CN1185811A - 依赖于逆转录病毒样颗粒的抗原呈递系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于哺乳动物预防性或治疗性免疫抗传染性疾病或肿瘤的基于一种DNA序列的抗原呈递系统,该DNA序列编码能够自组装成天脂膜颗粒的蛋白,优选逆转录病毒族转异性抗原(gag)。

Description

依赖于逆转录病毒样颗粒的抗原呈递系统
发明的技术领域
发明的技术问题是以逆转录病毒型特异性抗原(gag)为基础提供抗原呈递系统用于抗哺乳动物感染性疾病或肿瘤的预防性或治疗性免疫。这项发明特别涉及到设计新的抗原呈递系统如：重组杆状病毒，塞姆利森林病毒、永恒转染的昆虫细胞或哺乳动物细胞。这项发明的基础是逆转录病毒的型特异性抗原如HIV-1的Pr55 gag前体蛋白在哺乳动物表达形成不成熟的逆转录病毒样颗粒。将完整的蛋白锚定在病毒样颗粒表面，可使这种不成熟病毒样颗粒(VLPs)的免疫原性增强，这些蛋白既可以来源gag载体成分的同一病毒的自身膜蛋白，也可以来源于其它任何病毒，感染因子，肿瘤细胞。自身蛋白或外源蛋白稳定锚定在病毒样颗粒的表面需要逆转录病毒的gag前体蛋白与待呈递的抗原的共表达，而且，呈递的抗原必须包括氨基端的信号序列和一个跨膜区，以保证抗原通过内质网运输到胞膜并稳定锚定在出胞的病毒样颗粒的表面。为了表明这一新颖的抗原呈递系统的通用性，我们在HIV-1 Pr55 gag前体蛋白的基础上构建了重组的病毒样颗粒，其能够呈递：●完整的HIV-1的外膜蛋白gp160。●通过来源于EB病毒的主要膜抗原gp220/350的一个异源性跨膜区，将锚定在病毒样颗粒表面的HIV-1的外在蛋白gp120的衍生物●或马疱疹病毒糖蛋白(gB)给免疫系统。不需用佐剂，这些刺状的、非复制的、非感染性的病毒样颗粒即可在不同动物模型中诱导出体液免疫、细胞免疫并具有保护性免疫。
背景
对病毒感染或癌变的病理的深入探索导致预防和治疗对策的产生，许多策略包括对宿主免疫的辅助。对包括多种多样的免疫能干细胞、细胞因子和抗原呈递途径的免疫网络的进一步明了有助于合理地调动特定的免疫反应支。在早期和无症状阶段，细胞免疫支的调动似乎在控制HIV-1感染中起关键作用，同样观察到，细胞免疫在控制肿瘤上起关键作用。诱导细胞免疫和体液免疫的一个关键问题在于建立未来用于人类的合适的、安全的抗原呈递系统。
在对蛋白抗原的免疫反应中，抗原呈递细胞(APC)处理和呈递抗原的模式决定哪些T细胞效应功能被特异性激活。简而言之，两种处理途径绝然不同：外源性途径中，细胞外液的蛋白或细胞膜上的蛋白进入呈递细胞，在细胞内经变性并在后期酸性环境中降解为12-15肽。这种途径产生的肽结合MHC-II类分子，转移到呈递细胞表面，并选择性激活CD4+细胞。可溶性蛋白抗原免疫一般激活CD4+T细胞(Germain，1991；Germainand Hendrix，1991)。而在内源性处理性途径，CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)被选择性激活。细胞内蛋白在胞浆中降解为8-15肽。这些肽转移到内质网并在那里结合初生的MHC-Iβ2m微球蛋白二聚体重链区，从而产生有运输能力的三聚体复合物，在无分泌途径存在时迅速转运到呈递细胞的表面。由I类分子呈递的肽选择性地激活CD8+细胞(Yewdell andBennink，1992；Townsend and Bodrner，1989)。
使用活的、重组病毒如痘苗病毒、腺病毒来克服内源性处理抗原途径中抗原呈递的问题日益不受人欢迎。而且，从安全的角度讲，在免疫低下病人身上使用这些方法也是难以接受的。然而，已经有许多不同方法，利用一些非复制因子将选择性的抗原决定簇或蛋白呈递给免疫系统，这些非复制因子包括短脂肽、整合到ISCOM颗粒的蛋白(Takahashi et al.1990；vanBinnendijk et al.1992；Larsson et a l.1993)、脂质体(Collins etal.1992；Huang et al.1992；Lopes and Chain，1992；Nair etal.1992；Reddy et al.1992；Zhou et al.1992；Chen et al.1993)或相关的去垢剂型佐剂皂甙(Newman et al.1992)或角鲨烯(Raychaudhuri et al.1992)。显示在体诱导由MHC-I类分子限制的细胞毒CD8+细胞的特别的运载系统主要基于病毒蛋白或酵母TY颗粒(Layton et al.1993；Martin et al.1993)。这些抗原呈递系统好象无须佐剂就引发强烈的免疫反应，但存在呈递的相关外源性抗原决定簇数量有限的问题。
为了开发一种非复制性的重组的HIV疫苗，我们探索构建一个基于重组的HIV-1 Pr55gag病毒样颗粒模拟不成熟的HIV病毒颗粒的抗原呈递系统。这种方法通过一个已证明的高度免疫相关载体呈递附加的、选择性的抗原决定簇，这些决定簇通过诱导抑制性抗体(Papsidero et al.1989；Wagner et al.1992)和细胞毒T淋巴细胞(Nixon et al.1988；Nixon et al.1990；Phillips and McMichael，1993)而产生免疫保护作用。非感染性的、形态上不成熟HIV-1病毒样颗粒的形成仅依赖于肉豆蔻化的HIV-1gag多聚体的表达(Gottlinger et al.1989)。已表明可通过用重组的痘苗病毒(Lopes and Chain，1992)或杆状病毒(Krausslich et al.1993)瞬时(Karacostas et al.1993；Wagneret al.1991)或永恒转染的真核细胞系(Gheysen et al.1989；Wagneret al.1992)产生重组病毒样颗粒。在这些重组的HIV-1 Pr55gag病毒样颗粒的基础上，我们构建了新颖的高度免疫原性抗原呈递系统，它能够将选择的、高度免疫相关的决定簇呈递给免疫系统。
在这一概念下，构建Pr55 gag表达盒允许插入gag以外的HIV阅读框中经过仔细选择的决定簇。当在真核细胞表达时，形成的嵌合蛋白将装配到不成熟的病毒样颗粒上，并呈递附加的免疫相关决定簇，排除有负面效应的决定簇，如：移植物抗宿主样反应、抗体增强HIV感染的CD4+细胞反应、gp120介导的凋亡。Pr55 gag缺失分析显示p24CA(aa211-241)和p6LI(aa436-471)两个结构域负责不成熟的病毒样颗粒突变体的装配，(1)gp120的主要中和抗体决定簇V3或(2)CD4结合结构域或(3)高度保守的gp41中和位点插入Pr55gag缺失体的易感区或融合到完整的前体蛋白的羧基端。通过重组的杆状病毒，这些嵌合体在昆虫细胞中表达出嵌合体病毒样颗粒，并在上清液中获得高纯度、高产量(Wagner etal.1994)。
为了分析这些抗原的免疫力，四组大白兔以四周的时间间隔分别注射纯化病毒样颗粒的不同制剂。所有的嵌合体病毒样颗粒免疫导致针对Pr55gag载体成分的高滴度抗体(1/100000〕。然而，特异性抗体和对同源病毒的中和的诱导依赖于插入的决定簇在gag运输多肽中的位置。给予完全弗氏佐剂不能显著地提高抗血清的抗体滴度或中和能力。相比而言，纯化的单体多肽的抗原性比重组的病毒样颗粒制剂差得多。
对于大多数病毒感染，细胞介导的免疫，特别是细胞毒T淋巴细胞反应，在控制疾病中起重要作用。有充足的证据表明HIV感染也是这样。来源于“长期不进展者”的新资料表明广泛的、复合的CTL反应对于控制HIV-1的感染很重要。Takahashi及其同事发现含有BALB/c小鼠的H2-Dd限制性CTL表位的V3-IIIB环，通过设计合理的抗原，可以作为有用的、快速的、容易取得的动物模型来研究CTL反应(Takahashi et al.1988)。以前，用三种不同的Pr55gag/V3重组痘苗病毒免疫BALB/c小鼠导致很强的CD8+CTL反应，这种反应与V3环在Pr55gag中的位置无关。这表明：用复制型载体，通过用嵌合的多肽作实验，改变旁侧序列不会对V3的处理和呈递产生负面影响(Wagner et al.1993)。
但以上表明应用外源性脂蛋白颗粒、脂蛋白、脂质体介导的蛋白转运来诱导CD8+的CTL是可行的，因此我们考察了嵌合的Pr55gag/V3诱导的V3特异性的CD8+的CTL反应。通过腹腔内(IP)、皮下(SC)、静脉(IV)注射三种途径给予BALB/c不同的病毒样颗粒制剂。免疫后5天，取小鼠脾进行细胞培养，并用V3肽标记的同基因型P815细胞再刺激，作淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养5天。经5天的体外再激活，检测效应细胞的特异性细胞毒活性。标准的51Cr释放实验中的靶细胞为16个氨基酸残基的V3共享肽(RIRIGPGRAFVTIGKI)标记的同基因型的A20或P815细胞，用于标记的肽能被V3特异的CTL所识别(Wagner et al.1992)。抗原的注射剂量与V3特异性的CTL反应在20微克到100纳克之间存在量效关系，100ng时的CTL仍认为是阳性。无论是腹腔内(IP)、皮下(SC)或静脉(IV)注射途径均不影响CTL活性。V3特异性的CTL不仅在脾脏，而且在淋巴结中也可以检测到。用裸露Pr55gag/V3病毒样颗粒免疫BALB/c小鼠，无需佐剂或复制型载体的条件下，可有效的诱导CTL反应(69％特异性裂解)，对照组中吸附在白蛋白或不完全弗氏佐剂上的病毒样颗粒只能激活微弱的CTL反应(24％、37％特异性裂解)。如上所述，对于不同类型的Pr55gag/V3重组的痘苗病毒，V3区在嵌合病毒样颗粒变异体(Pr55gag/V3-3/，Pr55gag/V3-4，Pr55gag/V3-5)中的位置不影响V3特异性的CTL反应的诱导。相比而言，在体内用重组的gp160只能诱导微弱的CTL反应，用Pr55gag病毒样颗粒或16氨基酸的V3肽免疫不足以诱导特异性的CTL反应。这些数据清楚地表明：重组的嵌合型病毒样颗粒是一个在体内能够诱导强的、特异性的CD8+/CTL反应和体液免疫的有效工具。
最近，在HIV病人和被免疫的猴子中证实，通过识别gp120外膜蛋白上的保守构象产生针对不同HIV毒株的中和抗体。因此，为了能够在●有效的CTL反应的同时●完全不需佐剂●不需要复制型载体条件下诱导这种抗体群，我们建立了一个新方法，利用一个异源的跨膜区(TM)，使gp120及其衍生物可以稳定地共价锚定在重组的HIV病毒样颗粒表面。这里，我们阐述呈递完整的外膜蛋白或嵌合体衍生物到免疫系统的过程，而且，我们将这一抗原呈递系统扩展到HIV以外的其它病毒来源的异源蛋白，这些病毒可以是EB病毒或马疱疹病毒(EHV-1)。在所有动物实验中，我们能够检测到这种抗原呈递系统诱导的细胞免疫和体液免疫。
发明简介
本发明解决的技术问题是要提供来自HIV或其它病毒、感染性试剂或肿瘤细胞的编码单纯的或经过修饰的多肽的DNA序列，其使这些多肽能够呈现在非感染性的逆转录病毒样颗粒表面。
解决以上技术上问题的办法是通过提供权利要求书中表征的实施方案而实现。
因此，本发明涉及到通过非感染性的逆转录病毒样颗粒将重要的抗原决定簇、单一的或嵌合的多肽呈递给免疫系统。
一种理想的具体方案为逆转录病毒样颗粒载体，由逆转录病毒的对人或其它灵长类动物有致病性的型别特异性抗原(gag)编码。
编码逆转录病毒样颗粒优选的DNA序列来源于HTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2、SIV或FIV中的任何一种逆转录病毒。
更优选的实施方案中，这种gag多肽是HIV-1的pr55gag。依赖于所用的宿主，gag多肽在宿主体内能自发的形成所谓的逆转录病毒样颗粒。
所选的另一种逆转录病毒样颗粒是由逆转录病毒的gag及其表面的一些刺突构成，这些刺突是由一些免疫相关的多肽和蛋白形成，共同呈递给免疫系统。
这些免疫相关的多肽或蛋白可来自任何感染性的物质或肿瘤细胞。优选逆转录病毒样颗粒所呈递的蛋白可以是单纯的(自然界存在)或嵌合的(自然界不存在)膜蛋白。
更优选的是，这些膜抗原可来自不同病毒，如，逆转录病毒或疱疹病毒。
更具体的方案是镶嵌在逆转录病毒样颗粒表面的外膜蛋白可来自任何逆转录病毒，包括HTLV-1，HTLV-2，HIV-1，HIV-2、SIV、FIV、EBV或马疱疹病毒(EHV)。更特殊的是，镶嵌在以上所说的逆转录病毒样颗粒表面的抗原是完整的HIV-1 gp160外膜蛋白、EBV gp220/350主要膜抗原或单纯疱疹病毒gB的EHV同源体。
在更一优选方案中，给定膜蛋白的穿膜区和胞浆区可被异源穿膜序列所代替，这种异源蛋白可由任何病毒或细胞膜蛋白编码。
上述含有一短的胞浆内末端的穿膜区来源于EBV的主要膜抗原gp220/350。
编码含有一短的胞浆内末端的穿膜区的EBVgp220/350d1DNA序列通过一段灵活的甘氨酸/丝氨酸的短序列连接到HIV-1 gp120糖蛋白及其衍生物上。
而且来自IL-3基因并编码其信号肽的5′DNA序列通过一段短的多克隆位点与甘氨酸/丝氨酸连接子及EBV gp220/350穿膜蛋白序列连接。
多克隆位点允许任何编码免疫相关序列的插入。
更重要的是，基于真核表达系统，融合的IL-3的N端信号肽序列介导嵌合蛋白从内质网转运到细胞膜表面。嵌合多肽在细胞膜表面的锚定是通过EBV gp220/350穿膜区锚定序列融合于嵌合多肽羧基端的结果。
取决于所用宿主细胞，上述逆转录病毒的gag多肽和单纯(自然界存在的)或嵌合(自然界不存在的)膜蛋白共表达并自发形成逆转录病毒样颗粒，其表面有单纯或嵌合型膜蛋白形成的刺突。
取决于所用宿主细胞和培养条件，上述带有刺突的逆转录病毒样颗粒可分泌到细胞培养上清液中，便于从培养基中回收表达产物。
更进一步，产生上述带有刺突的逆转录病毒样颗粒的系统可以是：(1)昆虫细胞中依赖于杆状病毒的表达系统，(2)稳定转染的果蝇细胞，(3)来源于Semliki-Forest病毒的驱动表达系统，(4)其它任何哺乳细胞系，如CHO细胞。
逆转录病毒样颗粒表面的抗原为至少含有一种抗原决定簇的多价抗原，通过与抗体结合，可用于各种感染体和细胞恶变的诊断。
上述重组VLPs可将至少一种来源于各种感染性和恶性抗原决定簇呈递给免疫系统，并刺激体液和细胞免疫应答，作为一种药物成分起到预防和治疗作用。
将一定足够量的上述VLPs用于人或马后诱导其免疫应答，可用于常规的预防和治疗HIV感染，EBV感染或EBV相关疾病及EHV感染。
附图简述图.1：图示编码gp160和gp120的嵌合基因gp160、gp120/TM，gp1205-/TM、gp12020-/TM质粒的构建。框中的数字是编码区的第一个核苷酸(ATG起始密码子的A)；一指合成的寡核苷酸(OI)。A.由pUJC8通过插入两个退火的寡核苷酸OI1和OI2产生plin20(MCS＝56个核苷酸的多克隆位点)。标出了MCS中的限制性内切酶位点。B.寡核苷酸3a和4a为人工合成，用于产生PCR片段，该片段编码IL-3信号肽。重切75核苷的PCR产物插入plin20的EcoR I/Ksp I位点产生plin20-S。C.寡核苷酸5和6用于产生编码缺失N端30个残基信号肽的gp160基因的PCR片段。用Ksp I/Pst I重切产生2481bp的PCR片段并插入plin20-S形成plin20-S-gp160。D.寡核苷酸7和8用于产生编码6个残基的Gly/Ser铰链区的PCR片段，并融合到EBVgp220/350跨膜区的N端。经Mro I/Pst I再酶切的PCR片段(长度为153bp)插入到plin20-S的酶切位点产生plin20-ST。E..寡核苷酸5和9用于产生编码缺失N端信号肽的30个残基的gp120基因的PCR片段。经Ksp I/Mro I再酶切后产生1431bp的PCR片段，然后，插入plin20-ST的Ksp I/Mro I酶切位点产生plin20-S-gp120-T。图.2重组的gp160、嵌合的gp120衍生物在昆虫细胞中的表达用重组的杆状病毒rAc160(泳道4)、rAC120/TM(泳道5)、rAc1205-/TM(泳道6)、rAc12020-/TM(泳道7)以10MIO感染剂量感染Sf细胞，用非感染的(泳道1)、或野生型杆状病毒(泳道2)、或表达Pr55gag基因产物的重组杆状病毒(泳道3)感染Sf9细胞作为对照。用Western blot分析三天后收集的10000细胞的提取物中不同的gp160/120的衍生物的正确表达。用针对V3区(A)(DuPont，NEA9303)和HIV-1的跨膜蛋白gp14(B)(DuPont，NEA9305)的单克隆抗体检测重组蛋白。标准分子量的位置在左边，特异性检测的重组蛋白的位置在图表右边。图.3在昆虫细胞中嵌合的HIV-1膜蛋白的共表达为了共表达Pr55gag与HIV-1的嵌合膜蛋白的变异体，用重组的Pr55gag杆状病毒和重组的gp160或rAC120/TM、rAc1205-/TM、rAc12020-/TM分别以10MIO感染剂量共感染H5昆虫细胞。通过针对HIV-1的位于Pr55gag前体(16/4/2)中的p24(A)和gp120中的V3结构域(B)的单克隆抗体、用West blot显示昆虫细胞裂解物中的两种成分。标准分子量的位置在左边，特异性检测的重组蛋白的位置在图表右边。图.4 gp160或其衍生物表达在病毒样颗粒的表面上A，B：用rAcgag和rAc160(泳道4)或rAC120/TM(泳道5)、rAc1205-/TM(泳道6)、rAc12020-/TM(泳道7)分别以10MIO感染剂量感染106H5细胞，四天后收集无血清的细胞培养上清。用非感染的(泳道1)、或野生型杆状病毒(泳道2)、或表达Pr55gag基因产物的重组杆状病毒(泳道3)感染Sf9细胞作为对照。用蔗糖密度梯度离心分离上清。每600微升的分装用p24夹心法分析(Abbott)。用通过针对p24和gp120中的V3结构域的单克隆抗体作West blot显示抗原峰的特征，提示Pr55gag前体和膜蛋白的衍生物在同一抗原峰。C、D：用10微升的针对p120的V3环的特异性鼠源单克隆抗体作免疫沉淀。免疫沉淀物经SDS-Page分离随后用针对p24(16/4/2)(C)和gp120中的V3结构域(D)的单克隆抗体作Westblot分析。标准分子量的位置在左边，特异性检测的重组蛋白的位置在图表右边。图.5：对BALB/cj鼠(H-2d)用重组的Pr55gag/env病毒样颗粒而不是HIV-1的V3环的衍生肽诱导V3特异性的CTL。BALB/cj鼠(H-2d)的在体实验不注射或注射单剂量的6微克的Pr55gag病毒样颗粒、或嵌合的Pr55gag/env病毒样颗粒、或50微克的16-mer的V3肽，不加佐剂。离体的CTL再激活和细胞毒实验如实施例中进行。图.6：通过共转染两种不同的重组的杆状病毒，带有刺状的gp14的病毒样颗粒产生于昆虫细胞。4天后收集上清。通过蔗糖密度梯度离心收集颗粒并用电镜检测纯度。5微升的制备液作15％的SDS-PAGE凝胶电泳，并转移到膜上，用抗HIV-1 gag的单克隆抗体(16/4/2)或抗-EHV-1的血清528/84检测。用单独用rAcgag转染产生的病毒样颗粒作对照(Co泳道)于72小时后收集。反应蛋白的分子量以kD标示。图7：病毒样颗粒的免疫电镜VLP-gp14的制备液吸附于网上，与抗gp14的单克隆抗体3F6孵育。结合的抗体3F6由金标的抗鼠IgG检测。如图所示为代表性免疫金标记的颗粒。图8：免疫BALB/c鼠的超敏反应用不同的gp14的制备液激发的超敏反应。组A表示用失活的RacL11和未转染的细胞培养上清肌肉注射免疫后两个鼠的耳缘厚度的平均增值。组B表示用同样的抗原鼻腔免疫激发的超敏反应。标准差在0到4％之间，未显示。图9：用野生型的EHV-1攻击感染后不同时间(天)的免疫动物的平均减重。组A表示经肌肉注射免疫并随后攻击感染后动物的平均重量的变化。组B表示鼻腔免疫后的动物的平均重量的变化。用pDES1鼻腔免疫、随后攻击感染的动物有明显的体重消减，而其它各组物明显的重量的变化。变化值以第0天(攻击前)所得分数的百分数表示，标准差在0到5.2％之间，未显示。图10：肌肉注射免疫(组A)、鼻腔免疫(组B)随后的攻击感染1天、3天、5天、8天时两个鼠左肺叶的平均病毒滴度。标准差以短线表示。检测的限度为10PFU/器官，无病毒检出的例子以小于1表示。星号表示经方差分析随后与BSA免疫小鼠的数值进行Bonferronl比较显示组间平均值有显著性差异(p＜0.05)。
实施例实施例1.载体的发展可望构建单一或嵌合型的膜蛋白(图1)
为了能够诱导HIV特异性中和抗体，除了诱导HIV特异CTL免疫应答外，我们建立了一种新方法，这种方法是利用异源穿膜区域，在重组的VLPs表面稳定地共价锚定gp120及其衍生物。这种方法排除了文献中报道的与gp41穿膜蛋白有关的免疫副反应。为了稳定递呈HIV-1 gp120抗原，并使之形成一种正确的免疫相关构象，我们构建了表达嵌合gp120衍生物的重组杆状病毒。其羧基端共价连接到EBVgp250/350的异源1型穿膜区。二个结构域被一种灵活的铰链区(gly/ser)3分开，使其各自能独立的折叠形成其结构域。为避免gp120的羧基端剪接位点非特异性剪切，或包膜嵌合体错误的折叠，另外增加羧基端减少5个(gp120/5)或20个(gp120/20-)氨基酸的衍生物，连接到穿膜区(TM)。在第二套DNA构建中，原始的gp160/120信号肽序列被编码IL-3信号肽的序列代替，这种嵌合型膜蛋白的构建如下所述：
(A)plin20的构建：为了便于克隆单一或嵌合型膜蛋白的载体系统，用一种新的多克隆位点代替pUC8的EcoRI/HindIII多克隆位点，这种新的多克隆位点包括5-EcoRI-Ksp1-Sac1-BgIII-Xba1-Sall-Xho1-Mro1-Psti-3′，是将两个退火的互补寡聚核苷酸连接到EcoRI/HindIII线性化的pUC8上而得到的。合成寡核苷酸1和2(OI1和OI2)及所有如下章节将提到的寡聚核苷酸都在附录中给出。HindIII限制性酶切位点在克隆过程中消失。
以下的构建过程均在标准的PCR条件下进行。为便于克隆，除扩增目的片段外，在引物5’端引入了限制性酶切位点，限制性酶切位点位于编码区旁侧，产物通过373ADNA序列仪(Applied Biosystem)双链测序得以验证。
(B)plin20-s的构建：将鼠IL-3 5’端编码的一个真核生物信号序列的75个核苷酸克隆到上述的plin20载体中，在退火和补平单链后得到两个重叠的合成寡聚核苷酸(OI3和OI4)作为PCR模板(反应1)，两个扩增引物OI3a和OI4a扩增IL-3信号肽并引入末端限制性酶切位点。扩增产物为合成双链寡聚核苷酸，其5’端含有EcoRI的限制性酶切位点，3末端含有Ksp1限制性酶切位点。双链寡聚核苷酸用EcoRI/Ksp1剪切并且插入线性化的plin20产生Plin20-S质粒。
(C)plin20-S-gp160的构建：要构建一个HIV-1 gp160全基因，由IL-3信号肽序列取代天然信号肽，HIV-1外膜糖蛋白(gp)全基因序列由pNL4-3质粒扩增得到。用寡聚核苷酸5和6作PCR反应引物，扩增一个1.4kb片段并克隆入Ksp1/Pst1酶切的plin20-S载体，该片段在其5’端有KspI限制性酶切位点，在其3’端有Pst1限制性酶切位点。gp160读码框架中5’Ksp限制性酶切位点的引入导致HIV-1 HX-10毒株中第32(E)和33(K)氨基酸残基改变为A、E、N。HIV-1 gp160亚克隆片段是由gp160序列中第31到第856氨基酸组成(核苷酸位置是第6314-8791)。
(D)plin20-ST的构建：用pBRBamHI-L作为模板，寡聚核苷酸7和8作为引物，PCR扩增EBVgp220/350穿膜域，构建plin20-ST质粒。EBVgp220/350TM编码序列两侧由寡聚核苷酸7和8引入酶切位点Mro1和Pst1。引物OI7的5’端另外连接到Gly/Ser连接子上，与EBVgp220/350TM连接。PCR产物用Mro1/Pst1消化并连接到plin20-S载体上。克隆的EBV片段在病毒基因组中的位置是89433-89576核苷酸，其互补链相对应的氨基酸在EBVgp220/350中是第860-907个氨基酸。(EBV B95-8.Baer etal.1984，Nature 310：207-211：Genebank，Accession V01555)
(E).plin20-S-gp120(突变体)-T的构建：利用(C)中提到的HIV-1编码序列把不同HIV-1gp120衍生物(120/TM，1205-/TM和12020-/TM)引入plin20-ST质粒。在PCR中，用寡聚核苷酸5(5′-引物)和9a、9b或9c(3′-引物)作PCR引物扩增HIVgp120衍生物(120/TM用OI9a，1205-/TM用OI9b，12020-/TM用OI9c)。所有的扩增片段在其5’端有Ksp1限制性酶切位点，在其3’端有Mro(限制性酶切位点)。利用这些限制性酶切位点，可将三种gp120衍生物亚克隆进入plin20-ST载体中。克隆的HIV-1 gp120变异型gp120、gp1205-/TM、gp12020-/TM，各自重装位置为31-506，502和487的氨基酸序列(对应的核苷酸位置是6314-7741，7729和7684)。在以下章节中，上述gp160/120衍生物为gp160，gp120/TM，gp1205-/TM和gp12020-/TM。
用同样的方法得到含HIV自身信号肽序列的HIVgp160/120TM衍生物构建体。以pNL4-3作模板PCR扩增上述基因片段，5’引物(OI10)(引入5′-EcoRI限制性酶切位点)用于扩增所有四个重组体，3’引物分别用OI6，OI9a，OI9b或OI9c。扩增的DNA片段被亚克隆进plin20系列载体中。EcoRI/Pst I gp160酶切、连接后，原始编码区(aa1-856)插入到plin20的EcoRI/Pst1位点。在EcoRI/Mro1限制性酶切位点插入不同的gp120编码序列(gp120：aa 1-506，gp1205-：aa 1-502，gp12020-：aa 1-487)，形成plin20-ST亚克隆。所用到的寡聚核苷酸：OI1            5′-AATTCAATCCGCGGGAGATCTAGAGTCGACTCGAGTCCGGAAATCTGC
           AGT-3′OI2            5′-AGCTACTGCGATTTCCGGACTCGAGTCGACTCTAGAATCTGAGCTCCCGC
           GGATTG-3′OI3            5′-ATATTAGAATTCGCCATGCTATTACTACTTCTTATGCTATTCCATCTAGGA
           CTACAAGCT-3′OI4            5′-CCTTCGCTGCAGTTCGTTCCCCGCGGTCATGTTTATGGGGTCTCGTCCTGA
           TATTGAAGCTTGTAGTCCTAGATG-3′OI3a           5′-ATATTAGAATTCGCCATGG-3′OI4a           5′-ATACCTTCGCTGCAGTTCGTTCC-3′OI5            5′-ATATTAGAATTCTCGAGCCGCGGAAAACTTGTGGGTCACAGTC-3 ′OI6            5′-ATATTACTGCAGTTATAGCAAAATCCTTTCC-3′OI7            5′-ATATTATCCGGAAGCGGGGCAGGATCCATGCTAGTACTTCAATGGGCC
           TCTCTG-3′OI8            5′-ATATTACTGCAGTTATACATAGGTCTCGGCCTC-3′OI9a           5′-ATATTATCCGGACACCACTCTTCTCTTTGC-3′OI9b           5′-ATATTATCCGGACTTTGCCTTGGTGGGTGCTACTCC-3′OI9c           5′-ATATTATCCGGATTTATATTTATAATTCACTTCTCC-3′OI10           5′-ATATTAGAATTCATGAGAGTGAAGGAGAAATATCAGC-3′实施例2.嵌合型HIV-1外膜基因在杆状病毒转移载体pVL1393中的亚克隆及重组杆状病毒的构建：
为了在昆虫细胞表达系统中构建表达嵌合型HIV-1外膜蛋白的重组杆状病毒，将编码gp160和gp120衍生物的EcoRI/Pst1DNA片段亚克隆到转移载体pVL1393的EcoRI/Pst1位点中，用Quiagen tip 100(Diagen)试剂盒纯化质粒DNA，按报道方法构建表达gp160(rAc160)和gp120(rAc120/TM，rAc1205-TM，rAc12020-TM)衍生物的重组杆状病毒(Wagneret al，1994)。实施例3.嵌合型HIV-1外膜蛋白在昆虫细胞中的表达
10MOI的重组杆状病毒(rAc 160，rAc 120/TM，rAc 120/20-TM)感染Spodoptera frugiperda细胞，提取104细胞并通过常规的Westernblot分析证明正确表达了不同的HIV-1 gp160/120衍生物。简单讲，就是将细胞裂解液用样品缓冲液(Sambrook et al，1989)稀释后，用10-12.5％的SDS-PAGE分离并电转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher和Schuell)。将膜在含10％的脱脂奶粉，0.05％Tween20(Sigma)和Tris缓冲液(TBS)中室温孵育1小时，TBS-Tween20洗；与含gp120V3区抗体mabs(Dupont9303)4℃过夜；TBS-Tween20洗2次后与抗鼠IgG-POD酶标抗体室温1小时，洗涤后加入底物(4-氯-1-萘酚)(图2)，通过免疫荧光及FACS扫描分析证明外膜蛋白呈现在细胞表面(表1)。
将感染的昆虫细胞用多聚甲醛固定(在1％的PBS中)，同抗gp120V3区的抗体(mab)(1/100稀释于PBS)共同孵育，洗2遍后与FITC标记的抗鼠IgG室温孵育10分钟，PBS洗2遍，用碘化丙锭染DNA，用荧光分光光度计(FACS scan，Becton-Dickinson)或紫外分析仪分析样品。实施例4.嵌合型HIV-1外膜蛋白在昆虫细胞中共表达
Pr55 gag重组杆状病毒和表达一种HIV-1外膜蛋白的重组杆状病毒共感染High five昆虫细胞，使HIV-1 Pr55 gag与如上所述的嵌合型HIV-1外膜蛋白不同变体共表达，说明见图1(每种病毒的MOI＝10)。用常规Western blot方法，结果证明在共感染细胞裂解物中有两种复合物共表达，抗体用抗Pr55 gag前体p24及gp120V3区的单克隆抗体(图3)。用V3环特异的鼠单抗及FACS扫描分析清晰的显示，包括ENV gp220/350糖蛋白跨膜结构域的COOH端在内的嵌合型gp120衍生物整合在细胞膜上，而且与gp160野生型多肽相比以2-3倍的量整合(表1)。实施例5.颗粒形成的分析
相应的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，共表达的Pr55 gag和gp120衍生物(图1，gp160，gp120/TM，gp120/5-TM，gp120/20-TM)超微切片显示有效的重组VLP的出芽(结果无显示)。为进一步研究这些VLPs的特性，共感染106High five昆虫细胞(gp160，gp120/TM，gp120/5-TM，gp120/20-TM)，4天后收集无血清培养细胞上清，10％-60％的蔗糖密度梯度离心，p24抗原夹心法定量检测不同部分，结果证明逆转录病毒样颗粒在密度为1.15-1.17g/cm3时沉降，与HIV成熟病毒颗粒密度一致。用P24(16/4/2)和gp120V3区的单抗免疫杂交实验证明在抗原峰部分存在Pr55gag前体和外膜蛋白(图4A，B)。实施例6.重组逆转录病毒样颗粒(VLP)表面表达gp160及其衍生物
用免疫沉淀法分析蔗糖密度梯度离心分析抗原峰部分，证明在重组的病毒样颗粒表面表达有gp160及衍生物。免疫沉淀按常规方法(Sambrooket.al，1989)，在无去污剂下，取10μl gp120 V3区特异性鼠单抗(DuPont9303)，免疫沉淀物用样品缓冲液(Sambrook et.al，1989)稀释，10-12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并电转移至硝酸纤维素膜上(Schleicher和Schuell)，在含0.05％Tween20(Sigma)，10％的脱脂奶粉的Tris缓冲液(TBS)中室温孵育1小时，然后用TBS-Tween20洗，与抗p24(16/4/2)或gp120(图4C，D)抗体4℃过夜。除去抗体后用TBS-Tween20洗2次，加抗鼠的IgG-POD酶联抗体室温1小时，洗干净加入底物(4-氯-1-萘酚)。如图4C和D所示，共感染细胞上清的蔗糖密度梯度离心后，仅峰值部分有Pr55gag前体免疫沉淀带，这清楚地表明gp160及衍生物暴露在感染细胞的表面。另外，同嵌合的gp120相比，Pr55gag同野生型gp160共表达使其外膜蛋白呈现明显减少(图4C，D)。
这些结果进一步由VLPs的免疫电镜证实，基本按Czemy和Mahnel(Czemy and Mahnel，1990)的报道进行VLPs免疫电镜。纯化的VLPs经2％的戊二醛固定后吸附到载网上，TBS洗后，用溶于TBS的3％的明胶(gelatine)于室温封闭1小时，室温与V3特异性单克隆抗体孵育1小时，TBS洗3遍，将载网置于抗鼠免疫金标记IgG(Sigma，5nm颗粒)中室温1小时，TBS洗3遍后，用磷钨酸对比，电镜观察(Zeiss EM 10C/CR)。实施例7.重组VLPs的纯化
VLPs是由共感染的HighFive细胞产生的，每个HighFive细胞都经1MOI重组杆状病毒的共感染，表达gp160(rAc160)、gp120及其衍生物(rAc120/TM，rAc 120/5-TM，rAc 120/20-TM)和rAc gag，后者编码HIV55 kDgag蛋白Pr55gag。收集感染4天(p.i)的HighFive细胞上清，按上述方法经蔗糖密度梯度离心加以纯化，用电镜检测其纯度及是否存在杆状病毒。将不含杆状病毒的部分稀释后，用Kontron离心机TFT41.41转头离心沉淀VLPs后以PBS重悬。实施例8.重组VLPs诱导的体液免疫反应
为评估不同方法制备的VLPs介导的体液免疫反应的能力，在没有佐剂的情况下，用重组的嵌合型颗粒免疫兔子，每只兔子用量20μg，每次间隔4个星期(表.2)。ELISA抗体滴度的确定及抗血清中和反应活性的定量测定如下操作：
抗原ELISA：微孔ELISA板(Greiner，Frickenhausen，德国)每孔包被500ngHIV-1 HX10裂解物、500ng重组p24、80ng rgp120或300ngV3肽(36肽)，溶于50μl 0.05M PH9.5碳酸钠盐缓冲液中，在湿盒中4℃过夜。血清用含3％FCS和2％Tween-20的PBS液稀释成1∶10-1∶1000，加入包被好的板孔，37℃孵育2小时后洗涤5遍，结合的抗体用辣根过氧化物酶-抗兔抗体(Dakopatts，Copenhagen，Denmark)检测，稀释度为1∶1000，然后用OPD-0.01％H2O2磷酸盐缓冲液(PH6.0)显色，最后用1MH2SO4终止反应，在波长492nm测定。OD值(光密度值)高出阴性对照血清平均OD值+3SD为阳性。所有的重组VLPs免疫的兔子都获得较高的抗体滴度，对Pr55gag载体成分的抗体滴度为1/64000，对纯化gp120的抗体滴度为1/64000-1/32000，但与V3肽同源的36个氨基酸多肽只检测到很低的抗体滴度(1/256)。
HIV-1中和试验：加热灭活血清经系列倍比稀释同MT4细胞产生的50TCID50量HIV-1 HX10毒株37℃孵育1.5小时，病毒血清混合物同5×104MT4混悬细胞37℃孵育1小时，病毒吸附后，除去未结合的病毒，每孔加入100μl培养液(RPMI-1640+10％FCS)。7天后(p.i)取100μl培养上清液用商业p24夹心法(Abbott实验室，Chicago III)定量检测细胞释放的病毒。通过比较对照孔病毒量来计算中和滴度，对p24的产生和释放抑制率超过90％的最高血清稀释度即为中和滴度。用于中和试验的兔子血清需经过3次免疫获得，如表2所示，对用于免疫的Pr55gag/env提取物，所有血清的中和滴度均在1∶128-1∶256之间。实施例9.重组VLPs介导的细胞免疫反应
Takahasi和其合作者研究表明，含有一个BALB/c小鼠H2-Dd限制性CTL表位的V3-IIIB可作为一个有效且易得到的动物模型，用于研究特定抗原引起的CTL反应(Takahashi et.al，1988)。如前所述，用三种不同Pr55gag/V3重组痘苗病毒变体免疫BALB/c小鼠，无论V3环在Pr55gag内的位置如何，均产生了很强的CD8+CTL反应(Wagner et.al，1993)。
为研究重组嵌合型gag/envVLP在体内介导CTL的能力，在不含佐剂或复制型载体的条件下，用10μg不同的gag/env杂合VLP来免疫BALB/c小鼠(H-2d)，对照组BALB/c小鼠注射50μg的16肽的V3肽(RIQRGPGRAFVTIGKI)或10μg Pr55gagVLP。免疫后6天取小鼠淋巴细胞，并与同源V3-16肽标记的同基因P815细胞共培养，辐射量为20000rad。对照组为用V3肽标记的P815细胞体外刺激的未免疫BALB/c小鼠细胞，体外培养5天后收集细胞毒效应细胞，同基因靶细胞A20用10-8M V3-16肽辐射1小时后测定细胞毒效应。在标准的50Cr释放试验中，阴性对照组中不对靶细胞A20进行辐射。无论合成的V3多肽或Pr55gagVLP都不足以诱导相应的V3特异性CTL反应，而纯化的gp160可引起比较弱的CTL反应(图5)。这些资料清楚地表明，锚定在重组Pr55gagVLP表面的gp160及其衍生物是较理想的呈递抗原，能引起对其膜蛋白的高效CTL反应。实施例10.来源于HIV-1以外的其它病毒的膜蛋白重组VPLs：马疱疹病毒gp14(gB)
马疱疹病毒gp14(gB)VLPs产生于共感染HighFive细胞，每个HighFive细胞都经1MOI重组杆状病毒rAc17-11的感染，重组杆状病毒rAc17-11表达EHV gp14膜蛋白(Osterrieder et.al，1994)和rACgag，后者编码HIV 55KDgag蛋白Pr55gag。在第一组系列试验中，确定了重组gp14 VLPs的最大载量时间点。不同的时间点收集感染的HighFive细胞上清液，用蔗糖梯度密度离心法纯化，电镜检测其纯度及是否存在杆状病毒。用PAGE分离5μl重悬的VLPs，制成免疫斑点，用抗-p24 mab16/4/2和马血清528/84同时进行免疫斑点杂交检测。HIV-gag的表达量在感染后12小时开始几乎保持水平，但是在VLPs上的gp14最早在感染后36小时检测到，并且在72小时达到最大量(图6)。在以后所有的试验中72小时收获颗粒。
荧光细胞仪的研究结果进一步证明gp14不仅仅是与VLPs一起被提纯，而且嵌合到VLPs颗粒上。生物素标记的mabs 4B6和16/4/2的相关反应表明抗-gag mab 16/4/2和gp14 mab 4B6使VLPs沉淀。在下一步的试验中我们解决了为什么即使跨膜区及胞内区蛋白缺失，gp14仍然出现在VLPs上。如前述，重组gp14在rAC17-11感染HighFive细胞12小时后在胞浆内出现，24小时出现在昆虫细胞的表面，到72小时达最大量(Osteriederet.al，1994)。此蛋白能在感染细胞表面停留120小时，直至胎盘蓝染色观察几乎所有的昆虫细胞死亡(资料未予显示)。这些结果显示尽管切去部分gp14，但糖蛋白仍能稳定地呈现在昆虫细胞的膜表面，跨膜与胞质区对于gp14驻留昆虫细胞胞浆面并非是必须的。
这些结果进一步用免疫电镜(Zeiss EM10/CR)观察上述gag/env嵌合型VLPs得到证实，抗体用抗-gp14mab 3F6(图.7)。实施例11.重组gp14嵌合型病毒样颗粒介导的体液免疫应答与其它抗原的比较
为比较不同抗原制备物产生的体液、细胞和潜在的保护性免疫应答，BALB/c鼠被进行下述免疫。
10μg pCEP-8-gp14(rgp14在大扬杆菌中表达并得到纯化)(Osterrieder et.al，1994)
rAc 7-11-gp14(rgp 14在感染重组gp14杆状病毒的昆虫细胞表达并纯化)
(Osterrieder et al，1994)
VLP-gp14(gp14呈现在重组的HIV-1 pr55gag的VLPs表面)
BSA
50μg pDES-gp14(DNA疫苗衍生自pcDNA/Amp(invitrogen)的含有CMV早期启动子的表达质粒，表达不含穿膜和细胞质区的EHV-1 gp-14，Osterrieder et al，待发表)。
108.5PFU RacL 11(Mayr et al，1968)
106.5PFU RacH(Mayr et al，1968)
在免疫鼠中获得的特异性的gp14系列ELISA和NT抗体滴度见表3。用gp14-刺突状VLPs在肌肉和鼻腔免疫后得到的ELISA和NT抗体滴度最高，其ELISA抗体滴度甚至比那些用活EHV-1病毒进行相同途径免疫得到的抗体滴度还高(RacL11，RacH)。用重组gp14杆状病毒rAc17-11感染4天的昆虫细胞上清液中纯化的gp14进行肌内免疫，得到的抗体水平比其它VLPs高，但用鼻腔免疫其抗体滴度明显降低。用大肠杆菌(pCEP-g-gp14)或pDES-1-gp14 DNA疫苗表达的gp14免疫产生ELISA滴度均较弱，并且用两种来源的gp14鼻腔免疫后没有检测的中和抗体。实施例12.嵌合VLPs介导的对重组gp14的DTH应答及其与其它抗原系统的比较
不同时间点通过对两只小鼠耳廓注射灭活的抗原，各种重组体免疫后的DTH应答是通过检测耳厚度得到。用VLPS和大肠杆菌表达的gp14(pCEP-8-gp14)通过皮下和鼻腔两种途径免疫小鼠，在注射后24小时小鼠耳厚度明显增加，这种反应在注射48小时后降低。用纯化的昆虫细胞rAc17-11产生的gp14和用pDES1DNA疫苗皮下免疫小鼠，同样也观察到小鼠耳厚度明显增加。相反，两种来源的gp14鼻腔免疫后的DTH反应较弱。有关DTH试验结果见图8。实施例13.嵌合型gp14 VLPs及其它抗原系列免疫小鼠后用Wt-EHV-1攻击的临床观察比较
用106.5PFU的野生型EHV-1株RacL11鼻腔攻击免疫小鼠，所有用BSA免疫的鼠都出现疾病症状，如表皮病、呼吸异常和隆起体态，并伴有明显体重下降，攻击后2天体重下降23％，用EHV-1 Ab4株也观察到类似现象(Awan et al.，1990)。
与其它结果相比(Awan et al 1990；Inazu et al.1993)，BSA-免疫鼠刺激感染后未见死亡现象，4-5后天体重恢复，但直到第8天后也没有达到感染前体重。然而，所有用重组gp14系列抗原皮下免疫鼠没有或仅有少量(＜6％)体重值降低；用pDES1 DNA疫苗免疫鼠中，仅在注射后4天出现边缘舌苔、呼吸困难和体重降低15％，同样，用VLP-gp14制备物和rAc17表达的重组gp14鼻腔免疫鼠中没有或仅有少量体重下降；pCEP-8-gp14和pDES-1免疫鼠，只有个别1-2个动物出现了病症，体重下降20％，与以前用活病毒株RacL11或RacH感染后发生的情况类似(图.9)。实施例14.用Wt-EHV-1攻击嵌合的gp14VLPs及其它抗原免疫鼠后的病毒再分离的比较
在攻击感染后，从两只鼠肺中重新得到病毒，这两只鼠在注射后第1、3、5、8天分别被处死。与BSA免疫小鼠相比，用活病毒株RacL11、RaCH皮下或鼻腔免过的鼠在攻击后其肺部的病毒滴度(103PFU/肺)都明显降低。从攻击后三天起，活病毒免疫小鼠中病毒滴度低于10pfu/器官，与BSA免疫小鼠在攻击1-8天的值明显不同(图10)。重组gp14提取物及含刺状gp14VLPs肌肉和鼻腔免疫小鼠肺部重新获得的病毒滴度显著降低。在攻击后第一天，第9、10组(表3)中病毒滴度是104PFV/器官，比BSA免疫鼠低100倍，攻击后第三天，上述两种方法免疫的小鼠肺部的病毒滴度低于10PFU/器官。虽然以前肌肉免疫并未用乳化的弗氏佐剂，病毒载量仍降低(表3)，而且，与BSA-免疫鼠相比，攻击感染后所有时间检测肺部病毒滴度值显著降低(P＜0.05)。纯化的rAc17-11-gp14(从昆虫细胞得到的gp14)皮下免疫小鼠(在Frends佐剂中乳化)攻击后3天，其肺中病毒载量显著降低(P＜0.05)。用相同抗原鼻腔免疫的小鼠肺中重获病毒滴度高于RacL、Pach或VLPs免疫小鼠，但是在攻击后第5检测不到病毒。用pCEP-8-gp14(从大肠杆菌得到的gp14)通过皮下和鼻腔两种方式免疫鼠均有较高的攻击后保护。来自昆虫细胞的gp14(rAc17-11gp14)通过皮下和鼻腔免疫鼠，肺部病毒滴度一般从攻击后第3天显著降低(P＜0.05)，50μg pDES1-DNA疫苗皮下和鼻腔免疫鼠在攻击后3、5、8天肺部病毒滴度最低，但仍能检测到(图10)。
综上所述，用gp14-刺突状VLPs肌肉和鼻腔内两种方式免疫小鼠能对随后的EHV-1攻击起到最有效地保护作用。
表1 FACA扫描分析显示的嵌合型HIV-1外膜蛋白的表面表达
  用下列物质感染细胞    均值    ％B-gp160   ％B-pr55/B-gp160    ％单次感染
        未感染B-WT     1111       44
         B-Pr55B-gp160B-gp120TMB-gp120/5TMB-gp120/20TM共感染     7292407370367       2100139127126
     B-Pr55/B-WT     10       3          10
    B-Pr55/B-gp160B-Pr55/B-gp120TMB-Pr55/B-gp120/5TMB-Pr55/B-gp120/20TM     96281190166       33966557          100292197172        33695145
表2 Pr55/env嵌合型VLPs诱导的抗体反应抗体滴度b疫苗a                 HIV裂解物      p24        gp120        V3     NTcPr55gag               3.2×104    3.2×104       -        -      ＝Pr55gag/gp160         6.4×104    6.4×104   6.4×104   ＜16   1∶256Pr55gag/gp120TM       3.2×104    3.2×104   3.2×104   ＜16   1∶256Pr55gag/gp1205-/TM   1.6×104    1.6×104   1.6×104   ＜16   1∶256Pr55gag/gp120220-/TM 1.6×104    3.2×104   1.6×104   256    1∶128a，在没有佐剂的情况下，用重组的嵌合型VLP免疫兔子，每只兔子用量10μg。b，二次加强免疫后三周用ELISA检测血清抗体水平，抗体水平以在492nm最大的光密度的一半时的抗体滴度(中点滴度)表示。测定了针对不同的抗原如HIV裂解物、重组p24，重组gp120和合成的V3肽(36肽)的抗体水平。滴度在1/16下考虑为非特异性反应，被视为阴性。c，注射后7天抑制p24的产生达90％以上的最高血清稀释度归为中和滴度。
表3不同组鼠的免疫计划及ELISA和血清中和抗体滴座
  小鼠组别        抗原    免疫途径   免疫时间    佐剂    ELISA滴度a(第35天)   SN滴度b(第35天)
     1      Racl.11      i.m.    第21天     无     1∶20,480     1∶16
     2      Racl.qq      i.nas.    第21天     无     1∶5,120     1∶8
     3        RacH       i.m.    第21天     无     1∶10,240     1∶16
     4        RacH      i.nas.    第21天     无     1∶2,560     1∶8
     5    pCEP-8-gp14       i.m.   第0/21天     FAc     1∶320     1∶4
     6    pCEP-8-gp14      i.nas.   第0/21天     无     1∶80    ＜1∶2
     7    rAc17-11-gp14       i.m.   第0/21天     FAc     1∶20,480     1∶8
     8    rAc17-11-gp14      i.nas.   第0/21天     无     1∶640     1∶2
     9      VLP-gp14       i.m.   第0/21天     无     1∶40,960     1∶8
     10      VLP-gp14      i.nas.   第0/21天     无     1∶2560     1∶4
     11    pDES1-gp14       i.m.   第0/21天     无     1∶80     1∶2
     12    pDES1-gp14      i.nas.   第0/21天     无     1∶40    ＜1∶2
     13        BSA       i.m.   第0/21天     FAc     ＜1∶10    ＜1∶2
     14        BSA      i.nas.   第0/21天     无     ＜1∶10    ＜1∶2
a.终点ELISA滴度用纯化的马疱疹病毒I型病毒颗粒(1μg/ml)确定，血清首次按1∶10起稀释，其后按1∶2对数稀释，450nm处读吸光度，超过牛血清白蛋白对照血清计数三个标准差为阳性。b.血清中和滴度用50TC1D50 RacH感染的RK13细胞确定。实验用一式三份倍比稀释的56℃30分灭活的血清。不加补体。滴度显示所有孔的稀释血清具有完全保护。c.首次免疫(第0天)，抗原用完全弗氏佐剂乳化，第二次免疫(第21天)用不完全弗后佐剂。所有配制液用PBS稀释，用106.5PFU的RacL11或RacH、10μg重组抗原、50μg的pDESI、10μg的牛血清白蛋白来免疫动物。
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Claims (26)

1.一种抗原呈递系统，其包括：(a)编码能自装配成无脂膜的蛋白质颗粒的蛋白，尤其是，在宿主细胞内表达时能形成颗粒型结构并转运到细胞外介质的逆转录病毒族特异抗原(gag)的DNA序列；和。(b)编码下列多肽区的DNA序列：
(ba)信号肽；和与其有效连结的
(bb)多肽的细胞外结构域；
(bc)跨膜区；及
(bd)胞浆区，其不含有介导与基质蛋白作用的氨基酸序列，
其中，所说的DNA序列(a)和(b)可在合适的宿主细胞内共表达。
2.根据权利要求1的抗原呈递系统，其中信号序列和/或跨膜区和/或胞浆区对于胞外区而言是异源的。
3.根据权利要求1的抗原呈递系统，其中信号序列和/或跨膜区和/或胞浆区对于胞外区是同源的。
4.根据权利要求1-3之任一项的抗原呈递系统，其中已除去了胞浆区氨基酸序列的作用位点。
5.根据权利要求1-3之任一项的抗原呈递系统，其中已诱变了所述胞浆区中的氨基酸序列，使之不能介导与基质蛋白的特异性作用。
6.根据权利要求1-5之任一项的抗原呈递系统，其中所述多肽的胞外区从致病性因子获得。
7.根据权利要求6的抗原呈递系统，其中所述致病因子是病毒、细菌、蛋白质感染因子或肿瘤细胞。
8.根据权利要求7的抗原呈递系统，其中所述病毒为HIV-1，HIV-2、HTLV-1、HTLV-2、SIV或FIV、EB病毒或疱疹病毒如马疱疹病毒。
9.根据权利要求6-8之任一项的抗原呈递系统，其中所述多肽的胞外结构域是单纯的胞外结构域。
10.根据权利要求6-8之任一项的抗原呈递系统，其中所述多肽的胞外结构域不是单纯的胞外结构域，优选是嵌合型胞外结构域。
11.根据权利要求7-10之任一项的抗原呈递系统，其中所述胞外结构域来自env蛋白。
12.根据权利要求1-11之任一项的抗原呈递系统，其中所述gag来自HTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2、SIV或FIV。
13.根据权利要求12的抗原呈递系统，其中所述gag是HIV-1的pr55gag。
14.根据权利要求1-13之任一项的抗原呈递系统，其中所述信号肽来自细胞介素-3的信号肽。
15.根据权利要求1-14之任一项的抗原呈递系统，其中所述跨膜区来自EBV gp220/350跨膜锚定区或来自疱疹病毒，任选地通过甘氨酸/丝氨酸连接子与所述胞外结构域连接。
16.根据权利要求1-15之任一项的抗原呈递系统，其中所述DNA序列(a)和(b)包含在同一个表达载体中。
17.根据权利要求1-15之任一项的抗原呈递系统，其中所述DNA序列(a)和(b)包含在不同的表达载体中。
18.根据权利要求16或17的抗原呈递系统，其中所述载体是杆状病毒载体或semliki森林病毒载体。
19.根据权利要求1-18之任一项的抗原呈递系统，其在真核细胞，优选哺乳动物细胞或昆虫细胞，优选Drosophila Schneider细胞中可表达。
20.用权利要求1-19之任一项的抗原呈递系统转染的宿主细胞。
21.根据权利要求20的宿主细胞，它是哺乳动物细胞或昆虫细胞，优选Drosophila Schneider细胞。
22.由权利要求1-19之任一项的抗原呈递系统编码的或由权利要求20或21的宿主细胞产生的抗原性多肽。
23.含有权利要求1-19之任一项的抗原呈递系统、权利要求20或21的宿主细胞和/或权利要求22的多肽的药物组合物或疫苗。
24.含有权利要求22的多肽的诊断组合物。
25.一种产生权利要求22的多肽的方法，其包括在适当培养其中培养权利要求20或21的宿主细胞，并从该培养基中收集所述宿主细胞产生的带有所述多肽的不成熟病毒样颗粒。
26.一种激发对抗原给药途径特异的免疫反应的方法，它是表皮给药，优选粘膜暴露，或侵入途径，优选注射或多次划破。
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