CN104450631A - 肠道病毒ev71型vp1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于免疫技术领域。为了实现此病毒样颗粒的制备，本发明首先构建了一种SIV GP41与EV71 VP1融合基因cVP1的真核表达载体，证实cVP1能够在哺乳动物细胞中表达并能够在细胞膜上表达。本发明进一步构建cVP1基因、gag基因的重组杆状病毒转座载体，制备杆状病毒，以两种杆状病毒共感染细胞的方式成功制备cVP1病毒样颗粒，此新型病毒样颗粒制备过程简单，易纯化，所获病毒样颗粒结构均一并在小鼠体内发挥较强的免疫原性。本发明通过膜锚定型融合基因的设计，利用杆状病毒表达系统制备了一种高效表达膜锚定VP1基因的病毒样颗粒。

Description

肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫技术领域，涉及一种病毒样颗粒及其制备方法，具体涉及肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)是5岁以下婴幼儿中的常见传染病，该病传染性强，传播途径复杂，在短时间内即可造成大流行。手足口病可由多种肠道病毒引起，其中主要为肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇A组16型(coxsackievirus A16，CoxA16)。手足口病近年来在我国持续爆发，严重危害公众健康并带来巨大社会负担。与CoxA16相比，EV71除可引起手足口病和疱疹性咽峡炎外，尚可引起脑干脑炎、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎、急性迟缓性麻痹等重症病例，病死率高，且有后遗症，严重威胁患儿健康。加强对EV71感染的防控，应用新的技术手段及策略，研发安全性高、免疫保护性强并利于产业化生产的新型手足口病疫苗具有重要的理论及实际应用意义。目前，虽然灭活疫苗已经研发成功，但是尚无成熟地、特异地针对EV71的免疫和治疗方案。研究表明，EV71病毒抗原表位基本位于外壳蛋白VP1、VP2上，而VP1壳蛋白不仅直接决定病毒的抗原性，还是病毒特异性中和表位所在区，因此成为研究的热点。

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是指由某种病毒一个或多个结构蛋白可在细胞内自行装配成的不含核酸成分的空心颗粒。病毒样颗粒具有众多优点：①不具有感染性及核酸整合致病性，相对灭活减毒疫苗其安全性得到了保障；②VLPs保持了病毒蛋白空间结构，可通过和病毒感染相似的途径将抗原呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护应答；③VLPs易规模化生产，可满足临床应用需要，因而成为一种备受关注的候选疫苗。

目前常用的病毒结构蛋白有HBVs，HPV，SIV gag蛋白等。SIV gag基因编码的蛋白可被蛋白水解酶裂解成3个结构蛋白，分别为基质(MA)、衣壳蛋白(CA)及核衣壳蛋白(NC)，可自我装配成核心颗粒，以出芽方式分泌到细胞外时获得包膜及膜蛋白。研究表明，可以利用gag的此特性将外源性的跨膜蛋白锚定在gag的包膜上获得VLPs。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用，本发明利用杆状病毒表达系统分别制备SIV gag与经改造的重组肠道病毒EV71型VP1的杆状病毒转座载体，并进一步通过杆状病毒表达系统，制备经改造的VP1病毒样颗粒，检测此病毒样颗粒的特性及小鼠体内免疫原性。本发明能够获得操作简易、纯化简便、纯度高、形态均一的EV71型VP1基因的病毒样颗粒，该病毒样颗粒能够有效应用于手足口病疫苗的制备。

本发明是通过以下技术方案来实现：

该病毒样颗粒是将cVP1融合基因克隆到真核表达载体及杆状病毒转座载体中得到cVP1融合基因重组转座载体和cVP1融合基因真核表达载体；将gag基因克隆到杆状病毒转座载体中，得到gag基因重组转座载体；用cVP1融合基因的真核表达载体转染哺乳动物细胞，检测其表达后，再用cVP1融合基因重组转座载体和gag基因重组转座载体制备cVP1和gag的杆粒，将杆粒转染TN5昆虫细胞，经分泌表达制得；

其中，所述cVP1融合基因是以重叠PCR法获得的SIV GP41与EV71 VP1的融合基因，且cVP1融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述cVP1融合基因包括GP41的信号肽区域、EV71 VP1、GP41的跨膜区和胞内区；其中，GP41的信号肽区域的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；EV71 VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；GP41跨膜区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；GP41胞内区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

所述真核表达载体为pCAGGs，cVP1融合基因克隆到pCAGGs载体所形成的的重组质粒为cVP1-pCAGGs。

所述的杆状病毒转座载体为pFastBac^TM1，cVP1融合基因克隆到pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为cVP1-pFastBac^TM1，gag基因克隆得pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为gag-pFastBac^TM1。

一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)采用重叠PCR法制得包括GP41的信号肽区域、EV71 VP1、GP41的跨膜区和胞内区的cVP1融合基因，将cVP1融合基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1中，得到重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1；

2)采用PCR方法制得gag基因，将gag基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1中，得到重组转座载体gag-pFastBac^TM1；

3)将重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1和gag-pFastBac^TM1按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的说明书分别转化DH10Bac感受态细胞，然后与Bacmid进行重组，经鉴定，分别得到重组杆粒gag-Bacmid和cVP1-Bacmid；

4)按照cellfectin说明书要求，将重组杆粒gag-Bacmid和cVP1-Bacmid分别转染TN5昆虫细胞，直至细胞病变率超过80％后，离心收集上清，得到P1代病毒，将P1代病毒连续传代2次后，得到重组杆状病毒rBV gag和rBVcVP1；

5)将重组杆状病毒rBV cVP1和rBVgag以(3～10):1的MOI比例接种TN5细胞，经悬浮培养后离心收集上清，经纯化制得肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒。

步骤1)是将cVP1融合基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1的EcoRI、NotI酶切位点之间，得到重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1；步骤2)是将gag基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1EcoRI、HindIII酶切位点之间，得到重组转座载体gag-pFastBac^TM1。

步骤5)所述的重组杆状病毒rBV cVP1和rBV gag的MOI比例为3:1、6:1或10:1。步骤5)是在28℃下悬浮培养72h后离心收集上清。

步骤5)所述的纯化具体操作为：

首先，将得到的上清经GE Quixstand系统超滤纯化，在4℃下进行浓缩；

然后，离心后收集上清，将上清经15％～50％的不连续蔗糖密度梯度，再在28000r/min、4℃的条件下超高速离心2h，收集不同浓度的组分；

最后，用PBS洗涤，再经28000r/min超高速离心30min，沉淀经PBS重悬，得到纯化后的肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒。

肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒在制备治疗手足口病的疫苗中的应用。

所述的疫苗为抗EV71病毒感染的疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明利用重叠PCR的方法构建带有SIV 膜蛋白GP41的信号肽区域、跨膜区和胞内区的肠道病毒EV71型VP1的融合基因，使此融合基因能够在细胞膜上表达，并利用SIV gag结构蛋白的特性，制备EV71型VP1病毒样颗粒。

本发明利用杆状病毒表达系统，分别获得gag、经改造的EV71型VP1基因的杆状病毒，两种病毒以一定比例MOI共感染昆虫细胞，制备含有EV71-VP1基因的病毒样颗粒，并对其特性做初步鉴定，此制备过程简便，易纯化，有望为新型手足口病疫苗的研发奠定实验室基础。

本发明利用gag能够自我组装成病毒样颗粒的特性，首次构建膜锚定的EV71型VP1基因cVP1，利用gag、cVP1杆状病毒共感染昆虫细胞TN5制备EV71型VP1病毒样颗粒。

本发明所制备的病毒样颗粒制备简便，易纯化，结构均一，并在小鼠体内起到较好的免疫效果。

附图说明

图1为本发明的膜锚定EV71型VP1融合基因结构示意图；

图2为EV71型VP1融合基因转染HeLa细胞检测VP1表达结果图；

其中，(a)为Western Blot方法检测VP1的表达的蛋白电泳图；(b)为免疫细胞化学方法检测VP1基因在细胞膜上的表达结果免疫显色照片；

图3为gag bacmid、VP1融合基因bacmid PCR鉴定结果图；

图4为gag bacmid、VP1融合基因bacmid转染TN5细胞后细胞病变图；

图5为bacmid转染TN5细胞后WB鉴定gag、VP1表达结果图；

其中，(a)为检测gag表达结果图；(b)为检测VP1表达结果图；

图6为rBV cVP1、gag不同MOI比例感染TN5细胞后WB鉴定gag、EV71VP1表达结果对比图；

其中，(a)为检测gag表达结果图；(b)为检测EV71 VP1表达结果图；

图7为病毒样颗粒电镜结果图；

图8为EV71型VP1病毒样颗粒Western Blot鉴定结果图；

其中，(a)为鉴定gag表达；(b)为鉴定VP1表达；

图9为VP1病毒样颗粒免疫分组及免疫流程图；

图10为免疫后ELISA测定结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、膜锚定EV71型VP1融合基因、gag表达载体的构建及鉴定

参见图1，为本发明所设计的膜锚定EV71型VP1融合基因结构。

含EV71-P1基因的重组质粒EV71-P1-TV由本室构建并保存，env-sf162-pCAGGs、SIV-gag-pCAGGs由美国EMORY大学Chinglai Yang教授馈赠。设计引物序列如表1所示：

表1引物设计序列

首先用HS DNA Polymerase Kit以EV71-P1-TV、env-sf162-pCAGGs为模板分别扩增EV71型VP1基因序列、SIV GP41的信号肽序列、SIV GP41的跨膜区和胞内区，PCR片段经琼脂糖凝胶电泳回收并用加A试剂盒加A后与PMD18T载体在4℃连接过夜，连接产物转化Jm109感受态细胞。经抗性平板筛选，制备质粒，并测序。

测序成功的质粒分别命名为SP-TV、VP1-TV、TM+CT-TV。再分别以SP-TV、VP1-TV、TM+CT-TV为模板重叠PCR SP-VP1-TMCT(其中下划线部分是附加的EcoRI与NotI酶切位点序列，扩增产物的预期大小是1523 bp，约55kDa)，扩增片段和真核表达载体PCAGGs、杆状病毒转座载体pFastBac^TM1分别用限制性内切酶EcoRI与NotI酶切处理，回收经酶切处理的扩增片段与载体并以T4 DNA连接酶在4℃连接过夜。连接产物经氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经抗性平板筛选，制备质粒，用限制性酶内切法鉴定目的片段并测序。测序成功的质粒命名为cVP1-pCAGGs、cVP1-pFastBac^TM1。同样用HS DNA Polymerase Kit以SIV-gag-pCAGGs为模板PCR gag基因，扩增片段和pFastBac^TM1分别用限制性内切酶EcoRI与HindIII酶切处理，回收酶切处理的扩增片段与载体并以T4 DNA连接酶在4℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞。经抗性平板筛选，制备质粒，鉴定并测序，测序成功的载体命名为gag-pFastBac^TM1。

二、鉴定cVP1的表达及表达分布

1、Western Blot 鉴定重组质粒表达

转染前一天将人宫颈癌HeLa细胞(1×10⁶/孔)接种于6孔板，次日细胞达对数生长期后参照脂质体Lipofectamine²⁰⁰⁰说明书分别转染cVP1-PCAGGs和pCAGGs质粒，转染后24小时收集细胞，RIPA细胞裂解液裂解细胞，加入SDS上样缓冲液，95℃变性5分钟，进行上样。

蛋白电泳结束后，将电泳产物电转移至NC膜上。电转完毕，取出NC膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入鼠抗EV71 VP1单抗，4℃过夜，PBST室温漂洗3次，PBS洗一次，再加入二抗，轻摇1h，PBST洗膜3次，PBS洗膜1次。将NC膜浸入等体积混合的化学发光试剂A液和B液中约1min，暗室中将NC膜贴在X光胶片上曝光，WB检测重组质粒的表达。结果参见图2(a)所示，其中，泳道1为Protein Marker；泳道2为转染pCAGGs的HeLa细胞样本；泳道3为转染cVP1-pCAGGs的HeLa细胞样本。电泳结果可以充分说明重组质粒能够表达，并且条带大小和预期一致大约55kDa，空载体转染组未见目的基因表达。

2、细胞免疫化学染色

通过免疫化学染色进一步分析验证融合基因的表达分布。HeLa细胞爬片，参照脂质体Lipofectamine²⁰⁰⁰说明书分别转染cVP1-PCAGGs和pCAGGs质粒，转染后24小时取出爬片，PBS清洗标本3次各5min，4％多聚甲醛固定10min，PBS清洗标本三次后空气干燥并粘于载玻片上。以3％H₂O₂阻断细胞内源性过氧化物酶，EV71 VP1抗体(1:200)，4℃过夜，PBS清洗标本三次后加通用型抗体(针对鼠、兔)37℃孵育45min，PBS清洗标本三次。DAB显色后封片，结果参见图2(b)所示，HeLa细胞转染cVP1-pCAGGs后结果阳性，包膜呈棕色；而转染pCAGGs空白质粒的细胞染色结果为阴性。此结果说明融合基因cVP1-PCAGGs能够在细胞水平成功表达，并且能够在细胞膜上表达，为膜锚定的质粒。

三、gag及cVP1融合基因重组转座及鉴定

1、质粒DNA的转座

将重组转座质粒gag-pFastBac^TM1、cVP1-pFastBac^TM1转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，并涂于含有X-gal和IPTG的筛选平板(含庆大霉素、卡那霉素及四环素抗性)，挑取白色菌落，接种入含有上述抗生素的培养基中，培养过夜，提取杆粒。

2、杆粒PCR鉴定

所提取杆粒用La DNA Polymerase Kit进行PCR鉴定，所用的引物为pUC/M13(M13上游引物:5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；M13下游引物:5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)，扩增条件为：94℃3min；94℃45sec，55℃45sec，72℃5min，35 cycles；72℃10min；4℃forever。扩增片段预计大小分别为3859、3823bp，PCR结果参见图3，其中，泳道一：DL15000；泳道二：阴性对照；泳道三：阳性对照杆粒；泳道四：cVP1 bacmid；泳道五：gag bacmid。结果表明重组杆粒能够扩增出相应片段，说明杆粒构建成功，并命名为gagbacmid、cVP1 bacmid。

四、获救重组杆状病毒

1、重组杆粒感染昆虫细胞

按照invitrogen试剂盒说明书再次提取杆粒，按照cellfectin转染试剂说明书分别将gag bacmid、cVP1 bacmid转染昆虫细胞TN5，设立TN5细胞对照，28℃培养，每天观察细胞病变情况，至5-7天出现细胞病变后，参见图4，分别为gag bacmid、VP1融合基因bacmid转染TN5细胞后细胞病变图。收集细胞培养上清，6000rpm 4℃离心30min,收集上清液，所得上清液含重组病毒,作为P1代病毒原液，此杆状病毒命名为rBV gag、rBV cVP1。收集转染后的TN5细胞，裂解液裂解，Western Blot检测gag、VP1的表达，结果如图5所示，其中，图5(a)是检测gag表达，泳道一为Protein Marker；泳道二：正常TN5细胞裂解产物；泳道三：gag bacmid转染后TN5细胞裂解产物。图5(b)为检测VP1表达，泳道一：Protein Marker；泳道二：cVP1 bacmid转染后TN5细胞裂解产物；泳道三：正常TN5细胞裂解产物。Western Blot显影条带约在55kDa，符合融合基因cVP1及gag的大小。

2、重组病毒的传代扩增及重组病毒滴度的测定

P1代rBV原液感染TN5细胞，28℃感染后96h，收集含有病毒的上清液，作为P2代病毒贮液。96孔板有限稀释法测定P2代病毒滴度(PFU/mL)。重复上述方法，以P2代病毒MOI 0.1感染TN5细胞，扩增P3代病毒，并测定病毒滴度。

五、cVP1病毒样颗粒(VLPs)的制备及鉴定

1、VLPs的初步制备

调整对数期生长的TN5细胞的浓度为2×10⁶/ml，分别以P3代rBVcVP1:gag MOI比例为3:1、6:1、10:1分别感染TN5细胞700mL(1.4×10⁹个细胞)；至病变细胞数﹥90％(感染后约72h)，收集全部细胞混悬液，6000rpm 4℃离心30min，留取上清，WB鉴定。结果参见图6，(a)为检测gag；(b)为检测EV71 VP1；泳道一：Protein Marker；泳道二：rBV cVP1:gag＝3:1；泳道三：rBV cVP1:gag＝6:1；泳道四：rBV cVP1:gag＝10:1。以6:1、10:1MOI比例感染的TN5细胞上清，能够检测到较高浓度的cVP1和gag，选择MOI 6:1用于后续试验。

2、VLPs的大量制备及纯化、鉴定

调整对数期生长的TN5细胞的浓度为2×10⁶/ml，以rBV cVP1:gag MOI比例为6:1感染TN5细胞700mL(2升容量瓶，2瓶)；至病变细胞数﹥90％(感染后约72h)，收集全部细胞混悬液，6000rpm 4℃离心30min,收集上清并装载到GE Quixstand超滤纯化系统，4℃进行浓缩。浓缩后的上清经不连续蔗糖密度(15％-50％)梯度超高速离心(28,000rpm，2h)，收获不同浓度的蔗糖组分，分离得到纯化的VLPs。纯化的VLPs用PBS洗涤，28,000rpm超高速离心30分钟，沉淀经PBS重悬，BCA蛋白浓度试剂盒测定浓度，稀释至1mg/ml，储存到-80℃分装备用。制备的VLPs命名为cVP1 VLPs。

2.1电镜检测病毒样颗粒的形态

用磷钨酸负染后，Hitachi-H7500透射电镜观察制备好的VLPs形态结构。电镜负染结果表明视野中出现结构完整的病毒样颗粒，其直径大小为100-110nm与gag病毒样颗粒直径大小相似(直径大小约110nm)，结果参见图7。图7(a)检测gag病毒样颗粒；图7(b)检测cVP1病毒样颗粒，表明该结构改造方式能产生结构完整的病毒样颗粒。

2.2 Western Blot检测gag及VP1的表达

将各个蔗糖梯度中获取的VLPs加入SDS上样缓冲液，95℃变性5分钟，进行上样。蛋白电泳结束后，将电泳产物电转移至NC膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入鼠抗EV71 VP1单抗以及兔抗gag P27多抗作为一抗，4℃过夜，PBST室温漂洗3次，PBS洗一次，再加入二抗，洗膜后显影。参见图8，其中，图8(a)鉴定gag表达；(b)鉴定VP1表达；泳道一：Protein Marker；泳道二：cVP1 VLPs 15％层；泳道三：cVP1VLPs 15-35％层；泳道四：cVP1VLPs35-50％层。结果显示cVP1 VLPs存在于15-35％及35-50％蔗糖层，而35-50％蔗糖层条带更纯。

六、小鼠免疫实验

1、小鼠免疫

分别用10μg cVP1 VLPs混合免疫佐剂后经腹腔注射免疫8周龄成年雌性BALB/c小鼠，初次免疫四周后加强免疫一次。每次免疫两周后采用眶后静脉丛刺破法采血，共免疫3次，并设置gag VLPs对照免疫组和TN5细胞裂解液对照免疫组。免疫分组及流程参见图9所示。

2.酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA方法检测免疫后小鼠血清中抗VP1抗体水平。实验前一天分别用纯化的EV71病毒或带有组氨酸标签的VP1纯化蛋白(8μg/ml)作为ELISA包被抗原，设置阳性对照。4℃包被过夜。第二天PBST洗板三次后用2％BSA-PBST封闭，室温2小时。将待检血清用稀释液从1：500开始作3倍连续稀释，加入抗原孔，100μl/孔，室温2小时；弃去血清，用PBST洗涤3～4次；加入经1:5000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG100μl/孔，室温1小时；弃去二抗，用PBST洗涤3次，甩干；加入底物溶液TMB(Sigma)显色约5分钟，然后用0.2N盐酸终止显色反应，用BioradModel 680酶标仪在490nm波长读取OD值进行分析。参见图10所示，可以看出，免疫后血清抗VP1蛋白效价，TN5细胞裂解液免疫组和gag VLPs免疫组只诱导出极低的抗体水平，基本与背景水平一致，而cVP1VLPs免疫组在第二次加强免疫后抗体浓度达到2¹²并持续维持至少8周。

Claims (10)

1.一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将cVP1融合基因克隆到真核表达载体及杆状病毒转座载体中得到cVP1融合基因重组转座载体和cVP1融合基因真核表达载体；将gag基因克隆到杆状病毒转座载体中，得到gag基因重组转座载体；用cVP1融合基因的真核表达载体转染哺乳动物细胞，检测其表达后，再用cVP1融合基因重组转座载体和gag基因重组转座载体制备cVP1和gag的杆粒，将杆粒转染TN5昆虫细胞，经分泌表达制得；

其中，所述cVP1融合基因是以重叠PCR法获得的SIV GP41与EV71VP1的融合基因，且cVP1融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒，其特征在于，所述cVP1融合基因包括GP41的信号肽区域、EV71VP1、GP41的跨膜区和胞内区；其中，GP41的信号肽区域的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；EV71VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；GP41跨膜区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；GP41胞内区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒，其特征在于，所述真核表达载体为pCAGGs，cVP1融合基因克隆到pCAGGs载体所形成的的重组质粒为cVP1-pCAGGs。

4.根据权利要求1所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒，其特征在于，所述的杆状病毒转座载体为pFastBac^TM1，cVP1融合基因克隆到pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为cVP1-pFastBac^TM1，gag基因克隆得pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为gag-pFastBac^TM1。

5.一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用重叠PCR法制得包括GP41的信号肽区域、EV71VP1、GP41的跨膜区和胞内区的cVP1融合基因，将cVP1融合基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1中，得到重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1；

2)采用PCR方法制得gag基因，将gag基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1中，得到重组转座载体gag-pFastBac^TM1；

3)将重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1和gag-pFastBac^TM1分别转化DH10Bac感受态细胞，然后与Bacmid进行重组，经鉴定，分别得到重组杆粒gag-Bacmid和cVP1-Bacmid；

4)将重组杆粒gag-Bacmid和cVP1-Bacmid分别转染TN5昆虫细胞，直至细胞病变率超过80％后，离心收集上清，得到P1代病毒，将P1代病毒连续传代2次后，得到重组杆状病毒rBV gag和rBV cVP1；

5)将重组杆状病毒rBV cVP1和rBV gag以(3～10):1的MOI比例接种TN5细胞，经悬浮培养后离心收集上清，经纯化制得肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒。

6.根据权利要求5所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤1)是将cVP1融合基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1的EcoRI、NotI酶切位点之间，得到重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1；步骤2)是将gag基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1EcoRI、HindIII酶切位点之间，得到重组转座载体gag-pFastBac^TM1。

7.根据权利要求5所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤5)所述的重组杆状病毒rBV cVP1和rBV gag的MOI比例为3:1、6:1或10:1；且是在28℃下悬浮培养72h后离心收集上清。

8.根据权利要求5所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤5)所述的纯化具体操作为：

首先，将得到的上清经GE Quixstand系统超滤纯化，在4℃下进行浓缩；

然后，离心后收集上清，将上清经15％～50％的不连续蔗糖密度梯度，再在28000r/min、4℃的条件下超高速离心2h，收集不同浓度的组分；

最后，用PBS洗涤，再经28000r/min超高速离心30min，沉淀经PBS重悬，得到纯化后的肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒。

9.权利要求1所述的肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒在制备治疗手足口病的疫苗中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为抗EV71病毒感染的疫苗。