CN1221666C - 腺病毒穿梭质粒及其构建方法 - Google Patents

Abstract

一种腺病毒穿梭质粒，其特征在于在腺病毒上有CMV增强子-心肌肌球蛋白轻链MLC-2V启动子及单独的绿色荧光蛋白GFP基因表达盒。本发明的质粒能够携带目的基因特异地在心肌细胞中表达，用能够便于检测质粒及其携带的目的基因的转染效率，检测腺病毒的滴度。

Description

腺病毒穿梭质粒及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种腺病毒穿梭质粒及其构建方法，以及其在制备心脏基因治疗载体中的应用。

背景技术

腺病毒是无包膜的双链DNA病毒，分布十分广泛。病毒基因组包括早期基因(E1-E4)，晚期基因(L1-L5)和聚合酶(VA)，基因组两侧为逆向末端重复序列(ITR)，其中含有基因组复制和包装序列。由于腺病毒感染效率高，有相当宽的感染宿主谱，既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞(静止细胞)，载体容量大，安全性高，腺病毒不整合进宿主染色体中，不会引起恶性肿瘤的发生，迄今为止未发现其参与人体主要疾病，容易制备，因而，腺病毒载体在基因治疗和基因功能研究方面得到了广泛应用，在人类疾病基因治疗方面使用也十分广泛。

目前进行的心肌基因治疗主要包括心肌缺血区血管发生、逆转心肌细胞肥厚和降低心肌细胞凋亡等方面。动物实验研究已证明，重组腺病毒载体是感染心肌细胞最有效的载体之一。但一般的腺病毒载体不含心脏特异的基因表达启动子，不能解决基因治疗的靶向性问题，降低了基因治疗的特异性和有效性。

发明内容

本发明的目的就是为了克服一般的腺病毒载体不含特异的基因表达启动子、不能解决心脏基因治疗的靶向性的缺点，提供一种心脏基因治疗靶向性较好、提高了基因治疗效果的腺病毒穿梭质粒。本发明的另一个目的是提供其构建方法。本发明的另一个目的是提供该质粒在制备心脏基因治疗载体中的应用。

本发明的目的通过下述方案得以实现：

本发明是在商业用质粒pAdTrack-CMV及与其相似的质粒的基础上改建的，pAdTrack-CMV是Howard Hughes医学研究所的商业用质粒，其具体结构在 http://www.coloncancer.org/adeasy.htm上有详细记载。

本发明的质粒的构建采用了人心肌肌球蛋白轻链(MLC-2V)启动子，取代原质粒pAdTrack-CMV的CMV启动子，使之具有在心肌细胞表达中的特异性。构建后的质粒的碱基序列为SEQ ID NO：3。

本发明的碱基序列在人心肌肌球蛋白轻链2启动子区与多克隆位点间即2827～2350位碱基不能变动，其余部分的碱基序列可以在1％范围内变异，即99％以上相同，而不影响本发明的效果。

本发明的pAdTrack-MLC质粒具有以下两个特点：1、该质粒的多克隆位点上游采用人MLC-2V启动子，MLC-2V启动子是心肌细胞的特异性表达的启动子，本发明的质粒能够携带目的基因特异地在心肌细胞中表达；2、本发明的质粒还包括单独的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，其不与目的基因融合表达，能够与便于用来检测质粒及其携带的目的基因的转染效率，检测腺病毒的滴度。

本发明的质粒的构建也可以不采用上述商业质粒，而采用直接改建其它腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上游的增强子和启动子序列的方式获得。

本发明的穿梭质粒可以制成注射剂。

本发明的腺病毒穿梭质粒与其它心血管疾病药物可制成复方制剂，用于在制备心血管疾病药物的应用。

本发明的穿梭质粒可携带治疗基因(目的基因)，介导制备重组腺病毒，用于治疗遗传性和后天性心脏病。

附图说明

图1为本发明pAdTrack-MLC质粒的结构图谱。

图2为pAdTrack-MLC质粒构建的技术路线图。

具体实施方式

实施例1  pAdTrack-MLC质粒的构建

限制性内切酶分析表明，在pAdTrack-CMV载体多克隆位点上、下游分别有单一的限制性内切酶Nde I位点。用PCR突变法将pAdTrack-CMV多克隆位点下游的Nde I(CATATG)位点突变为CATATC，而只保留多克隆位点上游单一的Nde I位点。同时以PCR扩增连接法制备CMV增强子-MLC-2V片段，以定向克隆法将CMV增强子-MLC-2V片段替换原pAdTrack-CMV质粒的CMV增强子和启动子。

具体作法如下：根据pAdTrack-CMV载体多克隆位点下游NdeI位点上、下游两侧单一的Hind III和Nhe I位点，设计2对引物分别扩增出对应片段。第1对引物，上游引物P1，

5′-GAGCCT AAGCTTCTAGATAAGA-3′(Hind III)，下游引物P2，5′-GCGTACTTGG GATATGATACACT-3′(Nde I突变)；第2对引物，上游引物P3，5′-AGTGTAT CATATCCCAAGTACGC-3′(Nde I突变)，下游引物P4，5′-AACAGCTCCTCGCCCTTGC-3′(Nhe I在扩增范围内)。由于P2和P3是完全互补序列，因此，用P1和P4为引物，以PCR扩增连接法制备去除Nde I位点的片段，并使其5′，3′端分别引入HindIII和Nhe I识别序列。以定向克隆法将这一无Nde I位点的连接片段替换原有序列。

根据已知的人MLC-2V启动子序列，设计合成PCR引物：上游引物，5′-AATGGGAGTTTGTTTTGGACCCAGAGCACAGAG-3′，下游引物，5′-TAATA AGATCTGGCCGGCCCCTGCTGT-3′(Bgl II)，以人基因组DNA为模板，扩增获得MLC-2V片段(250bp)。序列(SEQ ID NO：1)如下：

GACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTT

TTGGGTCTCACGTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATG

GGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCCTCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGCGGTCATGGGGTTATTTTTAA

CCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCAGGGGCCGGCC

根据pAdTrack-CMV载体的CMV增强子序列(CMV enhancer)，设计合成PCR引物：上游引物，5′-GTGTAT CATATGCCAAGTAC-3′(Nde I)，下游引物，5′-CTCTGTGCTCTGGGTCCAAAACAAACTCCCATT-3′，以pAdTrack-CMV载体为模板，扩增获得CMV enhancer片段(227bp)。序列(SEQ ID NO：2)如下：

CCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGGATTATGCCCAGTACATGACC

TTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTT

TGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGAC

GTCAATGGGAGTTTGTTTTG

由于CMV enhancer的下游引物和MLC-2V的上游引物是完全互补序列，因此，用CMV enhancer的上游引物和MLC-2V的下游引物，以PCR扩增连接法制备CMV enhancer-MLC-2V连接片段，并使其5′，3′端分别引入Nde I和Bgl II识别序列。根据突变后pAdTrack多克隆位点上游CMV增强子和启动子两侧单一的Nde I和Bgl II识别位点，以定向克隆法将CMV增强子和MLC-2V片段替换CMV增强子和启动子，构建成pAdTrack-MLC。

用Southern印迹分析法鉴定，MLC-2V已整合到重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-MLC中。

技术路线如图2。

实施例2  病毒扩增、提取与纯化

以原生生物大肠杆菌为宿主细胞，用常规分子生物学方法扩增pAdTrack-MLC，并提取、纯化。具体见文献《分子克隆实验指南》([美]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，第二版)。

实施例3  细胞学实验：

以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，用脂质体法将同量的pAdTrack-CMV、pAdTrack-MLC转染培养的Hela(人子宫癌细胞株)、Ea.hy926(人胚脐静脉内皮细胞)、IMA(人肠系膜下动脉中层平滑肌细胞株)和Hep2(人肝癌细胞株)，转染后24hr，观察各组细胞中的GFP表达情况。结果发现：pAdTrack-CMV在以上细胞中都可表达，而pAdTrack-MLC不表达。

用脂质体法将同量的pAdTrack-CMV、pAdTrack-MLC转染分离培养的乳鼠心肌细胞，转染后24hr，观察各组细胞中的GFP表达情况。结果发现：pAdTrack-CMV和pAdTrack-MLC都有表达。

实验表明，本发明的pAdTrack-MLC质粒能特异地在心肌细胞内表达。

实施例4  整体动物实验：

以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，分别用pAdTrack-CMV、pAdTrack-MLC同腺病毒基因组质粒制备重组腺病毒载体rAdEasy-CMV和rAdEasy-MLC。分别将同量静脉注射新西兰兔，48hr后，取新西兰兔的心脏、肝、肺、血管等组织标本进行切片观察。结果发现，注射rAdEasy-CMV的新西兰兔的心脏、肝、肺、血管等组织内都有GFP表达，而注射rAdEasy-MLC的新西兰兔只在心肌组织中有GFP表达。

实验表明，用本发明的pAdTrack-MLC质粒构建的重组腺病毒只能在心肌组织中特异表达。

实施例3的细胞学实验结果与实验例4的整体动物实验结果一致。本发明的上述实施例是用来说明本发明的可实施的效果，而绝非对本发明的任何限制。

<110>广东省人民医院

<120>腺病毒穿梭质粒及其构建方法

<160>3

<210>1

<211>250

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>Promoter

<400>

GACCCAGAGC ACAGAGCATC GTTCCCAGGC CAGGCCCCAG CCACTGTCTC TTTAACCTTG 60

AAGGCATTTT TGGGTCTCAC GTGTCCACCC AGGCGGGTGT CGGACTTTGA ACGGCTCTTA 120

CTTCAGAAGA ACGGCATGGG GTGGGGGGGC TTAGGTGGCC TCTGCCTCAC CTACAACTGC 180

CAAAAGCGGT CATGGGGTTA TTTTTAACCC CAGGGAAGAG GTATTTATTG TTCCACAGCA 240

GGGGCCGGCC                                                        250

<210>2

<211>227

<212>DNA

<213>人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus)

<220>

<221>Enhancer

<400>

CCAAGTACGC CCCCTATTGA CGTCAATGAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCA TTATGCCCAG 60

TACATGACCT TATGGGACTT TCCTACTTGG CAGTACATCT ACGTATTAGT CATCGCTATT 120

ACCATGGTGA TGCGGTTTTG GCAGTACATC AATGGGCGTG GATAGCGGTT TGACTCACGG 180

GGATTTCCAA GTCTCCACCC CATTGACGTC AATGGGAGTT TGTTTTG               227

<210>3

<211>9164

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc-feature

<400>

NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNCGGCGC ATTAAGCGCG CGGGTGTGGT 60

GGTTACGCGC AGCGTGACCG CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT 120

CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT 180

CCCTTTAGGG TTCCGATTTA GAGCTTTACG GCACCTCGAC CGCAAAAAAC TTGATTTGGG 240

TGATGGTTCA CGTAGTGGGC CATCGCCCTG ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA 300

GTCCACGTTC TTTAATAGTG GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCGC 360

GGTCTATTCT TTTGATTTAT AAGGGATGTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA 420

GCTGATTTAA CAAAAATTTT AACAAAATTC AGAAGAACTC GTCAAGAAGG CGATAGAAGG 480

CGATGCGCTG CGAATCGGGA GCGGCGATAC CGTAAAGCAC GAGGAAGCGG TCAGCCCATT 540

CGCCGCCAAG CTCTTCAGCA ATATCACGGG TAGCCAACGC TATGTCCTGA TAGCGGTCCG 600

CCACACCCAG CCGGCCACAG TCGATGAATC CAGAAAAGCG GCCATTTTCC ACCATGATAT 660

TCGGCAAGCA GGCATCGCCA TGGGTCACGA CGAGATCCTC GCCGTCGGGC ATGCTCGCCT 720

TGAGCCTGGC GAACAGTTCG GCTGGCGCGA GCCCCTGATG CTCTTCGTCC AGATCATCCT 780

GATCGACAAG ACCGGCTTCC ATCCGAGTAC GTGCTCGCTC GATGCGATGT TTCGCTTGGT 840

GGTCGAATGG GCAGGTAGCC GGATCAAGCG TATGCAGCCG CCGCATTGCA TCAGCCATGA 900

TGGATACTTT CTCGGCAGGA GCAAGGTGAG ATGACAGGAG ATCCTGCCCC GGCACTTCGC 960

CCAATAGCAG CCAGTCCCTT CCCGCTTCAG TGACAACGTC GAGCACAGCT GCGCAAGGAA 1020

CGCCCGTCGT GGCCAGCCAC GATAGCCGCG CTGCCTCGTC TTGCAGTTCA TTCAGGGCAC 1080

CGGACAGGTC GGTCTTGACA AAAAGAACCG GGCGCCCCTG CGCTGACAGC CGGAACACGG 1140

CGGCATCAGA GCAGCCGATT GTCTGTTGTG CCCAGTCATA GCCGAATAGC CTCTCCACCC 1200

AAGCGGCCGG AGAACCTGCG TGCAATCCAT CTTGTTCAAT CATGCGAAAC GATCCTCATC 1260

CTGTCTCTTG ATCAGAGCTT GATCCCCTGC GCCATCAGAT CCTTGGCGGC GAGAAAGCCA 1320

TCCAGTTTAC TTTGCAGGGC TTCCCAACCT TACCAGAGGG CGCCCCAGCT GGCAATTCCG 1380

GTTCGCTTGC TGTCCATAAA ACCGCCCAGT CTAGCTATCG CCATGTAAGC CCACTGCAAG 1440

CTACCTGCTT TCTCTTTGCG CTTGCGTTTT CCCTTGTCCA GATAGCCCAG TAGCTGACAT 1500

TCATCCGGGG TCAGCACCGT TTCTGCGGAC TGGCTTTCTA CGTGAAAAGG ATCTAGGTGA 1560

AGATCCTTTT TNNNNNNCAA CAACGTTGCG CAAACTATTA ACTGGCGAAC TACTTACTCT 1620

AGCTTCCCGG CAACAATTAA TAGACTGGAT GGAGGCGGAT AAAGTTGCAG GACCACTTCT 1680

GCGCTCGGCC CTTCCGGCTG GCTGGTTTAT TGCTGATAAA TCTGGAGCCG GTGAGCGTGG 1740

GTCTCGCGGT ATCATTGCAG CACTGGGGCC AGATGGTAAG CCCTCCCGTA TCGTAGTTAT 1800

CTACACGACG GGGAGTCAGG CAACTATGGA TGAACGAAAT AGACAGATCG CTGAGATAGG 1860

TGCCTCACTG ATTAAGCATT GGTAACTGTC AGACCAAGTT TACTCATATA TACTTTAGAT 1920

TGATTTAAAA CTTCATTTTT AATTTAAAAG GATCTAGGTG AAGATCCTTT TTGATAATCT 1980

CATGACCAAA ATCCCTTAAC GTGAGTTTTC GTTCCACTGA GCGTCAGACC CCGTAGAAAA 2040

GATCAAAGGA TCTTCTTGAG ATCCTTTTTT TCTGCGCGTA ATCTGCTGCT TGCAAACAAA 2100

AAAACCACCG CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA GAGCTACCAA CTCTTTTTCC 2160

GAAGGTAACT GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT ACCAAATACT GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA 2220

GTTAGGCCAC CACTTCAAGA ACTCTGTAGC ACCGCCTACA TACCTCGCTC TGCTAATCCT 2280

GTTACCAGTG GCTGCTGCCA GTGGCGATAA GTCGTGTCTT ACCGGGTTGG ACTCAAGACG 2340

ATAGTTACCG GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG GGTTCGTGCA CACAGCCCAG 2400

CTTGGAGCGA ACGACCTACA CCGAACTGAG ATACCTACAG CGTGAGCTAT GAGAAAGCGC 2460

CACGCTTCCC GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA AGCGGCAGGG TCGGAACAGG 2520

AGAGCGCACG AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA CGCCTGGTAT CTTTATAGTC CTGTCGGGTT 2580

TCGCCACCTC TGACTTGAGC GTCGATTTTT GTGATGCTCG TCAGGGGGGC GGAGCCTATG 2640

GAAAAACGCC AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGCC TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA 2700

CATGTTCTTT CCTGCGTTAT CCCCTGATTC TGTGGATAAC CGTATTACCG CCTTTGAGTG 2760

AGCTGATACC GCTCGCCGCA GCCGAACGAC CGAGCGCAGC GAGTCAGTGA GCGAGGAAGC 2820

GGAAGAGCGC CTGATGCGGT ATTTTCTCCT TACGCATCTG TGCGGTATTT CACACCGNNN 2880

GGATCCTTAA TTAANNNATC ATCAATAATA TACCTTATTT TGGATTGAAG CCAATATGAT 2940

AATGAGGGGG TGGAGTTTGT GACGTGGCGC GGGGCGTGGG AACGGGGCGG GTGACGTAGG 3000

TTTTAGGGCG GAGTAACTTG TATGTGTTGG GAATTGTAGT TTTCTTAAAA TGGGAAGTTA 3060

CGTAACGTGG GAAAACGGAA GTGACGATTT GAGGAAGTTG TGGGTTTTTT GGCTTTCGTT 3120

TCTGGGCGTA GGTTCGCGTG CGGTTTTCTG GGTGTTTTTT GTGGACTTTA ACCGTTACGT 3180

CATTTTTTAG TCCTATATAT ACTCGCTCTG CACTTGGCCC TTTTTTACAC TGTGACTGAT 3240

TGAGCTGGTG CCGTGTCGAG TGGTGTTTTT TTAATAGGTT TTCTTTTTTA CTGGTAAGGC 3300

TGACTGTTAG GCTGCCGCTG TGAAGCGCTG TATGTTGTTC TGGAGCGGGA GGGTGCTATT 3360

TTGCCTAGGC AGGAGGGTTT TTCAGGTGTT TATGTGTTTT TCTCTCCTAT TAATTTTGTT 3420

ATACCTCCTA TGGGGGCTGT AATGTTGTCT CTACGCCTGC GGGTATGTAT TCCCCCGGGC 3480

TATTTCGGTC GCTTTTTAGC ACTGACCGAT GAATCAACCT GATGTGTTTA CCGAGTCTTA 3540

CATTATGACT CCGGACATGA CCGAGGAGCT GTCGGTGGTG CTTTTTAATC ACGGTGACCA 3600

GTTTTTTTAC GGTCACGCCG GCATGGCCGT AGTCCGTCTT ATGCTTATAA GGGTTGTTTT 3660

TCCTGTTGTA AGACAGGCTT CTAATGTTTA AATGTTTTTT TGTTATTTTA TTTTGTGTTT 3720

ATGCAGAAAC CCGCAGACAT GTTTGAGAGA AAAATGGTGT CTTTTTCTGT GGTGGTTCCG 3780

GAGCTTACCT GCCTTTATCT GCATGAGCAT GACTACGATG TGCTTTCTTT TTTGCGCGAG 3840

GCTTTGCCTG ATTTTTTGAG CAGCACCTTG CATTTTATAN NNGAATTCGT TTAAACNNNA 3900

GTCTGTATAC GGGGACACGG ACAGCCTTTT CGTCACCGAG CGTGGACACC GGCTCATGGA 3960

AACCAGAGGT AAGAAACGCA TCAAAAAGCA TGGGGGAAAC CTGGTTTTTG ACCCCGAACG 4020

GCCAGAGCTC ACCTGGCTCG TGGAATGCGA GACCGTCTGC GGGGCCTGCG GCGCGGATGC 4080

CTACTCCCCG GAATCGGTAT TTCTCGCGCC CAAGCTCTAC GCCCTCAAAA GTCTGCACTG 4140

CCCCTCGTGC GGCGCCTCCT CCAAGGGCAA GCTGCGCGCC AAGGGCCACG CCGCGGAGGG 4200

GCTGGACTAT GACACCATGG TCAAATGCTA CCTGGCCGAC GCGCAGGGCG AAGACCGGCA 4260

GCGCTTCAGC ACCAGCAGGA CCAGCCTCAA GCGCACCCTG GCCAGCGCGC AGCCCGGAGC 4320

GCACCCCTTC ACCGTGACCC AGACTACGCT GACGAGGACC CTGCGCCCGT GGAAAGACAT 4380

GACCCTGGCC CGTCTGGACG AGCACCGACT ACTGGCGTAC AGCGAAAGCC GCCCCAACCC 4440

GCGAAACGAG GAGATATGCT GGATCGAGAT GCCGTAGAGC AGGTGACCGA GCTGTGGGAC 4500

CGCCTGGAAC TGCTTGGTCA AACGCTCAAA AGCATGGCTA CGGCGGACGG TCTCAAACCG 4560

TTGAAAAACT TTGCTTCCTT GCAAGAACTG CTATCGCTGG GCGGCGAGCG CCTTCTGGCG 4620

GATTTGGTCA GGGAAAACAT GCGAGTCAGG GACATGCTTA ACGAAGTGGC CCCCCTGCTC 4680

AGGGATGACG GCAGCTGCAG CTCTCTTAAC TACCAGTTGC ACCCGGTAAT AGGTGTGATT 4740

TACGGGGCCA CCGGCTGCGG TAAGTCGCAG CTGCTCAGGA ACCTGCTTTC TTCCCAGCTG 4800

ATCTCCCCTA CCCCGGAAAC CGTTTTCTTC ATCGCCCCGC AGGTAGACAT GATCCCCCCA 4860

TCTGAACTCA AAGCGTGGGA AATGCAAATC TGTGAGGGTA ACTACGCCCC TGGGCCGGAT 4920

GGAACCATTA TACCGCAGTC TGGCACCCTC CGCCCGCGCT TTGTAAAAAT GGCCTATGAC 4980

GATCTCATCC TGGAACACAA CTATGACGTT AGTGATCCCA GAAATATCTT CGCCCAGGCC 5040

GCCGCCCGTG GGCCCATTGC CATCATTATG GACGAATGCA TGGAAAATCT TGGAGGTCAC 5100

AAGGGCGTCT CCAAGTTCTT CCACGCATTT CCTTCTAAGC TACATGACAA ATTTCCCAAG 5160

TGCACCGGAT ACACTGTGCT GGTGGTTCTG CACAACATGA ATCCCCGGAG GGATATGGCT 5220

GGGAACATAG CCAACCTAAA AATACAGTCC AAGATGCATC TCATATCCCC ACGTATGCAC 5280

CCATCCCAGC TTAACCGCTT TGTAAACACT TACACCAAGG GCCTGCCCCT GGCAATCAGC 5340

TTGCTACTGA AAGACATTTT TAGGCACCAC GCCCAGCGCT CCTGCTACGA CTGGATCATC 5400

TACAACACCA CCCCGCAGCA TGAAGCTCTG CAGTGGTGCT ACCTCCACCC CAGAGACGGG 5460

CTTATGCCCA TGTATCTGAA CATCCAGAGT CACCTTTACC ACGTCCTGGA AAAAATACAC 5520

AGGACCCTCA ACGACCGAGA CCGCTGGTCC CGGGCCTACC GCGCGCGCAA AACCCCTAAA 5580

TAAAGACAGC AAGACACTTG CTTGATCCAA ATCCAAACAG AGTCTGGTTT TTTATTTATG 5640

TTTTAAACCG CATTGGGAGG GGAGGAAGCC TTCAGGGCAG AAACCTGCTG GCGCAGATCC 5700

AACAGCTGCT GAGAAACGAC ATTAAGTTCC CGGGTCAAAG AATCCAATTG TGCCAAAAGA 5760

GCCGTCAACT TGTCATCGCG GGCGGATGAA CGGGAAGCTG CACTGCTTGC AAGCGGGCTC 5820

AGGAAAGCAA AGTCAGTCAC AATCCCGCGG GCGGTGGCTG CAGCGGCTGA AGCGGCGGCG 5880

GAGGCTGCAG TCTCCAACGG CGTTCCAGAC ACGGTCTCGT AGGTCAAGGT AGTAGAGTTT 5940

GCGGGCAGGA CGGGGCGACC ATCAATGCTG GAGCCCATCA CATTCTGACG CACCCCGGCC 6000

CATGGGGGCA TGCGCGTTGT CAAATATGAG CTCACAATGC TTCCATCAAA CGAGTTGGTG 6060

CTCATGCCGG CGGCGGCTGC TCCAAAACAG ATACAAAACT ACATAAGACC CCCACCTTAT 6120

ATATTCTTTC CCACCCTTAN NNTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG TTCATACCCC 6180

ATATATGGAG TTCCGCGTTG GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC CACCCCCGCC 6240

CATTGACGTC AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACCCC AATAGGGACT TTCCATTGAC 6300

GTCAATGGGT GGAGTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATCATA 6360

TGCCAAGTAC GCCCCCTATT GACGTCAATG ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CATTATGCCC 6420

AGTACATGAC CTTATGGGAC TTTCCTACTT GCCAGTACAT CTACGTATTA GTCATCCCTA 6480

TTACCATGGT GATGCGGTTT TGCCAGTACA TCAATGGCCG TGGATACCGG TTTGACTCAC 6540

GGCGATTTCC AAGTCTCCAC CCCATTGACG TCAATGGGAG TTTGTTTTGG ACCCAGAGCA 6600

CAGAGCATCG TTCCCAGCCC AGCCCCCAGC CACTGTCTCT TTAACCTTGA AGGCATTTTT 6660

GGGTCTCACG TGTCCACCCA CGCGGGTGTC GGACTTTGAA CGCCTCTTAC TTCAGAAGAA 6720

CCGCATGGGG TGGGGGGCCT TAGGTGGCCT CTCCCTCACC TACAACTGCC AAAAGCGGTC 6780

ATGGGGTTAT TTTTAACCCC AGGGAAGACC TATTTATTGT TCCACACCAG GGGCCGGCCA 6840

GATCTGGTAC CGTCGACCCG CCCGCTCGAG CCTAAGCTTC TAGATAAGAT ATCCGATCNN 6900

TGGAGTTCGT GACCGCCGCC GGGATCACTC TCGGCATGGA CGAGCTGTAC AAGTCCGGAC 6960

TCAGATCCAC CGGATCTAGA TAACTGATCA TAATCAGGCA TACCACATTT GTAGAGGTTT 7020

TACTTGCTTT AAAAAACCTC CCACACCTCC CCCTGAACCT GAAACATAAA ATGAATGCAA 7080

TTGTTGTTGT TAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA 7140

CAAATTTCAC AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA 7200

TCAATGTATC TTAACGCGNN NTAATAGTAA TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA 7260

TATATGGAGT TCCGCGTTAC ATAACTTACG GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC 7320

GACCCCCGCC CATTGACGTC AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT 7380

TTCCATTGAC GTCAATGGGT GGAGTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA 7440

GTGTATCATA TCCCAAGTAC GCCCCCTATT GACGTCAATG ACCGTAAATG GCCCGCCTGG 7500

CATTATGCCC AGTACATGAC CTTATGGGAC TTTCCTACTT GGCAGTACAT CTACGTATTA 7560

GTCATCGCTA TTACCATGGT GATGCGGTTT TGGCAGTACA TCAATGGGCG TGGATAGCGG 7620

TTTGACTCAC GGGGATTTCC AAGTCTCCAC CCCATTGACG TCAATGGGAG TTTGTTTTGG 7680

CACCAAAATC AACGGGACTT TCCAAAATGT CGTAACAACT CCGCCCCATT GACGCAAATG 7740

GGCGGTAGGC GTGTACGGTG GGAGGTCTAT ATAAGCAGAG CTGGTTTAGT GAACCGTCAG 7800

ATCCGCTAGC GCTACCGGTC GCCACCATGG TGAGCAAGGG CGAGGAGCTG TTCACCGGGG 7860

TGGTGCCCAT CCTGGTCGAG CTGGACGGCG ACGTAAACGG CCACAAGTTC AGCGTGTCCG 7920

GCGAGGGCGA GGGCGATGCC ACCTACGGCA AGCTGACCCT GAAGTTCATC TGCACCACCG 7980

GCAAGCTGCC CGTGCCCTGG CCCACCCTCG TGACCACCCT GACCTACGGC GTGCAGTGCT 8040

TCAGCCGCTA CCCCGACCAC ATGAAGCAGC ACGACTTCTT CAAGTCCGCC ATGCCCGAAG 8100

GCTACGTCCA GGAGCGCACC ATCTTCTTCA AGGACGACGG CAACTACAAG ACCCGCGCCG 8160

AGGTGAAGTT CGAGGGCGAC ACCCTGGTGA ACCGCATCGA GCTGAAGGGC ATCGACTTCA 8220

AGGAGGACGG CAACATCCTG GGGCACAAGC TGGAGTACAA CTACAACAGC CACAACGTCT 8280

ATATCATGGC CGACAAGCAG AAGAACGGCA TCAAGGTGAA CTTCAAGATC CGCCACAACA 8340

TCGAGGACGG CAGCGTGCAG CTCGCCGACC ACTACCAGCA GAACACCCCC ATCGGCGACG 8400

GCCCCGTGCT GCTGCCCGAC AACCACTACC TGAGCACCCA GTCCGCCCTG AGCAAAGACC 8460

CCAACGAGAA GCGCGATCAC ATGGTCCTGC TGGAGTTCGT GACCGCCGCC GGGATCACTC 8520

TCGGCATGGA CGAGCTGTAC AAGTCCGGAC TCAGATCCAC CGGATCTAGA TAACTGATCA 8580

TAATCAGCCA TACCACATTT GTAGAGGTTT TACTTGCTTT AAAAAACCTC CCACACCTCC 8640

CCCTGAACCT GAAACATAAA ATGAATGCAA TTGTTGTTGT TAACTTGTTT ATTGCAGCTT 8700

ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC AAATAAAGCA TTTTTTTCAC 8760

TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC TTAACGCGNN NTTACGCGCT 8820

ATGAGTAACA CAAAATTATT CAGATTTCAC TTCCTCTTAT TCAGTTTTCC CGCGAAAATG 8880

GCCAAATCTT ACTCGGTTAC GCCCAAATTT ACTACAACAT CCGCCTAAAA CCGCGCGAAA 8940

ATTGTCACTT CCTGTGTACA CCGGCGCACA CCAAAAACGT CACTTTTGCC ACATCCGTCG 9000

CTTACATGTG TTCCGCCACA CTTGCAACAT CACACTTCCG CCACACTACT ACGTCACCCG 9060

CCCCGTTCCC ACGCCCGCGC CACGTCACAA ACTCCACCCC CTCATTATCA TATTGGCTTC 9120

AATCCAAAAG GGGCAGAGAG CTGGAAGGGA NNNTTAATTA ANNN                  9164

Claims (4)

1、一种腺病毒穿梭质粒，其特征在于所述质粒是将pAdTrack-CMV的启动子被人心肌肌球蛋白轻链MLC-2V启动子所取代，并且携带有绿色荧光蛋白GFP基因表达盒。

2、根据权利要求1所述的腺病毒穿梭质粒，其特征在于其碱基序列为SEQ ID NO：3。

3、一种如权利要求1的腺病毒穿梭质粒的构建方法，其特征在于用PCR突变法将pAdTrack-CMV多克隆位点下游的Nde I(CATATG)位点突变为CATATC，而只保留多克隆位点上游单一的Nde I位点，同时以PCR扩增连接法制备CMV增强子-MLC-2V片段，以定向克隆法将CMV增强子-MLC-2V片段替换原pAdTrack-CMV质粒的CMV增强子和启动子。

4、权利要求1的腺病毒穿梭质粒在制备心肌基因治疗载体中的应用。

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