CN1665565A - Ghrelin－载体偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是ghrelin或ghrelin衍生肽的阵列。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含病毒样颗粒和至少一个与之结合的ghrelin或ghrelin衍生肽。本发明也提供制备偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于疫苗的制备，该疫苗用于治疗肥胖症和与食物摄取增加或体重增加有关的其它疾病，以及有效诱导免疫应答，特别是抗体应答。此外，本发明的组成物尤其可用于在所述范围内有效诱导自身特异性免疫应答。

Description

GHRELIN-载体偶联物
发明背景
发明领域
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是ghrelin或ghrelin衍生肽的阵列。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含病毒样颗粒和至少一种与之结合的ghrelin或ghrelin衍生肽。
本发明也提供分别制备偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于制备疫苗，该疫苗用于治疗肥胖症和与食物摄取增加或体重增加有关的其它疾病，以及有效诱导免疫应答，特别是抗体应答。此外，本发明的组成物尤其可用于在所述范围内有效诱导自身特异性免疫应答。
相关技术
肥胖是影响全世界数百万人的一种疾病。尽管肥胖的原因可能多种多样，但是几乎所有类型的肥胖的一个共同原因是食物摄取增多。有许多因子可以调节饥饿和进食行为，包括leptin(瘦素)、生长激素(GH)、神经肽Y(NPY)、刺豚鼠(agouti)相关蛋白(AGRP)等。最近鉴定的一种重要的进食行为调节因子是ghrelin(胃饥饿素)，它是胃以及脑的某些部分(下丘脑)中产生的一种酰化肽(Kojima等人．Nature 402：656-660(1999))。Ghrelin由含有117个氨基酸的前蛋白原(prepro)形式酶切产生，获得在丝氨酸3处n-辛酰化的28个氨基酸长的肽。生物活性ghrelin需要在该位点n-辛酰化。已经鉴定了27个氨基酸的ghrelin第二同种型(Ghrelin-desQ14)，它在位点14处缺乏一个谷氨酰胺(Q)，然而这个同种型只是循环ghrelin的一种次要组成。同全长ghrelin一样，Ghrelin-des-Q14的生物活性依赖丝氨酸3上的n-辛酰基。然而，最强的功能活性来自于28个氨基酸的ghrelin同种型(Hosoda等人．Biochem.Biophys.Res.Commun.279(3)：909-913(2000))。Ghrelin高度保守，人和大鼠ghrelin只有2个氨基酸不同(GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：31)与GSSFLSPEHQKAQQ-RKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：32))(Kojima等人．Nature 402：656-660(1999))。
ghrelin受体(GHS-R)在大脑的不同区域表达，包括下丘脑中的弓状核(Arc)和腹内侧核以及脑垂体(Howard等人．Science273：974-977(1996))；McKee等人．Mol Endokrin.11：415-423(1997)；Guan等人，Mol brain research 48：23-29(1997))，表明ghrelin主要在脑中起作用。除了刺激脑垂体释放GH之外(Kojima等人．Nature 402：656-660(1999))，最近还确定ghrelin是一种重要的中枢进食调节剂(Nakazato等人，Nature 409：194-198(2001))。具体而言，在脑室内施用后，ghrelin显示可刺激进食。而且，脑室内施用抗ghrelin抗体可抑制进食。Ghrelin注射诱导NPY释放的上调，抗NPY抗体以及AGRP拮抗剂阻断ghrelin诱导的进食，提示ghrelin通过增强NPY和AGRP的表达调节进食(Nakazato等人，Nature 409：194-198(2001))。此外，在小鼠和大鼠中，每日外周施用ghrelin可诱导体重增加，在禁食的大鼠中血清ghrelin浓度升高，进食可以降低其浓度，这进一步提示ghrelin在调节进食方面起重要作用(Tschop等人，Nature 407：908-912)。在Arc中表达反义GHS-RRNA的转基因大鼠表现为较轻的体重和较少的脂肪组织，这支持ghrelin调节体重的观点(Shuto等人，JCI 109：1429-1436(2002))。也有证据表明ghrelin在人类进食行为中的重要作用。对人外周施用ghrelin可增强食欲，增加人的食物摄取(Wren等人，J ClinEndocrinol Metab 86：5992-5998(2001))。普拉德-威利综合征(Prader-Willi Syndrome)是人类综合性肥胖的最常见形式，其患者显示显著升高的ghrelin水平(Cummings等人．Nat Med 8：643-644(2002))。另外，在节食诱导的体重减轻后，人血浆ghrelin水平也强烈升高，这与人们在停止节食后体重快速恢复有关。相反，在行胃旁路术的患者中，在节食期间及以后ghrelin水平仍然较低，在这种情况下患者通常不恢复体重((Cummings等人，N Engl J Med21：1623-1630(2002))。因此，在人类，ghrelin似乎是食物摄取和体重的重要调节剂。
由于外周施用ghrelin能够提高食物摄取，导致体重增加(Tschop等人，Nature 407：908-912)，因此胃产生的ghrelin可能通过血流到达大脑，并触发进食。因此，在动物和人类中，可能可以通过阻断ghrelin从血液向大脑迁移，从而停止食物摄取。已经证明特异性抗体能够阻断ghrelin在脑中的作用(Nakazato等人，Nature409：194-198(2001))，外周抗体也可能能够阻断周围ghrelin的作用。另外，由于抗体无法穿过血脑屏障，因此ghrelin特异性抗体或许能够将ghrelin与大脑隔离，而不能作用于脑中的ghrelin。这是一个特别有吸引力的可能性，因为ghrelin也在脑中产生，可能发挥不同于调节食物摄取的功能(Nakazato等人，Nature 409：194-198(2001))。因此，肥胖症的一种可能的治疗方法是在宿主中诱导ghrelin特异性抗体，使ghrelin被长期阻断，从而使食物摄取减少，这与行胃旁路术的患者中所见类似。
WO98/42840公开了ghrelin和ghrelin衍生片段对胃肠道的影响，特别是对胃动力和胃排空的影响。另外，US 6′420′521也公开了短ghrelin肽影响胃功能(包括胃排空、胃收缩性和葡萄糖吸收)的用途。
然而，通常难以诱导针对肽，特别是针对自身肽的抗体应答。提高接种效率的一种方法是提高所用抗原的重复程度。与分离的蛋白质不同，在不用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下，病毒均诱导快速、有效的免疫应答(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。尽管病毒通常几乎不含蛋白质，但是它们比其分离的成分能引发更强的免疫应答。对于B细胞应答，众所周知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和秩序。许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示规则的表位阵列，可有效交联B细胞上表位特异性免疫球蛋白(Bachmann和Zinkernagel，Immunol.Today17：553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是一种强激活信号，可直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生。进而，这些触发的B细胞能够激活T辅助细胞，随后诱导B细胞由产生IgM抗体向产生IgG抗体的转换，以及长期B细胞记忆的产生—这是所有接种的目标(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。病毒结构甚至与自身免疫病中抗抗体的产生有关，是对病原体的自然应答的—部分(参见Fehr，T.等人，J.Exp.Med.185：1785-1792(1997))。因此，高度组织的病毒表面所呈递的抗体能够诱导强烈的抗抗体应答。
然而，如上所述，免疫系统通常不能产生抗自身来源结构的抗体。对于低浓度存在的可溶性抗原，这是由于在Th细胞水平上的耐受。在这种情况下，将自身抗原与一种能够输送T辅助细胞的载体偶联可以打破这种耐受。对于高浓度存在的可溶性蛋白质或低浓度的膜蛋白，B细胞和Th细胞可能耐受。然而，B细胞耐受可能是可逆的(无反应性)，施用与外源载体偶联的高度组织形式的抗原能够打破这种耐受(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。
发明概述
我们发现，ghrelin或ghrelin肽，与具有内在重复组织结构的核心颗粒结合，特别是分别与病毒样颗粒(VLP)和VLP亚单位结合，所产生的高度有序、重复的偶联物是诱导特异性抗体的强免疫原。本发明提供了肥胖症和相关疾病的一种预防和治疗方法，该方法基于有序、重复的ghrelin或ghrelin衍生肽核心颗粒阵列，具体而言分别基于VLP-ghrelin/ghrelin肽偶联物和阵列。这种预防和治疗组成物在接种的动物和人中能够诱导高滴度的抗ghrelin抗体。因此，本发明集中于ghrelin及其脑相关特性。而且，本发明还集中于ghrelin在脑中的中枢效应，更重要的是对食欲、生长激素分泌和能量稳态的调节。因此，优选地，我们的接种策略诱导的抗体能够结合ghrelin的n-辛酰化形式。如上所述，当与核心颗粒偶联时，或者优选地在佐剂中施用时，ghrelin或较短的ghrelin肽片段也能够用来在人和动物中诱导ghrelin特异性抗体。
因此，ghrelin的短肽片段，特别是在C端或N端分别与核心颗粒或病毒样颗粒偶联的残基24-33、42-51、31-41和28-37的相应较短肽，能够诱导高度特异性抗ghrelin抗体，这些抗体能够在外周循环的ghrelin进入CNS之前中和它们，并对生长激素从而对食物摄取发挥作用。
因此在本发明的一个优选实施方案中，抗原或抗原决定簇选自对应于SEQ ID NO：144-146所示任意序列的残基24-33、42-51、31-41和28-37的ghrelin肽，其中所述优选的ghrelin肽片段选自：(a)人ghrelin；(b)牛ghrelin；(c)绵羊ghrelin；(d)狗ghrelin；(e)猫ghrelin；(f)小鼠ghrelin；(g)猪ghrelin；和(h)马ghrelin。
更具体而言，在本发明中，我们令人惊讶地诱导了高水平的能够识别ghrelin的n-辛酰化形式的抗体(如此处所述，特别是如实施例17所述)。而且，产生的抗体也识别另外一种同种型，Ghrelin-desQ14。因此，用C端或N端分别与核心颗粒或优选地与VLP连接的ghrelin和ghrelin肽接种产生的抗体能够阻断n-辛酰化ghrelin进入脑内，调节小鼠的食物摄入。因此，本发明集中于针对活性ghrelin的接种策略，作为肥胖症及其它相关疾病的一种治疗方法。
如此处所述，特别是如实施例18所述，用C端或N端分别与核心颗粒或优选地与VLP连接的ghrelin和ghrelin肽接种可使小鼠的食物摄取减少，提示ghrelin和ghrelin肽分别是食物摄取的重要调节因子，针对ghrelin和ghrelin肽的抗体分别被认为是肥胖症和其它相关疾病的可能的治疗方法。
本发明因此提供一种组成物，其包含：(a)核心颗粒，其含有至少一个第一附着位点；(b)至少一种抗原或抗原决定簇，其含有至少一个第二附着位点，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin衍生肽，所述第二附着位点选自：(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与第一附着位点连接；其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。适用于本发明的核心颗粒的优选实施方案有病毒、病毒样颗粒、噬菌体、RNA噬菌体的病毒样颗粒、细菌菌毛或鞭毛，或具有内在重复结构、能够形成本发明有序、重复抗原阵列的其它任何核心颗粒。
更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是ghrelin或ghrelin衍生肽VLP偶联物。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含病毒样颗粒和至少一种与之结合的ghrelin或ghrelin衍生肽。本发明也提供分别制备偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于制备治疗肥胖症和相关疾病的疫苗，以及预防或治疗肥胖症和相关疾病并有效诱导免疫应答、特别是抗体应答的药物疫苗(pharmaccine)。而且，在所述范围内，本发明的组成物尤其可用于有效诱导自身特异性免疫应答。
在本发明中，ghrelin或ghrelin衍生肽一般以定向方式分别与核心颗粒和VLP结合，产生有序、重复的ghrelin或ghrelin衍生肽抗原阵列。而且，核心颗粒和VLP的高度重复、组织的结构分别介导ghrelin或ghrelin衍生肽以高度有序、重复的方式展示，产生高度组织、重复的抗原阵列。此外，ghrelin或ghrelin衍生肽分别与核心颗粒和VLP的结合还提供T辅助细胞表位，因为对于分别用核心颗粒-ghrelin或ghrelin衍生肽阵列和VLP-ghrelin或ghrelin衍生肽阵列免疫的宿主而言，核心颗粒和VLP是外源的。这些阵列在其高度组织结构、大小和阵列表面的抗原重复性等方面不同于现有技术的偶联物。
本发明的一个方面，ghrelin或ghrelin衍生肽在合适的表达宿主中表达或者合成，而核心颗粒和VLP从分别适于核心颗粒和VLP折叠和装配的表达宿主中表达和纯化。ghrelin或ghrelin衍生肽可以化学合成。由于生物活性ghrelin在位点3处含有一个n-辛酰化丝氨酸，因此化学合成是制备用于含有生物活性形式ghrelin的疫苗制剂的ghrelin的优选方法。然后将ghrelin或ghrelin衍生肽分别与核心颗粒和VLP结合，装配成ghrelin或ghrelin衍生肽阵列。
另一方面，本发明提供一种组成物，其包含：(a)病毒样颗粒，和(b)至少一种抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin衍生肽，所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含：(a)本发明的组成物，和(b)药物可接受载体。
另一方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含含有下列成分的组成物：(a)核心颗粒，其含有至少一个第一附着位点；(b)至少一种抗原或抗原决定簇，其含有至少一个第二附着位点，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin衍生肽，所述第二附着位点选自：(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与第一附着位点连接；其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
另一方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含一种含有如下成分的组成物：(a)病毒样颗粒；和(b)至少一种抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin衍生肽；其中至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
另一方面，本发明提供一种生产权利要求1的组成物的方法，该方法包括：(a)提供病毒样颗粒；(b)提供至少一种抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin衍生肽；(c)将所述病毒样颗粒与所述至少一种抗原或抗原决定簇混合，使得所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
类似地，本发明提供一种生产本发明组成物的方法，该方法包括：(a)提供含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)提供含有至少一个第二附着位点的至少一种抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin衍生肽，所述第二附着位点选自：(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点；其中所述第二附着位点能够与第一附着位点连接；(c)将所述核心颗粒与所述至少一种抗原或抗原决定簇混合，其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
另一方面，本发明提供一种免疫方法，包括对动物或人施用权利要求1的组成物。
另一方面，本发明提供权利要求1的组成物在生产用于治疗肥胖症或相关疾病的药物中的应用。
另一方面，本发明提供权利要求1的组成物在制备用于治疗或预防肥胖症或相关疾病的药物中的应用。此外，另一方面，本发明也提供权利要求1的组成物单独或与其它试剂组合在生产用于治疗或预防肥胖症或相关疾病和/或刺激哺乳动物免疫系统的组成物、疫苗、药物或药剂中的应用。
因此，本发明具体提供适于预防和/或缓解或治疗肥胖症或相关疾病的疫苗组合物。本发明还提供免疫和接种方法，分别用于动物(特别是宠物如猫或狗)以及人类预防和/或缓解或治疗肥胖症或相关疾病。本发明的组合物可以用于预防或治疗目的。
在具体实施方案中，本发明提供预防、治疗和/或缓解由“自身”基因产物，即如此处所用的“自身抗原”引起或加重的肥胖症或相关疾病的方法。在相关实施方案中，本发明提供分别在动物和个体中诱导免疫应答的方法，可产生可预防、治疗和/或缓解由“自身”基因产物引起或加重的肥胖症或相关疾病的抗体。
本领域普通技术人员应当理解，当对动物或人施用本发明的组成物时，它们可以在含有盐、缓冲液、佐剂或希望用来提高组合物效能的其它物质的组合物之中。在大量资料中提供了适于制备药物组合物的材料的例子，包括《Remington药学》(Remington’s Pharma ceuticalSciences)(Osol，A编著，Mack Publishing Co.(1990))。
如果接受个体能够耐受本发明的组合物的施用，则称该组合物是“药理学可接受的”。此外，本发明的组合物将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效应的量)施用。
本发明的组合物可以通过本领域公知的多种方法施用，但是通常通过注射、输液、吸入、口服或其它适当的物理方法施用。组合物也可肌肉内、静脉内或皮下施用。用于施用的组合物成分包括无菌水(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭性包衣提高皮肤通透性并提高抗原吸收。
根据本领域所知、本发明的以下描述和权利要求书，本领域普通技术人员应当了解本发明的其它实施方案。
附图简述
图1显示鼠C-Ghrelin(SEQ ID：No.77)或鼠Ghrelin-GC(SEQID：No.105)与Qβ衣壳蛋白反应产生的偶联产物。第M道是分子量标准，第1道显示衍生化的Qβ VLP，第2道显示可溶性级分中的Qβ-C-Ghrelin，第3道显示不可溶级分中的Qβ-C-Ghrelin，第4道显示可溶性级分中的Ghrelin-GC-Qβ，第5道显示不可溶级分中的Ghrelin-GC-Qβ。在不可溶级分中只有极少的产物。
图2显示小鼠在第0、14、21、42天用鼠Qβ-C-Ghrelin(Qb-cGhr)、鼠Ghrelin-GC-Qβ(Qb-GhrC)或PBS免疫后，在合并的小鼠血清中检测到的ghrelin特异性IgG抗体的平均滴度。ELISA滴度表示为在ELISA测定中达到半数最大0D的血清稀释度。ELISA板用丝氨酸辛酰化的鼠ghrelin(Bachem，产品号H-4862)以20μg/ml的浓度包被。封闭平板，然后与连续稀释的第14、21、42天的小鼠血清一起孵育。用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。也检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。
图3显示小鼠用鼠Qβ-C-Ghrelin(Qb-cGhr)、鼠Ghrelin-GC-Qβ(Qb-GhrC)或PBS免疫后，小鼠的累积食物消耗。用PBS免疫小鼠作为对照。在第0-14天，所有小鼠都给予正常饮食。随后给予所有小鼠高脂肪(45％)饮食，以促进饮食诱导的肥胖的发展。食物和水随意给予。监测各个小鼠的体重变化，在免疫后(免疫后第5、11、14、21、28、35、40、49和55天)也定期监测每个笼子(即组)的食物与水的消耗。
发明详述
除非另外定义，此处所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。下文描述了优选的材料与方法，但是在本发明的实施与试验中可以使用与此处所述相似或相当的任何材料与方法。
1.定义
佐剂：此处所用的术语“佐剂”指免疫应答的非特异性刺激物，或者可以在宿主中产生贮存的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物混合时，可以引起更强的免疫应答。可以使用多种佐剂。例子包括：弗氏完全及不完全佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。其它佐剂包括：无机凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚，以及潜在的可用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。这些佐剂在本领域公知。能够与本发明的组成物一起施用的其它佐剂包括但不限于：单磷酰脂免疫调节剂、AdjuVax100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可包括这些物质的混合物。
来源于南美树木Quillaja Saponaria Molina树皮的、具有佐剂活性的免疫活性皂苷级分为本领域公知。例如，QS21，也被称为QA21，是一种HPLC纯化的来自Quillaja Saponaria Molina树的级分，其生产方法在美国专利号5,057,540中公开(作为QA21)。Scott等人，Int.Archs.Allergy Appl.Immun.，1985，77，409也公开了作为佐剂的Quillaja皂苷。单磷酰脂A及其衍生物为本领域公知。一种优选的衍生物是3脱氧酰化的单磷酰脂A，由英国专利号2220211公开。进一步优选的佐剂在WO00/00462中描述，其公开内容在此引用作为参考。
然而，本发明的一个有利的特征是本发明组成物的高免疫原性。如此处已经概述的，或者随着本说明书下面将要说明的，在另外一个或优选的实施方案中，提供了不含佐剂的疫苗和药物组合物，形成不含佐剂的治疗AD的疫苗和药物组合物，从而具有出色的安全性，因为佐剂可引起副作用。如此处所用的术语“不含”在治疗AD的疫苗和药物组合物方面指不加佐剂使用的疫苗和药物组合物。
氨基酸接头：本说明书中的“氨基酸接头”，也被称为“接头”，在此使用时，将抗原或抗原决定簇与第二附着位点连接，或者更优选地，已经包含或含有第二附着位点，一般—但不是一定—是一个氨基酸残基，优选的是半胱氨酸残基。然而，此处所用的术语“氨基酸接头”并非意味着这种氨基酸接头只是由氨基酸残基组成，但是由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的一个优选实施方案。氨基酸接头的氨基酸残基优选地包含本领域公知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸，所有L-或所有D-氨基酸或其混合物。然而，本发明也包括含有具有巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头。这样的分子优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。然而，除了氨基酸接头外，本发明范围内也包括优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分且不含任何氨基酸的接头。抗原或抗原决定簇或任选地第二附着位点与氨基酸接头之间优选通过至少一个共价键，更优选通过至少一个肽键连接。
动物：此处所用的术语“动物”包括例如：人、绵羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、水貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类动物。
抗体：此处所用的术语“抗体”指能够结合表位或抗原决定簇的分子。该术语包括整个抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。最优选地，这些抗体是人抗原结合性抗体片段，包括但不限于：Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段。抗体可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。此处所用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白文库的抗体，或者来自一种或多种不表达内源免疫球蛋白的人免疫球蛋白转基因动物的抗体，如授予Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598所述。
抗原：此处所用的术语“抗原”指如果被MHC分子呈递，即能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。此处所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的激活。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或者连接于Th细胞表位，并且包含于佐剂中。一种抗原可能包含一种或多种表位(B和T表位)。上述特异性反应指抗原优选地一般以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。此处所用的抗原也可以是几种抗原的混合物。
抗原决定簇：此处所用的术语“抗原决定簇”指可被B或T淋巴细胞特异识别的抗原部分。B淋巴细胞响应抗原决定簇产生抗体，而T淋巴细胞通过增殖和建立介导细胞和/或体液免疫所必须的效应功能来响应抗原决定簇。
连接(association)：此处所用的术语“连接”当用于第一和第二附着位点时，指第一与第二附着位点优选地通过至少一个非肽键结合。连接的性质可以是共价、离子、疏水、极性的或其任意组合，优选地，连接的性质是共价的。
第一附着位点：此处所用的短语“第一附着位点”指非天然或天然来源的一种元件，位于抗原或抗原决定簇上的第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。第一附着位点通常且优选地位于核心颗粒(优选地如病毒样颗粒)表面。核心和病毒样颗粒表面上分别存在多个一般为重复构型的第一附着位点。
第二附着位点：此处所用的短语“第二附着位点”是指与抗原或抗原决定簇有关的元件，位于核心颗粒和病毒样颗粒表面的第一附着位点分别可与之连接。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。抗原或抗原决定簇上存在至少一个第二附着位点。因此，术语“包含至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇”指至少含有抗原或抗原决定簇和第二附着位点的抗原或抗原性构建体。然而，特别是对于非天然来源(即在抗原或抗原决定簇内非天然存在)的第二附着位点，这些抗原或抗原性构建体含有“氨基酸接头”。
结合(bound)：此处所用的术语“结合”指结合或附着，它们可以是共价的，例如通过化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是，例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比术语如“偶联”、“融合”和“附着”范围更广，并且包括后者。
外壳蛋白：此处所用的术语“外壳蛋白”是指噬菌体或RNA噬菌体的蛋白质，能够参与噬菌体或RNA噬菌体的衣壳装配。然而，当指RNA噬菌体外壳蛋白基因的具体基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的具体基因产物被称为“Qβ CP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包含“Qβ CP”以及A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要由QβCP组成，含有少量A1蛋白。同样，VLP Qβ外壳蛋白主要含有Qβ CP，以及少量A1蛋白。
核心颗粒：此处所用的术语“核心颗粒”指具有固有重复组织的刚性结构。此处使用的核心颗粒可以是合成方法的产物或生物学方法的产物。
偶联的：此处所用的术语“偶联的”指通过共价键或通过强非共价相互作用附着，一般且优选地指通过共价键附着。本领域技术人员常用来偶联生物活性物质的任何方法都能在本发明中使用。
有效量：此处所用的术语“有效量”是指足以达到希望的生物学效应的量或必需的量。组合物的有效量是获得这种所选结果的量，此量可由本领域技术人员常规确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量是引起免疫系统激活、在暴露于抗原后产生抗原特异性免疫应答所必需的量。该术语也与“足量”同义。
用于任何具体用途的有效量根据如下因素而不同：所治疗的疾病、具体施用的组合物、患者体重和/或疾病的严重程度。本领域普通技术人员能够根据经验确定本发明的具体组合物的有效量，而不需要过多的实验。
表位：此处所用的术语“表位”指在动物、优选地哺乳动物、最优选地人类中具有抗原或免疫原活性的多肽的连续或不连续部分。表位可被抗体或通过在MHC分子内的T细胞受体被T细胞识别。此处所用的“免疫原性表位”定义为能够在动物中引发抗体应答或诱导T细胞应答的多肽部分，这可通过本领域公知的任何方法测定。(参见，例如：Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983))。此处所用的术语“抗原性表位”定义为抗体能够免疫特异地结合其抗原的蛋白质部分，这种特异性结合可通过本领域公知的任何一种方法测定。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位不一定必须是免疫原性的。抗原性表位也可以是T细胞表位，此时它们能够被MHC分子内的T细胞受体免疫特异地结合。
一个表位可以以该表位唯一的空间构象包含3个氨基酸。一个表位通常由至少约5个这样的氨基酸组成，更常见地由至少约8-10个这样的氨基酸组成。如果表位是一种有机分子，它可以象硝基苯基一样小。
融合：此处所用的术语“融合”指不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合在一条多肽链中组合。除了与末端之一融合外，术语“ 融合”还包括内部融合，即不同来源的序列插入一条多肽链内。
Ghrelin：此处所用的术语“ghrelin”是指来源于ghrelin基因编码的蛋白质的肽。此处所用的ghrelin包括人、猫、狗和所有家畜以及其它一些动物中已知的所有形式的ghrelin。此处所用的Ghrelin包括含有或者不含n-辛酰基修饰的ghrelin。而且，ghrelin也包括ghrelin存在的所有剪接变体。另外，由于不同种的ghrelin之间存在高度序列同源性(在大鼠与人ghrelin之间只有两个氨基酸交换(Kojima等人．Nature 402：656-660(1999))，与人ghrelin具有80％以上、优选地90％以上、更优选地95％以上、更优选地99％以上同一性的ghrelin的所有天然变体在此都被称为“ghrelin”。
如此处所用的术语“ghrelin衍生肽”或“ghrelin肽”被广泛定义为任何如下所述的肽：它是ghrelin的一部分，含有原始ghrelin肽的至少2个、优选地至少3个、更优选地至少4个、更优选地至少5个、或者至少6个、更优选地至少8个或9个、甚至更优选地至少10个连续氨基酸。一般而言，“ghrelin肽”和“ghrelin片段”可以互换使用。而且，此处所用的术语“ghrelin肽及其片段”除了ghrelin肽之外还包括所述ghrelin肽的任何部分，其中所述部分可以优选地通过在N端和/或C端缺失一个或多个氨基酸产生。通过在真核或原核表达系统中重组表达能够获得Ghrelin肽，它们表达为单独的ghrelin肽，或与其它氨基酸或蛋白质的融合体，例如为了利于ghrelin肽的折叠、表达或可溶性，或者利于ghrelin肽的纯化。为了利于或者使ghrelin肽与VLP或衣壳亚单位蛋白质的融合蛋白能够正确折叠，可以向ghrelin肽的N端或C端添加一个或多个氨基酸。为了使ghrelin肽与VLP或衣壳或核心颗粒的亚单位蛋白质能够偶联，可以向ghrelin肽添加至少一个第二附着位点。此外，ghrelin肽也可以利用本领域公知的方法合成。这些肽甚至可以含有在相应的ghrelin蛋白中不存在的氨基酸。这些肽可以通过n-辛酰化修饰。
残基：此处所用的术语“残基”指多肽骨架或侧链中的具体氨基酸。
免疫应答：此处所用的术语“免疫应答”指导致B和/或T淋巴细胞和/或抗原呈递细胞激活或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，在某些情况下，免疫应答可能是低强度的，只有在使用至少一种根据本发明的物质时才能检测到。“免疫原性的”指用来刺激活生物免疫系统的试剂，使得免疫系统的一种或多种功能增强，并且针对该免疫原性剂。“免疫原性多肽”是能引发细胞和/或体液免疫应答的多肽，无论它是单独的还是与载体相连接，使用还是不使用佐剂。优选地，抗原呈递细胞可以被激活。
“增强”免疫应答的物质指这样一种物质：与不添加该物质时测得的相同的免疫应答相比，添加该物质时观察到更高或增强或偏离的免疫应答。例如利用51Cr释放试验，能够测定在免疫中使用及不使用该物质获得的样品中细胞毒性T细胞的裂解活性。与不使用该物质时的CTL裂解活性相比，CTL裂解活性提高时的物质的量被称为足以增强动物对该抗原的免疫应答的量。在一个优选实施方案中，免疫应答至少提高约2倍，更优选地约3倍或更多。分泌的细胞因子的量或类型也可能改变。此外，诱导的抗体或其亚类的量也可能改变。
免疫：此处所用的术语“免疫”或“免疫作用”或相关术语指提供产生针对靶抗原或表位的基本免疫应答(包括抗体和/或细胞免疫，如效应CTL)的能力。这些术语不要求产生完全免疫，而是产生大大高于基线的免疫应答。例如，如果在使用本发明的方法后哺乳动物产生针对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，则可认为该动物针对该靶抗原进行了免疫。
天然来源：此处所用的术语“天然来源”指其全部或部分不是合成的，而是自然存在或产生的。
非天然的：此处所用的术语通常指并非来源于自然，更具体而言，该术语指来自人工。
非天然来源：此处所用的术语“非天然来源”通常指合成的或者并非来源于自然；更具体而言，该术语是指来自人工。
有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列：此处所用的术语“有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇分别相对于核心颗粒和病毒样颗粒一般且优选地均匀空间排列。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可能是一种几何模式。合适的有序、重复抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选实例是具有严格重复的类结晶排列的抗原或抗原决定簇，优选地间隔1-30纳米，优选地5-15纳米。
菌毛：此处所用的术语“菌毛”指细菌细胞的胞外结构，它由蛋白质单体(例如菌毛单体)组成，这些单体组织成有序、重复的模式。此外，菌毛也是与多种过程的结构，如细菌细胞与宿主细胞表面受体的附着、细胞间基因交换和细胞-细胞识别。菌毛的例子包括1型菌毛、P-菌毛、FlC菌毛、S-菌毛和987P-菌毛。菌毛的其它例子在以下描述。
菌毛样结构：此处所用的短语“菌毛样结构”指具有类似于菌毛的特征、由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个例子是由表达修饰的菌毛蛋白的细菌细胞形成的结构，这种修饰菌毛蛋白形成与天然菌毛不相同的有序、重复阵列。
多肽：此处所用的术语“多肽”指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接而成的分子。它指氨基酸分子链，不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质。该术语也指多肽的表达后修饰，例如：糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生的多肽不一定由指定的核酸序列翻译而来。也可以用任何一种方法生产，包括化学合成。
自身抗原：此处所用的术语“自身抗原”指由宿主DNA编码的蛋白质，宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自身的。另外，由两种或几种自身分子组合产生的蛋白质，或者代表一部分自身分子的蛋白质，以及与上述定义的两种自身分子具有高度同源性(＞95％，优选地＞97％，更优选地＞99％)的蛋白质也可以认为是自身的。
治疗：此处所用的术语“治疗”指预防和/或治疗。例如，当用于传染病时，该术语提高患者对病原体感染的抗性，或者换句话说，降低患者感染病原体或表现感染所致病症的可能性的预防处理，以及患者感染后的抗感染治疗，例如减轻或消除感染或阻止其恶化。当用于肥胖症或相关疾病时，术语“治疗”指提高患者对肥胖的抗性和/或逆转肥胖的预防或治疗性处理。
疫苗：此处所用的术语“疫苗”指含有本发明的组成物并且是能够对动物施用的形式的制剂。一般而言，疫苗包含常用的盐水或缓冲水溶液介质，本发明的组成物悬浮或溶解于其中。以这种形式，本发明的组成物能够方便地用来预防、改善或治疗疾病。在导入宿主后，疫苗能够引起免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞的激活和/或其它细胞应答。
任选地，本发明的疫苗还包含佐剂，与本发明的化合物相比，这种佐剂可能占一小部分或大部分。
病毒样颗粒(VLP)：此处所用的术语“病毒样颗粒”指类似于病毒颗粒的结构。而且，根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非传染性的，因为它缺乏病毒基因组的全部或部分，特别是病毒基因组的复制性和传染性部分。根据本发明的病毒样颗粒可能含有不同于其基因组的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的一个典型的优选实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体或RNA噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”在此可以互换使用，指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。一般且优选地，病毒蛋白质亚单位分别装配为病毒衣壳和衣壳，它们具有固有的重复结构，这种结构一般是球形或管状。例如，RNA噬菌体或HBcAg的衣壳是二十面体对称的球形。此处所用的术语“衣壳样结构”指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体，它类似于上述衣壳形态，但是不同于典型的对称装配体，同时保持足够程度的顺序和重复性。
噬菌体的病毒样颗粒：此处所用的术语“噬菌体的病毒样颗粒”指类似于噬菌体的结构的病毒样颗粒，它是非复制性和非传染性的，至少缺乏编码噬菌体复制机制的基因，一般也缺乏编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也包括这样的噬菌体病毒样颗粒，其中上述基因仍然存在但是无活性，从而产生非复制性和非传染性的噬菌体病毒样颗粒。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP：由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位自装配而成、任选地含有宿主RNA的衣壳结构，被称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一个具体例子是Qβ外壳蛋白的VLP。在此情况下，Qβ外壳蛋白的VLP可能仅仅由Qβ CP亚单位(通过Qβ CP基因的表达产生，该基因含有例如一个TAA终止密码子，通过抑制阻止任何更长A1蛋白的表达，参见Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))装配而成，或者在衣壳装配体中还含有A1蛋白亚单位。
病毒颗粒：此处所用的术语“病毒颗粒”指病毒的形态学形状。某些病毒类型含有由蛋白质衣壳围绕的基因组；其它一些具有附加结构(例如包膜、尾等)。
一种(个)：术语“一种(个)”在本公开内容中使用时，除非另外说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。
本领域技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案包括重组核酸技术的使用，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白在原核和真核细胞中的表达等。这些方法为本领域技术人员公知，在出版的实验室方法手册中常见(例如，Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》(Molecular cloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。应用组织培养细胞系进行的基本实验室技术(Celis，J.编著，《细胞生物学》(Cell Biology)，Academic Press，第二版，(1988))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane，D.，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白质纯化指南”(Guide to Protein Purification)，Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，《蛋白质纯化原理与实践》(Protein Purification Principles andPractice)，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有大量描述，这些文献全部在此引用作为参考。
2.增强免疫应答的组成物和方法
本发明提供用于增强动物对ghrelin或ghrelin肽的免疫应答的组成物和方法。本发明的组成物包含或者由下列成分组成：(a)核心颗粒，其含有至少一个第一附着位点；(b)至少一种抗原或抗原决定簇，其含有至少一个第二附着位点，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin肽，所述第二附着位点选自：(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中天然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与第一附着位点连接；所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。更具体而言，本发明的组成物包含或者由下列成分组成：病毒样颗粒，和至少一种抗原或抗原决定簇，其中抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin肽，至少一种抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合，形成有序、重复的抗原-VLP阵列。而且，本发明也能够使技术人员方便地构建这种组成物，尤其用来治疗和/或预防肥胖症。
在一个实施方案中，核心颗粒包括或者选自病毒、细菌菌毛、细菌菌毛蛋白形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、RNA噬菌体的病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒或其重组形式。可以选择本领域公知的具有有序、重复外壳和/或核心蛋白结构的任何病毒作为本发明的核心颗粒；合适的病毒的例子包括：辛德毕斯病毒和其它甲病毒，弹状病毒(例如水泡性口炎病毒)，小RNA病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)，披膜病毒(例如风疹病毒)，正粘病毒(例如索戈托病毒、贝特肯病毒、家禽流感病毒)，多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、禽多瘤病毒BFDV)，细小病毒，轮状病毒，诺瓦克病毒，口蹄疫病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒，烟草花叶病毒，禽兽棚病毒，和人乳头瘤病毒，以及优选地RNA噬菌体，噬菌体Qβ，噬菌体R17，噬菌体M11，噬菌体MX1，噬菌体NL95，噬菌体fr，噬菌体GA，噬菌体SP，噬菌体MS2，噬菌体f2，噬菌体PP7(例如，参见Bachman，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17：553-558(1996)中的表1)。
在另外一个实施方案中，本发明利用病毒的基因工程产生有序、重复的病毒包膜蛋白与第一附着位点的融合体，所述第一附着位点包含于或者优选地是异源蛋白质、肽、抗原决定簇或选择的反应性氨基酸残基。在构建本发明的组成物中可以使用本领域公知的其它基因操作；例如，可以通过基因突变限制重组病毒的复制能力。此外，由于化学或物理灭活，或者如上所述由于缺乏可复制的基因组，用于本发明的病毒不能复制。为了与第一附着位点融合而选择的病毒蛋白应当具有组织的、重复的结构。在病毒表面上，这种组织的、重复的结构包括类晶体结构，其间距为5-30nm，优选地5-15nm。这类融合蛋白的产生将在病毒表面产生多个有序、重复的第一附着位点，反映原始病毒蛋白的正常组织结构。本领域技术人员应当理解，第一附着位点可以是任何合适的蛋白质、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢物或其组合，或者是它们的一部分，它们可以用来特异性地附着抗原或抗原决定簇，产生有序、重复的抗原阵列。
在本发明的另一个实施方案中，核心颗粒是重组甲病毒，更具体而言，是重组辛德毕斯病毒。甲病毒是正链RNA病毒，它们在感染的细胞的细胞质中完整复制其基因组RNA，而不需要DNA中间物(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol.Rev.58：491-562(1994))。甲病毒科的几个成员，辛德毕斯病毒(Xiong，C.等人，Science243：1188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.11：18-22(1993))、西门利启森林病毒(SFV)(Liljestrm，P.&Garoff，H.，Bio/Technology 9：1356-1361(1991))及其它病毒(Davis，N.L.等人，Virology 171：189-204(1989))，在作为基于病毒的多种不同蛋白质的表达载体(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8：578-582(1997)；Liljestrm，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5：495-500(1994))以及作为疫苗研制的候选物方面已经受到极大关注。最近，公布了涉及甲病毒在异源蛋白质表达和疫苗研制中的用途的大量专利(参见美国专利号5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245；5,814,482)。本发明的甲病毒核心颗粒的构建可以利用重组DNA技术领域公知的方法进行，如上述文章所述，在此引用作为参考。
可以利用多种不同的重组宿主细胞制备用于抗原或抗原决定簇附着的基于病毒的核心颗粒。例如，已知甲病毒具有较广的宿主谱；辛德毕斯病毒感染培养的哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞，以及某些昆虫细胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51：645(1973)；Leake，C.，J.Gen.Virol.35：335(1977)；Stollar，V.《披膜病毒》(The Togaviruses)R.W.Schlesinger编著，Academic Press，(1980)，pp.583-621)。因此，有大量重组宿主细胞能够在本发明的实施中使用。BHK、COS、Vero、HeLa和CHO细胞特别适于异源蛋白质的制备，因为它们能够以类似于人细胞的方式糖基化异源蛋白质(Watson，E.等人，Glycobiology 4：227(1994))，并且能够被筛选(Zang，M.等人，Bio/Technology 13：389(1995))或遗传改造(RennerW.等人，Biotech.Bioeng，4：476(1995)；Lee K.等人，Biotech.Bioeng.50：336(1996))，以便在无血清培养基及悬液中生长。
向宿主细胞中引入多核苷酸载体能够用标准实验室手册所述的方法实现(参见，例如：Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)，第9章；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，JohnH.Wiley & Sons，Inc.(1997)，第16章)，包括如电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂介导的转染、转导、刮刀载入、冲击导入和感染等方法。向宿主细胞内导入外源DNA序列的方法在Felgner，P.等人的美国专利号5,580,859中有描述。
也可以用包装的RNA序列感染宿主细胞。通过将这些包装的RNA序列添加到培养基中而将它们导入宿主细胞内。例如，多篇文献资料中描述了非传染性甲病毒颗粒的制备，包括《辛德毕斯表达系统》(Sindbis Expression System)，C版(Invitrogen目录号K750-1)。
当利用哺乳动物细胞作为重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒时，这些细胞通常在组织培养基中培养。在培养基中培养细胞的方法在本领域中公知(参见，例如：Celis，J.编著，《细胞生物学》(CellBiology)，Academic Press，第二版，(1998)；Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，《动物细胞培养》(Cultureof Animal Cells)，Alan R.Liss，Inc.(1983))。
在本发明中适于作为核心颗粒的RNA病毒的其它例子包括但不限于：呼肠孤病毒科的成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽逆转录病毒的多个血清型)，环状病毒属(蓝舌病毒、Eugenangee病毒、克米罗沃病毒、非洲马疫病毒和科罗拉多蜱热病毒)，轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、鼠轮状病毒、猿轮状病毒、牛或绵羊轮状病毒、禽轮状病毒)；小RNA病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，人肠道孤(ECHO)病毒，甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒，猿肠道病毒，鼠脑脊髓炎(ME)病毒，脊髓灰质炎病毒，牛肠道病毒，猪肠道病毒)，心肌病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒)，鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113个亚型；其它鼻病毒)，鹅口疮病毒属(口蹄疫病毒(FMDV))；杯状病毒科，包括猪水泡疹病毒、圣米格尔海狮病毒、猫小RNA病毒和诺瓦克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传脑炎，远东蜱传脑炎，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，多种人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，乙型流感(多个人亚型)，丙型流感(可能分离的属)；副粘液病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)；黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传脑炎，远东蜱传脑炎，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，多个人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，乙型流感(多个人亚型)，丙型流感(可能分离的属)；副粘液病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡性病毒属(VSV)，钱迪普拉病毒，佛朗德-哈特公园病毒，狂犬病病毒属(狂犬病病毒)，鱼弹状病毒，丝状病毒(马堡病毒和埃博拉病毒)；砂粒样病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，塔卡里伯病毒复合物，拉萨病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人肠道冠状病毒，猫传染性腹膜炎病毒(猫冠状病毒)。
可以用作核心颗粒的DNA病毒的实例包括但不限于：痘病毒科，包括正痘病毒属(重型天花病毒、轻型天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、水牛痘病毒、兔痘病毒、小鼠脱脚病病毒)，野兔痘病毒属(粘液瘤病毒，纤维瘤病毒)，禽痘病毒属(鸡痘病毒，其它禽痘病毒)，羊痘病毒属(绵羊痘病毒，山羊痘病毒)，猪痘病毒属(猪痘病毒)，副痘病毒属(触染性脓疮性皮炎病毒，假牛痘病毒，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(1型和2型单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，假狂犬病病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)和β-疱疹病毒(人巨细胞病毒和猪、猴、啮齿动物巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马雷克病病毒，松鼠猴疱疹病毒，蛛猴疱疹病毒，兔疱疹病毒，豚鼠疱疹病毒，勒克肿瘤病毒)；腺病毒科，包括乳腺病毒属(人A、B、C、D、E亚群和未分群的；猿腺病毒(至少23个血清型)，传染性犬肝炎病毒，牛、猪、绵羊、蛙和其它许多种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；不可培养的腺病毒；乳头多瘤空泡病毒科，包括乳头瘤病毒属(人乳头状瘤病毒，牛乳头瘤病毒，兔乳头瘤病毒，其它种的多种致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿猴空泡病毒(SV-40)，兔空泡病毒(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，以及其它灵长类动物多瘤病毒，如亲淋巴乳头瘤病毒)；细小病毒科，包括腺伴随病毒属，细小病毒属(猫全血细胞减少症病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申水貂病病毒等)。最后，DNA病毒可包括如慢性传染性神经性病原体(CHINA病毒)的病毒。
在其它实施方案中，细菌菌毛蛋白、细菌菌毛蛋白的亚部分，或含有细菌菌毛蛋白或其亚部分的融合蛋白，可以用来分别制备本发明的组成物和疫苗组合物。菌毛蛋白的例子包括下列细菌产生的菌毛蛋白：大肠杆菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。适用于本发明的菌毛蛋白的氨基酸序列包括GenBank报告AJ000636、AJ132364、AF229646、AF051814、AF051815和X00981所述的序列，其完整内容在此引用作为参考。
细菌菌毛蛋白在输入细菌周质之前，通常被加工，除去N端前导序列。此外，本领域技术人员应当认识到，分别用来制备本发明的组成物和疫苗组合物的细菌菌毛蛋白通常不含天然存在的前导序列。
适用于本发明的菌毛蛋白的一个具体例子是大肠杆菌的P-菌毛蛋白(GenBank报告AF237482(SEQ ID NO：1))。适用于本发明的大肠杆菌1型菌毛蛋白的一个例子是含有GenBank报告P04128所述氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的菌毛蛋白，它由具有GenBank报告M27603所示核苷酸序列(SEQ ID NO：3)的核酸编码。这些GenBank报告的完整公开内容在此引用作为参考。另外通常也用上述蛋白质的成熟形式分别制备本发明的组成物和疫苗组合物。
适于在本发明的实施中使用的细菌菌毛蛋白或菌毛蛋白亚部分通常能够结合形成有序、重复的抗原阵列。
在体外制备菌毛和菌毛样结构的方法在本领域公知。例如，Bullitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：12890-12895(1996)描述了大肠杆菌P-菌毛亚单位的体外重建。此外，Eshdat等人(J.Bacteriol.148：308-314(1981))也描述了适于裂解大肠杆菌1型菌毛和菌毛重建的方法。简言之，这些方法如下：通过在饱和盐酸胍中37℃孵育裂解菌毛。然后通过层析纯化菌毛蛋白，之后用5mM tris(羟甲基)盐酸氨基甲烷(pH8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚体。Eshdat等人还发现，在用含有5mM MgCl2的5mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH8.0)透析后，菌毛蛋白二聚体重装配形成菌毛。
另外，例如使用常规基因工程和蛋白质修饰方法，可以修饰菌毛蛋白，使之含有第一附着位点，抗原或抗原决定簇通过第二附着位点与第一附着位点连接。此外，抗原或抗原决定簇也可以通过第二附着位点与这些蛋白质中天然存在的氨基酸残基直接连接。这些修饰的菌毛蛋白然后可以在本发明的疫苗组合物中使用。
分别用来制备本发明的组成物和疫苗组合物的细菌菌毛蛋白可以用类似于此处对于HBcAg所述的方法修饰。例如，可以将半胱氨酸和赖氨酸残基缺失或者置换为其它氨基酸残基，并且可以向这些蛋白质中添加第一附着位点。此外，菌毛蛋白也可以表达为修饰形式，或者可以在表达后化学修饰。类似地，也可以从细菌中收获完整的菌毛，然后化学修饰。
在另一个实施方案中，从细菌(例如大肠杆菌)中收获菌毛或菌毛样结构，用来形成本发明的组成物和疫苗组合物。适于制备组成物和疫苗组合物的一个例子是大肠杆菌1型菌毛，它由具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的菌毛蛋白单体构成。
本领域公知一些收获细菌菌毛的方法。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74：623-632(1998))描述了一种从大肠杆菌中收获P-菌毛的菌毛纯化方法。根据该方法，从含有P-菌毛质粒的多菌毛大肠杆菌上剪切菌毛，通过溶解和MgCl2(1.0M)沉淀的循环纯化。
收获后，菌毛或菌毛样结构可用多种方法修饰。例如，可以向菌毛中添加第一附着位点，抗原或抗原决定簇可通过第二附着位点与之附着。换句话说，可以收获并修饰细菌菌毛或菌毛样结构，产生有序、重复的抗原阵列。
抗原或抗原决定簇能够与菌毛或菌毛样结构中天然存在的半胱氨酸残基或赖氨酸残基连接。在这些情况下，天然存在的氨基酸残基的高度有序和重复性将引导抗原或抗原决定簇与菌毛或菌毛样结构偶联。例如，使用异双功能交联剂，菌毛或菌毛样结构能够与抗原或抗原决定簇的第二附着位点连接。
当利用生物天然合成的结构(例如菌毛)制备本发明的组成物和疫苗组合物时，遗传工程改造这些生物使它们产生具有希望的特征的结构通常是有利的。例如，当使用大肠杆菌1型菌毛时，可以修饰从中收获菌毛的大肠杆菌，使之产生具有特定特征的结构。可能的菌毛蛋白修饰的例子包括插入一个或多个赖氨酸残基、缺失或置换一个或多个天然存在的赖氨酸残基、缺失或置换一个或多个天然存在的半胱氨酸残基(例如SEQ ID NO：2中位点44和84处的半胱氨酸残基)。
另外也可以对菌毛蛋白基因进行其它修饰，产生含有并非赖氨酸残基的第一附着位点的表达产物(例如FOS或JUN域)。当然，合适的第一附着位点通常仅限于不妨碍菌毛蛋白形成适于在本发明的疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构的位点。
可以在体内修饰(例如通过同源重组)细菌细胞中天然存在的菌毛蛋白基因，或者可以将具有特定特征的菌毛蛋白基因插入这些细胞内。例如，可以将菌毛蛋白基因导入细菌细胞中，作为复制型克隆载体或插入细菌染色体内的载体的一种组分。插入的菌毛蛋白基因也可以与表达调节控制序列(例如lac操纵基因)连接。
在大多数情况下，在本发明的组成物和疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构分别由单一类型的菌毛蛋白亚单位构成。通常使用由相同亚单位组成的菌毛或菌毛样结构，因为预期它们能够形成表现为高度有序、重复抗原阵列的结构。
然而，本发明的组合物也包括包含由不同菌毛蛋白亚单位构成的菌毛或菌毛样结构的组成物和疫苗。形成这些菌毛或菌毛样结构的菌毛蛋白亚单位可以由细菌细胞中天然存在的基因表达，或者由导入细胞内的基因表达。当天然存在的菌毛蛋白基因和导入的基因都在形成菌毛或菌毛样结构的细胞中表达时，结果通常是由这些菌毛蛋白的混合物形成的结构。此外，当两种或多种菌毛蛋白基因在一种细菌细胞中表达时，每种菌毛蛋白基因的相对表达通常是决定菌毛或菌毛样结构中不同菌毛蛋白亚单位比例的因素。
当希望获得具有混合菌毛蛋白亚单位特定组成的菌毛或菌毛样结构时，至少一种菌毛蛋白基因的表达可以由一种异源诱导型启动子调节。这些启动子以及其它基因元件可以用来调节细菌细胞中产生的不同菌毛蛋白亚单位的相对含量，从而调节菌毛或菌毛样结构的组成。
另外，抗原或抗原决定簇也能通过并非肽键的键与细菌菌毛或菌毛样结构连接，在本发明的组成物中使用的产生菌毛或菌毛样结构的细菌细胞能够被基因改造，产生与抗原或抗原决定簇融合的菌毛蛋白。形成菌毛或菌毛样结构的这类融合蛋白适于在本发明的疫苗组合物中使用。
本申请中的病毒样颗粒指类似于病毒颗粒但是不致病的结构。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此是非传染性的。病毒样颗粒也能通过异源表达大量生产，并且易于纯化。
在一个优选实施方案中，核心颗粒是一种病毒样颗粒，并且该病毒样颗粒是一种重组病毒样颗粒。熟练技术人员能够利用重组DNA技术和公众易于获得的病毒编码序列生产VLP。例如，为了在病毒启动子的调节控制下利用可以作为商品获得的杆状病毒载体表达，可以改造病毒包膜或核心蛋白的编码序列，对序列进行适当修饰，以使该编码序列与调节序列功能性连接。例如，为了在细菌表达载体中表达，也可以改造病毒包膜或核心蛋白的编码序列。
VLP的例子包括但不限于：乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))、辛德毕斯病毒、轮状病毒(美国专利号5,071,651和5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610(1995))、诺瓦克病毒(Jiang，X.等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))的衣壳蛋白，逆转录病毒GAG蛋白(WO96/30523)，逆转录转座子Ty蛋白p1，乙型肝炎病毒(WO92/11291)、人乳头瘤病毒(WO98/15631)、RNA噬菌体、Ty、fr-噬菌体、GA-噬菌体和Qβ-噬菌体的表面蛋白。
本领域技术人员应当理解，本发明的VLP不限于任何具体形式。该颗粒可以被化学合成或通过生物学方法生产，可以是天然的或是非天然的。例如，这类实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。
在一个更具体的实施方案中，VLP可包含或者基本由或者由选自下列的重组多肽或其片段组成：重组轮状病毒多肽，重组诺瓦克病毒多肽，重组甲病毒多肽，重组口蹄疫病毒多肽，重组麻疹病毒多肽，重组辛德毕斯病毒多肽，重组多瘤病毒多肽，重组逆转录病毒多肽，重组乙型肝炎病毒多肽(例如HBcAg)，重组烟草花叶病毒多肽，重组禽兽棚病毒多肽，重组人乳头瘤病毒多肽，重组噬菌体多肽，重组RNA噬菌体多肽，重组Ty多肽，重组fr-噬菌体多肽，重组GA-噬菌体多肽和重组Qβ-噬菌体多肽。病毒样颗粒还可以进一步包含或者基本由或者由这些多肽的一种或多种片段以及这些多肽的变体组成。多肽的变体与其野生型对应物在氨基酸水平上例如具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成。优选地，RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1)噬菌体PP7；和m)噬菌体AP205。
在本发明的另外一个优选实施方案中，该病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，重组蛋白包含、基本由或者由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。
因此，构成衣壳或VLP的RNA噬菌体外壳蛋白，或者适于自装配为衣壳或VLP的噬菌体外壳蛋白的片段，是本发明的进一步优选的实施方案。例如，噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。进而，这些蛋白质在表达后自发形成衣壳。另外，这些衣壳也能形成具有固有重复组织的结构。
能够用来制备本发明的组成物的噬菌体外壳蛋白的具体优选实例包括如下RNA噬菌体的外壳蛋白：噬菌体Qβ(SEQ ID NO：4；PIR数据库，登录号VCBPQβ指Qβ CP，和SEQ ID NO：5；登录号AAA16663指Qβ A1蛋白)，噬菌体R17(SEQ ID NO：6；PIR登录号VCBPR7)，噬菌体fr(SEQ ID NO：7；PIR登录号VCBPFR)，噬菌体GA(SEQ ID NO：8；GenBank登录号NP-040754)，噬菌体SP(SEQ ID NO：9；GenBank登录号CAA30374指SP CP，和SEQ ID NO：10；登录号NP695026指SP A1蛋白)，噬菌体MS2(SEQ ID NO：11；PIR登录号VCBPM2)，噬菌体M11(SEQID NO：12；GenBank登录号AAC06250)，噬菌体MX1(SEQ ID NO：13；GenBank登录号AAC14699)，噬菌体NL95(SEQ ID NO：14；GenBank登录号AAC14704)，噬菌体f2(SEQ ID NO：15；GenBank登录号P03611)，噬菌体PP7(SEQ ID NO：16)，噬菌体AP205(SEQ ID NO：28)。此外，噬菌体Qβ的A1蛋白(SEQ ID NO：5)或C端丢失多达100、150或180个氨基酸的C端截短形式可能掺入Qβ外壳蛋白的衣壳装配体中。为了确保衣壳形成，通常限制衣壳装配体中A1蛋白相对于Qβ CP的百分比。
也发现Qβ外壳蛋白当在大肠杆菌中表达时自装配为衣壳(Kozlovska TM.等人，GENE 137：133-137(1993))。获得的衣壳或病毒样颗粒显示二十面体噬菌体样衣壳结构，其直径为25nm，T＝3半对称。此外，噬菌体Qβ的晶体结构已经解析。该衣壳含有180个外壳蛋白拷贝，它们通过二硫键连接成共价五聚体和六聚体(GolmohammadiR.等人，Structure 4：543-5554(1996))，使Qβ外壳蛋白的衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有与衣壳内的其它亚单位不是通过二硫键连接或者不完全连接的亚单位。然而，在VLP内一般有超过约80％的亚单位彼此通过二硫键连接。因此，在重组Qβ衣壳加样到非还原性SDS-PAGE上之后，可见对应于单体Qβ外壳蛋白的带以及对应于Qβ外壳蛋白五聚体或六聚体的带。不完全二硫键连接的亚单位在非还原性SDS-PAGE中能够表现为二聚体、三聚体乃至四聚体带。Qβ衣壳蛋白也显示对有机溶剂和变性剂的不同寻常的抗性。我们惊奇地发现，高至30％的DMSO和乙腈浓度和高至1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Qβ外壳蛋白的衣壳的高稳定性是一个有利的特征，特别是对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人的用途来说。
在大肠杆菌中表达后，Qβ外壳蛋白的N端甲硫氨酸通常被除去，这可以通过如Stoll，E.等人，J.Biol.Chem.252：990-993(1977)所述的N端Edman测序观察到。本发明的范围内也包括由未去除N端蛋氨酸的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或者含有N端蛋氨酸已被切除或仍然存在的Qβ外壳蛋白混合物的VLP。
根据本发明进一步优选的RNA噬菌体，特别是Qβ的病毒样颗粒在WO02/056905中公开，其公开内容在此全文引用作为参考。
其它一些RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后也显示自装配(Kastelein，RA等人，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170：238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了外壳蛋白外还含有所谓的连读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1通过在UGA终止密码子处抑制而产生，长度为329个氨基酸。本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳缺乏A2裂解蛋白，而含有来自宿主的RNA。RNA噬菌体的外壳蛋白是一种RNA结合蛋白，与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用，作为病毒生命周期中的一种翻译抑制物。这种相互作用的序列和结构元件已知(Witherell，GW.& Uhlenbeck，OC.Biochemistry 28：71-76(1989)；LimF.等人，J.Biol.Chem.271：31839-31845(1996))。已知这种茎环和RNA通常参与病毒装配(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或者由RNA噬菌体的突变外壳蛋白，优选地由上述RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。在另外一个优选实施方案中，通过置换除去至少一个或者至少两个赖氨酸残基，或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基，修饰RNA噬菌体的突变外壳蛋白；此外，也能通过缺失至少一个或者至少两个赖氨酸残基，或者通过插入添加至少一个赖氨酸残基，修饰RNA噬菌体的突变外壳蛋白。缺失、置换或添加至少一个赖氨酸残基可以改变偶联程度，即每个RNA噬菌体VLP亚单位的Aβ1-6肽的量，特别是用来匹配和适应疫苗的要求。
在另外一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或者由下列成分组成：具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的外壳蛋白，或具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的氨基酸序列的外壳蛋白的混合物，或SEQ ID NO：5的突变体，其中N端甲硫氨酸优选地被切除。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或者由突变Qβ外壳蛋白组成。在另外一个优选实施方案中，通过置换去除至少一个赖氨酸残基，或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基，修饰这些突变外壳蛋白。或者，也可以通过缺失至少一个赖氨酸残基，或者通过插入添加至少一个赖氨酸残基，修饰这些突变外壳蛋白。
有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的衣壳表面。本发明也可以使用以精氨酸替换暴露的赖氨酸残基的Qβ突变体。在本发明的实施中能够使用下列Qβ外壳蛋白突变体和突变Qβ VLP：“Qβ-240”(Lys13-Arg；SEQ ID NO：17)，“Qβ-243”(Asn10-Lys；SEQ IDNO：18)，“Qβ-250”(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO：19)，“Qβ-251”(SEQ ID NO：20)和“Qβ-259”(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ IDNO：21)。因此，在本发明的进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白组成，其包含具有选自下列的氨基酸序列的蛋白质：a)SEQ ID NO：17的氨基酸序列；b)SEQID NO：18的氨基酸序列；c)SEQ ID NO：19的氨基酸序列；d)SEQ IDNO：20的氨基酸序列；e)SEQ ID NO：21的氨基酸序列。上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在WO02/056905中描述。具体参照上述申请的实施例18。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或者由上述Qβ突变体之一和相应A1蛋白的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
AP205基因组由成熟蛋白质、外壳蛋白、复制酶和相关噬菌体中不存在的两个开放阅读框组成；裂解基因和开放阅读框在成熟基因的翻译中起作用(Klovins，J.等人，J.Gen.Virol. 83：1523-33(2002))。AP205外壳蛋白可以由质粒pAP283-58(SEQ ID NO：27)表达，该质粒是pQb10的衍生物(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))，含有一个AP205核糖体结合位点。此外，AP205外壳蛋白也可以被克隆到pQb185内，位于载体中核糖体结合位点的下游。这两种方法都导致蛋白质的表达和衣壳的形成，如本申请人于2002年7月17日提交的标题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请所述，在此全文引用作为参考。载体pQb10和pQb185是由pGEM载体衍生的载体，克隆基因在这些载体中的表达受trp启动子控制(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))。质粒pAP283-58(SEQ ID NO：27)在下列序列中包含一个推断的AP205核糖体结合位点，位于AP205外壳蛋白的XbaI位点下游和ATG起始密码子的直接上游：tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAA-GT GAGGAAAATCACatg(SEQ ID NO：57)。载体pQb185在XbaI位点下游和起始密码子上游包含一个SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGT AGGAGTCAGGCCatg，(SEQ IDNO：58)，SD序列以下划线标出)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段组成。
本发明的这一优选实施方案包含可构成衣壳的AP205外壳蛋白。这些蛋白质是重组表达或从天然来源制备。电子显微镜检查(EM)和免疫扩散证实，在细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。在EM中可见，AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：28)形成的衣壳与AP205RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎无法区别。AP205VLP具有高度免疫原性，能够与抗原和/或抗原决定簇连接，产生展示以重复方式定向的抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体。能够产生针对这样展示的抗原的高滴度抗体，表明结合的抗原和/或抗原决定簇能够与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。
AP205 VLP的可装配突变形式，包括第5位氨基酸脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：29)，也可以在本发明的实施中使用，形成本发明的一个进一步优选的实施方案。这些VLP、来自天然来源的AP205 VLP或AP205病毒颗粒可以与抗原结合，产生本发明的有序、重复的抗原阵列。
AP205 P5-T突变外壳蛋白可以由质粒pAP281-32(SEQ ID NO：30)表达，该质粒由pQb185直接衍生，含有突变AP205外壳蛋白基因而不是Qβ外壳蛋白基因。为了表达AP205外壳蛋白，用表达AP205外壳蛋白的载体转染大肠杆菌。
分别表达外壳蛋白和突变外壳蛋白、导致自装配为VLP的方法，在实施例20和21中描述。合适的大肠杆菌株包括但不限于：大肠杆菌K802、JM109、RR1。合适的载体和菌株及其组合可以如下鉴定：通过SDS-PAGE分别检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达，如下鉴定衣壳的形成和装配：任选地首先通过凝胶过滤纯化衣壳，随后用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-137(1993))检测。
由载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白由于在大肠杆菌细胞质中加工，可能缺乏初始的甲硫氨酸。AP205 VLP的切割形式、未切割形式或其混合物是本发明的进一步优选的实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段组成。
在本发明的实施中也可以使用能够分别装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段。这些片段可以通过分别在外壳蛋白和突变外壳蛋白的内部或末端删除产生。适合装配为VLP的向外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中的插入或者抗原序列与外壳蛋白和突变外壳蛋白序列的融合，是本发明的另外的实施方案，分别产生嵌合AP205外壳蛋白和颗粒。插入、缺失以及与外壳蛋白序列融合的结果，以及是适合装配为VLP，能够通过电子显微镜检查确定。
由上述AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒能够分离为纯化形式，分离方法是联合使用利用沉淀的分级分离步骤和利用凝胶过滤的纯化步骤，例如使用Sepharose CL-4B、Sepharose CL-2B、Sepharose CL-6B柱及其组合，分离病毒样颗粒的其它一些方法在本领域公知，可以用来分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利号4,918,166描述了利用超速离心分离酵母逆转录转座子Ty的VLP，在此全文引用作为参考。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经被测定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，可以鉴定表面暴露的残基，并修饰RNA噬菌体外壳蛋白，使得通过插入或置换可以插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，噬菌体外壳蛋白的这些修饰形式也可以用于本发明。因此，也可以利用形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体MS2和噬菌体AP205的外壳蛋白)制备本发明的组成物。
尽管上述变异蛋白质的序列与其野生型不同，但是这些变异蛋白质通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包括：进一步包含可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的组成物和疫苗组合物，以及分别制备这些组成物和疫苗组合物的方法，用来制备这些组成物的各种蛋白质亚单位，和编码这些蛋白质亚单位的核酸分子。因此，本发明的范围内包括野生型蛋白质的变体形式，它们可形成衣壳或衣壳样结构，保留结合并形成衣壳或衣壳样结构的能力。
因此，本发明还包括分别含有如下蛋白质的组成物和疫苗组合物，该蛋白质包含或者基本由或者由与野生型蛋白质至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，它们分别可形成有序的阵列，具有固有的重复结构。
本发明的范围内还包括编码用来制备本发明组成物的蛋白质的核酸分子。
在其它实施方案中，本发明还包括含有如下蛋白质的组成物，该蛋白质包含或者基本由或者由与SEQ ID NO：4-21所示任何一种氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
适用于本发明的蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构或VLP的蛋白质的C端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具有SEQID NO：4-21任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的N端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具有SEQID NO：4-21任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质包括可形成衣壳或衣壳样结构的N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括具有SEQ ID NO：4-21任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸，从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端和C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括含有如下蛋白质的组成物，这些蛋白质包含或者基本由或者由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
因此，本发明包括由可形成衣壳或VLP的蛋白质制备的组成物和疫苗组合物，由各种蛋白质亚单位和VLP或衣壳制备这些组成物的方法，制备这些蛋白质亚单位的方法，编码这些亚单位的核酸分子，以及利用本发明的这些组成物接种个体和/或引发免疫应答的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种疫苗组合物，其进一步含有佐剂。在另外一个实施方案中，疫苗组合物不含佐剂。在本发明的另一个实施方案中，疫苗组合物含有本发明的核心颗粒，其中该核心颗粒包含、优选地是病毒样颗粒，其中优选地所述病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。优选地，病毒样颗粒包含或者基本由或者由下列成分组成：RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，优选RNA噬菌体外壳蛋白的重组蛋白或其片段。在一个优选实施方案中，RNA噬菌体的外壳蛋白具有选自下列的氨基酸：(a)SEQ ID NO：4；(b)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的混合物；(c)SEQ ID NO：6；(d)SEQ ID NO：7；(e)SEQ ID NO：8；(f)SEQ ID NO：9；(g)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的混合物；(h)SEQ ID NO：11；(i)SEQ ID NO：12；(k)SEQ ID NO：13；(1)SEQ IDNO：14；(m)SEQ ID NO：15；(n)SEQ ID NO：16；(o)SEQ ID NO：28。此外，本发明疫苗组合物的病毒样颗粒的重组蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中该RNA噬菌体选自：(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(k)噬菌体f2；(1)噬菌体PP7；和(m)噬菌体AP205。
在一个优选实施方案中，通过去除，或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基，修饰所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白。在另外一个优选实施方案中，通过缺失至少一个赖氨酸残基，或者通过插入添加至少一个赖氨酸残基，修饰所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白。在一个优选实施方案中，病毒样颗粒含有RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
如前所述，本发明包括病毒样颗粒或其重组形式。在一个进一步优选的实施方案中，在本发明组成物中使用的颗粒包含乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)或HBcAg的片段。在另外一个实施方案中，在本发明组成物中使用的颗粒包含下述乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)或HBcAg的片段，它们经过修饰除去或减少了游离半胱氨酸残基的数量。Zhou等人(J.Virol.66：5393-5398(1992))证实，修饰后除去天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg保留结合并形成衣壳的能力。因此，适于在本发明组成物中使用的VLP包括那些包含修饰的HBcAg或其片段的VLP，其中一个或多个天然存在的半胱氨酸残基已经缺失或者被替换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
HBcAg是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的一种蛋白质。HBcAg的一些同种型已经被鉴定，本领域技术人员能够容易地获得其氨基酸序列。在大多数情况下，本发明的组成物和疫苗组合物分别用HBcAg的加工形式(即已经除去乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的HBcAg)制备。
另外，当在不发生加工的条件下制备HBcAg时，HBcAg通常以“加工的”形式表达。例如，当利用将蛋白质表达定向于细胞质的大肠杆菌表达系统制备本发明的HBcAg时，表达的这些蛋白质通常不含乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列。
可以用于本发明的乙型肝炎病毒样颗粒的制备在下列专利中公开，例如：WO00/32227，具体见实施例17-19和21-24，以及WO01/85208，具体见实施例17-19、21-24、31和41，和WO02/056905。最后一个申请具体参照实施例23、24、31和51。全部这三篇文献在此均引用作为参考。
本发明还包括经修饰后缺失或置换了一个或多个其它半胱氨酸残基的HBcAg变体。本领域公知，游离半胱氨酸残基能够参与一些化学副反应。这些副反应包括二硫键交换，与例如在与其它物质联合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物反应，或暴露于紫外线后的直接氧化以及与核苷酸的反应。因而可能产生毒性加合物，特别是考虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向。毒性加合物以多种种类分布，它们单个均以低浓度存在，但同时存在时达到毒性水平。
鉴于上述，在疫苗组合物中使用经修饰除去天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当抗原或抗原决定簇附着时，毒性物质能够结合的位点数量减少或者完全消失。
适用于实施本发明的一些天然存在的HBcAg变体已经被鉴定。例如，Yuan等人(J.Virol. 73：10122-10128(1999))描述了在对应于SEQ ID NO：22中位点97的位点处异亮氨酸残基被置换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残基的变体。一些HBcAg变体以及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列在下列GenBank报告中公开：AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X85299、X85307、X65257、X85311、X85301(SEQ ID NO：23)、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520(SEQID NO：24)、P03153、AF110999和M95589，其公开内容均在此引用作为参考。上述乙型肝炎核心抗原前体变体的序列还在WO01/85208中的SEQ ID NO：89-138中公开。这些HBcAg变体在氨基酸序列多个位点处不同，包括对应于位于SEQ ID NO：25中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183处的氨基酸残基。在WO00/198333、WO00/177158和WO00/214478中描述了适于在本发明组成物中使用，并且可根据本申请书公开内容进一步修饰的其它一些HBcAg变体。
如上所述，本发明组成物和疫苗组合物中分别使用一般为加工的HBcAg(即缺乏前导序列的)。本发明包括使用上述变体HbcAg的疫苗组合物，以及使用这些组合物的方法。
一种多肽是否具有与上述野生型氨基酸序列之一或其亚部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，可以利用公知的计算机程序如Bestfit程序常规测定。当利用Bestfit或其它任何序列比对程序确定一种具体序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，参数设置为在参照氨基酸序列的全长计算同一性百分数，并且使同源性缺口可达参照序列中氨基酸残基总数的5％。
上述HBcAg变体和前体的氨基酸序列彼此相对地相似。因此，HBcAg变体中位于对应于SEQ ID NO：25中特定位点的位点处的氨基酸残基，指在SEQ ID NO：25所示氨基酸序列中该位点处的氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性在很大程度上足够高，使得本领域技术人员不难验证分别如SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列，以及一种具体HBcAg变体的氨基酸序列，并鉴定“相应的”氨基酸残基。此外，SEQ ID NO：24所示的HBcAg氨基酸序列，显示来源于感染土拨鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列，与含有SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的HBcAg有足够的同源性，显然在SEQ ID NO：23中存在3个氨基酸残基的插入，位于SEQ ID NO：25的氨基酸残基155与156之间。
本发明还包括包含感染鸟类的乙型肝炎病毒的HBcAg变体的疫苗组合物，以及包含这些HBcAg变体的片段的疫苗组合物。对于这些HBcAg变体，在应用到本发明的疫苗组合物中之前，这些多肽中天然存在的1、2、3个或更多的半胱氨酸残基可被置换为另外一种氨基酸残基或者缺失。
如上所述，去除游离半胱氨酸残基减少了毒性成分能够与HBcAg结合的位点数，也除去了相同或相邻HBcAg分子的赖氨酸与半胱氨酸残基交联的位点。因此，在本发明的另一个实施方案中，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一个或多个半胱氨酸残基缺失或者被替换为另一种氨基酸残基。
在其它实施方案中，本发明的组成物和疫苗组合物分别含有已经除去C端区(例如SEQ ID NO：25的氨基酸残基145-185或150-185)的HBcAg。因此，适于在实施本发明中使用的其它修饰的HBcAg包括C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
适于在实施本发明中使用的HBcAg还包括N端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰HBcAg。
适于在实施本发明中使用的HBcAg还包括N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸并且从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括包含具有以下特征的HBcAg多肽的组成物和疫苗组合物，该多肽包含或者基本由或者由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
在本发明的某些实施方案中，向HBcAg多肽内引入一个赖氨酸残基，以介导ghrelin或ghrelin肽与HBcAg VLP的结合。在优选实施方案中，用一种具有以下特征的HBcAg制备本发明的组成物，该HBcAg包含或者由SEQ ID NO：25的氨基酸1-144或1-149、1-185组成，它经过修饰，使得对应于位点79和80的氨基酸被替换为具有氨基酸序列Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO：33)的肽，产生具有氨基酸序列SEQ ID NO：26的HBcAg变体。在进一步优选的实施方案中，SEQ IDNO：25的位点48和107处的半胱氨酸残基突变为丝氨酸。本发明还包括包含具有以下特征的相应多肽的组成物，该多肽具有上述任一乙型肝炎核心抗原前体变体所示的氨基酸序列，也有上述氨基酸改变。本发明的范围内还包括能够结合形成衣壳或VLP并且具有上述氨基酸改变的其它HBcAg变体。因此，本发明还包括分别包含具有以下特征的HBcAg多肽的组成物，该多肽包含或者由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，以及必要时加工除去N端前导序列并且通过上述改变修饰的这些蛋白质的形式。
本发明的组成物或疫苗组合物可以包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可以由氨基酸序列不同的HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和一个或多个氨基酸残基已经改变(例如缺失、插入或置换)的修饰HbcAg的疫苗组合物。此外，本发明优选的疫苗组合物是呈现高度有序、重复的抗原阵列的组合物，其中该抗原是ghrelin或ghrelin肽。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，至少一种ghrelin或ghrelin肽通过至少一个共价键分别与所述核心颗粒和病毒样颗粒结合。优选地，至少一种ghrelin或ghrelin肽通过至少一个共价键分别与所述核心颗粒和病毒样颗粒结合，所述共价键是一种非肽键，分别产生核心颗粒-ghrelin的有序、重复阵列和ghrelin-VLP阵列或偶联物。这种ghrelin-VLP阵列和偶联物一般且优选地分别具有重复、有序的结构，因为至少一个、通常一个以上的ghrelin或ghrelin肽以定向方式与VLP和核心颗粒结合。优选地，120个以上，180个以上，优选地270个以上，优选地360个以上ghrelin或ghrelin肽与VLP结合。根据下文应当理解，至少一种ghrelin或ghrelin肽分别与VLP和核心颗粒的定向、直接以及明确的结合和附着，分别确保了重复、有序的ghrelin-VLP和核心颗粒阵列和偶联物的形成。此外，VLP和核心颗粒的典型、固有的高度重复、组织的结构分别有助于以高度有序、重复的方式展示ghrelin或ghrelin肽，分别产生高度组织、重复的ghrelin-VLP/核心颗粒阵列和偶联物。
因此，本发明优选的偶联物和阵列在高度组织化结构、大小和阵列表面抗原重复性等方面分别不同于现有的偶联物。而且，本发明优选的实施方案还允许颗粒和抗原在表达宿主中表达，保证抗原(即至少一种ghrelin或ghrelin肽)的正确折叠，和VLP的正确折叠和装配。
本发明公开了ghrelin或ghrelin肽分别与核心颗粒和VLP结合的方法。如上所述，在本发明的一个方面，一般且优选地使用异双功能交联剂，通过化学交联使ghrelin或ghrelin肽分别与核心颗粒和VLP结合。有几种异双功能交联剂在本领域公知。在优选实施方案中，异双功能交联剂含有一个能够与优选的第一附着位点(即分别与核心颗粒和VLP或至少一个VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的官能团，并且含有另外一个能够与优选的第二附着位点(即在ghrelin或ghrelin肽上天然存在的，通过还原可供反应的半胱氨酸残基；或在ghrelin或ghrelin肽上构建的，任选地通过还原可供反应的半胱氨酸残基)反应的官能基团。该方法的第一步，一般称为衍生化，是核心颗粒或VLP与交联剂反应。反应产物是活化的核心颗粒或活化的VLP，也被称为活化的载体。第二步，用常用方法如凝胶过滤或透析除去未反应的交联剂。第三步，ghrelin或ghrelin肽与活化的载体反应，该步骤一般被称为偶联步骤。未反应的ghrelin或ghrelin肽任选地可以在第四步例如通过透析除去。有几种异双功能交联剂在本领域公知，包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它例如可从Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)获得的含有一个氨基反应性官能团和一个半胱氨酸残基反应性官能团的交联剂。上述交联剂在与氨基反应后均能导致酰胺键的形成，与半胱氨酸反应后形成硫醚键。适于在本发明的实施中使用的另一类交联剂，其特征在于偶联后在ghrelin或ghrelin肽与核心颗粒或VLP之间引入一个二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。交联剂分别衍化核心颗粒和VLP的程度可能受不同实验条件影响，如每个反应物的浓度、一种试剂相对于另一种试剂的过量程度、pH、温度和离子强度。偶联程度，即分别在每个核心颗粒和VLP亚单位上的ghrelin或ghrelin肽的数量，可通过改变上述实验条件调节，以满足疫苗的要求。ghrelin或ghrelin肽的溶解度可能限制能够在每个亚单位上偶联的ghrelin或ghrelin肽的数量，当获得的疫苗不可溶时，减少每个亚单位上ghrelin或ghrelin肽的数量是有利的。
ghrelin或ghrelin肽分别与核心颗粒和VLP结合的一种特别有利的方法是核心颗粒和VLP表面上的赖氨酸残基分别与ghrelin或ghrelin肽上的半胱氨酸残基连接。因此，在本发明的一个优选实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。在某些实施方案中，为了分别与核心颗粒和VLP偶联，可能需要在ghrelin或ghrelin肽上构建一个氨基酸接头，该接头含有半胱氨酸残基作为第二附着位点或者作为第二附着位点的一部分。此外，也可以通过ghrelin或ghrelin肽内的插入或突变引入半胱氨酸。此外，也可以通过化学偶联引入半胱氨酸残基。
氨基酸接头的选择分别取决于抗原和自身抗原的性质，即取决于ghrelin或ghrelin肽的性质，其生化性质，如pI、电荷分布和糖基化。柔性的氨基酸接头通常是有利的。氨基酸接头的优选实施方案选自：(a)CGG；(b)N-端γ-1接头；(c)N-端γ-3接头；(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5(SEQ IDNO：34)；(g)N-端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，1＝0-2(SEQ ID NO：35)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ-1接头；(m)C-端γ-3接头；(n)C-端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5(SEQ ID NO：36)；(p)C-端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，1＝0-2，o＝0-8(SEQ ID NO：37)。
氨基酸接头的进一步优选的例子包括免疫球蛋白的铰链区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n(SEQ ID NO：38)和甘氨酸接头(G)n，它们均进一步含有半胱氨酸残基作为第二附着位点，任选地还含有其它的甘氨酸残基。一般来说，这类氨基酸接头的优选实例是：N-端γ1：CGDKTHTSPP(SEQ ID NO：39)；C-端γ1：DKTHTSPPCG(SEQ ID NO：40)；N-端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO：41)；C-端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO：42)；N-端甘氨酸接头：GCGGGG(SEQID NO：43)；C-端甘氨酸接头：GGGGCG(SEQ ID NO：44)；C端甘氨酸-赖氨酸接头：GGKKGC(SEQ ID NO：45)；N端甘氨酸-赖氨酸接头：CGKKGG(SEQ ID NO：46)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，特别是当抗原是ghrelin肽时，在肽的C端优选GGCG(SEQ ID NO：47)、GGC或GGC-NH2(“NH2”表示酰胺化)接头，或者在其N端优选CGG，作为氨基酸接头。甘氨酸残基通常插入体积庞大的氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中体积较大氨基酸的潜在空间位阻。
ghrelin或ghrelin肽上的半胱氨酸残基必须是还原状态，才能与活化的VLP上的异双功能交联剂反应，即必须有含有游离巯基的游离半胱氨酸或半胱氨酸残基。当作为结合位点的半胱氨酸残基是氧化形式时，例如，如果形成二硫桥键，则需要用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫桥键。
根据上述优选方法，利用异双功能交联剂使ghrelin或ghrelin肽分别与核心颗粒和VLP结合，可使ghrelin或ghrelin肽以定向方式分别与核心颗粒和VLP偶联。ghrelin或ghrelin肽分别与核心颗粒和VLP结合的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS分别交联ghrelin或ghrelin肽与核心颗粒和VLP的方法。ghrelin或ghrelin肽也可以首先通过反应硫醇化，例如使用SATA、SATP或iminothiolane。必要时，在去保护之后，ghrelin或ghrelin肽可以分别与核心颗粒和VLP偶联，如下所述。在分离过量的硫醇化试剂之后，ghrelin或ghrelin肽分别与预先用含有半胱氨酸反应性基团的异双功能交联剂活化的核心颗粒和VLP反应，活化的核心颗粒和VLP展示至少一个或几个半胱氨酸残基反应性的功能基团，如上所述的硫醇化的ghrelin或ghrelin肽能够与它反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另外一些方法使用同型双功能剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)，或含有分别对核心颗粒和VLP的胺基或羧基有反应性的功能基团的其它已知同型双功能交联剂，使ghrelin或ghrelin肽分别附着于核心颗粒和VLP。
结合VLP与ghrelin或ghrelin肽的其它方法包括核心颗粒和VLP分别被生物素化，ghrelin或ghrelin肽表达为链霉亲和素融合蛋白的方法，或者ghrelin或ghrelin肽和核心颗粒和VLP分别都被生物素化的方法，如WO00/23955所述。在这种情况下，通过调节ghrelin或ghrelin肽与链霉亲和素的比例，首先使ghrelin或ghrelin肽与链霉抗亲和素或亲和素蛋白结合，使得仍有自由结合位点可以分别与下一步添加的核心颗粒和VLP结合。此外，也可以在“一锅”反应中混合所有成分。其它能够分别与核心颗粒和VLP或者ghrelin或ghrelin肽交联的配体-受体对(其中存在受体和配体的可溶形式并可利用)，也可以作为使ghrelin或ghrelin肽与核心颗粒和VLP结合的结合剂。或者，配体或受体也可以与ghrelin或ghrelin肽融合，从而介导分别与化学结合或融合有受体或配体的核心颗粒和VLP的结合。融合也可以通过插入或置换实现。
如前所述，在本发明的一个优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP，在一个更优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP。
如果空间上允许，一个或几个抗原分子，即ghrelin或ghrelin肽，可以被附着于RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚单位上，优选地通过RNA噬菌体VLP的暴露的赖氨酸残基附着。RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的一个具体特征是每个亚单位偶联几个抗原的可能性。这能够产生密集的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方案中，至少一个ghrelin或ghrelin肽分别与核心颗粒和病毒样颗粒的结合和附着分别是通过病毒样颗粒的至少一个第一附着位点与抗原或抗原决定簇的至少一个第二附着位点之间的相互作用和连接而实现的。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的布局，有3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，另外4个赖氨酸残基暴露于衣壳外面。这些明确的特性有利于抗原附着于颗粒外部，而不是赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在其表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基有确定的布局。
在本发明的进一步优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，并且/或者第二附着位点包含巯基或半胱氨酸残基。在本发明的一个非常优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，ghrelin或ghrelin肽通过ghrelin或ghrelin肽上天然存在的或构建的半胱氨酸残基与RNA噬菌体外壳蛋白的VLP的赖氨酸残基结合，特别是与Qβ外壳蛋白的VLP结合。
来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达量，这允许以较低的成本生产大量的材料。
如上所述，本发明的偶联物和阵列在高度组织化结构、大小以及阵列表面抗原重复性等方面分别不同于现有的偶联物。而且，用VLP作为载体可以分别形成具有不同抗原密度的坚固的抗原阵列和偶联物。具体而言，使用RNA噬菌体的VLP，尤其是使用RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP，能够获得极高的表位密度。具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白VLP组成物的制备可以根据本申请所述实现。在本发明优选的实施方案中，当ghrelin肽优选地与Qβ外壳蛋白的VLP偶联时，优选地每个亚单位的ghrelin肽的平均数量为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4 2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或更高。
如此处定义的第二附着位点可以天然存在或非天然存在于抗原或抗原决定簇内。如果抗原或抗原决定簇上没有合适的天然存在的第二附着位点，则必须为该抗原构建非天然的第二附着位点。
如上所述，有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP表面。这些残基一般在与交联剂分子反应后被衍化。在不是所有暴露的赖氨酸残基都能与抗原偶联的情况中，在衍化步骤后，已经与交联剂反应的赖氨酸残基的ε-氨基上附着有交联剂分子。这导致一个或几个正电荷丢失，可能不利于VLP的可溶性和稳定性。如下文所述的公开的Qβ外壳蛋白突变体中，通过用精氨酸代替一些赖氨酸残基，我们防止了正电荷的过多丢失，因为精氨酸残基不与交联剂反应。而且，用精氨酸代替赖氨酸残基可产生更确定的抗原阵列，因为可以与抗原反应的位点变少了。
因此，在本申请公开的下列Qβ外壳蛋白突变体和突变Qβ VLP中，用精氨酸替换了暴露的赖氨酸残基：Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ IDNO：17)、Qβ-250(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO：19)和Qβ-259(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO：21)。克隆这些构建体，表达蛋白质，纯化VLP，并与肽和蛋白质抗原偶联。也构建了Qβ-251(SEQ IDNO：20)，在本申请中能够找到关于如何表达、纯化和偶联Qβ-251外壳蛋白的VLP的指南。
在另外一个实施方案中，我们公开了含有另一个额外赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白，它适用于获得更高密度的抗原阵列。克隆该突变Qβ外壳蛋白Qβ-243(Asn10-Lys；SEQ ID NO：18)，表达该蛋白质，分离并纯化衣壳或VLP，显示额外赖氨酸残基的引入不妨碍亚单位自装配为衣壳或VLP。因此，可以用Qβ外壳蛋白突变体的VLP分别制备ghrelin或ghrelin肽阵列和偶联物。抗原与VLP附着、特别是与RNA噬菌体外壳蛋白VLP附着的一种特别优选的方法是连接RNA噬菌体外壳蛋白VLP表面上存在的赖氨酸残基与抗原(即ghrelin或ghrelin肽)上天然存在的或构建的半胱氨酸残基。为了使半胱氨酸残基能够有效地作为第二附着位点，必须有一个巯基能够用于偶联。因此，半胱氨酸残基必须是还原状态，即，必须有可供利用的游离半胱氨酸或含有游离巯基的半胱氨酸残基。如果作为第二附着位点的半胱氨酸残基是氧化形式，例如，如果它形成二硫桥键，则需要使用如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫桥键。必须根据每种抗原调节还原剂的浓度和还原剂超过抗原的摩尔数。必要时需要检测滴定范围，从低至10μM或更低的浓度，到可达10-20mM或更高，并估计抗原与载体的偶联。尽管如WO02/056905所述，低浓度还原剂适于偶联反应，但是技术人员应当知道，较高的浓度抑制偶联反应，此时必须通过透析或凝胶过滤除去还原剂。透析或平衡缓冲液的pH通常低于7，优选地低于6。必须检测低pH缓冲液与抗原活性或稳定性的相容性。
通过选择交联剂和其它反应条件，可以调节RNA噬菌体外壳蛋白的VLP上的表位密度。例如，交联剂Sulfo-GMBS和SMPH一般能够获得高表位密度。高浓度反应物正向影响衍化，可以通过操纵反应条件来控制与RNA噬菌体外壳蛋白的VLP偶联、特别是与Qβ外壳蛋白的VLP偶联的抗原数量。
在设计非天然的第二附着位点之前，必须选择融合、插入或一般构建的位置。因此这样选择第二附着位点的位置，使其避免第二附着位点或含有它的任何氨基酸接头的空间位阻。在其它一些实施方案中，希望产生针对不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体应答。在这些实施方案中，第二附着位点的选择应防止产生针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。
在最优选的实施方案中，ghrelin或ghrelin肽仅包含一个第二附着位点或一个反应性附着位点，它们能够与分别位于核心颗粒和VLP或VLP亚单位上的第一附着位点连接。这确保了至少1个、一般1个以上、优选地超过10、20、40、80、120、150、180、210、240、270、300、360、400、450个抗原分别与核心颗粒和VLP确定、均匀地结合和连接。因此，抗原上含有单一第二附着位点或单一反应性附着位点确保了单一、均匀类型的结合和连接，分别产生高度有序、重复的阵列。例如，如果通过赖氨酸(作为第一附着位点)和半胱氨酸(作为第二附着位点)相互作用分别实现结合和连接，根据本发明该优选实施方案，确保了每个抗原只有一个半胱氨酸残基能够分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点结合和连接，而无论该半胱氨酸残基在抗原上是天然存在还是非天然存在。
在一些实施方案中，在抗原上构建第二附着位点需要融合一个含有根据本发明的公开内容适于作为第二附着位点的氨基酸的氨基酸接头。因此，在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸接头通过至少一个共价键与抗原或抗原决定簇结合。优选地，该氨基酸接头包含或者由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，氨基酸接头包含巯基或半胱氨酸残基。在另一个优选实施方案中，该氨基酸接头是半胱氨酸。氨基酸接头的一些选择标准以及本发明氨基酸接头的进一步优选实施方案在上文中已经提及。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，至少一个抗原或抗原决定簇，即ghrelin或ghrelin肽，分别与核心颗粒和病毒样颗粒融合。如上所述，VLP一般由至少一种可装配为VLP的亚单位组成。因此，在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇，优选地至少一个ghrelin或ghrelin肽，与病毒样颗粒或能够掺入VLP内的蛋白质的至少一个亚单位融合，产生嵌合VLP-亚单位-ghrelin或ghrelin肽融合蛋白。
ghrelin或ghrelin肽的融合可以按如下实现：插入VLP亚单位序列内，或与VLP亚单位或能够掺入VLP内的蛋白质的N端或C端融合。在下文中，当指肽与VLP亚单位的融合蛋白时，包括该肽与亚单位序列任一端的融合或向亚单位序列内的内部插入。
融合也可以如下实现：向VLP亚单位变体内插入ghrelin或ghrelin肽序列，其中亚单位序列的一部分缺失，被称为截短突变体。截短突变体可能包括VLP亚单位序列的N端或C端缺失或内部部分缺失。例如，氨基酸残基79-81缺失的具体VLP HBcAg是含有内部缺失的截短突变体。ghrelin或ghrelin肽与截短突变体VLP亚单位的N端或C端的融合也是本发明的实施方案。同样，也可以通过置换实现表位融合到VLP亚单位序列内，例如对于具体VLP HBcAg，用一种外源表位代替氨基酸79-81。因此，如下文所述，实现融合的方法包括：向VLP亚单位的序列中插入ghrelin或ghrelin肽序列，用ghrelin或ghrelin肽序列置换VLP亚单位序列的一部分，或者缺失、置换或插入的组合。
嵌合的ghrelin或ghrelin肽VLP亚单位通常能够自装配为VLP。展示与其亚单位融合的表位的VLP在此也被称为嵌合VLP。如上所述，病毒样颗粒包含或者由至少一种VLP亚单位组成。在本发明的另一个实施方案中，病毒样颗粒包含或者由嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位(即不含与之融合的抗原的VLP亚单位)的混合物组成，产生所谓的镶嵌颗粒。这可能有利于确保VLP的形成和装配。在这些实施方案中，嵌合VLP-亚单位的比例可以是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。
可以向与VLP亚单位序列任一端融合的肽或表位序列的任一端添加侧翼氨基酸残基，或者向插入VLP亚单位序列内部的这种肽序列的任一端添加侧翼氨基酸残基。在向待融合的ghrelin或ghrelin肽添加的侧翼序列中特别优选使用甘氨酸和丝氨酸残基。甘氨酸残基提供额外的柔韧性，这可降低外源序列向VLP亚单位序列内融合时可能的去稳定作用。
在本发明的一个具体实施方案中，VLP是乙型肝炎核心抗原VLP。已经报道了与HBcAg N端融合的融合蛋白(Neyrinck，S.等人，NatureMed.5：1157-1163(1999))或向所谓的主要免疫显性区(MIR)中的插入(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)，WO01/98333)，它们是本发明的优选实施方案。MIR中存在缺失的HBcAg的天然存在的变体也已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)，在此全文引用作为参考)，与N端或C端的融合，以及与野生型HBcAg相比在对应于缺失位点的MIR位点处的插入，也是本发明的实施方案。与C端的融合也已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。本领域技术人员能够容易地找到如何利用经典分子生物学技术构建融合蛋白的指南(Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory  Press，Cold  Spring  Habor，N.Y.(1989)；Ho等人，Gene 77：51(1989))。编码HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于表达HBcAg和HBcAg融合蛋白的载体和质粒已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)，Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：1157-1163(1999))，可以在本发明的实施中使用。通过实施例(实施例6)，我们也描述了向HBcAg的MIR内插入表位，产生嵌合的自装配HBcAg。优化自装配效率和展示插入HBcAg MIR内的表位的一个重要因素是插入位点的选择，以及插入时从MIR内HBcAg序列上删除的氨基酸数量(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP 0 421 635；US 6,231,864)，即HBcAg的哪些氨基酸将被置换为新的表位。例如，已经报道了用外源表位置换HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP0421635；US 6,231,864)。HBcAg含有一个长精氨酸尾(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))，它不是衣壳装配所必需的，能够结合核酸(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001))。包含或缺乏这一精氨酸尾的HbcAg都是本发明的实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP。在细菌、特别是在大肠杆菌中表达后，RNA噬菌体的主要外壳蛋白自发装配为VLP。能够用来制备本发明组成物的噬菌体外壳蛋白的具体例子包括RNA噬菌体如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：4；PIR数据库，登录号VCBPQβ指Qβ CP，和SEQ ID NO：5；登录号AAA16663指QβA1蛋白)和噬菌体fr(SEQ ID NO：7；PIR登录号VCBPFR)的外壳蛋白。
在一个更优选的实施方案中，至少一个ghrelin或ghrelin肽与一个Qβ外壳蛋白融合。已经报道了下述融合蛋白构建体，其中表位与QβA1蛋白截短形式的C端融合，或者插入A1蛋白内(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology，39：9-15(1996))。A1蛋白是通过UGA终止密码子的抑制产生的，长度为329个氨基酸，或者如果考虑N端甲硫氨酸的切除，为328个氨基酸。丙氨酸(QβCP基因编码的第二个氨基酸)之前N端甲硫氨酸的切除在大肠杆菌中常常发生，Qβ外壳蛋白CP的N端也是如此。位于UGA琥珀密码子3’的A1基因部分编码长度为195个氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位点72与73之间插入至少一个ghrelin或ghrelin肽产生本发明的其它实施方案(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))。ghrelin或ghrelin肽在C端截短的QβA1蛋白C端的融合为本发明的进一步优选的实施方案。例如，Kozlovska等人(Intervirology 39：9-15(1996))描述了QβA1融合蛋白，其中表位与在位点19处截短的QβCP延伸的C端融合。
如Kozlovska等人(Intervirology 39：9-15(1996))所述，展示融合表位的颗粒的装配一般需要同时存在A1蛋白-ghrelin或ghrelin肽融合和野生型CP，才能形成镶嵌颗粒。然而，本发明的范围内也包括包含病毒样颗粒、特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP的实施方案，其仅仅由融合了至少一个ghrelin或ghrelin肽的VLP亚单位组成。
镶嵌颗粒的产生可以用多种方法实现。Kozlovska等人，Intervirology 39：9-15(1996)描述了两种方法，它们均能在本发明的实施中使用。第一种方法，通过在大肠杆菌株中(携带编码克隆的UGA抑制子tRNA的质粒，使UGA密码子翻译为Trp：pISM3001质粒(Smiley B.K.等人，Gene 134：33-40(1993))表达编码Qβ A1融合蛋白(在CP与CP延伸之间含有一个UGA终止密码子)的质粒，介导VLP上融合表位的有效展示。另一种方法，将CP基因终止密码子修饰为UAA，与表达A1蛋白-ghrelin或ghrelin肽融合体的第二种质粒共转化。第二种质粒编码不同的抗生素抗性，其复制起点与第一种质粒相一致(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))。第三种方法，CP和A1蛋白-ghrelin或ghrelin肽融合体以双顺反子的形式编码，与一种启动子如Trp启动子有效连接，如Kozlovska等人，Intervirology 39：9-15(1996)的图1所示。
在另外一个实施方案中，ghrelin或ghrelin肽插入fr CP的氨基酸2与3之间(切割的CP的编号，其中N端甲硫氨酸已经切除)，从而产生ghrelin或ghrelin肽-fr CP融合蛋白。用于构建和表达可自装配为VLP的fr CP融合蛋白并且在本发明的实施中可以使用的载体和表达系统已经有报道(Pushko P.等人，Prot.Eng. 6：883-891(1993))。在一个具体实施方案中，ghrelin或ghrelin肽序列插入fr CP缺失变体内氨基酸2之后，其中fr CP的残基3和4已经删除(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。
表位在RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N端突起β-发夹中的融合，以及随后融合表位在RNA噬菌体MS-2的自装配VLP上的呈递，也已经有报道(WO92/13081)，ghrelin或ghrelin肽通过插入或置换融合到MS-2RNA噬菌体的外壳蛋白内也属于本发明的范围。
在本发明的另一个实施方案中，ghrelin或ghrelin肽与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，ghrelin或ghrelin肽与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1融合。已经报道了用于构建及在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达BPV-1融合蛋白的载体和表达系统(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO00/23955)。用ghrelin或ghrelin肽置换BLV-1L1的氨基酸130-136，产生BPV-1L1-ghrelin或ghrelin肽融合蛋白，是本发明的一个优选实施方案。已报道了在杆状病毒载体中克隆以及在杆状病毒感染的Sf9细胞中的表达，可以在本发明的实施中应用(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：2373-2378(1999)，WO00/23955)。展示融合的ghrelin或ghrelin肽的装配颗粒能够用多种方法纯化，如凝胶过滤或蔗糖梯度超速离心(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO00/23955)。
在本发明的另一个实施方案中，ghrelin或ghrelin肽与能够掺入Ty VLP内的Ty蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，ghrelin或ghrelin肽与TYA基因编码的p1或衣壳蛋白融合(Roth，J.F.，Yeast 16：785-795(2000))。酵母逆转录转座子Ty1、2、3、4已经从酿酒酵母中分离，而逆转录转座子Tf1已经从粟酒裂殖酵母中分离(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，“酵母转座元件”，《酵母的分子和细胞生物学：基因组动力学、蛋白质合成和能量学》(The molecularand Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces：Genomedynamics，Protein Synthesis，and Energetics)，p.193，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1991))。逆转录转座子Ty1和2与植物和动物元件的copia类别有关，而Ty3属于逆转录转座子的gypsy家族，它与植物和动物逆转录病毒有关。在Ty1逆转录转座子中，p1蛋白，也被称为Gag或衣壳蛋白，长度为440个氨基酸。在VLP的成熟过程中p1在位点408处被切割，产生p2蛋白，后者是VLP的基本成分。
已经报道了与p1的融合蛋白和在酵母中表达该融合蛋白的载体(Adams，S.E.等人，Nature 329：68-70(1987))。例如，通过向pMA5620质粒的BamHI位点内插入编码ghrelin或ghrelin肽的序列，该ghrelin或ghrelin肽可以与p1融合(Adams，S.E.等人，Nature329：68-70(1987))。将编码外源表位的序列克隆到pMA5620载体内导致融合蛋白的表达，该融合蛋白包含Ty1-15的p1的氨基酸1-381，其C端与外源表位的N端融合。同样，ghrelin或ghrelin肽的N端融合，或向p1序列内的内部插入，或将p1序列部分置换，也属于本发明的范围。具体而言，在Ty序列内位于Ty蛋白p1(EP0677111)的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之间插入ghrelin或ghrelin肽，为本发明的优选实施方案。
适于ghrelin或ghrelin肽融合的其它VLP有，例如：逆转录病毒样颗粒(WO9630523)、HIV2 Gag(Kang，Y.C.等人，Biol.Chem.380：353-364(1999))、豇豆花叶病毒(Taylor，K.M.等人，Biol.Chem.380：387-392(1999))、细小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等人，Virology263：89-99(1999))、HBsAg(US 4,722,840,EP0020416B1)。
适于实施本发明的嵌合VLP的例子也包括Intervirology 39：1(1996)所述的VLP。预期可在本发明中使用的VLP的其它例子有：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、烟草花叶病毒。也已经制备了SV40、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒和诺瓦克病毒的病毒样颗粒，这些VLP的嵌合VLP也属于本发明的范围。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin肽。
在本发明的另外一个非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇选自：a)人ghrelin；b)猫ghrelin；c)狗ghrelin；d)牛ghrelin；e)绵羊ghrelin；f)马ghrelin；g)猪ghrelin；h)a)-g)中任何一种ghrelin的肽或其片段。
在本发明的另外一个非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇包含、基本由或者由选自下列的氨基酸序列组成：
(a)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：48)
(b)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：31)
(c)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：49)
(d)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：50)
(e)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：32)
GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：51)
KKPPAKLQPR(SEQ ID NO：52)
PPAKLQPR(SEQ ID NO：53)
AKLQPR(SEQ ID NO：54)
GSSFLSPEHQ(SEQ ID NO：55)
EHQRVQQRKE(SEQ ID NO：56)
EHQRVQQRKES(SEQ ID NO：111)
EHQKAQQRKE(SEQ ID NO：112)
EHQKAQQRKES(SEQ ID NO：113)
EHQKLQQRKE(SEQ ID NO：114)
EHQKLQQRKES(SEQ ID NO：115)
LSPEHQRVQQ(SEQ ID NO：116)
LSPEHQKAQQ(SEQ ID NO：117)
(s)LSPEHQKLQQ(SEQ ID NO：118).
在本发明的另外一个非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇分别是人、猫、猪、马、绵羊、牛、豚鼠、狗或小鼠ghrelin和ghrelin肽。Ghrelin和ghrelin肽分别能够通过在强启动子控制下表达编码ghrelin和ghrelin肽的DNA来制备。优选地，该DNA不编码preproghrelin，而只编码活性n-辛酰基修饰肽的肽骨架。文献中已经描述了各种实施例，在修饰后可以用于表达任何希望的种的ghrelin。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是ghrelin衍生肽或其片段。优选地，该ghrelin肽选自：a)人ghrelin肽；b)牛ghrelin肽；c)猫ghrelin肽；d)狗ghrelin肽；e)猪ghrelin肽；f)鸡ghrelin肽；g)小鼠ghrelin肽；h)马ghrelin肽；i)绵羊ghrelin肽；和j)a)-i)中任何一种ghrelin肽的片段。
这些ghrelin肽或其片段可以用标准分子生物学技术产生，其中编码目的片段的核苷酸序列通过PCR扩增，并且克隆为与多肽尾(如组氨酸尾、Flag尾、myc尾)或抗体恒定区(Fc区)融合的融合体。通过在ghrelin片段与尾之间引入肠激酶切割位点，纯化后该ghrelin片段通过肠激酶消化可以与该标签分离。另外一种方法，可以用本领域技术人员周知的标准肽合成反应在体外合成含或不含n-辛酰基修饰的ghrelin片段。另一种方法，通过蛋白酶消化或化学切割全长ghrelin，可以产生ghrelin片段，这两种方法都是本领域技术人员公知的。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，ghrelin肽包含至少一个ghrelin的抗原性位点。本领域技术人员知道如何分别鉴定相应的肽和氨基酸序列。优选的片段可以含有ghrelin的N端或C端。C端可能特别有用，因为n-辛酰基修饰靠近N端，这种修饰也许会干扰未修饰形式的特异性抗体的结合。
优选的人ghrelin肽可包含：
KKPPAKLQPR(SEQ ID NO：52)
PPAKLQPR(SEQ ID NO：53)
AKLQPR(SEQ ID NO：54)
KLQPR(SEQ ID NO：59)
GSSFLSPEHQ(SEQ ID NO：55)
EHQRVQQRKES(SEQ ID NO：111)
LSPEHQRVQQ(SEQ ID NO：116)
GSSFLSP(SEQ ID NO：119)
然而，来自ghrelin内部位点的肽可能也是疫苗的有吸引力的候选者。因为各个种的ghrelin高度同源，因此可能诱导交叉反应性抗体应答。因此，针对狗或小鼠ghrelin的抗体应答也可能识别人ghrelin，反之亦然。因此，在本发明的范围内，与人ghrelin的氨基酸同一性大于80％、优选地大于85％、更优选地大于90％、或者更优选地大于95％、97％甚至99％的所有ghrelin分子及其衍生的肽都可用于接种。
具体而言，如何修饰人ghrelin或ghrelin肽以结合病毒样颗粒的指南已在本申请中给出。使用本发明的组成物针对ghrelin进行免疫可提供一种治疗肥胖症的方法，该组成物优选地含有与核心颗粒和VLP结合的人ghrelin或ghrelin肽。
在本发明的另外一个非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin肽，其包含或者基本由或者由选自下列的氨基酸序列组成：
(a)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(人)(SEQ ID NO：48)
(b)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(人)(SEQ ID NO：31)
(c)GSSFLSPEHQRVQ(人)(SEQ ID NO：60)
(d)QRKESKKPPAKLQPR(人)(SEQ ID NO：61)
(e)PPAKLQPR(人)(SEQ ID NO：53)
(f)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(狗)(SEQ ID NO：49)
(g)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(狗)(SEQ ID NO：50)
(h)GSSFLSPEHQKLQ(狗)(SEQ ID NO：62)
(i)QRKESKKPPAKLQPR(狗)(SEQ ID NO：63)
(k)EHQRVQQRKE(人)(SEQ ID NO：56)
(l)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(小鼠)(SEQ ID NO：32)
(n)(a)-(l)任一项的任何片段的氨基酸序列。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原簇还包含至少一个第二附着位点，该位点选自：(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中天然存在的附着位点。在一个优选实施方案中，所述附着位点含有本发明的氨基酸接头，优选C、CG或CGG接头序列。优选地，至少含有所述第二附着位点的抗原或抗原决定簇包含或者基本由或者由选自下列的氨基酸序列组成：
CGSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(人)(SEQ ID NO：64)
CGSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(人)(SEQ ID NO：65)
GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPRC(人)(SEQ ID NO：66)
GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPRGC(人)(SEQ ID NO：120)
GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRC(人)(SEQ ID NO：67)
GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRGC(人)(SEQ ID NO：121)
GSSFLSPEHQRVQC(人)(SEQ ID NO：68)
GSSFLSPEHQRVQGC(人)(SEQ ID NO：122)
CQRKESKKPPAKLQPR(人)(SEQ ID NO：69)
CPPAKLQPR(人)(SEQ ID NO：70)
CGSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(狗)(SEQ ID NO：71)
CGSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(狗)(SEQ ID NO：72)
GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPRC(狗)(SEQ ID NO：73)
GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPRGC(狗)(SEQ ID NO：123)
GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPRC(狗)(SEQ ID NO：74)
GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPRGC(狗)(SEQ ID NO：124)
GSSFLSPEHQKLQC(SEQ ID NO：75)
GSSFLSPEHQKLQGC(SEQ ID NO：125)
CEHQRVQQRKE(SEQ ID NO：76)
CGSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(小鼠)(SEQ ID NO：77)
GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRC(小鼠)(SEQ ID NO：126)
GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRGC(小鼠)(SEQ ID NO：127)
GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRC(小鼠)(SEQ ID NO：128)
GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRGC(小鼠)(SEQ ID NO：129)
GSSFLSPEHQKAQC(小鼠)(SEQ ID NO：130)
GSSFLSPEHQKAQGC(小鼠)(SEQ ID NO：131)
GGSSFLSPEHQGC(SEQ ID NO：132)
CKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：133)
CEHQKAQQRKE(SEQ ID NO：134)
CEHQKAQQRKES(SEQ ID NO：135)
CLSPEHQKAQQ(SEQ ID NO：136)
CEHQRVQQRKES(SEQ ID NO：137)
CLSPEHQRVQQ(SEQ ID NO：138)
(a)-(ee)中任一项的任何片段的氨基酸序列。
实例13描述了一些非常优选的ghrelin肽，其中具体提供了相应的鼠肽。为了与VLP和菌毛偶联，这些肽含有N端或C端半胱氨酸残基作为添加的第二附着位点。这些非常优选的短ghrelin肽片段当分别与VLP和核心颗粒偶联时能够具有非常强的免疫原性。而且，优选的ghrelin片段也能够克服当靶向自身蛋白时出现的安全性问题，因为较短的片段更不太可能含有T细胞表位。一般而言，肽越短，对于T细胞活化越安全。然而，肽太短也可能无法诱导可以在溶液中牢固结合ghrelin的高亲和力抗体。
选择对应于残基1-10的鼠ghrelin片段的非常优选的ghrelin肽片段(GSSFLSPEHQ)(SEQ ID NO：55)，主要是因为在所有已知的种中，ghrelin的N端片段相同。另外，在ghrelin尚未鉴定的种中也可能相同。而且，C端残基谷氨酰胺当分别与VLP和核心颗粒偶联时，可提高溶解度，有利于制备可溶性疫苗产物。实际上，肽的溶解度通常是偶联效率和疫苗稳定性的一个限制因素。其它原因包括避免潜在的T细胞表位。选择较小的肽片段可降低存在T细胞表位的可能性。鼠ghrelin残基1-10通过C端与VLP偶联，当免疫小鼠时可诱导N端特异性抗体，这些抗体能够结合活性ghrelin，从而防止它通过血脑屏障，使食物摄取减少。
由于与以上类似的原因，选择对应于残基42-51(KKPPAKLQPR)(SEQ ID NO：52)的鼠ghrelin肽片段的非常优选的ghrelin肽片段。唯一的差别是，通过N端偶联的这种肽片段当免疫小鼠时能够诱导ghrelin的C端部分特异性抗体。而且，能够增强抗体识别，因为丝氨酸3上的n-辛酰基可以避免，因而降低了干扰的可能性。通过N端与VLP偶联的鼠ghrelin残基42-51可诱导能够中和活性ghrelin的抗体，从而防止它通过血脑屏障，使食物摄取减少。
此外，另外选择了以下一些非常优选的ghrelin肽片段，其对应于残基31-41(EHQKAQQRKES)(SEQ ID NO：113)和残基28-37(LSPEHQKAQQ)(SEQ ID NO：117)的鼠ghrelin肽片段，它们含有ghrelin的中心片段。类似地，这些ghrelin片段可避免潜在的T细胞表位，也可避免丝氨酸上的n-辛酰基。这些肽通过N端或C端与VLP偶联可诱导能够中和活性ghrelin的抗体，从而防止它通过血脑屏障，使食物摄取减少。
适用于本发明的进一步优选的ghrelin肽可以利用现有的或未来的单克隆或多克隆抗体鉴定。
未来可能在尚未获得序列信息的种中发现进一步优选的ghrelin分子和来源于这些分子的肽。
相关领域的普通技术人员应当理解，对此处所述的方法和用途进行其它适当的修饰和改变是显而易见的，可以在不背离本发明的范围或其任何实施方案的情况下进行这种修饰和改变。现在已经详细描述了本发明，通过下列实施例将能更清楚地理解本发明，这些实施例只是用于说明，并非意在限制本发明。
实施例
实施例1
突变Qβ外壳蛋白的构建和表达，突变Qβ外壳蛋白VLP或衣壳的纯化
质粒构建和突变外壳蛋白的克隆
pQβ-240的构建：
质粒pQβ10(Kozlovska，TM等人，Gene137：133-137)作为构建pQβ-240的原始质粒。突变Lys13→Arg通过反向PCR产生。反向引物以反向尾-尾方向设计：
5′-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3′(SEQ ID NO：78)和
5′-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3′(SEQ IDNO：79)。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，第二次PCR使用上游引物
5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO：80)和下游引物
5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ IDNO：81)。
第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒的试剂按照厂商的方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-240的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的高效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列：(SEQ ID NO：17)
AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-243的构建：
质粒pQβ10作为构建pQβ-243的原始质粒。突变Asn10→Lys通过反向PCR产生。反向引物以反向尾-尾方向设计：
5′-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3′(SEQ ID NO：82)和
5′-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3′(SEQ IDNO：83)。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，第二次PCR使用上游引物
5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO：80)和下游引物
5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ IDNO：81)。第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒的试剂按照厂商的方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-243的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的高效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列：(SEQ ID NO：18)
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-250的构建：
质粒pQβ-240作为构建pQβ-250的原始质粒。突变Lys2→Arg通过定点诱变产生。用上游引物
5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′(SEQ ID NO：84)和下游引物
5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO：85)
合成突变PCR片段，将其导入pQβ-185表达载体内单一的限制酶切位点NcoI和HindIII处。PCR反应用PCR试剂盒的试剂按照厂商的方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-250的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的高效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列：(SEQ ID NO：19)
ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-251的构建：
质粒pQβ10作为构建pQβ-251的原始质粒。突变Lys16→Arg通过反向PCR产生。反向引物以反向尾-尾方向设计：
5′-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3′(SEQ IDNO：86)和
5′-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3′(SEQ IDNO：87)。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，第二次PCR使用上游引物
5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO：80)和下游引物
5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ IDNO：81)。第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒的试剂按照厂商的方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-251的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的高效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。获得的由该构建体编码的氨基酸序列如SEQ.ID NO：20所示。
pQβ-259的构建：
质粒pQβ-251作为构建pQβ-259的原始质粒。突变Lys2→Arg通过定点诱变产生。用上游引物
5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′(SEQ ID NO：84)和下游引物
5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO：85)合成突变PCR片段，将其导入pQβ-185表达载体中单一的限制酶切位点NcoI和HindIII处。PCR反应用PCR试剂盒的试剂按照厂商的方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-259的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的高效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列：(SEQ ID NO：21)
AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
Qβ和Qβ突变体的表达与纯化的一般方法
表达
用Qβ外壳蛋白表达质粒转化大肠杆菌JM109。在含20μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基中接种用Qβ外壳蛋白表达质粒转化的克隆。接种的培养物不加振摇在37℃下孵育16-24小时。制备的接种物随后用含有20μg1ml氨苄青霉素的100-300ml新鲜LB培养基1∶100稀释，并且不加振摇在37℃下孵育过夜。获得的二次接种物在摇瓶中用含有1％酪蛋白氨基酸和0.2％葡萄糖的M9培养基1∶50稀释，并在37℃振摇下孵育过夜。
纯化
纯化程序使用的溶液和缓冲液：
1.裂解缓冲液 LB
50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和新鲜制备的5μg/ml的PMSF。不含溶菌酶和DNAse。
2. SAS
饱和硫酸铵水溶液。
3.缓冲液 NET
20mM Tris-HCl，pH7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEG
NET中的40％(w/v)聚乙二醇6000
破碎与裂解
将冷冻细胞以2ml/g的浓度重悬浮于LB中。混合物以22KH超声处理5次各15秒，间隔1分钟，在冰上冷却溶液。然后用JaneckiK60转子以14000rpm离心裂解液1小时。除非另外说明，以下描述的离心步骤全都用同一转子进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用LB洗涤2次。离心后合并裂解液的上清液和洗涤级分。
分级分离
在搅拌下，向上述合并的裂解液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液。调节SAS的体积为总体积的1/5，获得20％的饱和度。溶液静置过夜，次日以14000rpm离心20分钟。沉淀用少量20％硫酸铵洗涤，再次离心。合并获得的上清液，逐滴加入SAS，获得40％的饱和度。溶液静置过夜，次日以14000rpm离心20分钟。将获得的沉淀溶解于NET缓冲液中。
层析
将溶解于NET缓冲液中的衣壳或VLP蛋白上样到SepharoseCL-4B柱上。在层析过程中洗脱出3个峰。第一个峰主要含有膜和膜片段，不予收集。衣壳含于第二个峰中，而第三个峰含有其它大肠杆菌蛋白质。
合并峰级分，将NaCl浓度调节至终浓度为0.65M。在搅拌下逐滴加入体积相当于合并峰级分一半的PEG溶液。该溶液不加搅拌静置过夜。以14000rpm离心20分钟沉淀衣壳蛋白。然后溶解于最小体积的NET中，再次上样到SepharoseCL-4B柱上。合并峰级分，用60％饱和(w/v)的硫酸铵沉淀。离心并溶解于NET缓冲液后，将衣壳蛋白上样到SepharoseCL-6B柱上进行层析。
透析和干燥
合并以上获得的峰级分，对无菌水充分透析，冻干保存。
Qβ240的表达与纯化
将细胞(质粒QP-240转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，超声处理5次各15秒(水冰夹套)，13000rpm离心1小时。上清液贮存于4℃，直到进一步处理，而碎片用9ml LB洗涤2次，最后用9ml0.7M尿素LB溶液洗涤。合并所有上清液，上样到Sepharose CL-4B柱上。用硫酸铵沉淀合并的峰级分并离心。然后用Sepharose 2B柱，最后用Sepharose 6B柱进一步纯化重新溶解的蛋白质。衣壳峰最后用水充分透析，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-243的表达与纯化
将细胞(大肠杆菌RR1)重悬浮于LB中，如一般方法所述处理。用Sepharose CL-4B柱，最后用Sepharose CL-2B柱，通过连续两次凝胶过滤步骤纯化该蛋白质。合并峰级分，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-250的表达与纯化
将细胞(pQβ-250转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，如上所述处理。用Sepharose CL-4B柱，最后用Sepharose CL-2B柱，通过凝胶过滤纯化该蛋白质，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-259的表达与纯化
将细胞(pQβ-259转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于Lβ中并超声处理。碎片用10ml LB洗涤1次，第二次用10ml 0.7M尿素LB溶液洗涤。用Sepharose CL-4B柱通过两次凝胶过滤层析步骤纯化该蛋白质。如上所述透析并冻干该蛋白质。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
实施例2
含有赖氨酸残基的肽向HBcAg c/e1表位(1-149)内的插入
HBcAg的c/e1表位(残基72-88)位于乙型肝炎病毒衣壳表面(HBcAg)的顶端区中。通过基因工程方法用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO：33)置换该区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)，获得HBcAg-Lys构建体(SEQ ID NO：26)。引入的赖氨酸残基在其侧链上含有反应性氨基，能够用于HBcAg颗粒与含有游离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。
具有SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的HBcAg-Lys DNA通过PCR产生：分别PCR扩增编码HBcAg片段(氨基酸残基1-78和81-149)的两条片段。这些PCR使用的引物也引入编码Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽(SEQ ID NO：33)的DNA序列。HBcAg(1-78)片段用引物EcoRIHBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)从pEco63扩增。HBcAg(81-149)片段用引物Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)从pEco63扩增。引物Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在两种PCR产物的末端引入互补DNA序列，使得两种PCR产物在随后的装配PCR中融合。装配的片段用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)通过PCR扩增。
对于这些PCR，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mMMgSO4的50ml反应混合物中使用100pmol每种oligo和50ng模板DNA。对于这两个反应，温度循环如下进行：94℃ 2分钟；94℃(1分钟)，50℃(1分钟)，72℃(2分钟)30个循环。
引物序列：
EcoRIHBcAg(s)：
(5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3’)(SEQ ID NO：88)；
Lys-HBcAg(as)：
(5’-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3’)(SEQ ID NO：89)；
Lys-HBcAg(s)：
(5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3’)(SEQ ID NO：90)；
HBcAg(1-149)Hind(as)：
(5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQ IDNO：91)。
为了通过PCR融合这两条PCR片段，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50ml反应混合物中使用100pmol引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，以及100ng两种纯化的PCR片段。PCR循环条件为：94℃2分钟；94℃(1分钟)，50℃(1分钟)，72℃(2分钟)30个循环。装配的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，纯化，在适当缓冲液中用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化19小时。将消化的DNA片段连接于EcoRI/HindIII-消化的pKK载体中，产生pKK-HBcAg-Lys表达载体。通过EcoRI/HindIII限制酶切分析和插入片段的DNA测序对PCR产物向载体内的插入进行分析。
实施例3
HBcAg-Lys的表达与纯化
用pKK-HBcAg-Lys转化大肠杆菌K802或JM109株。用1ml细菌过夜培养物接种100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基。培养液在37℃下培养4小时，直到600nm的OD值大约达到0.8。添加IPTG至终浓度为1mM诱导HBcAg-Lys的合成。诱导后，细菌在37℃下再振摇4小时。以5000×g离心15分钟收集细菌。将沉淀冻存于-80℃。融解沉淀，重悬浮于添加了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的细菌裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，pH7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20，10mM EDTA)中。将细胞在室温下孵育30分钟，通过超声处理破碎。在IPTG诱导HBcAg-Lys表达中使用携带pKK-HBcAg-Lys表达质粒或对照质粒的大肠杆菌细胞。在加入IPTG之前，从携带pKK-HBcAg-Lys质粒的细菌培养液和携带对照质粒的培养液中采集样品。加入IPTG4小时后，再次从含有pKK-HBcAg-Lys的培养液和对照培养液中采集样品。通过SDS-PAGE，随后考马斯蓝染色，监测蛋白质的表达。
然后以12,000×g离心裂解液30分钟，除去不可溶的细胞碎片。使用抗HBcAg单克隆抗体(YVS1841，购自Accurate Chemical andScientific Corp.，Westbury，NY，USA)，通过Western blotting分析上清液和沉淀，表明显著量的HBcAg-Lys蛋白是可溶的。简言之，以14,000×g离心来自表达HBcAg-Lys的大肠杆菌细胞和来自对照细胞的裂解液30分钟。分离上清液(＝可溶级分)和沉淀(＝不可溶级分)，用SDS样品缓冲液稀释至相同体积。通过SDS-PAGE，随后用抗-HBcAg单克隆抗体YVS1841进行Western blotting分析样品。
对澄清的细胞裂解液进行分级梯度离心，其中使用的蔗糖分级梯度由4ml 65％蔗糖溶液、覆盖于其上的3ml 15％蔗糖溶液、以及随后的4ml细菌裂解液组成。样品在4℃下以100,000×g离心3小时。离心后，从梯度顶部采集1ml级分，通过SDS-PAGE，随后通过考马斯蓝染色分析。用考马斯蓝染色检测HBcAg-Lys蛋白。
HBcAg-Lys蛋白在15％与65％蔗糖之间的界面处富集，表明已经形成衣壳颗粒。大多数细菌蛋白质仍存在于该梯度的不含蔗糖的上层中，因此HBcAg-Lys颗粒的分级梯度离心导致颗粒的富集和部分纯化。
HBcAg-Lys的大规模表达和纯化如下进行。制备过夜培养物，方法是将单菌落接种到100ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。次日用800ml LB氨苄青霉素培养基稀释25ml预培养液，培养液生长到光密度OD600为0.6-0.8。然后用1mM IPTG诱导培养液，再培养4小时。收集细胞，基本如上所述裂解。
然后纯化HBcAg-Lys，方法是首先用硫酸铵(30％饱和)从澄清的细胞裂解液中沉淀蛋白质，然后将重新溶解的沉淀上样到凝胶过滤柱(Sephacryl S-400，Pharmacia)上。合并的级分再次用硫酸铵沉淀，重新溶解沉淀，再次上样到同一凝胶过滤柱上。最后合并级分并浓缩，用Bradford试验(BioRad)测定其浓度。
实施例4
不含游离半胱氨酸残基、含有插入的赖氨酸残基的HBcAg的构建
用下列方法构建如下肝炎核心抗原(HBcAg)，在此称为HBcAg-lys-2cys-Mut，它在对应于SEQ ID NO：25中48和107的位点处不含半胱氨酸残基，而含有一个插入的赖氨酸残基。
如下引入所述两个突变，首先应用下列PCR引物组合分别扩增如实施例2所述制备的HBcAg-Lys基因的3个片段。用PCR方法和常规克隆技术制备HBcAg-lys-2cys-Mut基因。
简言之，用下列引物制备片段1：
引物1：EcoRIHBcAg(s)
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO：88)
引物2：48as
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(SEQ ID NO：92)
用下列引物制备片段2：
引物3：48s
GAGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(SEQ ID NO：93)
引物4：107as
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC(SEQ ID NO：94)
用下列引物制备片段3：
引物5：HBcAg149hind-as
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG(SEQ IDNO：95)
引物6：107s
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(SEQ ID NO：96)
然后用PCR引物EcoRIHBcAg(s)和107as组合片段1和2，产生片段4。然后用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg149hind-as组合片段4和片段3，产生全长基因。全长基因用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化，克隆到在相同限制酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)中。HBcAg-lys-2cys-Mut的表达与纯化如实施例3所述进行。
实施例5
HBcAg1-185-Lys的构建
肝炎核心抗原(HBcAg)1-185如实施例2所述进行修饰。通过基因工程方法用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO：33)替换c/e1表位(残基72-88)区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)，获得HBcAg1-185-Lys构建体(SEQ ID NO：26)。引入的赖氨酸残基在其侧链上含有一个反应性氨基，可以用于HBcAg颗粒与含有游离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。用PCR方法和常规克隆技术制备HBcAg1-185-Lys基因。
如下插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列(SEQ ID NO：33)：如以上实施例2所述，从pEco63扩增HBcAg基因的两条不同片段，随后通过PCR融合这两条片段，装配为全长基因。使用下列PCR引物组合：
片段1：
引物1：EcoRIHBcAg(s)((SEQ ID NO：88)，见实施例2)
引物2：Lys-HBcAg(as)((SEQ ID NO：89)，见实施例2)
片段2：
引物3：Lys-HBcAg(s)((SEQ ID NO：90)，见实施例2)
引物4：HBcAgwtHindIIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQ ID NO：97)
装配：
引物1：EcoRIHBcAg(s)((SEQ ID NO：88)，见实施例2)
引物2：HBcAgwtHindIIII(SEQ ID NO：97)
装配的全长基因用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化，克隆到用相同限制酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)中。
实施例6
肽表位在HBcAg的MIR区中的融合
将HBcAg1-185的残基79和80置换为具有序列VNLTWSRASG(SEQID NO：98)的表位CεH3。CεH3序列来源于人IgE重链第三恒定区的序列。用装配PCR法将该表位插入HBcAg1-185序列中。第一个PCR步骤中，用来源于ATCC克隆pEco63并用引物HBcAg-wt EcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev扩增的HBcAg1-185基因作为两个不同反应的模板，扩增含有编码CεH3序列的序列元件的两条片段。然后在装配PCR反应的第二个PCR步骤中装配这两条片段。
第一个PCR步骤的引物组合：CεH3fwd与HBcAg-wt Hind III rev，和HBcAg-wt EcoRI fwd与CεH3rev。在装配PCR反应中，第一个PCR步骤中分离的两条片段首先通过3个PCR循环装配，这一步不需要外部引物，之后将外部引物添加到反应混合物中进行下25个循环。外部引物：HBcAg-wt EcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev。
为了在大肠杆菌中表达，利用EcoRI和HindIII位点将PCR产物克隆到pKK223.3中(见实施例2)。嵌合VLP如实施例2所述在大肠杆菌中表达并纯化。从凝胶过滤中洗脱出HBcAg1-185-CεH3的洗脱体积显示融合蛋白装配为嵌合VLP。
引物序列：
CεH3fwd：
5′GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC
3′(SEQ ID NO：99)
    V   N   L   T   W   S   R  A   S   G A80 S   R   D   L   V  V86
(SEQ ID NO：100)
CεH3rev：
5′ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3′
(SEQ ID NO：101)
                                           D78 E   L   N   N   G V72
(SEQ ID NO：102)
HBcAg-wt EcoRI fwd：
5’CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ IDNO：103)
HBcAg-wt Hind III rev：
5’CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQ ID NO：104)
实施例7
ghrelin肽表位在HBcAg的MIR区中的融合
将HBcAg1-185的残基79和80置换为序列为EHQRVQQRKE(SEQ IDNO：56)的ghrelin肽表位。用如实施例6所述相同的策略设计两条重叠引物，通过装配PCR构建融合蛋白。将PCR产物克隆到pKK223.3载体内，并在大肠杆菌K802中表达。嵌合VLP如实施例3所述表达并纯化。
实施例8
ghrelin肽表位向CP延伸位点19处截短的QβA1蛋白C端的融合
在pQβ10作为模板的PCR反应中使用可与QβA1基因的5’端退火的一条引物和可与A1基因的3’端退火的一条引物，后者还含有编码序列为KKPPAKLQPR(SEQ ID NO：52)的ghrelin片段的额外序列元件。将PCR产物克隆到pQβ10内(Kozlovska T.M.等人，Gene137：133-37(1993))，嵌合VLP如实施例1所述表达并纯化。
实施例9
ghrelin肽表位向fr外壳蛋白位点2与3之间的插入
利用标准分子生物学技术向pFrd8载体的Bsp119I位点中插入互补引物，该引物编码序列为EHQRVQQRKE(SEQ ID NO：56)的ghrelin肽序列，并且含有Bsp119I相容的末端和允许框内插入的其它核苷酸(Pushko，P.等人，Prot.Eng.6：883-91(1993))。或者，在用Bsp119I消化后用Klenow补平pFrd8载体的突出端，在Klenow处理后将编码ghrelin肽鼠ghrelin肽序列的核苷酸和用于框内克隆的其它核苷酸连接到pFrd8中。通过测序对含有正确方向插入的克隆进行分析。嵌合融合蛋白在大肠杆菌JM109或大肠杆菌K802中的表达和纯化如Pushko，P.等人，Prot.Eng.6：883-91(1993)所述进行，不同之处在于层析步骤用Sepharose CL-4B或Sephacryl S-400(Pharmacia)进行。类似于实施例1中关于Qβ所述的方法，细胞裂解液用硫酸铵沉淀，通过连续两个凝胶过滤纯化步骤纯化。
实施例10
ghrelin肽表位在载体pOGS8111中Ty1蛋白p1的位点67与68之间的插入
合成两条编码序列为EHQRVQQRKE的人ghrelin肽(SEQ ID NO：56)的互补寡核苷酸，其末端与pOGS8111的NheI位点相容。根据EP06777111所述添加额外核苷酸，用以框内插入编码鼠ghrelin表位的序列。位于插入表位侧翼的氨基酸AS和SS由改变的NheI位点(由于在pOGS8111的TyA(d)基因中插入寡核苷酸产生的)编码。
为了如EP0677111和此处的参考文献所述表达嵌合Ty VLP，用POGS8111转化酿酒酵母MC2株。如EP0677111所述通过蔗糖梯度超速离心纯化嵌合Ty VLP。
实施例11
ghrelin肽表位向1型乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1中的插入
用编码序列为EHQRVQQRKE(SEQ ID NO：56)的ghrelin表位序列置换BPV-1L1基因的编码氨基酸130-136的序列，该基因克隆在pFastBacl(GIBCO/BRL)载体内(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.USA 96：2373-2378(1999))。该构建体的序列通过核苷酸序列分析证实。利用GIBCO/BRL杆状病毒系统，如厂商所述产生重组杆状病毒。如Kirnbauer，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.89：12180-84(1992)和Greenstone，H.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.95：1800-05(1998)所述从感染杆状病毒的Sf9细胞中纯化嵌合VLP。
实施例12
用与VLP融合的ghrelin-肽免疫小鼠
如实施例15所述用实施例7、9、10、11中产生的展示序列为EHQRVQQRKE(SEQ ID NO：56)的鼠ghrelin表位的嵌合VLP来免疫小鼠。如实施例14所述，用ghrelin特异的ELISA分析从免疫小鼠中获得的血清。
通过跟踪小鼠的体重增加及测量食物摄取检查该疫苗的效果。
实施例13
鼠ghrelin和鼠ghrelin肽与Qβ衣壳蛋白的偶联：ghrelin肽疫苗
化学合成下列ghrelin肽：
cGhrel：CGSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：77)
GhrelC：GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：105)
cGhrQ14：CGSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：106)
GhrQ14C：GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：107)
Ghre124-33C GGSSFLSPEHQGC(SEQ ID NO：132)
cGhrel42-51 CKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：133)
cGhrel31-40 CEHQKAQQRKE(SEQ ID NO：134)
cGhrel31-41 CEHQKAQQRKES(SEQ ID NO：135)
cGhrel28-37 CLSPEHQKAQQ(SEQ ID NO：136)
它们含有添加的N端或C端半胱氨酸残基，以便与VLP和菌毛偶联，和如下所述用来与Qβ化学偶联。
5ml 140μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液与108μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用5L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析两次各2小时。100μl透析的反应混合物然后与28.6μl 10mM ghrelin肽贮存液(DMSO中)(肽/Qβ衣壳蛋白比为1∶10)反应。偶联反应在15℃水浴中进行2小时。反应混合物随后在4℃下用5L20mMHepes，150mM NaCl，pH7.2透析两次各24小时。
离心偶联产物，在还原性条件下用16％SDS-PAGE分析上清液和沉淀。凝胶用考马斯亮蓝染色。
ghrelin肽与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与10倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析两次各2小时。透析的fr反应混合物然后与等摩尔浓度的ghrelin肽，或者以1∶2的ghrelin肽/fr比，在16℃摇床上反应过夜。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
ghrelin肽与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与10倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析两次各2小时。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合物然后与等摩尔浓度的ghrelin肽，或者以1∶2的ghrelin肽/HBcAg-Lys-2cys-Mut比，在16℃摇床上反应过夜。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
ghrelin肽与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes，pH7.2中的溶液与50倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH在摇床上室温反应60分钟。反应混合液在PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)上脱盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质级分，脱盐、衍化的菌毛蛋白以等摩尔或者以1∶2肽菌毛比与ghrelin肽在16℃摇床上反应过夜。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
实施例14
用VLP-ghrelin肽偶联物免疫小鼠
用与Qβ偶联的ghrelin肽免疫小鼠
将实施例13所列的与Qβ偶联的鼠ghrelin肽与明矾混合、在IFA中乳化，或者不含佐剂，用来免疫雌性C57BL/6小鼠。在第0天、第14天、第28天皮下注射50μg。免疫后，小鼠在第14、21、28、42天眼眶后采血，随后以一个月的间隔采血。血清用ghrelin蛋白特异的ELISA分析。
为了便于清楚地理解，已经通过说明和实施例详细地描述了本发明，本领域普通技术人员应当理解，在不影响本发明或其任何具体实施方案的范围的情况下，能够在较广或等同范围的条件、制剂和其它要素范围内修饰或改变本发明，这些修饰或改变包括在所附权利要求书的范围之内。
本说明书中提到的所有公开文件、专利和专利申请都代表本发明所属领域中技术人员的水平，均在此引用作为参考，如同具体、单独地引用每个公开文本、专利和专利申请作为参考。
实施例15
C-Ghrelin和Ghrelin-GC与Qβ衣壳蛋白的偶联
2ml 2.0mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与114.4 μl SMPH(Pierce)溶液(来自溶于DMSO的50mM贮存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mMHepes，150mM NaCl，pH7.2透析两次各2小时。
透析、衍化的Qβ VLP随后与鼠C-Ghrelin(SEQ ID NO：77)或鼠Ghrelin-GC肽(SEQ ID NO：105)在20mM Hepes，150mMNaCI pH7.2中15℃反应2小时。偶联反应以多个等份进行，其中1ml衍化的QβVLP(浓度为2mg/ml)与286μl 10mM肽溶液反应。向偶联反应中加入10％乙腈。反应溶液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析一次2小时，然后透析过夜。
偶联产物用16％SDS-PAGE凝胶分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。结果显示在图1中。在考马斯亮蓝染色的凝胶中能够检测到偶联产物，并清楚地证明C-Ghrelin或Ghrelin-GC与Qβ衣壳蛋白的共价偶联。对应于每个亚单位偶联1、2、3或4个肽的偶联带用箭头指出。
图1显示鼠C-Ghrelin或鼠Ghrelin-GC与Qβ衣壳蛋白反应产生的偶联产物。第2道和第4道分别显示Qβ-C-Ghrelin和Ghrelin-GC-Qβ的可溶性级分中的偶联产物。在不可溶级分中几乎没有产物。
实施例16
用与Qβ衣壳蛋白偶联的C-Ghrelin或Ghrelin-GC免疫小鼠
对雌性C57BL/6小鼠(每组5只)接种与Qβ衣壳蛋白偶联的鼠C-Ghrelin(SEQ ID：No.77)或鼠Ghrelin-GC(SEQ ID：No.105)。50μg来自每个样本的透析的疫苗用PBS稀释到200μl的体积，在第0、14、42天皮下注射(腹部两侧各100μl)。该疫苗不加其它任何佐剂施用。一组小鼠用PBS免疫作为对照。对小鼠在第0、14、21、42天眼眶后采血，血清用Ghrelin特异的ELISA分析(实施例17概述)。此外，在实验过程中定期监测小鼠的体重和食物消耗(实施例18概述)。
实施例17
用ELISA检测ghrelin特异性抗体
ELISA板用浓度为20μg/ml的丝氨酸-辛酰化的鼠ghrelin(Bachem，产品号H-4862)包被。封闭平板，然后与连续稀释的第14、21、42天的小鼠血清一起孵育。用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。也检测同一小鼠的免疫前血清作为对照(图2)。
在用Qβ-C-Ghrelin或Ghrelin-CG-Qβ免疫的小鼠中，第21天分别达到13000和8000的平均滴度(图2)。免疫前血清或来自PBS免疫小鼠的血清显示与ghrelin没有任何反应性。这清楚地证明，ghrelin-VLP偶联物即使是自身蛋白质仍然能够诱导针对ghrelin的高抗体滴度。
实施例18
使用与Qβ衣壳蛋白偶联的C-Ghrelin或Ghrelin-GC
进行的效能实验
如实施例16所述，对雌性C57BL/6小鼠(每组5只)接种与Qβ衣壳蛋白偶联的鼠C-Ghrelin或Ghrelin-GC。用PBS免疫小鼠作为对照。在第0-14天，所有小鼠都给予正常饮食。随后给予所有小鼠高脂肪(45％)饮食，以促进饮食诱导的肥胖的发展。食物和水随意给予。监测各小鼠的体重变化，在免疫后也定期监测(免疫后第5、11、14、21、28、35、40、49和55天)每个笼子(即组)中食物与水的消耗(见图3)。
在用鼠Qβ-C-Ghrelin或鼠Ghrelin-CG-Qβ免疫的小鼠中，与PBS免疫的对照小鼠相比，食物摄入平均减少约30-40％(图3)。这清楚地证明，ghrelin-VLP偶联物能够抑制食欲并减少食物消耗。
实施例19
使用与Qβ衣壳蛋白偶联的C-Ghrelin或Ghrelin-GC
在肥胖症动物模型中进行的效能实验
对雌性C57BL/6ob/ob小鼠(每组5只)接种与Qβ衣壳蛋白偶联的鼠C-Ghrelin或Ghrelin-GC。对照小鼠用PBS或单独的QβVLP免疫。50μg透析的疫苗或对照蛋白质用200μl体积的PBS稀释，在第0天皮下注射(腹部两侧各100μl)，其中含有或不含明矾。对小鼠在第14、28、42天用相应的制剂加强。
对小鼠在第0、14、21、42、56、70天眼眶后采血，然后以一个月的间隔采血。如实施例17所述，用Ghrelin特异的ELISA分析血清中的ghrelin特异性抗体。如果在实验期间ghrelin特异性抗体滴度显著下降，则对小鼠进行加强免疫。如实施例18所述，通过测量随意摄取条件下的食物消耗及跟踪小鼠的体重增加确定疫苗的效果。
实施例20
AP205外壳蛋白基因的克隆
AP205外壳蛋白(CP)的cDNA(SEQ ID NO：28)由两条cDNA片段装配而成，这两条片段利用反转录PCR技术由噬菌体AP205 RNA产生，并且克隆到商品化质粒pCR4-TOPO内进行测序。反转录技术为相关领域普通技术人员所周知。质粒p205-246中所含的第一条片段含有位于CP序列上游的269个核苷酸和编码CP前24个N端氨基酸的74个核苷酸。质粒p205-262中所含的第二条片段含有编码CP的氨基酸12-131的364个核苷酸和位于CP序列下游的另外162个核苷酸。p205-246和p205-262均由J.Klovins惠赠。
质粒283.-58由两步PCR设计，是为了将来自质粒p205-246和p205-262的两条CP片段融合于一个全长CP序列内。
为了向质粒pQb185内克隆，使用含有NcoI位点的上游引物p1.44，或者为了向质粒pQb10内克隆，使用含有XbaI位点的上游引物p1.45，和含有HindIII限制位点下游引物p1.46(限制性内切酶识别序列用下划线标出)：
p1.44 5′-AA CC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3′(SEQ IDNO：139)
p1.45 5′-AA TCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3′(SEQ  IDNO：140)
p1.46 5′-AA AAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3′(SEQID NO：141)
在第一个PCR中使用了另外两条引物，在p205-262所含片段的5′端退火的p1.47，和在质粒p205-246所含片段的3′端退火的p1.48，用来扩增这些片段。引物p1.47和p1.48彼此互补。
p1.47：5′-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTTTCAGCAAGTCTG-3′(SEQ ID NO：142)
p1.48：5′-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGAGTTGGATCACTC-3′(SEQ ID NO：143)
前两个PCR反应产生两条片段。第一条片段用引物p1.45和p1.48和模板p205-246产生。第二条片段用引物p1.47和p1.46和模板p205-262产生。这两条片段都作为模板用于第二个PCR反应，即剪接重叠延伸，其中使用引物组合p1.45和p1.46或p1.44和p1.46。这两个二步PCR反应的产物分别用XbaI或NcoI和HindIII消化，利用相同的限制酶切位点将其分别克隆到pQb10或pQb185内，这是在大肠杆菌色氨酸操纵子启动子控制下的两种pGEM衍生的表达载体。
获得两种质粒，pAP283-58(SEQ ID NO：27)和pAP281-32(SEQ IDNO：30)，前者在pQb10中含有编码野生型AP205CP(SEQ ID NO：28)的基因，后者在pQb185中含有突变Pro5→Thr(SEQ ID NO：29)。外壳蛋白序列通过DNA测序证实。pAP283-58含有位于CP的ATG密码子上游和XbaI位点下游的49个核苷酸，并且含有推断的外壳蛋白mRNA的原始核糖体结合位点。
实施例21
重组AP205 VLP的表达与纯化
A.重组AP205 VLP的表达
大肠杆菌JM109用质粒pAP283-58转化。在5ml含有20μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中接种单菌落，不加振摇在37℃下孵育16-24小时。
制备的接种物用100-300ml含有20μg/ml氨苄青霉素的LB培养基1∶100稀释，不加振摇在37℃下孵育过夜。获得的第二种接种物用含有0.2％葡萄糖和缓冲磷酸盐的2TY培养基1∶50稀释，并且在摇床上37℃孵育过夜。离心收集细胞，冻存于-80℃。
B.重组AP205 VLP的纯化
溶液与缓冲液：
裂解缓冲液
50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和5mg/mlPMSF。
SAS
饱和硫酸铵水溶液。
缓冲液 NET
20mM Tris-HCl，pH7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
PEG
40％(w/v)聚乙二醇6000，溶于NET
裂解：
将冷冻细胞以2ml/g细胞的浓度重悬浮于裂解缓冲液中。将混合物以22KH超声处理5次各15秒，间隔1分钟，在冰上冷却该溶液。然后用F34-6-38转子(Ependorf)以12000rpm离心裂解液20分钟。除非另外说明，以下所述的离心步骤全都使用同一转子进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用裂解缓冲液洗涤2次。离心后合并裂解液的上清液和洗涤级分。
可以进一步利用硫酸铵沉淀纯化AP205 VLP。第一步，选择AP205VLP不会沉淀的硫酸铵浓度。弃去获得的沉淀。第二步，选择AP205 VLP定量沉淀的硫酸铵浓度，通过离心(14000rpm，20分钟)从该沉淀步骤获得的沉淀中分离AP205 VLP。将获得的沉淀溶解于NET缓冲液中。
层析：
将来自合并上清液的衣壳蛋白上样到Sepharose4B柱(2.8×70cm)上，用NET缓冲液以4ml/小时/级分的速度洗脱。合并级分28-40，用60％饱和的硫酸铵沉淀。这些级分在沉淀之前使用AP205特异性抗血清通过SDS-PAGE和WesternBlot分析。将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，上样到Sepharose 2B柱(2.3×65cm)，以3ml/小时/级分的流速洗脱。这些级分通过SDS-PAGE分析，收集级分44-50，合并，用60％饱和的硫酸铵沉淀。将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，用Sepharose 6B柱(2.5×47cm)纯化，以3ml/小时/级分的流速洗脱。这些级分通过SDS-PAGE分析。合并级分23-27，将盐浓度调节为0.5M，用PEG6000沉淀(加入40％贮存水溶液，至终浓度为13.3％)。将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，上样到与以上相同的Sepharose 2B柱上，以相同的方式洗脱。合并级分43-53，用60％饱和的硫酸铵沉淀。将离心分离的沉淀重新溶解于水中，获得的蛋白质溶液用水充分透析。每克细胞能够分离约10mg纯化的蛋白质。
用电子显微镜检查病毒样颗粒，显示它们与噬菌体颗粒相同。
为了便于清楚地理解，在此已经通过举例说明和实施例全面详细地描述了本发明，本领域普通技术人员应当理解，在不影响本发明或其任何具体实施方案的范围的情况下，能够在较广或等同范围的条件、制剂和其它参数内修饰或改变本发明，这些修饰或改变包括在所附权利要求书的范围之内。
本说明书中提到的所有公开文件、专利和专利申请表明了本发明所属领域中技术人员的水平，均在此引用作为参考，如同具体、单独地引用每个公开文本、专利和专利申请作为参考。
                         序列表
<110>赛托斯生物技术公司
     马丁·F·巴克曼(Bachmann，Martin F)
     阿尔玛·富卢里贾(Fulurija，Alma)
<120>Grehlin-载体偶联物
<130>PA040W0
<150>US 60/396,638
<151>2002-07-19
<160>146
<170>PatentIn version3.2
<210>1
<211>172
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>1
Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Thr Pro Gln
1               5                   10                  15
Gly Gln Gly Arg Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys
            20                  25                  30
Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ala Asp Gln Ser Ile Asp Phe Gly Gln Leu
        35                  40                  45
Ser Lys Ser Phe Leu Ala Asn Asp Gly Gln Ser Lys Pro Met Asn Leu
    50                  55                  60
Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Asn Gly Asn
65                  70                  75                  80
Ala Lys Thr Gly Ser Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Thr Val Ser
                85                  90                  95
Gly His Pro Ser Glu Leu Ala Thr Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ala Ile
            100                 105                 110
Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Asn Val Pro Phe Asp Gly Thr Glu Gly
        115                 120                 125
Asp Pro Asn Leu Leu Lys Asp Gly Asp Asn Val Leu His Tyr Thr Thr
    130                 135                 140
Val Gly Lys Lys Ser Ser Asp Gly Asn Ala Gln Ile Thr Glu Gly Ala
145                 150                 155                 160
Phe Ser Gly Val Ala Thr Phe Asn Leu Ser Tyr Gln
                165                 170
<210>2
<211>182
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Ser Ser Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr
            20                  25                  30
Val His Phe Lys Gly Glu Val Val Asn Ala Ala Cys Ala Val Asp Ala
        35                  40                  45
Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Gln Leu Gly Gln Val Arg Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Leu Ala Gln Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Gln
65                  70                  75                  80
Leu Asn Asp Cys Asp Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Ala Val Ala Phe
                85                  90                  95
Leu Gly Thr Ala Ile Asp Ala Gly His Thr Asn Val Leu Ala Leu Gln
            100                 105                 110
Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ala Thr Asn Val Gly Val Gln Ile Leu Asp
        115                 120                 125
Arg Thr Gly Ala Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Ser Ser Glu
    130                 135                 140
Thr Thr Leu Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Pro Phe Gln Ala Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Ala Thr Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ala Ala Asn Ala Asp Ala Thr
                165                 170                 175
Phe Lys Val Gln Tyr Gln
            180
<210>3
<211>853
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>3
acgtttctgt ggctcgacgc atcttcctca ttcttctctc caaaaaccac ctcatgcaat     60
ataaacatct ataaataaag ataacaaata gaatattaag ccaacaaata aactgaaaaa    120
gtttgtccgc gatgctttac ctctatgagt caaaatggcc ccaatgtttc atcttttggg    180
ggaaactgtg cagtgttggc agtcaaactc gttgacaaac aaagtgtaca gaacgactgc    240
ccatgtcgat ttagaaatag ttttttgaaa ggaaagcagc atgaaaatta aaactctggc    300
aatcgttgtt ctgtcggctc tgtccctcag ttctacgacg gctctggccg ctgccacgac    360
ggttaatggt gggaccgttc actttaaagg ggaagttgtt aacgccgctt gcgcagttga    420
tgcaggctct gttgatcaaa ccgttcagtt aggacaggtt cgtaccgcat cgctggcaca    480
ggaaggagca accagttctg ctgtcggttt taacattcag ctgaatgatt gcgataccaa    540
tgttgcatct aaagccgctg ttgccttttt aggtacggcg attgatgcgg gtcataccaa    600
cgttctggct ctgcagagtt cagctgcggg tagcgcaaca aacgttggtg tgcagatcct    660
ggacagaacg ggtgctgcgc tgacgctgga tggtgcgaca tttagttcag aaacaaccct    720
gaataacgga accaatacca ttccgttcca ggcgcgttat tttgcaaccg gggccgcaac    780
cccgggtgct gctaatgcgg atgcgacctt caaggttcag tatcaataac ctacctaggt    840
tcagggacgt tca                                                       853
<210>4
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qβ
<400>4
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>5
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体Qβ
<400>5
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala lle Trp Ser Leu Glu Glu
                165                 170                 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
            180                 185                 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
    210                 215                 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
                245                 250                 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
            260                 265                 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
        275                 280                 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
    290                 295                 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305                 310                 315                 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
                325
<210>6
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体R17
<400>6
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>7
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体fr
<400>7
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp IIe Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>8
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体GA
<400>8
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
        35                  40                  45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65                  70                  75                  80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lle Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
            100                 105                 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
        115                 120                 125
Tyr Ala
    130
<210>9
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>9
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>10
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>10
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
    50                  55                  60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp lle Tyr Glu Arg
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
                325
<210>11
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体MS2
<400>11
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>12
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体Ml1
<400>12
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>13
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体MX1
<400>13
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu lle Asp Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>14
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌体NL95
<400>14
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1               5                   10                 15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
            180                 185                 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
                245                 250                 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
            260                 265                 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
                325                 330
<210>15
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体f2
<400>15
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>16
<211>128
<212>PRT
<213>噬菌体PP7
<400>16
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
        35                  40                  45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
    50                  55                  60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
            100                 105                 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
        115                 120                 125
<210>17
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ240突变体
<400>17
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>18
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ243突变体
<400>18
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Ash Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>19
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ250突变体
<400>19
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>20
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ251突变体
<400>20
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>21
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ259突变体
<400>21
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>22
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>22
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>23
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>23
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5               10                      15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>24
<211>188
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>24
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln
65                  70                  75                  80
Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
            100                 105                 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys
            180                 185
<210>25
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>25
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105             110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>26
<211>152
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>26
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
 1              5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val
                85                  90                  95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
        115                 120                 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
145                 150
<210>27
<211>3635
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pAP283-58
<400>27
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga     60
gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga    120
ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt    180
gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt    240
taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg    300
tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca    360
atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg    420
ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt    480
ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata    540
gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc    600
taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc    660
atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg    720
taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc    780
agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgcacacagt gcggttgctg    840
gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga    900
gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca    960
tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgcttca acggcctcaa cctactactg   1020
ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gatatggtgc actctcagta   1080
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta tcgctacgtg actgggtcat   1140
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc   1200
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc a gaggttttc  1260
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta   1320
tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg   1380
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg   1440
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt   1500
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt   1560
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg   1620
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa   1680
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt   1740
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag   1800
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt   1860
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga   1920
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt   1980
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta   2040
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg   2100
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc   2160
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt   2220
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg   2280
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg   2340
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa   2400
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa   2460
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga   2520
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg   2580
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact   2640
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac   2700
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg   2760
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg   2820
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga   2880
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgcgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc   2940
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg   3000
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc   3060
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc   3120
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt   3180
cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc   3240
gctcgccgca gccgaacgac gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc   3300
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca   3360
tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct   3420
ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa   3480
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac   3540
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag   3600
tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt                              3635
<210>28
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>28
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu AlaThr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                 95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>29
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>AP205外壳蛋白
<400>29
Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>30
<211>3607
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pAP281-32
<400>30
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga     60
gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag    120
acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta    180
tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg    240
aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc    300
agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc    360
agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac    420
actcttcgcg agcggcaacg ccggtttggg tttccttgac cctactgcgg ctatcgtatc    480
gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat    540
acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg    600
tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt    660
cggttgggtt ggacagacct ctgagtttct ggtaacgccg ttccgcaccc cggaaatggt    720
caccgaacca ttcagcaggg tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc    780
ccgcatcacc ggcgccacag gtgcggtgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg    840
gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg atcgctggtt tccgcctggg tatggtggca    900
ggccccgtgg cccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc    960
ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa   1020
gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc   1080
caactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg   1140
ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgcttc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg   1200
tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc   1260
ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat   1320
ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggacccc ctattggttt   1380
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct   1440
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc   1500
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa   1560
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg   1620
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgtttttca atgatgagca cttttaaagt   1680
tctgctatgt gtcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg   1740
catacactat tctcagaatg acttggtggt acctaccagt cacagaaaag catcttacgg   1800
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg   1860
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca   1920
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa   1980
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtac gaacggcaac aacgttgcgc aaactattaa   2040
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata   2100
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat   2160
ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc   2220
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata   2280
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt   2340
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga   2400
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag   2460
cggtcagacc ccgtagaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa   2520
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag   2580
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg   2640
tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat   2700
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta   2760
ccgggttgga ctcaagacga taggtaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg   2820
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc   2880
gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa   2940
gcggcagggt cggaacaaga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc   3000
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt   3060
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct   3120
ttggctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc   3180
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gacggcgcag   3240
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg   3300
ttggccgatt cattaatgca gctgtggtgt catggtcggt gatcgccagg gtgccgacgc   3360
gcatctcgac tgcatggtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg   3420
tatggccgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt   3480
ctggataatg ttttttgcgg cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct   3540
ggtgacaatt aatcatcgaa ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa aagggtatcg   3600
cggaatt                                                             3607
<210>31
<211>28
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>32
<211>28
<212>PRT
<213>小鼠
<400>32
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>33
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>33
Gly Gly Lys Gly Gly
1               5
<210>34
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端甘氨酸接头
<220>
<221>重复
<222>(1)..(1)
<223>甘氨酸可以被重复0到5次
<220>
<221>重复
<222>(3)..(3)
<223>甘氨酸可以被重复0到12次
<400>34
Gly Cys Gly
1
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端甘氨酸丝氨酸接头
<220>
<221>重复
<222>(1)..(1)
<223>甘氨酸可以被重复0到5次
<220>
<221>重复
<222>(3)..(3)
<223>甘氨酸可以被重复0到10次
<220>
<221>重复
<222>(4)..(4)
<223>丝氨酸可以被重复0到2次
<220>
<221>重复
<222>(5)..(9)
<223>这些残基作为一组可以被重复0到3次
<400>35
Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>36
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C端甘氨酸接头
<220>
<221>重复
<222>(1)..(1)
<223>甘氨酸可以被重复0到12次
<220>
<221>重复
<222>(3)..(3)
<223>甘氨酸可以被重复0到5次
<400>36
Gly Cys Gly
1
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C端甘氨酸丝氨酸接头
<220>
<221>重复
<222>(1)..(1)
<223>甘氨酸可以被重复0到10次
<220>
<221>重复
<222>(2)..(2)
<223>丝氨酸可以被重复0到2次
<220>
<221>重复
<222>(3)..(7)
<223>这些残基作为一组可以被重复0到3次
<220>
<221>重复
<222>(8)..(8)
<223>甘氨酸可以被重复0到8次
<220>
<221>重复
<222>(10)..(10)
<223>甘氨酸可以被重复0到5次
<400>37
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly
1               5                    10
<210>38
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甘氨酸丝氨酸接头
<220>
<221>重复
<222>(1)..(5)
<223>这些残基作为一组可以被重复任意次
<400>38
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端γ1
<400>39
Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro
1               5                   10
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C端γ1
<400>40
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly
1               5                   10
<210>41
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端γ3
<400>41
Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala
1               5                   10                  15
Pro
<210>42
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C端γ3
<400>42
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Cys Gly
<210>43
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端甘氨酸接头
<400>43
Gly Cys Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>44
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C端甘氨酸接头
<400>44
Gly Gly Gly Gly Cys Gly
1               5
<210>45
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C端甘氨酸赖氨酸接头
<400>45
Gly Gly Lys Lys Gly Cys
1               5
<210>46
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端甘氨酸赖氨酸接头
<400>46
 Cys Gly Lys Lys Gly Gly
 1               5
<210>47
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C端接头
<400>47
Gly Gly Cys Gly
 1
<210>48
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Grehlin前体突变体
<400>48
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>49
<211>28
<212>PRT
<213>狗
<400>49
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>50
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>狗ghrelin突变体
<400>50
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>51
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠ghrelin突变体
<400>51
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
        20               25
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5                   10
<210>53
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5
<210>54
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>54
Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5
<210>55
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>55
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln
1               5                   10
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>56
Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu
1               5                   10
<210>57
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AP205核糖体结合位点
<400>57
tctagaattt tctgcgcacc catcccgggt ggcgcccaaa gtgaggaaaa tcacatg        57
<210>58
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体pQβ185的SD序列
<400>58
tctagattaa cccaacgcgt aggagtcagg ccatg                                35
<210>59
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>59
Lys Leu Gln Pro Arg
1               5
<210>60
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>60
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln
1               5                   10
<210>61
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>61
Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5                   10                  15
<210>62
<211>13
<212>PRT
<213>狗
<400>62
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln
1               5                   10
<210>63
<211>15
<212>PRT
<213>狗
<400>63
Gln Arg Lys Glu Ser Lvs Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5                   10                  15
<210>64
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽突变体
<400>64
Cys Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>65
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽24-51突变体
<400>65
Cys Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg
1               5                   10                  15
Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>66
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽突变体
<400>66
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Cys
            20                  25
<210>67
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽24-51突变体
<400>67
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Cys
            20                  25
<210>68
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽24-36突变体
<400>68
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Cys
1               5                   10
<210>69
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽37-51突变体
<400>69
Cys Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5                   10                  15
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽44-51突变体
<400>70
Cys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5
<210>71
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>狗ghrelin肽24-51突变体
<400>71
Cys Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg
1               5                   10                  15
Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>72
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>狗ghrelin肽突变体
<400>72
Cys Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>73
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>狗ghrelin肽24-51突变体
<400>73
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Cys
            20                  25
<210>74
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>狗ghrelin突变体
<400>74
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Cys
            20                  25
<210>75
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>狗ghrelin肽24-36突变体
<400>75
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Cys
1               5                   10
<210>76
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽31-40突变体
<400>76
Cys Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu
1               5                   10
<210>77
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠ghrelin肽24-51突变体
<400>77
Cys Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg
1               5                   10                  15
Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>78
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>78
ggtaacatcg gtcgagatgg aaaacaaact ctggtcc                              37
<210>79
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>79
ggaccagagt ttgttttcca tctcgaccga tgttacc                              37
<210>80
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>80
agctcgcccg gggatcctct ag                                              22
<210>81
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>81
cgatgcattt catccttagt tatcaatacg ctgggttcag                           40
<210>82
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>82
ggcaaaatta gagactgtta ctttaggtaa gatcgg                               36
<210>83
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>83
ccgatcttac ctaaagtaac agtctctaat tttgcc                               36
<210>84
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>84
ggccatggca cgactcgaga ctgttacttt agg                                  33
<210>85
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>85
gatttaggtg acactatag                                                  19
<210>86
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>86
gatggacgtc aaactctggt cctcaatccg cgtgggg                              37
<210>87
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>87
ccccacgcgg attgaggacc agagtttgac gtccatc                              37
<210>88
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EcoRIHBcAg(s)引物
<400>88
ccggaattca tggacattga cccttataaa g                                    31
<210>89
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Lys-HBcAg(as)引物
<400>89
cctagagcca cctttgccac catcttctaa attagtaccc acccaggtag c              51
<210>90
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Lys-HBcAg(s)引物
<400>90
gaagatggtg gcaaaggtgg ctctagggac ctagtagtca gttatgtc                  48
<210>91
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg(1-149)Hind(as)引物
<400>91
cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaag                             38
<210>92
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>48as引物
<400>92
gtgcagtatg gtgaggtgag gaatgctcag gagactc                              37
<210>93
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>48s引物
<400>93
gagtctcctg agcattcctc acctcaccat actgcac                              37
<210>94
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>107as引物
<400>94
cttccaaaag tgagggaaga aatgtgaaac cac                                  33
<210>95
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg149hind-as
<400>95
cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaagcg ttgatag                   47
<210>96
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>107s引物
<400>96
gtggtttcac atttcttccc tcacttttgg aag                                  33
<210>97
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAgwtHindlIII引物
<400>97
cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg                             38
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>表位CeH3
<400>98
Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly
1               5                   10
<210>99
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CeH3fwd引物
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
<400>99
gtt aac ttg acc tgg tct cgt gct tct ggt gca tcc agg gat cta gta       48
Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val
1               5                   10                  15
gtc                                                                   51
Val
<210>100
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CeH3fwd引物
<400>100
Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val
1               5                   10                  15
Val
<210>101
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CeH3rev引物
<400>101
accagaagca cgagaccagg tcaagttaac atcttccaaa ttattaccca c              51
<210>102
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CeH3rev引物肽
<400>102
Asp Glu Leu Asn Asn Gly Val
1               5
<210>103
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg-wt EcoRI fwd引物
<400>103
ccggaattca tggacattga cccttataaa g                                    31
<210>104
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg-wt Hind III rev引物
<400>104
cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg                             38
<210>105
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GhrelC突变体
<400>105
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Gly Cys
            20                  25                  30
<210>106
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>cGhrQ14突变体
<400>106
Cys Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>107
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GhrQ14C突变体
<400>107
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Gly Cys
            20                  25
<210>108
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ghrelin肽突变体
<400>108
Cys Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5                   10
<210>109
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ghrelin肽突变体
<400>109
Cys Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5
<210>110
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ghrelin肽突变体
<400>110
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Cys
1               5                   10
<210>111
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>111
Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser
1               5                   10
<210>112
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>112
Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu
1               5                   10
<210>113
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>113
Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser
1               5                   10
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>狗
<400>114
Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys Glu
1               5                   10
<210>115
<211>11
<212>PRT
<213>狗
<400>115
Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys Glu Ser
1               5                   10
<210>116
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>116
Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln
1               5                   10
<210>117
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>117
Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln
1            5               10
<210>118
<211>10
<212>PRT
<213>狗
<400>118
Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln
1               5                   10
<210>119
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>119
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro
1               5
<210>120
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ghrelin肽突变体
<400>120
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Gly Cys
            20                  25
<210>121
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ghrelin肽突变体
<400>121
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Gly Cys
            20                  25                  30
<210>122
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ghrelin肽突变体
<400>122
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
<210>123
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ghrelin肽突变体
<400>123
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Gly Cys
            20                  25                  30
<210>124
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ghrelin肽突变体
<400>124
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Gly Cys
            20                  25
<210>125
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ghrelin肽突变体
<400>125
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
<210>126
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠ghrelin肽突变体
<400>126
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lvs Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Cys
            20                  25
<210>127
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠ghrelin肽突变体
<400>127
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Gly Cys
            20                  25
<210>128
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠ghrelin肽突变体
<400>128
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Cys
            20                  25
<210>129
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠ghrelin肽突变体
<400>129
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Gly Cys
            20                  25                  30
<210>130
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠ghrelin肽突变体
<400>130
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Cys
1               5                   10
<210>131
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠ghrelin肽突变体
<400>131
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
<210>132
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ghre124-33C
<400>132
Gly Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Gly Cys
1               5                   10
<210>133
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>cGhre142-51
<400>133
Cys Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
1               5                   10
<210>134
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>cGhrel31-40
<400>134
Cys Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu
1               5                   10
<210>135
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>cGhrel31-41
<400>135
Cys Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser
1               5                   10
<210>136
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>cGhrel28-37
<400>136
Cys Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln
1               5                   10
<210>137
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽突变体
<400>137
Cys Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser
1               5                   10
<210>138
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人ghrelin肽突变体
<400>138
Cys Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln
1               5                   10
<210>139
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.44
<400>139
aaccatggca aataagccaa tgcaa                                           25
<210>140
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.45
<400>140
aatctagaat tttctgcgca cccatcccgg                                      30
<210>141
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.46
<400>141
aaaagcttaa gcagtagtat cagacgatac g                                    31
<210>142
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.47
<400>142
gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg                       43
<210>143
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.48
<400>143
cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc                       43
<210>144
<211>117
<212>PRT
<213>智人
<400>144
Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu
1               5                   10                  15
Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His
            20                  25                  30
Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu
        35                  40                  45
Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe
65                  70                  75                  80
Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln
                85                  90                  95
Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu
            100                 105                 110
Ala Pro Ala Asp Lys
        115
<210>145
<211>117
<212>PRT
<213>狗
<400>145
Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu
1               5                   10                  15
Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His
            20                  25                  30
Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu
        35                  40                  45
Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe
65                  70                  75                  80
Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln
                85                  90                  95
Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu
            100                 105                 110
Ala Pro Ala Asp Lys
    115
<210>146
<211>117
<212>PRT
<213>小鼠
<400>146
Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu
1               5                   10                  15
Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His
            20                  25                  30
Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu
        35                  40                  45
Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe
65                  70                  75                  80
Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln
                85                  90                  95
Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu
            100                 105                 110
Ala Pro Ala Asp Lys
        115

Claims (50)

1.一种组成物，其包含：
(a)核心颗粒，其含有至少一个第一附着位点；和
(b)至少一个抗原或抗原决定簇，其含有至少一个第二附着位点，
其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin肽，所述第二附着位点选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，
其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；所述ghrelin或ghrelin肽与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
2.权利要求1的组成物，其中所述核心颗粒选自：
i)病毒；
ii)病毒样颗粒；
iii)噬菌体；
iv)RNA噬菌体的病毒样颗粒；
v)细菌菌毛；
vi)病毒衣壳颗粒；和
vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的重组形式。
3.权利要求1的组成物，其中所述核心颗粒包含，优选地是病毒样颗粒，其中优选所述病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。
4.权利要求2或3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含选自下列的重组蛋白或其片段：
(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；
(b)重组麻疹病毒蛋白；
(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；
(d)重组轮状病毒蛋白；
(e)重组口蹄疫病毒蛋白；
(f)重组逆转录病毒蛋白；
(g)重组诺瓦克病毒蛋白；
(h)重组甲病毒蛋白；
(i)重组人乳头瘤病毒蛋白；
(j)重组多瘤病毒蛋白；
(k)重组噬菌体蛋白；
(l)重组RNA噬菌体蛋白；
(m)重组Ty蛋白；
(n)重组Qβ-噬菌体蛋白；
(o)重组GA-噬菌体蛋白；
(p)重组fr-噬菌体蛋白；
(q)重组AP205噬菌体蛋白；和
(q)(a)-(q)中任意重组蛋白的片段。
5.权利要求2或3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心抗原。
6.权利要求2或3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成。
7.权利要求6的组成物，其中所述RNA噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；
(l)噬菌体PP7；和
(m)噬菌体AP205。
8.权利要求2-3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成。
9.权利要求2-3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体fr的重组蛋白或其片段组成。
10.权利要求2-3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
11.权利要求3-10任一项的组成物，其中所述重组蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。
12.权利要求11的组成物，其中所述RNA噬菌体外壳蛋白具有选自如下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：4；
(b)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的混合物；
(c)SEQ ID NO：6；
(d)SEQ ID NO：7；
(e)SEQ ID NO：8；
(f)SEQ ID NO：9；
(g)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的混合物；
(h)SEQ ID NO：11；
(i)SEQ ID NO：12；
(k)SEQ ID NO：13；
(l)SEQ ID NO：14；
(m)SEQ ID NO：15；
(n)SEQ ID NO：16；和
(o)SEQ ID NO：28。
13.权利要求3-10任一项的组成物，其中所述重组蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。
14.权利要求13的组成物，其中所述RNA噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；
(l)噬菌体PP7；和
(m)噬菌体AP205。
15.权利要求13-14任一项的组成物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过置换去除至少一个赖氨酸残基进行了修饰。
16.权利要求13-14任一项的组成物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过置换添加至少一个赖氨酸残基进行了修饰。
17.权利要求13-14任一项的组成物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过缺失至少一个赖氨酸残基进行了修饰。
18.权利要求13-14任一项的组成物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过插入添加至少一个赖氨酸残基进行了修饰。
19.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点通过至少一个共价键连接。
20.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点通过至少一个非肽键连接。
21.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述ghrelin或ghrelin肽与所述核心颗粒融合。
22.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin，其选自：
(a)人ghrelin；
(b)牛ghrelin；
(c)绵羊ghrelin；
(d)狗ghrelin；
(e)猫ghrelin；
(f)小鼠ghrelin；
(g)猪ghrelin；
(h)马ghrelin；和
(k)(a)-(h)中任一种ghrelin的肽或其片段。
23.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin肽，其选自：
(a)人ghrelin肽；
(b)牛ghrelin肽；
(c)绵羊ghrelin肽；
(d)狗ghrelin肽；
(e)猫ghrelin肽；
(f)小鼠ghrelin肽；
(g)猪ghrelin肽；
(h)马ghrelin肽；和
(k)(a)-(h)中任一种ghrelin的肽或其片段。
24.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin肽，优选人ghrelin肽或狗ghrelin肽。
25.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述ghrelin或ghrelin肽包含或者优选地具有选自下列的氨基酸序列：
(a)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：48)
(b)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：31)
(c)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：49)
(d)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：50)
(e)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：32)
(f)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：51)
(g)KKPPAKLQPR(SEQ ID NO：52)
(h)PPAKLQPR(SEQ ID NO：53)
(i)AKLQPR(SEQ ID NO：54)
(j)GSSFLSPEHQ(SEQ ID NO：55)
(k)EHQRVQQRKE(SEQ ID NO：56)
(l)KLQPR(SEQ ID NO：59)
(m)GSSFLSPEHQRVQ(SEQ ID NO：60)
(n)QRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：61)
(o)GSSFLSPEHQKLQ(SEQ ID NO：62)
(p)QRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：63)
(q)EHQRVQQRKES(SEQ ID NO：111)
(r)EHQKAQQRKE(SEQ ID NO：112)
(s)EHQKAQQRKES(SEQ ID NO：113)
(t)EHQKLQQRKE(SEQ ID NO：114)
(u)EHQKLQQRKES(SEQ ID NO：115)
(v)LSPEHQRVQQ(SEQ ID NO：116)
(w)LSPEHQKAQQ(SEQ ID NO：117)
(x)LSPEHQKLQQ(SEQ ID NO：118)，和
(y)GSSFLSP(SEQ ID NO：119).
26.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定族是具有至少一个ghrelin抗原性位点的ghrelin肽。
27.前述权利要求中任一项的组成物，进一步含有氨基酸接头，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第二附着位点组成。
28.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述第二附着位点或含有所述第二附着位点的氨基酸接头在C端或N端与所述ghrelin或ghrelin肽结合。
29.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述第二附着位点或含有所述第二附着位点的氨基酸接头选自：
(a)GGC；
(b)GGC-CONH2；
(c)GC；
(d)GC-CONH2；
(e)C；和
(f)C-CONH2。
30.前述权利要求中任一项的组成物，其中至少含有所述第二附着位点的所述ghrelin或ghrelin肽包含、优选地由选自下列的氨基酸序列组成：
(a)CGSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：64)
(b)CGSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：65)
(c)CGSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：71)
(d)CGSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：72)
(e)CGSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：77)
(f)CGSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：106)
(g)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：66)
(h)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：120)
(i)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：67)
(j)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：121)
(k)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：73)
(l)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：123)
(m)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：74)
(n)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：124)
(o)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：105)
(p)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：107)
(q)CKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：108)
(r)CPPAKLQPR(SEQ ID NO：70)
(s)CAKLQPR(SEQ ID NO：109)
(t)GSSFLSPEHQC(SEQ ID NO：110)
(u)CEHQRVQQRKE(SEQ ID NO：76)
(v)GSSFLSPEHQRVQC(SEQ ID NO：68)
(w)GSSFLSPEHQRVQGC(SEQ ID NO：122)
(x)CQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：69)
(y)GSSFLSPEHQKLQC(SEQ ID NO：75)
(z)GSSFLSPEHQKLQGC(SEQ ID NO：125)
(aa)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：126)
(bb)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：127)
(cc)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：128)
(dd)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：129)
(ee)GSSFLSPEHQKAQC(SEQ ID NO：130)
(ff)GSSFLSPEHQKAQGC(SEQ ID NO：131)
(gg)GGSSFLSPEHQGC(SEQ ID NO：132)
(hh)CKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：133)
(ii)CEHQKAQQRKE(SEQ ID NO：134)
(jj)CEHQKAQQRKES(SEQ ID NO：135)
(kk)CLSPEHQKAQQ(SEQ ID NO：136)
(ll)CEHQRVQQRKES(SEQ ID NO：137)和
(mm)CLSPEHQRVQQ(SEQ ID NO：138).
31.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定族是ghrelin或者优选ghrelin肽的无生物活性形式，不含n-辛酰基修饰。
32.一种药物组合物，其含有：
(a)权利要求1的组成物；和
(b)药物可接受的载体。
33.权利要求32的药物组合物，进一步含有佐剂。
34.权利要求32或33任一项的药物组合物，其中所述疫苗组合物不含佐剂。
35.一种疫苗组合物，其含有前述权利要求中任一项的组成物。
36.权利要求35的疫苗组合物，进一步含有佐剂。
37.权利要求35或36任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物不含佐剂。
38.权利要求35-37中任一项的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段。
39.权利要求35-38中任一项的疫苗组合物，其中所述ghrelin或ghrelin肽选自：
(a)人ghrelin；
(b)牛ghrelin；
(c)绵羊ghrelin；
(d)狗ghrelin；
(e)猫ghrelin；
(f)小鼠ghrelin；
(g)猪ghrelin；
(h)马ghrelin；和
(k)(a)-(h)中任一种ghrelin的肽或其片段。
40.权利要求35-39中任一项的疫苗组合物，其中所述ghrelin或ghrelin肽包含、优选地具有选自下列的氨基酸序列：
(a)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：48)
(b)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：31)
(c)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：49)
(d)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：50)
(e)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：32)
(f)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：51)
(g)KKPPAKLQPR(SEQ ID NO：52)
(h)PPAKLQPR(SEQ ID NO：53)
(i)AKLQPR(SEQ ID NO：54)
(j)GSSFLSPEHQ(SEQ ID NO：55)
(k)EHQRVQQRKE(SEQ ID NO：56)
(l)KLQPR(SEQ ID NO：59)
(m)GSSFLSPEHQRVQ(SEQ ID NO：60)
(n)QRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：61)
(o)GSSFLSPEHQKLQ(SEQ ID NO：62)
(p)QRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：63)
(q)EHQRVQQRKES(SEQ ID NO：111)
(r)EHQKAQQRKE(SEQ ID NO：112)
(s)EHQKAQQRKES(SEQ ID NO：113)
(t)EHQKLQQRKE(SEQ ID NO：114)
(u)EHQKLQQRKES(SEQ ID NO：115)
(v)LSPEHQRVQQ(SEQ ID NO：116)
(w)LSPEHQKAQQ(SEQ ID NO：117)
(x)LSPEHQKLQQ(SEQ ID NO：118)，和
(y)GSSFLSP(SEQ ID NO：119).
41.权利要求35-39中任一项的疫苗组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是包含、优选地由选自下列的氨基酸序列组成的ghrelin肽：
(a)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：48)
(b)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：31)
(c)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：49)
(d)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：50)
(e)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：32)
(f)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：51)
(g)KKPPAKLQPR(SEQ ID NO：52)
(h)PPAKLQPR(SEQ ID NO：53)
(i)AKLQPR(SEQ ID NO：54)
(j)GSSFLSPEHQ(SEQ ID NO：55)
(k)EHQRVQQRKE(SEQ ID NO：56)
(l)KLQPR(SEQ ID NO：59)
(m)GSSFLSPEHQRVQ(SEQ ID NO：60)
(n)QRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：61)
(o)GSSFLSPEHQKLQ(SEQ ID NO：62)
(p)QRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：63)
(q)EHQRVQQRKES(SEQ ID NO：111)
(r)EHQKAQQRKE(SEQ ID NO：112)
(s)EHQKAQQRKES(SEQ ID NO：113)
(t)EHQKLQQRKE(SEQ ID NO：114)
(u)EHQKLQQRKES(SEQ ID NO：115)
(v)LSPEHQRVQQ(SEQ ID NO：116)
(w)LSPEHQKAQQ(SEQ ID NO：117)
(x)LSPEHQKLQQ(SEQ ID NO：118)，和
(y)GSSFLSP(SEQ ID NO：119).
42.权利要求35-41中任一项的疫苗组合物，其中至少含有所述第二附着位点的所述抗原或抗原决定簇包含选自下列的氨基酸序列：
(a)CGSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：64)
(b)CGSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：65)
(c)CGSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：71)
(d)CGSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：72)
(e)CGSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：77)
(f)CGSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：106)
(g)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：66)
(h)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：120)
(i)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：67)
(j)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：121)
(k)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：73)
(l)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：123)
(m)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：74)
(n)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：124)
(o)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：105)
(p)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：107)
(q)CKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：108)
(r)CPPAKLQPR(SEQ ID NO：70)
(s)CAKLQPR(SEQ ID NO：109)
(t)GSSFLSPEHQC(SEQ ID NO：11O)
(u)CEHQRVQQRKE(SEQ ID NO：76)
(v)GSSFLSPEHQRVQC(SEQ ID NO：68)
(w)GSSFLSPEHQRVQGC(SEQ ID NO：122)
(x)CQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：69)
(y)GSSFLSPEHQKLQC(SEQ ID NO：75)
(z)GSSFLSPEHQKLQGC(SEQ ID NO：125)
(aa)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：126)
(bb)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：127)
(cc)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO：128)
(dd)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO：129)
(ee)GSSFLSPEHQKAQC(SEQ ID NO：130)
(ff)GSSFLSPEHQKAQGC(SEQ ID NO：131)
(gg)GGSSFLSPEHQGC(SEQ ID NO：132)
(hh)CKKPPAKLQPR(SEQ ID NO：133)
(ii)CEHQKAQQRKE(SEQ ID NO：134)
(jj)CEHQKAQQRKES(SEQ ID NO：135)
(kk)CLSPEHQKAQQ(SEQ ID NO：136)
(ll)CEHQRVQQRKES(SEQ ID NO：137)和
(mm)CLSPEHQRVQQ(SEQ ID NO：138).
43.一种生产前述权利要求中任一项的组成物的方法，其包括：
(a)提供含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；
(b)提供含有至少一个第二附着位点的至少一个抗原或抗原决定簇，
其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin肽，其中所述第二附着位点选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点；和
其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；和
(c)混合所述心颗粒与所述至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
44.一种免疫方法，包括对动物或人施用前述权利要求中任一项的组成物或组合物。
45.权利要求44的免疫方法，其中所述抗原或抗原决定簇是自身抗原。
46.权利要求44-45中任一项的免疫方法，其中所述动物是人，其中所述抗原或抗原决定簇是人ghrelin或人ghrelin肽。
47.权利要求44-46中任一项的免疫方法，其中所述动物来源于猫科，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin肽。
48.权利要求44-47中任一项的免疫方法，其中所述动物来源于犬科，其中所述抗原或抗原决定簇是猫科ghrelin或ghrelin肽。
49.用作药物的权利要求1-42中任一项的组成物或组合物。
50.权利要求1-42中任一项的组成物或组合物在生产治疗肥胖症的药物中的应用。
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