CN1599623A - 免疫刺激物向病毒样颗粒内的包装:制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是基于病毒样颗粒(VLP)能够装载免疫刺激物，特别是含非甲基化C和G(CpG)的DNA寡核苷酸这一发现。这些CpG－VLP比不含CpG的对应物免疫原性大大增强，并且可诱发增强的B和T细胞应答。针对与VLP任选地偶联、融合或以其他方式附着之抗原的免疫应答，与针对VLP本身的免疫应答相似地增强。另外，针对VLP和抗原两者的T细胞应答尤其集中在Th1型。因此，附着于含CpG之VLP的抗原可以是理想的疫苗，用于对变态反应、肿瘤和其它自身分子以及慢性病毒病进行预防或治疗接种。

Description

免疫刺激物向病毒样颗粒内的包装：制备方法与用途
发明背景
发明领域
本发明涉及疫苗学、免疫学和医学领域。通过将免疫刺激物，特别是免疫刺激性核酸，更具体而言是含有至少一种非甲基化CpG序列的寡核苷酸，包装到病毒样颗粒(VLP)内，本发明提供用于增强免疫应答的组合物和方法，该应答针对VLP或者针对与VLP偶联、融合或以其他方式附着的抗原。本发明能用来诱发强烈、持续的T细胞应答，尤其可用于肿瘤和慢性病毒病以及变态反应和其它慢性病的治疗。
相关技术
免疫系统的本质建立在两个不同的基础支柱上：一个是特异性或获得性免疫，其特征在于相对较慢的应答动力学和记忆能力；另一个是非特异性或先天免疫，其显示快速的应答动力学，但缺乏记忆。淋巴细胞是获得性免疫系统的关键角色。每种淋巴细胞都表达具有独特特异性的抗原受体。在通过该受体识别抗原后，淋巴细胞增殖并产生效应功能。只有很少的淋巴细胞显示对一种给定抗原或病原体的特异性，通常需要大量增殖才能检测到效应应答—因此，获得性免疫系统具有较慢的动力学。由于相当一部分扩增淋巴细胞存活，并且在抗原消失后仍可保留一定的效应功能，当第二次遇到该抗原时，获得性免疫系统反应较快。这就是记忆能力的基础。
淋巴细胞对一种病原体的特异性仅局限于少数细胞，必须增殖才能获得功能，与之相反，先天免疫系统的细胞和分子通常大量存在，而且识别与病原体有关的数量有限的固定特征(Medzhitov，R.和Janeway，C.A.，Jr.，Cell 91：295-298(1997))。这类模式的例子包括脂多糖(LPS)、富含非甲基化CG的DNA(CpG)或双链RNA，它们分别是细菌和病毒感染特异的。
大多数免疫学研究都集中于获得性免疫系统，只是最近先天免疫系统才受到关注。在历史上，获得性和先天性免疫系统是作为两个不同的体系来处理和分析的，它们很少有共性。由于这种差异，很少有研究人员想知道为什么当使用刺激先天免疫的佐剂时抗原对特异性免疫系统的免疫原性大大增强(Sotomayor，E.M.等人，Nat.Med.5：780(1999)；Diehl，L.等人，Nat.Med.5：774(1999)；Weigle，W.O.，Adv.Immunol.30：159(1980))。然而，这一问题的答案对于了解免疫系统以及理解保护性免疫与自身免疫之间的平衡十分关键。
对先天免疫系统的理性操作，特别是激活参与T细胞引发(priming)的APC以有意诱发自身特异性T细胞应答，提供了一种以T细胞为基础的肿瘤治疗方法。因此，当前大多数治疗都集中在使用激活的树状细胞(DC)作为抗原载体，以诱发持续的T细胞应答(Nestle等人，Nat.Med.4：328(1998))。同样，为了提高肿瘤细胞的免疫原性，与肿瘤细胞一起使用先天免疫系统的体内激活剂，如CpG或抗-CD40抗体(Sotomayor，E.M.等人，Nat.Med.5：780(1999)；Diehl，L.等人，Nat.Med.5：774(1999))。
刺激先天免疫的因子对APC的普遍激活通常可能是引发自身特异性淋巴细胞和自身免疫的原因。这种激活可提高共同刺激分子或细胞因子(如IL-12或IFNα)的表达。这一观点与以下发现一致：与甲状腺提取物一起施以LPS能够克服耐受并引发自身免疫甲状腺炎(Weigle，W.O.，Adv.Immunol.30：159(1980))。而且，在转基因小鼠模型上，最近发现单独施以自身肽没能引起自身免疫，除非APC被另一种途径激活(Garza，K.M.等人，J.Exp.Med.191：2021(2000))。以下发现进一步强调了先天免疫与自身免疫病之间的联系：LPS、病毒感染或APC的普遍激活可延迟或防止外周耐受的形成(Vella，A.T.等人，Immunity 2：261(1995)；Ehl，S.等人，J.Exp.Med.187：763(1998)；Maxwell，J.R.等人，J.Immunol.162：2024(1999))。这样，先天免疫不仅可增强自身特异性淋巴细胞的激活，而且可抑制其随后消失。这些发现可以扩展到肿瘤生物学和慢性病毒病的控制。
用次要组织相容性抗原(如HY抗原)免疫后细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的诱发需要T辅助细胞(Th细胞)存在(Husmann，L.A.和M.J.Bevan，Ann.NY.Acad.Sci.532：158(1988)；Guerder，S.和P.Matzinger，J.Exp.Med.176：553(1992))。通过交叉引发，即用可到达I类途径的外源抗原引发而诱导的CTL应答，也需要Th细胞存在(Bennett，S.R.M.等人，J.Exp.Med.186：65(1997))。这些发现对于肿瘤治疗具有重要意义，T辅助细胞对于肿瘤细胞诱发保护性CTL应答可能非常重要(Ossendorp，F.等人，J.Exp.Med.187：693(1998))。
活化的Th细胞上的一种重要效应分子是CD40-配体(CD40L)，它可与B细胞、巨噬细胞和树状细胞(DC)上的CD40相互作用(Foy，T.M.等人，Annu.Rev.Immunol.14：591(1996))。B细胞上CD40的触发对于同型转换和产生B细胞记忆是不可缺少的(Foy，T.M.等人，Ann.Rev.Immunol.14：591(1996))。最近表明，巨噬细胞和DC上CD40的刺激导致它们的激活和成熟(Cella，M.等人，Curr.Opin.Immunol.9：10(1997)；Banchereau，J.和R.M.Steinman，Nature 392：245(1998))。具体而言，DC在激活后上调共同刺激分子并产生细胞因子，如IL-12。有意思的是，这种CD40L介导的DC成熟似乎导致对CTL应答的辅助作用。实际上，最近表明，Th细胞引起的CD40触发使DC能够启动CTL应答(Ridge，J.P.等人，Nature 393：474(1998)；Bennett，S.R.M.等人，Nature 393：478(1998)；Schoenenberger，S.P.等人，Nature 393：480(1998))。这与较早前的发现相一致：Th细胞识别与CTL相同的APC上的配体，表明它们需要相同的相互作用(Bennett，S.R.M.等人，J.Exp.Med.186：65(1997))。因此CD40L介导的Th细胞刺激导致DC的激活，后者随后能够引发CTL应答。对于人类，I型干扰素，特别是干扰素α和β，可能与IL-12一样重要。
与这些依赖Th的CTL应答不同，病毒通常能够在没有T辅助细胞的情况下诱发保护性CTL应答(综述见Bachmann，M.F.等人，J.Immunol.161：5791(1998))。具体而言，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)(Leist，T.P.等人，J.Immunol.138：2278(1987)；Ahmed，R.等人，J.Virol.62：2102(1988)；Battegay，M.等人，Cell Immunol.167：115(1996)；Borrow，P.等人，J.Exp.Med.183：2129(1996)；Whitmire，J.K.等人，J.Virol.70：8375(1996))、水泡性口炎病毒(VSV)(Kündig，T.M.等人，Immunity 5：41(1996))、流感病毒(Tripp，R.A.等人，J.Immunol.155：2955(1995))、痘苗病毒(Leist，T.P.等人，Scand.J.Immunol.30：679(1989))和小鼠脱脚病病毒(Buller，R.等人，Nature328：77(1987))在CD4+T细胞耗尽或II类或CD40表达缺陷的小鼠中能够引发CTL应答。病毒的这种不依赖Th细胞的CTL引发机制现在还不清楚。而且，大多数病毒不能完全刺激不依赖Th细胞的CTL应答，但是在Th细胞缺陷小鼠中病毒特异的CTL活性降低。因此，Th细胞可增强抗病毒CTL应答，但是这种辅助机制尚未完全清楚。最近表明，DC通过交叉引发呈递流感来源的抗原(Albert，M.L.等人，J.Exp.Med.188：1359(1998)；Albert，M.L.等人，Nature 392：86(1998))。因此，与次要组织相容性抗原和肿瘤抗原相似(Ridge，J.P.等人，Nature 393：474(1998)；Bennett，S.R.M.等人，Nature 393：478(1998)；Schoenenberger，S.P.等人，Nature 393：480(1998))，Th细胞可能通过DC上的CD40触发辅助CTL的诱导。因此，利用CD40L或抗-CD40抗体刺激CD40可增强病毒或肿瘤细胞刺激后的CTL诱导。
然而，尽管CD40L是一种重要的DC激活剂，但是在免疫应答过程中似乎还有其它分子能够刺激DC的成熟和激活。实际上，CD40与LCMV或VSV特异性CTL的诱导没有明显相关性(Ruedl，C.等人，J.Exp.Med.189：1875(1999))。因此，尽管VSV特异的CTL应答部分依赖于CD4+T细胞的存在(Kündig，T.M.等人，Immunity 5：41(1996))，但是这种辅助作用不是由CD40L介导的。在免疫应答过程中触发DC成熟的效应分子的候选者包括Trance和TNFα(Bachmann，M.F.等人，J.Exp.Med.189：1025(1999)；Sallusto，F.和A.Lanzavecchia，J.Exp.Med.179：1109(1994))。
已经明确，单独施用纯化蛋白质通常不足以引起强烈的免疫应答；分离的抗原通常必须与被称为佐剂的辅助物质一起施用。施用的抗原在这些佐剂内受到保护，不会被快速降解，佐剂导致长时间释放低水平抗原。
与分离的蛋白质不同，在不用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下，病毒诱导快速、有效的免疫应答(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。尽管病毒通常几乎不含蛋白质，但它们比其分离的成分能引发更强的免疫应答。对于B细胞应答，众所周知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和秩序。许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示规则的表位阵列，可有效地将表位特异性免疫球蛋白交联在B细胞上(Bachmann &Zinkernagel，Immunol.Today 17：553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是一种强激活信号，可直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生。进而，这些触发的B细胞能够激活T辅助细胞，进而诱导B细胞中由产生IgM抗体向产生IgG抗体的转换，以及长期B细胞记忆的产生—这是所有接种的目标(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。病毒结构甚至与自身免疫病中抗抗体的产生有关，是对病原体的自然应答的一部分(参见Fehr，T.等人，J.Exp.Med.185：1785-1792(1997))。因此，以规则、重复阵列组织起来的病毒颗粒上的抗原具有高度的免疫原性，因为它们能够直接激活B细胞。
除了强B细胞应答外，病毒颗粒也能诱导细胞毒性T细胞应答的产生，这是免疫系统的另一个重要目标。对于非细胞病变病毒(如HIV或乙型肝炎病毒)的消除和肿瘤的根除而言，这些细胞毒性T细胞特别重要。细胞毒性T细胞不识别天然抗原，而是识别与MHC I类分子结合的降解产物(Townsend & Bodmer，Ann.Rev.Immunol.7：601-624(1989))。巨噬细胞和树状细胞能够摄取并加工外源病毒颗粒(而不是其可溶性分离成分)，并且将产生的降解产物呈递给细胞毒性T细胞，使其激活并增殖(Kovacsovics-Bankowski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：4942-4946(1993)；Bachmann等人，Eur.J.Immunol.26：2595-2600(1996))。
作为抗原的病毒颗粒与其分离的成分相比表现出两个优点：(1)由于具有高度重复的表面结构，它们能够直接激活B细胞，产生高抗体滴度和长期的B细胞记忆；(2)病毒颗粒，而不是可溶性蛋白质，具有诱发细胞毒性T细胞应答的能力，即使这些病毒是非感染性的且不使用佐剂。
几种新的疫苗策略是利用病毒所固有的免疫原性。这些方法中一些集中在病毒颗粒的颗粒性质上；例如，参见Harding，C.V.和Song，R.(J.Immunology 153：4925(1994))，它公开了一种由乳胶珠和抗原组成的疫苗；Kovacsovics-Bankowski，M.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：4942-4946(1993))，它公开了一种由氧化铁珠和抗原组成的疫苗；授予Kossovsky，N.等人的美国专利号5,334,394，它公开了抗原包被的核心颗粒；美国专利号5,871,747，它公开了在表面上含有与之共价键合的一种或多种蛋白质的合成聚合物颗粒；和一种含有非共价结合的包被的核心颗粒，这种包被至少部分覆盖该核心颗粒的表面，以及与该包被核心颗粒接触的至少一种生物活性剂(参见，如WO94/15585)。
在进一步的发展中，由于病毒样颗粒(VLP)的结构特征及其非感染性，它们在疫苗生产领域得到应用。VLP是由一种或多种类型的许多蛋白质分子以对称形式构成的超分子结构。它们缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。VLP通常能通过异源表达大量生产，并且易于纯化。
另外，例如在细菌和大多数非脊椎动物中存在的富含非甲基化CG基序(CpG)的DNA，在体外及体内对B细胞、树状细胞和其它APC都显示强刺激活性。尽管细菌DNA在许多脊椎动物种之间是免疫刺激性的，但是具体CpG基序可能不同。实际上，刺激小鼠免疫细胞的CpG基序可能不一定刺激人免疫细胞，反之亦然。
尽管富含CpG基序的DNA寡聚体显示免疫刺激能力，但其有效性通常有限，因为它们在体外及体内均不稳定。因此，它们显示不好的药代动力学。于是，为了使CpG-寡核苷酸更加有效，通过向磷酸骨架引入硫代磷酸修饰来稳定它们通常是必要的。
使用CpG-寡核苷酸刺激免疫应答的第二个局限性是它们缺乏特异性，因为与CpG-寡核苷酸接触的所有APC和B细胞都受到刺激。因此，稳定或包装它们，将其细胞激活作用局限于同样呈递相关抗原的细胞，可提高CpG-寡核苷酸的有效性和特异性。
另外，免疫刺激性CpG-寡脱氧核苷酸也诱发严重的副作用，在小鼠中引起髓外血细胞形成伴脾大和淋巴结病(Sparwasser等人，J.Immunol.(1999)，162：2368-74和实施例18)。
VLP已经证明可在MHC I类分子上有效呈递，它们可能在通过微胞饮作用摄取后被有效加工并在MHC I类上交叉引发。交叉引发机制迄今为止尚不清楚，但是已经提出了依赖TAP和不依赖TAP的途径。
最近疫苗接种策略已经取得显著进展，但是现有策略仍然需要改进。特别是，本领域仍然需要研制新的改进的疫苗，与天然病原体一样有效地引起强CTL免疫应答和抗病原体保护，而APC和其它细胞未被普遍激活。
发明概述
本发明基于以下的意外发现：免疫刺激物如DNA寡核苷酸能够包装到VLP内，使其免疫原性增强。出乎意料的是，VLP内的核酸和寡核苷酸分别能够用免疫刺激物和含有CpG基序的DNA-寡核苷酸特异替换。令人吃惊的是，这些包装的免疫刺激物，特别是免疫刺激性核酸，如含非甲基化CpG的寡核苷酸，保留了其免疫刺激能力，但是不会广泛激活先天免疫系统。根据本发明的含有VLP和免疫刺激物的组合物，特别是CpG-VLP，免疫原性显著强于不含CpG的对应物，并且诱发更强的B和T细胞应答。针对与VLP任选地偶联、融合或以其他方式附着的抗原的免疫应答与针对VLP本身的免疫应答相似地增强。另外，针对VLP和抗原的T细胞应答尤其集中于Th1型。因此，附着于含CpG的VLP的抗原可能是用于变态反应、肿瘤和其它自身分子和慢性病毒病的预防或治疗接种的理想疫苗。
在第一个实施方案中，本发明提供一种用于增强动物免疫应答的组合物，其包含病毒样颗粒和免疫刺激物，优选地免疫刺激性核酸，更优选地含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述免疫刺激物、核酸或寡核苷酸与病毒颗粒偶联、融合或以其他方式附着，或被后者包封，即结合。在另一个实施方案中，该组合物还包含与病毒样颗粒结合的抗原。
在本发明的一个优选实施方案中，免疫刺性激核酸，特别是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通过磷酸骨架的硫代磷酸修饰而稳定化。在另一个优选实施方案中，免疫刺激性核酸，特别是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通过消化VLP内的RNA同时添加含有所选CpG的DNA寡核苷酸，而被包装到VLP内。在一个同样优选的实施方案中，可将VLP解装配，之后在CpG存在下重装配。
在一个更优选的实施方案中，免疫刺激性核酸不含CpG基序，但是显示免疫刺激活性。这些核酸在WO 01/22972中有描述。该文献中所述的所有序列在此引用作为参考。
在一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒是一种重组病毒样颗粒。同样优选地，病毒样颗粒不含脂蛋白包膜。优选地，重组病毒样颗粒包含或者由下列成分组成：乙型肝炎病毒、BK病毒或其它人多瘤病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒或人乳头瘤病毒、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体、GA-噬菌体、fr-噬菌体和Ty的重组蛋白。在一个具体实施方案中，病毒样颗粒包含或者由一种或多种不同乙型肝炎病毒核心(衣壳)蛋白(HBcAg)组成。
在一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段。优选的RNA-噬菌体是Qβ-噬菌体、AP 205-噬菌体、GA-噬菌体、fr-噬菌体。
在另一个实施方案中，抗原是一种重组抗原。在另一个实施方案中，抗原可选自：(1)适于诱发对癌细胞的免疫应答的多肽；(2)适于诱发对传染病的免疫应答的多肽；(3)适于诱发对变应原的免疫应答的多肽；(4)适于诱发对自身抗原的增强应答的多肽；(5)适于在家畜或宠物中诱发免疫应答的多肽。
在另一个实施方案中，抗原可选自：(1)适于诱发对癌细胞的免疫应答的有机分子；(2)适于诱发对传染病的免疫应答的有机分子；(3)适于诱发对变应原的免疫应答的有机分子；(4)适于诱发对自身抗原的增强应答的有机分子；(5)适于在家畜或宠物中诱发免疫应答的有机分子；(6)适于诱发对药物、激素或毒性化合物的应答的有机分子。
在一个具体实施方案中，抗原包含或由毒性T细胞表位组成。在一个相关实施方案中，病毒样颗粒包含乙型肝炎病毒核心蛋白，细胞毒性T细胞表位与该乙型肝炎核心蛋白的C端融合。在一个实施方案中，它们通过亮氨酸连接序列融合。
本发明的另一方面，提供了一种增强人或其它动物的免疫应答的方法，包括向该动物体内导入一种组合物，该组合物包含病毒样颗粒和免疫刺激物，优选地免疫刺激性核酸，更优选地含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中该刺激物，优选地核酸，更优选地寡核苷酸，与该病毒样颗粒结合(即偶联、附着或包封)。在另一个实施方案中，该组合物还包含与病毒样颗粒结合的抗原。
在本发明的另一个实施方案中，组合物通过皮下、肌肉内、鼻内、皮内、静脉内或直接导入淋巴结内来导入动物体内。在一个同样优选的实施方案中，局部施用这种免疫增强组合物，在希望接种的肿瘤或局部病毒灶附近施用。
在本发明的一个优选方面，免疫应答是T细胞应答，针对抗原的T细胞应答增强。在一个具体实施方案中，T细胞应答是细胞毒性T细胞应答，针对抗原的细胞毒性T细胞应答增强。
本发明也涉及一种疫苗，其包含免疫有效量的本发明的免疫增强组合物，以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一个优选实施方案中，该疫苗还包含至少一种佐剂，如弗氏不完全佐剂。本发明也提供一种免疫和/或治疗动物的方法，包括对动物施以免疫有效量的本发明公开的疫苗。
在本发明的一个优选实施方案中，含有免疫刺激物的VLP，优选地含有免疫刺激性核酸的VLP，更优选地含有非甲基化CpG的寡核苷酸VLP，用于接种动物或人，以对抗VLP本身或与VLP偶联、融合或附着的抗原。这种经修饰的VLP可以用来例如分别针对肿瘤、病毒病、自身分子和自身抗原或非肽小分子接种。这种接种可以是用于预防或治疗目的，或者同时用于这两种目的。该修饰的VLP也能用来对变态反应接种，以诱导免疫偏离。
在大多数情况下，希望的免疫应答是针对与含免疫刺激物的VLP、优选地含免疫刺激性核酸的VLP、更优选地含非甲基化CpG的寡核苷酸VLP偶联、融合或以其他方式附着的抗原。抗原可以是肽、蛋白质、结构域、碳水化合物或小分子，如类固醇激素或药物，如烟碱。在某些条件下，希望的免疫应答可以是针对VLP本身。后一种用途将用于VLP来源于希望接种对抗的病毒的情况。
注射途径优选的是皮下或肌肉内，但是也可以通过真皮内、鼻内、静脉内或直接导入淋巴结内来给予含CpG的VLP。在一个同样优选的实施方案中，局部施用含CpG的抗原偶联的或游离的VLP，在希望接种的肿瘤或局部病毒灶附近施用。
应当理解，以上的概述和下面的详述只是代表性和说明性的，旨在进一步说明申请保护的本发明。
附图简述
图1显示CpG-寡核苷酸的DNA序列(A)和来源于乙型肝炎病毒核心的含p33肽的VLP的DNA序列(B)。九聚体p33表位与乙型肝炎核心蛋白的C端在位点185处通过一个三亮氨酸连接序列以基因工程方法融合。
图2显示通过电子显微镜检查(A)和SDS-PAGE(B)分析的p33-VLP的结构。重组生产的野生型VLP(由HBcAg[aa 1-185]单体组成)和p33-VLP上样到Sephacryl S-400凝胶过滤柱(AmershamPharmacia Biotechnology AG)上进行纯化。合并的级分上样到羟基磷灰石柱上。收集流出液(含有纯化的HBc衣壳)，加样到还原性SDS-PAGE凝胶上进行单体分子量分析(B)。
图3显示在对照孵育后或RNase A消化后，非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的p33-VLP，用溴化乙锭(A)或考马斯蓝(B)染色，以分析RNA或蛋白质的存在。重组生产的p33-VLP用PBS缓冲液稀释到终浓度0.5μg/μl蛋白质，在不含(1道)或含有(2道)RNase A(100μg/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。随后向样品中补充6倍浓DNA加样缓冲液(MBSFermentas GmbH，Heidelberg，德国)，在1％非变性琼脂糖凝胶中以100伏特电压电泳30分钟。用Gene Ruler标准(MBS Fermentas GmbH，Heidelberg，德国)作为p33-VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明存在包装于p33-VLP中的RNA(A)或p33-VLP衣壳本身(B)。在3个独立实验中获得了相同的结果。
图4显示在只有缓冲液或有含CpG的DNA-寡聚体的存在下，在对照孵育后或RNase A消化后，非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的p33-VLP，用溴化乙锭(A)或考马斯蓝(B)染色，以分析RNA/DNA或蛋白质的存在。重组p33-VLP用PBS缓冲液稀释到终浓度0.5μg/μl蛋白质，并在不含(1道)或含有(2道)RNase A(100μg/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。在RNase A消化之前向样品3中添加5nmol CpG-寡核苷酸(骨架含有硫代磷酸修饰)。用Gene Ruler标准(MBS Fermentas GmbH，Heidelberg，德国)作为p33-VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明存在包装于p33-VLP中的RNA或CpG-寡核苷酸(A)或存在p33-VLP衣壳本身(B)。当VLP与RNase A共孵育中使用含磷酸二酯键的CpG-寡核苷酸时，获得相同的结果。
图5显示在存在含CpG的DNA-寡聚体及随后透析(为了除去未与VLP结合的CpG DNA)的条件下，在RNase A消化之前及之后，非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的p33-VLP，用溴化乙锭(A)或考马斯蓝(B)染色，以分析DNA或蛋白质的存在。重组p33-VLP用PBS缓冲液稀释到终浓度0.5μg/μl蛋白质，在不含(1道)或含有(2-5道)RNase A(100μg/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。在RNase A消化之前向VLP中添加50nmolCpG-寡核苷酸(磷酸骨架含有硫代磷酸修饰：2道和3道，含有磷酸二酯键：4道和5道)。应用300kDa MWCO透析膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，USA)，处理的样品对PBS(4500倍稀释)充分透析24小时，以除去过量的DNA(3道和5道)。用Gene Ruler标准(MBS Fermentas GmbH，Heidelberg，德国)作为p33-VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明存在包于p33-VLP中的RNA或CpG-寡核苷酸(A)或存在p33-VLP衣壳本身(B)。
图6显示在对照孵育后或RNase A消化后，非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的p33-VLP，其中只在完成RNA消化后添加含CpG的寡核苷酸，用溴化乙锭(A)或考马斯蓝(B)染色，以分析RNA/DNA或蛋白质的存在。重组p33-VLP用PBS缓冲液稀释为终浓度0.5μg/μl蛋白质，在不含(1道)或含有(2道和3道)RNase A(100μg/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。只在RNase A消化后向样品3中添加5nmol CpG-寡核苷酸(磷酸骨架含有硫代磷酸修饰)。用Gene Ruler标准(MBS Fermentas GmbH，Heidelberg，德国)作为p33-VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明p33-VLP中存在RNA或CpG-寡核苷酸(A)或存在p33-VLP衣壳本身(B)。当VLP的重装配使用含磷酸二酯键的CpG-寡核苷酸时，获得相同的结果。
图7显示包装有CpG-寡核苷酸(磷酸骨架含有硫代磷酸修饰)的p33-VLP在诱导病毒保护方面有效。用100μg单独的p33-VLP、与20nmol CpG-寡核苷酸混合的p33-VLP(p33-VLP+CpG)或透析游离CpG-寡核苷酸后包装有CpG-寡核苷酸的p33-VLP(p33-VLP/CpG)皮下初次免疫小鼠。未处理的小鼠作为阴性对照。21天后，用LCMV(200pfu，静脉内)攻击小鼠，5天后测定脾脏中的病毒滴度，方法如以下文献所述：Bachmann，M.F.，“淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒特异的细胞毒性T细胞应答的评价”，《免疫学方法手册》(Immunologymethods Mannual)，Lefkowitz，I.编著，Academic Press Ltd.，New York，NY(1997)p.1921。
图8显示包装有CpG-寡核苷酸(含有磷酸二酯键)的p33-VLP在诱导病毒保护方面有效。用100μg单独的p33-VLP、与20nmolCpG-寡核苷酸混合的p33-VLP(p33-VLP+CpG)或透析游离CpG-寡核苷酸后包装有CpG-寡核苷酸的p33-VLP(p33-VLP/CpG)皮下初次免疫小鼠。未处理的小鼠作为阴性对照。21天后，用LCMV(200pfu，静脉内)攻击小鼠，5天后测定脾脏中的病毒滴度，方法如以下文献所述：Bachmann，M.F.，“淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒特异的细胞毒性T细胞应答的评价”，《免疫学方法手册》，Lefkowitz，I.编著，Academic Press Ltd.，New York，NY(1997)p.1921。
图9显示单独用CpG-寡核苷酸处理的小鼠没有受到免于病毒感染的保护。小鼠用20nmol CpG-寡核苷酸(p33-VLP)皮下初次免疫(CpG)，或者不加处理作为阴性对照(未处理)。21天后，用LCMV(200pfu，静脉内)攻击小鼠，5天后测定脾脏中的病毒滴度，方法如以下文献所述：Bachmann，M.F.，“淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒特异的细胞毒性T细胞应答的评价”，《免疫学方法手册》，Lefkowitz，I.编著，Academic Press Ltd.，New York，NY(1997)p.1921。
图10显示BKV(AS)VP1蛋白的氨基酸序列(GI：332779)。该序列在酵母中表达，产生BKV衣壳(Sasnauskas K.等人，J.Biol.Chem.380(3)：381(1999)；K.等人，“不同多瘤病毒的重组病毒样颗粒在酵母中的生产”，第3届国际“作为疫苗的病毒样颗粒”会议，柏林(2001))。
图11显示用于包装和稳定BKV VLP的246bp双链DNA片段的DNA序列。
图12显示在对照孵育或RNase A消化，以及随后与荧光硫代磷酸(pt)CpG-寡核苷酸一起孵育后，在非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳中的BKV VLP(15μg)。紫外线激发能够在溴化乙锭染色的凝胶中检测DNA(A)，以及在不使用溴化乙锭的情况下检测CpG-FAM寡聚物的荧光(B)。1道：未处理的BKV VLP；2道：RNase A处理的BKV VLP；3道：RNase A处理的BKV VLP，加CpG(pt)-FAM孵育；4道：RNase A处理的BKV VLP，加CpG(pt)-FAM孵育，加DNaseI处理；M道：Gene Ruler 1kb分子量标准(MBI Fermentas GmbH，Heidelberg，德国)。箭头表明在BKV VLP中存在RNA或CpG-FAM寡聚物。
图13显示在对照孵育或RNase A消化，以及随后与双链(ds)DNA(246bp)一起孵育后，在非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳中的BKVVLP(15μg)，用溴化乙锭(A)或考马斯蓝(B)染色。1道：未处理的BKV VLP；2道：RNase A处理的BKV VLP；3道：RNase A处理并与ds DNA一起孵育的BKV VLP；M道：Gene Ruler 1kb分子量标准(MBI Fermentas GmbH，Heidelberg，德国)。箭头表明在BKV VLP中存在RNA或ds DNA。
图14显示在对照孵育或RNase A消化，以及随后与CpG-寡核苷酸(含磷酸或硫代磷酸(pt)骨架)一起孵育后，在非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳中的BKV VLP(15μg)，用溴化乙锭(A)或考马斯蓝(B)染色。1道：BKV VLP贮存液(PBS/50％甘油)；2道：未处理(PBS缓冲液)的BKV VLP；3道：RNase A处理的BKV VLP；4道：RNase A处理的BKV VLP，透析后；5道：RNase A处理的BKVVLP，与CpG-寡核苷酸孵育；6道：RNase A处理的BKV VLP，与CpG(pt)-寡聚物孵育；7道：RNase A处理的BKV VLP，与CpG(pt)-寡聚物孵育，透析后；M道：Gene Ruler 1kb分子量标准(MBIFermentas GmbH，Heidelberg，德国)。箭头表明在BKV VLP中存在RNA或CpG-寡核苷酸。
图15显示用BKV VLP和硫代磷酸(pt)CpG-寡核苷酸免疫后第14天，小鼠抗BKV VLP IgG1和IgG2a OD50％抗体滴度。1道：RNase处理的BKV VLP；2道：RNase处理的BKV VLP以及0.3nmolCpG(pt)-寡聚物；3道：RNase处理的BKV VLP以及20nmol CpG(pt)-寡聚物；4道：含有0.3nmol CpG(pt)-寡聚物的RNase处理的BKVVLP。
图16显示在对照孵育后或RNase A消化后，在非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的p33-VLP，其中只在完成RNA消化后添加线性双链DNA(长350个碱基对)，用溴化乙锭(A)或考马斯蓝(B)染色，以分析RNA/DNA或蛋白质的存在。重组p33-VLP用PBS缓冲液稀释为终浓度0.5μg/μl蛋白质，在不含(1道)或含有(2、3、4道)RNase A(100μg/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。只在RNase A消化后向样品3和4中添加长度为350bp的线性双链DNA，至终浓度为100ng/ml，并在37℃下孵育3小时。样品4进一步在37℃下用DNase I(50IU/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)再消化3小时。Gene Ruler标准(MBSFermentas GmbH，Heidelberg，德国)作为p33-VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明存在游离的或包封于p33-VLP中的RNA/dsDNA(A)和p33-VLP(B)。
图17显示B-CpG包装于HBc33 VLP内。
图18显示NKCpG包装于HBc33 VLP内。
图19显示g10gacga-PO包装于HBc33 VLP内。
图20显示CyCpG-150包装于HBc33 VLP内。
图21显示NKCpGpt包装于HBcP1A VLP内。
图22显示p33与HBcAg VLP的偶联。
图23显示B-CpGpt包装于HBx33 VLP内。
图24显示p33与QβVLP的偶联。
图25显示允许在QβVLP中用RNase A水解RNA的离子强度和低蛋白质浓度。
图26显示离子强度提高免疫刺激性核酸向QβVLP内的包装。
图27显示B-CpGpt、g10gacga-PO和dsCyCpG包装于Qbx33 VLP内。
图28显示在免疫刺激性核酸存在下，QβVLP解装配并重装配后，蔗糖梯度离心产生的级分的SDS-PAGE分析。
图29显示在寡核苷酸(CpG)20OpA存在下，解装配并重装配后，QβVLP的电子显微照片。
图30显示解装配并重装配的QβVLP的ouchterlony分析(免疫扩散)。
图31显示解装配并重装配的QβVLP的凝胶电泳分析。
图32显示解装配并与寡核苷酸CyOpA重装配的QβVLP的电子显微照片。
图33显示纯化的解装配并与不同免疫刺激性核酸重装配的QβVLP的电子显微照片。
图34显示与寡脱氧核苷酸CyOpA重装配的QβVLP与p33GGC肽偶联的SDS-PAGE分析。
图35显示在QβVLP解装配并重装配，随后与p33 GGC肽偶联后，包装的寡脱氧核苷酸。
图36显示通过大小排阻层析纯化解装配的Qβ外壳蛋白。
图37显示通过大小排阻层析纯化重装配的QβVLP。
图38显示在不同寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的电子显微照片。
图39显示重装配并纯化的Qβ衣壳中二硫键模式的分析。
图40显示通过核酸酶处理和琼脂糖凝胶电泳分析重装配QβVLP的核酸内容物。
图41显示通过蛋白酶K处理和聚丙烯酰胺TBE/尿素凝胶电泳分析重装配QβVLP的核酸内容物。
图42显示解装配、随后在CyCpG存在下重装配的AP205 VLP的电子显微照片。
图43显示解装配并在CyCpG存在下重装配的AP205 VLP的琼脂糖凝胶电泳分析。
图44显示解装配并重装配的AP205的电子显微照片。
图45显示解装配并在CyCpG存在下重装配的AP205 VLP的琼脂糖凝胶电泳分析。
图46显示解装配并重装配的AP205 VLP的SDS-PAGE分析。
图47显示与解装配并重装配的AP205 VLP偶联的肽的SDS-PAGE分析。
图48显示是游离免疫刺激性核酸而不是包装于VLP内的免疫刺激性核酸诱发脾大。
图49显示包装于与抗原融合的VLP中的不同免疫刺激性核酸导致强抗原特异性CTL应答和抗病毒保护。
图50显示包装于与抗原融合的VLP内的免疫刺激性核酸g10gacga-PS导致强抗原特异性CTL应答和抗病毒保护。
图51显示包装于HBcAg和QβVLP内的免疫刺激性核酸导致强抗原特异性CTL应答和抗病毒保护。
图52显示包装于VLP内的免疫刺激性核酸在诱导CTL应答方面比与免疫刺激性核酸混合的VLP更有效。
图53显示QβVLP内RNA的非酶促RNA水解的分析。
图54显示非酶促RNA水解后寡脱氧核苷酸向QβVL内的包装。
图55显示非酶促RNA水解后寡脱氧核苷酸向QβVLP内包装的分析。
发明详述
除非另外定义，此处使用的所有科技术语与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实施与试验中可以使用与此处所述相似或相当的任何材料与方法，但是下文描述了优选的材料与方法。
1.定义
氨基酸接头：本说明书中的“氨基酸接头”，也被称为“接头”，用来连接抗原或抗原决定簇和第二附着位点，或者更优选地，该接头已经包含或含有第二附着位点，该附着位点一般(但不是一定)是一个氨基酸残基，优选地是半胱氨酸残基。然而，术语“氨基酸接头”在此使用时并非意味着这种氨基酸接头只由氨基酸残基组成，尽管由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的一个优选实施方案。氨基酸接头的氨基酸残基优选地由本领域公知的天然氨基酸或非天然氨基酸、所有L-或所有D-氨基酸或其混合物组成。然而，本发明也包括一种氨基酸接头，其含有一种带巯基或半胱氨酸残基的分子。该分子优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。然而，除了氨基酸接头外，本发明范围内也包括优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分且不含任何氨基酸的接头。抗原或抗原决定簇或(任选地)第二附着位点与氨基酸接头的结合优选地是通过至少一个共价键，更优选地是通过至少一个肽键。
动物：在此使用的术语“动物”包括例如：人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠、小鼠、哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类动物。
抗体：在此使用的术语“抗体”是指能够结合一种表位或抗原决定簇的分子。该术语包括完整的抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。最优选地，这些抗体是人抗原结合性抗体片段，包括但不限于：Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段。抗体可以是任何动物来源的，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。在此使用的术语“人” 抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白文库的抗体，或者来自表达一种或多种人免疫球蛋白且不表达内源免疫球蛋白的转基因动物，如授予Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598所述。
抗原：在此使用的术语“抗原”是指如果被MHC分子呈递，即能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的激活。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或连接于一种Th细胞表位，并且包含于佐剂中。一种抗原可能包含一种或多种表位(B和T表位)。上述特异性反应是指抗原优选地通常以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的大量其它抗体或TCR反应。
“微生物抗原”在此是指微生物的抗原，包括但不限于：传染性病毒、传染性细菌、寄生虫和传染性真菌。这些抗原包括完整的微生物以及天然的分离物及其片段或衍生物，以及与天然微生物抗原相同或相似、并能诱发该微生物特异的免疫应答的合成或重组化合物。如果一种化合物诱发针对一种天然微生物抗原的免疫应答(体液和/或细胞应答)，则该化合物与该天然微生物抗原相似。这些抗原在本领域中常用，本领域技术人员周知。
已经在人体中发现的传染性病毒的例子包括但不限于：逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒，如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III)；和其它分离株，如HIV-LP)；小RNA病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如导致胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；本扬病毒科(例如汉坦病毒、本扬病毒、静脉病毒和内罗病毒)；砂粒样病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳头多瘤空泡病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1、2，水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)；虹彩病毒(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原体，丁型肝炎的病原体(被认为是乙型肝炎病毒的一种缺陷型卫星病毒)，非甲非乙肝炎的病原体(1类＝体内传播的；2类＝肠胃外传播的(即丙型肝炎)；诺瓦克病毒及相关病毒，和星形病毒)。
在脊椎动物中，革兰氏阴性和革兰氏阳性菌都可作为抗原。这些革兰氏阳性菌包括但不限于：巴斯德氏菌属的种，葡萄球菌属的种和链球菌属的种。革兰氏阴性菌包括但不限于：大肠杆菌，假单胞菌属的种和沙门氏菌属的种。传染性细菌的具体例子包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)，布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)，分枝杆菌属的种(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)，链球菌(绿色组)，粪链球菌(Streptococcusfaecalis)，牛链球菌(Streptococcus bovis)，链球菌(厌氧种)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，致病性弯曲杆菌属的种，肠球菌属的种，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，炭疽芽孢杆菌(Bacillusantracis)，白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，棒杆菌属的种，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)，拟杆菌属(Bacteroides)的种，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)，苍白密螺旋体(Treponema pallidium)，极细密螺旋体(Treponema pertenue)，钩端螺旋体属(Leptospira)，立克次体属(Rickettsia)，衣氏放线菌(Actinomyces israelli)和衣原体(Chlamydia)。
传染性真菌的例子包括：新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和白色念珠菌(Candida albicans)。其它传染性微生物(如原生生物)包括：疟原虫，如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)和血吸虫属(Shistosoma)。
其它医学相关的微生物在文献中已有大量描述，例如，参见C.G.A.Thomas，《医学微生物学》，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，其完整内容在此引用作为参考。
本发明的组合物和方法也可用于是通过刺激针对癌抗原的抗原特异性免疫应答治疗癌症。“肿瘤抗原”在此是指一种与肿瘤或癌症相关并能够引发免疫应答的化合物，如肽。特别是，该化合物在MHC分子中呈递时能够引发免疫应答。肿瘤抗原能够由癌细胞制备，方法包括：制备癌细胞粗提物，如Cohen等人，Cancer Research，54：1055(1994)所述；部分纯化抗原；通过重组技术或从头合成已知抗原。肿瘤抗原包括作为整个肿瘤或癌症多肽或其抗原性部分的抗原。这些抗原能够分离或者通过重组或本领域公知的其它任何方法制备。癌症或肿瘤包括但不限于：胆管癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞癌)；黑素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；肾癌，以及其它癌和肉瘤。
抗原决定簇：在此使用的术语“抗原决定簇”是指可被B或T淋巴细胞特异识别的抗原部分。B淋巴细胞通过产生抗体对外源抗原决定簇起反应，而T淋巴细胞是细胞免疫的介质。因此，抗原决定簇或表位是可被抗体识别或者(对于MHC)可被T细胞受体识别的抗原部分。
抗原呈递细胞：在此使用的术语“抗原呈递细胞”是指具有免疫刺激能力的一群不均一的白细胞或骨髓衍生细胞。例如，这些细胞能够产生与MHC分子结合的肽，后者能够被T细胞识别。该术语与术语“佐细胞”同义，包括如朗罕氏细胞、交错突细胞、B细胞、巨噬细胞和树状细胞。在某些条件下，上皮细胞、内皮细胞和其它非骨髓来源的细胞也可以作为抗原呈递细胞。
连接(association)：术语“连接”在用于第一和第二附着位点时，是指第一和第二附着位点优选地通过至少一个非肽键结合。连接的性质可能是共价、离子、疏水、极性的或其任意组合，优选地，连接的性质是共价的。
第一附着位点：在此使用的短语“第一附着位点”是指非天然或天然来源的一种组件，位于抗原或抗原决定簇上的第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。第一附着位点通常且优选地位于病毒样颗粒表面。病毒样颗粒表面上存在多个第一附着位点，一般呈重复构型。
第二附着位点：在此使用的短语“第二附着位点”是指与抗原或抗原决定簇结合的一种组件，位于病毒样颗粒表面上的第一附着位点可与之连接。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。抗原或抗原决定簇上存在至少一个第二附着位点。因此，术语“包含至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇”是指至少含有抗原或抗原决定簇和该第二附着位点的抗原或抗原构建体。然而，特别是对于非天然来源(即抗原或抗原决定簇内不天然存在)的第二附着位点，这些抗原或抗原构建体含有“氨基酸接头”。
结合(bound)：在此使用的术语“结合”是指如下结合：可能是共价的，例如通过化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可能是，例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。该术语也包括物质的包封或部分包封。术语“结合”比术语“偶联”、“融合”、“包封”、“包装”和“附着”等更广义，并且包括后者。例如，免疫刺激物，如含非甲基化CpG的寡核苷酸，可以用VLP包封，而不存在实际上的结合，既不是共价的也不是非共价的。
外壳蛋白：在此使用的术语“外壳蛋白”是指噬菌体或RNA噬菌体的蛋白质，它能够参与噬菌体或RNA-噬菌体的衣壳装配。然而，当指RNA-噬菌体的外壳蛋白基因的特异基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA-噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的特异基因产物被称为“QβCP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包含“QβCP”以及A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要由QβCP组成，含有少量A1蛋白。同样，VLP Qβ外壳蛋白主要含有QβCP，以及少量A1蛋白。
偶联：在此使用的术语“偶联”是指通过共价键或通过强非共价相互作用而附着。本领域技术人员常用来偶联生物活性物的任何方法都可用于本发明。
融合：在此使用的术语“融合”是指不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合而组合于一条多肽链中。除了与末端之一融合外，术语“融合”还包括内部融合，即不同来源的序列插入多肽链内。
CpG：在此使用的术语“CpG”是指含有非甲基化胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸序列的寡核苷酸(例如“CpG DNA”或含有胞嘧啶及随后的鸟嘌呤、并通过一个磷酸酯键连接的DNA)，它能刺激/激活脊椎动物细胞，例如对该细胞具有促细胞分裂作用，或诱导或提高该细胞的细胞因子表达。例如，CpG可用于激活B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞，如单核细胞、树状细胞和巨噬细胞，以及T细胞。CpG也可包括核苷酸类似物，如含有磷酸硫酯键的类似物，可以是双链或单链的。双链分子通常在体内更稳定，而单链分子免疫活性更高。
表位：在此使用的术语“表位”是指在动物、优选哺乳动物、最优选在人中具有抗原性或免疫原活性的多肽部分。“免疫原性表位”在此定义为能在动物中引发抗体应答或诱发T细胞应答的多肽部分，这种应答可通过本领域公知的任何方法测定。(参见，例如：Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983))。术语“抗原性表位”在此定义为抗体能够在其上免疫特异性结合相应抗原的蛋白部分，这种结合可用本领域众所周知的任何方法测定。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位不需要必须是免疫原性的。抗原性表位也可以是T细胞表位，此时它们能被MHC分子内的T细胞受体免疫特异地结合。
一个表位可能包含3个氨基酸，具有该表位独特的空间构象。一个表位通常由至少约5个这样的氨基酸组成，更常见地由至少约8-10个这样的氨基酸组成。如果表位是一种有机分子，它可以象硝基苯基一样小。
免疫应答：在此使用时的术语“免疫应答”是指导致B和/或T淋巴细胞激活或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，在某些情况下，免疫应答可能是低强度的，只有在使用至少一种根据本发明的物质时才能检测到。“免疫原性”是指一种试剂能用来刺激活生物的免疫系统，使得免疫系统的一种或多种功能增强，并且针对该免疫原性剂。“免疫原性多肽”是引发细胞和/或体液免疫应答的多肽，无论它是单独的还是与载体相连接，使用或不使用佐剂。
免疫(immunization)：在此使用的术语“免疫”或相关术语是指产生针对靶抗原或表位的实质免疫应答(包括抗体或细胞免疫，如效应CTL)的能力。这些术语不要求产生完全免疫，而是产生实质性地高于基线的免疫应答。例如，如果在使用本发明的方法后哺乳动物产生对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，则可认为对针该靶抗原免疫了该哺乳动物。
免疫刺激性核酸：在此使用的术语“免疫刺激性核酸”是指能够诱发和/或增强免疫应答的核酸。免疫刺激性核酸在此包括核糖核酸，特别是脱氧核糖核酸。优选地，免疫刺激性核酸包含至少一种CpG基序，如CG二核苷酸，其中C是未甲基化的。CG二核苷酸可能是回文序列的一部分，或者可能包含于一种非回文序列内。如上所述的不含CpG基序的免疫刺激性核酸包括，例如，缺乏CpG二核苷酸的核酸，以及含有其中CG二核苷酸被甲基化的CG基序的核酸。在此使用的术语“免疫刺激性核酸”也指含有修饰碱基(如4-溴-胞嘧啶)的核酸。
免疫刺激物：在此使用的术语“免疫刺激物”是指能够诱发和/或增强免疫应答的物质。在此，免疫刺激物包括但不限于toll样受体激活物和诱导细胞因子分泌的物质。Toll样受体激活物包括但不限于：免疫刺激性核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑并喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白和免疫刺激性有机物，如紫杉醇。
天然来源：在此使用的术语“天然来源”是指其全部或部分不是合成的，而是自然存在或产生的。
非天然的：在此使用时的该术语通常是指并非来源于自然，更具体而言，该术语是指来自人工。
非天然来源：在此使用时的术语“非天然来源”通常是指合成的或并非来源于自然，更具体而言，该术语是指来自人工。
规则、重复的抗原或抗原决定簇阵列：在此使用的术语“规则、重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常是指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于分别相对于核心颗粒和病毒样颗粒，抗原或抗原决定簇一般且优选地均匀空间排列。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是一种几何模式。合适的规则、重复抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选实例具有严格重复的抗原或抗原决定簇类结晶排列，优选地间隔0.5-30纳米，更优选地5-15纳米。
寡核苷酸：在此使用的术语“寡核苷酸”或“寡聚体”是指包含2个或更多核苷酸的核酸序列，通常至少约6个核苷酸到约100,000个核苷酸，优选地约6个到约2000个核苷酸，更优选地约6个到约300个核苷酸，更优选地约20个到约300个核苷酸，进一步优选地约20个到约100个核苷酸。术语“寡核苷酸”或“寡聚体”也指包含超过100个到约2000个核苷酸、优选地超过100个到约1000个核苷酸、更优选地超过100个到约500个核苷酸的核酸序列。“寡核苷酸”通常也指任何一种聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“寡核苷酸”包括但不限于：单链和双链DNA，作为单链和双链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，作为单链和双链区的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子(它可能是单链的，或者更一般而言是双链的或是单链和双链区的混合物)。另外，“寡核苷酸”也指包含RNA或DNA或既含RNA又含DNA的三链区。此外，寡核苷酸也可能是合成的、基因组的或重组的，例如λ-DNA、粘粒DNA、人工细菌染色体、酵母人工染色体和丝状噬菌体，如M13。
术语“寡核苷酸”也包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，和为了稳定性或其它原因而含有修饰骨架的DNA或RNA。例如，合适的核苷酸修饰/类似物包括肽核酸、肌苷、三苯甲基碱基、硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、5-硝基吲哚脱氧呋喃核糖基、5-甲基脱氧胞嘧啶和5，6-二氢-5，6-二羟基脱氧胸苷。已经对DNA和RNA进行了多种修饰；因此，“寡核苷酸”包括在自然界中常见的多核苷酸的化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。本领域技术人员了解其它核苷酸类似物/修饰。
包装：术语“包装”在此是指免疫刺激物，特别是免疫刺激性核酸，与VLP有关的状态。在此，术语“包装”包括结合，这可能是共价的，例如化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可能是，例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。该术语也包括物质的包封或部分包封。术语“包装”包括如“偶联”、“包封”和“附着”等术语。例如，免疫刺激物如含非甲基化CpG的寡核苷酸可以用VLP包封，而不需存在实际上的结合，既不是共价的也不是非共价的。具体而言，在一个优选实施方案中，如果免疫刺激性核酸作为免疫刺激物，术语“包装”是指包装状态的核酸不能被DNase或RNase水解。在优选实施方案中，免疫刺激性核酸包装于VLP衣壳内，最优选地以非共价方式包装。
本发明的组合物可以任选地与一种药学可接受的载体组合。术语“药学可接受的载体”在此是指适于对人或其它动物施用的一种或多种相容的固体或液体材料、稀释剂或封装物。术语“载体”是指一种天然或合成的有机或无机成分，活性成分与之结合，从而利于活性成分的应用。
有机分子：在此使用的术语“有机分子”是指天然或合成来源的任何化学物质。具体而言，术语“有机分子”在此包括例如选自下列的任何一种分子：核苷酸、脂类、碳水化合物、多糖、脂多糖、类固醇、生物碱、萜和脂肪酸，它是天然或合成来源的。术语“有机分子”具体包括如烟碱、可卡因、海洛因等分子或滥用药品中所含的其它药理学活性分子。有机分子通常含有或经修饰后含有一种化学功能团，使它能够与根据本发明的病毒样颗粒偶联、结合或以其它方法附着。
多肽：在此使用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子，是指氨基酸分子链，而对产物的特定长度没有限制。因此，多肽的定义内包括肽、寡肽和蛋白质。该术语也指多肽的表达后修饰，例如：糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生的多肽不一定由指定的核酸序列翻译而来。也可以用任何方法生产，包括化学合成。
可“增强”免疫应答的物质是指这样一种物质，与未添加该物质时测得的相同免疫应答相比，添加该物质时观察到更高或增强或偏离的免疫应答。例如，可以在使用或不使用该物质的情况下，例如用51Cr释放试验，测定细胞毒性T细胞的裂解活性。与不加该物质时的CTL裂解活性相比，CTL裂解活性提高时的物质含量被认为是足以增强动物对该抗原的免疫应答的量。在一个优选实施方案中，免疫应答至少提高至原水平的约2倍，更优选地约3倍或更多。分泌的细胞因子的量也可以改变。
有效量：在此使用的术语“有效量”是指足以达到希望的生物效应的量或必需的量。组合物的有效量是能够获得所选结果的量，此含量可由本领域技术人员按常规方式确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量是引起免疫系统激活、在暴露于抗原后产生抗原特异性免疫应答所必需的量。该术语也与“足量”同义。
用于任一种具体用途的有效量根据如下因素而不同：如所治疗的疾病、具体施用的组合物、患者体重和/或疾病的严重程度。本领域技术人员能够根据经验确定本发明的特定组合物的有效量，而不需要过多的实验。
自身抗原：在此使用的术语“自身抗原”是指宿主DNA编码的蛋白质，宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自身的。另外，两种或几种自身分子组合产生的蛋白质、或代表自身分子一部分的蛋白质以及与上述两种自身分子具有高度同源性的蛋白质(＞95％，优选地＞97％，更优选地＞99％)也可以认为是自身的。在本发明的一个更优选的实施方案中，抗原是一种自身抗原。可用于本发明的自身抗原非常优选的实施方案如WO 02/056905所述，其公开内容在此完整引用作为参考。
治疗(treatment)：在此使用的术语“治疗”是指预防和/或治疗。例如，当用于传染病时，该术语是指提高患者对病原体感染的抗性，或者换句话说，降低患者感染病原体或表现感染所致病症的可能性的预防性治疗，以及患者感染后的抗感染治疗，例如减轻或消除感染或阻止其恶化。
疫苗：在此使用的术语“疫苗”是指包含本发明的组合物并且是能够对动物施用的形式的制剂。一般而言，疫苗包含常用的盐水或缓冲液，本发明的组合物悬浮或溶解于其中。以这种形式，本发明的组合物能够方便地用于预防、改善或治疗一种疾病。在导入宿主后，疫苗能够引起免疫应答，包括但不限于抗体、细胞因子的产生和/或其它细胞应答。
任选地，本发明的疫苗还包含一种佐剂，与本发明的化合物相比，它可能占一小部分或大部分。在此使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或可以在宿主中产生一种储存站的物质，与本发明的疫苗与该储存站结合时能够产生更强的免疫应答。有多种佐剂可以使用。例子包括弗氏不完全佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。在此，术语“佐剂”也指通常特异性的免疫应答刺激剂，当与本发明的疫苗组合时能够产生更强且通常特异的免疫应答。例子包括但不限于GM-CSF、IL-2、IL-12、IFNα。本领域技术人员知道更多的例子。
病毒样颗粒：在此使用时的术语“病毒样颗粒”是指一种类似于病毒颗粒但是未证明其具有致病的结构。一般而言，根据本发明的病毒样颗粒不携带编码病毒样颗粒蛋白质的遗传信息。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此是感传染性的。病毒样颗粒通常也能通过异源表达大量生产，且易于纯化。某些病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。如上所述，根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非感染性的，因为它缺乏病毒基因组的全部或一部分，特别是病毒基因组的复制性和传染性部分。根据本发明的病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的一个典型和优选的实施方案是一种病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体或RNA-噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”在此可以互换使用，是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。一般且优选地，病毒蛋白质亚单位分别装配为一种病毒衣壳和衣壳，它具有固有重复组织的结构，其中这种结构一般是球形或管状。例如，RNA-噬菌体或HBcAg的衣壳是二十面体对称的球形。在此使用的术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体，它类似于如上所述衣壳形态，但是不同于典型的对称装配体，而保持足够程度的秩序和重复性。
噬菌体的病毒样颗粒：在此使用的术语“噬菌体的病毒样颗粒”是指类似于噬菌体结构的病毒样颗粒，它是非复制性和非感染性的，至少缺乏编码噬菌体复制机制的基因，一般也缺乏编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也应当包括这样的噬菌体病毒样颗粒，其中上述基因仍然存在但是无活性，于是也产生非复制性和非感染性的噬菌体病毒样颗粒。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP：由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位自装配而成、任选地含有宿主RNA的衣壳结构，被称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一个具体例子是Qβ外壳蛋白的VLP。在此情况中，Qβ外壳蛋白的VLP可能仅仅由QβCP亚单位装配而成(通过表达含有如TAA终止密码子的QβCP基因产生，该终止密码子通过抑制阻止较长A1蛋白的表达，参见Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))，或者在衣壳装配体中还含有A1蛋白亚单位。
术语“病毒颗粒”在此是指病毒的形态学形状。某些病毒类型含有由蛋白质衣壳围绕的基因组；其它的具有附加结构(例如包膜、尾等)。
无包膜病毒颗粒由围绕并保护病毒基因组的蛋白质衣壳组成。包膜病毒也具有围绕病毒遗传物质的衣壳结构，另外还有围绕该衣壳的脂双层包膜。在本发明的一个优选实施方案中，VLP没有脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一个更优选的实施方案中，VLP完全不含包膜。
一种：术语“一种”在本公开内容中使用时，除非另外说明，是指“至少一种”或“一种或一种以上”。
本领域技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案涉及重组核酸技术的应用，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白质在原核和真核细胞中的表达等。这些方法是本领域技术人员公知的，在出版的实验室方法手册中常见(例如，Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。应用组织培养细胞系进行的基本实验室技术(Celis，J.编著，《细胞生物学》，AcademicPress，第二版，(1988))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane，D.，《抗体：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白质纯化指南”，Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，《蛋白质纯化原理与实践》，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有大量描述，这些文献均在此引用作为参考。
2.增强免疫应答的组合物和方法
本发明提供增强动物对一种或多种抗原的免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物包含或者由下列成分组成：病毒样颗粒和免疫刺激物，优选地免疫刺激性核酸，更优选地含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中免疫刺激物、免疫刺激性核酸或寡核苷酸与该病毒样颗粒结合。而且，本发明能够使技术人员方便地构建这种组合物，用于多种治疗和/或预防目的，包括传染病以及慢性传染病的预防和/或治疗，以及如癌症的预防和/或治疗。
本申请书中的病毒样颗粒是指类似于病毒颗粒但是不致病的结构。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。另外，病毒样颗粒能通过异源表达大量生产，并且易于纯化。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒是一种重组病毒样颗粒。本领域技术人员能够利用重组DNA技术和可公开获得的病毒编码序列生产VLP。例如，为了使用可购得的杆状病毒载体在杆状病毒表达载体中表达，可以将病毒包膜或核心蛋白的编码序列克克隆在病毒启动子的调节控制下，对序列进行适当修饰，使编码序列与调节序列功能连接。例如，也可以操作病毒包膜或核心蛋白的编码序列，以便在细菌表达载体中表达。
VLP的例子包括但不限于：乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))、辛德毕斯病毒、轮状病毒(美国专利号5,071,651和5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610(1995))、诺瓦克病毒(Jiang，X.等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))的衣壳蛋白，逆转录病毒GAG蛋白(PCT专利申请号WO 96/30523)，逆转录转座子Ty蛋白p1，乙型肝炎病毒(WO 92/11291)、人乳头瘤病毒(WO 98/15631)、人多瘤病毒(Sasnauska K.等人，Biol.Chem.380(3)：381-386(1999)；Sasnauskas K.等人，“不同多瘤病毒的重组病毒样颗粒在酵母中的生产”，第三届国际“作为疫苗的病毒样颗粒”会议，柏林，2001年9月26-29日)、RNA噬菌体、Ty、fr-噬菌体、GA-噬菌体、AP 205-噬菌体、特别是Qβ-噬菌体的表面蛋白。
本领域技术人员应当理解，本发明的VLP不限于任何特定形式。该颗粒能够化学合成或通过生物学方法生产，可以是天然的或非天然的。例如，这种实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。在一个具体实施方案中，VLP可以包含或者由下列成分组成：重组轮状病毒多肽；重组诺瓦克病毒多肽；重组甲病毒多肽；可形成细菌菌毛或菌毛样结构的重组蛋白；重组口蹄疫病毒多肽；重组麻疹病毒多肽；重组辛德毕斯病毒多肽；重组逆转录病毒多肽；重组乙型肝炎病毒多肽(例如HBcAg)；重组烟草花叶病毒多肽；重组禽兽棚病毒多肽；重组人乳头瘤病毒多肽；重组多瘤病毒多肽，特别是重组人多瘤病毒多肽，特别是重组BK病毒多肽；重组噬菌体多肽，重组RNA噬菌体多肽；重组Ty多肽；重组fr-噬菌体多肽，重组GA-噬菌体多肽，重组AP 205-噬菌体多肽，特别是重组Qβ-噬菌体多肽。该病毒样颗粒还可以包含或者由这些多肽的一种或多种片段以及这些多肽的变体组成。多肽的变体与其野生型对应物在氨基酸水平上例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。优选地，RNA-噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或基本由或由RNA-噬菌体Qβ或RNA-噬菌体fr的重组蛋白或其片段组成。
在本发明的一个更优选的实施方案中，重组蛋白包含或基本由或由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。
因此，形成衣壳或VLP的RNA-噬菌体外壳蛋白，或者适于自装配为衣壳或VLP的噬菌体外壳蛋白的片段，是本发明的更优选的实施方案。例如，噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。而且，这些蛋白质在表达后自动构成衣壳。另外，这些衣壳也能形成具有固有重复组织的结构。
能够用来制备本发明的组合物的噬菌体外壳蛋白的具体优选实例包括如下RNA噬菌体的外壳蛋白，如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：10；PIR数据库，登录号VCBPQβ，指QβCP，和SEQ ID NO：11；登录号AAA16663，指QβA1蛋白)，噬菌体R17(SEQ ID NO：12；PIR登录号VCBPR7)，噬菌体fr(SEQ ID NO：13；PIR登录号VCBPFR)，噬菌体GA(SEQ ID NO：14；GenBank登录号NP-040754)，噬菌体SP(SEQ ID NO：15；GenBank登录号CAA30374，指SP CP，和SEQID NO：16；关于SP A1蛋白的登录号)，噬菌体MS2(SEQ ID NO：17；PIR登录号VCBPM2)，噬菌体M11(SEQ ID NO：18；GenBank登录号AAC06250)，噬菌体MX1(SEQ ID NO：19；GenBank登录号AAC14699)，噬菌体NL95(SEQ ID NO：20；GenBank登录号AAC14704)，噬菌体f2(SEQ ID NO：21；GenBank登录号P03611)，噬菌体PP7(SEQ ID NO：22)。此外，噬菌体Qβ的A1蛋白或从C端丢失多达100、150或180个氨基酸的C端截短形式可以掺入在Qβ外壳蛋白的衣壳装配中。为了确保衣壳形成，衣壳装配中QβA1蛋白相对于QβCP的百分比通常受到限制。
也发现Qβ外壳蛋白在大肠杆菌中表达时自装配为衣壳(Kozlovska TM.等人，GENE 137：133-137(1993))。获得的衣壳或病毒样颗粒显示二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T＝3准对称。噬菌体Qβ的晶体结构已经解析。衣壳含有180个拷贝的外壳蛋白，它们通过二硫键连接成共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure 4：543-5554(1996))，使Qβ外壳蛋白的衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有与衣壳内的其它亚单位不是通过二硫键连接或不完全连接的亚单位。因此，在重组Qβ衣壳加样到非还原SDS-PAGE之后，对应于单体Qβ外壳蛋白的带以及对应于Qβ外壳蛋白五聚体或六聚体的带可见。不完全二硫键连接的亚单位在非还原SDS-PAGE中可能表现为二聚体、三聚体乃至四聚体带。Qβ衣壳蛋白对有机溶剂和变性剂也显示异常的抗性。我们惊奇地发现，高至30％的DMSO和乙腈浓度和高至1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Qβ外壳蛋白衣壳的高稳定性是一个有利的特征，特别是对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人来说。
在大肠杆菌中表达后，Qβ外壳蛋白的N端甲硫氨酸通常被除去，通过如Stoll，E.等人，J.Biol.Chem.252：990-993(1977)所述的N端Edman测序可以检测。本发明的范围内也包括由其中N端甲硫氨酸尚未去除的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或者含有其中N端甲硫氨酸被切除或仍然存在的混合Qβ外壳蛋白的VLP。
RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后也进一步表现为自装配(Kastelein，RA等人，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170：238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了外壳蛋白外还含有所谓的连读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1通过在UGA终止密码子处抑制而产生，长度为329个氨基酸。本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳都缺乏A2裂解蛋白，而含有来自宿主的RNA。RNA噬菌体的外壳蛋白是一种RNA结合蛋白，与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用，作为病毒生命周期中的一种翻译抑制物。这种相互作用的序列和结构组件已知(Witherell，GW.& Uhlenbeck，OC.Biochemistry 28：71-76(1989)；LimF.等人，J.Biol.Chem.271：31839-31845(1996))。已知茎环和RNA通常参与病毒装配(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))。
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或基本由或由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或由RNA噬菌体的突变外壳蛋白、优选地上述RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，RNA噬菌体的突变外壳蛋白已通过置换除去至少一个赖氨酸残基、或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基而被修饰；此外，RNA噬菌体的突变外壳蛋白也可以通过删除至少一个赖氨酸残基、或通过插入添加至少一个赖氨酸残基而修饰。
在另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或基本由或由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含或基本由或由下列成分组成：具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的外壳蛋白，或具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的氨基酸序列的外壳蛋白的混合物，或SEQ ID NO：11的突变体，其中N端甲硫氨酸优选地被切除。
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含或基本由或由突变Qβ外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，这些突变外壳蛋白通过置换去除至少一个赖氨酸残基或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基而被修饰。此外，这些突变外壳蛋白也可以通过删除至少一个赖氨酸残基或通过插入添加至少一个赖氨酸残基而被修饰。
有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的衣壳表面。本发明也可以使用以精氨酸替换暴露赖氨酸残基的Qβ突变体。在本发明中可以使用下列Qβ外壳蛋白突变体和突变QβVLP：“Q3-240”(Lys13-Arg；SEQ ID NO：23)，“Qβ-243”(Asn 10-Lys；SEQ ID NO：24)，“Qβ-250”(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO：25)，“Qβ-251”(SEQ ID NO：26)和“Qβ-259”(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO：27)。因此，在本发明的更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白组成，其包含具有选自下列的氨基酸序列的蛋白质：a)SEQ ID NO：23的氨基酸序列；b)SEQ ID NO：24的氨基酸序列c)SEQ ID NO：25的氨基酸序列；d)SEQ ID NO：26的氨基酸序列；e)SEQ ID NO：27的氨基酸序列。上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902中公开。具体参照上述申请的实施例18。
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或由上述Qβ突变体之一和相应A1蛋白的混合物组成。
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
AP205基因组由成熟蛋白质、外壳蛋白、复制酶和相关噬菌体中不存在的两个开放阅读框组成；一种裂解基因和开放阅读框在成熟基因的翻译中起作用(Klovins，J.等人，J.Gen.Virol.83：1523-33(2002))。AP205外壳蛋白能够由质粒pAP283-58(SEQ ID NO：79)表达，该质粒是pQb10的衍生物(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))，含有一个AP205核糖体结合位点。此外，AP205外壳蛋白也可以克隆到pQb185内，位于载体中核糖体结合位点的下游。两种方法都导致蛋白质的表达和衣壳的形成，如2002年7月17日提交的标题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请(申请号60/396,126)所述，在此完整引用作为参考。载体pQb10和pQb185是由pGEM载体衍生的载体，克隆到这些载体中的基因的表达受trp启动子控制(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))。质粒pAP283-58(SEQ ID NO：79)包含推断的具有下列序列的AP205核糖体结合位点，位于AP205外壳蛋白的XbaI位点下游和ATG起始密码子直接上游：tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGT GAGG AAAATCACatg。载体pQb185在XbaI位点下游和起始密码子上游包含一个SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGT AGGAGTCAGGCCatg，SD序列以下划线标出)。
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段组成。
本发明的这一优选实施方案包含可构成衣壳的AP205外壳蛋白。这些蛋白质是重组表达的或从天然来源制备的。电子显微镜检查(EM)和免疫扩散证实，在细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。在EM中可见，AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：80)形成的衣壳与AP205 RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎无法辨别。AP205 VLP具有高度免疫原性，能够与抗原和/或抗原决定簇连接，产生以重复方式展示抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体。能够产生针对这样展示的抗原的高滴度抗体，这表明结合的抗原和/或抗原决定簇能够与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。
AP205 VLP的可装配突变形式，包括氨基酸5处的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：81)，也可以在本发明中使用，形成本发明的一个更优选的实施方案。这些VLP、来自天然来源的AP205 VLP或AP205病毒颗粒可以与抗原结合，产生根据本发明的规则、重复的抗原阵列。
AP205 P5-T突变外壳蛋白能够由质粒pAP281-32(SEQ IDNO：82)表达，该质粒由pQb185直接衍生，含有突变AP205外壳蛋白基因代替Qβ外壳蛋白基因。用表达AP205外壳蛋白的载体转染大肠杆菌，以表达AP205外壳蛋白。
分别表达外壳蛋白和突变外壳蛋白、导致自装配为VLP的方法，在2002年7月17日提交的题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请(申请号60/396,126)中描述，在此完整引用作为参考。合适的大肠杆菌株包括但不限于：大肠杆菌K802、JM 109、RR1。合适的载体和菌株及其组合能够通过SDS-PAGE分别检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达而鉴定，衣壳形成和装配如下鉴定：任选地首先通过凝胶过滤纯化衣壳，随后用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-137(1993))检测。
由载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白由于在大肠杆菌细胞质中加工，可能缺乏起始甲硫氨酸。AP205 VLP的切割、未切割形式或其混合物是本发明的进一步优选的实施方案。
在本发明的另一个优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。
在本发明的另一个优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段组成。
在本发明中也可使用能够分别装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段。可以通过内部删除或分别在外壳蛋白和突变外壳蛋白的末端删除产生这些片段。向外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中插入抗原序列或抗原序列与外壳蛋白和突变外壳蛋白序列融合(与VLP装配相容)，是本发明的另一实施方案，分别产生嵌合AP205外壳蛋白和颗粒。插入、缺失以及与外壳蛋白序列融合的结果，以及是否与VLP装配相容，能够通过电子显微镜检查确定。
由上述AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒能够分离为纯化形式，分离方法是组合使用通过沉淀的分级分离步骤和通过凝胶过滤的纯化步骤，例如使用Sepharose CL-4B、SepharoseCL-2B、Sepharose CL-6B柱及其组合，如2002年7月17日提交的题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请(申请号60/396,126)所述，在此完整引用作为参考。分离病毒样颗粒的其它方法在本领域公知，可以用来分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利号4,918,166描述了利用超速离心分离酵母逆转录转座子Ty的VLP，在此完整引用作为参考。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经测定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，能够鉴定表面暴露残基，从而能够修饰RNA-噬菌体外壳蛋白，使得通过插入或置换能插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，噬菌体外壳蛋白的这些修饰形式也可以用于本发明。因此，也可以用形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP和噬菌体MS2、噬菌体AP 205的外壳蛋白)制备本发明的组合物。
尽管上述变异蛋白质的序列不同于其野生型，但是这些变异蛋白质通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包括：分别还包含可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的组合物和疫苗组合物，以及分别制备这些组合物和疫苗组合物的方法，用来制备这些组合物的各种蛋白质亚单位，和编码这些蛋白质亚单位的核酸分子。因此，本发明的范围内包括野生型蛋白质的变体形式，它们可形成衣壳或衣壳样结构，保留结合并形成衣壳或衣壳样结构的能力。
因此，本发明还包括包含如下蛋白质的组合物和疫苗组合物，该蛋白质包含或基本由或由与野生型蛋白质至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，它们各自可形成规则的阵列，具有固有的重复结构。
本发明的范围内还包括编码用来制备本发明组合物的蛋白质的核酸分子。
在其它实施方案中，本发明还包括包含如下蛋白质的组合物，该蛋白质包含或基本由或由与SEQ ID NO：10-27所示任一种氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
适用于本发明的蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构或VLP的蛋白质的C端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具有SEQ ID NO：10-27任一种所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的N端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具有SEQID NO：10-27任一个所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质包括可形成衣壳或衣壳样结构的N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括具有SEQ ID NO：10-27任一个所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸，从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端和C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括包含如下蛋白质的组合物，这些蛋白质包含或基本由或由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
本发明包括由可形成衣壳或VLP的蛋白质制备的组合物和疫苗组合物，由各种蛋白质亚单位和VLP或衣壳制备这些组合物的方法，制备这些蛋白质亚单位的方法，编码这些亚单位的核酸分子，和利用本发明的这些组合物接种和/或在个体中引发免疫应答的方法。
保留诱发免疫应答能力的VLP片段可能包含或由如下长度的多肽组成，这些多肽长度约为15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸，显然这取决于组成VLP的亚单位的序列长度。这些片段的例子包括此处所述适于制备免疫应答增强组合物的蛋白质片段。
在本发明的另一个优选实施方案中，VLP缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在另一个优选实施方案中，VLP完全不含包膜。
缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜，特别是完全缺少包膜，产生结构和组成更加明确的病毒样颗粒。这些更加明确的病毒样颗粒可以使副作用减至最小。而且，缺少含脂蛋白的包膜，或者特别是完全缺少包膜，使得病毒样颗粒内掺入潜在毒性分子和热原的可能性消失或减至最小。
如前所述，本发明包括病毒样颗粒或其重组形式。本领域技术人员了解如何生产这些颗粒并将其与抗原附着。通过其它的实例，本发明在此说明作为病毒样颗粒的乙型肝炎病毒样颗粒的生产(实施例1)。
在一个实施方案中，本发明的组合物中使用的颗粒由修饰的乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(HBcAg)或HBcAg片段构成，它们经过修饰除去或减少了游离半胱氨酸残基的数量。Zhou等人(J.Virol.66：5393-5398(1992))证实，修饰后除去自然存在的半胱氨酸残基的HBcAg保留结合并形成多聚体结构的能力。因此，适于在本发明的组合物中使用的核心颗粒包括那些包含修饰HBcAg或其片段的颗粒，其中一个或多个自然存在的半胱氨酸残基已被删除或被替换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
HBcAg是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的蛋白质。HBcAg的一些同种型已经被鉴定，本领域技术人员能够容易地获得其氨基酸序列。例如，具有图1所示氨基酸序列的HBcAg蛋白长度为185个氨基酸，是通过加工212个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白而产生的。这种加工导致从乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端除去29个氨基酸。类似地，长度为185个氨基酸的HBcAg蛋白通过加工214个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白而产生。
在优选实施方案中，用HBcAg的加工形式(即已经除去乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的HBcAg)制备本发明的疫苗组合物。
另外，在不发生加工的条件下生产HBcAg时，HBcAg通常表达为“加工”形式。例如，细菌系统(如大肠杆菌)通常不会除去在真核细胞中正常表达的蛋白质的前导序列，也称为“信号肽”。因此，当利用将蛋白质定向表达于细胞质的大肠杆菌表达系统生产本发明的HBcAg时，这些蛋白质通常表达为不含乙型肝炎核心抗原前体蛋白N端前导序列的形式。
可用于本发明的乙型肝炎病毒样颗粒的制备在下列专利中有描述，例如：WO 00/32227、特别是其实施例17-19和21-24，以及WO01/85208、特别是其实施例17-19、21-24、31-41，和2002年1月18日提交的未决的美国申请10/050,902号。最后一个申请中具体参照实施例23、24、31和51。全部三篇文献在此均明确引用作为参考。
本发明也包括经修饰后缺失或置换一个或多个其它半胱氨酸残基的HBcAg变体。因此，本发明的疫苗组合物包括包含如下HBcAg的组合物，其中图1所示氨基酸序列中不含的半胱氨酸残基已经被删除。
本领域众所周知，游离半胱氨酸残基可能参与一些化学副反应。这些副反应包括二硫键交换，与例如在与其它物质联合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物反应，或暴露于紫外线后的直接氧化以及与核苷酸的反应。因而可能产生毒性加合物，特别是考虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向。毒性加合物将会以多种形式分布，它们单个可能以低浓度存在，但在一起存在时达到毒性水平。
如上所述，在疫苗组合物中使用经修饰除去天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当抗原或抗原决定簇附着时，毒性物能够结合的位点在数量上减少或者完全消失。
适用于本发明的一些天然存在的HBcAg变体已经被鉴定。例如，Yuan等人(J.Virol.73：10122-10128(1999))描述了在对应于SEQ IDNO：28位点97的位点处异亮氨酸残基被置换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残基的变体。一些HBcAg变体以及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列公开于GenBank报告AAF121240(SEQ ID NO：29)、AF121239(SEQ ID NO：30)、X85297(SEQ ID NO：31)、X02496(SEQID NO：32)、X85305(SEQ ID NO：33)、X85303(SEQ ID NO：34)、AF151735(SEQ ID NO：35)、X85259(SEQ ID NO：36)、X85286(SEQID NO：37)、X85260(SEQ ID NO：38)、X85317(SEQ ID NO：39)、X85298(SEQ ID NO：40)、AF043593(SEQ ID NO：41)、M20706(SEQ ID NO：42)、X85295(SEQ ID NO：43)、X80925(SEQ IDNO：44)、X85284(SEQ ID NO：45)、X85275(SEQ ID NO：46)、X72702(SEQ ID NO：47)、X85291(SEQ ID NO：48)、X65258(SEQID NO：49)、X85302(SEQ ID NO：50)、M32138(SEQ ID NO：51)、X85293(SEQ ID NO：52)、X85315(SEQ ID NO：53)、U95551(SEQID NO：54)、X85256(SEQ ID NO：55)、X85316(SEQ ID NO：56)、X85296(SEQ ID NO：57)、AB033559(SEQ ID NO：58)、X59795(SEQ ID NO：59)、X85299(SEQ ID NO：60)、X85307(SEQ IDNO：61)、X65257(SEQ ID NO：62)、X85311(SEQ ID NO：63)、X85301(SEQ ID NO：64)、X85314(SEQ ID NO：65)、X85287(SEQID NO：66)、X85272(SEQ ID NO：67)、X85319(SEQ ID NO：68)、AB010289(SEQ ID NO：69)、X85285(SEQ ID NO：70)、AB010289(SEQ ID NO：71)、AF121242(SEQ ID NO：72)、M90520(SEQ IDNO：73)、P03153(SEQ ID NO：74)、AF110999(SEQ ID NO：75)和M95589(SEQ ID NO：76)，其公开内容均在此引用作为参考。这些HBcAg变体在多个位点处的氨基酸序列不同，包括对应于SEQ IDNO：77中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183处氨基酸残基的氨基酸残基。WO 00/198333、WO 00/177158和WO00/214478中描述了适于在本发明的组合物中使用、并可根据本说明书公开内容进一步修饰的其它HBcAg变体。
适用于本发明的HbcAg可以来源于任何生物，只要它们能够包封或偶联或附着、特别是能够包装含非甲基化CpG的寡核苷酸，并诱发免疫应答。
如上所述，一般将加工的HBcAg(即缺乏前导序列的)用于本发明的疫苗组合物中。本发明包括使用上述变异HbcAg的疫苗组合物，以及应用这些组合物的方法。
本发明的范围内还包括能够连接形成二聚或多聚结构的其它HBcAg变体。因此，本发明还包括包含HBcAg多肽的疫苗组合物，该多肽中包含或由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，以及必要时加工除去N端前导序列的这些蛋白质的形式。
一种多肽的氨基酸序列是否具有与野生型氨基酸序列之一或其亚部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，可以利用公知的计算机程序如Bestfit程序常规确定。当利用Bestfit或其它任何序列比对程序确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否如95％相同时，设置参数使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且允许同源性缺口达参照序列中氨基酸残基总数的5％。
具有SEQ ID NO：29-72和73-76所示氨基酸序列的HBcAg变体和前体彼此相对相似。因此，HBcAg变体中位于对应于SEQ ID NO：77中特定位点的位点处的氨基酸残基，是指SEQ ID NO：77所示氨基酸序列中该位点处的氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性绝大部分足够高，因此本领域技术人员不难检查分别如SEQ ID NO：77和图1所示的氨基酸序列，以及特定HBcAg变体的氨基酸序列，并确定“相应的”氨基酸残基。此外，SEQ ID NO：73所示HBcAg氨基酸序列，其显示来源于感染土拨鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列，与含有SEQ ID NO：77所示氨基酸序列的HBcAg有足够的同源性，显然在SEQ ID NO：73中，相当于在SEQ ID NO：77的氨基酸残基155与156之间插入了3个氨基酸残基。
本发明也包括包含感染鸟类的乙型肝炎病毒HBcAg变体的疫苗组合物，以及包含这些HBcAg变体的片段的疫苗组合物。本领域技术人员会理解，在添加到本发明的疫苗组合物中之前，这些多肽中自然存在的1、2、3个或更多的半胱氨酸残基可以被置换为另一种氨基酸残基或者缺失。
如上所述，去除游离半胱氨酸残基减少了毒性成分能够与HBcAg结合的位点数，也除去了该HBcAg或相邻HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨酸残基交联的位点。因此，在本发明的另一个实施方案中，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一个或多个半胱氨酸残基缺失或被替换为另一种氨基酸残基。
在其它实施方案中，本发明的组合物和疫苗组合物分别含有已经除去C端区的HBcAg(例如SEQ ID NO：77的氨基酸残基145-185或150-185)。适于在本发明中使用的其它修饰HBcAg包括C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
适于在本发明中使用的HBcAg也包括N端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰HBcAg。
适于在本发明中使用的HBcAg还包括N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸并且从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗组合物，该多肽包含或基本由或由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
在本发明的某些实施方案中，向HBcAg多肽内引入赖氨酸残基，以介导抗原或抗原决定簇与HBcAg的VLP的结合。在优选实施方案中，用一种HBcAg制备本发明的组合物，该HBcAg包含或由SEQ IDNO：77的氨基酸1-144或1-149、1-185组成，对其修饰使对应于位点79和80的氨基酸被替换为氨基酸序列为Gly-Gly-Lys-Gly-Gly的肽(SEQ ID NO：78)。这些组合物尤其可用于抗原决定簇与HBcAg的VLP相偶联的实施方案中。在进一步优选的实施方案中，SEQ IDNO：77的位点48和107处的半胱氨酸残基突变为丝氨酸。本发明还包括包含相应多肽的组合物，该多肽具有SEQ ID NO：29-74任一所示的氨基酸序列，它们也含有上述氨基酸改变。本发明的范围内还包括能够连接形成衣壳或VLP并且含有上述氨基酸改变的其它HBcAg变体。因此，本发明还包括组合物和疫苗组合物，它们分别包含如下HBcAg多肽，该多肽包含或由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，以及必要时加工除去N端前导序列和通过上述氨基酸改变修饰的这些蛋白质的变化形式。
本发明的组合物或疫苗组合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可由氨基酸序列不同的多种HbcAg构成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和一个或多个氨基酸残基已经改变(例如缺失、插入或置换)的修饰HBcAg的疫苗组合物。本发明的优选疫苗组合物是具有高度规则、重复的抗原阵列的组合物。
如上所述，本发明是基于以下的意外发现：免疫刺激物，优选地免疫刺激性核酸，更优选地DNA寡核苷酸，能够包装到VLP内。出乎意料的是，VLP内的核酸可被特异性地置换为免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选含有CpG基序的DNA-寡核苷酸。例如，CpG-VLP比不含CpG的对应物免疫原性显著提高、引发特异性更高的效应，并且诱发增强的B和T细胞应答。针对与VLP偶联、融合或以其他方式附着的抗原的免疫应答与针对VLP本身的免疫应答相似地增强。另外，针对VLP和抗原两者的T细胞应答尤其集中在Th1型。而且，包装的核酸和CpG分别受到保护而免于降解，即它们更加稳定。而且，来自先天免疫系统的细胞的非特异性激活被大大降低。
先天免疫系统能够识别微生物病原体所共有的固定分子模式。最近的研究揭示，这种识别是诱发高效免疫应答中的一个关键步骤。微生物产物增强免疫应答的主要机制是刺激APC，特别是树状细胞，产生促炎细胞因子，并且表达高水平的T细胞共同刺激分子。这些激活的树状细胞随后启动初次T细胞应答，决定T细胞介导的效应功能的类型。
两类核酸，即1)在特定侧翼碱基内含有免疫刺激序列、特别是非甲基化CpG二核苷酸的细菌DNA(称为CpG基序)，2)由多种病毒类型合成的双链RNA，是能增强免疫应答的微生物成分的重要成员。合成双链(ds)RNA，如聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)，能够诱导树状细胞产生促炎细胞因子并表达高水平的共同刺激分子。
Tokunaga和Yamamoto等人的一系列研究表明，细菌DNA或合成寡脱氧核苷酸诱导人PBMC和小鼠脾细胞产生I型干扰素(IFN)(Yamamoto等人的综述，Springer Semin Immunopathol.22：11-19)。最初合成Poly I:C作为I型IFN的一种强诱导剂，但它也能诱导其它细胞因子如IL-12。
优选的核糖核酸包括聚肌苷酸-聚胞苷酸双链RNA(poly I:C)。核糖核酸及其修饰及其生产方法在Levy，H.B.(Methods Enzymol.1981，78：242-251)、DeClercq，E(Methods Enzymol.1981，78：227-236)和Torrence，P.F.(Methods Enzymol 1981；78：326-331)以及其中的参考文献中有描述。核糖核酸可以从生物中分离。核糖核酸也包括其它合成核糖核酸，特别是合成的poly(I:C)寡核苷酸，它们通过磷酸二酯骨架的修饰、特别是通过硫代磷酸酯修饰形成核酸酶抗性。在另一个实施方案中，用脱氧核糖代替poly(I:C)的核糖骨架。本领域技术人员了解合成寡核苷酸的合成方法。
在本发明的另一个优选实施方案中，包括可激活toll样受体(TLR)的分子。迄今为止已知10种人toll样受体。它们由多种配体激活。TLR2由肽聚糖、脂蛋白、脂磷壁酸和酵母聚糖激活；TLR3由双链RNA如poly(I:C)激活；TLR4由脂多糖、脂磷壁酸和紫杉醇激活；TLR5由细菌鞭毛、特别是鞭毛蛋白激活；TLR6由肽聚糖激活；TLR7由咪喹莫特和咪唑并喹啉化合物如R418激活；TLR9由细菌DNA、特别是CpG DNA激活。TLR1、TLR8和TLR10的配体迄今为止还不知道。然而，最近的报告表明，相同的受体能够与不同的配体相互作用，并且存在其它受体。以上所列配体并非群举，本领域技术人员知道其它配体。
优选地，含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列：
5’X1X2CGX3X4 3’
其中X1、X2、X3、X4是任一种核苷酸。另外，该寡核苷酸可以包含约6个到约100,000个核苷酸，优选地约6个到约2000个核苷酸，更优选地约20个到约2000个核苷酸，更优选地包含约20个到约300个核苷酸。另外，该寡核苷酸也可以包含超过100个到约2000个核苷酸，优选地超过100个到约1000个核苷酸，更优选地超过100个到约500个核苷酸。
在一个优选实施方案中，含CpG的寡核苷酸在磷酸骨架上含有一个或多个硫代磷酸酯修饰。例如，本发明的范围内包括其中有一个或多个磷酸骨架修饰或者全部磷酸骨架修饰的含CpG的寡核苷酸，以及其中一个、多个或全部核苷酸磷酸骨架修饰为硫代磷酸酯修饰的含CpG的寡核苷酸。
含CpG的寡核苷酸可以是重组的、基因组的、合成的、cDNA、质粒衍生的和单链或双链的。为在本发明中应用，可以利用本领域众所周知的多种方法之一从头合成核酸。例如，β-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage，S.L.和Caruthers，M.H.，Tet.Let.22：1859(1981)；核苷H-磷酸法(Garegg等人，Tet.Let.27：4051-4054(1986)；Froehler等人，Nucl.Acid.Res.14：5399-5407(1986)；Garegg等人，Tet.Let.27：4055-4058(1986)；Gaffney等人，Tet.Let.29：2619-2622(1988))。这些化学法可以用市售的多种自动寡核苷酸合成仪进行。或者，CpG也可以在质粒中大规模生产(参见Sambrook，T.等人，《分子克隆：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)，它在对患者施用后降解为寡核苷酸。可以利用已知技术如使用限制性内切酶、外切核酸酶或内切核酸酶，由现有的核酸序列(例如基因组或cDNA序列)制备寡核苷酸。
免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸，可以用本领域已知的任何一种方法与VLP结合，只要该组合物在动物中能够增强免疫应答。例如，寡核苷酸可以共价或非共价结合。另外，VLP也可以完全或部分地包封免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸。优选地，免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸能够结合于VLP位点，如寡核苷酸结合位点(天然或非天然存在的)、DNA结合位点或RNA结合位点。在另一个实施方案中，VLP位点包含一个富含精氨酸的重复片段。
本发明组合物的一个具体用途是为了增强对抗原的特异性免疫应答而激活树状细胞。可以用离体(ex vivo)或体内技术增强免疫应答。离体技术可以用于自体或异源细胞，但优选地用于自体细胞。在优选实施方案中，树状细胞从外周血或骨髓中分离，但是可以从任何树状细胞来源中分离。为了癌症免疫治疗对树状细胞的离体操作在本领域的几篇参考文献中已有描述，包括Engleman，E.G.，Cytotechnology 25：1(1997)；Van Schooten，W.等人，MolecularMedicine Today，June，255(1997)；Steinman，R.M.，ExperimentalHematology 24：849(1996)；Gluckman，J.C.，Cytokines，Cellular andMolecular Therapy 3：187(1997)。
也可以利用体内方法使树状细胞接触本发明的组合物。为了实现这一点，将CpG与一种任选地偶联、融合或以其他方式附着有抗原的VLP组合，直接给予需要免疫治疗的患者。在一些实施方案中，优选地在肿瘤局部区域施用VLP/CpG，这能够用本领域周知的任何一种方法实现，例如直接向肿瘤内注射。
本发明的组合物还可以包含与病毒样颗粒结合的抗原或抗原决定簇。本发明根据希望的治疗效果提供依所选抗原或抗原决定簇而不同的组合物。适用于本发明的非常优选的抗原或抗原决定簇公开在WO 00/32227、WO 01/85208和WO 02/056905中，其公开内容在此完整引用作为参考。
抗原可以是来源已知或者未知的任何抗原。可以从细菌、病毒或其它病原体中分离，或者可以是通过合适的编码核酸表达获得的重组抗原。也可以从朊病毒、肿瘤、自体分子、非肽半抗原分子、变应原和激素分离。在一个优选实施方案中，抗原是一种重组抗原。抗原的选择当然取决于希望的免疫应答和宿主。
在本发明的免疫增强组合物的一个实施方案中，诱发对VLP本身的免疫应答。在本发明的另一个实施方案中，病毒样颗粒与希望增强对其免疫应答的一种抗原/免疫原偶联、融合或以其他方式附着。
在本发明的另一个优选的实施方案中，至少一种抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒融合。如上所述，VLP一般由至少一种可装配为VLP的亚单位组成。因此，在本发明的一个更优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒的或能够掺入VLP内的蛋白质的至少一种亚单位融合，产生嵌合的VLP-亚单位-抗原融合体。
抗原或抗原决定簇的融合可以按如下实现：插入VLP亚单位序列内，或与VLP亚单位或能够掺入VLP内的蛋白质的N端或C端融合。在下文中，当提到一种肽与VLP亚单位的融合蛋白时，包括该肽与亚单位序列任一端的融合或向亚单位序列内的内部插入。
也可以通过向VLP亚单位变体内插入抗原或抗原决定簇序列实现融合，其中亚单位序列的一部分缺失，也被称为截短突变体。截短突变体可能在N端或C端或内部缺失VLP亚单位的部分序列。例如，氨基酸残基79-81缺失的具体VLP HBcAg是含有内部缺失的截短突变体。抗原或抗原决定簇与截短突变体VLP-亚单位的N端或C端的融合也产生本发明的实施方案。同样，表位向VLP亚单位序列内的融合也可以通过置换实现，例如对于特定VLP HBcAg，用一种外源表位代替氨基酸79-81。因此，如下文所说的融合可以如下实现：向VLP亚单位的序列中插入抗原或抗原决定簇序列，用抗原或抗原决定簇置换VLP亚单位序列的一部分，或者缺失、置换或插入的组合。
嵌合抗原或抗原决定簇-VLP亚单位通常能够自装配为VLP。能展示与亚单位融合的表位的VLP在此也称为嵌合VLP。如上所述，病毒样颗粒包含或由至少一种VLP亚单位组成。在本发明的另一实施方案中，病毒样颗粒包含或由嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位(即不与抗原融合的VLP亚单位)的混合物组成，产生所谓的镶嵌颗粒。这可能有利于确保VLP的形成和装配。在这些实施方案中，嵌合VLP-亚单位的比例可能是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。
侧翼氨基酸残基可以添加到与VLP亚单位序列的任一端融合的肽或表位序列的任一端，或者向VLP亚单位序列内部插入这种肽序列。甘氨酸和丝氨酸残基是特别有用的氨基酸，可以在向待融合肽中添加的侧翼序列中使用。甘氨酸残基提供额外的柔性，这可降低外源序列与VLP亚单位序列融合中潜在的去稳定作用。
在本发明的一个具体实施方案中，VLP是一种乙型肝炎核心抗原VLP。抗原或抗原决定簇与HBcAg N端的融合蛋白(Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：1157-1163(1999))或向所谓的主要免疫显性区(MIR)中的插入已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001)，WO 01/98333)，也是本发明的优选实施方案。在MIR中有缺失的天然存在的HBcAg变体也已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)，在此完整引用作为参考)，与N端或C端的融合以及与野生型HBcAg相比在对应于缺失位点的MIR位点处的插入，也是本发明的实施方案。与C端的融合也已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。本领域技术人员能容易地找到如何利用经典分子生物学技术构建融合蛋白的指南(Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ho等人，Gene 77：51(1989))。编码HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于表达HBcAg和HBcAg融合蛋白的载体和质粒已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)，Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：1157-1163(1999))，可用于实施本发明。优化自装配效率和插入HBcAg MIR内之表位展示的一个重要因素是插入位点的选择，以及插入时从MIR内HBcAg序列上删除的氨基酸数量(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP 0 421635；美国专利号6,231,864)，换句话说，哪些HBcAg氨基酸将被置换为新的表位。例如，已经报道了用外源表位置换HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP0421635；US 6,231,864)。HBcAg含有一个长精氨酸尾(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))，它不是衣壳装配并能够结合核酸所必需的(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。包含或缺乏这一精氨酸尾的HbcAg都是本发明的实施方案。
在本发明的另一个优选的实施方案中，VLP是一种RNA噬菌体的VLP。RNA噬菌体的主要外壳蛋白在细菌、特别是在大肠杆菌内表达后自发装配为VLP。可用来制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体例子包括RNA噬菌体如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：10，PIR数据库，登录号VCBPQβ，指QβCP；和SEQ ID NO：11，登录号AAA16663，指QβA1蛋白)和噬菌体fr(SEQ ID NO：13，PIR登录号VCBPFR)的外壳蛋白。
在本发明的一个更优选的实施方案中，至少一种抗原或抗原决定簇与Qβ外壳蛋白融合。已经报道了如下融合蛋白构建体，其中表位与QβA1蛋白截短形式的C端融合，或插入A1蛋白内(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology，39：9-15(1996))。A1蛋白是通过UGA终止密码子处的抑制产生的，长度为329个氨基酸，或者如果考虑N端甲硫氨酸的切除，为328个氨基酸。丙氨酸(QβCP基因编码的第二个氨基酸)之前N端甲硫氨酸的切除在大肠杆菌中常常发生，Qβ外壳蛋白的N端就是如此。位于UGA琥珀密码子3’边的A1基因部分编码长度为195个氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位点72与73之间插入至少一个抗原或抗原决定簇产生本发明另外的实施方案(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))。抗原或抗原决定簇在C端截短的Qβ A1蛋白C端处的融合产生本发明另外的优选实施方案。例如，Kozlovska，T.M.等人(Intervirology 39：9-15(1996))描述了如下QβA1蛋白融合，其中表位融合在位点19处截短的QβCP延伸的C端。
如Kozlovska等人(Intervirology 39：9-15(1996))所述，展示融合表位的颗粒的装配一般需要存在A1蛋白-抗原融合和野生型CP，以形成镶嵌颗粒。然而，仅由与至少一种抗原或抗原决定簇融合的VLP亚单位组成的病毒样颗粒、特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP的实施方案也在本发明的范围内。
镶嵌颗粒的产生可以用数种方法实现。Kozlovska等人，Intervirology 39：9-15(1996)描述了3种方法，它们均用于实施本发明。第一种方法，通过在如下大肠杆菌菌株中表达在CP与CP延伸之间含有一个UGA终止密码子的编码QβA1融合蛋白的质粒，介导VLP上融合表位的有效展示，该大肠杆菌菌株携带编码克隆UGA抑制性tRNA的质粒，使UGA密码子翻译为Trp(pISM3001质粒(Smiley B.K.等人，Gene 134：33-40(1993))。另一种方法，将CP基因终止密码子修饰为UAA，并与表达A1蛋白-抗原融合体的第二种质粒共转化。该第二种质粒编码不同的抗生素抗性，其复制起点与第一种质粒相容(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))。第三种方法，CP和A1蛋白-抗原融合体以双顺反子的形式编码，与启动子如Trp启动子有效连接，如Kozlovska等人，Intervirology 39：9-15(1996)的图1所示。
在另外一个实施方案中，抗原或抗原决定簇插入在fr CP的氨基酸2与3之间(切割的CP的编号，其中N端甲硫氨酸已经切除)，从而产生抗原或抗原决定簇-fr CP融合蛋白。用于构建和表达可自装配为VLP的fr CP融合蛋白并且可用于本发明的载体和表达系统已经有报道(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。在一个具体实施方案中，抗原或抗原决定簇序列插入在fr CP缺失变体内氨基酸2之后，该变体中fr CP的残基3和4缺失(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。
表位在RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N端突起β-发夹中的融合，以及随后融合表位在RNA噬菌体MS-2的自装配VLP上的呈递，也已经有描述(WO 92/13081)，抗原或抗原决定簇通过插入或置换融合到MS-2 RNA噬菌体的外壳蛋白内也属于本发明的范围。
在本发明的另一个实施方案中，抗原或抗原决定簇与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，抗原或抗原决定簇与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1融合。用于构建及在杆状病毒/昆虫细胞系统内表达BPV-1融合蛋白的载体和表达系统已经有描述(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。用一种抗原或抗原决定簇置换BLV-1 L1的氨基酸130-136产生BPV-1 L1-抗原融合蛋白，这是本发明的一个优选实施方案。在杆状病毒载体中克隆以及在杆状病毒感染的Sf9细胞中表达已经有描述，可用于实施本发明(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。展示所融合抗原或抗原决定簇的装配颗粒可以用多种方法进行纯化，如凝胶过滤或蔗糖梯度超速离心(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。
在本发明的一个实施方案中，抗原或抗原决定簇与一种能够掺入Ty VLP内的Ty蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，抗原或抗原决定簇与TYA基因编码的p1或衣壳蛋白融合(Roth，J.F.，Yeast16：785-795(2000))。酵母逆转录转座子Ty1、2、3、4已经从酿酒酵母中分离，而逆转录转座子Tf1已经从粟酒裂殖酵母中分离(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，“酵母转座因子”，《酵母的分子和细胞生物学：基因组动力学、蛋白质合成和能量学》，p.193，Cold Spring HarborLaboratory Press(1991))。逆转录转座子Ty1和2与植物和动物因子的copia类别有关，而Ty3属于逆转录转座子的gypsy家族，它与植物和动物逆转录病毒有关。在Ty1逆转录转座子中，p1蛋白(也称为Gag或衣壳蛋白)的长度为440个氨基酸。p1在VLP的成熟过程中在位点408处被切割，产生p2蛋白，后者是VLP的必要组分。
与p1的融合蛋白和用于在酵母中表达该融合蛋白的载体已经有描述(Adams，S.E.等人，Nature 329：68-70(1987))。例如，通过向pMA5620质粒的BamHI位点内插入编码抗原或抗原决定簇的序列，该抗原或抗原决定簇可与p1融合(Adams，S.E.等人，Nature 329：68-70(1987))。将编码外源表位的序列克隆到pMA5620载体内导致融合蛋白的表达，该融合蛋白包含Ty1-15的p1氨基酸1-381，其C端与外源表位的N端融合。同样，抗原或抗原决定簇的N端融合，或向p1序列内的内部插入，或p1序列一部分的置换，也属于本发明的范围内。具体而言，将一种抗原或抗原决定簇插入Ty序列内Ty蛋白p1的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之间(EP0677111)，产生本发明的优选实施方案。
适于抗原或抗原决定簇融合的其它VLP有，例如：逆转录病毒样颗粒(WO9630523)、HIV2 Gag(Kang，Y.C.等人，Biol.Chem.380：353-364(1999))、豇豆花叶病毒(Taylor，K.M.等人，Biol.Chem.380：387-392(1999))、细小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等人，Virology263：89-99(1999))、HBsAg(US 4,722,840，EP0020416B1)。
适于本发明的嵌合VLP的例子也包括Intervirology 39：1(1996)中所描述的那些。可用于本发明的VLP的其它例子有：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIVGAG、烟草花叶病毒。也已制备了SV40、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒和诺瓦克病毒的病毒样颗粒，包含抗原或抗原决定簇的这些VLP的嵌合VLP也属于本发明的范围。
如上所述，通过插入病毒样颗粒构建单体的序列内，包含与病毒样颗粒融合的抗原的实施方案，也属于本发明的范围。有时，抗原可以插入在包含缺失的病毒样颗粒构建单体形式中。此时，在没有插入抗原的情况下，病毒样颗粒构建单体可能不能形成病毒样结构。
有时，可以应用重组DNA技术使一种异源蛋白质与一种VLP蛋白相融合(Kratz，P.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1915(1999))。例如，本发明包括与本发明的抗原(或其部分，优选地至少10、20或50个氨基酸)重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)的VLP，产生融合蛋白或偶联物。这种融合不一定必须是直接融合，可以通过接头序列发生。更一般而言，当使用与病毒样颗粒融合、偶联或附着的表位作为根据本发明的抗原时，一般在表位的一端或两端添加间隔或接头序列。这些接头序列优选地包含可被蛋白酶体、内体的蛋白酶或细胞的其它囊状区室识别的序列。
一种偶联方法是通过肽键，其中偶联物可以是一种连续的多肽，即融合蛋白。对于根据本发明的融合蛋白，不同肽或多肽在框内彼此连接，形成一条连续多肽。因此，该融合蛋白的第一部分包含一种抗原或免疫原，该融合蛋白的第二部分在第一部分的N端或C端包含VLP。或者，本发明也可以向VLP的内部插入，在抗原两端任选地带有连接序列。
当用HBcAg作为VLP时，抗原优选地与HBcAg颗粒的C端连接。展示MHC I类限制的肽p33(来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)糖蛋白)的C端融合的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)作为模型抗原(HBcAg-p33)。长度为185个氨基酸的野生型HBc蛋白装配为非常规则的颗粒，它由180个亚单位组成，表现为几何二十面体。可以在HBcAg和其它VLP的不同位点插入相对较大的外源序列，而保留形成结构化衣壳的能力，这种弹性在文献中有很好的证明。这使得HBc VLP成为设计非复制性疫苗的有力候选者。
可以向融合蛋白的抗原与配体之间插入一个柔性的接头序列(例如，含聚甘氨酸-聚丝氨酸的序列，如[Gly4Ser]2(Huston等人，Meth.Enzymol 203：46-88(1991)))。也可以构建一种融合蛋白使之含有一个“表位标签”，该标签使融合蛋白能够结合一种抗体(例如单克隆抗体)，例如用于标记或纯化。表位标签的一个例子是Glu-Glu-Phe三肽，它可被单克隆抗体YL1/2识别。
本发明也涉及含有编码VLP的序列和编码抗原/免疫原的序列的嵌合DNA。例如，该DNA能够在杆状病毒转化的昆虫细胞中、在酵母细胞或细菌中表达。对表达系统没有任何限制，常规用途的表达系统有大量选择。优选使用允许蛋白质大量表达的系统。由于细菌表达系统的效率高，通常优选该系统。适用于本发明的细菌表达系统的一个例子见Clarke等人，J.Gen.Virol.71：1109-1117(1990)；Borisova等人，J.Virol.67：3696-3701(1993)；Studier等人，Methods Enzymol.185：60-89(1990)中所述。合适的酵母表达系统的一个例子见Emr.Methods Enzymol.185：231-3(1990)中所述；杆状病毒系统也是适用的，它们以前曾用于制备衣壳蛋白。可以使用组成型或诱导型表达系统。通过有效表达系统的选择和可能的修饰，可能控制所获蛋白质的形式。
在本发明的一个具体实施方案中，希望增强对其免疫应答的抗原与乙型肝炎病毒衣壳(核心)蛋白(HBcAg)在框内偶联、融合或以其它方式附着。然而，本领域所有人员都应当清楚，在本发明的融合蛋白构建中也可以使用其它病毒样颗粒。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述至少一种抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与病毒样颗粒结合。优选地，该至少一种抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与病毒样颗粒结合，该共价键是一种非肽键，分别导致产生抗原或抗原决定簇阵列和抗原或抗原决定簇-VLP偶联物。这种抗原或抗原决定簇阵列和偶联物一般且优选地分别具有重复、规则的结构，因为所述至少一种抗原或抗原决定簇以定向方式与VLP结合。所述至少一种抗原或抗原决定簇与VLP的定向及明确的结合和附着确保了重复、规则的抗原或抗原决定簇-VLP阵列和偶联物的形成，这在下文中可以看出。而且，VLP固有的典型高度重复性规则结构有助于以高度规则、重复的方式展示抗原或抗原决定簇，分别产生高度规则、重复的抗原或抗原决定簇-VLP阵列和偶联物。
因此，本发明优选的偶联物和阵列在高度组织化结构、大小和阵列表面抗原重复性等方面都不同于现有的偶联物。本发明优选的实施方案还允许颗粒在表达宿主中表达，保证VLP的正确折叠和装配，然后抗原进一步与之偶联。
本发明公开了抗原或抗原决定簇与VLP的结合方法。如上所述，在本发明的一个方面，通过化学交联，一般且优选地通过使用异双功能交联剂，将至少一种抗原或抗原决定簇与VLP结合。本领域已知一些异双功能交联剂。在优选实施方案中，异双功能交联剂的一个功能基团能够与优选的第一附着位点(即VLP或至少一个VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应，另一个功能基团能够与优选的第二附着位点(即与抗原或抗原决定簇融合的、任选地也可进行还原反应的半胱氨酸残基)反应。该方法的第一步，一般称为衍生化，是VLP与交联剂的反应。反应产物是活化的VLP，也称为活化载体。第二步，按常用方法如凝胶过滤或透析除去未反应的交联剂。第三步，抗原或抗原决定簇与活化的VLP反应，该步骤一般称为偶联步骤。未反应的抗原或抗原决定簇任选地可在第四步中除去，例如通过透析。有几种异双功能交联剂是本领域公知的。这包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可从Pierce ChemicalCompany(Rockford，IL，USA)获得的其它交联剂，其含有一个对氨基有反应性的功能基团和一个对半胱氨酸残基有反应性的功能基团。上述交联剂均导致硫醚键的形成。适用于本发明的另一类交联剂，其特征在于偶联时在抗原或抗原决定簇与VLP之间引入一个二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。交联剂衍化VLP的程度可受不同实验条件的影响，如反应双方各自的浓度，一种试剂相对于另一种的过量，pH，温度和离子强度。偶联程度，即相对于每个VLP亚单位的抗原或抗原决定簇的量，可通过改变上述实验条件来调节，以满足疫苗的要求。
抗原或抗原决定簇与VLP的一种特别优选的结合方法是VLP表面的赖氨酸残基与抗原或抗原决定簇上的半胱氨酸残基连接。在某些实施方案中，含有半胱氨酸残基作为第二附着位点或作为其一部分的氨基酸接头与抗原或抗原决定簇融合，可能是与VLP偶联所必需的。
柔性的氨基酸接头通常是优选的。氨基酸接头的例子选自：(a)CGG；(b)N-端γ-1接头；(c)N-端γ-3接头；(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，1＝0-2；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ-1接头；(m)C-端γ-3接头；(n)C-端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8。
氨基酸接头的其它例子包括免疫球蛋白的铰链区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n和甘氨酸接头(G)n，它们均还含有一个半胱氨酸残基作为第二附着位点，任选地含有另外的甘氨酸残基。这类氨基酸接头的典型优选实例是：N-端γ1：CGDKTHTSPP；C-端γ1：DKTHTSPPCG；N-端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP；C-端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG；N-端甘氨酸接头：GCGGGG；C-端甘氨酸接头：GGGGCG。
当疏水抗原或抗原决定簇与VLP结合时，特别适于本发明的其它氨基酸接头有，作为N-端接头的CGKKGG或CGDEGG，或者作为C-端接头的GGKKGC和GGEDGC。对于C-端接头，末端半胱氨酸任选地被C端酰胺化。
在本发明的优选实施方案中，优选肽C-端的GGCG、GGC或GGC-NH2(“NH2”表示酰胺化)接头或肽N-端的CGG作为氨基酸接头。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中较大氨基酸的可能空间位阻。在本发明的最优选的实施方案中，氨基酸接头GGC-NH2与抗原或抗原决定簇的C-端融合。
抗原或抗原决定簇上的半胱氨酸残基必须是还原状态，才能与活化的VLP上的异双功能交联剂反应，即必须有含有游离巯基的游离半胱氨酸或半胱氨酸残基。当作为结合位点的半胱氨酸残基是氧化形式时，例如，如果形成二硫键，则需要用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。如WO 02/05690所述，低浓度还原剂适于偶联，技术人员应当知道，较高浓度抑制偶联反应，此时必须在偶联前必须除去还原剂，或者降低其浓度，例如通过透析、凝胶过滤或反相HPLC。
根据上述优选方法，利用异双功能交联剂使抗原或抗原决定簇与VLP结合，可使抗原或抗原决定簇与VLP以定向方式偶联。抗原或抗原决定簇与VLP结合的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS将抗原或抗原决定簇与VLP交联的方法。另外一些方法使用均双功能剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或含有对VLP的胺基或羧基具有反应性的功能基团的其它已知均双功能交联剂，使抗原或抗原决定簇与VLP附着。
VLP与抗原或抗原决定簇结合的其它方法包括生物素化VLP、抗原或抗原决定簇表达为链亲和素-融合蛋白的方法，或抗原或抗原决定簇和VLP均被生物素化的方法，如WO 00/23955所述。在这种情况下，通过调节抗原或抗原决定簇与链亲和素的比例，首先使抗原或抗原决定簇与链亲和素或亲和素结合，使得仍有自由结合位点可与下一步添加的VLP结合。或者，也可以在“一锅”反应中混合所有成分。其它配体-受体对也可以作为结合抗原或抗原决定簇与VLP的结合剂，其中存在受体和配体的可溶形式，并且能够与VLP或抗原或抗原决定簇交联。或者，配体或受体也可以与抗原或抗原决定簇融合，从而介导分别与受体或配体化学结合或融合的VLP的结合。也可以通过插入或置换实现融合。
如前所述，在本发明的一个优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP，在一个更优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP。
如果空间上允许，一个或几个抗原分子，即一个或几个抗原或抗原决定簇，能够附着于RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚单位上，优选地通过RNA噬菌体VLP的暴露赖氨酸残基附着。RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的一个特殊特征是每个亚单位能够偶联几个抗原。这能够产生密集的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒的结合和附着分别是通过病毒样颗粒的至少一个第一附着位点与抗原或抗原决定簇的至少一个第二附着位点之间的相互作用和连接实现的。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的拓扑学，有3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，其它4个赖氨酸残基暴露于衣壳外面。这些明确的特性有利于抗原附着于颗粒外部，而不是赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在其表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基有确定的拓扑学。
在本发明的更优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，并且/或者第二附着位点包含巯基或半胱氨酸残基。在本发明的一个非常优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇通过半胱氨酸残基与RNA噬菌体外壳蛋白VLP的赖氨酸残基结合，特别是与Qβ外壳蛋白的VLP结合。
来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达量，这允许以较低的成本大量生产材料。
如上所述，本发明的偶联物和阵列在高度组织化结构、大小以及阵列表面抗原重复性等方面分别不同于现有的偶联物。而且，用VLP作为载体可以分别形成具有不同抗原密度的庞大的抗原阵列和偶联物。特别是，使用RNA噬菌体的VLP，尤其是使用RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP，能够获得极高的表位密度。具体而言，将人Aβ1-6表位与Qβ外壳蛋白的VLP偶联，能够获得每个亚单位1.5个以上表位的密度。具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白VLP组合物的制备可以根据本申请的教导实现。在本发明的优选实施方案中，当抗原或抗原决定簇与Qβ外壳蛋白的VLP偶联时，每个亚单位的平均抗原或抗原决定簇数量为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或更高是优选的。
如此处定义的第二附着位点可能是抗原或抗原决定簇天然存在或非天然存在的。如果抗原或抗原决定簇上没有合适的天然存在的第二附着位点，则必须为该抗原改造非天然第二种附着位点。
如上所述，有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP表面。这些残基一般在与交联剂分子反应时被衍化。如果不是所有的暴露赖氨酸残基都能与抗原偶联，与交联剂反应的赖氨酸残基在衍化步骤后ε-氨基连接交联剂分子。这使得一个或几个正电荷丢失，这可能不利于VLP的可溶性和稳定性。通过用精氨酸代替一些赖氨酸残基，如下文所述的Qβ外壳蛋白突变体，我们防止了正电荷的过多丢失，因为精氨酸残基不与交联剂反应。而且，用精氨酸置换赖氨酸残基可产生更明确的抗原阵列，因为有更少的位点可以与抗原反应。
因此，在本申请公开的下列Qβ外壳蛋白突变体和突变QβVLP中，用精氨酸替换了暴露的赖氨酸残基：Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ IDNO：23)、Qβ-250(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO：25)和Qβ-259(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO：27)。克隆了这些构建体，表达了蛋白质，纯化了VLP，并用于与肽和蛋白质抗原偶联。也构建了Qβ-251(SEQ ID NO：26)，在本申请中能够找到如何表达、纯化和偶联Qβ-251外壳蛋白VLP的指南。
在另一个实施方案中，我们公开了含有一个额外赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白，它适用于获得更高密度的抗原阵列。经克隆该突变Qβ外壳蛋白Qβ-243(Asn10-Lys；SEQ ID NO：24)，表达蛋白质，分离并纯化衣壳或VLP，表明该额外赖氨酸残基的引入与亚单位自装配为衣壳或VLP相容。因此，可以用Qβ外壳蛋白突变体的VLP分别制备抗原或抗原决定簇阵列和偶联物。抗原与VLP、特别是与RNA噬菌体外壳蛋白VLP附着的一种特别优选的方法是使RNA噬菌体外壳蛋白VLP表面的赖氨酸残基与添加于抗原中的半胱氨酸残基连接。为了使半胱氨酸残基能够有效地作为第二附着位点，必须有一个巯基能用来偶联。因此，半胱氨酸残基必须是还原状态，即，必须有游离半胱氨酸或含有游离巯基的半胱氨酸残基。如果作为第二附着位点的半胱氨酸残基是氧化形式，例如，如果它形成二硫键，则需要使用如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。必须为每种抗原调节还原剂的浓度和还原剂超过抗原的摩尔数。必要时需要检测滴定范围，从低至10μM或更低的还原剂浓度，到可达10-20mM或更高，并评价抗原与载体的偶联。尽管如WO 02/056905所述低浓度还原剂适于偶联反应，较高浓度抑制偶联反应，但是本领域技术人员应当知道，此时必须除去还原剂或降低其浓度，例如通过透析、凝胶过滤或反相HPLC。透析或平衡缓冲液的pH通常低于7，优选地低于6。必须检测低pH缓冲液与抗原活性或稳定性的相容性。
通过选择交联剂和其它反应条件，能够调节RNA噬菌体外壳蛋白VLP上的表位密度。例如，交联剂Sulfo-GMBS和SMPH一般能够获得高表位密度。高浓度反应物正面影响衍生化，可以通过操作反应条件来控制与RNA噬菌体外壳蛋白VLP偶联、特别是与Qβ外壳蛋白VLP偶联的抗原数量。
在设计非天然的第二附着位点之前，必须选择融合、插入或遗传构建的位置。第二附着位点的位置的选择例如可基于抗原的晶体结构。抗原的这种晶体结构可以提供关于分子C端或N端的可用性(例如取决于它们是否可接触到溶剂)或关于适于作为第二附着位点的残基(如半胱氨酸残基)暴露于溶剂的信息。暴露的二硫键也可能是第二附着位点的来源(对于Fab片段即如此)，因为用例如2-巯基乙胺、TCEP、β-巯基乙醇或DTT温和还原，它们通常能转化为单个半胱氨酸残基。选择不影响抗原免疫原性的温和还原条件。如果自身抗原免疫旨在抑制自身抗原与其天然配体的相互作用，通常添加第二附着位点使得能够产生针对与天然配体相互作用之位点的抗体。因此，选择第二附着位点的位置，以避免来自第二附着位点或含有它的任何氨基酸接头的空间位阻。在其它实施方案中，希望针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点之外的一种位点的抗体应答。在这些实施方案中，可选择第二附着位点，以防止产生针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。
选择第二附着位点位置的其它标准包括：抗原的寡聚状态，寡聚位点，辅因子的存在，以及存在的揭示抗原结构和序列中位点(在该位点对该抗原的修饰与自身抗原的功能相容或者适于产生可识别自身抗原的抗体)的实验证据。
在非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇包含单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点，后者分别能够与核心颗粒和VLP或VLP亚单位上的第一附着位点结合。这进一步确保至少有一种、但一般是一种以上、优选地超过10、20、40、80、120种抗原分别与核心颗粒和VLP明确、均一地结合。因此，抗原上含有单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点确保了类型单一、均匀的结合，分别产生高度规则、重复的阵列。例如，如果通过赖氨酸-(作为第一附着位点)和半胱氨酸-(作为第二附着位点)相互作用实现结合，根据本发明的这一优选实施方案，确保每个抗原只有一个半胱氨酸残基能够分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点结合，而无论该半胱氨酸残基在抗原上是天然存在还是非天然的。
在某些实施方案中，在抗原上构建第二附着位点需要根据本发明的公开内容融合含有适于作为第二附着位点的氨基酸的氨基酸接头。因此，在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸接头通过至少一个共价键与抗原或抗原决定簇结合。优选地，该氨基酸接头包含或由第二附着位点组成。在一个更优选的实施方案中，氨基酸接头包含一个巯基或半胱氨酸残基。在另一个优选实施方案中，该氨基酸接头是半胱氨酸。氨基酸接头的一些选择标准以及根据本发明的氨基酸接头的优选实施方案在上文中已经提及。
在本发明的另一个具体实施方案中，选择附着位点为与HBcAg框内融合的赖氨酸或半胱氨酸残基。在一个优选实施方案中，抗原与HBcAg的C端通过一个三亮氨酸接头融合。
当抗原或抗原决定簇与VLP通过一个赖氨酸残基连接时，有利的是置换或删除一个或多个天然存在的赖氨酸残基，以及HBcAg变体中存在的其它赖氨酸残基。
在许多情况下，当天然存在的赖氨酸残基被消除时，向HBcAg内引入另一个赖氨酸作为抗原或抗原决定簇的附着位点。插入赖氨酸残基的方法在本领域公知。也可以在不除去现有赖氨酸残基的情况下添加赖氨酸残基。
已经证明HBcAg的C端可引导该蛋白质的核定位(Eckhardt等人，J.Virol.65：575-582(1991))。而且也认为该蛋白质的这一区域使HBcAg具有结合核酸的能力。
如上所述，适用于本发明的HBcAg也包括N端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰HBcAg。然而，在组成病毒样颗粒的亚单位序列内含有内部缺失的病毒样颗粒变体也适用于本发明，只要它们保留病毒样颗粒的规则或颗粒结构。例如，HBcAg序列内的内部缺失是适宜的(Preikschat，P.等人，J.Gen.Virol.80：1777-1788(1999))。
适用于本发明的其它HBcAg包括N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸、并从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42或48个氨基酸的HBcAg。
本发明的疫苗组合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可以由氨基酸序列不同的多个HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和修饰HBcAg的疫苗组合物，在修饰HBcAg中一个或多个氨基酸残基已经改变(例如缺失、插入或置换)。然而在大多数应用中，只使用一种HBcAg。
本发明适用于多种各样的抗原。在一个优选实施方案中，抗原是蛋白质、多肽或肽。在另一个实施方案中，抗原是DNA。抗原也可以是脂类、碳水化合物或有机分子，特别是有机小分子，如烟碱。
本发明的抗原可选自：(a)适于诱发对癌细胞的免疫应答的多肽；(b)适于诱发对传染病的免疫应答的多肽；(c)适于诱发对变应原的免疫应答的多肽；(d)适于在家畜或宠物中诱发免疫应答的多肽；(e)(a)-(d)所述任一种多肽的片段(例如结构域)。
优选的抗原包括来自病原体(例如病毒、细菌、寄生虫、真菌)和肿瘤的抗原(特别是肿瘤相关抗原或“肿瘤标志物”)。其它优选抗原包括自身抗原。
在实施例所述的具体实施方案中，抗原是来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的肽p33。p33肽是研究最多的CTL表位之一(Pircher等人，“双特异性T细胞受体转基因小鼠中耐受性的诱导随抗原而不同”，Nature 342：559(1989)；Tissot等人，“体外表征重组T细胞受体的功能：基于pMHC四聚体的方法”，J Immunol Methods236：147(2000)；Bachmann等人，“用T细胞激动剂、部分激动剂和拮抗剂刺激幼稚T细胞后4种类型的Ca2+信号”，Eur.J.Immunol.27：3414(1997)；Bachmann等人，“抗病毒细胞毒性T细胞应答的功能成熟”，J.Virol.71：5764(1997)；Bachmann等人，“肽诱导的幼稚T细胞的TCR下调预测激动剂/部分激动剂性质并与T细胞激活密切相关”，Eur.J.Immunol.27：2195(1997)；Bachmann等人，“LFA-1和CD28在幼稚T细胞激活过程中的不同作用：粘附还是共同刺激”，Immunity 7：549(1997))。p33特异的T细胞被证实在转基因小鼠中诱发致死性糖尿病(Ohashi等人，“在病毒抗原转基因小鼠中病毒感染消除“耐受’并诱导糖尿病”，Cell 65：305(1991))并且能够阻止表达p33的肿瘤细胞的生长(Kündig等人，“成纤维细胞在淋巴器官中作为有效的抗原呈递细胞”，Science 268：1343(1995)；Speiser等人，“内源性抗原特异的CTL肿瘤治疗不会导致自身免疫病”，J.Exp.Med.186：645(1997))。因此，这种特异性表位特别适于研究自身免疫、肿瘤免疫以及病毒病。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原或抗原决定簇是可用来预防传染病的那些。这种治疗可用来治疗影响多种宿主(例如人、牛、绵羊、猪、狗、猫、其它哺乳动物种和非哺乳动物种)的广泛的多种传染病。可治疗的传染病在本领域众所周知，例子包括：病毒病性疾病的传染，如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、乳头瘤病毒等；或细菌性疾病的传染，如肺炎、结核、梅毒等；或寄生虫病的感染，如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。因此，为本发明的组合物选择的抗原或抗原决定簇在医学领域众所周知；抗原或抗原决定簇的例子包括：HIV抗原gp140和gp160；流感抗原血凝素、M2蛋白和神经酰胺酶、乙型肝炎表面抗原或核心抗原和疟疾环子孢子蛋白或其片段。
如上所述，抗原包括来自天然来源或合成的传染性微生物，如病毒、细菌和真菌及其片段。人和非人脊椎动物的传染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒。逆转录病毒包括简单逆转录病毒和复杂逆转录病毒。简单逆转录病毒包括B型逆转录病毒、C型逆转录病毒和D型逆转录病毒亚群。B型逆转录病毒的一个例子是小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)。C型逆转录病毒包括C型A群的亚群(包括劳斯肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)和禽成髓细胞性白血病(AMV))和C型B群(包括鼠白血病病毒(MLV)、猫白血病病毒(FeLV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、脾坏死病毒(SNV)、网状内皮组织增生病病毒(RV)和猿肉瘤病毒(SSV))。D型逆转录病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和1型猿逆转录病毒(SRV-1)。复杂逆转录病毒包括慢病毒、T细胞白血病病毒和泡沫病毒的亚群。慢病毒包括HIV-1，也包括HIV-2、SIV、维斯那病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性白血病病毒(EIAV)。T细胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猿T细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
在脊椎动物中作为抗原的RNA病毒的例子包括但不限于：呼肠孤病毒科的成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽逆转录病毒的多种血清型)，环状病毒属(蓝舌病毒、Eugenangee病毒、克米罗沃病毒、非洲马疫病毒和科罗拉多蜱热病毒)，轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、鼠轮状病毒、猿轮状病毒、牛或绵羊轮状病毒、禽轮状病毒)；小RNA病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，肠道致细胞病变性人肠道孤(ECHO)病毒，甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒，猿肠道病毒，鼠脑脊髓炎(ME)病毒，脊髓灰质炎病毒，牛肠道病毒，猪肠道病毒)，心肌病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒)，鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113个亚型；其它鼻病毒)，鹅口疮病毒属(口蹄疫(FMDV))；杯状病毒科，包括猪水泡疹病毒、圣米格尔海狮病毒、猫小RNA病毒和诺瓦克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传病毒，远东蜱传病毒，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(A型流感病毒，多种人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，B型流感(多种人亚型)，C型流感(可能分离的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)；黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传病毒，远东蜱传病毒，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(A型流感病毒，多种人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，B型流感(多种人亚型)，C型流感(可能分离的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡性病毒属(VSV)，钱迪普拉病毒，佛朗德-哈特公园病毒)，狂犬病病毒属(狂犬病病毒)，鱼弹状病毒和丝状病毒(马堡病毒和埃博拉病毒)；砂粒样病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，塔卡里伯病毒复合物，拉萨病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人肠道冠状病毒，和猫传染性腹膜炎病毒(猫冠状病毒)。
在脊椎动物中作为抗原的DNA病毒的例子包括但不限于：痘病毒科，包括正痘病毒属(重型天花病毒、轻型天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、水牛痘病毒、兔痘病毒、小鼠脱脚病病毒)，野兔痘病毒属(粘液瘤病毒，纤维瘤病毒)，禽痘病毒属(鸡痘病毒，其它禽痘病毒)，羊痘病毒属(绵羊痘病毒，山羊痘病毒)，猪痘病毒属(猪痘病毒)，副痘病毒属(触染性脓疮性皮炎病毒，假牛痘病毒，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(1型和2型单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，假狂犬病病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)和β-疱疹病毒(人巨细胞病毒和猪、猴、啮齿动物巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马雷克病病毒，松鼠猴疱疹病毒(Herpes saimiri)，蛛猴疱疹病毒(Herpesvirusateles)，兔疱疹病毒，豚鼠疱疹病毒，勒克肿瘤病毒)；腺病毒科，包括乳腺病毒属(人A、B、C、D、E亚群和未分组的；猿腺病毒(至少23种血清型)，传染性犬肝炎病毒，牛、猪、绵羊、蛙和其它许多种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；不可培养的腺病毒；乳头多瘤空泡病毒科，包括乳头瘤病毒属(人乳头状瘤病毒，牛乳头瘤病毒，兔乳头瘤病毒，其它物种的多种致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿空泡剂(SV-40)，兔空泡剂(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，以及其它灵长类动物多瘤病毒，如亲淋巴乳头瘤病毒)；细小病毒科，包括腺伴随病毒属，细小病毒属(猫全血细胞减少症病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申水貂病病毒等)。最后，DNA病毒可包括不属于上述科的病毒，如库鲁病病毒、克-雅氏症病毒和慢性传染性神经性病原体(CHINA病毒)。
以上所列均是举例说明性的，并非限制性的。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原包含一种或多种细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或这两种表位的组合。
除了增强人体抗原特异性免疫应答外，优选实施方案的方法尤其适于治疗其它哺乳动物或其它动物，例如鸟类，如母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉。鸟类是多种感染的最初目标。
鸡中常见感染的一个例子是鸡传染性贫血病毒(CIAV)。CIAV最早是在1979年在马雷克病免疫接种研究过程中分离的(Yuasa等人，Avian Dis.23：366-385(1979))。自那时起，在所有主要家禽生产国的商品家禽中都检测到了CIAV(van Bulow等人，pp.690-699，《家禽疾病》，第九版，Iowa State University Press 1991)。
象其它脊椎动物一样，鸟类的接种可以在任何年龄段进行。对于活微生物，通常在12周龄之前进行接种，对于灭活微生物或其它类型的疫苗，通常在14-18周接种。对于卵内接种，可以在胚胎发育的最后四分之一时段内进行接种。疫苗可以通过皮下、喷雾、口服、眼内、气管内、鼻内、卵内或通过此处所述的其它方法施用。
牛和家畜也易受感染。影响这些动物的疾病能够导致严重的经济损失，特别是牛的疾病。本发明的方法可用于保护家畜如牛、马、猪、绵羊和山羊免遭感染。
牛可被牛病毒感染。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种小的包膜正链RNA病毒，与猪霍乱病毒(HOCV)和绵羊边界病病毒(BDV)一起归类为瘟病毒属。尽管瘟病毒以前被归类为披膜病毒科，但是一些研究建议它们应当与黄病毒和丙型肝炎病毒(HCV)群一起重新归类为黄病毒科。
马疱疹病毒(EHV)包括一组抗原性不同的生物剂，它们在马中引起从亚临床到致死性疾病的多种感染。它们包括马疱疹病毒-1(EHV-1)，这是普遍存在于马中的一种病原体。EHV-1与流产、呼吸道疾病、中枢神经系统疾病的流行有关。其它EHV包括EHV-2或马巨细胞病毒，EHV-3或马性交疹病毒，和EHV-4(以前归类为EHV-1亚型2)。
绵羊和山羊可以被多种危险微生物感染，包括维斯那-梅迪病毒。
灵长类动物如猴、猿和猕猴可能被猿免疫缺陷病毒感染。已经报告灭活的细胞病毒和不含细胞的全猿免疫缺陷疫苗在猕猴中产生保护(Stott等人，Lancet 36：1538-1541(1990)；Desrosiers等人，PNAS USA86：6353-6357(1989)；Murphey-Corb等人，Science 246：1293-1297(1989)；Carlson等人，AIDS Res.Human Retroviruses 6：1239-1246(1990))。已经报告重组HIV gp120疫苗在黑猩猩中产生保护(Berman等人，Nature 345：622-625(1990))。
猫科动物，无论是驯养的还是野生的，都易感染多种微生物。例如，猫传染性腹膜炎是在驯养和野生猫科(如狮、豹、猎豹和美洲虎)中都存在的疾病。当希望预防猫科动物感染这种和其它类型的病原微生物时，可以用本发明的方法接种猫科动物，防止它们感染。
家猫可能感染几种逆转录病毒，包括但不限于：猫白血病病毒(FeLV)、猫肉瘤病毒(FeSV)、内源性C型致癌RNA病毒(RD-114)和猫合胞体形成病毒(FeSFV)。Pedersen等人，Science 235：790-793(1987)首先报告了猫亲T淋巴慢病毒(也称为猫免疫缺陷病毒)的发现。猫传染性腹膜炎(FIP)是在驯养和野生猫科动物中不可预期地发生的一种散发病。FIP主要是家猫的一种疾病，但是也曾经在狮、美洲狮、豹、猎豹和美洲虎中诊断出。罹患FIP的较小型野生猫科动物包括猞猁和狞獾、sand cat和pallas cat。
有鳍鱼类、有壳水生动物或其它水生生物的病毒和细菌疾病给水产养殖业带来严重的问题。由于孵化场或封闭海水养殖区中动物密度高，传染病有可能消灭如有鳍鱼类、有壳水生动物或其它水生生物设施中的大部分动物。一旦疾病发展，对疾病的预防是比干预更希望的应对鱼类威胁的补救措施。鱼的接种是唯一可导致长期免疫保护的预防方法。例如，美国专利号5,780,448描述了基于核酸的鱼类接种。
鱼类免疫系统具有许多类似于哺乳动物免疫系统的特征，如存在B细胞、T细胞、淋巴因子、补体和免疫球蛋白。鱼类具有淋巴细胞亚类，其作用在许多方面似乎类似于哺乳动物的B细胞和T细胞。可以通过口服或通过浸没或注射施用疫苗。
水生物种包括但不限于有鳍鱼类、有壳水生动物和其它水生动物。有鳍鱼类包括所有有脊椎的鱼类，它们可能是硬骨鱼或软骨鱼，如鲑鱼、鲤鱼、鲶鱼、yellowtail、鲷和黑鲈。鲑鱼是有鳍鱼类的一个科，包括鳟鱼(包括虹鳟鱼)、鲑鱼和红点鲑。有壳水生动物的例子包括但不限于：蛤、龙虾、小河虾、螃蟹和牡蛎。其它培养的水生动物包括但不限于鳗鱼、鱿鱼和章鱼。
病毒性水产养殖病原体的多肽包括但不限于：病毒性出血性败血病病毒(VHSV)的糖蛋白或核蛋白；传染性造血坏死病毒(IHNV)的G或N蛋白；传染性胰腺坏死病毒(IPNV)的VP1、VP2、VP3或N结构蛋白；鲤鱼春季病毒血症病毒(SVC)的G蛋白；水道鲶鱼病毒(CCV)的膜结合蛋白、tegumin或衣壳蛋白或糖蛋白。
细菌病原体的多肽包括但不限于：导致疖病的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁调节外膜蛋白(IROMP)、外膜蛋白(OMP)、A-蛋白，导致细菌性肾病(BKD)的沙氏肾杆菌(Renibacterium salmoninarium)的p57蛋白，耶尔森氏菌的主要表面结合抗原(msa)、表面表达的细胞毒素(mpr)、表面表达的溶血素(ish)和鞭毛抗原；巴斯德氏菌的胞外蛋白(ECP)、铁调节外膜蛋白(IROMP)和结构蛋白；鳗弧菌(Vibrosis anguillarum)和奥氏弧菌(V.ordalii)的OMP和鞭毛蛋白；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiellosis ictaluri)和迟钝爱德华氏菌(E.tarda)的鞭毛蛋白、OMP蛋白、aroA和purA；小瓜虫属的表面抗原；柱状噬纤维菌(Cytophaga columnari)的结构性和调节性蛋白；立克次体的结构性和调节性蛋白。
寄生虫病原体的多肽包括但不限于小瓜虫属的表面抗原。
本发明的另一方面，提供了这样的疫苗组合物，其适于在由“自身”基因产物(例如肿瘤坏死因子)引起或加重之疾病的预防和/或缓解方法中使用。因此，本发明的疫苗组合物包括导致产生可预防和/或缓解由“自身”基因产物引起或加重疾病之抗体的组合物。这类疾病的例子包括移植物抗宿主病、IgE-介导的变态反应、过敏反应、成人呼吸窘迫综合征、节段性肠炎、过敏性哮喘、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、Graves病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性自身免疫病、重症肌无力、免疫增生性疾病淋巴结病(IPL)、血管免疫增生性淋巴结病(AIL)、免疫母细胞性淋巴结病(IBL)、类风湿关节炎、糖尿病、朊病毒病、多发性硬化症、阿尔茨海默病和骨质疏松。
在相关具体实施方案中，本发明的组合物是一种免疫治疗剂，它能用来治疗和/或预防变态反应、癌症或药物成瘾。
治疗这类疾病的医学领域的技术人员应当知道如何选择用于制备组合物及在治疗变态反应的方法中使用的抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原决定簇的代表性例子包括：蜂毒磷脂酶A2，Bet v I(桦树花粉变应原)，5Dol m V(白面黄蜂毒变应原)，Der p I(屋尘螨变应原)，以及能用来引发免疫应答的各自的片段。
治疗这类疾病的医学领域的技术人员应当知道如何为治疗癌症的组合物和方法选择抗原或抗原决定簇(参见Renkvist等人，CancerImmunol.Immunother.50：3-15(2001)，在此引用作为参考)，本发明范围内包括这些抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原决定簇的代表性例子包括：Her2(乳腺癌)；GD2(神经母细胞瘤)；EGF-R(恶性胶质母细胞瘤)；CEA(甲状腺髓样癌)；CD52(白血病)；人黑素瘤蛋白gp100；人黑素瘤蛋白gp100表位，如氨基酸154-162(序列：KTWGQYWQV)、209-217(ITDQVPFSV)、280-288(YLEPGPVTA)、457-466(LLDGTATLRL)和476-485(VLYRYGSFSV)；人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1；人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1表位，如氨基酸27-35(AAGIGILTV)和32-40(ILTVILGVL)；酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白(例如TRP-1和TRP-2)；酪氨酸酶表位，如氨基酸1-9(MLLAVLYCL)和369-377(YMDGTMSQV)；NA17-A nt蛋白；NA17-A nt蛋白表位，如氨基酸38-64(VLPDVFIRC)；MAGE-3蛋白；MAGE-3蛋白表位，如氨基酸271-279(FLWGPRALV)；其它人肿瘤抗原，例如CEA表位，如氨基酸571-579(YLSGANLNL)；p53蛋白；p53蛋白表位，如氨基酸65-73(RMPEAAPPV)、149-157(STPPPGTRV)和264-272(LLGRNSFEV)；Her2/neu表位，如氨基酸369-377(KIFGSLAFL)和654-662(IISAVVGIL)；NY-ESO-1肽157-165和157-167，159-167；HPV16 E7蛋白；HPV16 E7蛋白表位，如氨基酸86-93(TLGIVCPI)；以及能够用来引发免疫应答的各自的片段。
治疗这类疾病的医学领域的技术人员应当知道如何为治疗药物成瘾、特别是精神药物成瘾的组合物和方法选择抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原决定簇的代表性例子包括，例如：阿片样物质和吗啡衍生物，如可待因、芬太尼、海洛因、吗啡和阿片；刺激剂，如苯丙胺(amphetamine)、可卡因、MDMA(亚甲二氧基去氧麻黄碱)、去氧麻黄碱、哌甲酯和烟碱；致幻剂，如LSD、麦斯卡林和赛洛西宾；以及大麻酯(cannabinoid)，如大麻(hashish)和大麻(marijuana)。
治疗这类疾病的医学领域的技术人员应当知道如何为治疗与自身抗原相关的其它疾病的组合物和方法选择抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原决定簇的代表性例子包括，例如：淋巴毒素(例如淋巴毒素α(LTα)、淋巴毒素β(LTβ))，淋巴毒素受体，核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)，血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体(VEGF-R)，白介素17和淀粉样β肽(Aβ1-42)，TNFα，MIF，MCP-1，SDF-1，Rank-L，M-CSF，血管紧张肽II，Endoglin，Eotaxin，Grehlin，BLC，CCL21，IL-13，IL-17，IL-5，IL-8，IL-15，缓激肽，抵抗素，LHRH，GHRH，GIH，CRH，TRH和胃泌素，以及能用来引发免疫应答的各自的片段。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原或抗原决定簇选自：(a)重组HIV多肽；(b)重组流感病毒多肽(例如流感病毒M2多肽或其片段)；(c)重组丙型肝炎病毒多肽；(d)重组乙型肝炎病毒多肽；(e)重组弓形体多肽；(f)重组恶性疟原虫多肽；(g)重组间日疟原虫多肽；(h)重组卵形疟原虫多肽；(i)重组三日疟原虫多肽；(j)重组乳腺癌细胞多肽；(k)重组肾癌细胞多肽；(l)重组前列腺癌细胞多肽；(m)重组皮肤癌细胞多肽；(n)重组脑癌细胞多肽；(o)重组白血病细胞多肽；(p)重组抑制蛋白(profiling)；(q)重组蜂螫变应原多肽；(r)重组坚果变应原多肽；(s)重组花粉多肽；(t)重组屋尘多肽；(u)重组猫或猫发变应原多肽；(v)重组食物变应原蛋白；(w)重组哮喘蛋白；(x)重组衣原体蛋白；(y)(a)-(x)所述任一种蛋白质的片段。
在本发明的另一个实施方案中，与病毒样颗粒偶联、融合或以其它方式附着的抗原是一种T细胞表位，它是细胞毒性或Th细胞表位。在一个更优选的实施方案中，抗原是至少两种、优选地不同表位的组合，其中所述至少两种表位直接连接或通过连接序列连接。这些表位优选地选自细胞毒性和Th细胞表位。
同样应当理解，本发明范围内也包括镶嵌病毒样颗粒，例如由分别与不同抗原和表位附着的亚单位组成的病毒样颗粒。本发明的这种组合物可以如下获得：例如，用两种相容的质粒转化大肠杆菌，这两种质粒分别编码与不同抗原和表位融合的组成病毒样颗粒的亚单位。在此情况中，镶嵌病毒样颗粒在细胞中直接装配或者在细胞裂解后装配。而且，本发明的这种组合物也可以按如下获得：不同抗原和表位的混合物与分离的病毒样颗粒附着。
本发明的抗原，特别是所述表位，可以被合成或重组表达，并且与病毒样颗粒偶联，或利用重组DNA技术与病毒样颗粒融合。抗原与病毒样颗粒附着的典型方法公开在WO 00/32227、WO 01/85208和WO 02/056905中，其公开内容在此完整地引用作为参考。
本发明也提供一种生产用来增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物包含VLP和与VLP结合的免疫刺激物、优选含非甲基化CpG的寡核苷酸，该方法包括VLP分别与免疫刺激物和寡核苷酸孵育，添加RNase，并纯化该组合物。在一个同样优选的实施方案中，该方法包括VLP与RNase孵育，分别添加免疫刺激物和寡核苷酸，并纯化该组合物。在一个实施方案中，VLP是在一种细菌表达系统中生产的。在另一个实施方案中，RNase是RNase A。
本发明还提供一种生产用来增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物包含与免疫刺激物结合、优选地与含非甲基化CpG的寡核苷酸结合的VLP，该方法包括解装配VLP，分别添加免疫刺激物和寡核苷酸，并重装配VLP。该方法还可能包括除去解装配的VLP的核酸，和/或在重装配后纯化该组合物。
本发明也提供能用来预防和/或缓解疾病的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物包含或由下列成分组成：免疫有效量的本发明的免疫增强组合物，以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。该疫苗任选地也可包含一种佐剂。
本发明还提供用来预防和/或缓解动物疾病的接种方法。在一个实施方案中，本发明提供用来预防多种动物物种(特别是哺乳动物，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等)的传染病的疫苗。该疫苗可以设计用来治疗病毒引起的感染，如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等；或细菌引起的感染，如肺炎、结核、梅毒等；或寄生虫引起的感染，如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。
在另一个实施方案中，本发明提供用来预防多种物种(特别是哺乳动物，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等)的癌症的疫苗。该疫苗可以设计用来治疗所有类型的癌症，包括但不限于淋巴瘤、癌、肉瘤和黑素瘤。
本领域技术人员会理解，当对动物施用本发明的组合物时，该组合物可以含有盐、缓冲剂、佐剂或希望用来提高组合物效力的其它物质。在大量资料中提出了适于制备药物组合物的材料的例子，包括Remington’s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack PublishingCo.，(1990))。
根据不同的宿主物种，可以用不同佐剂增强免疫应答，包括但不限于：弗氏(完全及不完全)佐剂，无机凝胶如氢氧化铝，表面活性剂如溶血卵磷脂，多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油状乳剂、匙孔戚血蓝蛋白、二硝基酚，以及可能用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂是本领域中众所周知的。可与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于：单磷酸脂免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐、MF-59和病毒体佐剂技术。佐剂也可包括这些物质的混合物。
如果接受个体能够耐受本发明的组合物的施用，则称该组合物是“药理学可接受的”。而且，本发明的组合物以“治疗有效量”施用(即产生希望的生理学效果的量)。
本发明的组合物可以通过本领域所知的多种方法施用。选择的具体方式当然取决于所选择的具体组合物、所治疗疾病的严重程度和治疗有效所需的剂量。一般来说，本发明的方法可以用医学可接受的任何给药方式实施，即，产生有效水平的活性化合物而不会引起临床上不可接受的副作用的任何方式。这些给药方式包括口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(通过粉末、软膏、液滴或皮肤帖片)、面颊或口或鼻喷雾。术语“肠胃外”在此使用时是指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液在内的给药方式。本发明的组合物也可以直接注射到淋巴结中。
用于给药的组合物成分包括无菌水(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭性包衣提高皮肤通透性并提高抗原吸收。
联合给药可以同时(例如作为混合物，或分开但同时或共同给药)或相继施用。这包括组合药剂作为治疗混合物一起施用各种形式，以及各种组合药剂分开但同时施用的方法，例如通过不同的静脉输入同一个体中。“联合”给药还包括先给予这些化合物或药剂之一，随后再给予第二种。
剂量水平取决于给药方式、患者状况和载体/佐剂制剂的质量。典型用量为每名患者约0.1μg-约20mg。优选的量是每名患者至少约1μg-100μg。优选多次给药以产生免疫，给药方案是本领域中适于所述对象的标准方案。
该组合物可以方便地制成单位剂量形式，可以按制药领域众所周知的任何方法制备。这些方法包括将本发明的组合物与构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。这些组合物通常按如下制备：使本发明的组合物均匀、密切地与一种液体载体、细碎的固体载体或这两种载体混合，然后在必要时使产品成形。
适于口服的组合物可以是分散的单位形式，如胶囊、片剂或锭剂，每个单位含有预定量的本发明的组合物。其它形式的组合物包括在水溶液或非水液体中的悬液，如糖浆、酏剂或乳剂。
其它给药系统包括定时释放、延时释放或持续释放给药系统。这些系统可以避免重复施用上述本发明的组合物，大大方便了患者和医生。有多种类型的释放给药系统可以应用，这些是本领域技术人员公知的。
本发明的其它实施方案包括生产本发明的组合物的方法，和利用所述组合物治疗癌症和变态反应的方法。
通过下列实施例和所附权利要求书，本发明的其它方面和实施方案将是显而易见的。
下列实施例只是说明性的，并非限制如所附权利要求书所限定的本发明的范围。本领域技术人员会理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的方法进行多种修改和变化。因此，本发明覆盖对本发明的这种修改和变化，只要它们属于所附权利要求书的范围及其等同物。
本文提到的所有专利和公开文献均明确地完整引用作为参考。
具体实施方式
实施例1
p33-HBcAg VLP的产生
在图1B中给出了含有LCMV肽p33的HBcAg的DNA序列。p33-HBcAg VLP(p33-VLP)如下产生：含有乙型肝炎病毒完整病毒基因组的乙型肝炎克隆pEco63购自ATCC。将编码HBcAg的基因导入表达载体pkk223.3(Pharmacia)的EcoRI/HindIII限制性酶切位点内，置于强tac启动子的控制下。通过标准PCR方法，将来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的p33肽(KAVYNFATM)与HBcAg的C端(1-185)通过一个三亮氨酸接头融合。为了良好表达而选择的大肠杆菌K802克隆用质粒转染，细胞生长并重新悬浮于5ml裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA，0.25％Tween-20，pH7.0)中。添加200μl溶菌酶溶液(20mg/ml)。超声处理后，添加4μl Benzonase和10mM MgCl2，悬液在室温下孵育30分钟，在4℃下以15000rpm离心15分钟，保留上清液。
然后，向上清液中添加20％(w/v)(0.2g/ml裂解液)硫酸铵。在冰上孵育30分钟后，在4℃以20000rpm离心15分钟，弃去上清液，沉淀重悬浮于2-3ml PBS中。20ml PBS溶液加样到SephacrylS-400凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotechnology AG)上，将级分加样到SDS-PAGE凝胶上，合并含有纯化p33-VLP的级分。将合并的级分加样到羟基磷灰石柱上。收集流出液(含有纯化的p33-VLP衣壳)(图2B)。电子显微镜检查按照标准程序进行。图2A显示一个代表性实例。
实施例2
含CpG的寡核苷酸可被包装于HBcAg VLP内
对重组p33-VLP进行非变性琼脂糖(1％)凝胶电泳，并用溴化乙锭或考马斯蓝染色，以检测RNA/DNA或蛋白质(图3)。细菌产生的VLP含有高水平的单链RNA，X-射线结晶学显示，该单链RNA可能与靠近HBcAg蛋白C端的精氨酸重复片段结合，在结构上位于VLP内部。通过VLP与RNase A孵育，污染的RNA能被轻易地消化除去。高活性RNase A的分子量约为14kDa，可能小到足以进入VLP，从而除去不希望的核糖核酸。
重组p33-VLP在RNase A消化之前添加CpG-寡核苷酸(图1A)。如图4所示，CpG-寡核苷酸的存在保持了衣壳结构，与未处理的p33-VLP相比类似的迁移证明了这一点。通过透析从未结合的寡核苷酸中纯化含CpG-寡核苷酸的VLP(用PBS稀释4500倍，24小时，使用300kDa MWCO透析膜)(图5)。
实施例3
通过用RNase除去RNA，随后向VLP内包装寡核苷酸，CpG-寡核苷酸可被包装于VLP内
p33-VLP(含有细菌单链RNA)首先与RNase A孵育，以除去RNA，第二步，向样品中添加免疫刺激性CpG-寡核苷酸(具有正常的磷酸二酯键，也有磷酸骨架的硫代磷酸酯修饰)(图6)。该实验清楚地表明，在RNA降解反应过程中不是必须同时需要CpG-寡核苷酸，而是能够在稍后添加。
实施例4
含有CpG-寡核苷酸的VLP(具有磷酸骨架的硫代磷酸酯修饰或正常的磷酸二酯键)诱导增强的抗病毒保护
小鼠皮下接种100μg含CpG-寡核苷酸的p33-VLP。在免疫前，通过透析从未结合的CpG-寡核苷酸中充分纯化p33-VLP制品(见实施例2和图5)。小鼠皮下接种单独的100μg p33-VLP、与20nmol CpG-寡核苷酸混合的100μg p33-VLP、单独的20nmol CpG-寡核苷酸，或不予处理，作为对照。21天后，用LCMV(200pfu，静脉内)攻击小鼠，5天后，如Bachmann，M.F.在“淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒特异性细胞毒性T细胞应答的评价”，《免疫学方法手册》，Lefkowitz，I.编著，Academic Press Ltd.，New York，NY(1997)p.1921所述检测脾脏中的病毒滴度。结果在图7、8、9中显示。
实施例5
BKV多瘤衣壳的产生
BK病毒(BKV)是一种无包膜双链RNA病毒，属于乳多空病毒科的多瘤病毒亚家族。VP1是主要的衣壳蛋白。VP1含362个氨基酸(图10)，大小为42kDa。当在大肠杆菌、昆虫细胞或酵母中生产时，VP1自发形成衣壳结构(Salunke D.M.等人，Cell 46(6)：895-904(1986)；Sasnauskas K.等人，Biol.Chem.380(3)：381-6(1999)；Sasnauskas K.等人，第三届国际“作为疫苗的病毒样颗粒”会议，柏林，2001年9月26-29日；Touze，A.等人，J Gen Virol.82(Pt 12)：3005-9(2001))。该衣壳被组织为72 VP1五聚体，形成二十面体结构。衣壳的直径约为45nm。
实施例6
荧光素标记的含CpG的寡核苷酸可被包装于BKV VLP内
在酵母中生产的VLP含有少量RNA，该RNA可被容易地消化，因此通过VLP与RNase A孵育除去。高活性RNase A酶的分子量约为14kDa，它足够消，可以进入VLP，从而除去不需要的核糖核酸。重组产生的BKV VLP在PBS缓冲液pH7.2中浓缩为1mg/ml，在存在或不存在RNase A(200μg/ml，Roche Diagnostics Ltd，Switzerland)的条件下37℃孵育3小时。在RNase A消化后，向BKV VLP中添加75nmol/ml荧光素标记的硫代磷酸酯CpG-FAM寡核苷酸，并在37℃下孵育3小时。随后BKV VLP在37℃下被DNaseI消化3小时(40μ/mlAMPD1，Sigma，Divison of Fluka AG，Switzerland)，或者不经DNaseI消化即加样。样品中添加6倍浓缩的DNA加样缓冲液(10mM Tris pH7.5，10％v/v甘油，0.4％橙黄G)，在0.8％非变性tris-乙酸pH7.5琼脂糖凝胶中65伏电压下电泳1小时。
图12显示对照孵育或RNase A消化，并随后与荧光CpG-FAM寡核苷酸(图1A的寡核苷酸，5’-荧光素标记)孵育后，非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳中的BKV VLP，用溴化乙锭染色后或不用溴化乙锭染色。在溴化乙锭存在下可以检测到核酸，而在不含溴化乙锭时，紫外线激发使CpG-FAM中的荧光素标记产生荧光。
RNase A消化使VLP的迁移改变，这在考马斯蓝染色的琼脂糖凝胶上可见，这可能是由于缺乏RNA的负电荷所致(图13和14)。添加CpG-寡核苷酸恢复了BKV VLP的迁移，并且产生与未处理的VLP中存在的RNA带同样迁移的荧光带。这清楚地表明，CpG-FAM寡核苷酸已经被包装于VLP内。
实施例7
大的双链寡核苷酸可被包装于BKV VLP内
为了导入双链(ds)核苷酸序列，向RNase A处理过的重组BKVVLP(实施例6)中添加50μg/ml(ds)DNA片段(246bp长，图11)，并在37℃下孵育3小时。样品中添加6倍浓缩的DNA加样缓冲液(10mM Tris pH7.5，10％v/v甘油，0.4％橙黄G)，在0.8％非变性tris-乙酸pH8.0琼脂糖凝胶中65伏电压下电泳1小时。
图13显示对照孵育或RNase A消化并随后与(ds)DNA孵育后，非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳中的BKV VLP(15μg)，用溴化乙锭或考马斯蓝染色，以检测RNA/DNA或蛋白质的存在与否。在溴化乙锭存在下，包装的DNA分子可见，是与考马斯蓝显色的VLP带同样迁移的一条带。
添加(ds)DNA恢复了BKV VLP的迁移，并且产生与考马斯蓝染色的VLP同样迁移的DNA带。这清楚地表明，(ds)DNA已经被包装于BKV VLP内。
实施例8
含CpG的寡核苷酸能够被包装于BKV VLP内
为了导入免疫刺激性CpG-寡核苷酸，向RNase A处理过的重组BKV VLP(实施例6)中添加150nmol/ml具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架的CpG-寡核苷酸，并在37℃下孵育3小时。使用300kDaMWCO透析膜(Spectrum Medical industries Inc.，Houston，USA)，将用于免疫小鼠的VLP制剂用PBS pH7.2充分透析(10000倍稀释)24小时，以除去RNase A和过量的CpG-寡核苷酸。样品中添加6倍浓缩的DNA加样缓冲液(10mM Tris pH7.5，10％v/v甘油，0.4％橙黄G)，在0.8％非变性tris-乙酸pH7.5琼脂糖凝胶中65伏电压下电泳1小时。
图14显示对照孵育或RNase A消化并随后与CpG-寡核苷酸(具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架)孵育后，非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳中的BKV VLP(15μg)，用溴化乙锭(A)或考马斯蓝(B)染色，以检测RNA/DNA或蛋白质的存在与否，以及透析后未结合的CpG-寡核苷酸的还原。图中可见未结合的CpG-寡核苷酸，为一条低分子量溴化乙锭染色带。
添加CpG-寡核苷酸恢复了BKV VLP的迁移，并且产生与考马斯蓝染色的VLP同样迁移的DNA带。这清楚地表明，CpG-寡核苷酸已经被包装于VLP内。
实施例9
含CpG-寡核苷酸(磷酸骨架上有硫代磷酸酯修饰)的VLP诱发增强的Th1定向免疫应答
雌性BALB/C小鼠(每组3只小鼠)皮下注射10μg含硫代磷酸酯CpG-寡核苷酸的BKV VLP(图1A)。作为对照，小鼠皮下注射溶于200μl PBS pH7.2中的10μg单独的RNase处理的BKV VLP或与0.3nmol或20nmol硫代磷酸酯CpG-寡核苷酸混合的BKV VLP，或者不予处理。BKV VLP如实施例8所述制备，在免疫之前通过透析从未结合的CpG-寡核苷酸中充分纯化。免疫后第14天，采集血液，测定对BKV VLP的IgG1和IgG2a抗体应答。
图15显示免疫后第14天的对BKV VLP的IgG1和IgG2a抗体应答。与用相同量(0.3nmol)的与BKV VLP混合的CpG-寡核苷酸或单独用BKV VLP免疫相比，用RNase A处理的含硫代磷酸酯CpG-寡核苷酸的BKV VLP免疫，IgG1滴度降低和抗BKV VLP IgG2a滴度增加。用与20nmol硫代磷酸酯CpG-寡核苷酸混合的BKV VLP免疫的小鼠显示极低的IgG1滴度和高IgG2a滴度。与对照相比，IgG1滴度降低，IgG2a滴度升高，这说明包装于BKV VLP中的硫代磷酸CpG-寡核苷酸诱发了Th1细胞定向的免疫应答。图15清楚显示，与仅与CpG-寡核苷酸混合的BKV VLP相比，含有包装于颗粒内的含CpG-寡核苷酸的BKV VLP具有更好的效果。
实施例10
通过首先RNase消化，随后添加dsDNA，线性双链DNA(dsDNA)可以被包装于VLP内
p33-VLP制剂(含有细菌RNA)(实施例1)首先与RNase A孵育，以除去RNA，第二步，向样品中添加线性dsDNA(350bp长)(图16)。包装有dsDNA的p33-VLP的迁移类似于含有RNA的p33-VLP之一。该实验表明，长度至少为350碱基对的线性dsDNA能够被包装于病毒样颗粒内。
实施例11
免疫刺激性核酸能够被包装于含有与抗原融合的融合蛋白的HBcAg VLP内
当通过表达乙型肝炎核心抗原融合蛋白HBc33(实施例1)或与肽P1A融合的融合蛋白(HBcP1A)，在大肠杆菌中生产HBcAg VLP时，它含有RNA，该RNA可被消化，因此通过VLP与RNase A孵育将其除去。
基因P1A编码由肥大细胞瘤肿瘤细胞系P815表达的一种蛋白质。显性CTL表位，被称为P1A肽，与MHC I类(Ld)结合，复合物被特异CTL克隆识别(Brndle等人，1998，Eur.J.Immunol.28：4010-4019)。利用标准分子生物学技术，使用合适的引物，通过PCR进行肽P1A-1(LPYLGWLVF)与HBcAg C端(氨基酸185，参见实施例1)的融合。将一个三亮氨酸接头克隆到HBcAg与肽序列之间。如实施例1所述进行表达。HBcAg与P1A的融合蛋白被称为HBcP1A，在大肠杆菌中表达时形成衣壳，可以按类似于实施例1所述的方法将其纯化。
酶促RNA水解：重组产生的HBcAg-p33(HBc33)和HBcAg-P1A(HBcP1A)VLP，在1×PBS缓冲液(KCl 0.2g/l，KH2PO4 0.2g/l，NaCl8g/l，Na2HPO4 1.15g/l)pH7.4中浓度为1.0mg/ml，在300μg/mlRNase A(Qiagen AG，Switzerland)存在下，在恒温混匀器中以650rpm37℃孵育3小时。
免疫刺激性核酸的包装：用RNase A消化RNA后，向HBcAg-p33VLP中添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpG、NKCpG、G10-PO(表I)。类似地，分别以130nmol/ml或1.2nmol/ml的浓度添加150mer单链Cy150-1和253mer双链dsCyCpG-253，它们均含有多个拷贝的CpG基序，在恒温混匀器中37℃孵育3小时。通过将CyCpG的双链多聚体克隆到pBluescript KS-的EcoRV位点内产生双链CyCpG-253DNA。在大肠杆菌XL1-blue中产生并用Qiagen Endofree质粒Giga试剂盒分离获得的质粒，用限制性内切核酸酶XhoI和XbaI消化，产生的限制酶切产物通过琼脂糖电泳分离。253bp的插入片段通过电洗脱和乙醇沉淀分离。通过对两条链测序检验其序列。
表I：实施例中使用的免疫刺激性核酸的序列
小写字母表示通过硫代磷酸酯键连接的脱氧核苷酸，而大写字母表示通过磷酸二酯键连接的脱氧核苷酸
 CyCpGpt  tccatgacgttcctgaataat
 CyCpG  TCCATGACGTTCCTGAATAAT
 B-CpGpt  tccatgacgttcctgacgtt
 B-CpG  TCCATGACGTTCCTGACGTT
 NKCpGpt  ggGGTCAACGTTGAggggg
 NKCpG  GGGGTCAACGTTGAGGGGG
 CyCpG-rev-pt  attattcaggaacgtcatgga
 g10gacga-PO(G10-PO)  GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG
 g10gacga-PS(G10-PS)  gggggggggggacgatcgtcgggggggggg
 (CpG)20OpA  CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACAGCAT
 Cy(CpG)20  TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCG
 Cy(CpG)20-OpA  TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACAGC
 CyOpA  TCCATGACGTTCCTGAATAATAAATGCATGTCAAACAGCAT
 CyCyCy  TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAAT
 Cy150-1  TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTGGATGACGTTGGTGAATTTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCTGACGTTCCTGAATAATTCC
 dsCyCpG-253(未显示互补链)  CTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTATTCATGACTTCCTGAATAATTCCATGACGTTGGTGAATAATTCCGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAAATCCAATCAAGCTTATCGATACCGTCGACC
DNase I处理：包装的HBcAg-p33 VLP随后在37℃下用DNase I消化(5U/ml)3小时(DNase I，不含RNase，Fluka AG，Switzerland)，并用300kDa MWCO透析膜(Spectrum Medical industries Inc.，Houston，USA)用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液为200倍体积)24小时，除去RNase A和过量的CpG-寡核苷酸。
Benzonase处理：由于某些单链寡脱氧核苷酸对DNase I处理有部分抗性，利用Benzonase处理从制品中除去游离的寡核苷酸。添加100-120U/ml Benzonase(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)和5mMMgCl2，在透析前37℃孵育3小时。
透析：使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum Medical industriesInc.，Houston，US)，在小鼠免疫实验中使用的包装有免疫刺激性核酸的VLP制剂用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液为200倍体积)24小时，除去添加的酶和游离的核酸。
包装的分析：包装的免疫刺激性核酸的释放：向50μl衣壳溶液中添加1μl蛋白酶K(600U/ml，Roche，Mannheim，Germany)、3μl10％SDS-溶液和6μl 10倍蛋白酶缓冲液(0.5M NaCl，50mM EDTA，0.1M Tris pH 7.4)，随后在37℃下孵育过夜。VLP在该条件下完全水解。在65℃下加热20分钟灭活蛋白酶K。向25μl衣壳中添加1μlRNase A(Qiagen，100μg/ml，稀释250倍)。2-30μg衣壳与1倍体积的2×加样缓冲液(1×TBE，42％w/v尿素，12％w/v Ficoll，0.01％溴酚蓝)混合，95℃加热3分钟，加样到10％(对于约20nt长的寡核苷酸)或15％(对于＞40mer的核酸)TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上。此外，样品也可以与6×加样染料(10mM Tris pH7.5，50mM EDTA，10％v/v甘油，0.4％橙黄G)一起加样到1％琼脂糖凝胶上。TBE/尿素凝胶用CYBRGold染色，琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色。
图17、18和19显示B-CpG、NKCpG和G10-PO寡核苷酸被包装于HBc33内。在RNase A处理后，VLP中的RNA内容物极大减少(图17A，18A，19A)，而大多数衣壳作为一条缓慢迁移的弥散带迁移，这可能是由于除去了带负电荷的RNA(图17B，18B，19B)。与过量寡核苷酸孵育后的衣壳比RNase A处理的衣壳含有更高含量的核酸，因此以类似于未处理衣壳的速度迁移。另外用DNase I或Benzonase降解游离的寡核苷酸，而包装于衣壳内的寡核苷酸不被降解，清楚地显示了寡核苷酸的包装。在某些情况下，在DNase I/Benzonase处理并透析后，通过蛋白酶K消化(如实施例15和16所述)证实寡核苷酸的包装。利用上述方法从衣壳中释放的寡核苷酸与用于包装的寡核苷酸大小相同，这一发现清楚地证实了寡核苷酸的包装(图17C，18C)。
图20显示大的单链寡核苷酸Cy150-1被包装于HBc33内。Cy150-1含有7.5个重复的CyCpG，按照标准寡核苷酸合成法(IBA，Gttingen，Germany)合成。衣壳中的RNA内容物在RNase A处理后极大减少，而大多数衣壳以缓慢迁移的弥散条带迁移(图20A，B)。衣壳用4倍体积的水稀释，并浓缩到1mg/ml。与过量的Cy150-1孵育后，衣壳含有大量核酸，因此以类似于未处理衣壳的速度迁移。另外用DNase I处理降解游离的、未包装的寡核苷酸，而衣壳内的寡核苷酸不被降解(图20A)。在TBE/尿素加样缓冲液中95℃加热3分钟，从包装的VLP中释放DNase I抗性的核酸，这表明存在150mer(图20C)。
图21显示NKCpGpt被包装于HBcP1A内。RNase处理减少核酸内容物，并使衣壳的迁移减慢。添加NKCpGpt可恢复衣壳中的核酸内容物并使迁移变快。
图17显示用1％琼脂糖凝胶分析B-CpG被包装于HBc33 VLP内，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是50μg下列样品：1.未处理的HBc33 VLP；2.RNase A处理的HBc33 VLP；3.RNase A处理并包装有B-CpG的HBc33 VLP；4.RNase A处理、包装有B-CpG并用DNase I处理的HBc33 VLP；5.RNase A处理、包装有B-CpG、DNase I处理并透析的HBc33 VLP；6.1kb MBIFermentas DNA标准分子量片段。(C)显示用1.5％琼脂糖凝胶溴化乙锭染色分析从VLP中提取的包装的oligo的量：加样到凝胶上的是下列样品：1.0.5nmol B-CpG对照；2.0.5nmol B-CpG对照；3.酚/氯仿抽提后HBc33中的B-CpG oligo内容物；4.酚/氯仿抽提并且用RNase A处理后HBc33中的B-CpG oligo内容物；5.酚/氯仿抽提并且用DNase I处理后HBc33中的B-CpG oligo内容物；6.空；7.MBIFermentas DNA标准分子量片段。
图18显示用1％琼脂糖凝胶分析NKCpG被包装于HBc33 VLP内，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.未处理的HBc33 VLP；2.RNase A处理的HBc33 VLP；3.RNase A处理并包装有NKCpG的HBc33 VLP；4.RNase A处理、包装有NKCpG、DNase I处理并且透析的HBc33 VLP；5.1kb MBIFermentas DNA标准分子量片段。(C)显示用15％TBE/尿素凝胶CYBRGold染色分析从VLP中提取的包装的寡核苷酸的量。加样到凝胶上的是下列样品：1.蛋白酶K消化及RNase A处理后HBc33中的NKCpG oligo内容物；2.20pmol NKCpG对照；3.10pmol NKCpG对照；4.40pmol NKCpG对照。
图19显示用1％琼脂糖凝胶分析g10gacga-PO被包装于HBc33VLP内，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段；2.未处理的HBc33 VLP；3.RNase A处理的HBc33 VLP；4.RNase A处理并包装有g10gacga-PO的HBc33 VLP；5.RNase A处理、包装有g10gacga-PO、Benzonase处理并透析的HBc33 VLP。
图20显示用1％琼脂糖凝胶分析CyCpG-150被包装于HBc33VLP内，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段；2.未处理的HBc33 VLP；3.RNase A处理的HBc33 VLP；4.RNase A处理并包装有CyCpG-150的HBc33 VLP；5.RNase A处理、包装有CyCpG-150、DNase I处理并透析的HBc33 VLP；6.RNase A处理、包装有CyCpG-150、DNase I处理并透析的HBc33 VLP。(C)显示用10％TBE/尿素凝胶CYBRGold染色分析从VLP中提取的包装的oligo的量。加样到凝胶上的是下列样品：1.20pmol CyCpG-150对照；2.10pmol CyCpG-150对照；3.4pmol CyCpG-150对照；4.应用1倍体积的TBE/尿素加样缓冲液，在95℃下加热3分钟之后，4μgHBc33中CyCpG-150oligo的含量。
图21显示用1％琼脂糖凝胶分析NKCpGpt被包装于HBcP1AVLP内，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段；2.未处理的HBcP1A VLP；3.RNase A处理的HBcP1A VLP；4.RNase A处理并包装有NKCpGpt的HBcP1A VLP。
实施例12
免疫刺激性核酸能够被包装到与抗原偶联的HBcAg-wt内
重组产生的HBcAg-wt VLP在与来自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的肽p33(CGG-KAVYNFATM)偶联后进行包装。为了偶联，HBcAg-wt VLP(2mg/ml)在恒温混匀器中用25×摩尔过量的SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚氨基-丙酰氨基)己酸]，Pierce)25℃衍化1小时。使用MWCO 10,000kD透析膜，将衍化的VLP在4℃下用Mes缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)pH7.4透析2次各2小时。随后在恒温混匀器中25℃孵育2小时，VLP(50μM)与p33肽(250μM)的N端半胱氨酸偶联。样品用1×PBS pH7.4充分透析(MWCO 300.000)，除去不需要的游离肽。
图22显示用SMPH衍化并与p33肽偶联的HBcAg-wt VLP的SDS-PAGE分析。样品通过16％SDS-PAGE分析，并用考马斯蓝染色。HBcAg-wt可见为一条21kD蛋白条带。由于SMPH的分子量低，衍化产物仅仅略微增大，不能通过SDS-PAGE鉴别。单独的肽可见为一条3kD条带，而偶联产物，被称为HBx33，在约24kD处显示第二条强条带，占总HBcAg-wt的50％以上。
酶促RNA水解：在RNase A(300μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)存在下，用4倍体积的H2O稀释HBx33 VLP(0.5-1.0mg/ml，1×PBS缓冲液pH7.4)，使盐浓度降低至0.2×PBS的终浓度，并在恒温混匀器中以650rpm 37℃孵育3小时。
免疫刺激性核酸的包装：RNase A消化后，用Millipore Microcon或Centriplus浓缩器浓缩HBx33 VLP，然后添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpGpt，在恒温混匀器中在0.2×PBS pH7.4中37℃孵育3小时。随后，反应混合物在37℃下用DNaseI消化(5U/ml)3小时(DNaseI，不含RNase，Fluka AG，Switzerland)。使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，USA)，将用于免疫小鼠的VLP制剂用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液为200倍体积)24小时，除去RNase A和过量的CpG-寡核苷酸。图23显示RNase处理减少了衣壳的核酸内容物，并且减缓其迁移。添加B-CpGpt可恢复衣壳的核酸内容物并使迁移加快。DNaseI仅消化游离寡核苷酸，而包装的寡核苷酸在透析后仍在VLP中保留(图23)。
图22显示与HBc VLP偶联的p33的SDS-PAGE分析，考马斯蓝染色。加样到凝胶上的是下列样品：1.NEB预染色的蛋白质标准，宽范围(#7708S)，10μl；2.CGG-p33肽；3.SMPH衍化的HBc VLP，透析前；4.SMPH衍化的HBc VLP，透析后；5.与CGG-p33偶联的HBc VLP，上清液；6.与CGG-p33偶联的HBc VLP，沉淀。
图23显示用1％琼脂糖凝胶分析B-CpGpt被包装于HBx33 VLP内，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是50μg下列样品：1.未处理的HBx33 VLP；2.RNase A处理的HBx33 VLP；3.RNase A处理并包装有B-CpGpt的HBx33 VLP；4.RNase A处理、包装有B-CpGpt并用DNase I处理的HBx33 VLP；5.RNase A处理、包装有B-CpGpt、DNase I处理并透析的HBx33 VLP；6.1kb MBIFermentas DNA标准分子量片段。
实施例13
免疫刺激性核酸能够被包装于与抗原偶联的QβVLP内
p33肽与QβVLP的偶联：
在与含有N端CGG和C端GGC延伸(CGG-KAVYNFATM和KAVYNFATM-GGC)的p33肽偶联后使用重组产生的QβVLP。重组产生的QβVLP在25℃下用10摩尔过量的SMPH(Pierce)衍化0.5小时，随后在4℃下用20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.2透析，除去未反应的SMPH。添加5倍摩尔过量的肽，并且在30％乙腈存在下在恒温混匀器中25℃反应2小时。图24显示SDS-PAGE分析，证明了由一个、两个或三个与Qβ单体偶联的肽组成的多个偶联带(箭头，图24)。
当通过表达噬菌体Qβ衣壳蛋白在大肠杆菌中产生QβVLP时，它含有RNA，该RNA能被消化，因此通过VLP与RNase A孵育除去。
低离子强度和低Qβ浓度使RNase A水解QβVLP中的RNA：
在20mM Hepes/150mM NaCl缓冲液(HBS)pH7.4中浓度为1.0mg/ml的QβVLP，通过添加RNase A(300μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)直接消化，或者用4倍体积的H2O稀释至终浓度为0.2×HBS，然后与RNase A(60μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)孵育。在恒温混匀器中以650rpm 37℃孵育3小时。图25证实，在1×HBS中只观察到极弱的RNA内容物的减少，而在0.2×HBS中大多数RNA均水解。与之一致的是，向1×HBS中添加RNase A后衣壳的迁移不改变，而向0.2×HBS中添加RNase后迁移较慢(图25B，D)。
低离子强度增加核酸在QβVLP中的包装
在0.2×HBS中RNase A消化后，用Millipore Microcon或Centriplus浓缩器将QβVLP浓缩至1mg/ml，其等份样品用1×HBS或0.2×HBS透析。向QβVLP中添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpG，在恒温混匀器中37℃孵育3小时。随后，在37℃下用Benzonase消化(100U/ml)QβVLP 3小时。利用1％琼脂糖凝胶在溴化乙锭或考马斯蓝染色后分析样品。图26显示，在1×HBS中只有极少量的寡核苷酸能被包装，而在0.2×HBS中可检测到强溴化乙锭染色带，它与衣壳的考马斯蓝染色位置重叠。
不同免疫刺激性核酸能够被包装于QβVLP中：
在0.2×HBS中RNase A消化后，用Millipore Microcon或Centriplus浓缩器将QβVLP浓缩至1mg/ml，并添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpGpt、g10gacga和253mer dsCyCpG-253(表I)，在恒温混匀器中37℃孵育3小时。随后，在37℃下用DNaseI(5U/ml)或Benzonase消化(100U/ml)QβVLP 3小时。利用1％琼脂糖凝胶在溴化乙锭或考马斯蓝染色后分析样品。图27显示，不同的核酸B-CpGpt、g10gacga和253mer dsDNA能够被包装于Qbx33内。包装的核酸对DNaseI消化有抗性，在透析过程中保持包装状态(图27)。通过蛋白酶K消化释放核酸，随后进行琼脂糖电泳和溴化乙锭染色，证实B-CpGpt的包装(图27C)。
图24显示与QβVLP偶联的p33在考马斯蓝染色后的SDS-PAGE分析。加样的是下列样品：(A)1.NEB预染色的蛋白质标准，宽范围(#7708S)，10μl；2.QβVLP，14μg；3.SMPH衍化的QβVLP，透析后；4.与CGG-p33偶联的QβVLP，上清液。(B)1.NEB预染色的蛋白质标准，宽范围(#7708S)，10μl；2.QβVLP，10μg；3.与GGC-p33偶联的QβVLP，上清液。
图25显示用1％琼脂糖凝胶分析，在低及高离子强度下RNase A对QβVLP中RNA的水解，用溴化乙锭(A，C)和考马斯蓝(B，D)染色。加样到凝胶上的是下列样品：(A，B)1.MBI Fermentas 1kb DNA标准分子量片段；2.未处理的QβVLP；3.在1×HBS缓冲液pH7.2中用RNase A处理的QβVLP。(C，D)1.MBI Fermentas DNA1kb标准分子量片段；2.未处理的QβVLP；3.在0.2×HBS缓冲液pH7.2中用RNase A处理的QβVLP。
图26显示用1％琼脂糖凝胶分析，在低及高离子强度下B-CpG在QβVLP内的包装，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是下列样品：1.未处理的QβVLP；2.RNase A处理的QβVLP；3.RNase A处理、在0.2×HBS缓冲液pH7.2中包装B-CpG并用Benzonase处理的QβVLP；4.RNase A处理、在1×HBS缓冲液pH7.2中包装B-CpG并用Benzonase处理的HBx33 VLP。
图27显示用1％琼脂糖凝胶分析B-CpGpt在Qbx33 VLP内的包装，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是50μg下列样品：1.未处理的Qbx33 VLP；2.RNase A处理的Qbx33 VLP；3.RNase A处理并包装有B-CpGpt的Qbx33 VLP；4.RNase A处理、包装有B-CpGpt、DNase I处理并透析的Qbx33 VLP；5.1kb MBIFermentas DNA标准分子量片段。(C)显示通过CYBR Gold染色15％TBE/尿素分析从VLP中提取的包装的oligo的量。加样到凝胶上的是下列样品：1.蛋白酶K消化和RNase A处理后2μg Qbx33 VLP中的BCpGpt oligo内容物；2.20pmol BCpGpt对照；3.10pmol BCpGpt对照；4.5pmol BCpGpt对照。
图27D和E显示用1％琼脂糖凝胶分析g10gacga-PO在Qbx33VLP内的包装，用溴化乙锭(D)和考马斯蓝(E)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.MBI Fermentas 1kb DNA标准分子量片段；2.未处理的Qbx33 VLP；3.RNase A处理的Qbx33 VLP；4.RNaseA处理并包装有g10gacga-PO的Qbx33 VLP；5.RNase A处理、包装有g10gacga-PO、Benzonase处理并透析的Qbx33 VLP。
图27E和F显示用1％琼脂糖凝胶分析dsCyCpG-253在Qbx33VLP内的包装，用溴化乙锭(E)和考马斯蓝(F)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.MBI Fermentas 1kb DNA标准分子量片段；2.未处理的Qbx33 VLP；3.RNase A处理的Qbx33 VLP；4.RNase A处理、包装有dsCyCpG-253并用DNaseI处理的Qbx33 VLP；5.RNaseA处理、包装有dsCyCpG-253、用DNaseI处理并透析的Qbx33 VLP。
实施例14
Qβ解装配、重装配和免疫刺激性核酸的包装
QβVLP的解装配和重装配
解装配：根据分光光度测定，70mg冻干纯QβVLP具有约35mg的蛋白质含量，使用下列三个公式获得的平均结果：1.(183×OD230nm-75.8×OD260nm)×体积(ml)-2.((OD235nm-OD280nm)/2.51)×体积-3.((OD228.5nm-OD234.5nm)×0.37)×体积。冻干的纯QβVLP溶解于7ml 6MGuHCl中，4℃孵育过夜。该溶液以6000rpm澄清15分钟(Eppendorf5810R，固定角度转子F34-6-38，在下列所有步骤中使用)。弃去极微量的沉淀，上清液用200-300ml NET缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.8，5mM EDTA，150mM NaCl)在3天内透析5次。此外，上清液也在3-4天内以连续方式用1.51NET缓冲液透析。获得的上清液以12000rpm离心20分钟。沉淀重新溶解于2-3ml 8M尿素中，上清液中加入固体硫酸铵至60％饱和度以沉淀上清液。向预先溶解于尿素中的沉淀内添加饱和硫酸铵溶液至60％饱和，使该溶液在4℃下沉淀4天，随后以12000rpm离心20分钟。这种沉淀，以及最初的上清液的沉淀，在总体积为3ml的7M尿素，10mM DTT中溶解并混合。该物质加样到Sephadex G75柱上，用7M尿素，10mM DTT以2ml/h的流速洗脱。分离到两个峰。高分子量峰早于较低表观分子量峰。用溶于相同洗脱缓冲液的胰凝乳蛋白酶校准该柱显示，第二个峰的表观分子量与二聚体形式的Qβ外壳蛋白一致。合并含有该二聚体物质的级分，用硫酸铵沉淀(2天，4℃)。用几滴水洗涤沉淀，再次离心，溶解于2ml 7M尿素，10mM DTT中。然后用短(1.5×27cm)Sepharose4B柱纯化该物质。合并从柱上洗脱下来的一个峰和级分，获得10ml体积的蛋白质制品，280nm与260nm的吸光度比为0.68/0.5，产生约450nmol的Qβ外壳蛋白(考虑到VLP中有180个亚单位，重装配后获得2.5nmol最大量的VLP)，蛋白质浓度为630μg/ml(用上述分光光度法计算)。
重装配：向10ml二聚体级分中添加β-巯基乙醇至终浓度为10％，并添加300μl含有12.3nmol寡核苷酸的(CpG)20OpA寡脱氧核苷酸溶液。重装配混合物首先在4℃下用30ml含有10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析2小时，然后在4℃下以连续方式，以8ml NET缓冲液/h的流速透析4天。然后重装配混合物用水透析脱盐，其中更换6次缓冲液(4×100ml，2×1升)。
280nm与260nm的吸光度比为0.167/0.24。蛋白质冷冻干燥。干燥的蛋白质再溶解于水中，用Beckman L 8-80离心机通过蔗糖梯度超速离心纯化，使用SW 50.1转子在4℃以22000rpm离心17h。蔗糖梯度纯化如下进行：5层1ml下列蔗糖浓度(w/v)的溶液被分层装到一个离心管内：50％，43％，36％，29％和22％。这样形成的连续层在4℃下放置过夜。0.5ml蛋白质样品在梯度上分层，如上所述离心17小时。从离心管底部开始洗脱梯度，5ml梯度分成16个约300μl的级分。梯度中的级分通过SDS-PAGE(图28)和Ouchterlony试验分析。级分6-9含有Qβ外壳蛋白，在Ouchterlony试验中产生QβVLP所特有的沉淀带。具有较低表观密度并且含有Qβ蛋白的级分11-15在Ouchterlony试验中不含衣壳带。重装配的Qβ与野生型Qβ在实验误差允许范围内具有相同的表观密度。合并蔗糖梯度的级分6-9，用水透析，冻干。然后溶解该物质进行电子显微镜(EM)分析(图29)和Ouchterlony试验(图30A和B)。EM方法如下：蛋白质悬液吸附到覆盖碳-聚醋酸甲基乙烯脂的网格上，用2％磷钨酸(pH 6.8)染色。用JEM 100C(JEOL，日本)电子显微镜，以80kV的加速电压检查该网格。用Kodak电子成像胶片进行照相记录(负片)，在Kodak Polymax相纸上洗印负片获得电子显微照片。这两种方法都表明，重装配的VLP具有与完整的QβVLP相同的大分子性质。另外，纯化的重装配QβVLP展示的二硫键模式与未处理的QβVLP所展示的二硫键模式无法区别，具有五聚体和六聚体的典型模式(图31A)。
核酸内容物的分析：用胰DNase I如下消化重装配的QβVLP。向200μl 0.5mg/ml与(CpG)20OpA寡核苷酸重装配的QβVLP溶液中添加20μl 1U/μl DNase I(Fluka)溶液和22μl DNase I缓冲液(20mMMgCl2，200mM Tris，pH8.3)。反应混合物在37℃下孵育2小时30分钟。随后通过酚/氯仿抽提分离样品中的核酸内容物，加样到2％琼脂糖凝胶上，用溴化乙锭染色(图31B)。在凝胶上检测到一条包装的寡脱氧核苷酸大小的带。还可见一条以较高表观分子量迁移的带。我们不能排除能在此高度产生一条带的(CpG)20OpA寡脱氧核苷酸多聚体的存在。凝胶显示，在重装配的QβVLP中含有DNase I保护的正确大小的寡脱氧核苷酸，因为该寡脱氧核苷酸随后能被DNase I消化，而不被RNase A消化。因此，在最初解装配VLP、从核酸中纯化解装配的外壳蛋白、随后在寡脱氧核苷酸存在下VLP重装配之后，寡脱氧核苷酸能够被成功包装于QβVLP中。
图28显示SDS-PAGE分析蔗糖梯度离心产生的级分。加样于凝胶上的是下列样品。1-10道：蔗糖梯度超速离心的级分6-15。
图29显示(A)完整的QβVLP以及(B)在寡核苷酸(CpG)20OpA存在下解装配并重装配、随后通过蔗糖梯度超速离心纯化的QβVLP的EM照片。观察到密集覆盖的衣壳，这些衣壳显示与完整的QβVLP相同的结构特征和性质。
图30显示重新构建的QβVLP的Ouchterlony分析(免疫扩散)。在图30A中，与寡核苷酸(CpG)20OpA重装配的QβVLP在完整的QβVLP旁加样。两条特有的沉淀带用黑色箭头指出。这两条沉淀带是并行的，表明重装配的QβVLP与完整的QβVLP一样扩散。在图30B中，样品1是在核糖体RNA存在下重装配的QβVLP，而样品2是完整的QβVLP，样品3是与寡核苷酸(CpG)20OpA重装配的QβVLP。沉淀带用白色箭头指出。
图31A显示通过非还原SDS-PAGE分析未处理的和重装配的QβVLP。QβVLP的五聚体和六聚体用箭头指出。
图31B显示与寡核苷酸(CpG)20OpA重装配的QβVLP经DNase I消化后提取的核苷酸内容物的琼脂糖凝胶电泳分析。核酸内容物未经处理(1道)，或者随后用DNase I消化(2道)或用RNase A消化(3道)；33μg重装配的QβVLP被加样到每个道中。300ng 50bp寡核苷酸加样到第4道，而10μl GeneRuler 100bp DNA标准分子量片段+标记物(MBI Fermentas)加样到第5道。
实施例15
Qβ的解装配以及与不同免疫刺激性核酸的重装配
QβVLP的解装配以及与不同序列的寡脱氧核苷酸的重装配
QβVLP的解装配基本如实施例1所述进行，不同之处在于用8M尿素代替7M尿素来重悬浮硫酸铵沉淀。
QβVLP与oligo CyOpA、CyCyCy、(CpG)20-OpA和CyCpG的重装配除下列变化之外基本如实施例1所述进行。在向透析袋中的二聚体溶液中添加寡脱氧核苷酸溶液之前，在程序中增加一个透析步骤，在4℃下用NET缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.8，5mM EDTA，150mMNaCl)中的10％β-巯基乙醇透析1小时。然后将寡脱氧核苷酸加到二聚体溶液中，如前所述，大约获得比衣壳(180个亚单位)10倍摩尔过量的寡核苷酸。重装配混合物首先在4℃下用30ml含10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析1小时，然后在4℃下以连续模式，以8mlNET缓冲液/h的流速透析4天。在重装配反应结束时采集QβVLP与寡脱氧核苷酸CyOpA的重装配反应的样品进行EM分析(图32)。采用上述使用磷钨酸的EM法。重装配混合物然后用水透析脱盐并干燥。
干燥的蛋白质重新溶解于水，通过蔗糖梯度超速离心纯化。对纯化的重装配的QβVLP也进行EM分析(图33A-D)。电子显微照片显示，重装配的VLP具有与完整的QβVLP相同的大分子特征。纯化可显著富集重装配颗粒制剂。因此，QβVLP与不同长度和序列的寡脱氧核苷酸成功重装配。
p33肽与重装配的QβVLP的偶联：与寡脱氧核苷酸CyOpA重装配的QβVLP以1.5mg/ml的浓度在26℃下20mM Hepes pH7.4中与终浓度为536μM的交联剂SMPH(由DMSO中的贮存液稀释)反应35分钟。衍化的QβVLP用一千倍体积的20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4透析2次各2小时。随后，透析的浓度为1.4mg/ml的衍化QβVLP在15℃下20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4中与终浓度为250μM的p33GGC肽(序列：KAVYNFATMGGC)反应2小时。图34的凝胶显示p33肽与QβVLP成功偶联。对应于每个亚单位偶联一个、分别两个肽的偶联带在图中用箭头指出。
核酸内容物的分析：重装配并偶联的QβVLP中的核酸内容物通过蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提及随后将提取的寡核苷酸加样到TBE/尿素PAGE凝胶上分析。分析方法如下。向25μl重装配的QβVLP(0.5-1mg/ml)中添加0.5μl蛋白酶K、1.5μl 10％SDS和3μl 10×蛋白酶缓冲液(0.5M NaCl，50mM EDTA，0.1M Tris pH7.4)。37℃孵育过夜后，65℃加热20分钟灭活蛋白酶K，并通过1×酚和1×氯仿抽提从样品中提取核酸内容物。随后，样品与1μl RNase A(Qiagen，100μg/ml，250倍稀释)37℃孵育2小时。相当于2μg的初始蛋白质与1倍体积的2×加样缓冲液(1ml 10×TBE，4.2g尿素，1.2g Ficoll，1ml 0.1％溴酚蓝，H2O，可达10ml)95℃加热3分钟，加样到15％TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上。凝胶在180V电压下电泳1.5小时，用10％乙酸/20％乙醇固定，用CYBR Gold(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)染色。为了定量，将10pmol和20pmol用于重装配的寡核苷酸加样到凝胶上作为参照。核酸内容物对RNase的抗性及其大小证明，包装的核酸是用于重装配的寡核苷酸。包装的寡脱氧核苷酸的定量如下进行：将提取的寡核苷酸的带强度与加样到同一凝胶上的参照含量的相同寡核苷酸的带强度进行比较。获得1.75nmolCyOpA/100μg QβVLP的数值，得出平均每个VLP 44个寡核苷酸的比例。
图32显示纯化前QβVLP与寡核苷酸CyOpA的重装配反应物的电子显微照片。放大倍数为200000倍。
图33A-D显示纯化的QβVLP与寡脱氧核苷酸(CpG)20(A)、CyCyCy(B)、CyCpG(C)和CyOpA(D)的重装配反应物的电子显微照片。放大倍数为200000倍。
图34显示与寡脱氧核苷酸CyOpA重装配的QβVLP与p33GGC肽偶联的SDS-PAGE分析。加样到凝胶上的是下列样品：1.预染色的蛋白质标准，宽范围(#7708S)，10μl；2.与CyOpA[1.5mg/ml]重装配的QβVLP，10μl；3.与CyOpA[1.5mg/ml]重装配且SMPH衍化的QβVLP，10μl；4.与CyOpA[1.5mg/ml]重装配、SMPH衍化且与p33肽偶联的QβVLP，10μl；5.与CyOpA[1.5mg/ml]重装配、SMPH衍化且与p33肽偶联的QβVLP，沉淀的1/5体积。
图35显示通过尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳CYBR Gold染色分析提取的包装的寡脱氧核苷酸。下列样品加样到凝胶上：1.与寡核苷酸CyOpA重装配且与p33 GGC肽偶联的QβVLP，凝胶上加样2μg蛋白质。2.与寡核苷酸CyOpA重装配且与p33 GGC肽偶联的QβVLP，在加样到凝胶之前冻融，2μg蛋白质。3.与寡核苷酸Cy(CpG)20重装配且与p33 GGC肽偶联的QβVLP，在加样到凝胶之前冻融，2μg蛋白质。4.CyOpA寡核苷酸，20pmol。5.CyOpA寡核苷酸，10pmol。
实施例16
Qβ的解装配、重装配与包装
QβVLP的解装配和重装配
解装配：20mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl中的10mg QβVLP(通过Bradford分析测定)用固体硫酸铵沉淀，至硫酸铵终饱和度为60％。沉淀在4℃下过夜进行，沉淀的VLP在4℃下离心60分钟(SS-34转子)沉淀。沉淀物重悬浮于含100mM DTT(终浓度)的1ml 6M盐酸胍(GuHCl)中，4℃孵育8小时。
通过大小排阻层析纯化Qβ外壳蛋白：溶液以14000rpm离心澄清10分钟(Eppendorf 5417R，固定角度转子F45-30-11，在下列所有步骤中使用)，用含有7M尿素，100mM TrisHCl，pH8.0，10mM DTT的缓冲液(2000ml)透析过夜。透析缓冲液更换一次，继续透析2小时。获得的悬液在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，保留上清液作为“上样级分”，其中含有解装配的外壳蛋白和RNA。蛋白质浓度通过Bradford分析测定，5mg总蛋白上样到HiLoadTMSuperdexTM 75制备级柱(26/60，Amersham Biosciences)上，该柱事先用7M尿素，100mM TrisHCl和10mM DTT平衡。用平衡缓冲液(7M尿素，100mM TrisHCl pH8.0，10mM DTT)在12℃下进行大小排阻层析，流速为0.5ml/min。在洗脱过程中监测254nm和280nm的吸光度。分离到两个峰。高分子量峰早于较低表观分子量峰。以1.5ml级分收集该峰，通过SDS-PAGE、随后的考马斯蓝染色以及SYBRGold染色分析这些等份(图36)。
通过离子交换层析纯化Qβ外壳蛋白：此外，澄清的上清液用含有7M尿素，20mM MES，10mM DTT，pH6.0的缓冲液(2000ml)透析过夜。透析缓冲液更换一次，继续透析2小时。获得的悬液在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，保留上清液作为“上样级分”，其中含有解装配的外壳蛋白和RNA。蛋白质浓度通过Bradford分析测定，10mg总蛋白用缓冲液A(见下)稀释至终体积10ml，以1ml/min的流速上样到1ml HiTrapTM SP HP柱(AmershamBiosciences，货号17-1151-01)上，该柱事先用缓冲液A(7M尿素，20mM MES，10mM DTT，pH6.0)平衡。收集含有RNA的流出液作为一种级分。用缓冲液A(30CV)充分洗涤该柱后，以0％-100％缓冲液B的线性梯度洗脱结合的Qβ外壳蛋白(梯度长度为5CV；缓冲液A：见上，缓冲液B：7M尿素，20mM MES，，10mM DTT，2M NaCl，pH6.0)。在上样、洗涤和洗脱过程中监测254nm和280nm的吸光度。收集1ml的峰级分，通过SDS-PAGE、随后的考马斯蓝染色以及SYBRGold染色分析。鉴定含有Qβ外壳蛋白而不含RNA的级分，通过添加100μl 1M TrisHCl，pH8.0调节pH。
合并含Qβ外壳蛋白但不含RNA的样品，用0.87M尿素，100mMTrisHCl，10mM DTT(2000ml)透析过夜，缓冲液更换一次，继续透析2小时。获得的悬液在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，保留上清液作为“解装配的外壳蛋白”。蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
重装配：浓度为0.5mg/ml的纯化Qβ外壳蛋白用于在寡脱氧核苷酸存在下VLP的重装配。对于重装配反应，使用的寡脱氧核苷酸比计算的Qβ-VLP衣壳的理论量过量10倍(单体浓度除以180)。重装配反应过程中，在Qβ外壳蛋白与将要包装的脱氧核苷酸混合后，该溶液(体积可达5ml)首先在4℃下用含有10％β-巯基乙醇的500mlNET缓冲液透析2小时，然后在4℃下以8ml NET缓冲液/h的流速，以连续模式透析72小时，最后以相同的连续模式用含有20mMTrisHCl，pH8.0，150mM NaCl的缓冲液再透析72小时。获得的悬液在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，上清液含有重装配且包装的VLP。蛋白质浓度通过Bradford分析测定，需要时用离心过滤装置(Millipore，UFV4BCC25，5K NMWL)浓缩重装配且包装的VLP，至终蛋白质浓度为3mg/ml。
重装配且包装的VLP的纯化：将可达10mg的总蛋白质上样到SepharoseTM CL-4B柱(16/70，Amersham Biosciences)上，该柱预先用20mM HEPES pH7.4，150mM NaCl平衡。在室温下用平衡缓冲液(20mM HEPES pH7.4，150mM NaCl)以0.4ml/min的流速进行大小排阻层析。在洗脱过程中监测254nm和280nm的吸光度。分离到两个峰。高分子量峰早于较低表观分子量峰。收集0.5ml级分，通过SDS-PAGE、随后的考马斯蓝染色分析(图37)。用高度纯化的来自大肠杆菌的完整Qβ衣壳校准该柱，显示主要第一峰的表观分子量与Qβ衣壳相符。
在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的分析：
A)衣壳的总体结构：在下列寡脱氧核苷酸之一(CyOpA，Cy(CpG)20OpA，Cy(CpG)20，CyCyCy，(CpG)20OpA)存在下，或在来自大肠杆菌的tRNA(Roche Molecular Biochemicals，货号109541)存在下重装配的QβVLP，通过电子显微镜检查分析(用乙酸双氧铀pH4.5负染)，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP相比较。阴性对照是没有核酸的重装配反应。重装配的衣壳显示与完整的QβVLP相同的结构特征和特性(图38)。
B)重装配衣壳的流体动力学大小：通过动态光散射(DLS)对在寡脱氧核苷酸存在下重装配的Qβ衣壳进行分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整QβVLP相同的流体动力学大小(取决于质量和构象)。
C)重装配衣壳中二硫键的形成：重装配的QβVLP通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP相比较。重装配的衣壳显示与完整QβVLP相同的二硫键模式(图39)。
D)通过琼脂糖凝胶电泳分析在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物：5μg重装配的QβVLP在25μl总反应体积中与0.35单位RNase A(Qiagen，货号19101)、15单位DNAse I(Fluka，货号31136)或在不添加任何酶的情况下37℃孵育3小时。从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP作为对照孵育，孵育条件与上述在寡脱氧核苷酸存在下重装配衣壳的孵育条件相同。反应液随后加样到0.8％琼脂糖凝胶上，首先用溴化乙锭染色(图40A)，随后用考马斯蓝染色(图40B)。溴化乙锭染色显示，添加的酶都不能消化重装配Qβ衣壳中的核酸内容物，表明核酸内容物(即寡脱氧核苷酸)受到保护。这一结果表明，添加的寡脱氧核苷酸在重装配反应过程中被包装到新形成的衣壳内。相反，从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP中的核酸内容物在添加RNase A后降解，表明该VLP中的核酸内容物由RNA组成。另外，琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色和考马斯蓝染色都显示，含核酸的QβVLP(分别为重装配的，从大肠杆菌中纯化的)以大约相同的大小迁移，这表明重装配反应产生的QβVLP与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP大小相当。
凝胶显示，重装配的QβVLP中存在DNAse I保护的寡脱氧核苷酸。而且，在用酚/氯仿抽提包装的寡脱氧核苷酸后，它们可被DNAseI消化，但不被RNase I消化。因此，在最初解装配VLP、从核酸中纯化解装配的外壳蛋白并随后在寡脱氧核苷酸存在下重装配VLP后，寡脱氧核苷酸能够被成功地包装于QβVLP内。
E)通过变性聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶电泳分析在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物：40μg重装配的QβVLP(0.8mg/ml)在60μl总反应体积中与0.5mg/ml蛋白酶K(PCR级，RocheMolecular Biochemicals，货号1964364)和反应缓冲液按照使用说明书37℃孵育3小时。从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP作为对照与蛋白酶K一起孵育，孵育条件与上述在寡脱氧核苷酸存在下重装配衣壳的孵育条件相同。然后将反应液与TBE-尿素加样缓冲液混合，加样到15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶(Novex，Invitrogen，货号EC6885)上。用于重装配反应的1pmol、5pmol和10pmol寡脱氧核苷酸加样到同一凝胶上，作为定性及定量标准。该凝胶用10％乙酸，20％甲醇固定，平衡至中性pH，并用SYBR-Gold(Molecular Probes货号S-11494)染色。SYBR-Gold染色显示(图41)，重装配的Qβ衣壳含有与重装配反应中使用的寡脱氧核苷酸共迁移的核酸。注意，从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP不含类似大小的核酸。总之，对在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物的分析显示，寡脱氧核苷酸受到保护而不被DNase I消化，意味着它们被包装，而且添加的寡脱氧核苷酸能够通过适当方法(例如蛋白酶K消化QβVLP)重新分离。
图36显示通过大小排阻层析纯化解装配的Qβ外壳蛋白。5μl指定级分(#)与加样缓冲液混合，加样到16％Tris-甘氨酸凝胶(Novexby Invitrogen，货号EC64952)上。电泳完成后，凝胶首先用考马斯蓝染色(A)，记录后该凝胶用SYBR-Gold染色(B)。注意，第一个高分子量峰(级分#15-#20)不含蛋白质而含核酸。另一方面，第二个较低表观分子量峰含有与核酸分离的解装配的外壳蛋白。
图37显示通过大小排阻层析纯化重装配的QβVLP。10μl指定级分(#)与加样缓冲液混合，加样到16％Tris-甘氨酸凝胶(Novexby Invitrogen，货号EC64952)上。电泳完成后，凝胶用考马斯蓝染色。由于是还原条件，二硫键被还原，重装配的VLP的蛋白质单体可见为14kDa外壳蛋白。
图38显示在不同寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的电子显微照片。VLP在指定寡脱氧核苷酸存在下或在tRNA存在下重装配，但是没有通过大小排阻层析纯化为均匀的悬液。从大肠杆菌中纯化的“完整”QβVLP制品作为阳性对照。重要的是，在重装配反应中通过添加任何指定核酸，与“阳性”对照相比，能够形成正确大小和构象的VLP。这表明，重装配过程通常不依赖于核苷酸序列和所用寡脱氧核苷酸的长度。注意，在重装配反应过程中添加核酸是形成QβVLP所必需的，因为如果重装配反应中不含核酸，则不形成颗粒。
图39显示重装配并纯化的Qβ衣壳中二硫键模式的分析。5μl指定衣壳与含或不含还原剂的加样缓冲液混合，加样到16％Tris-甘氨酸凝胶上。电泳完成后，凝胶用考马斯蓝染色。与从大肠杆菌中纯化的“完整”衣壳相比，重装配的QβVLP显示相同的二硫键模式。
图40显示通过核酸酶处理和琼脂糖凝胶电泳分析重装配的QβVLP的核酸内容物。5μg重装配并纯化的QβVLP和5μg从大肠杆菌中纯化的QβVLP分别如上所述处理。处理后，样品与加样染料混合，上样到0.8％琼脂糖凝胶上。电泳后，凝胶首先用溴化乙锭染色(A)，记录后该凝胶用考马斯蓝染色(B)。注意，重装配并纯化的QβVLP的核酸内容物对RNase A消化有抗性，而从大肠杆菌中纯化的QβVLP的核酸内容物在与RNase A孵育后被消化。这表明，重装配的Qβ衣壳的核酸内容物由寡脱氧核苷酸组成，它们当然不会被RNase A消化。因此，在重装配反应过程中寡脱氧核苷酸被包装于QβVLP内。
图41显示通过蛋白酶K处理和聚丙烯酰胺TBE/尿素凝胶电泳分析重装配的QβVLP的核酸内容物。经蛋白酶K处理消化的相当于1μg的QβVLP与TBE-尿素加样缓冲液混合，加样到15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶(Novex，Invitrogen，货号EC6885)上。用于重装配反应的1pmol、5pmol和10pmol寡脱氧核苷酸加样到同一凝胶上，作为定性及定量标准。电泳完成后，固定凝胶，平衡至中性pH，用SYBR-Gold(Molecular Probes货号S-11494)染色。注意，从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP不含与从重装配Qβ衣壳中提取的核酸大小相似的核酸。另外，从重装配的VLP中分离的核酸与重装配反应中使用的寡脱氧核苷酸共迁移。该结果证实，使用的寡脱氧核苷酸被包装到重装配的Qβ衣壳中。
实施例17
AP205解装配-纯化-重装配和免疫刺激性核酸的包装
A.AP205 VLP的解装配和重装配，使用在不添加寡脱氧核苷酸的条件下能够重装配的材料
解装配：40mg冻干纯化的AP205 VLP溶解于4ml 6M GuHCl中，4℃孵育过夜。解装配的混合物以8000rpm离心(Eppendorf 5810R，固定角度转子F34-6-38，在下列所有步骤中使用)。沉淀溶解于7M尿素中，上清液用NET缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.8，5mM EDTA，150mM NaCl)透析3天，其中更换3次缓冲液。另外，也以连续方式透析4天。透析的溶液以8000rpm离心20分钟，沉淀溶解于7M尿素中，上清液用硫酸铵(60％饱和)沉淀，溶解于含有10mM DTT的7M尿素缓冲液中。合并溶解于7M尿素中的上述所有沉淀，用硫酸铵(60％饱和)沉淀，溶解于含有10mM DTT的7M尿素缓冲液中。合并溶解于含有10mM DTT的7M尿素缓冲液中的材料，加样到Sephadex G75柱上，该柱用含有10mM DTT的7M尿素缓冲液以2ml/h平衡并洗脱。从柱上洗脱下一个峰。收集3ml的级分。合并含有AP205外壳蛋白的峰级分，用硫酸铵(60％饱和)沉淀。以8000rpm离心20分钟分离沉淀。溶解于7M尿素，10mM DTT中，加样到短Sepharose 4B柱(1.5×27cm Sepharose 4B，2ml/h，7M尿素，10mMDTT作为洗脱缓冲液)上。从该柱上主要洗脱下一个峰，其含有一个小肩。含有AP205外壳蛋白的级分通过SDS-PAGE鉴定，合并，除去肩部。获得10.3ml样品。通过分光光度法测定稀释25倍的蛋白质等份，来估计蛋白质浓度，使用下列公式：(1.55×OD280-0.76×OD260)×体积。平均浓度为1nmol/ml VLP(2.6mg/ml)。280nm与260nm的吸光度比为0.12/0.105。
重装配：向样品中添加1.1ml β-巯基乙醇，配制下列重装配反应物：
1. 1ml AP205外壳蛋白，不含核酸
2. 1ml AP205外壳蛋白，rRNA(约200 OD260单位，10nmol)
3. 9ml AP205外壳蛋白，CyCpG(370μl 225pmol/μl溶液，即83nmol)。
这些混合物用30ml含10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析1小时。不含核酸的混合物分开透析。然后以连续方式继续透析3天，更换11NET缓冲液。反应混合物随后用水充分透析(更换5次缓冲液)，冻干。它们再溶解于水中，进行EM分析。所有混合物均含有衣壳，表明AP205 VLP重装配不依赖于可检测核酸的存在，如同利用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳所测定的。与CyCpG重装配的AP205的EM分析在图42B中显示。EM程序如下：蛋白质悬液吸附到覆盖碳-聚醋酸甲基乙烯脂的网格上，用2％磷钨酸(pH6.8)染色。用JEM 100C(JEOL，日本)电子显微镜以80kV的加速电压检查该网格。用Kodak电子成像胶片进行照相记录(负片)，在Kodak Polymax相纸上洗印负片获得电子显微照片。在CyCpG存在下重装配的VLP通过Sepharose 4B柱(1×50cm)纯化，用NET缓冲液洗脱(1ml/h)。级分通过Ouchterlony试验分析，并合并含有VLP的级分。获得8ml样品，用水透析脱盐，干燥。衣壳产量为10mg。用0.6％琼脂糖凝胶溴化乙锭染色分析溶解物质，结果表明衣壳不含核酸。在重装配步骤之后和充分透析之前采集的含CyCpG的重装配反应样品用0.6％琼脂糖凝胶分析，如图43A和B所示。能够获得迁移高度与完整的AP205VLP相同并且能够用溴化乙锭和考马斯蓝染色的一条带，表明含有寡脱氧核苷酸的AP205 VLP已经被重装配。重装配程序后的充分透析步骤可能导致寡脱氧核苷酸扩散到VLP之外。值得注意的是，如利用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳所测定的，在不含可检测的寡脱氧核苷酸的条件下，AP205 VLP也能被重装配。因此，在最初解装配VLP、从核酸中纯化解装配的外壳蛋白并随后在寡脱氧核苷酸存在下重装配VLP后，寡脱氧核苷酸能够与AP205 VLP成功结合。
图42显示用于解装配步骤的完整的重组AP205 VLP(A)或解装配并且随后在CyCpG存在下重装配的AP205 VLP(B)的电子显微照片。
图43显示在CyCpG存在下重装配的AP205 VLP样品的琼脂糖凝胶电泳分析，该分析直接在重装配步骤后透析前进行。图43A中的凝胶用溴化乙锭染色。与CyCpG重装配的AP205 VLP加样到第1道，未处理的纯AP205 VLP加样到第2道。箭头所指为重装配的AP205 VLP的带。图43B中的凝胶用考马斯亮蓝染色。未处理的AP205 VLP加样到第1道，与CyCpG重装配的AP205 VLP加样到第2道。
B.AP205 VLP的重装配，使用在不添加寡脱氧核苷酸的条件下不能重装配的解装配材料
解装配：100mg纯化并干燥的重组AP205 VLP(Cytos专利)如上所述解装配。所有步骤都基本如部分A的解装配所述进行，只是使用8M尿素溶解硫酸铵沉淀步骤的沉淀物，并且省去了重装配之前使用CL-4B柱的凝胶过滤步骤。通过光谱测定，使用部分A所述公式，合并的Sephadex G-75柱级分含有21mg蛋白质。样品的280nm吸光度与260nm吸光度之比为0.16∶0.125。样品稀释50倍进行测定。
重装配：Sephadex G-75凝胶过滤纯化步骤获得的蛋白质制品用60％饱和的硫酸铵沉淀，获得的沉淀物溶解于2ml 7M尿素，10mMDTT中。样品用含10％β-巯基乙醇的8ml NET缓冲液稀释，用40ml含10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析1小时。通过向透析袋内的蛋白质样品中添加0.4ml CyCpG溶液(109nmol/ml)启动重装配。建立连续模式的透析，NET缓冲液作为洗脱液。继续透析2天，在完成该透析步骤后采集样品进行EM分析(图44B)。透析的重装配溶液随后用含50％v/v甘油的NET缓冲液透析，实现浓缩。透析一天后更换一次缓冲液。透析继续进行共3天。
在Sepharose 4-B柱(1×60cm)上，用NET缓冲液以1ml/h的流速进行凝胶过滤，纯化透析并浓缩的重装配溶液。级分用Ouchterlony试验检测，干燥含衣壳的级分，重悬浮于水中，并在20mM Hepes pH7.6平衡的4-B柱上重新层析。使用下列三个公式：
1.(183×OD230nm-75.8×OD260nm)×体积(ml)-2.((OD235nm-OD280nm)/2.51)×体积-3.((OD228.5nm-OD234.5nm)×0.37)×体积
检测到6-26mg重装配的VLP的蛋白质含量。
重装配的AP205 VLP通过如上所述的EM、琼脂糖凝胶电泳和在非还原条件下SDS-PAGE分析。
解装配材料的EM分析显示，用盐酸胍处理AP205 VLP从根本上破坏了VLP的衣壳装配。该解装配材料与寡核苷酸的重装配产生衣壳(图44B)，其通过凝胶过滤纯化并进一步富集(图44C)。获得两种大小的颗粒；在图44C的电子显微照片上可见直径约25nm的颗粒和更小的颗粒。没有寡核苷酸时无法获得重装配。将重装配的颗粒加样到琼脂糖电泳上显示，重装配的颗粒含有核酸。通过酚抽提提取核酸内容物，随后加样到琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，显示颗粒含有用于重装配的寡核苷酸(图45A)。通过将该寡核苷酸样品与从颗粒中提取的核酸材料从左到右加样，确定包装的寡核苷酸的特性。已经加样了重装配的AP205 VLP并且已用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶再用考马斯蓝染色，显示颗粒的寡核苷酸内容物与蛋白质内容物共迁移(图45B)，表明寡核苷酸已经被包装到颗粒中。
向SDS-PAGE凝胶上加样重装配的AP205 VLP，在不含还原剂的条件下电泳(图46)，证实重装配的颗粒已经形成二硫桥接，如同未处理的AP205 VLP一样。而且，二硫键模式也与未处理的颗粒相同。
图44所示是解装配的AP205 VLP蛋白的电子显微照片，而图44B显示纯化前的重装配的颗粒。图3C显示纯化的重装配AP205 VLP的电子显微照片。图3A-C的放大倍数是200000倍。
图45A和B显示通过琼脂糖凝胶电泳分析重装配的AP205 VLP。两张图上加样到凝胶上的样品从左至右是：未处理的AP205 VLP，含有不同含量的与CyCpG重装配并纯化的AP205 VLP的3个样品，未处理的QβVLP。图45A的凝胶用溴化乙锭染色，而在图45B上同一凝胶用考马斯蓝染色。
图46显示在非还原条件下加样的重装配AP205 VLP的SDS-PAGE分析。5个样品被加样到凝胶上。加样到凝胶上的样品从左到右是：蛋白质分子量标准，未处理的野生型Qβ，重装配的野生型Qβ，未处理的AP205 VLP，重装配的AP205 VLP。AP205 VLP亚单位的分子量是14.0kDa，而Qβ亚单位的分子量为14.3kDa(这两个分子量都是根据N端甲硫氨酸计算出来的)。二硫键连接的多聚体在图中均以箭头标出。
C.p33表位(序列：H2N-KAVYNFATMGGC-COOH，不含N端和C端)与含CyCpG的重装配AP205 VLP的偶联
如部分B所述获得的重装配AP205 VLP，在20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4中，以1.4mg/ml的浓度与5倍过量的交联剂SMPH(由50mM DMSO贮存液稀释而成)在15℃下反应30分钟。获得的所谓衍化的AP205 VLP用至少1000倍体积的20mM Hepes，150mMNaCl，pH7.4缓冲液透析2次各2小时。衍化的AP205以1mg/ml的浓度与2.5倍或5倍过量的肽(由20mM DMSO贮存液稀释而成)在15℃下反应2小时。样品随后在液氮中骤冻以贮存。
偶联反应的结果如图6所示。在偶联反应中通过使用5倍过量的肽而不是2.5倍过量的肽能够达到更高程度的偶联。
图47所示为偶联反应的SDS-PAGE分析。将下列样品(从左到右)加样到凝胶上：蛋白质分子量标准；衍化的AP205 VLP(d)；与2.5倍过量的肽偶联的AP205 VLP，上清液(s)；与2.5倍过量的肽偶联的AP205 VLP，沉淀物(p)；与5倍过量的肽偶联的AP205 VLP，上清液(s)；与5倍过量的肽偶联的AP205 VLP，沉淀物(p)。
实施例18
游离的免疫刺激性核酸而不是包装于VLP内的免疫刺激性核酸诱导脾肿大
小鼠不予处理，或皮下免疫单独的100μgHBc33、20nmolCyCpGpt、与20nmol CyCpGpt混合的100μgHBc33或包装有CyCpGpt的100μg HBc33。12天后，分离脾脏，测量脾脏重量和脾的细胞构成。当单独给予CyCpGpt时，诱发脾脏重量和细胞数极大增加(图48)。给予包装于HBc33中的CyCpGpt时没有观察到这一作用，但是该组合物能够诱导对抗病毒攻击的保护(参见实施例4)。
实施例19
体内病毒保护试验
牛痘保护试验
几组(每组3只)雌性C57B1/6小鼠皮下免疫单独的100μg与p33偶联或融合的VLP、与20nmol免疫刺激性核酸混合的或包装有免疫刺激性核酸的100μg与p33偶联或融合的VLP。为了评价周围组织中的抗病毒免疫，小鼠在7-9天后腹膜内感染1.5×106pfu表达LCMV-糖蛋白的重组牛痘病毒(包含p33肽)。5天后取出卵巢，测定病毒滴度。用匀浆器在含有5％胎牛血清并补充谷氨酰胺、Earls’s盐和抗生素(青霉素/链霉素/两性霉素)的最低必需培养基(Gibco)中研磨卵巢。悬液以10倍稀释滴定到BSC40细胞上。37℃孵育过夜后，粘附细胞层用含有50％乙醇、2％结晶紫和150mM NaCl的溶液染色来显示病毒噬斑。未免疫的原初小鼠作为对照。
LCMV保护试验
几组(每组3只)雌性C57B1/6小鼠皮下免疫单独的或与佐剂/20nmol CpG寡核苷酸混合的100μg与p33偶联或融合的VLP。为了检测全身抗病毒免疫，小鼠在11-13天后腹膜内感染200pfu LCMV-WE。4天后分离脾脏，测定病毒滴度。用匀浆器在含有2％胎牛血清并补充谷氨酰胺、Earls’s盐和抗生素(青霉素/链霉素/两性霉素)的最低必需培养基(Gibco)中研磨脾脏。悬液以10倍稀释滴定到MC57细胞上。孵育1小时后，细胞上覆盖含5％胎牛血清、1％甲基纤维素和抗生素(青霉素/链霉素/两性霉素)的DMEM。37℃孵育2天后，通过细胞内染色法(染色病毒核蛋白)评价细胞的LCMV感染：细胞用4％甲醛固定30分钟，随后用1％Triton X-100裂解20分钟。与10％胎牛血清孵育1小时阻断非特异性结合。细胞用大鼠抗-LCMV-抗体(VL-4)染色1小时。过氧化物酶偶联的山羊抗大鼠IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc)作为二抗，随后按照标准程序用ODP底物进行显色反应。
实施例20
包装于与抗原融合的VLP内的不同免疫刺激性核酸导致强抗原特异性CTL应答和病毒保护
HBcAg与肽p33的融合蛋白(HBc33)如实施例1所述生产，如实施例11所述包装不同的CpG核酸。
向小鼠注射100μg疫苗，在重组牛痘攻击后如实施例19所述检测卵巢中的牛痘滴度。双链CyCpGpt(dsCyCpGpt)如下生产：通过80℃10分钟的加热步骤，使0.5mM DNA寡核苷酸CyCpGpt与CyCpG-rev-pt(表I)在15mM Tris pH7.5中退火，随后冷却至室温。在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上检查寡核苷酸的杂交。
含有CyCpG、NKCpG、B-CpG和g10gacga-PS的HBc33衣壳确实诱发了能够完全抑制病毒感染的CTL应答(图49，图50)。用含有磷酸二酯键或硫代磷酸酯键的核酸(pt或PS)可以观察到保护。甚至双链寡核苷酸dsCyCpGpt也能诱导对抗牛痘攻击的保护(图49)。
实施例21
包装于HBcAg和QβVLP中的免疫刺激性核酸导致强抗原特异性CTL应答和病毒保护
HBcAg与肽p33的融合蛋白(HBc33)如实施例1所述生产，如实施例11所述包装不同的CpG核酸。肽p33与RNA噬菌体Qβ偶联，寡核苷酸B-CpGpt如实施例13所述被包装。向小鼠注射100μg、30μg、10μg或3μg每种疫苗，如实施例19所述检测重组牛痘攻击后卵巢中的牛痘滴度。100μg和30μg HBc33和含包装的B-CpG的Qbx33确实诱导了对抗病毒攻击的完全保护，而在较低浓度下观察到部分保护或没有保护(图51)。
实施例22
包装于与自身抗原偶联的VLP内的免疫刺激性核酸能够克服对自身抗原的耐受
用200pfu LCMV免疫在胰β岛细胞中表达LCMV糖蛋白的转基因小鼠(Ohasi等人，Cell 65，305-317(1991))，与20nmol CyCpGpt混合的100μg HBc33、包装有CyCpGpt的100μg HBc33或与20nmolCyCpGpt混合的100μg p33肽作为对照。每4天用Glucotrend Plus葡萄糖检测试剂盒(Roche)测定血糖水平。血糖水平高于12mM的小鼠被认为患有糖尿病。LCMV免疫在第12天在4/4动物中均诱发糖尿病。与HBc33混合的CyCpGpt只导致1/3的小鼠患糖尿病。用包装有CyCpGpt的HBc33免疫的3只小鼠中有2只在第12天发展为糖尿病，第3只小鼠在第16天发展为糖尿病。用与CyCpGpt混合的肽p33免疫在3只小鼠中均未诱发糖尿病。这清楚地表明，包装到与抗原融合的VLP内的免疫刺激性核酸在增强强CTL应答方面比核酸与抗原的混合物更加有效。它们甚至能诱发比与VLP融合并与免疫刺激性核酸混合的抗原更强的应答。
实施例23
包装于与抗原偶联的VLP内的免疫刺激性核酸在诱导抗原特异性CD8+T细胞方面比与免疫刺激性核酸混合的VLP更加有效
C57BL/6小鼠皮下免疫单独的、与CyCpGpt混合的、或包装有CyCpGpt的100μg HBc33。未处理的小鼠作为对照。
免疫8天后，血液淋巴细胞用PE标记的p33四聚体和FITC偶联的单克隆抗-CD8抗体双染色，检测p33特异的CD8+T细胞，p33特异性细胞占总CD8+T细胞群体的百分数通过FACS分析测定。
表II.接种与CpG混合或包装有CpG的p33-VLP后，p33特异性CD8+T细胞的诱导。数字对应于频率平均值(百分数)和标准差。
含包装的CyCpGpt的HBc33比与CyCpGpt混合的HBc33诱导了更高频率的p33特异性CD8+T细胞(表II)。由于包装的寡核苷酸的量大大低于(约1/20)混合组使用的寡核苷酸量，这清楚地证明，含有包装的免疫刺激性核酸的VLP在诱导大量抗原特异性CD8+T细胞方面更加有效。
实施例24
包装于VLP内的免疫刺激性核酸在诱发CTL应答方面比与免疫刺激性核酸混合的VLP更加有效
几组C57BL/6小鼠皮下用单独的、与20nmol CyCpGpt混合的或包装有CyCpGpt的100μg p33-VLP致敏。为了检测最初的离体细胞毒性，在致敏9天后用接种小鼠的脾脏制备效应细胞悬液。p33肽脉冲作用于EL-4细胞(10-6M，在2％FCS MEM培养基中37℃2h)，用于5h 51Cr释放试验。
免疫   p33特异性CD8+T细胞的频率 每组小鼠数
  未处理的HBc33HBc33+CyCpGpt(混合的)HBc33/CyCpGpt(包装的)   0.20.3±0.12.1±0.94.3±1.1   2455
图52显示皮下用单独的100μg p33-VLP(A)、与20nmolCyCpGpt混合的(B)或包装有CyCpGpt的(C)100μg p33-VLP致敏的C57BL/6小鼠组的最初离体细胞毒性。9天后，以指定的效：靶细胞比，对p33脉冲处理的(实心符号)或未脉冲处理的(空心符号)EL-4靶细胞进行5-h 51Cr释放试验，检测脾细胞的直接离体CTL活性。细胞培养上清液的放射性用Cobra II计数器(Canberra Packard，Downers Growe，IL)测定。自发释放始终＜10％。每只小鼠的效应细胞进行两个系列的稀释。在(A)中，每组使用2只小鼠，而(B)和(C)显示每组4只小鼠的数据。
图52清楚地证明，单独的100μg HBc33不会诱发最初的体内CTL应答，而与20nmol CyCpGpt混合的相同量的HBc33诱发明显的细胞毒性。然而，尽管包装的寡核苷酸的量大大低于(约1/20)混合组使用的寡核苷酸的量，但是当使用含包装CyCpGpt的100μgHBc33进行免疫时，细胞毒性增强(图52)。
实施例25
VLP的RNA内容物的非酶促水解和免疫刺激性核酸的包装
VLP核酸内容物依赖于ZnSO4的降解
溶于20mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl中的5mg QβVLP(通过Bradfold分析测定)在SnakeSkinTM折叠透析管(Pierce，货号68035)中在4℃下用2000ml 50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2或2000ml 4mM HEPES，pH7.4，30mM NaCl透析2小时。每种透析缓冲液均更换一次，在4℃下再继续透析16小时。透析的溶液以14000rpm澄清10分钟(Eppendorf 5417R，固定角度转子F45-30-11，在下列所有步骤中使用)，再次通过Bradfold分析测定蛋白质浓度。溶于50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2中的QβVLP用相应缓冲液稀释至蛋白质终浓度为1mg/ml，而溶于4mM HEPES pH7.4，30mM NaCl中的QβVLP用相应缓冲液稀释至蛋白质终浓度为0.5mg/ml。这种含衣壳的溶液在4℃下以14000rpm再次离心10分钟。上清液与ZnSO4(添加至2.5mM终浓度)在Eppendorf恒温混匀器装置中以550rpm 60℃孵育24小时。24小时后溶液以14000rpm澄清10分钟，弃去沉淀。ZnSO4依赖性核酸降解效率通过琼脂糖凝胶电泳证实(图53)。上清液在4℃下用5000ml 4mM HEPES pH7.4，30mM NaCl透析2小时。更换一次5000ml缓冲液，在4℃下继续透析过夜。透析的溶液在4℃下以14000rpm澄清10分钟，弃去微小的沉淀物，上清液的蛋白质浓度通过Bradfold分析测定。
以氯化铜/二氮杂菲/过氧化氢处理衣壳获得类似的结果。本领域技术人员了解RNA水解的备选非酶促方法。
将寡脱氧核苷酸包装于ZnSO4处理的VLP内：
寡脱氧核苷酸的包装使用ZnSO4处理且透析的Qβ衣壳，其蛋白质浓度(通过Bradfold分析测定)为0.4mg/ml-0.9mg/ml(分别对应于159nM和357.5nM的衣壳浓度)。添加与QβVLP衣壳相比300倍摩尔过量的寡脱氧核苷酸，在Eppendorf恒温混匀器中以550rpm37℃孵育3小时。3小时后反应液在4℃下以14000rpm离心10分钟。上清液在MWCO 300000的Spectra/PorCE DispoDialyzer(Spectrum，货号135 526)中在4℃下用5000ml 20mM HEPES pH7.4，150mMNaCl透析8小时。更换一次5000ml缓冲液，在4℃下继续透析过夜。透析的样品的蛋白质浓度通过Bradfold分析测定。如实施例11和13所述分析Qβ衣壳及其核酸内容物。
图53显示通过琼脂糖凝胶电泳分析ZnSO4处理的QβVLP：从大肠杆菌中纯化并用缓冲液1(50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2)或缓冲液2(4mM HEPES pH7.4，30mM NaCl)透析的QβVLP在存在或不存在2.5mM硫酸锌(ZnSO4)的条件下60℃孵育24小时。该处理后，等量指定样品(5μg蛋白质)与加样染料混合，加样到0.8％琼脂糖凝胶上。电泳后，凝胶用溴化乙锭染色。注意，用ZnSO4处理VLP导致核酸内容物的降解，而假处理的对照不受影响。
图54显示将寡脱氧核苷酸包装于ZnSO4处理的VLP内，以及通过琼脂糖凝胶电泳对它们的分析。2.5mM硫酸锌(+ZnSO4)处理的QβVLP用4mM HEPES pH7.4，30mM NaCl透析，与过量的寡脱氧核苷酸37℃孵育3小时(由于透析，ZnSO4的浓度降低106数量级，因此只在括号中标明)。在寡脱氧核苷酸存在下孵育后，等量的指定样品(5μg蛋白质)与加样染料混合，加样到0.8％琼脂糖凝胶上。电泳后，凝胶用溴化乙锭染色。注意，与未处理的从大肠杆菌纯化的Qβ衣壳相比，向ZnSO4处理的QβVLP中添加寡脱氧核苷酸恢复了这样处理的衣壳的电泳行为。
图55显示通过Benzonase和蛋白酶K消化和聚丙烯酰胺TBE/尿素凝胶电泳分析ZnSO4和寡脱氧核苷酸处理的QβVLP的核酸内容物：如上所述，将寡脱氧核苷酸包装于ZnSO4处理的QβVLP内。按照使用说明用25μl Benzonase(Merck，货号1.01694.0001)消化25μg该VLP。在热灭活核酸酶后(80℃30分钟)，按照使用说明用蛋白酶K(酶的终浓度为0.5mg/ml)处理VLP。3小时后，Benzonase和蛋白酶K消化的等量2μg QβVLP与TBE-尿素样品缓冲液混合，加样到15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶(Novex，Invitrogen，货号EC6885)上。加于第2道的衣壳在缓冲液1(见上文)存在下用2.5mMZnSO4处理，而加于第3道的衣壳在缓冲液2(见上文)存在下用2.5mM ZnSO4处理。用于重装配反应的1pmol、5pmol和10pmol寡脱氧核苷酸加样到同一凝胶上(4-6道)作为定性及定量标准。作为对照，从大肠杆菌纯化的Qβ衣壳被完全相同处理，并用同一聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶分析(1道)。完成电泳后，固定凝胶，平衡至中性pH，用SYBR-Gold(Molecular Probes，货号S-11494)染色。注意，完整的QβVLP(从大肠杆菌中纯化)不含与从ZnSO4和寡脱氧核苷酸处理的Qβ衣壳中提取的大小相似的核酸。另外，从后一种VLP分离的核酸与重装配反应中使用的寡脱氧核苷酸共迁移。该结果证实，所用的寡脱氧核苷酸被包装于ZnSO4处理的Qβ衣壳内。
实施例26
含有免疫刺激性核酸的VLP诱发T细胞应答，这种应答能被病毒载体LCMV加强
小鼠皮下用20μg含有免疫刺激性核酸的p33-VLP致敏。免疫前，通过透析从未结合的CpG-寡脱氧核苷酸中充分纯化p33-VLP制品(参见实施例2和图5)。12天后采集血液，通过四聚体染色测定p33特异性T细胞的频率。小鼠用200pfu活LCMV株WE加强，5天后测定特异性T细胞的频率。加强前的频率为3.5％+/-1.8％，加强后为15.5％+/-1.9％。
实施例27
含有免疫刺激性核酸的VLP诱发T细胞应答，这种应答能被病毒载体：重组痘苗病毒加强
小鼠皮下用20μg含有免疫刺激性核酸的p33-VLP致敏。免疫前，通过透析从未结合的CpG-寡脱氧核苷酸中充分纯化p33-VLP制品(参见实施例2和图5)。12天后采集血液，通过四聚体染色测定p33特异性T细胞的频率。小鼠用106pfu表达LCMV-GP的重组痘苗病毒加强，5天后测定特异性T细胞的频率。
实施例28
含有免疫刺激性核酸的VLP诱发T细胞应答，这种应答能被病毒载体：重组金丝雀痘病毒加强
小鼠皮下用20μg含有免疫刺激性核酸的p33-VLP致敏。免疫前，通过透析从未结合的CpG-寡脱氧核苷酸中充分纯化p33-VLP制品(参见实施例2和图5)。12天后采集血液，通过四聚体染色测定p33特异性T细胞的频率。小鼠用107pfu表达LCMV-GP的重组金丝雀痘病毒加强，5天后测定特异性T细胞的频率。
实施例29
含有免疫刺激性核酸的VLP能够加强T细胞应答
小鼠静脉内感染表达LCMV-GP的重组痘苗病毒。20天后采集血液，通过四聚体染色测定p33特异性T细胞的频率。在同一天用含有免疫刺激性核酸的p33-VLP制品加强小鼠(参见实施例2和图5)，5天后测定特异性T细胞的频率。
实施例30
将免疫刺激核糖核酸包装于VLP内
免疫刺激性核酸如poly(I:C)(Sigma)或含有磷酸二酯键或硫代磷酸酯骨架的合成双链30mer聚肌苷酸和聚胞苷酸溶于水中。此外，也用聚脱氧肌苷酸和聚脱氧肌苷酸制备双链poly(I:C)类似物。如实施例11、13或25所述，用RNase处理HBc33 VLP和QβVLP，以0.2×HBS中1、10、100nmol/ml的浓度添加核酸，在恒温混匀器中37℃孵育3小时。通过酶促水解或透析除去过量的核酸，并如实施例11、13、25所述对核酸进行分析。
此外，如实施例14、15、16所述，在Qβ外壳蛋白重装配过程中包装免疫刺激性核糖核酸及其类似物。重装配如下进行：向10ml二聚体级分中添加β-巯基乙醇至终浓度为10％，添加300μl核酸溶液，使其1、10、100摩尔过量于衣壳浓度。重装配混合物首先在4℃下用30ml含10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析2小时，然后在4℃下以连续模式，以8ml NET缓冲液/h的流速透析4天。然后用水透析使重装配的混合物脱盐，更换6次缓冲液(4×100ml，2×11)。然后如实施例14所述通过蔗糖梯度离心，或者如实施例16所述通过凝胶过滤，分离重装配的QβVLP。
                          序列表
<110>赛托斯生物技术公司
Bachmann，Martin F.
Storni，Tazio
Maurer，Patrick
Tissot，Alain
Schwarz，Katrin
Meijerink，Edwin
Lipowsky，Gerad
Pumpens，Paul
Cielens，Indulis
Renhofa，Regina
<120>免疫刺激物向病毒样颗粒内的包装：制备方法与用途
<130>1700.022PC02
<140>待定
<141>Herewith
<150>60/374,145
<151>2002-04-22
<150>60/318,994
<151>2001-09-14
<160>73
<170>PatentIn version 3.1
<210>10
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>10
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>11
<211>328
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>11
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr VaL Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ser
    130                 135                 140
Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro Gly
145                 150                 155                 160
Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu Val
                165                 170                 175
Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala Val
            180                 185                 190
Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu Gly
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr Phe
    210                 215                 220
Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr Leu
225                 230                 235                 240
Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu Gly
                245                 250                 255
Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Lys
            260                 265                 270
Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His Ala
        275                 280                 285
Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly Ala
    290                 295                 300
Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile Gln
305                 310                 315                 320
Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
                325
<210>12
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体R17
<400>12
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>13
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体fr
<400>13
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>14
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体GA
<400>14
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
        35                  40                  45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65                  70                  75                  80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
            100                 105                 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
        115                 120                 125
Tyr Ala
    130
<210>15
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>15
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>16
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>16
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
    50                  55                  60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
                325
<210>17
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体MS2
<400>17
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>18
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体M11
<400>18
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>19
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体MX1
<400>19
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>20
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌体NL95
<400>20
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
            180                 185                 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
                245                 250                 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
            260                 265                 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
                325                 330
<210>21
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体f2
<400>21
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>22
<211>128
<212>PRT
<213>噬菌体PP7
<400>22
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
        35                  40                  45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
    50                  55                  60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
            100                 105                 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
        115                 120                 125
<210>23
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>23
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>24
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>24
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>25
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>25
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>26
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>26
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>27
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>27
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>28
<211>184
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>28
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr
            20                  25                  30
Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser
        35                  40                  45
Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
    50                  55                  60
Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser
65                  70                  75                  80
Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
            100                 105                 110
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu
    130                 135                 140
Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg
145                 150                 155                 160
Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>29
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>29
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys
            180
<210>30
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>30
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Thr Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Ile Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys
            180
<210>31
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>31
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Sar Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>32
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>32
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Asn Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>33
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>33
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Thr Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 1l0
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>34
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>34
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>35
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>35
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>36
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>36
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro Gln
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Giu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>37
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>37
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Gly Ser Gln Cys
    210
<210>38
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>38
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Phe Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Asp Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Ser Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>39
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>39
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>40
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>40
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg His Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Arg Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Tyr Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
            165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>41
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>41
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Phe Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Ala Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu yal Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Cys
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>42
<211>183
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成人乙型肝炎病毒核心蛋白基因
<400>42
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>43
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>43
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Ser
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>44
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>44
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>45
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>45
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>46
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>46
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Ala Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Thr Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>47
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>47
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
       195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>48
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>48
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>49
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>49
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Thr Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Gln Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ala Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>50
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>50
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Phe Glu Cys Ser Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>51
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<400>51
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Xaa Asp Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Ile Thr
                85                  90                  95
Leu Ser Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Thr Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>52
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>52
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Asn Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>53
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>53
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Cys Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>54
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>54
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Prc Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Pro Gln Cys
    210
<210>55
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>55
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Ser Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>56
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>56
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Leu Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>57
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>57
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Lys Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>58
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>58
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ala
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>59
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>59
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Thr Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Gln Asp Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Val Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Val Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>60
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>60
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Val Phe Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>61
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>61
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Thr Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>62
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>62
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Ile Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>63
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>63
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Val
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Ala Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>64
<211>213
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>64
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser
        195                 200                 205
Arg Glu Ser Gln Cys
    210
<210>65
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>65
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Thr Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>66
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>66
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Ala Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Ile Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>67
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>67
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Thr Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>68
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>68
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Arg Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Thr Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>69
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>69
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Val Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ala
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>70
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>70
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Ala Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>71
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>71
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>72
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>72
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys
            180
<210>73
<211>188
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>73
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln
65                  70                  75                  80
Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
            100                 105                 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg ALa Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys
            180                 185
<210>74
<211>217
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>74
Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp
            20                  25                  30
Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe
        35                  40                  45
Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala
    50                  55                  60
Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg
            100                 105                 110
Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln His Thr Val
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr
                165                 170                 175
Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg
            180                 185                 190
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
        195                 200                 205
Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys
    210                 215
<210>75
<211>262
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>75
Met Asp Val Asn Ala Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro
1               5                   10                  15
Asp Asp Phe Phe Pro Lys Ile Glu Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp
            20                  25                  30
Ala Leu Glu Pro Tyr Trp Lys Ser Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu
        35                  40                  45
Ile Ala Thr His Phe Val Asp Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr
    50                  55                  60
Gln Gly Met His Glu Ile Ala Glu Ala Ile Arg Ala Val Ile Pro Pro
65                  70                  75                  80
Thr Thr Ala Pro Val Pro Ser Gly Tyr Leu Ile Gln His Asp Glu Ala
                85                  90                  95
Glu Glu Ile Pro Leu Gly Asp Leu Phe Lys Glu Gln Glu Glu Arg Ile
            100                 105                 110
Val Ser Phe Gln Pro Asp Tyr Pro Ile Thr Ala Arg Ile His Ala His
        115                 120                 125
Leu Lys Ala Tyr Ala Lys Ile Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg
    130                 135                 140
Arg Leu Leu Trp Trp His Tyr Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Ala Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Asn Tyr Ile Ser Arg Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu
                165                 170                 175
Lys Tyr Arg Gly Arg Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro
            180                 185                 190
Ile Gln Val Ala Gln Gly Gly Arg Lys Thr Ser Thr Ala Thr Arg Lys
        195                 200                 205
Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr Val Val
    210                 215                 220
Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Ser Ser Pro
225                 230                 235                 240
Gln Arg Ala Gly Ser Pro Leu Pro Arg Ser Ser Ser Ser His His Arg
                245                 250                 255
Ser Pro Ser Pro Arg Lys
            260
<210>76
<211>305
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>76
Met Trp Asp Leu Arg Leu His Pro Ser Pro Phe Gly Ala Ala Cys Gln
1               5                   10                  15
Gly Ile Phe Thr Ser Ser Leu Leu Leu Phe Leu Val Thr Val Pro Leu
            20                  25                  30
Val Cys Thr Ile Val Tyr Asp Ser Cys Leu Cys Met Asp Ile Asn Ala
        35                  40                  45
Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro
    50                  55                  60
Lys Ile Asp Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp Ala Leu Glu Pro Tyr
65                  70                  75                  80
Trp Arg Asn Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu Ile Ala Thr His Phe
                85                  90                  95
Val Asp Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr Gln Gly Met His Glu
            100                 105                 110
Ile Ala Glu Ala Leu Arg Ala Ile Ile Pro Ala Thr Thr Ala Pro Val
        115                 120                 125
Pro Gln Gly Phe Leu Val Gln His Glu Glu Ala Glu Glu Ile Pro Leu
    130                 135                 140
Gly Glu Leu Phe Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Leu Thr Asn Phe Gln Pro
145                 150                 155                 160
Asp Tyr Pro Val Thr Ala Arg Ile His Ala His Leu Lys Ala Tyr Ala
                165                 170                 175
Lys Ile Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg Arg Leu Leu Trp Trp
            180                 185                 190
His Tyr Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Pro Asn Val Thr Asn Tyr Ile
        195                 200                 205
Ser Arg Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Lys Tyr Arg Gly Lys
    210                 215                 220
Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro Ile Gln Val Ala Gln
225                 230                 235                 240
Gly Gly Arg Asn Lys Thr Gln Gly Val Arg Lys Ser Arg Gly Leu Glu
                245                 250                 255
Pro Arg Arg Arg Arg Val Lys Thr Thr Ile Val Tyr Gly Arg Arg Arg
            260                 265                 270
Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser
        275                 280                 285
Pro Leu Pro Arg Thr Ser Arg Asp His His Arg Ser Pro Ser Pro Arg
    290                 295                 300
Glu
305
<210>77
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>77
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>78
<211>152
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>78
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro G1u His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val
                85                  90                  95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
        115                 120                 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
145                 150
<210>79
<211>3635
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pAP283-58
<400>79
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga    60
gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga    120
ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt    180
gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt    240
taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg    300
tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca    360
atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg    420
ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt    480
ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata    540
gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc    600
taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc    660
atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg    720
taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc    780
agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgcacacagt gcggttgctg    840
gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga    900
gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca    960
tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgcttca acggcctcaa cctactactg    1020
ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gatatggtgc actctcagta    1080
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta tcgctacgtg actgggtcat    1140
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc    1200
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc    1260
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta    1320
tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg    1380
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg    1440
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt    1500
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt    1560
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg    1620
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa    1680
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt    1740
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag    1800
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt    1860
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga    1920
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt    1980
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta    2040
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg    2100
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc    2160
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt    2220
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg    2280
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg    2340
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa    2400
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa    2460
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga    2520
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg    2580
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact    2640
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac    2700
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg    2760
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg    2820
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga    2880
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgcgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc    2940
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg    3000
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc    3060
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc    3120
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt    3180
cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc    3240
gctcgccgca gccgaacgac gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc    3300
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca    3360
tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct    3420
ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa    3480
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac    3540
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag    3600
tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt                               3635
<210>80
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>AP205外壳蛋白
<400>80
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser G1y Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>81
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>AP205外壳蛋白
<400>81
Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>82
<211>3607
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pAP281-32
<400>82
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga    60
gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag    120
acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta    180
tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg    240
aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc    300
agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc    360
agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac    420
actcttcgcg agcggcaacg ccggtttggg tttccttgac cctactgcgg ctatcgtatc    480
gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat    540
acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg    600
tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt    660
cggttgggtt ggacagacct ctgagtttct ggtaacgccg ttccgcaccc cggaaatggt    720
caccgaacca ttcagcaggg tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc    780
ccgcatcacc ggcgccacag gtgcggtgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg    840
gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg atcgctggtt tccgcctggg tatggtggca    900
ggccccgtgg cccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc    960
ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa    1020
gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc    1080
caactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg    1140
ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgcttc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg    1200
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tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc    1500
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tctgctatgt gtcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg    1740
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ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca    1920
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa    1980
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtac gaacggcaac aacgttgcgc aaactattaa    2040
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata    2100
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ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc    2220
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata    2280
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt    2340
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga    2400
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag    2460
cggtcagacc ccgtagaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa    2520
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag    2580
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg    2640
tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat    2700
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta    2760
ccgggttgga ctcaagacga taggtaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg    2820
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc    2880
gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa    2940
gcggcagggt cggaacaaga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc    3000
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt    3060
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct    3120
ttggctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc    3180
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gacggcgcag    3240
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tatggccgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt    3480
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ggtgacaatt aatcatcgaa ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa aagggtatcg    3600
cggaatt                                                              3607

Claims (207)

1.一种增强动物免疫应答的组合物，其包含：
(a)一种病毒样颗粒；和
(b)一种免疫刺激物；
其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒结合。
2.权利要求1的组合物，其进一步包含至少一种抗原，其中所述抗原与所述病毒样颗粒结合。
3.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是一种toll样受体激活物。
4.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是一种细胞因子分泌诱导物。
5.权利要求3的组合物，其中所述toll样受体激活物选自或基本由下列成分组成：
(a)免疫刺激性核酸；
(b)肽聚糖；
(c)脂多糖；
(d)脂磷壁酸；
(e)咪唑并喹啉化合物；
(f)鞭毛蛋白；
(g)脂蛋白；
(h)免疫刺激有机分子；
(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一种物质的任何混合物。
6.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激物选自或基本由下列成分组成：
(a)核糖核酸；
(b)脱氧核糖核酸；
(c)嵌合核酸；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任何混合物。
7.权利要求6的组合物，其中所述核糖核酸是poly(I:C)或其衍生物。
8.权利要求6的组合物，其中所述脱氧核酸选自或基本由下列成分组成：
(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
9.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是一种含非甲基化CpG的寡核苷酸。
10.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒缺乏含脂蛋白的包膜。
11.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒是一种重组病毒样颗粒。
12.权利要求11的组合物，其中所述病毒样颗粒选自：
(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；
(b)重组麻疹病毒蛋白；
(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；
(d)重组轮状病毒蛋白；
(e)重组口蹄疫病毒蛋白；
(f)重组逆转录病毒蛋白；
(g)重组诺瓦克病毒蛋白；
(h)重组人乳头瘤病毒蛋白；
(i)重组BK病毒蛋白；
(j)重组噬菌体蛋白；
(k)重组RNA噬菌体蛋白；
(l)重组Qβ-噬菌体蛋白；
(m)重组GA-噬菌体蛋白；
(n)重组fr-噬菌体蛋白；
(o)重组AP205-噬菌体蛋白；
(p)重组Ty蛋白；和
(q)(a)-(p)中任何一种重组蛋白的片段。
13.权利要求12的组合物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白。
14.权利要求12的组合物，其中所述病毒样颗粒是BK病毒VP1蛋白。
15.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段。
16.权利要求15的组合物，其中所述RNA-噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；
(l)噬菌体PP7；和
(m)噬菌体AP205。
17.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段。
18.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
19.权利要求9的组合物，其中含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列：
5’X1X2CGX3X4 3’
其中X1、X2、X3、X4是任一种核苷酸。
20.权利要求19的组合物，其中至少所述核苷酸X1、X2、X3、X4之一含有磷酸骨架修饰。
21.权利要求9的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含或基本由或由选自下列的序列组成：
(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT；
(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT；
(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG；
(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG；和
(e)如表1所述的“dsCyCpG-253”。
22.权利要求21的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有磷酸骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者该寡核苷酸磷酸骨架的每个磷酸部分均为硫代磷酸酯修饰。
23.权利要求9的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸是回文结构。
24.权利要求23的组合物，其中所述含非甲基化CpG的回文寡核苷酸包含或基本由或由序列GGGGTCAACGTTGAGGGGG组成。
25.权利要求24的组合物，其中所述含非甲基化CpG的回文寡核苷酸含有磷酸骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者该寡核苷酸磷酸骨架的每个磷酸部分均为硫代磷酸酯修饰。
26.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒非共价结合。
27.权利要求9的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸与所述病毒样颗粒非共价结合。
28.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸与一种病毒样颗粒位点结合，该位点选自寡核苷酸结合位点、DNA结合位点和RNA结合位点。
29.权利要求9的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸与一种病毒样颗粒位点结合，该位点选自寡核苷酸结合位点、DNA结合位点和RNA结合位点。
30.权利要求29的组合物，其中所述寡核苷酸结合位点是一种非天然存在的寡核苷酸结合位点。
31.权利要求29的组合物，其中所述病毒样颗粒位点包含一个富含精氨酸的重复片段。
32.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸含有磷酸骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者该寡核苷酸磷酸骨架的每个磷酸部分均为硫代磷酸酯修饰。
33.权利要求9的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有磷酸骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者该寡核苷酸磷酸骨架的每个磷酸部分均为硫代磷酸酯修饰。
34.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含约6-约100000个核苷酸。
35.权利要求34的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含约6-约2000个核苷酸。
36.权利要求35的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含约20-约2000个核苷酸。
37.权利要求36的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含约20-约300个核苷酸。
38.权利要求37的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含20-100个核苷酸。
39.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含超过100-约2000个核苷酸。
40.权利要求39的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含超过100-约1000个核苷酸。
41.权利要求40的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含超过100-约500个核苷酸。
42.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种重组寡核苷酸。
43.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种基因组寡核苷酸。
44.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种合成寡核苷酸。
45.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种质粒衍生的寡核苷酸。
46.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种单链寡核苷酸。
47.权利要求5的组合物，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种双链寡核苷酸。
48.权利要求2的组合物，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒通过至少一个共价键结合。
49.权利要求2的组合物，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒通过至少一个共价键结合，其中该共价键是非肽键。
50.权利要求2的组合物，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒融合。
51.权利要求2的组合物，其中所述抗原或抗原决定簇进一步包含至少一个第二附着位点，该位点选自：
(a)所述抗原或抗原决定簇中非天然存在的附着位点；和
(b)所述抗原或抗原决定簇中天然存在的附着位点。
52.权利要求2的组合物，其进一步包含一种氨基酸接头，其中该氨基酸接头包含或由所述第二附着位点组成。
53.权利要求2的组合物，其中所述抗原选自：
(a)多肽；
(b)碳水化合物；
(c)类固醇激素；和
(d)有机分子。
54.权利要求53的组合物，其中所述抗原是一种有机分子。
55.权利要求54的组合物，其中所述有机分子选自：
(a)可待因；
(b)芬太尼；
(c)海洛因；
(d)吗啡；
(e)苯丙胺；
(f)可卡因；
(g)亚甲二氧基去氧麻黄碱；
(h)去氧麻黄碱；
(i)哌甲酯；
(j)烟碱；
(k)LSD；
(l)麦斯卡林；
(m)赛洛西宾；和
(n)四氢大麻酚。
56.权利要求2的组合物，其中所述抗原是一种重组抗原。
57.权利要求2的组合物，其中所述抗原来源于：
(a)病毒；
(b)细菌；
(c)寄生虫；
(d)朊病毒；
(e)肿瘤；
(f)自身分子；
(g)非肽半抗原分子；
(h)变应原；和
(i)激素。
58.权利要求57的组合物，其中所述抗原是一种肿瘤抗原。
59.权利要求58的组合物，其中所述肿瘤抗原选自：
(a)Her2；
(b)GD2；
(c)EGF-R；
(d)CEA；
(e)CD52；
(f)CD21；
(g)人黑素瘤蛋白gp100；
(h)人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1；
(i)酪氨酸酶；
(j)NA17-Ant蛋白；
(k)MAGE-3蛋白；
(l)p53蛋白；
(m)HPV16 E7蛋白；
(n)(a)-(m)中任一种肿瘤抗原的抗原性片段。
60.权利要求2的组合物，其中所述抗原与所述病毒样颗粒通过连接序列结合。
61.权利要求60的组合物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白。
62.权利要求60的组合物，其中所述病毒样颗粒是BK病毒核心蛋白。
63.权利要求2的组合物，其中所述抗原是一种细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或至少两种所述表位的组合，其中所述至少两种表位直接结合或通过连接序列结合。
64.权利要求63的组合物，其中所述细胞毒性T细胞表位是病毒性或肿瘤细胞毒性T细胞表位。
65.权利要求63的组合物，其中所述抗原与所述病毒样颗粒通过连接序列结合。
66.权利要求63的组合物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白。
67.权利要求66的组合物，其中所述细胞毒性T细胞表位与乙型肝炎病毒核心蛋白的C端融合。
68.权利要求67的组合物，其中所述细胞毒性T细胞表位与所述乙型肝炎病毒核心蛋白的C端通过连接序列融合。
69.权利要求63的组合物，其中所述病毒样颗粒是BK病毒VP1蛋白。
70.权利要求69的组合物，其中所述细胞毒性T细胞表位与所述BK病毒VP1蛋白的C端融合。
71.权利要求70的组合物，其中所述细胞毒性T细胞表位与所述BK病毒VP1蛋白的C端通过连接序列融合。
72.一种增强动物免疫应答的方法，包括向所述动物体内导入一种组合物，该组合物包含：
(a)一种病毒样颗粒；和
(b)一种免疫刺激物；
其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒结合。
73.权利要求72的方法，其进一步包含一种抗原，其中所述抗原与所述病毒样颗粒结合。
74.权利要求72的方法，其中所述免疫刺激物是一种toll样受体激活物。
75.权利要求72的方法，其中所述免疫刺激物是一种细胞因子分泌诱导物。
76.权利要求74的方法，其中所述toll样受体激活物选自或基本由下列成分组成：
(a)免疫刺激性核酸；
(b)肽聚糖；
(c)脂多糖；
(d)脂磷壁酸；
(e)咪唑并喹啉化合物；
(f)鞭毛蛋白；
(g)脂蛋白；
(h)免疫刺激性有机分子；
(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一种物质的任何混合物。
77.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激物选自或基本由下列成分组成：
(a)核糖核酸；
(b)脱氧核糖核酸；
(c)嵌合核酸；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任何混合物。
78.权利要求77的方法，其中所述核糖核酸是poly(I:C)或其衍生物。
79.权利要求77的方法，其中所述脱氧核酸选自或基本由下列成分组成：
(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
80.权利要求72的方法，其中所述免疫刺激物是一种含非甲基化CpG的寡核苷酸。
81.权利要求72的方法，其中所述病毒样颗粒缺乏含脂蛋白的包膜。
82.权利要求72的方法，其中所述病毒样颗粒是一种重组病毒样颗粒。
83.权利要求82的方法，其中所述病毒样颗粒选自：
(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；
(b)重组麻疹病毒蛋白；
(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；
(d)重组轮状病毒蛋白；
(e)重组口蹄疫病毒蛋白；
(f)重组逆转录病毒蛋白；
(g)重组诺瓦克病毒蛋白；
(h)重组人乳头瘤病毒蛋白；
(i)重组BK病毒蛋白；
(j)重组噬菌体蛋白；
(k)重组RNA噬菌体蛋白；
(l)重组Qβ-噬菌体蛋白；
(m)重组GA-噬菌体蛋白；
(n)重组fr-噬菌体蛋白；
(o)重组AP205-噬菌体蛋白；
(p)重组Ty蛋白；和
(q)(a)-(p)中任何一种重组蛋白的片段。
84.权利要求83的方法，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白。
85.权利要求83的方法，其中所述病毒样颗粒是BK病毒VP1蛋白。
86.权利要求72的方法，其中病毒样颗粒包含RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段。
87.权利要求86的方法，其中所述RNA-噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；
(l)噬菌体PP7；和
(m)噬菌体AP205。
88.权利要求72的方法，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段。
89.权利要求72的方法，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
90.权利要求80的方法，其中含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列：
5’X1X2CGX3X4 3’
其中X1、X2、X3、X4是任一种核苷酸。
91.权利要求90的方法，其中至少所述核苷酸X1、X2、X3、X4之一含有磷酸骨架修饰。
92.权利要求80的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含或基本由或由选自下列的序列组成：
(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT；
(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT；
(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG；
(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG；和
(e)如表1所述的“dsCyCpG-253”。
93.权利要求92的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有磷酸骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者该寡核苷酸磷酸骨架的每个磷酸部分均为硫代磷酸酯修饰。
94.权利要求80的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸是回文结构。
95.权利要求94的方法，其中所述含非甲基化CpG的回文寡核苷酸包含或基本由或由序列GGGGTCAACGTTGAGGGGG组成。
96.权利要求95的方法，其中所述含非甲基化CpG的回文寡核苷酸含有磷酸骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者该寡核苷酸磷酸骨架的每个磷酸部分均为硫代磷酸酯修饰。
97.权利要求72的方法，其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒非共价结合。
98.权利要求72的方法，其中所述病毒样颗粒是在一种细菌表达系统中生产的。
99.权利要求72的方法，其中所述病毒样颗粒是在一种酵母表达系统中生产的。
100.权利要求80的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸与所述病毒样颗粒非共价结合。
101.权利要求72的方法，其中所述免疫刺激性核酸被所述病毒样颗粒包装，优选地包封。
102.权利要求80的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸被所述病毒样颗粒包装，优选地包封。
103.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸与一种病毒样颗粒位点结合，该位点选自寡核苷酸结合位点、DNA结合位点和RNA结合位点。
104.权利要求80的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸与一种病毒样颗粒位点结合，该位点选自寡核苷酸结合位点、DNA结合位点和RNA结合位点。
105.权利要求104的方法，其中所述寡核苷酸结合位点是一种非天然存在的寡核苷酸结合位点。
106.权利要求104的方法，其中所述病毒样颗粒位点包含一个富含精氨酸的重复片段。
107.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸含有磷酸骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者该寡核苷酸磷酸骨架的每个磷酸部分均为硫代磷酸酯修饰。
108.权利要求80的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有磷酸骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者该寡核苷酸磷酸骨架的每个磷酸部分均为硫代磷酸酯修饰。
109.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含约6-约100000个核苷酸。
110.权利要求109的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含约6-约2000个核苷酸。
111.权利要求110的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含约20-约2000个核苷酸。
112.权利要求111的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含约20-约300个核苷酸。
113.权利要求112的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含20-100个核苷酸。
114.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含超过100-约2000个核苷酸。
115.权利要求114的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含超过100-约1000个核苷酸。
116.权利要求115的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含超过100-约500个核苷酸。
117.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种重组寡核苷酸。
118.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种基因组寡核苷酸。
119.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种合成寡核苷酸。
120.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种质粒衍生的寡核苷酸。
121.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种单链寡核苷酸。
122.权利要求76的方法，其中所述免疫刺激性核酸，优选地所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，是一种双链寡核苷酸。
123.权利要求73的方法，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒通过至少一个共价键结合。
124.权利要求73的方法，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒通过至少一个共价键结合，其中该共价键是非肽键。
125.权利要求73的方法，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒融合。
126.权利要求73的方法，其中所述抗原或抗原决定簇进一步包含至少一个第二附着位点，该位点选自：
(a)所述抗原或抗原决定簇中非天然存在的附着位点；和
(b)所述抗原或抗原决定簇中天然存在的附着位点。
127.权利要求73的方法，其进一步包含一种氨基酸接头，其中该氨基酸接头包含或由所述第二附着位点组成。
128.权利要求73的方法，其中所述抗原选自：
(a)多肽；
(b)碳水化合物；
(c)类固醇激素；和
(d)有机分子。
129.权利要求128的方法，其中所述抗原是一种有机分子。
130.权利要求129的方法，其中所述有机分子选自：
(a)可待因；
(b)芬太尼；
(c)海洛因；
(d)吗啡；
(e)苯丙胺；
(f)可卡因；
(g)亚甲二氧基去氧麻黄碱；
(h)去氧麻黄碱；
(i)哌甲酯；
(j)烟碱；
(k)LSD；
(l)麦斯卡林；
(m)赛洛西宾；和
(n)四氢大麻酚。
131.权利要求73的方法，其中所述抗原是一种重组抗原。
132.权利要求73的方法，其中所述抗原来源于：
(a)病毒；
(b)细菌；
(c)寄生虫；
(d)朊病毒；
(e)肿瘤；
(f)自身分子；
(g)非肽半抗原分子；
(h)变应原；和
(i)激素。
133.权利要求132的方法，其中所述抗原是一种肿瘤抗原。
134.权利要求133的方法，其中所述肿瘤抗原选自：
(a)Her2；
(b)GD2；
(c)EGF-R；
(d)CEA；
(e)CD52；
(f)CD21；
(g)人黑素瘤蛋白gp100；
(h)人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1；
(i)酪氨酸酶；
(j)NA17-Ant蛋白；
(k)MAGE-3蛋白；
(l)p53蛋白；
(m)HPV16 E7蛋白；
(n)(a)-(m)中任一种肿瘤抗原的抗原片段。
135.权利要求73的方法，其中所述抗原与所述病毒样颗粒通过连接序列结合。
136.权利要求135的方法，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白。
137.权利要求135的方法，其中所述病毒样颗粒是BK病毒VP1蛋白。
138.权利要求73的方法，其中所述抗原是一种细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或至少两种所述表位的组合，其中所述至少两种表位直接连接或通过连接序列连接。
139.权利要求138的方法，其中所述细胞毒性T细胞表位是病毒性或肿瘤细胞毒性T细胞表位。
140.权利要求138的方法，其中所述抗原与所述病毒样颗粒通过连接序列结合。
141.权利要求138的方法，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白。
142.权利要求141的方法，其中所述细胞毒性T细胞表位与所述乙型肝炎病毒核心蛋白的C端融合。
143.权利要求142的方法，其中所述细胞毒性T细胞表位与所述乙型肝炎病毒核心蛋白的C端通过连接序列融合。
144.权利要求138的方法，其中所述病毒样颗粒是BK病毒VP1蛋白。
145.权利要求144的方法，其中所述细胞毒性T细胞表位与所述BK病毒VP1蛋白的C端融合。
146.权利要求145的方法，其中所述细胞毒性T细胞表位与所述BK病毒VP1蛋白的C端通过连接序列融合。
147.权利要求72的方法，其中所述免疫应答是增强的B细胞应答。
148.权利要求72的方法，其中所述免疫应答是增强的T细胞应答。
149.权利要求148的方法，其中所述T细胞应答是一种CTL应答。
150.权利要求148的方法，其中所述T细胞应答是一种Th细胞应答。
151.权利要求150的方法，其中所述Th细胞应答是Th1细胞应答。
152.权利要求72的方法，其中所述动物是一种哺乳动物。
153.权利要求152的方法，其中所述哺乳动物是人。
154.权利要求72的方法，其中所述组合物通过皮下、肌肉内、静脉内、鼻内或直接导入淋巴结内来导入动物体内。
155.一种生产可增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物包含一种病毒样颗粒和与所述病毒样颗粒结合的免疫刺激物，该方法包括：
(a)所述病毒样颗粒与所述免疫刺激物一起孵育；
(b)添加RNase；和
(c)纯化该组合物。
156.权利要求155的方法，其中所述免疫刺激物是一种免疫刺激性核酸，其选自或基本由下列成分组成：
(a)核糖核酸；
(b)脱氧核糖核酸；
(c)嵌合核酸；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任何混合物。
157.权利要求156的方法，其中所述核糖核酸是poly(I:C)或其衍生物。
158.权利要求156的方法，其中所述脱氧核酸选自或基本由下列成分组成：
(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
159.权利要求155的方法，其中所述免疫刺激物是一种含非甲基化CpG的寡核苷酸。
160.权利要求155的方法，其中所述病毒样颗粒是在一种细菌表达系统中生产的。
161.权利要求155的方法，其中所述RNase是RNase A。
162.一种生产可增强动物免疫应答的组合物的方法，所述组合物包含病毒样颗粒和与所述病毒样颗粒结合的免疫刺激物，该方法包括：
(a)将所述病毒样颗粒与Rnase一起孵育；
(b)添加所述免疫刺激物；和
(c)纯化该组合物。
163.权利要求162的方法，其中所述免疫刺激物是一种免疫刺激性核酸，其选自或基本由下列成分组成：
(a)核糖核酸；
(b)脱氧核糖核酸；
(c)嵌合核酸；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任何混合物。
164.权利要求163的方法，其中所述核糖核酸是poly(I:C)或其衍生物。
165.权利要求163的方法，其中所述脱氧核酸选自或基本由下列成分组成：
(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
166.权利要求162的方法，其中所述免疫刺激物是一种含非甲基化CpG的寡核苷酸。
167.权利要求162的方法，其中所述病毒样颗粒是在一种细菌表达系统中生产的。
168.权利要求162的方法，其中所述RNase是RNase A。
169.一种生产可增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物包含病毒样颗粒和与所述病毒样颗粒结合的免疫刺激物，该方法包括：
(a)解装配所述病毒样颗粒；
(b)添加所述免疫刺激物；和
(c)重装配所述病毒样颗粒。
170.权利要求169的方法，其中所述免疫刺激物是一种免疫刺激性核酸，其选自或基本由下列成分组成：
(a)核糖核酸；
(b)脱氧核糖核酸；
(c)嵌合核酸；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任何混合物。
171.权利要求170的方法，其中所述核糖核酸是poly(I:C)或其衍生物。
172.权利要求170的方法，其中所述脱氧核酸选自或基本由下列成分组成：
(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
173.权利要求169的方法，其中所述免疫刺激物是一种含非甲基化CpG的寡核苷酸。
174.权利要求169的方法，其进一步包括除去解装配的病毒样颗粒中的核酸。
175.权利要求169的方法，其进一步包括在重装配(c)后纯化所述组合物。
176.一种生产可增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物包含病毒样颗粒和与所述病毒样颗粒结合的免疫刺激物，该方法包括：
(a)将所述病毒样颗粒与包含金属离子、能够水解所述病毒样颗粒中核酸的溶液一起孵育；
(b)添加所述免疫刺激物；和
(c)纯化该组合物。
177.权利要求176的方法，其中所述免疫刺激物是一种免疫刺激性核酸，其选自或基本由下列成分组成：
(a)核糖核酸；
(b)脱氧核糖核酸；
(c)嵌合核酸；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任何混合物。
178.权利要求177的方法，其中所述核糖核酸是poly(I:C)或其衍生物。
179.权利要求177的方法，其中所述脱氧核酸选自或基本由下列成分组成：
(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
180.权利要求176的方法，其中所述免疫刺激物是一种含非甲基化CpG的寡核苷酸。
181.权利要求176的方法，其中所述金属离子选自：
(a)锌(Zn)离子；
(b)铜(Cu)离子；
(c)铁(Fe)离子；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种离子的任何混合物。
182.一种疫苗，其包含免疫有效量的权利要求1的组合物，和一种药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
183.权利要求182的疫苗，其还包含一种佐剂。
184.一种免疫或治疗动物的方法，包括对所述动物施用免疫有效量的权利要求182的疫苗。
185.权利要求184的方法，其中所述动物是一种哺乳动物。
186.权利要求185的方法，其中所述哺乳动物是人。
187.一种疫苗，其包含免疫有效量的权利要求2的组合物，和一种药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
188.权利要求187的疫苗，其还包含一种佐剂。
189.一种免疫或治疗动物的方法，包括对所述动物施用免疫有效量的权利要求187的疫苗。
190.权利要求189的方法，其中所述动物是一种哺乳动物。
191.权利要求190的方法，其中所述哺乳动物是人。
192.一种免疫或治疗动物的方法，包括通过施用免疫有效量的权利要求182的疫苗，在所述动物中引发T细胞应答。
193.权利要求192的方法，其进一步包括在所述动物中加强免疫应答的步骤。
194.权利要求193的方法，其中通过施用免疫有效量的权利要求182的疫苗或免疫有效量的异种疫苗实现这种加强。
195.权利要求194的方法，其中所述异种疫苗是一种DNA疫苗。
196.一种免疫或治疗动物的方法，包括通过施用免疫有效量的权利要求182的疫苗，在所述动物中加强T细胞应答。
197.权利要求196的方法，其进一步包括在所述动物中引发T细胞应答的步骤。
198.权利要求197的方法，其中通过施用免疫有效量的权利要求182的疫苗或免疫有效量的异种疫苗实现这种引发。
199.权利要求198的方法，其中所述异种疫苗是一种DNA疫苗。
200.一种免疫或治疗动物的方法，包括通过施用免疫有效量的权利要求187的疫苗，在所述动物中引发T细胞应答。
201.权利要求200的方法，其进一步包括在所述动物中加强免疫应答的步骤。
202.权利要求201的方法，其中通过施用免疫有效量的权利要求187的疫苗或免疫有效量的异种疫苗实现这种加强。
203.权利要求202的方法，其中所述异种疫苗是一种DNA疫苗或病毒疫苗或金丝雀痘疫苗。
204.一种免疫或治疗动物的方法，包括通过施用免疫有效量的权利要求187的疫苗，在所述动物中加强T细胞应答。
205.权利要求204的方法，其进一步包括在所述动物中引发T细胞应答的步骤。
206.权利要求205的方法，其中通过施用免疫有效量的权利要求187的疫苗或免疫有效量的异种疫苗实现这种引发。
207.权利要求206的方法，其中所述异种疫苗是一种DNA疫苗或病毒疫苗或金丝雀痘疫苗。
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