 18, 서열번호 27). 상기 합성 단편은 5.17 kb AmpR pBluescript II SK 플라스미드에 공급하였다.
합성 단편을 함유하는 ColoAd1 셔틀 벡터 및 pBluescript 플라스미드는 표 15에 상세히 기재된 반응으로 37 ℃에서 1시간 동안 분해하였다:
Figure pct00018
분해된 셔틀 벡터 및 합성 단편 둘 다는 0.8 % 아가로스 겔 상에서 분리하고 적당한 크기의 단편들을 겔 정제하고 40 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물에서 용출시켰다.
상기 합성 단편은 실온에서 1시간 동안 10 ㎕ 반응에서 lx 리가제 완충액 및 1 ㎕ T4 DNA 리가제 반응과 함께 3 ㎕:1 ㎕의 용적에서 셔틀 벡터로의 삽입체의 3:1 연결 비율을 사용하여 ColoAd1 셔틀 벡터로 연결하였다.
2 ㎕의 연결 혼합물은 제조업자의 프로토콜에 따라 42 ℃에서 열 쇼크에 의해 XL-1 블루 세포에 형질전환시켰다. 형질전환시킨 후, 5개의 콜로니를 LB 가나마이신 플레이트로부터 집어내고 250 rpm, 37 ℃에서 가나마이신을 함유하는 3 ml의 LB 브로쓰에서 밤새 배양하였다. 미니프렙(Minipreps)은 제조업자의 프로토콜에 따라 각각의 배양물에 대해 수행하고 정제된 DNA는 40 ㎕ 완충액에서 용출시켰다.
본래의 제한 부위 Sbfl 및 Sgfl을 함유하는 ColoAd2.4 셔틀 벡터의 작제를 확인하기 위해, 제한 효소 분석을 5개 샘플의 각각에 대해 수행하였다. EcoRV 및 Sbfl을 사용한 제한 분해물은 하기 표 16에 상세하게 설정하였다:
Figure pct00019
모든 5개의 분해물은 올바른 크기별 단편을 생성하였다: 3 kb 및 9kb의 밴드(도 19).
추정 ColoAd2.4 셔틀 벡터 #5는 글리세롤 스톡으로부터 세균에서 증폭시키고 DNA를 수거하고 맥시프렙(maxiprep)으로 정제하였다. 상기 작제물 #5는 서열 분석하여 ColoAd2.4 셔틀 벡터의 성공적인 작제를 확인하였다(서열번호 26).
실시예 3 ColoAd2 .0 셔틀 벡터의 작제
ColoAd2.0 셔틀 벡터(서열번호 15, 도 20)는 실시예 1에서 작제된 ColoAd1 셔틀 벡터로부터 제조하였다. ColoAd2.0 셔틀 벡터를 제조하기 위해 사용되는 방법은 실시예 2에서 상세히 기재된 PspOMI 및 Acll 제한 부위 사이의 합성 DNA 단편의 연결을 사용하여 ColoAd2.4 셔틀 벡터를 제조하기 위해 사용된 것들과 동일하였다.
ColoAd2.0 셔틀 벡터를 작제하기 위해 사용된 합성 DNA 단편 서열은 이것이 Fsel 본래의 제한 부위를 포함하는 섬유(L5) 유전자의 업스트림에 추가의 9bp 및 2개의 폴리아데닐화 서열 및 Sgfl, Notl 및 Sbfl 본래의 제한 부위를 포함하는 섬유 유전자의 다운스트림에 추가의 123bp를 함유한다는 것을 제외하고는 ColoAd1 셔틀 벡터에서 대체하는 서열과 유사하였다(서열번호 16, 도 21)
ColoAd2.0 셔틀 벡터의 작제는 표 17에서 mix에 의해 상세히 기재된 바와 같이 37 ℃에서 1시간 효소 Fsel, Ascl, Notl, Sbfl 또는 PspOMI를 사용한 제한 분해물 패널에 의해 확인하였다:
Figure pct00020
2 ul의 각각의 분해물은 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 모든 작제물은 각각의 분해물에 대해 올바른 밴드 패턴을 보여주었다(도 22). ColoAd2.0 셔틀 벡터 작제물 #4를 선택하였고 ColoAd2.0 셔틀 벡터(서열번호 15)의 성공적인 작제를 확인하였다
실시예 4. ColoAd2 .1 셔틀 벡터의 작제
ColoAd2.1 셔틀 벡터(서열번호 17, 도 23)는 PspOMI와 Acll 제한 부위 사이의 DNA 서열을 2개의 PCR 반응에 의해 제조된 DNA 단편(서열번호 18)으로 대체함에 의해 ColoAd1 셔틀 벡터(실시예 1에서 제조된)로부터 제조하였다. 제조된 DNA 단편은 이것이 섬유 유전자의 업스트림에 추가의 9bp(AGCGGCCGC-서열번호 19, 도 3)를 함유하는 것을 제외하고는 ColoAd1 셔틀 벡터에서 대체하는 서열과 동일하였다. 이들 추가의 염기들은 본래의 Notl 제한 부위를 포함한다(도 24c).
Notl 제한 부위를 PCR에 의해 PspOMI-Acll 플랭킹된 서열로 도입하기 위해, 2개의 PCR 반응을 요구하였다. 5' PspOMI 제한 부위 및 도입된 3' Notl 부위(도 24a)를 포함하는 단편을 생성시키는 하나의 PCR(PCR 1) 및 도입된 5' Notl 부위 및 3' Acll 부위(도 24b)를 포함하는 단편을 생성시키는 제2(PCR 2). Notl 부위에서 이들 PCR 생성물의 연결은 ColoAd2.0 셔틀 벡터 작제에서 사용된 ColoAd2.0 DNA 단편(도 24c)을 생성하였다. 2개의 PCR 반응을 위해 사용되는 프라이머는 표 18에 나타낸다:
Figure pct00021
PCR 1은 프라이머 0274(서열번호 20) 및 0275(서열번호 21)를 사용하는 ColoAd1 게놈 주형 DNA에 대해서 수행하였다. 50 ㎕의 반응 용적은 하기 표 19에 따른 PCR 1 반응에 대해 사용하였고 PCR 1 생성물의 도식은 도 24a에 나타낸다(서열번호 24).
Figure pct00022
PCR 2는 프라이머 0276(서열번호 22) 및 0277(서열번호 23)을 사용하여 ColoAd1 게놈 주형 DNA 상에서 수행하였다. 50 ㎕의 반응 용적은 하기 표 20에 따라 PCR 2 반응을 위해 사용하였고 PCR 2의 도식은 도 24b에 나타낸다(서열번호 25).
Figure pct00023
PCR 반응은 둘 다 표 21에 상세히 기재된 프로그램에 따라 수행하였다:
Figure pct00024
30 주기의 증폭을 수행하였다: [단계 1] x 1, [단계 2, 단계 3, 단계 4] x 30, [단계 5] x 1.
PCR 생성물의 전체 용적은 제조업자의 프로토콜에 따라 스핀 칼럼 방법에 의해 정제하였고 40 ㎕의 용출 완충액으로 용출시켰다.
PCR 1 생성물을 이어서 BamHI 및 Notl로 분해하고(표 22) 클로닝 벡터는 또한 37 ℃에서 1시간 동안 Bglll 및 Notl로 분해하였다(표 23 참조).
[표 22]
PCR 생성물:
Figure pct00025
[표 23]
벡터:
Figure pct00026
분해된 벡터 및 PCR 1 생성물은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 분리하고 적당한 크기의 단편들은 겔 정제하고 40 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 용출시켰다.
PCR 1 생성물은 실온에서 1시간 동안 20 ㎕의 반응에서 1 x 리가제 완충액 및 1 ㎕의 T4 DNA 라가제와 함께 10 ㎕:1 ㎕의 용적에서 벡터에 대한 삽입체의 3:1 연결 비율을 사용하여 벡터에 연결하였다.
6 ㎕의 연결 혼합물은 제조업자의 프로토콜에 따라 42 ℃에서 열 쇼크에 의해 XL-1 블루 세포에 형질전환시켰다. 형질전환 후, 5개의 콜로니는 LB 가나마이신 플레이트로부터 집어내고 37 ℃에서 250 rpm으로 가나마이신을 함유하는 3 ml의 LB 브로쓰에서 밤새 배양하였다. 미니프렙은 제조업자의 프로토콜에 따라 각각의 배양물에 대해 수행하고 정제된 DNA는 40 ㎕의 완충액에 용출시켰다.
PCR 1 생성물에 함유된 벡터를 확인하기 위해, 제한 효소 분석은 5개 샘플의 각각에 대해 수행하였다. Spel 및 Ascl를 사용한 제한 분해는 표 24에 상세히 기재된 바와 같이 37 ℃에서 1시간 동안 설정하였다:
Figure pct00027
모든 5개의 분해는 올바른 크기별 단편들을 생성시켰다: 1.5 kb 및 4 kb의 밴드.
PCR 2 생성물, 및 PCR 1 생성물을 함유하는 새롭게 생성된 벡터는 표 25에 상세히 기재된 바와 같이 37 ℃에서 1시간 동안 Notl 및 EcoRI로 분해하였다:
Figure pct00028
PCR 1 단편 및 PCR 2 생성물을 함유하는 분해된 벡터는 0.8 % 아가로스 겔 상에서 분리하고 적당한 크기의 단편들은 겔 정제하고 40 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 용출시켰다.
PCR 2 생성물은 실온에서 1시간 동안 20 ㎕의 반응에서 1 x 리가제 완충액 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제와 함께 10 ㎕:1 ㎕의 용적에서 벡터에 대한 삽입체의 3:1 연결 비율을 사용하여 벡터에 연결하였다.
6 ㎕의 연결 혼합물은 제조업자의 프로토콜에 따라 42 ℃에서 열 쇼크에 의해 XL-1 블루 세포에 형질전환시켰다. 형질전환 후, 5개의 콜로니를 LB 가나마이신 플레이트로부터 집어내고 37 ℃에서 250 rpm으로 가나마이신을 함유하는 3 ml의 LB 브로쓰에서 밤새 배양하였다. 미니프렙은 제조업자의 프로토콜에 따라 각각의 배양에 대해 수행하였고 정제된 DNA는 40 ㎕ 완충액에 용출시켰다.
벡터가 PCR 1 및 PCR 2 생성물 둘 다로 이루어진 DNA 단편을 함유하는지를 확인하기 위해, 제한 효소 분석은 5개 샘플의 각각에 대해 수행하였다. PspOMI 및 Acll을 사용한 제한 분해물은 표 26에 상세히 기재된 바와 같이 37 ℃에서 1시간 동안 설정하였다:
Figure pct00029
모든 5개의 분해는 올바른 크기별 단편을 생성하였다: 2.3 kb 및 3.15 kb의 밴드. 벡터에서 PspOMI 및 Acll 부위 사이의 DNA 단편의 서열이 올바른지를 확인하기 위해 샘플 #5를 서열 분석하였다(서열번호 18).
이어서 ColoAd2.1 셔틀 벡터를 실시예 1에서 작제된 ColoAd1 셔틀 벡터로부터 제조하였다. 2개의 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 단편을 ColoAd1 셔틀 벡터로 연결시키기 위해 사용된 방법은 실시예 2에서 ColoAd2.4 셔틀 벡터를 제조하기 위해 합성 DNA 단편을 연결시키는 것들과 동일하였다.
ColoAd2.1 셔틀 벡터의 작제는 표 27에서 mix에 의해 상세히 기재된 바와 같이 37 ℃에서 1시간 동안 효소 Notl 및 Ascl로 제한 분해에 의해 확인하였다:
Figure pct00030
2 ㎕의 각각의 분해는 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하고 모든 작제물은 ColoAd2.1 셔틀 벡터에 상응하는 올바른 밴드 패턴을 보여준다(도 25). ColoAd2.1 셔틀 벡터 샘플 #4를 선택하고 서열분석하여 ColoAd2.1 셔틀 벡터의 성공적인 작제를 확인시켜 준다(서열번호 17).
실시예 5 상동성 재조합에 의한 ColoAd2 .4, ColoAd2 .0 또는 ColoAd2 .1 플라스미드의 작제
ColoAd2.0(서열번호 30), ColoAd2.4(서열번호 28) 및 ColoAd2.1(서열번호 31) 플라스미드는 상동성 재조합에 의해 ColoAd2.0, ColoAd2.4 및 ColoAd2.1 셔틀 벡터로부터 제조하였다. 방법의 도식적 개요는 도 5에 제공된다.
ColoAd2.0, ColoAd2.4 및 ColoAd2.1 셔틀 벡터에서 PspOMI 부위는 셔틀 벡터가 전기컴피턴트 이. 콜라이에서 ColoAd1 게놈과의 상동성 재조합을 위해 선형화되도록 하였다.
ColoAd2.4 셔틀 벡터(서열번호 26)(68.6 ng/㎕)는 하기의 반응을 사용하여 37 ℃에서 1시간 동안 PspOMI로 분해하였다:
Figure pct00031
50 ㎕의 분해물은 37 ℃에서 1시간 동안 1 ㎕의 CIP(소 알칼린 포스파타제)로 처리하였다.
상기 분해물은 풀링하고 시그마 진루트 미니프렙 칼럼 상에서 정제하여 40 ㎕의 NFW에서 용출시킨다. 재조합은 40 ㎕의 전기컴피턴트 BJ5183 세포(Agilent)에서 3.5 ㎕(23.4 ng/㎕)의 ColoAd2.4 셔틀 벡터 및 1.5 ㎕(36ng/㎕)의 ColoAd1을 사용하여 수행하였다. 음성 대조군은 또한 40 ㎕ BJ5183 세포에서 3.5 ㎕의 선형화된 벡터(ColoAd2.4 벡터) 세포를 사용하여 수행하였다. 재조합은 제조업자의 프로토콜(#200154 Agilent)에 따라 전기천공에 의해 수행하였다.
5 ㎕의 배양물을 희석하고 LB 한천 + 가나마이신 상에 분배하고 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 상기 음성 대조군은 LB + Kan 플레이트 상에서 거의 정상 크기의 콜로니를 나타내었고, 재조합 플레이트는 많은 작은 콜로니 및 여러 대형 또는 중형 콜로니를 보여주었다(도 27a). 실험 플레이트로부터 48개 콜로니를 집어내고 37 ℃, 250 rpm으로 3 ml의 LB 브로쓰 + Kan에 밤새 접종하였다.
상기 DNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 미니프렙에 의해 세균으로부터 정제하고 40 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 용출시켰다.
DNA 샘플 중에 재조합체의 존재를 결정하기 위해, 후보물은 표 29의 하기 반응을 사용하여 EcoRV 및 Sbfl로 분해하였다:
Figure pct00032
상기 분해물은 150 V에서 1시간 동안 0.8 % 아가로스 겔 상에서 전개하였다(도 27b).
재조합체 #3, #8 및 #10은 EcoRV/Sbfl 분해 후 올바른 밴드를 보여주었고 각각 2 ㎕는 제조업자의 프로토콜에 따라 50 ㎕의 XL-1 블루 세포에 형질전환시켰다. 50 ㎕의 세포는 LB 및 가나마이신 플레이트 상에 플레이팅하고 37 ℃에서 밤새 배양하였다.
#8 플레이트로부터, 7개 콜로니를 집어내고 37 ℃에서 220 rpm으로 밤새 가나마이신을 갖는 3 ml의 LB 브로쓰에서 성장시켰다. 미니프렙은 제조업자의 프로토콜에 따라 재조합 클론 상에서 수행하고 DNA는 40 ㎕의 NFW에서 용출시켰다. 진단학적 제한 효소 분해는 표 30의 하기의 분해 반응을 사용하여 1시간 동안 37 ℃에서 설정하였다:
Figure pct00033
Figure pct00034
상기 분해물은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 전개하였다(도 28).
분해된 작제물 중에, 재조합체 ColoAd2.4 #4 플라스미드는 올바른 제한 패턴을 가졌다. 따라서, 이러한 플라스미드는 글리세롤 스톡으로부터 증폭시키고 DNA는 미니프렙에 의해 정제하였고 서열 분석하였다(서열번호 28). 이것은 ColoAd2.4 플라스미드의 성공적인 생성을 확인시켜주었다(도 26). 도 2에 나타낸 ColoAd2.0(서열번호 30), ColoAd2.4(서열번호 28) 및 ColoAd2.1(서열번호 31) 플라스미드는 상기 방법을 사용하여 모두 성공적으로 작제되었다.
모든 플라스미드는 서열 분석하여 어떠한 원치않는 변화가 ColoAd1 게놈 서열에 존재하지 않음을 확인하였다.
실시예 6 셔틀 벡터의 2단계 연결의 실패
실시예 1에 기재된 20 ㎕의 ColoAd1 5' 아암 및 3' 아암 PCR 생성물은 하기 표 32에 상세히 기재된 바와 같이 37 ℃에서 2시간 동안 PspOMI에 의해 분해하였다:
Figure pct00035
상기 분해물은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 분리하고, 겔 정제하고 30 ㎕의 용출 완충액에서 용출시켰다.
용출된 생성물의 전체 용적은 연결 반응을 위해 사용하였다.
5' 아암 및 3' 아암(~4.6 kb 및 ~4.5 kb) 단편은 실온에서 2.5시간 동안 10 ㎕(낮은) 또는 25 ㎕(높은)의 용적을 사용하여 1:1 비율로 연결시켰다.
Figure pct00036
상기 연결 반응은 70 ℃에서 5분 동안 열 불활성화시키고 2개의 PCR은 프라이머 0199(서열번호 6) 또는 프라이머 0198(서열번호 5)을 사용한 각각의 연결 세트에 대해 수행하여 ~9.1 kb 단편을 증폭시켰다.
1 ㎕의 각각의 PCR 생성물은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 전개하였다(도 29a).
낮은 용적의 연결 후 PCR 생성물의 총 용적은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 분리하고 겔 정제하고 40 ㎕ 용출 완충액으로 용출시켰다.
상기 연결된 PCR 9kb 생성물 및 이전에 PCR 증폭된 ~3 kb p15a-Kan 벡터는 하기의 mix를 사용하여 37 ℃에서 2시간 동안 효소 Ascl로 제한 분해시켰다:
Figure pct00037
상기 Ascl 분해된 ~9kb 단편은 20분 동안 65 ℃에서 열 불활성화시키고 Ascl 분해된d p15a KAN 벡터는 37 ℃에서 1시간 동안 1 ㎕ CIP로 처리하였다.
1 ㎕의 분해된 생성물은 1 % 아가로스 겔 상에서 전개하여 상대적 DNA 농도를 평가하였다(도 29b).
각각의 생성물의 전체 용적을 이어서 스핀 칼럼 방법으로 정제하고 40 ㎕의 용출 완충액에 용출시켰다.
~ 9kb 단편(5' 아암-3' 아암)과 p15a-Kan 벡터 간의 연결은 실온에서 1.5시간 동안 하기의 비율로 2 ㎕의 T4 DNA 리가제 및 4 ㎕의 리가제 완충액을 사용하여 수행하였다:
1:1(5 ㎕); 1:2(2 ㎕:4 ㎕); 1:3(2 ㎕:6 ㎕); 1:3(4 ㎕:12 ㎕); 및 1:3(3 ㎕:9 ㎕)
각각의 연결 mix의 전체 용적은 제조업자의 프로토콜(Stratagene #200314)에 따라 열 쇼크에 의해 50 ㎕의 XL-10 골드 울트라컴피턴트 세포에 형질전환시켰다.
500 ㎕의 각각의 배양물은 LB + 가나마이신 플레이트 상에 분주하고 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니는 플레이트 상에 존재하고 37 ℃에서 250 rpm으로 LB 브로쓰에서 증폭시켰다. DNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 미니프렙에 의해 세균으로부터 정제하였다.
정제된 DNA는 실시예 1에 상세히 기재된 것들과 동일한 진단적 PCR 및 제한 분해 방법에 의해 ColoAd1 셔틀 벡터의 존재에 대해 분석하였다.
올바른 크기별 배향된 작제물에 대해, 진단적 PCR은 1.3 kb, 1.4 kb 및 1.1 kb 밴드를 생성할 것으로 예상되고 제한 분해물은 PspOMI에 대해 단일 ~12 kb 밴드 및 PspOMI/Ascl에 대해 ~3 kb 밴드 및 ~4.7 kb 밴드를 생성할 것으로 예상되었다. 샘플의 어떠한 것도 진단적 방법에 의한 올바른 밴드를 보여주지 않았다(도 16).
실시예 7 리포터 전이유전자 카세트( pNG - 62)를 함유하는 ColoAd2 .4 플라스미드의 작제
실시예 5에서 생성된 ColoAd2.4 플라스미드를 사용하여 pNG-62로 호칭되는 플라스미드(서열번호 35, 도 30)를 작제하였고, 이는 ColoAd2.4 플라스미드 단일 제한 부위 Sgfl과 Sbfl 사이에 리포터 유전자 전이유전자 카세트를 함유하였다. 상기 전이유전자 카세트는 분지된 스플라이스 수용체 서열(bSA), 형광 리포터 유전자, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 SV40 레이트 폴리A 서열(PA)로 이루어져 있다.
1) 전이유전자 카세트의 작제
3' SV40 레이트 폴리A 서열과 함께 GFP 서열(mpSF-CMV-GFP-PA)을 함유한 클로닝 벡터를 전이유전자 카세트의 작제를 위한 PCR 주형으로서 사용하였다.
분지된 스플라이스 수용체(bSA) 및 KOZAK 서열 5'- TGCTAATCTTCCTTTCTCTCTTCAGGCCGCC-3'(서열번호 36)을 PCR에 의해 GFP 유전자의 5' 말단에 부가하였다. PCR 프라이머는 또한 bSA 서열의 개시 앞에 5' Sgfl 부위를 도입하고 SV40 폴리A 서열 뒤에 3' Sbfl 부위를 도입하여 전이유전자 카세트 PCR 생성물(도 31, 서열번호 37)을 수득하였다. PCR 생성물을 증폭시키기 위해 사용되는 PCR 프라이머는 표 35에 상세히 기재되어 있다:
Figure pct00038
50 ㎕의 반응 용적은 표 36에 상세히 기재된 PCR 반응을 위해 사용하였다:
Figure pct00039
PCR 증폭은 표 37에서의 프로그램에 따라 수행하였다:
Figure pct00040
PCR 생성물은 40 ㎕의 NFW에서 스핀 칼럼 용출시킴에 의해 정제하였다. Sgfl 및 Sbfl 제한 부위를 함유하는 PCR 생성물 및 서브-클로닝 벡터를 37 ℃에서 1시간 동안 효소 Sgfl 및 Sbfl(표 38)로 분해하였다.
Figure pct00041
상기 분해된 생성물은 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하고 적당한 크기의 단편은 겔 정제하고 40 ul의 뉴클레아제가 없는 물에 용출시켰다.
상기 분해된 정제된 PCR 생성물을 실온에서 1시간 동안 10 ㎕의 반응에서 1x 리가제 완충액 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제와 함께 3 ㎕:1 ㎕의 용적에서 벡터에 대한 삽입체의 3:1 연결 비율을 사용하여 선형화된 벡터에 연결하였다.
1 ㎕의 연결 반응물을 LB + 암피실린(100 ㎍/ml) 플레이트 상의 50 ㎕의 XL 골드 세포 및 100 ㎕ 분주물에 형질전환시켰다. 밤새 성장시킨 후 >50개의 콜로니가 배양 플레이트 상에 존재하였다. 5개의 콜로니를 집어내어 암피실린을 함유하는 3 ml의 LB 브로쓰에서 밤새 배양하였다. DNA는 미니프렙으로 정제하고 40 ㎕의 완충액에 용출시켰다.
벡터내 전이유전자 카세트의 존재를 확인하기 위해, 작제물은 진단학적으로 Sgfl 및 Sbfl 제한 효소로 분해하였다.
Figure pct00042
모든 5개의 작제물은 분해물로부터 올바른 크기의 단편을 생성시켰다: 1.1 kb 및 4.7 kb의 밴드(도 32). 따라서, 작제물 #1은 서열 분석하고 GFP 전이유전자 카세트의 성공적인 작제를 확인하였다(도 31, 서열번호 37).
2) 플라스미드 NG-62의 작제
GFP 전이유전자 카세트(576 ng/㎕) 및 ColoAd2.4 플라스미드(583 ng/㎕)를 함유하는 작제물 #1은 표 40에 나타낸 반응을 사용하여 37 ℃에서 2시간 동안 Sgfl 및 Sbfl로 분해하였다:
Figure pct00043
분해물은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 분리하고 적당한 크기의 단편은 겔로부터 절단하였다. 이어서 ColoAd2.4 플라스미드는 QIAEX II 키트(QIAGEN)를 사용하여 정제하고 GFP 전이유전자 카세트는 퀵 겔 추출 키트(quick gel extraction kit) (QIAGEN)를 사용하여 정제하였다.
전이유전자 카세트(40 ng/㎕)는 1.5:1 연결 비율의 삽입체 대 벡터(2.25 ㎕: 3.7 ㎕) 또는 2:1 연결 비율(3 ㎕: 4 ㎕)을 사용하여 ColoAd2.4 플라스미드(18 ng/㎕)에 연결하였다. 상기 반응은 10 ㎕의 반응 용적에서 1 x 리가제 완충액 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제를 사용하여 수행하였다. 상기 연결은 16 ℃에서 16시간 동안 수행하였다.
4 ㎕의 연결 혼합물은 제조업자의 지침(Agilent)에 따라 50 ㎕의 XL-블루 세포에 형질전환시키고 전체 형질전환 용적은 가나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 분주하였다. 밤새 성장 후 모든 콜로니를 플레이트로부터 집어내어 37 ℃에서 250 rpm으로 가나마이신을 함유하는 3 ml의 LB 브로쓰에서 밤새 배양하였다.
DNA는 미니프렙에 의해 정제하고 40 ㎕의 완충액에 용출시켰다.
pNG-62 플라스미드가 제조되었는지를 결정하기 위해, 상기 작제물은 표 41에 상세히 기재된 바와 같이 효소 Nhel 및 EcoRV를 사용하여 제한 분해에 의해 스크리닝하였다:
Figure pct00044
상기 분해 생성물은 0.8 % 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 스크리닝된 작제물 중에, 1.5:1 비율 연결로부터 번호 1, 2 및 3 및 2:1 비율 연결로부터 번호 1, 2 및 4는 플라스미드 pNG-62의 12.3 kb, 9.7 kb, 5.5 kb 및 3.1kb의 예측된 패턴에 상응하는 밴드 크기를 보여주었다(도 33a).
추정 pNG-62 작제물 #2(1.5:1) 및 #1(2:1)은 효소 Bglll 또는 효소 Nhel 및 EcoRV로 진단적으로 추가로 제한 분해하고(도 33b) 이어서 서열 분석하였다. 이것은 플라스미드 pNG-62(서열번호 35, 도 30)의 성공적인 작제를 확인시켜 주었다.
실시예 8 NG -62 바이러스 생산 및 전이유전자 발현
실시예 7에 생성된 플라스미드 pNG-62는 선형화시키고 이를 사용하여 도입된 Sgfl 및 Sbfl 제한 부위 사이의 섬유(L5) 유전자의 다운스트림에 삽입된 리포터 유전자(GFP) 전이유전자와 함께 ColoAd1 게놈을 함유하는 생존 ColoAd1 바이러스 입자를 제조하였다.
플라스미드 pNG-62(685 ng/㎕)는 효소 Ascl로 제한 분해하여 선형화하여 NG-62 바이러스 게놈(서열번호 38)을 제조하였다. 상기 제한 분해 반응은 표 42에 따라 설정하고 37 ℃에서 2시간 동안 수행하였다.
Figure pct00045
분해된 pNG-62 DNA는 50 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물로 희석시키고 이어서 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제하였다. 이어서 상기 추출된 NG-62 DNA를 300 ㎕의 >95 %의 분자 생물학 등급 에탄올 및 10 ㎕의 3M 나트륨 아세테이트 중에 -20 ℃에서 16시간 동안 침전시켰다.
상기 침전된 DNA는 14000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화하고 다시 14000 rpm에서 5분 동안 다시 원심분리하기 전 500 ㎕ 70 % 에탄올 중에 세척하였다. 청명한 DNA 펠렛을 공기 건조시키고 15 ㎕의 리포펙타민 형질감염 시약을 함유하는 500 ㎕의 OptiMEM에 재현탁시키고 30분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서 형질감염 혼합물은 70 % 컨플루언시 때까지 성장한 Hek293 세포를 함유하는 T-25 플라스크에 적가하였다. 37 ℃에 5 % CO2에서 2시간 동안 형질감염 혼합물로 세포를 항온처리한 후 4 ml의 세포 배지(2% FBS로 보충된 글루타민과 함께 DMEM 높은 글루코스)를 세포에 첨가하고 플라스크는 37 ℃, 5 % CO2에서 항온처리하였다.
형질감염된 Hek293 세포는 24시간 마다 모니터링하였고 48시간 내지 72시간 마다 추가의 배지를 보충하였다. 바이러스의 제조는 세포 단일층에서 상당한 세포변성 효과(CPE)의 관찰에 의해 모니터링하였다. CPE가 관찰되면, 바이러스는 3회의 동결-해동 주기에 의해 Hek293 세포로부터 수거하였다. 수거된 NG-62 바이러스를 사용하여 AD293 세포에 감염시키고 감염 후 24시간 및 48시간째에 세포 단일층에서 상당한 CPE의 관찰에 의해 생존가능한 바이러스 생산을 확인하였다(도 34a). 바이러스로부터 GFP 전이유전자의 생산성 발현은 또한 면역형광 이미지화에 의해 감염된 AD293 세포에서 확인되었다(도 34b).
참조문헌들
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tggtcctgga acacaggaga 6060 tgccccagag gtgcaaacct ctgctacaac cctagtcacc tccccattta ccttttacta 6120 catcagagaa gacgactgac aaataaagtt tgcgatcgct accctgcagg aacttgttta 6180 tttgaaaatc aattcacaaa atccgagtag ttattttgcc tcccccttcc catttaacag 6240 aatacaccaa tctctcccca cgcacagctt taaacatttg gataccatta gatatagaca 6300 tggttttaga ttccacattc caaacagttt cagagcgagc caatctgggg tcagtgatag 6360 ataaaaatcc atcgggatag tcttttaaag cgctttcaca gtccaactgc tgcggatgcg 6420 actccggagt ctggatcacg gtcatctgga agaagaacga tgggaatcat aatccgaaaa 6480 cggtatcgga cgattgtgtc tcatcaaacc cacaagcagc cgctgtctgc gtcgctccgt 6540 gcgactgctg tttatgggat cagggtccac agtgtcctga agcatgattt taatagccct 6600 taacatcaac tttctggtgc gatgcgcgca gcaacgcatt ctgatttcac tcaaatcttt 6660 gcagtaggta caacacatta ttacaatatt gtttaataaa ccataattaa aagcgctcca 6720 gccaaaactc atatctgata taatcgcccc tgcatgacca tcataccaaa gtttaatata 6780 aattaaatga cgttccctca aaaacacact acccacatac atgatctctt ttggcatgtg 6840 catattaaca atctgtctgt accatggaca acgttggtta 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tctccacaat atatatatac 33120 acaagcccta aactgacgta atgggagtaa agtgtaaaaa atcccgccaa acccaacaca 33180 caccccgaaa ctgcgtcacc agggaaaagt acagtttcac ttccgcaatc ccaacaggcg 33240 taacttcctc tttctcacgg tacgtgatat cccactaact tgcaacgtca ttttcccacg 33300 gtcgcaccgc cccttttagc cgttaacccc acagccaatc accacacgat ccacactttt 33360 taaaatcacc tcatttacat attggcacca ttccatctat aaggtatatt atatagatag 33420 g 33421 <210> 39 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 350 <400> 39 tatgcgatcg ctgctaatcc tttctctctt caggccacca tggtgagcaa gggc 54 <210> 40 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 323 <400> 40 ctgaagagag aaactacctg caggaccaca tttgtagagg ttttac 46 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site <400> 41 caaaacgtcg tgagacagtt tg 22 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site <400> 42 taactataac ggtcctaagg tagcgaa 27 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site <400> 43 tagggataac agggtaat 18

Claims (30)

  1. 선택 마커 유전자 및 낮은 카피의 세균 복제 오리진을 포함하는 셔틀 벡터를 제조하는 방법으로서, 아데노바이러스 게놈은 5' ITR, 3' ITR, L5 유전자를 포함하고, 상기 방법은,
    a) 하기의 3개의 단편들:
    i) 벡터 단편의 5' 말단이 제1 제한 효소 부위로 개시하고 상기 벡터 단편의 3' 말단에서 제2 제한 효소 부위로 종결되는, 선택 마커 유전자 및 낮은 카피의 세균 복제 오리진을 포함하는 벡터 단편,
    ii) 5' 아암(arm)의 5' 말단이 제2 제한 효소 부위로 개시하고 상기 5' 아암의 3' 말단에서 제3 제한 효소 부위로 종결되는, 5' ITR을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 5' 말단을 포함하는 5'-아암,
    iii) 3' 아암의 5' 말단이 제3 제한 효소 부위로 개시하고 3' 아암의 3' 말단에서 제1 제한 효소 부위로 종결되는, 3' ITR 및 L5 유전자를 포함하는 아데노바이러스 게놈의 3' 말단을 포함하는 3'-아암
    을 동등한 비율로 연결시키고,
    1-단계 3-방식 연결을 수행하여:
    3' 아암(단편 iii)의 3' 말단을 제1 제한 효소 부위에서 벡터 단편(단편 i)의 5' 말단으로 연결하고,
    벡터 단편(단편 i)의 3' 말단을 제2 제한 효소 부위에서 5' 아암(단편 ii)의 5' 말단으로 연결하고,
    5' 아암(단편 ii)의 3' 말단을 적어도 L5 유전자의 제3 제한 효소 부위에서 3' 아암(단편 iii)의 5' 말단으로 연결하여, 제1 제한 효소 부위, 이어서 벡터 단편, 이어서 제2 제한 효소 부위, 이어서 5' 아암, 이어서 제3 제한 효소 부위, 이어서 3' 아암으로 배열된 환형화된 셔틀 벡터를 형성함을 포함하는, 아데노바이러스 셔틀 벡터를 제조하는 단계,
    b) 적어도 하나의 본래의 제한 부위 및/또는 전이유전자를 L5 유전자와 E3 부위, E4 부위 또는 상기 2개의 부위를 포함하는 (또는 이로 이루어진) 그룹으로부터 선택된 부위 사이의 위치에서 상기 셔틀 벡터로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서. 상기 5' 아암이 아데노바이러스 게놈의 5' 말단의 약 2.4 내지 4.7 kb를 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 3' 아암이 아데노바이러스 게놈의 3' 말단의 약 3.3 내지 4.8 kb를 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 3-방식 연결이 단편 i), ii) 및 iii)에 대해 1:1:1의 비율로 수행되는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 1-단계 3-방식 연결이 적어도 50분 동안 수행되는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 1-단계 3-방식 연결이 대략 실온, 예를 들어, 20 내지 25 ℃에서 수행되는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 본래의 제한 부위가 Fsel, Notl, Sbfl 및 Sgfl로부터 독립적으로 선택되는, 예를 들어, Notl 또는 Sbfl 및 Sgfl 또는 Fsel 및 Notl 및 Sbfl 및 Sgfl인, 방법.
  8. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 및 제2 제한 효소 부위가 동일한, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 벡터 단편이 탈인산화되는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 복제 오리진이 p15A인, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 선택 마커 유전자가 KanR인, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이 복제할 수 있는 아데노바이러스로부터 기원하는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 청구항에 있어서, 단계 a) 또는 단계 b)의 셔틀 벡터와 아데노바이러스 게놈 간의 상동성 재조합을 수행하여 플라스미드를 형성하는 단계 c)를 추가로 포함하는 방법.
  14. 청구항 7에 있어서, 단계 c)가 3.5:1.5의 비율로 수행되는, 방법.
  15. 청구항 6 또는 7에 있어서, 단계 c)가 전기컴피턴트(electrocompetent) BJ5183 세포에서 수행되는, 방법.
  16. 청구항 7 내지 9 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이 EnAd1, OvAd1, OvAd2, Ad3, Ad5 및 Ad11로부터 선택되는, 방법.
  17. 청구항 13 내지 16 중 어느 한 청구항에 있어서, 아데노바이러스, 예를 들어, 복제 가능한 아데노바이러스 또는 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 제조하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 아데노바이러스를 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 청구항의 방법으로부터 수득가능한 셔틀 벡터, 플라스미드, 아데노바이러스 또는 약제학적 조성물.
  20. a) L5 유전자, E3 부위 및/또는 E4 부위를 포함하는 아데노바이러스 게놈,
    b) 상기 L5 유전자와 E3 부위, E4 부위, 및 E3 부위 및 E4 부위 각각을 포함하는 (또는 이로 이루어진) 그룹으로부터 선택된 부위 사이의 위치에 적어도 하나의 본래의 제한 부위,
    c) 낮은 카피의 세균 복제 오리진, 및
    d) 선별 마커 유전자를 포함하는, 아데노바이러스 플라스미드.
  21. 청구항 14에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이 서브그룹 B 아데노바이러스 게놈, 예를 들어, EnAd, OvAd2, Ad3, Ad11 및 Ad5, 예를 들어 EnAd인, 아데노바이러스 플라스미드.
  22. 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 본래의 제한 부위가 Fsel, Notl, Sbfl 및 Sgfl로부터 독립적으로 선택되는, 아데노바이러스 플라스미드.
  23. 청구항 18 내지 20 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 본래의 제한 부위가 L5 유전자와 E3 부위 사이의 위치에 있고, 예를 들어, 상기 본래의 제한 부위가 Notl인, 아데노바이러스 플라스미드.
  24. 청구항 18 내지 21 중 어느 한 청구항에 있어서, L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치에서 적어도 2개의 본래의 제한 부위가 있고, 예를 들어, 상기 2개의 본래의 제한 부위가 Sbfl 및 Sgfl인, 아데노바이러스 플라스미드.
  25. 청구항 22에 있어서, L5 유전자와 E4 부위 사이의 위치에 3개의 본래의 제한 부위가 있는, 아데노바이러스 플라스미드.
  26. 청구항 23에 있어서, 상기 3개의 본래의 제한 부위가 Sbfl, Sgfl 및 Fsel의 각각 하나인, 아데노바이러스 플라스미드.
  27. 청구항 18 내지 26 중 어느 한 청구항에 있어서, 적어도 하나의 본래의 E1 제한 부위를 추가로 포함하는, 아데노바이러스 플라스미드.
  28. 청구항 18 내지 27 중 어느 한 청구항에 있어서, 예를 들어, 특히, 치료학적 단백질, 펩타이드 또는 RNA, 예를 들어, 항체 또는 항체 도메인, 프로-드럭 전환 효소, 면역조절인자, 효소, siRNA, 전사 인자, 세포내 시그날 전달 또는 표면 막 단백질 또는 항원을 암호화하는 목적하는 치료학적 유전자; 및 리포터 유전자 또는 루시퍼라제 또는 eGFP와 같은 이미지화제로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 전이유전자를 포함하는 전이유전자 카세트를 추가로 포함하는, 아데노바이러스 플라스미드.
  29. 치료에서 청구항 29에 따른 아데노바이러스 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 청구항 29에 따른 치료학적 유효량의 아데노바이러스 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는 환자를 치료하는 방법.
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