ES2140380T5 - Secuencias de adn que codifican polipeptidos gag retroviricos modificados y vacunas que las contienen o agregados de las mismas. - Google Patents

Abstract

ESTRATEGIAS DE VACUNAS DEL VIH-1 CONVENCIONALES, BASADAS EN LA PARTE EXTERNA DE LA PROTEINA ENV GP160/120, NO HAN SIDO HASTA AHORA CAPACES DE INDUCIR UNA INMUNIDAD PROTECTORA. ADEMAS, ANTICUERPOS REALZADOS PUEDEN INFLUENCIAR NEGATIVAMENTE LA PROGRESION DE LA ENFERMEDAD. DEBIDO A LA APARICION TEMPRANA EN LA INFECCION Y SU NATURALEZA PARTICULAR, LA PROTEINA P55-GAG DEL NUCLEO DEL VIRUS PARECE SER UN CANDIDATO A VACUNA QUE PROMETE. LA EXPRESION P55-NUCLEO FUE ENSAYADA MEDIANTE UNA COMBINACION DE VACUNA Y VIRUS BACULO. EL VERTIDO DE LAS PARTICULAS DE NUCLEO 90-110 NM EN UN MEDIO DE CULTIVO FUE OBSERVADA EN AMBOS SISTEMAS DE EXPRESIONES Y PROBADOS MEDIANTE UN MICROSCOPIO DE ELECTRON DE SECCION ULTRADELGADA Y ANALISIS DE SEDIMENTACION. LA ADICION DE LA SECUENCIA CODIFICADA DE PROTEASA EN UN PROCESO EFICIENTE DE LA MOLECULA PRECURSORA P55ACULO . PROTEASA SIGNIFICANTE MEDIANTE EL PROCESO DEL PRECURSOR GAG EN EL SISTEMA-VACCINIA QUE SOLO ALCANZADA POR LA ADICION DE LA SECUENCIA CODIFICADA POL ENTERA. EN CONTRASTE CON OTROS RETROVIRUS (MMLV), PROTEASA VIH-1 MEDIATIZADA PROCESADA NO DEPENDE DE LA MIRISTILACION DE P55-GAG. UN PROCESO MEDIATIZADO DE PROTEASA NO COMPLETA EL PROCESO DE MADURACION DE LAS PARTICULAS DE PRECURSOR-P55, PERO EN CONTRASTE, INHIBE LA FORMACION DE PARTICULAS, OTRAS INVESTIGACIONES ENFOCADAS EN LA APLICACION DE PARTICULAS-P55-GAG PREMATURAS. PARA EXTENDER SU ESPECTRO INMUNOLOGICO, UNA SECUENCIA CONSENSUADA DEL MAYOR VIH EPITOPE V3 DE GP120 QUE NEUTRALIZA, DISEÑADO EN NUESTRO LABORATORIO, FUE INSERTADO EN DIFERENTES ZONAS DE LA MOLECULA PORTADORA P55. LA EXPRESION DE LAS PROTEINAS QUIMERICAS P55/V3 EN E. COLI Y EL SISTEMA DE EXPRESION VACCINIA FUE PROBADO POR EL ANALISIS WESTERN BLOT, UTILIZANDO (I) ANTICUERPOS MONOCLONALES DIRIGIDOS A P55 Y LA ZONA V3 INSERTADA Y (II) SERA PEPTIDO MONOESPECIFICO ANTI-V3. PARTICULAS HIBRIDAS P55/V3 SERAN PURIFICADAS DESDE CELULAS INFECTADAS DE BACULOVIRUS. LOS VIRUS DE VACCINIA P55/V3 RECOMBINANTES SON, EN ADICION A LA PRODUCCION DEANTIGENOS, UTILIZADOS DIRECTAMENTE COMO UNA VACUNA VIVA EN ANIMALES EXPERIMENTALES.

Description

Secuencias de ADN que codifican polipéptidos gag retrovíricos modificados y vacunas que las contienen o agregados de las mismas.

El problema técnico que sirve de base a la presente invención es proporcionar secuencias de ADN que codifiquen polipéptidos p55-gag retrovíricos modificados, que puedan ser utilizadas para inmunizar mamíferos contra enfermedades retrovíricas. Esta invención se refiere en particular a una vacuna recombinante de subunidad contra HIV, de nuevo diseño, producida en sistemas de expresión adecuados tales como, por ejemplo, baculovirus o virus de la viruela vacuna, recombinantes, respectivamente en células de insecto o en células de mamífero. La invención se basa en el antígeno p55-gag, específico para grupo, de HIV-1, que constituye el núcleo vírico y su capacidad formadora de partículas, cuando es producido en células eucariotas. La inmunogenicidad de las partículas p55 de núcleo prematuras, con un tamaño de 90-110 nm, puede ser extendida insertando epítopes bien caracterizados de otros marcos de lectura derivados de HIV-1, HIV-2 ó SIV (por ejemplo env, nef, pol), en tres regiones diferentes de la secuencia codificadora de gag que han sido seleccionadas mediante análisis asistido por ordenador de la estructura secundaria de p55. Para demostrar el principio general de la expresión estable y la inmunogenicidad incrementada de las partículas p55/gp120 recombinantes, se han insertado en la secuencia codificadora de la proteína portadora de p55, secuencias ejemplificadas por la región de fijación de CD4, gp120, una secuencia de consenso del epítope neutralizador V3 principal de gp120, y una secuencia de gp41 ("región fusogénica"), y se han expresado por medio de virus de la viruela vacuna y baculovirus, recombinantes, las construcciones resultantes. Los virus de la viruela vacuna p55/gp120 recombinantes pueden ser aplicados directamente como vacunas vivas o como una fuente de antígeno de proteína. Los baculovirus recombinantes son empleados para la producción y purificación eficaces de sólo las vacunas de subunidad p55/gp120 particulares y quiméricas.

Con respecto a la capacidad del HIV para persistir de manera latente en células infectadas, la eliminación de virus libres por medio de anticuerpos neutralizadores, así como el aclaramiento de células infectadas, por medio de citólisis celular dependiente de anticuerpos (AD-CC) y células T citotóxicas, tienen una importancia decisiva para el progreso de la enfermedad. Para aprender más acerca de cómo el sistema inmunitario se enfrenta a virus libres o a células infectadas por HIV, muchos laboratorios se han centrado en la identificación y caracterización de epítopes de células B y T, incluyendo todos los marcos de lectura. El papel de la respuesta inmunitaria humoral es crucial en la infección por HIV. Durante todas las fases de la progresión de la enfermedad, con excepción de las fases finales del SIDA, pueden detectarse anticuerpos para casi todas las proteínas del HIV (Vornhagen y otros, 1989). Se han descrito epítopes neutralizadores dirigidos contra las proteínas estructurales externas gp120 (Goudsmit y otros, 1988; Palker y otros, 1988), gp41 (Chan y otros, 1986), y contra las proteínas estructurales internas p17 (Papsidero y otros, 1989) y p24 (Wolf y otros, 1990), que podrían desempeñar un papel en la eliminación de virus libres. La citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC; Lyerly y otros, 1987, 1988) puede ser importante para eliminar células infectadas con HIV. Uno de tales epítopes ADCC parece estar localizado en la parte C-terminal de gp120. Sin embargo, también se conocen anticuerpos que influyen de manera negativa en el progreso de la enfermedad (intensificación de anticuerpos mediada por Fc y/o por complemento; Takeda y otros, 1989, Homsey y otros, 1989, Robinson y otros, 1989). La proliferación de células T4 puede ser específica de grupo, y mediante la aplicación de péptidos sintéticos se ha probado que está dirigida contra distintos epítopes env, gag y pol (Schrier y otros, 1989). El trazado del mapa de células T con virus de la viruela vacuna gp120 recombinantes ha identificado cuatro epítopes colaboradores de T en el gp120 (Berzofsky y otros, 1988, Krohn y otros, 1988). Además, se han podido establecer tres líneas de células T positivas para CD4, específicas para p24. Se han definido para proteínas env (Takahashi y otros, 1988, Siciliano y otros, 1988), proteínas gag (Nixon y otros, 1988), y proteínas pol (Walker y otros, 1988, 1989), epítopes CTL restringidos a MHC de clase I. La lisis mediada por CTL es extraordinariamente importante para la eliminación de las células infectadas. Otros sistemas de virus (virus de la gripe, virus de la rabia, citomegalovirus) han indicado que las proteínas no estructurales son capaces de generar inmunidad a través de la inducción de células T citotóxicas, y que se consigue el cebado del sistema inmunitario, el cual, cuando se ve atacado, provoca una respuesta aún más eficaz incluso hacia otras proteínas víricas (Milich y otros, 1988).

El empleo del HIV completo o de genes codificados de HIV intacto no puede asegurar la ausencia de efectos adversos en la inmunización. Entre estos efectos negativos se cuentan la intensificación de los anticuerpos, reacciones autoinmunitarias, tolerancia inducida, o efectos secundarios alérgicos.

A pesar de los prometedores resultados iniciales in vitro, la inmunización con gp160 completo o subunidades no parece ser suficiente para inducir inmunidad protectora. Las propiedades neutralizadoras de la respuesta inmunitaria inducida quedaban restringidas al mismo aislado empleado para la inmunización (específico de tipo, no de grupo; Nara y otros, 1988). Además, se ha demostrado que el HIV todavía puede amplificarse en animales inmunizados contra gp160 después de haber sido expuestos (Hu y otros, 1987). Varias razones pueden explicar la falta de inmunidad protectora:

1. Los epítopes decisivos de gp120 varían a un ritmo más rápido que el de su eliminación por los anticuerpos

2. La diseminación de los virus está mediada por contacto directo célula-célula al comienzo de la infección. Una respuesta inmunitaria humoral no es suficiente, y eventualmente una respuesta celular a gp120 tampoco es suficiente.

3. Los anticuerpos intensificadores pueden influir de manera negativa en el progreso de la enfermedad. En diferentes estudios in vitro se ha demostrado la intensificación de la infección por HIV, dependiente del complemento y mediada por Fc (Takeda y otros, 1988, Homsey y otros, 1989, Robinson y otros, 1989).

4. Epítopes que imitan productos de genes celulares normales desencadenan respuestas inmunitarias que atacan a células normales (Reiher y otros, 1986, Golding y otros, 1988, 1989).

5. Efectos inmunosupresores de la cubierta de HIV: gp120 libre se fija con elevada afinidad a la molécula receptora de CD4 de células diana, y las marca para el ataque ADCC (Lyerly y otros, 1988) y para el ataque CTL in vitro (Siciliano y otros, 1988, Lancavecchia y otros, 1988). Además, existe evidencia de que la fijación de gp120 a la molécula CD4 interfiere con la región del receptor de CD4 que es necesaria para la interacción con moléculas MHC de clase II (Weinhold y otros, 1989, Clayton y otros, 1989). Además, en el HIV gp41 están también presentes regiones de gp120 homólogas a las de la glicoproteína transmembránica de retrovirus humanos de tipo C, de las que se sabe que son sumamente supresoras de la función de los macrófagos (Clanciola y otros, 1988).

Así, el problema técnico que sirve de base a la presente invención es proporcionar secuencias de ADN que codifiquen un polipéptido p55-gag retrovírico modificado, que puedan ser utilizadas para inmunizar mamíferos contra enfermedades retrovíricas.

La solución del problema técnico anterior se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

De acuerdo con esto, la presente invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido gag retrovírico modificado tal como está caracterizado en las reivindicaciones, conteniendo dicho polipéptido gag al menos una secuencia de aminoácidos que representa un determinante antigénico de polipéptido no-gag, en donde la secuencia de ADN se deriva del retrovirus HIV-1, en donde el polipéptido gag es p55, en donde dicha secuencia de aminoácidos reemplaza una o varias regiones de dicho polipéptido gag, siendo capaces dichas regiones de presentar al sistema inmunitario la secuencia de aminoácidos insertada, de manera que se desencadena una respuesta inmunitaria, y en donde la región antes citada está situada en las posiciones de los aminoácidos 99 a 154, 211 a 241, o 436 a 471, o en cualquier combinación de las mismas.

Una respuesta inmunitaria semejante, o bien es una respuesta inmunitaria humoral, o bien es una respuesta inmunitaria mediada por células. Tales respuestas inmunitarias implican el compartimiento de células B y/o de células T.

El término "presentar" se refiere a la disponibilidad de un antígeno para el inmunorreconocimiento, de una manera tal que inicie la respuesta inmunitaria primaria y/o recupere dicha respuesta inmunitaria.

Las regiones en las cuales son reemplazadas dichas secuencias de aminoácidos son seleccionadas de acuerdo con los criterios siguientes:

(a) hidrofilia,

(b) flexibilidad y

(c) probabilidad superficial de la región eliminada.

La secuencia de aminoácidos antes mencionada reemplaza posiciones de secuencia de polipéptido gag.

En una realización preferida de la presente invención, la secuencia de ADN que codifica dicha secuencia adicional de aminoácidos es insertada por medio de un enlazador. Estos enlazadores son enlazadores convencionales que pueden contener varios lugares de escisión por enzimas de restricción que permiten incorporar según métodos convencionales, secuencias de ADN que codifican la secuencia adicional de aminoácidos antes mencionada.

En realizaciones preferidas de la presente invención, el determinante antigénico de polipéptido no-gag es:

(a)

al menos una parte del dominio de fijación de CD4 de gp120;

(b)

al menos una parte de la región variable 3 de gp120;

o

(c)

al menos una parte de una región conservada de gp41.

Partes particularmente preferidas del dominio de fijación de CD4 de gp120 se derivan de la región V3 del mismo, e incluyen las subregiones y derivados de dicha región V3 que están descritos con detalle en la Solicitud de Patente Europea que reivindica la prioridad del documento EP 90 10 5313.2.

Las partes antes mencionadas de las proteínas son regiones seleccionadas de las mismas que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria a los virus que se presentan en la naturaleza. Preferentemente, son capaces de inducir la formación de anticuerpos que reaccionan con los virus que se presentan en la naturaleza, o bien de inducir una respuesta inmunitaria mediada por células frente a infecciones por dichos virus.

En otra realización, la invención se refiere a vectores recombinantes que contienen cualesquiera de las secuencias de ADN antes mencionadas.

Dichos vectores recombinantes incluyen plásmidos convencionales que pueden ser empleados para la clonación o para la expresión de la secuencia de ADN en una célula huésped. En el caso de plásmidos de expresión, preferentemente se combina la secuencia de ADN con una secuencia de promotor que controla su expresión en células huésped apropiadas.

En una realización adicional, la invención se refiere a virus recombinantes que contienen una secuencia de ADN tal como las antes mencionadas. Preferentemente, este virus recombinante se deriva del virus de la viruela vacuna.

La invención se refiere también a organismos huésped que son transformados por dichos vectores recombinantes o virus recombinantes.

Además, la presente invención se refiere a un polipéptido gag retrovírico modificado que está codificado por cualquiera de las secuencias de ADN antes mencionadas.

La presente invención se refiere además a agregados que están en forma de partículas.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido gag retrovírico modificado tal como se ha caracterizado antes, comprendiendo dicho método cultivar un organismo huésped tal como se ha mencionado antes, en condiciones apropiadas, y recuperar del medio el producto de expresión.

Constituye una realización específica adicional de la invención producir dichas partículas gag en un sistema de expresión dependiente de baculovirus en células de insecto Spodoptera frugiperda y, empleando líneas celulares establemente transfectadas, en células de Drosophila Schneider.

Finalmente, la invención se refiere a una vacuna que contiene un virus recombinante tal como se ha descrito antes, y a un polipéptido formador de partículas tal como se ha descrito. En realizaciones preferidas estas vacunas contienen también un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Para desarrollar una vacuna recombinante de diseño, que sea capaz de inducir inmunidad protectora frente a la infección por HIV, es necesario un conocimiento detallado de la antigenicidad y variabilidad de las estructuras que se encuentran implicadas en la adsorción y penetración del virus. Pocas aproximaciones alternativas están basadas en partículas derivadas de HIV, total o parcialmente desprovistas de gp120, o en proteína gag purificada.

Los siguientes razonamientos son bases de la presente invención

1.

Debido a la variabilidad observada del HIV deben incluirse grandes porciones de productos de gen inmunológicamente relevantes.

2.

Deben estar excluidos epítopes de los que se sabe que generan anticuerpos intensificadores y epítopes de los que se sabe que imitan proteínas celulares.

3.

Deben tenerse en consideración como componentes de la vacuna aquellas regiones que inducen inmunidad de células T y que son dianas de ADCC.

4.

El producto de vacuna debe ser generado como un antígeno en forma de partículas, para actuar como inmunógeno en una forma estable sin aplicación de coadyuvantes adicionales.

5.

Para expresar estos componentes directamente en células infectadas pueden emplearse virus recombinantes alternativos tales como virus de la viruela vacuna, herpes simplex o adenovirus.

La posibilidad de producir partículas de núcleo p55 prematuras en sistemas eucarióticos de expresión permite a los autores de la presente invención diseñar una vacuna de subunidad que cumple los postulados arriba mencionados. El grupo de los autores de la presente invención, y otros, han expresado partículas autólogas de núcleo p55 en el sistema de expresión del virus de la viruela vacuna y de baculovirus. Al igual que lo que se sabe de otras vacunas de subunidad particulares (por ejemplo partículas de 22 nm de Hep. B), las estructuras de partículas muestran un potencial coadyuvante intrínseco que es utilizado en la presente invención.

Producción de partículas de híbrido p55/gp120 recombinante de acuerdo con la invención

Como consecuencia de todos los hallazgos, los autores de la presente invención han utilizado partículas de núcleo p55 como un vehículo autólogo para epítopes apropiados fuera del contexto de otros marcos de lectura.

1)

Se clonó p55-gag en un vector pUC comercial, y se expresó en la cepa JM109 de E. coli. Para la clonación de la proteína p55 auténtica sin secuencias no traducidas se empleó la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). La subsiguiente expresión de p55 en sistemas eucarióticos se consiguió mediante virus de viruela vacuna y baculovirus, recombinantes. La formación de partículas p55 fue demostrada mediante sedimentación en gradiente de sacarosa y microscopía electrónica.

2)

La identificación de posiciones apropiadas en la proteína de núcleo p55 para la inserción de epítopes procedentes de otros marcos de lectura fue realizada por medio de análisis asistido por ordenador de la estructura secundaria de p55 (Wolf y otros, 1988). Mediante esta aproximación, los autores de la presente invención predijeron cuatro regiones dentro de la proteína de núcleo p55 que estaban expuestas en la superficie de la proteína.

3)

Para el desarrollo de las secuencias p55-núcleo/gp120-env (cubierta), recombinantes, se sintetizó un polienlazador. Esta secuencia de enlazador contenía todos los sitios de restricción que eran necesarios para el desarrollo y posterior expresión de tres construcciones de supresión de p55 distintas, carente cada una de una región que codifica 30-45 aminoácidos. De esta manera se consiguió la compatibilidad de todas las construcciones de supresión en cuanto a la inserción de secuencias extrañas, para la subclonación y posterior expresión en sistemas de vector eucarióticos.

4)

En una primera aproximación, para la inserción en las construcciones de supresión de p55 se seleccionaron tres epítopes del marco de lectura gp120-env de HIV-1:

La región de fijación de CD4

La adsorción de virus libres y células infectadas con HIV a células diana CD4 está dirigida por la fijación de la proteína de membrana externa vírica gp120 a la proteína CD4 de la membrana celular. La molécula receptora de CD4 está expresada principalmente en linfocitos T4 y en células del linaje de los monocitos y los macrófagos. La región que es responsable de la interacción con el receptor de CD4 está situada en la parte C-terminal de gp120 (aminoácidos 413-451), y está bien conservada en diferentes aislados de HIV (Kowalski y otros, 1987, Lasky y otros, 1987). Aunque parece que la región fijadora de CD4 no es inmunogénica en seres humanos en la infección natural, se ha demostrado que la inserción de esta región en la proteína estructural VP1 de la superficie de poliovirus induce anticuerpos neutralizadores en animales infectados. Además, anticuerpos monoclonales dirigidos contra esta secuencia tienen capacidad neutralizadora e inhiben in vitro la formación de sincitias a través del bloqueo de la unión de virus libres o de células infectadas por HIV, dependiente de CD4, a las células diana (Sun y otros, 1989).

Lazo GPGR-V3 de gp120

El lazo hipervariable V3 del gp120 ha sido descrito por el grupo de los autores de la presente invención como la única región hipervariable sin secuencia de consenso para la N-glicosilación, y se ha discutido su importancia inmunológica (Modrow y otros, 1987). Se ha identificado esta región como el epítope neutralizador principal de HIV-1, y podría estar relacionada con una secuencia de 24 aminoácidos (aminoácidos 302-326). Un péptido de 6 aminoácidos es suficiente para inducir anticuerpos neutralizadores. Esta secuencia contiene un motivo de giro beta de 4 aminoácidos, GPGR, que está sumamente conservado en diferentes aislados (Palker y otros, 1988, Goudsmit y otros, 1988). Los aminoácidos flanqueadores parecen ser críticos para la fijación de anticuerpos y la neutralización de virus específica respecto al tipo. Se ha caracterizado una secuencia de 14 aminoácidos (315-329) como una región diana de ADCC. Además, se puede demostrar que las células T citotóxicas restringidas de MHC clase I reconocen un péptido de 18 aminoácidos de la región V3 en el modelo de ratón (Takahashi y otros, 1988). No está claro hasta la fecha cómo los anticuerpos neutralizadores de V3 inhiben realmente la infección y la formación de sincitias in vitro (Skinner y otros, 1988). Resultados recientes han proporcionado posibles claves que indican la elaboración de gp120 en ciertas condiciones de ensayo, para dar dos polipéptidos (de 50 kD y de 70 kD). Se ha trazado el mapa del lugar de escisión directamente con respecto a la secuencia CPGRA conservada del lazo V3. El gp120 elaborado todavía es capaz de fijarse a la molécula CD4, pero ya no puede ser reconocido por anticuerpos neutralizadores anti-V3. La tripstatina, un nuevo inhibidor de proteasa de tipo Kunitz con una elevada homología de secuencia respecto a la región V3 de gp120, inhibe la actividad de proteasa descrita y la posterior formación de sincitias. El suceso de elaboración post-fijación, dependiente de V3, parece constituir una predisposición para la fusión de la membrana vírica externa o la membrana de células infectadas con HIV-1 con una célula diana CD4 (Hattori y otros, 1989). Esto podría explicar esencialmente el efecto inhibidor de anticuerpos neutralizadores anti-V3. Las evidencias recientes indican que la supresión de este lazo en un clon infeccioso anula la infectividad del virus.

La región conservada gp41

El gp41 interviene como mediador en la fusión de membranas del HIV fijado, con la célula diana CD4, y en la formación de sincitias de células infectadas con células sin infectar (Kowalski y otros, 1987, Mc Clure y otros, 1988). Los anticuerpos monoclonales producidos contra un antígeno específico de grupo gp41 neutralizan in vitro un panel de diferentes aislados de HIV-1. La inserción del epítope neutralizador gp41 en el poliovirus VP1 y la posterior inmunización de animales de experimentación ha dado como resultado la inducción de anticuerpos neutralizadores anti-gp41, que inhiben la formación de sincitias (Evans y otros, 1989).

La región de fijación de CD4 y la región fusogénica gp41 han sido amplificadas y subclonadas en las construcciones de supresión de p55 empleando la reacción PCR. Se ha sintetizado químicamente la secuencia de consenso del epítope neutralizador V3 principal de gp120, y también se ha insertado en los clones de supresión de p55. Para determinar la expresión correcta de las proteínas de fusión p55/gp120 diseñadas, se han producido en E. coli las proteínas recombinantes, y han sido verificadas mediante análisis de tinción tipo Western.

5)

Después de subclonar las construcciones recombinantes p55/gp120 finales en vectores de transferencia eucarióticos, se han expresado estos genes híbridos en sistemas de expresión de virus de la viruela vacuna y baculovirus. La expresión correcta ha sido verificada mediante análisis de tinción tipo Western e inmunofluorescencia. Mediante microscopía electrónica se ha estudiado la formación de partículas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Descripción del procedimiento de clonación para el clon de expresión en E. coli pUC8p55.

Figura 2: Expresión de p55 (v-p55) y p55 en combinación con la proteasa de HIV (v-p55prt), por virus de viruela vacuna recombinantes. Se infectaron células CV1 con 10 pfu (unidades formadoras de partículas) de virus de viruela vacuna recombinante p55. Se cosecharon las células al cabo de 36 horas (v-p55) y a diferentes intervalos después de la infección, y se resuspendieron en mezcla en ebullición. Las células infectadas fueron analizadas mediante un análisis de tinción tipo Western convencional, de la manera siguiente: los lisados celulares fueron separados en una PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) al 17,5%, y teñidos sobre membranas de nylon (Sleicher and Schuell). Las proteínas recombinantes de 55 kD y 41 kD fueron detectadas mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra p24 (mab 13/5) y contra p17. Tal como ha demostrado el experimento, la proteasa de HIV-1 no posee influencia sobre la expresión de p55 en el sistema de expresión en el virus de la viruela vacuna. Tal como ha indicado la reacción del producto acortado de 41 kD con el anticuerpo monoclonal anti-p17, al menos parte del producto acortado comparte las secuencias N-terminales con la proteína de 55 kD completa.

Figura 3: Expresión de p55 por baculovirus recombinantes (b-p55). Se infectaron células de Spodoptera frugiperda con 10 pfu de dichos virus. Cada día se cosecharon células infectadas, hasta el día 5. Las células procedentes de los días 1-5 y el sobrenadante del cultivo del día 5 fueron resuspendidos en mezcla en ebullición, y analizados mediante análisis de tinción tipo Western convencional. Las proteínas recombinantes fueron detectadas específicamente por medio de anticuerpos monoclonales dirigidos contra p24.

Figura 4: Se analizaron mediante sedimentación por densidad en sacarosa (2,5 horas, TST 41,14; 28.000 r.p.m.) 2 ml de sobrenadante de cultivo de células infectadas con b-p55, cosechadas 5 días después de la infección. Se recogieron 19 fracciones (600 \mul), y se analizaron 20 \mul de cada fracción mediante análisis de tinción tipo Western convencional empleando anticuerpos monoclonales específicos para p24, con el fin de detectar la proteína recombinante. Tal como demostró la tinción negativa subsiguiente, las partículas p55 prematuras quedaron acumuladas en la fracción 17, con una densidad de sacarosa de 45%.

Figura 5: Cinco días después de la infección se fijaron en glutaraldehído al 2% células de Spodoptera frugiperda, infectadas con 10 pfu de b-p55, y se analizaron en cuanto a formación de partículas mediante microscopía electrónica de sección ultrafina. Se detectaron partículas de p55 prematuras, de 90-110 nm, brotando de la membrana citoplasmática.

Figura 6: Mediante análisis asistido por ordenador de la estructura secundaria de p55 se predijo que cuatro regiones constituían epítopes expuestos sobre la superficie de la proteína de núcleo. Se eliminaron estas secciones y fueron suplementadas por pequeños polienlazadores, seleccionados para la integración sencilla de epítopes extraños.

Figura 7: Secuencias de cebador sintéticas empleadas en la reacción PCR, pequeños fragmentos de enlazador sintético para hacer a las construcciones de supresión de p55 compatibles entre sí, en relación con el marco de lectura, para la inserción de epítopes extraños y de un epítope producido sintéticamente del gp120 de HIV-1.

a)

polienlazador sintético para construir el vector plin8 derivado de pUC8.

b)

cebadores sintéticos empleados para amplificar la parte 3 de la construcción 4 de supresión de p55.

c)

secuencia de cebador sintética necesaria para amplificar la región fijadora de CD4 de gp120 derivado de HIV-1.

d)

secuencia de cebador sintética necesaria para amplificar la región fusogénica de gp41 derivado de HIV-1.

e)

secuencia de una región de consenso, sintetizada químicamente, del epítope neutralizador V3 principal de HIV-1.

Figura 8: Procedimiento de clonación para desarrollar la construcción 1 de plin8p55.

Figura 9: Procedimiento de clonación para desarrollar la construcción 2 de plin8p55.

Figura 10: Procedimiento de clonación para desarrollar la construcción 3 de plin8p55.

Figura 11: Procedimiento de clonación para desarrollar la construcción 4 de plin8p55.

Figura 12a: Expresión de tres construcciones diferentes de supresión de plin8p55 (plin8p55 2, 3 y 4) al lado de la expresión de los clones respectivos, con la secuencia de consenso insertada del epítope neutralizador V3 principal de HIV-1 (plin8p55V3-2, -3 y -4). Se cultivaron bacterias recombinantes hasta una densidad óptica de 0,6, se indujeron durante 2 horas por medio de IPTG 2 mM, se lisaron en mezcla en ebullición, y se caracterizaron mediante análisis de tinción tipo Western convencional. Las proteínas de fusión p55v3 recombinantes fueron detectadas específicamente mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra p24 (a) y mediante un combinado de sueros humanos (b).

Figura 12b: Expresión de cuatro construcciones diferentes de supresión de plin8p55 (plin8p55 1, 2, 3 y 4) al lado de la expresión de los clones respectivos, con la región fijadora de CD4 insertada de la región C3 de gp120 de HIV-1 (plin8p55CD4-1, -2, -3 y -4). Se cultivaron bacterias recombinantes hasta una densidad óptica de 0,6, se indujeron durante 2 horas por medio de IPTG 2 mM, se lisaron en mezcla en ebullición, y se caracterizaron mediante análisis de tinción tipo Western convencional. Las proteínas de fusión p55CD4 recombinantes fueron detectadas específicamente mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra p24.

Figura 13: Expresión de tres proteínas de fusión p55/V3 diferentes (p55V3-2, -3 y -4) en E. coli después de la inducción con IPTG 2 mM, a una densidad óptica de 0,6. Las proteínas de fusión p55V3 recombinantes fueron detectadas específicamente mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra p24 (a) y (c) contra el epítope V3 de un aislado extraño (IIIb). Un suero policlonal producido contra un péptido sintético que representa la secuencia original de la secuencia de consenso de V3, detectó el p55/V3 incluso mejor que el anticuerpo monoclonal derivado del péptido IIIb. El hecho de que ni el anticuerpo monoclonal ni el suero policlonal específico para V3 detecten la proteína p55V3-2 indica que el contexto antigénico de la región V3 es importante para la detección inmunológica.

Figura 14: Se infectaron células CV-1 con 10 pfu de v-p55V3-3, se cosecharon dos días después de la infección, y se caracterizaron mediante análisis de tinción tipo Western convencional, empleando anticuerpos monoclonales dirigidos contra p24 y contra la región V3 derivada de IIIb.

Los ejemplos ilustran la invención:

Ejemplo 1 Expresión de p55 en E. coli (métodos estándar: Sambrook y otros, 1989)

Antes de que se pudiera producir p55 en sistemas eucarióticos, tuvo que ser clonado y expresado en E. coli. Para la expresión preliminar se eligió el sistema de vector pUC. Para clonar la secuencia 5' de la proteína del núcleo de manera precisa, sin secuencias sin traducir más largas, los autores de la presente invención insertaron un oligonucleótido sintético de 62 pares de bases que codificaba los 15 aminoácidos N-terminales de p55, en marco con el fragmento lacZ alfa, en el sitio Bam HI/Hind III del vector pUC8. Dos sitios de restricción 3' localizados en el oligonucleótido, ClaI y SalI, han permitido a los autores de la presente invención completar el marco de lectura gag mediante la inserción de un fragmento p55-ClaI/HincII de 1.694 pares de bases, figura 1). La expresión de la proteína recombinante en E. coli después de la inducción con IPTG 2 mM dio como resultado la producción de una proteína de 55 kD, demostrada mediante análisis por tinción tipo Western convencional, empleando anticuerpos monoclonales.

Ejemplo 2 Expresión de p55 por virus de la viruela vacuna recombinantes

El fragmento BamHI/SalI que codificaba todo el marco de lectura p55 pudo ser subclonado directamente en el vector de transferencia pAvB de la viruela vacuna, y ser recombinado en virus de la viruela vacuna. Los productos de expresión fueron analizados mediante análisis por tinción tipo Western convencional, empleando anticuerpos anti-p24 (figura 2).

Ejemplo 3 Expresión de p55 por baculovirus recombinantes

Para expresar la proteína del núcleo mediante baculovirus recombinantes, tuvo que ser subclonada dos veces: se tuvo que insertar el fragmento BamHI/SAlI en el sitio BamHI/SalI de pUC19. Después se subclonó adicionalmente el fragmento SacI/SalI codificador de p55, en el sitio SacI/SalI de un vector plC19R comercial. Después de esta operación, se pudo reclonar la secuencia codificadora de p55 en un único sitio BamHI del báculo-vector de transferencia pVL941 (Summers y otros, 1988). Después de un suceso de recombinación, la proteína del núcleo fue expresada por baculovirus recombinantes p55 en células de insecto de Spodoptera frugiperda. La expresión fue analizada mediante análisis de tinción tipo Western (figura 3).

Ejemplo 4 Identificación de partículas p55 prematuras

La formación de partículas p55 fue caracterizada mediante análisis de sedimentación en sacarosa y microscopía electrónica. Se centrifugaron gradientes de sacarosa a 28.000 r.p.m. durante 150 minutos en un rotor TST 41.14. Se analizaron 19 fracciones mediante tinción negativa y análisis de tinción tipo Western en busca de partículas p55. Las partículas se habían acumulado en la fracción 17, con una densidad de sacarosa de 1,41 (figura 4). El análisis de células de Spodoptora frugiperda mediante microscopía electrónica en sección ultrafina identificó partículas p55 prematuras que brotaban de la membrana citoplasmática hacia el medio de cultivo (figura 5).

Ejemplo 5 Análisis asistido por ordenador de la estructura secundaria de p55

Para poder insertar de manera racional en la proteína del núcleo epítopes seleccionados, derivados de otros marcos de lectura distintos de gag, debían ser establecidas a nivel de ADN varias construcciones de supresión de p55 que careciesen de un tramo de 120 a 180 pares de bases. Los autores de la presente invención decidieron, basándose en el análisis asistido por ordenador de la estructura secundaria de p55, eliminar cuatro secuencias codificadoras de 30 a 45 aminoácidos de acuerdo con criterios de exposición de las regiones respectivas sobre la superficie de la proteína p55 (figura 6). Todos los mutantes de supresión se derivaban del clon de expresión pUC8p55.

Ejemplo 6 Construcción de las construcciones de supresión de p55

La base de cada una de las cuatro construcciones de supresión de p55 era un polienlazador especialmente diseñado, que suplementaba el polienlazador derivado de pUC8. El nuevo fragmento enlazador contenía todos los sitios de restricción para construir cuatro clones de supresión de p55 diferentes, para expresar directamente en E. coli, y para subclonar directamente las construcciones finales en diferentes vectores de transferencia, diseñados para expresar genes eucarióticos. El derivado de pUC8 resultante recibió la denominación plin8 (figura 7a).

Referencia 1

Construcción-1 de supresión de p55 (plin8p55 1)

El desarrollo de la construcción-1 de supresión de p55 se basó en el clon pUC19p55 arriba descrito. Para eliminar dos sitios AccI, se acortó la secuencia codificadora p55 en la medida del fragmento 3'PstI de 1.100 pares de bases (pUC19p55BP). En los sitios ClaI/AccI de la secuencia codificadora de p55 N-terminal se insertó un fragmento enlazador de 26 pares de bases, que contenía dos sitios de restricción adicionales (SacI/XhoI; figura 7b), con el fin de conseguir la compatibilidad de la construcción descrita, con todos los clones de supresión de p55 posteriores (pUC19p55BP 1). De este modo se eliminó un fragmento de ADN de 129 pares de bases, que codificaba 43 aminoácidos. Después de esto se completó la secuencia codificadora de p55 mediante el fragmento 3'PstI/SalI (pUC19p55 1). El fragmento-1 de supresión de p55 resultante fue subclonado en el vector plin8 (plin8p55 1) (figura 8).

Ejemplo 7 Construcción-2 de supresión de p55 (plin8p55 2)

En el sitio BamHI/HindIII de plin8 se clonó el fragmento BamHI/HindIII de 300 pares de bases, derivado de pUC8, que codificaba una parte N-terminal de p55 (plin8p55BH). Después de esto se insertó el fragmento 3'NsiI/SalI de 1.283 pares de bases en el sitio PstI/SalI de plin8p55BH (plin8p55 2) (figura 9).

Ejemplo 8 Desarrollo de la construcción-3 de supresión de p55 (plin8p55 3)

En los sitios BamHI/SalI del vector plin8 descrito se subclonó un fragmento BamHI/SalI derivado de pUC8p55 que codificaba toda la proteína del núcleo de HIV-1 (plin8p55). Para hacer a la construcción compatible con los otros clones de supresión de p55, se insertó en el sitio PstI/SpeI de plin8p55 un fragmento enlazador XhoI/SacI de 27 pares de bases. La construcción de supresión de p55 resultante fue renombrada como plin8p55 3 (figura 10).

Ejemplo 9 Desarrollo de la construcción-4 de supresión de p55 (plin8p55 4)

Se clonó en el sitio BamHI/SalI de plin8 la secuencia codificadora de gag completa, derivada de pUC8p55 (plin8p55). Mediante reacción en cadena de polimerasa se amplificó la parte 3' (que codifica los aminoácidos 471-512) de la secuencia codificadora de p55, empleando un cebador 5' de 61 pares de bases que contenía cinco sitios de restricción diferentes (BamHI, BglII, XhoI, EcoRI, SacI) y un cebador 3' de 21 pares de bases que contenía un sitio de restricción HincII (figura 7d). Se insertó el fragmento BglII/SalI amplificado en el sitio BglII/SalI de la construcción plin8p55 (figura 11). En el clon final plin8p55 4, se eliminó una secuencia de 105 pares de bases que codificaba 35 aminoácidos.

Ejemplo 10 Compatibilidad de las cuatro construcciones de supresión de p55

Las construcciones de supresión de p55 desarrolladas son compatibles con respecto a:

1.

La inserción de secuencias extrañas. En cada una de las cuatro "casettes" puede insertarse una secuencia definida, sin cambios en el marco de lectura.

2.

La posibilidad de subclonar directamente las construcciones completadas, en vectores apropiados para la expresión de genes eucarióticos.

Ejemplo 11 Expresión en E. coli de las construcciones de supresión de p55

Todas las construcciones de supresión fueron expresadas en E. coli JM109 tras inducción con IPTG 2 mM. Los productos de expresión fueron verificados mediante análisis de tinción tipo Western convencional empleando anticuerpos monoclonales anti-p24.

Ejemplo 12 Inserción de epítopes seleccionados de otros marcos de lectura

1.

Mediante reacción PCR se amplificaron la región fijadora de CD4 del gp120 de HIV-1 y la región fusogénica de gp41. Los cebadores 5' contenían un sitio XhoI, y los cebadores 3' contenían un sitio SacI, para ser capaces de insertar fragmentos XhoI/SacI amplificados en las construcciones de supresión de p55 (figura 7e).

2.

Se sintetizó químicamente una secuencia de consenso diseñada del epítope neutralizador V3 principal de gp120, y fue integrada en el sitio XhoI/SacI de las construcciones de supresión de p55 (figura 7f).

Ejemplo 13 Expresión en E. coli de las proteínas de fusión p55/gp120 completadas

Se expresaron en E. coli, tras inducción con IPTG 2 mM, los productos de fusión p55/gp120 descritos en el Ejemplo 15, y fueron analizados mediante análisis por tinción tipo Western convencional, empleando anticuerpos monoclonales anti-p24 y un combinado de sueros humanos (figura 12a).

Ejemplo 14 Verificación de la expresión correcta de un epítope insertado

La expresión del epítope neutralizador V3 principal de gp120, insertado, fue verificada empleando un anticuerpo monoclonal comercial dirigido contra la región V3 de la cepa HT-LVIIIb, mediante análisis por tinción tipo Western convencional. Un suero monoespecífico policlonal producido contra el péptido de consenso de V3 sintético también reconoció en análisis por tinción tipo Western el epítope integrado.

Ejemplo 15 Subclonación en vectores de expresión eucarióticos de las construcciones p55/gp120 completadas

Se subclonaron las construcciones p55/gp120 en (i) el sitio BglII/SalI del vector de transferencia de viruela vacuna pAvB, en (ii) el único sitio BamHI del báculo-vector de transferencia pVL941, y en (iii) el sitio XbaI/SalI del vector pMD, para expresar las proteínas quiméricas en células CHO.

Ejemplo 16 Expresión en sistemas de expresión eucarióticos de las construcciones p55/gp120 completadas

Tras la transfección y recombinación de los genes híbridos en el ADN bacteriano (virus de la viruela vacuna, baculovirus), las proteínas de fusión fueron expresadas por virus de la viruela vacuna recombinantes en células CV1, y por baculovirus recombinantes en células de Spodoptera frugiperda. Los productos de expresión fueron verificados mediante análisis de tinción tipo Western convencional y mediante análisis de inmunofluorescencia, empleando anticuerpos monoclonales anti-p24 específicos.

Ejemplo 17 Análisis de la formación de partículas

La formación de partículas fue estudiada mediante microscopía electrónica empleando secciones ultrafinas de células fijadas con glutaraldehído, que habían sido infectadas con virus de la viruela vacuna o con baculovirus, recombinantes, p55/gp120.

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Claims (11)

1. Un método para producir una secuencia de ADN que codifica un polipéptido gag retrovírico modificado que forma una partícula, conteniendo dicho polipéptido gag al menos una secuencia de aminoácidos que representa un determinante antigénico de polipéptido no-gag, en donde dicha secuencia de ADN que codifica el polipéptido gag se deriva del retrovirus HIV-1, en donde dicha secuencia de ADN que codifica dicha secuencia de aminoácidos reemplaza una o varias regiones de dicha secuencia de ADN que codifica dicho polipéptido gag, siendo capaces dicha o dichas regiones de presentar al sistema inmunitario la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN insertada, de manera que se desencadena una respuesta inmunitaria, y en el cual dicha región está situada en las posiciones de aminoácidos 99 a 154, 211 a 241, o 436 a 471, o en cualquier combinación de las mismas, comprendiendo dicho método la sustitución de al menos un codón de una secuencia de ADN que codifica dicho polipéptido gag, por una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos no gag.

2. El método según la reivindicación 1, en el cual la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos adicional es insertada por medio de un enlazador.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el cual el determinante antigénico de polipéptido no-gag es

(a)

al menos una parte del dominio de fijación de CD4 de gp120;

(b)

al menos una parte de la región variable 3 de gp120; o

(c)

al menos una parte de la región fusogénica de gp41.

4. Un método para producir un vector recombinante, que comprende la inserción de una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en una molécula de vector.

5. Un método para producir un virus recombinante, que comprende las etapas de insertar una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en una molécula de ADN vírico.

6. El método según la reivindicación 5, en el cual el virus recombinante es un virus de la viruela vacuna.

7. Un método para producir un huésped que es portador de un vector recombinante que se puede obtener mediante un método según la reivindicación 4, o un virus recombinante que se puede obtener mediante un método según la reivindicación 5 ó 6, comprendiendo dicho método la incorporación de dicho vector recombinante o de dicho virus recombinante en un huésped apropiado.

8. Un método para producir un polipéptido gag retrovírico modificado que está codificado por una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende los pasos de cultivar en condiciones adecuadas un huésped que se puede obtener mediante un método según la reivindicación 7, y recuperar del medio dicho polipéptido.

9. Un método según la reivindicación 8, en el cual los polipéptidos forman partículas.

10. El método según la reivindicación 8 ó 9, en el cual dicho organismo huésped es una célula de insecto, preferentemente una célula de Spodoptera frugiperda, y en el cual dicho virus con el cual se ha transformado dicha célula de insecto es un virus de insecto recombinante, preferentemente un baculovirus.

11. El método según la reivindicación 8 ó 9, en el cual dicha célula huésped es una célula de insecto, preferentemente una célula de Drosophila Schneider, y en donde dicho vector recombinante con el cual se ha transformado dicha célula de insecto es replicable de manera estable en células de insecto.