ES2354830T3 - Vacuna de vih. - Google Patents
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Abstract
Un lentivirus recombinante que tiene un péptido señal de glucoproteína gp120, en el que dicho péptido señal de glucoproteína 120 se selecciona del grupo constituido por las secuencias polipeptídicas enumeradas como SEC ID Nº 3-6.
Description
Vacuna de VIH.
La invención se refiere a una vacuna novedosa
para uso en la prevención y/o el tratamiento del SIDA. Más
particularmente, la invención se refiere a la producción del virus
del SIDA en grandes cantidades para la formulación de una vacuna de
VIH/SIDA que es no citolítica y avirulenta.
A pesar de los recientes avances en la terapia
antivírica, no hay una cura permanente para el SIDA o la infección
por VIH. La terapia farmacológica es un escenario prometedor de
investigación en términos de proporcionar una terapia eficaz, sin
embargo, debido a los efectos secundarios, cumplimiento y gastos, la
progresión no ha sido rápida. Agravando estas dificultades está el
hecho de que la disponibilidad de dichos fármacos es limitada en
los países en desarrollo, donde se estima que ocurrirán la gran
mayoría de infecciones por VIH.
Debido al éxito que han tenido las vacunas de
enfermedades infecciosas, siendo el más notable contra la viruela y
la polio, continúa la búsqueda de una vacuna eficaz contra el SIDA.
Se han intentado una variedad de enfoques. Es más, la mayoría del
desarrollo de vacuna de VIH-1 se ha concentrado en
vacunas de subunidades. La dificultad con el enfoque de vacuna de
subunidades ha sido la capacidad de producir una inmunidad óptima.
Actualmente, no es conocido exactamente cuáles componentes del
antígeno o antígenos de VIH y del sistema inmunitario son
necesarios para protección de la infección natural.
La vía preferida para el desarrollo de vacunas
en general es usar virus enteros, inactivados o atenuados, tales
como la vacuna del virus de la polio inactivado, o vacunas de virus
vivos atenuados, tales como la vacuna oral de la polio.
Desgraciadamente, este enfoque puede ser problemático como se
muestra por el "incidente Cutter", en el que una inactivación
inadecuada de la vacuna de la polio dio como resultado la
transmisión de polio clínica mediada por vacuna.
Los ensayos de vacuna anteriores han buscado
inmunógenos basados en proteína de subunidades recombinante, tales
como la glucoproteína 120 (gp120) de cubierta de
VIH-1. La mayoría de resultados de este enfoque han
sido decepcionantes, aunque pautas de inmunización que emplean tanto
virus recombinantes vivos como proteína de subunidades han
desencadenado en ciertos individuos tanto CTL CD8+ específicos de
cubierta como neutralizantes de cubierta de VIH-1
(Cooney, E. L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
1882-86 (1993); McElrath, M. J. et al. J.
Infect. Dis. 69: 41-47 (1994); Graham, B. S.
et al. J. Infect. Dis. 166: 244-52
(1992) y Graham, B. S. et al. J. Infect. Dis. 167:
533-37 (1993)).
De forma interesante, se ha encontrado que la
secuencia señal de gp120 de VIH-1, que se designa
como NSS (secuencia señal natural), que está asociada con la
extensión de la secreción de gp120. Se ha mostrado que la
sustitución de NSS por secuencia señal de melitina de abeja
melífera o de interleucina 3 de murina (IL-3),
produce un alto nivel de producción y una secreción eficaz de gp120
(Li, Y. et al. Virology 204: 266-278
(1994) y Li, Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:
9606-9611 (1996)). Sin embargo, no es conocido si la
secuencia señal de gp120 de VIH-1 tiene un papel en
la patogenicidad del virus. El documento WO 00/09703 da a conocer
un retrovirus recombinante en el que la secuencia señal natural de
la glucoproteína gp120 de cubierta de VIH-1 se ha
reemplazado por la secuencia señal de melitina.
Con respecto a las vacunas de VIH, se ha
mostrado que la deleción del gen nef de VIH atenúa el virus.
Desrosiers y sus asociados han demostrado que la vacunación de
macacos Rhesus con VIS con deleción de nef protegía
de la exposición a VIS de tipo silvestre (Daniels, M. D. et
al. Science 258:1938 (1992); Desrosiers, R. C. et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6353 (1989)) y otros
han demostrado que el gen nef es indispensable para la
replicación de VIS y VIH (Daniels, M. D. et al.
Science 258: 1938 (1992); Gibbs, J. S., et al.
AIDS Res. and Human Retroviruses 10:343 (1994); Igarashi, T.
et al. J. Gen. Virol. 78:985 (1997); Kestler III, H.
W. et al. Cell 65:651 (1991)). Además, se ha
encontrado que la deleción del gen nef vuelve al virus no
patógeno en un hospedador normalmente susceptible (Daniels, M. D.
et al. Science 258:1938 (1992)). Sin embargo, no se
ha encontrado que esta deleción proporcione una forma del virus que
pueda producirse en grandes cantidades.
En consecuencia, es necesaria una vacuna que sea
avirulenta y que pueda producirse en grandes cantidades.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a un lentivirus recombinante que tiene un péptido señal de
glucoproteína gp120, en el que dicho péptido señal de glucoproteína
120 se selecciona del grupo constituido por las secuencias
polipeptídicas enumeradas en las SEC ID Nº 3-6.
El virus puede volverse avirulento mediante la
deleción de una cantidad suficiente del gen nef. El
lentivirus recombinante puede un virus de inmunodeficiencia humana
recombinante, tal como VIH-1.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a una vacuna que comprende un lentivirus recombinante del
primer aspecto. En ciertas realizaciones, la vacuna comprende
adicionalmente un coadyuvante. La invención caracteriza también una
vacuna del segundo aspecto para uso en la prevención o el
tratamiento de una infección lentivírica en un paciente necesitado
de ello.
Resultarán evidentes rasgos y ventajas
adicionales de la presente invención a partir de la siguiente
descripción detallada y reivindicaciones.
La Figura 1 contiene fotografías de exámenes
microscópicos con contraste de fase de células del insecto S.
frugiperda (SF21) infectadas con baculovirus de tipo silvestre y
recombinante. El panel A exhibe células infectadas con el
virus de la poliedrosis nuclear de Autographica californica
(AcNPV) de tipo silvestre, en el que se observan células intactas;
el panel B exhibe células infectadas con AcNPV recombinante
que expresa la glucoproteína 120 de cubierta de virus de
inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) con su secuencia
señal natural (vAc-gp120-NS), en el
que se observa lisis celular; el panel C exhibe células
infectadas con AcNPV recombinante que expresa gp120 de cubierta de
VIH-1 sin su secuencia señal natural
(vAc-gp120-\DeltaS), en el que se
observan células intactas; el panel D exhibe células
infectadas con AcNPV recombinante que expresa gp120 de cubierta de
VIH-1 en el que la secuencia señal natural está
reemplazada por una secuencia señal de melitina
(vAc-gp120-MS), en el que se
observan células intactas; el panel E exhibe células
infectadas con AcNPV recombinante que expresa glucoproteína G del
virus de la estomatitis vesicular
(vAc-VSV-G), en el que se observan
células intactas; el panel F exhibe células infectadas con
AcNPV recombinante que expresa glucoproteína G del virus de la
estomatitis vesicular (VSV-G) con la secuencia señal
natural de la glucoproteína gp120 de VIH-1 adjunta
(vAcVSV-G-NS), en el que se observa
lisis
celular.
celular.
La Figura 2 proporciona gráficas que ilustran
los efectos de la secuencia señal de glucoproteína 120 (gp120) de
cubierta de VIH-1 sobre la muerte celular. La Figura
2A exhibe el porcentaje de células permeabilizadas con azul de
tripano (células muertas) después de expresar una glucoproteína
recombinante (rgp120) o la proteína glucoproteína G del virus de la
estomatitis vesicular (VSV-G) con diferentes
secuencias señal. La Figura 2B exhibe los resultados de un ensayo
de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (kit de detección de
citotoxicidad de Boehringer Mannheim). Se midieron las cantidades
de LDH liberadas de células SF21 infectadas con virus recombinantes
que expresan rgp120 o VSV-G con secuencias señal
diferentes cuantificando el tinte de formazano formado en placas
ELISA leídas a
490 nm.
490 nm.
La Figura 3 exhibe resultados de electroforesis
en gel que proporcionan un análisis de la fragmentación del ADN de
células del insecto S. frugiperda (SF21) infectadas con un
virus de la poliedrosis nuclear de Autographica californica
(AcNPV) que expresa glucoproteína 120 de cubierta de
VIH-1 con diferentes secuencias señal. Se extrajo
el ADN celular total (A) o el ADN de bajo peso molecular (B) a las
48 horas después de la infección y se analizó mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1,2% en presencia de bromuro de
etidio; carriles M: marcador de ADN; carriles WT: células
infectadas con AcNPV; carriles \DeltaS: células infectadas con un
AcNPV recombinante que expresa una glucoproteína 120 de cubierta de
VIH-1 con su secuencia señal natural eliminada
(vAc-gp120-\DeltaS); carril NS:
células infectadas con un AcNPV recombinante que expresa una
glucoproteína 120 de VIH-1 con su secuencia señal
natural intacta (vAc-gp120-NS);
carriles MS: exhiben células infectadas con un AcNPV recombinante
que expresa una glucoproteína 120 de cubierta de
VIH-1 con su secuencia señal natural reemplazada
por una secuencia señal de melitina de abeja melífera
(vAc-gp120-MS).
La Figura 4 exhibe resultados de electroforesis
en gel de agarosa que proporcionan un análisis de la fragmentación
de ADN de células del insecto S. frugiperda (SF21) infectadas
con virus de la poliedrosis nuclear de Autographica
californica (AcNPV) recombinante que expresan la glucoproteína G
del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) con o
sin la secuencia señal natural de la glucoproteína 120 (gp120) de
cubierta de VIH-1. Se extrajo el ADN celular total
(A) o el ADN de bajo peso molecular (B) a las 48 horas después de la
infección y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al
1,2% en presencia de bromuro de etidio; carriles M: marcador de
ADN; carriles VSV-G: células infectadas con un AcNPV
recombinante que expresa una glucoproteína G del virus de la
estomatitis vesicular no modificada; carriles
VSV-G-NS: células infectadas con un
AcNPV recombinante que expresa una glucoproteína G del virus de la
estomatitis vesicular, modificada para contener la secuencia señal
natural de gp120 de cubierta de VIH-1
(vAcVSV-G-NS).
La Figura 5 exhibe la construcción de clones
províricos de VIH-1 modificados genéticamente.
Usando el provirus de clado B de VIH-1,
pNL4-3, como vector basal, se prepararon tres formas
modificadas genéticamente del virus. Estas incluyen
pNL4-3^{nef-}, que contiene una deleción orientada
del gen nef, pNL4-3^{SSR}, en el que se ha
reemplazado la secuencia señal de glucoproteína Env natural por la
secuencia señal de melitina de abeja melífera y
pNL4-3^{nef-/SSR}, que contiene una combinación de
ambas mutaciones de deleción de nef y de reemplazo de
secuencia señal. El plásmido pNL4-3^{WT}
representa el provirus original de tipo silvestre.
La Figura 6 exhibe una gráfica que muestra que
una supervivencia celular prolongada conduce a un rendimiento
vírico aumentado en células A3.01. Los virus de clado B de
VIH-1 modificados genéticamente incluyen
NL4-3^{nef-}, que contiene una deleción orientada
del gen nef, NL4-3^{SSR}, en el que se ha
reemplazado la secuencia señal de glucoproteína Env natural por la
secuencia señal de melitina de abeja melífera,
NL4-3^{nef-/SSR}, que contiene una combinación de
ambas mutaciones de deleción de nef y reemplazo de secuencia
señal y NL4-3^{WT}, que representa el provirus
original de tipo silvestre.
La Figura 7 exhibe la infectividad de mutantes
de NL4-3 de VIH-1 en células A3.01 y
H9 usando el ensayo MAG1. Los virus de clado B de
VIH-1 modificados genéticamente incluyen
NL4-3^{nef-}, que contiene una deleción orientada
del gen nef, NL4-3^{SSR}, en que se ha
reemplazado la secuencia señal de glucoproteína Env natural por la
secuencia señal de melitina de abeja melífera,
NL4-3^{nef-/SSR}, que contiene una combinación de
ambas mutaciones de deleción de nef y reemplazo de secuencia
señal y NL4-3^{WT}, que representa el provirus
original de tipo silvestre.
La Figura 8 exhibe la inducción del efecto
citopático (formación de sincitio) por
VIH-1_{NL4-3} en células
infectadas H9. Los virus de clado B de VIH-1
modificados genéticamente incluyen NL4-3^{nef-},
que contiene una deleción orientada del gen nef,
NL4-3^{SSR}, en que se ha remplazado la secuencia
señal de glucoproteína Env natural por la secuencia señal de
melitina de abeja melífera, NL4-3^{nef-/SSR}, que
contiene una combinación de ambas mutaciones de deleción de
nef y reemplazo de secuencia señal y
NL4-3^{WT}, que representa el provirus original
de tipo silvestre.
La Figura 9 exhibe la construcción de genes
quiméricos gag-NE que portarán el gen gag de VIH con
varias secuencias de codificación de V3 distintas con o sin
epítopos neutralizantes conservados de los clados de
VIH-1 mayoritarios. La Figura 9a consiste en el gen
gag de VIH-2 con dominios V3 de
VIH-1 de clados B, C y E, y la Figura 9b consiste
en el gen gag de VIH-2 con dominios V3 de
VIH-1 de clados A, D, F y G. En la Figura 9c, se
han seleccionado los epítopos de gp120 que representan una región
constante, C3, de los clados B, C y E, así como el epítopo
neutralizante conservado (CNE) de gp41 representado por 6
aminoácidos (Muster, et al., J. Virol. 67: 6642,
1993), para preparar anticuerpos neutralizantes que reaccionarán de
forma cruzada con la mayoría de aislamientos de
VIH-1.
La Figura 10 exhibe la construcción de un gen
quimérico gag-TCE con múltiples epítopos de
linfocitos T citotóxicos (TCE) de proteínas gp41, Nef, gp120,
transcriptasa inversa (RT), Tat y Rev del clado B de
VIH-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Por conveniencia, se proporciona a continuación
el significado de ciertos términos y frases empleados en la memoria
descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas. A menos que se
definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos
usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se
entiende habitualmente por un experto en la técnica a la que
pertenece esta invención.
Los artículos "un" y "una" se usan en
la presente memoria para designar a uno o más de uno (concretamente,
al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo.
El término "aminoácido" es conocido en la
técnica. En general, las abreviaturas usadas en la presente memoria
para designar los aminoácidos y los grupos protectores están basadas
en las recomendaciones de la Comisión sobre nomenclatura bioquímica
de la IUPAC-IUB (véase Biochemistry (1972)
11:1726-1732). En ciertas realizaciones, los
aminoácidos usados en las aplicaciones de esta invención son
aquellos aminoácidos de origen natural encontrados en proteínas, o
los productos anabólicos o catabólicos de origen natural de dichos
aminoácidos que contienen grupos amino y carboxilo. Las cadenas
laterales de aminoácidos particularmente adecuadas incluyen cadenas
laterales seleccionadas de los siguientes aminoácidos: glicina,
alanina, valina, cisteína, leucina, isoleucina, serina, treonina,
metionina, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina, asparagina,
lisina, arginina, prolina, histidina, fenilalanina, tirosina y
triptófano.
El término "aminoácido" incluye
adicionalmente análogos, derivados y congéneres de cualquier
aminoácido específico designado en la presente memoria, así como
derivados aminoácidos protegidos C-terminales o
N-terminales (por ejemplo, modificados con un grupo
protector N-terminal o C-terminal).
Por ejemplo, la presente invención contempla el uso de análogos de
aminoácidos en los que una cadena lateral se alarga o acorta
mientras que sigue proporcionando un carboxilo, amino u otro grupo
funcional precursor reactivo para ciclación, así como análogos de
aminoácidos que tienen cadenas laterales variantes con grupos
funcionales apropiados. Por ejemplo, el compuesto en cuestión puede
incluir un análogo de aminoácido tal como, por ejemplo,
cianoalanina, canavanina, ácido yencólico, norleucina,
3-fosfoserina, homoserina, dihidroxifenilalanina,
5-hidroxitriptófano,
1-metilhistidina, 3-metilhistidina,
ácido diaminopimélico, ornitina o ácido diaminobutírico. Se
reconocerán por los expertos en la técnica otros metabolitos o
precursores de aminoácido de origen natural que tienen cadenas
laterales que son adecuadas en la presente memoria, y están
incluidos en el alcance de la presente invención.
Se incluyen también los estereoisómeros (d) y
(l) de dichos aminoácidos cuando la estructura de los aminoácidos
admita formas estereoisoméricas. La configuración de los aminoácidos
y residuos de aminoácidos de la presente memoria se designa por los
símbolos apropiados (d), (l) o (dl), además, cuando no se designa la
configuración, el aminoácido o residuo puede tener la configuración
(d), (l) o (dl). Ha de entenderse en consecuencia que los isómeros
que surgen de dicha asimetría están incluidos dentro del alcance de
esta invención. Dichos isómeros pueden obtenerse en forma
sustancialmente pura mediante técnicas de separación clásicas y
mediante síntesis controlada estéricamente. Con los fines de esta
solicitud, a menos que se observe expresamente lo contrario, se
considerará que un aminoácido dado incluye ambos estereoisómeros (d)
o (l).
El término "anticuerpo" como se usa en la
presente memoria se pretende que incluya anticuerpos enteros, por
ejemplo, de cualquier isotipo (IgG, IgA, IgM, IgE, etc), incluyendo
anticuerpos policlonales, monoclonales, recombinantes y humanizados
y fragmentos de los mismos que reconocen específicamente y son
capaces de unirse a un epítopo de una proteína. Los anticuerpos
pueden fragmentarse usando técnicas convencionales y cribarse la
utilidad en los fragmentos de la misma manera. Por tanto, el término
incluye segmentos de porciones escindidas proteolíticamente o
preparadas recombinantemente de una molécula de anticuerpo que son
capaces de reaccionar selectivamente con una cierta proteína. Los
ejemplos no limitantes de dichos fragmentos proteolíticos y/o
recombinantes incluyen Fab, F(ab')_{2}, Fab', Fv y
anticuerpos monocatenarios (scFv) que contienen un dominio
V[L] y/o V[H] unido por un ligador peptídico. Los scFv
pueden estar ligados covalente o no covalentemente formando
anticuerpos que tienen dos o más sitios de unión.
El término "sustituciones conservativas"
designa cambios entre aminoácidos de propiedades moleculares
ampliamente similares. Por ejemplo, los intercambios en el grupo
alifático de alanina, valina, leucina e isoleucina pueden
considerarse como conservativos. A veces, la sustitución de glicina
por uno de estos puede considerarse también conservativa. Otros
intercambios conservativos incluyen aquellos en el grupo alifático
de aspartato y glutamato, en el grupo de amida de asparagina y
glutamina, en el grupo de hidroxilo de serina y treonina, en el
grupo aromático de fenilalanina, tirosina y triptófano, en el grupo
básico de lisina, arginina e histidina, y en el grupo que contiene
azufre de metionina y cisteína. A veces, la sustitución en el grupo
de metionina y leucina puede considerarse también conservativa. Los
grupos de sustitución conservativa preferidos son
aspartato-glutamato;
asparagina-glutamina;
valina-leucina-isoleucina;
alanina-valina;
valina-leucina-isoleucina-metionina;
fenilalanina-tirosina;
fenilalanina-tirosina-triptófano;
lisina-arginina e
histidina-lisina-arginina.
El término "esencialmente no citolítico"
como se usa en la presente memoria significa que el retrovirus no
daña significativamente ni mata las células que infecta.
"Equivalente" cuando se usa para describir
ácidos nucleicos o secuencias nucleotídicas designa secuencia
nucleotídicas que codifican polipéptidos funcionalmente
equivalentes. Las secuencias nucleotídicas equivalentes incluirán
secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o
deleciones nucleotídicas, tales como una variante alélica; y por lo
tanto, incluirán secuencias que difieren debido a la degeneración
del código genético. Por ejemplo, las variantes de ácido nucleico
pueden incluir aquellas producidas por sustituciones, deleciones o
adiciones nucleotídicas. Las sustituciones, deleciones o adiciones
pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar
alteradas en regiones codificantes, regiones no codificantes o
ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden
producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos
conservativas o no conservativas.
Los péptidos variantes pueden prepararse
covalentemente mediante síntesis química directa usando
procedimientos bien conocidos en la técnica. Las variantes pueden
incluir adicionalmente, por ejemplo, deleciones, inserciones o
sustituciones de residuos en la secuencia de aminoácido. Puede
prepararse también cualquier combinación de deleción, inserción y
sustitución para llegar al constructo final, a condición de que el
constructo final posea la actividad deseada. Estas variantes pueden
prepararse mediante mutagénesis dirigida a sitio (como se
ejemplifica por Adelman et al., DNA 2: 183 (1983)) de
los nucleótidos en el ADN que codifica la molécula peptídica,
produciendo así ADN que codifica la variante, y después de ello,
expresando el ADN en cultivo de células recombinantes. Las
variantes exhiben típicamente la misma actividad biológica
cualitativa que los polipéptidos de tipo silvestre. Es conocido en
la técnica que pueden sintetizarse también todas las sustituciones
de aminoácidos individuales posibles de un polipéptido conocido
(Geysen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA)
18:3998-4002 (1984)). Aunque los efectos de
sustituciones diferentes no son siempre aditivos, es razonable
esperar que dos sustituciones individuales favorables o neutras en
diferentes posiciones de residuo de un polipéptido puedan
combinarse con seguridad sin perder actividad proteica. Son
procedimientos para la preparación de polipéptidos degenerados los
descritos en Rutter, patente de EE.UU. nº 5.010.175; Haughter et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82:
5131-5135 (1985); Geysen et al., Proc.
Nat. Acad. Sci. (USA) 18:3998-4002 (1984);
WO86/06487 y WO86/00991.
Al idear una estrategia de sustitución, un
experto en la técnica determinaría cuáles residuos variar y cuáles
aminoácidos o clases de aminoácidos son reemplazos adecuados.
También pueden tenerse en cuenta estudios de variaciones de
secuencia en familias de proteínas homólogas de origen natural.
Ciertas sustituciones de aminoácidos son toleradas más a menudo que
otras, y estas a menudo están correlacionadas con similitudes de
tamaño, carga, etc. entre el aminoácido original y su reemplazo.
Pueden hacerse también inserciones o deleciones de aminoácidos,
como se describe anteriormente. Las sustituciones son
preferiblemente conservativas, véanse, por ejemplo, Schulz et
al., "Principle of Protein Structure"
(Springer-Verlag, Nueva York (1978)) y Creighton,
"Proteins: Structure and Molecular Properties" (W.H. Freeman
& Co., San Francisco (1983)); ambas incorporadas a la presente
como referencia en su
totalidad.
totalidad.
Un fragmento "funcional" de un ácido
nucleico como se usa en la presente memoria es un fragmento de ácido
nucleico capaz de codificar una secuencia señal de un gen ligado al
fragmento. Por tanto, un "fragmento funcional" de un ácido
nucleico se pretende que incluya ácidos nucleicos capaces de
codificar una secuencia señal en condiciones apropiadas.
El término "VIH" es conocido por el experto
en la técnica y designa el virus de la inmunodeficiencia humana.
Hay dos tipos de VIH: VIH-1 y VIH-2.
Hay muchas cepas diferentes de VIH-1. Las cepas de
VIH-1 pueden clasificarse en tres grupos: el grupo
"principal" M, el grupo "marginal" O y el grupo
"nuevo" N. Estos tres grupos pueden representar tres
introducciones separadas del virus de inmunodeficiencia de simios en
seres humanos. En el grupo M, hay al menos diez subtipos o clados:
por ejemplo, clados A, B, C, D, E, F, G, H, I, J y K. Un
"clado" es un grupo de organismos, tal como una especie, cuyos
miembros comparten rasgos homólogos derivados de un antecesor
común. Cualquier referencia a VIH-1 en esta
solicitud incluye todas estas cepas.
Los términos "polinucleótido" y "ácido
nucleico" se usan intercambiablemente para designar una forma
polimérica de nucleótidos de cualquier longitud,
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos:
regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento
génico, loci (locus) definidos a partir de análisis de ligamiento,
exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN transferente (ARNt),
ARN ribosómico (ARNt), ribozimas, ADNc, polinucleótidos
recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores,
ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier
secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido
puede comprender nucleótidos modificados tales como nucleótidos
metilados y análogos nucleotídicos. Si están presentes, las
modificaciones en la estructura nucleotídica pueden conferirse
antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de
nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleotídicos.
Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la
polimerización, tal como mediante conjugación con un componente
marcador. El término polinucleótido "recombinante" significa
un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o
sintético que no aparece en la naturaleza o está ligado a otro
polinucleótido en una disposición no natural. Un
"oligonucleótido" designa un polinucleótido monocatenario que
tiene menos de aproximadamente 100 nucleótidos, menos de
aproximadamente, por ejemplo, 75, 50, 25, o 10 nucleótidos.
Los términos "polipéptido", "péptido"
y "proteína" (si es monocatenaria) se usan intercambiablemente
en la presente memoria para designar polímeros de aminoácidos. El
polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender
aminoácidos modificados y puede interrumpirse por no aminoácidos.
Los términos comprenden también un polímero de aminoácido que se ha
modificado, por ejemplo, por formación de enlace disulfuro,
glucosilación, lapidación, acetilación, fosforilación o cualquier
otra manipulación, tal como conjugación con un componente
marcador.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de la
invención pueden sintetizarse químicamente, por ribosomas en un
sistema exento de células o por ribosomas en una célula. La síntesis
química de polipéptidos de la invención puede llevarse a cabo
usando una variedad de procedimientos reconocidos en la técnica,
incluyen la síntesis en fase sólida por etapas, la semisíntesis
mediante religación auxiliada conformacionalmente de fragmentos
peptídicos, ligación enzimática de segmentos peptídicos clonados o
sintéticos y ligación química. La ligación química nativa emplea
una reacción quimioselectiva de dos segmentos peptídicos no
protegidos para producir un intermedio ligado por tioéster
transitorio. El intermedio ligado por tioéster transitorio
experimenta espontáneamente entonces una transposición,
proporcionando el producto de ligación completo que tiene un enlace
peptídico nativo en el sitio de ligación. Los productos de ligación
completos son químicamente idénticos a las proteínas producidas
mediante síntesis exenta de células. Los productos de ligación
completos pueden replegarse y/u oxidarse, según se permita,
formando moléculas de proteína que contienen disulfuro nativas
(véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6.184.344 y
6.174.530 y T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech.
(1993): vol. 4, p. 420; M. Miller, et al., Science
(1989): vol. 246, p. 1149; A. Wlodawer, et al.,
Science (1989): vol. 245, p. 616; L. H. Huang, et
al., Biochemistry (1991): vol. 30, p. 7402; M. Schnolzer,
et al., Int. J. Pept. Prot. Res. (1992): vol. 40, p.
180-193; K. Rajarathnam, et al.,
Science (1994): vol. 264, p. 90; R. E. Offord, "Chemical
Approaches to Protein Engineering", en "Protein Design and the
Development of New therapeutics and Vaccines", J. B. Hook, G.
Poste, Eds., (Plenum Press, Nueva York, 1990) p.
253-282; C. J. A. Wallace, et al., J.
Biol. Chem. (1992): vol. 267, p 3852; L. Abrahmsen, et
al., Biochemistry (1991): vol. 30, p. 4151; T. K. Chang,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:
12544-12548; M. Schnlzer, et al.,
Science (1992): vol., 3256, p. 221 y K. Akaji, et al.,
Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33: 184).
Como es conocido por un experto en la técnica
"retrovirus" son virus de ARN de cadena positiva diploides que
se replican mediante un intermedio de ADN integrado (ADN provírico).
En particular, tras la infección por el virus de ARN, se transcribe
de forma inversa el genoma lentivírico en el ADN mediante una
transcriptasa inversa codificada en el virus que se porta como
proteína en cada retrovirus. Se integra entonces seudoaleatoriamente
el ADN vírico en el genoma de la célula hospedadora, formando un
"provirus" que se hereda por las células descendientes. El
genoma retrovírico contiene al menos tres genes: gag codifica
las proteínas del núcleo y estructurales del virus; pol
codifica transcriptasa inversa, proteasa e integrasa y env
codifica las proteínas de superficie del virus. En la familia
retrovírica, el VIH se clasifica como un lentivirus, al tener
similitudes genéticas y morfológicas con lentivirus animales tales
como los que infectan a gatos (virus de la inmunodeficiencia
felina), ovejas (virus visna), cabras (virus de la
artritis-encefalitis caprina) y primates no humanos
(virus de la inmunodeficiencia de simios).
Como se usa en la presente memoria, "deleción
suficiente" significa la deleción de suficiente secuencia de
ácido nucleico para evitar la transcripción y así la producción del
correspondiente producto proteico.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está basada al menos en
parte en el sorprendente descubrimiento de que el reemplazo de la
secuencia señal natural (NSS) de la glucoproteína gp120 de cubierta
de VIH-1 por una secuencia señal que no contiene
más de un aminoácido cargado positivamente da como resultado un
VIH-1 modificado que es no citolítico y como tal es
capaz de síntesis, glucosilación y secreción de alta eficacia de
gp120. En particular, se observó que la alteración de los residuos
de aminoácidos cargados positivamente en la secuencia señal de
gp120 no solo aumentaba el nivel de expresión, sino también el nivel
de secreción. El nivel de secreción aumentaba a medida que se
reducía la cantidad de carga positiva. En contraposición, la
retirada de los cinco residuos de aminoácidos cargados
positivamente en la secuencia señal de gp120 de clado B de
VIH-1 dio como resultado la acumulación en las
células de grandes cantidades de la forma no glucosilada de gp120.
Este resultado indicaba que es necesario un número mínimo de
residuos de aminoácidos cargados positivamente para una
translocación eficaz de la proteína a través de la membrana del
RE.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la presente invención
proporciona un VIH-1 recombinante esencialmente no
citolítico capaz de replicación de alta eficacia en el que la NSS
de la glucoproteína de cubierta del virus se reemplaza por una
secuencia señal de aproximadamente 20 a aproximadamente 40
aminoácidos de longitud en la que dicha secuencia señal no contiene
más de un (1) aminoácido cargado positivamente.
La secuencia señal de gp120 modificada de la
invención puede prepararse sustituyendo aminoácidos neutros por
aminoácidos cargados positivamente en la secuencia señal natural
(M R V K E KK TQHLW R WGW R WGTMLLGML
MIGSA; SEC ID Nº 1); dichas modificaciones pueden representarse como: MX_{1}VX_{2}EX_{3}KTQHLWX_{4}WGWX_{5}WGT
MLLGMLMICAS (SEC ID Nº 2) en la que X_{1}, X_{2}, X_{3}, X_{4} y X_{5} son aminoácidos neutros. Los residuos cargados positivamente se muestran en negrita y subrayados.
MIGSA; SEC ID Nº 1); dichas modificaciones pueden representarse como: MX_{1}VX_{2}EX_{3}KTQHLWX_{4}WGWX_{5}WGT
MLLGMLMICAS (SEC ID Nº 2) en la que X_{1}, X_{2}, X_{3}, X_{4} y X_{5} son aminoácidos neutros. Los residuos cargados positivamente se muestran en negrita y subrayados.
Las secuencias señal modificadas según la
invención incluyen:
| M R VAEI K TQHLW R WGW R WGTMLLGMLMICSA | (YL-1; SEC ID Nº 3), |
| MIV K E KK TQHLWIWGWIWGTMLLGMLMIGSA | (YL-2; SEC ID Nº 4), |
| M R VVEI K TQHLWIWGWIWGTMLLGMLMIGSA | (YL-3; SEC ID Nº 5), |
| MIVAEI K TQHLWIWGWIWGTMLLGMLMIGSA | (YL-4; SEQ ID NO: 6). |
Las siguientes secuencias señal no entran dentro
del alcance de la invención:
M K FLVNVALVFMVVYISYIYADPINM
(péptido señal de melitina modificado, la secuencia subrayada es el
resultado de la inserción de un ligador e indica cinco aminoácidos
entre la secuencia señal y la proteína gp120 madura; SEC ID Nº
7),
MLLLLLMLFHLGLQASISGRDPINM (péptido señal
de interleucina 3 modificado, la secuencia subrayada es el resultado
de la inserción de un ligador e indica siete aminoácidos entre la
secuencia señal y la proteína gp120 madura; SEC ID Nº 8).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención caracteriza adicionalmente
vacunas que comprenden una cantidad eficaz de un lentivirus
recombinante de la invención como se describe anteriormente.
Las composiciones de vacuna de la invención son
adecuadas para administración a sujetos en forma biológicamente
compatible in vivo. La expresión "forma biológicamente
compatible in vivo" como se usa en la presente memoria
significa una forma de administrar la sustancia en la que los
efectos tóxicos estén compensados por los efectos terapéuticos. Las
sustancias pueden administrarse a cualquier animal, preferiblemente
seres humanos.
Las vacunas de la presente invención pueden
contener adicionalmente diluyentes, adyuvantes y/o vehículos
adecuados. Preferiblemente, las vacunas contienen un coadyuvante
que puede potenciar la inmunogenicidad de la vacuna in vivo.
El coadyuvante puede seleccionarse de muchos adyuvantes conocidos en
la técnica incluyendo la porción de lípido A de endotoxina de
bacterias gramnegativas, dimicolato de trehalosa de micobacterias,
el fosfolípido lisolecitina, bromuro de dimetildictadecilamonio
(DDA), ciertos polímeros en bloque de
polioxipropileno-polioxietileno
(POP-POE), hidróxido de aluminio, liposomas y
polímeros de CpG
(citosina-fosfato-guanidina). Las
vacunas pueden incluir también citocinas que son conocidas por
potenciar la respuesta inmunitaria, incluyendo
GM-CSF, IL-2, IL-12,
TNF e IFN-\gamma.
La dosis de vacuna puede variar según factores
tales como el estado patológico, la edad, sexo y peso del individuo
y la capacidad del anticuerpo de desencadenar una respuesta
inmunitaria en el individuo. La pauta de dosificación puede
ajustarse para proporcionar una respuesta terapéutica óptima. Por
ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas diariamente o
la dosis puede reducirse proporcionalmente como se indique por las
exigencias de la situación terapéutica. La dosis de vacuna puede
variarse también para proporcionar una respuesta a la dosis
preventiva óptima dependiendo de las circunstancias.
Las vacunas de la presente invención pueden
formularse e introducirse como vacuna por vía oral, intradérmica,
intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal
e intravaginal, o cualquier otra vía estándar de inmunización.
En formulaciones de las vacunas en cuestión,
pueden estar presentes en los agentes formulados agentes
humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato
de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes,
agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes
edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y
antioxidantes.
Las composiciones en cuestión pueden ser
adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal
y sublingual), rectal, vaginal, por aerosol y/o parenteral. Las
formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de
dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier
procedimiento bien conocido en la técnica de la farmacia. La
cantidad de composición que puede combinarse con un material
portador para producir una dosis individual puede variar
dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo de
administración particular.
Los procedimientos de preparación de estas
formulaciones incluyen la etapa de poner en asociación composiciones
de la presente invención con el vehículo y, opcionalmente, uno o
más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se
preparan poniendo en asociación uniforme e íntima los agentes con
vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos,
y entonces, si es necesario, conformando el producto.
Las formulaciones adecuadas para administración
oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras,
comprimidos, pastillas masticables (usando una base aromatizada,
habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos,
gránulos o como solución o suspensión en un líquido acuoso o no
acuoso, o como emulsión de aceite en agua o agua en aceite, o como
elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte tal como
gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga), que contienen
cada uno una cantidad predeterminada de una composición en cuestión
de la misma como ingrediente activo. Las composiciones de la
presente invención pueden administrarse también como bolo,
electuario o pasta.
En las formas farmacéuticas sólidas para
administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas,
polvos, gránulos y similares), se mezcla la composición en cuestión
con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como
citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los
siguientes: (1) cargas o extensores tales como almidones, lactosa,
sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes
tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina,
polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; (3) humectantes
tales como glicerol; (4) agentes disgregantes tales como agar,
carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico,
ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de
la solución tales como parafina; (6) acelerantes de la absorción
tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes
humectantes tales como, por ejemplo, alcohol acetílico y
monoestearato de glicerol; (8) absorbentes tales como caolín y
arcilla de bentonita; (9) lubricantes tales como talco, estearato de
calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos,
laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos y (10) agentes
colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las
composiciones pueden comprender también agentes de tamponación.
Pueden emplearse composiciones sólidas de tipo similar como cargas
en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes
tales como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles
de alto peso molecular y similares.
Puede prepararse un comprimido mediante
compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes
accesorios. Los comprimidos por compresión pueden prepararse usando
aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa),
lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo,
glicolato sóido de almidón o carboximetilcelulosa de sodio
reticulada), agentes tensioactivos o dispersantes. Los comprimidos
por moldeo pueden prepararse moldeando en una máquina adecuada una
mezcla de la composición en cuestión humedecida con un diluyente
líquido inerte. Los comprimidos y otras formas farmacéuticas
sólidas tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden
ranurarse opcionalmente o prepararse con recubrimientos y cubiertas,
tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien
conocidos en la técnica de formulación farmacéutica.
Las formas farmacéuticas líquidas para
administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones,
disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente
aceptables. Además de la composición en cuestión, las formas
farmacéuticas líquida pueden contener diluyentes inertes usados
comúnmente en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros
disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como
alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato
de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol,
1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites
de semilla de algodón, cacahuete, germen de maíz, oliva, ricino y
sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y
ésteres de ácido graso de sorbitán, y mezclas de los mismos.
Las suspensiones, además de la composición en
cuestión, pueden contener agentes de suspensión tales como, por
ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol
y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de
aluminio, bentonita, agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las formulaciones para administración rectal o
vaginal pueden presentarse como supositorios, que pueden prepararse
mezclando una composición en cuestión con uno o más excipientes o
vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo,
manteca de cacao, polietilenglicol, una cera de supositorio o un
salicilato, y que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos
a temperatura corporal y, por lo tanto, se fundirán en la cavidad
corporal liberando el agente activo. Las formulaciones que son
adecuadas para administración vaginal incluyen también pesarios,
tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de
pulverización que contienen vehículos tales que son conocidos en la
técnica por ser apropiados.
Las formas farmacéuticas para administración
transdérmica de una composición en cuestión incluyen polvos,
pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles,
disoluciones, parches e inhalantes. El componente activo puede
mezclarse en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente
aceptable, y con cualquier conservante, tampón o propelente que
pueda ser necesario.
Los pomadas, pastas, cremas y geles pueden
contener, además de la composición en cuestión, excipientes tales
como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas,
almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles,
siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o
mezclas de los mismos.
Los polvos y pulverizaciones pueden contener,
además de la composición en cuestión, excipientes tales como
lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de
calcio y poliamida en polvo, o mezclas de estas sustancias. Las
pulverizaciones pueden contener adicionalmente propulsores
corrientes tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos no
sustituidos volátiles tales como butano y propano.
Las composiciones de la presente invención
pueden administrarse como alternativa por aerosol. Esto se consigue
preparando un aerosol acuoso, preparación liposómica o partículas
sólidas que contienen el compuesto. Podría usarse una suspensión no
acuosa (por ejemplo, propelente de fluorocarbono). Pueden usarse
nebulizadores sónicos porque minimizan la exposición del agente al
cizallamiento, que puede dar como resultado la degradación de los
compuestos contenidos en las composiciones en cuestión.
Normalmente, se prepara un aerosol acuoso
formulando una solución o suspensión acuosa de una composición en
cuestión con vehículos y estabilizantes farmacéuticamente
convencionales. Los vehículos y estabilizantes varían con los
requisitos de la composición en cuestión particular, pero incluyen
típicamente tensioactivos no iónicos (Tween, Pluronics o
polietilenglicol), proteínas inocuas como seroalbúmina, ésteres de
sorbitán, ácido oleico, lecitina, aminoácidos tales como glicina,
tampones, sales, azúcares o alcoholes de azúcar. Los aerosoles se
preparan generalmente a partir de disoluciones isotónicas.
Además, las vacunas pueden administrarse por vía
parenteral como inyecciones (intravenosa, intramuscular o
subcutánea). Las composiciones de vacuna de la presente invención
pueden contener opcionalmente uno o más adyuvantes. Puede usarse
cualquier coadyuvante adecuado, tal como polímeros de CpG, hidróxido
de aluminio, fosfato de aluminio, aceites vegetales y animales y
similares, dependiendo la cantidad de coadyuvante de la naturaleza
del coadyuvante particular empleado. Además, las composiciones de
vacuna antiinfecciosa pueden contener también al menos un
estabilizante, tal como carbohidratos tales como sorbitol, manitol,
almidón, sacarosa, dextrina y glucosa, así como proteínas tales
como albúmina o caseína, y tampones tales como fosfatos de metal
alcalino y similares.
Las composiciones farmacéuticas de esta
invención adecuadas para administración parenteral comprenden una
composición en cuestión en combinación con una o más disoluciones,
dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas
isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos
estériles que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones
inyectables justo antes del uso, que pueden contener antioxidantes,
tampones, bacteriostatos, solutos que vuelven la formulación
isotónica con la sangre del receptor pretendido, o agentes de
suspensión o espesantes.
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos
adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas
de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como
glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas
adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de
oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.
La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso
de materiales de recubrimiento tales como lecitina, mediante el
mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de
dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Adicionalmente, los lentivirus recombinantes no
citolíticos de la presente invención pueden encapsularse en
liposomas y administrarse mediante infección. Los sistemas de
suministro de liposomas comercialmente disponibles están
disponibles en Novavax, Inc. de Rockville, Md., disponibles
comercialmente con el nombre Novasomes^{TM}. Estos liposomas se
formulan específicamente para suministro de inmunógeno o anticuerpo.
En una realización de la invención, pueden usarse Novasomes^{TM}
que contienen péptidos o moléculas de anticuerpo unidas a la
superficie de estos liposomas cargados positivamente no
fosfolipídicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede prevenirse o tratarse una infección
lentivírica en un sujeto administrando al sujeto una cantidad eficaz
de una vacuna de la presente invención.
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Los lentivirus recombinantes de la presente
invención pueden prepararse usando técnicas conocidas en la técnica.
En una realización, el lentivirus puede introducirse en una célula
hospedadora en condiciones adecuadas para la replicación y
expresión del lentivirus en el hospedador. En consecuencia, la
presente invención proporciona también una célula transfectada con
un lentivirus recombinante de la invención.
La célula es preferiblemente un linfocito T, más
preferiblemente un linfocito T que no deriva de una línea celular
transformada.
El término "cantidad eficaz" como se usa en
la presente memoria significa una cantidad eficaz y a dosificaciones
y durante los periodos de tiempo necesarios para conseguir el
resultado deseado. El término "animal" como se usa en la
presente memoria incluye todos los miembros del reino animal,
incluyendo mamíferos, preferiblemente seres humanos.
Un procedimiento para matar o destruir células
diana, preferiblemente células cancerosas, puede comprender
administrar a la célula o células una cantidad eficaz de un virus
recombinante, preferiblemente virus de la estomatitis vesicular
(VSV) o cualquier otro virus de ARN portador específico de las
células diana, preferiblemente NSS de
VIH-1.
VIH-1.
Preferiblemente, las células están en un animal
necesitado de ello, lo más preferiblemente en seres humanos. Las
células que están infectadas o son cancerosas expresan marcadores
celulares específicos para los que puede incorporarse un sitio de
reconocimiento complementario en un vector adecuado en el que se ha
incorporado NSS de VIH-1. Se ha tomado este enfoque
con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), que se ha modificado
por ingeniería genética para incorporar los genes de CD4 y CXCR4,
orientando así al VSV modificado a infectar células infectadas con
VIH-1 (Schnell, M. J. et al. Cell
90:849-857 (1997)). En consecuencia, la presente
invención proporciona un procedimiento para matar células diana,
tales como células cancerosas, que comprende administrar un virus
recombinante que contiene NSS y un sitio de reconocimiento
específico de las células diana a un animal necesitado de ello. La
NSS de VIH-1 puede incorporarse a un vector de tipo
VSV modificado que se ha orientado a un tipo de célula cancerosa
específica basándose en un antígeno de superficie de célula
cancerosa particular, proporcionando así al VSV la capacidad de
inducir la apoptosis en las células cancerosas diana.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos no limitantes son
ilustrativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1a
Se ha descrito anteriormente la construcción de
baculovirus recombinantes que expresan la glucoproteína 120 del
virus de la inmunodeficiencia humana 1 con su secuencia señal
natural (gp120-NSS), con su secuencia señal natural
reemplazada por una secuencia señal de melitina de abeja melífera
(gp120-MSS), y con su secuencia señal natural
retirada (gp120-\DeltaS) por Li et al.
(Virology 204:266-278 (1994)). Se ha descrito
anteriormente la construcción de baculovirus recombinantes que
expresan la glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular
(VSV_{Ind}G) por Bailey et al. (Virology
169:323-331 (1989)).
Se describe a continuación la construcción de
baculovirus recombinantes que expresan proteína G de VSV_{Ind}
con la secuencia señal de la glucoproteína gp120 de cubierta de
VIH-1
(VSV-G-NSS).
Para reemplazar la secuencia señal de la
proteína VSV-G, los presentes inventores
construyeron en primer lugar
VSV-G-\DeltaS (glucoproteína G del
virus de la estomatitis vesicular sin su secuencia señal) mediante
PCR con dos cebadores:
El cebador nº 2 es complementario del gen de
VSV-G C-terminal.
Se usó como molde el plásmido pwKI (que contiene
el gen G completo de VSV_{Ind}, y proporcionado amablemente por
el Dr. Robert R. Wagner, University of Virginia, EE.UU.), y se
amplificó con el kit Geneamp mediante 30 ciclos de PCR en un
termociclador de Perkin Elmer Cetus (los ciclos fueron 94ºC 1 min,
45ºC 2 min, 72ºC 3 min) a partir de 20 ng de pwKI como molde y 1,0
\muM de cada cebador.
Todos los cebadores tenían sitios BamHI en su
extremo 5', de modo que el fragmento de ADN de
VSV-G-\DeltaS amplificado podía
insertarse en el sitio BamHI del plásmido pBluescript SK VECTOR
(Stratagene), el clon en que se seleccionó el extremo 5' de
VSV-G-\DeltaS hacia el promotor T7
y se digirió con las enzimas de restricción SphI+
XhoI.
XhoI.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1b
Para cambiar los aminoácidos cargados
positivamente localizados en la secuencia señal de gp120 de cubierta
de VIH-1 a aminoácidos apolares, se efectuó una
mutagénesis dirigida a oligonucleótido mediante PCR en un
termociclador de Perkin-Elmer Cetus. Los cuatro
cebadores oligonucleotídicos mutantes que se diseñaron para generar
una serie de mutaciones (YL-1, YL-2,
YL-3 e YL-4) en la región de
codificación de la secuencia señal de gp120 de cubierta de
VIH-1 son:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los nucleótidos subrayados son los
alterados.
Además, se usó un cebador universal
(YL-5; 5'-AGC TTG GAT CCT TAT CTT
TTT TCT CTC TGC TGC ACC-3' (SEC ID Nº 15))
complementario del extremo C del gen de gp120, para obtener los
clones de gp120 mutantes completos. Se amplificó la secuencia de
codificación de gp120 con el kit Geneamp mediante 30 ciclos de PCR
(los ciclos fueron 94ºC 1 min, 45ºC 2 min, 72ºC 3 min) a partir de
20 ng de pUC19-gp120-NSS linealizado
con HindIII como molde y 1,0 \muM de cada cebador mutante y el
cebador universal. Todos los cebadores tenían sitios BamHI en su
extremo 5', de modo que el fragmento de ADN de gp120 amplificado
podía insertarse en el sitio BamHI de pAcYM1. Todos los mutantes
construidos tienen las mutaciones esperadas verificadas mediante
secuenciación de terminación de cadena didesoxi.
\newpage
Ejemplo
1c
Se amplificó la secuencia señal del gen
env de VIH-1 a partir de
pBluescript-gp120-NSS mediante PCR
con los dos cebadores siguientes:
Se digirió el fragmento de ADN amplificado que
contenía la secuencia señal de VIH-1 con las enzimas
de restricción XhoI más SphI y se insertó en un vector pBluescript
VSV-G-\DeltaS digerido con XhoI y
SphI. El plásmido resultante se designa como pBSK
VSV-G-NSS, y el constructo se
confirmó adicionalmente mediante secuenciación de ADN.
Se insertó el fragmento BamHI de
VSV-G-NSS en el sitio BamHI de un
pAcYM1 de baculovirus (Li, Y. et al. Virology
204:266-278 (1994)), y se generó un baculovirus
recombinante que expresa VSV-G-NSS
mediante un procedimiento de transfección estándar (Li, Y. et
al. Virology 204:266-278 (1994)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se infectaron células SF21 con AcNPV
recombinante a una MOI de 5 UFP/célula y se incubaron a 27ºC durante
48 horas. Se examinaron las células infectadas mediante microscopio
de contraste de fases. Se muestran los resultados en la Figura 1.
Estos resultados demuestran que la secuencia señal de env de
VIH-1 mata rápidamente las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
I. Ensayo de azul de tripano: Se
infectaron células SF21 con AcNPV recombinante a una MOI de 5
UFP/célula durante 1 h, se retiró el inóculo y se incubó con el
medio completo TNM-FH que contiene 10% de suero
fetal bovino (FBS). A las 24, 48 y 72 horas después de la
infección, se tiñeron las células con azul de tripano (GIBCO, BRL)
durante 5 min, se contaron las células por el microscopio y se
determinó el porcentaje de células muertas usando la siguiente
fórmula:
II. Ensayo de liberación de lactato
deshidrogenasa (LDRA): Se efectuó el LDRA según las
instrucciones del fabricante (kit de detección de citotoxicidad de
Boehringer Mannheim). Se infectaron células SF21 con AcNPV
recombinante a una MOI de 5 UFP/célula durante 1 hora, se retiró el
inóculo y se incubó con medio completo a 27ºC, se recogió medio de
cultivo a intervalos regulares de 12 h y se centrifugó a 12.000 rpm
durante 1 min. Se diluyó el sobrenadante de cultivo 10 veces y se
incubaron 100 \mul del sobrenadante con 100 \mul de mezcla de
reacción (kit de detección de citototoxicidad) durante 30 min a
temperatura ambiente. Se midió la absorbancia de las muestras a 490
nm cuantificando el tinte de formazeno usando un lector de
microplacas (ELISA) (Bio-Rad 550). Los resultados
de los ensayos de azul de tripano y de liberación de lactato
deshidrogenasa se ilustran en las Figuras 2A y 2B,
respectiva-
mente.
mente.
En conclusión, rgp120 y VSV-G
con la secuencia señal de env de VIH-1
natural matan células mucho más rápido. Las células sobreviven
mucho más tiempo sin la secuencia señal de env de
VIH-1 natural o con la secuencia señal de melitina.
La secuencia señal de env de VIH-1 natural es
responsable de la rápida muerte celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
I. Procedimiento de extracción de ADN
total: Se infectaron células SF21 (3 x 10^{6}) con AcNPV
recombinante a una MOI de 5 UFP/célula durante 1 h. Se retiró el
inóculo y se incubó con medio completo a 27ºC durante 48 h. Se
sedimentaron las células a 2500 rpm durante 10 min y se extrajeron
con TSE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, 1% de SDS, al que se añadió
proteinasa K a una concentración final de 70 \mug/ml). Se
incubaron entonces las muestras durante 2 h a 37ºC y al final de la
incubación se añadió NaCl a una concentración final 1 M, y se
incubaron entonces las muestras a 4ºC durante una noche. Se extrajo
el ADN con fenol:cloroformo (1:1) y con cloroformo. Finalmente, se
añadió etanol (al 100%) para precipitar el ADN (15 min a 80ºC) y se
sedimentó el precipitado de ADN mediante microcentrifugación a
12.000 rpm durante 15 min. Se lavó el sedimento de ADN una vez con
etanol al 70%, se resuspendió en TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM)
con ARNasa A (50 \mug/ml), se sometió a electroforesis en gel de
agarosa al 1,2% y se tiñó con bromuro de etidio (N. Chejanovsky y E.
Gershburg, Virology 209:519-525 (1995)). Los
resultados se ilustran en la Figura 3. Los resultados anteriores
demuestran que la secuencia señal de env de
VIH-1 natural induce la apoptosis.
II. Extracción de ADN fragmentado: Se
infectaron células SF21 con
vAc-VSV-G (VSV-G) o
vAc-VSV-G-NSS
(VSV-G-NSS) a una MOI de 5
UFP/célula y se incubaron a 27ºC durante 48 horas. A las 48 horas
después de la infección, se sedimentaron estas células (3 x
10^{6}) a 2.500 rpm durante 5 min y se lisaron en una solución que
contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM y 0,5%
de Triton X-100, y se centrifugaron a 12.000 rpm
durante 25 min en una microcentrífuga Eppendorf para sedimentar el
ADN cromosómico. Se digirió el sobrenadante con 0,1 mg de ARNasa A
por ml a 37ºC durante 1 h, y entonces durante 2 h con 1 mg de
proteinasa K por ml a 50ºC en presencia de 1% de SDS, se extrajo
con fenol y cloforomo y se precipitó con etanol frío. Se resuspendió
el precipitado en TE y se sometió a electroforesis en gel de
agarosa al 11,5% que contenía 5 \mug de bromuro de etidio por ml.
Se visualizó el ADN mediante transiluminación UV (Rosario Leopardi y
Bernard Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:9583-9587 (1996)). Los resultados se muestran en
la Figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
I. Construcción del plásmido
pNL4-3 que contiene la sustitución de NSS (por
secuencia señal de MSS, IL-3 o cualquier otra) y la
deleción de vpu: Un clon de ADN provírico de
VIH-1 infeccioso, pNL4-3
(proporcionado por el Dr. Malcolm Martin a través del programa AIDS
Research and Reference Reagent, Division of AIDS, NIAID, NIH;
Adachi, et al. J. Virol. 59:284-291
(1986)) contiene dos sitios únicos de enzima de restricción: EcoRI
(posición 5744) y BamHI (posición 8466). La región de codificación
del gen env parte de la posición 6221 y termina en la
posición 8785. Para reemplazar la secuencia señal natural de
env de VIH-1 por la de melitina,
IL-3 o cualquier otra secuencia señal de proteína
secretora, se aísla el fragmento EcoRI-BamHI de
pNL4-3 del gel de agarosa y se subclona en el sitio
EcoRI-BamHI del vector pBluescript SK (pBSK). A
partir de este producto, se diseñan cuatro cebadores como
sigue:
sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan pBSK-env como molde más los
cebadores nº 1 y nº 2 y se efectúa la PCR para amplificar la porción
izquierda de la región env, fragmento de 477 pb. De forma
similar, se emplean los cebadores nº 3 y nº 4 para amplificar la
porción derecha de env, 2245 pb. Se digirió el producto de
PCR EcoRI-PstI (fragmento de 477 pb) con
EcoRI+PstI, mientras que se cortó el producto de PCR
PstI-BamHI (fragmento de 2245 pb) con PstI+BamHI.
Se clonó entonces el fragmento de 2245 pb digerido con
PstI-BamHI en los sitios PstI+BamHI del vector
pBSK.
Después de esto, se digirió el
pBSK-2245 con EcoRI+PstI y se ligó con los productos
de PCR digeridos con EcoRI+PstI (fragmento de 445 pb), dando como
resultado el plásmido pBSK-env-\DeltaS.
Se digirió el plásmido pBSK-env-\DeltaS
con PstI+NcoI y se ligó entonces con el oligonucleótido sintético
que codifica secuencia señal de MSS, secuencia señal de
IL-3, secuencias señal naturales mutadas o cualquier
otra secuencia señal deseada. Este oligonucleótido sintético
contiene un sitio PstI en el extremo 5' y un sitio NcoI en el
extremo 3'. Antes de la ligación en el vector, se digirieron en
primer lugar estos oligonucleótidos bicatenarios con PstI+
NcoI.
NcoI.
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótido sintético que codifica la
secuencia señal de melitina (solo se muestra el sentido
positivo):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótido sintético que codifica la
secuencia señal de interleucina 3 (solo se muestra el sentido
positivo):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de secuenciar para verificar la correcta
modificación, se digirió el plásmido con EcoRI+BamHI para aislar el
fragmento EcoRI-BamHI, que se reclonó en los sitios
EcoRI-BamHI del vector de ADN provírico
pNL4-3. El plásmido resultante se designa
pHIV-1-MSS (o
pHIV-1-IL3SS).
Además, durante la construcción anterior, no
solo se sustituye la NSS por secuencia señal de MSS o de
IL-3, sino que se crea también una deleción parcial
del gen vpu. El vpu codifica 82 aminoácidos y su
extremo 3' se superpone con la secuencia señal del gen env
de VIH-1, aproximadamente 28 aminoácidos. Sin
embargo, está en un marco de lectura diferente (marco de lectura
-1). Los estudios han mostrado que la deleción de los genes
vpu o nef no alteraba la replicación vírica en PBMC de
chimpancé, PBMC humanos o en la línea celular híbrida B/T CEMx174
(James, et al. AIDS Res. Human Retrovirus
10:343-350 (1994)). Por lo tanto, durante la
amplificación por PCR del fragmento de 455 pb de la porción
izquierda de env con los cebadores nº 1 y nº 2, se añadieron
dos codones de terminación justo delante del codón de inicio de los
genes env, que da como resultado la deleción de 28
aminoácidos de vpu (véase el cebador nº 2).
II. Construcción de un plásmido que contiene
la deleción de nef: La secuencia de codificación del gen
nef parte de la posición 8787 y termina en la posición 9407
en el clon de ADN provírico pNL4-3. Hay también dos
únicos sitios de enzima de restricción: el sitio BamHI en posición
8466 del gen env y el sitio XhoI en posición 8887 del gen
nef. Para preparar la deleción del gen nef, se digirió
el plásmido pHIV-MSS (o IL-3SS) con
BamHI y XhoI. Se aislaron las 421 pb resultantes del fragmento
BamHI-XhoI y se subclonaron en los sitios
BamHI-XhoI del vector
pBSK.
pBSK.
\newpage
Se diseñaron dos cebadores:
El gen nef codifica 26 aminoácidos según
el presente diseño. Se insertaron dos codones de terminación en el
sitio XhoI que dan como resultado que nef codifique solo 33
aminoácidos. Después de la amplificación por PCR y digestión con
BamHI+XhoI, se clonó de nuevo este fragmento de ADN de PCR de 421 pb
al vector BamHI-XhoI
pHIV-1-MSS (o
IL-3SS). El plásmido recombinante resultante
contiene la sustitución de NSS y la deleción parcial de vpu
y nef, que se usa para el ensayo de vacuna.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se sembraron inicialmente células A3.01 en
placas de 6 pocillos a una densidad de 1 x 10^{6} células/pocillo
y se transfectaron con 10 \mug de ADN provírico. A los 3 días
después de la transfección, y cada 2 días después, se recogieron
los cultivos y se dividieron las células 1:2 en medio fresco sin la
adición de células suplementarias no infectadas. Se reunieron los
sobrenadantes de cultivo recogidos en cada punto temporal mostrado
y se analizó la presencia de p24 por ELISA como indicador de la
producción vírica. Las células infectadas con el virus
NL4-3^{WT} o NL4-3^{nef-}
mostraron una producción vírica máxima a los 13 días después de la
transfección, sin embargo las células mostraron altos niveles de CPE
y los números de células bajaron rápidamente, terminándose los
cultivos a los 17 días después de la transfección. Sin embargo, las
células infectadas con virus NL4-3^{SSR} o
NL4-3^{nef-/SSR} mostraron un CPE mínimo y
permanecieron infectadas persistentemente hasta 29 días después de
la transfección, en cuyo punto las células sucumbieron eventualmente
al CPE inducido por virus y se terminaron los cultivos. Los
cultivos de virus NL4-3^{WT} o
NL4-3^{nef-} producían un máximo de 1 x 10^{2}
\mug de p24, mientras que los virus NL4-3^{SSR}
o NL4-3^{nef-/SSR} producían más de 1 x 10^{6}
\mug de p24 en una sola recogida. Los resultados se muestran en la
Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Después de la transfección de ADN provírico, se
dividieron las células cada dos días, se recogieron muestras del
sobrenadante de cultivo y se analizaron mediante ELISA de p24 para
controlar la replicación vírica. Para valorar la infectividad de
las partículas víricas que se están produciendo, se analizaron
adicionalmente muestras mediante el ensayo MAGI a los 8 días
después de la transfección tanto en células A3.01 como H9, y los
resultados se estandarizaron para representar el número de
partículas víricas infecciosas presentes por ng de proteína p24.
Como se muestra anteriormente, el mutante de reemplazo de la
secuencia señal de Env (NL4-3^{SSR}) y el mutante
combinación de deleción de nef/reemplazo de secuencia señal de Env
(NL4-3^{nef-/SSR}) poseen ambos una infectividad
sustancialmente reducida, siendo el mutante de reemplazo
aproximadamente 2 veces a 3 veces menos infeccioso que el virus
natural (NL4-3^{WT}), y exhibiendo el mutante de
combinación del orden de 50 veces de aumento de infectividad en
comparación con el natural. Los resultados se muestran en la Figura
7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se infectaron células H9 a una multiplicidad de
infección de 3 con cada uno de los virus indicados. Se dejaron
proceder las infecciones, dividiendo los cultivos 1:2 cada dos días.
A los 6 días después de la infección, se examinaron las células por
microscopio óptico y se observó el efecto citopático (CPE). Véase la
Figura 8. Como se muestra, las células H9 infectadas con los virus
NL4-3^{WT} o NL4-3^{nef-} (ambos
contienen la secuencia señal de Env natural) exhibían un inicio
rápido del CPE incluyendo muerte celular y formación de sincitios
grandes (flecha negras). En contraposición, las células infectadas
con virus NL4-3^{SSR} o
NL4-3^{nef-/SSR} (que contienen la secuencia señal
de melitina en lugar de la secuencia señal de Env natural)
mostraron muy poca señal de CPE a pesar de la replicación de VIH
activa (como se mide mediante ELISA de p24 de
VIH-1, no mostrado).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Hemos construido genes quiméricos de gag
con una selección de secuencias V3 y C3 de todos los clados
principales de VIH-1. Se teoriza que los
anticuerpos preparados contra estos epítopos lineales múltiples
serán capaces de interaccionar no solo con las regiones V3
originales, sino también con cualquier variante menor que pueda
haberse generado por infección natural o aquellas que están
presentes en VIH, que se transmiten de forma natural por la
población. Ambas regiones V3 de las proteínas gp120 y Gag contienen
los epítopos neutralizantes (NE) así como epítopos de linfocitos T
citotóxicos (TCE). Estos epítopos pueden ser capaces de funcionar
independientemente como inmunógenos. Se han ligado múltiples
secuencias de bucle de V3 a una secuencia de gag de
VIH-2 para proporcionar un antígeno mayor para
expresión y para formar partículas de tipo vírico (VLP) para
aumentar el potencial de inducción de efectores citotóxicos. La
estrategia de ligar múltiples epítopos de V3 se ilustra en las
Figuras 9a y 9b.
Hemos construido adenovirus humanos 5
recombinantes defectivos de replicación (rAd) insertando los genes
quiméricos gag-V3 y gag-TCE en la región E1a
de AD5. Se amplificaron estos Ad5 recombinantes en células 2P3
humanas que expresan constitutivamente proteínas E1a (véase el
Ejemplo 11).
Se ha mostrado que los anticuerpos
neutralizantes están dirigidos no solo a los dominios V3, sino
también a otras regiones de VIH-1 (Luo et
al., Virology 179: 874, 1990). De forma interesante, el
análisis de neutralización cruzada de diferentes aislamientos
víricos sugiere que pueden existir patrones conservados de
neutralización entre subtipos de VIH-1. Por ejemplo,
algunos sueros de un tipo de individuos infectados con
VIH-1 neutralizan todos los subtipos de
VIH-1, independientemente de sus clados. Esta
demostración de neutralización es el resultado de los epítopos de
neutralización conservados tales como los presentes en gp41
(Muster, et al., J. Virol. 67: 6642, 1993), o de
aquellos epítopos correspondientes al sitio de unión a CD4 en gp120
(Thali, M. et al., J. Virol. 66: 5635, 1992). Una
presión de selección diferencial, relacionada con la emergencia de
variantes de VIH-1, está asociada a la no progresión
a largo plazo. Por tanto, la presencia de estas regiones C3 en
gp120 es probable que proporcione protección adicional (Wang, W -K.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6693, 1996). Véase
la Figura 9c.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se cree que los CTL específicos de VIH ejercen
una presión de selección inmunológica en personas infectadas con
VIH. Sin embargo, solo están disponibles unos pocos fragmentos de
datos respecto a los efectos de esta limitación sobre la variación
de secuencia vírica in vivo. Se han seleccionado los epítopos
de linfocitos T citotóxicos (TCE) principales de gp120, gp41, Nef,
RT y Rev de VIH-1 y se han ligado al gen gag
de VIH-1, para crear un gen
gag-TCE quimérico que puede expresarse por un
adenovirus recombinante. La Figura 10a muestra la construcción del
gen gag de VIH-1 con dos TCE diferentes a
partir de gp120, dos TCE diferentes de Nef y un TCE de gp41 de la
cepa VIH-1_{HXB2}. Además, se ha construido
también otro gen quimérico gag-TCE de
VIH-1 que expresará TCE de proteínas RT, Tat y Rev
de VIH-1_{HXHB2}. Se han construido adenovirus
humanos recombinantes (rAd) defectivos de replicación que portan
estos gag-NE de VIH-2 y
gag-TCE de VIH-1 como parte
de una vacuna de VIH/SIDA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Hemos modificado las secuencias de ADN terminal
de los módulos génicos que contienen las secuencias de codificación
de gag-NE de VIH-2 y
gg-TCE de VIH-1 flanqueados
por el sitio de restricción BamHI para insertar estos genes en un
vector adenovírico. Los protocolos generales a usar para la
manipulación de vectores adenovíricos se han descrito anteriormente
(Graham, et al., J. Gen. Virol. 36: 59, 1977). Se ha
usado el sistema simplificado para generar adenovirus recombinantes
según Graham y colaboradores (He, T. -C. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 95: 2509, 1998). Esta nueva técnica
requiere una manipulación enzimática mínima, al usar recombinación
homóloga en bacterias en lugar de en células eucarióticas. Se ha
adaptado esta nueva estrategia y se ha encontrado que es un sistema
extremadamente eficaz para generar adenovirus recombinantes. Se han
construido vectores adenovíricos defectivos de replicación con
insertos de genes quiméricos gag-NE de
VIH-2 o gag-TCE de
VIH-1 en la región E1a de adenovirus humanos (Ad5)
usado técnicas que se habían empleado previamente. Se han generado
exitosamente tres adenovirus recombinantes defectivos de replicación
con gag-NE de VIH-2 y dos
adenovirus recombinantes defectivos de replicación con
gag-TCE de VIH-1. Se ha
identificado la expresión de la proteína quimérica
Gag-NE de VIH-2 y la formación de
partículas de tipo virus de Gag-NE mediante análisis
de inmunoprecipitación y transferencia Western usando el anticuerpo
anti-Gag (Luo, L, Li, Y y Kang C. Y. "Budding and
secretion of HIV Gag-Env virus-like
particles from recombinant human adenovirus infected cells",
Virus Research 92: 75-82, 2003).
Se propagaron los adenovirus recombinantes
defectivos de replicación que portan los genes quiméricos
gag-NE de VIH-2 o
gag-TCE de VIH-1 en la región
E1a de adenovirus humano 5 en células 293 que expresan la proteína
E1a constitutivamente. Estos adenovirus recombinantes se replican
bien en células 293 y fue fácil preparar 10^{12} unidades de
formación de placa (UFP) después de purificar por CsCl.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Los sujetos de ensayo para este estudio de
vacuna serán 18 macacos Rhesus macho (Macaca
mulatto).
I. Antígeno y coadyuvante: Se usan los
siguientes antígenos y adyuvantes.
1. Antígeno de virus entero inactivado:
Se producirá un VIH-1 de clado B modificado
genéticamente (NL4-3^{nef-/SSR}), se purificará y
experimentará inactivación por AT-2. Para
inmunización, animales específicos recibirán 500 \mug de antígeno
suspendido en 500 \mul de PBS (formulado con 500 \mul de
coadyuvante oligodesoxinucleótido de CpG (ODN)).
2. Adenovirus recombinante defectivo de
replicación (rAd): Se prepararán y purificarán disoluciones
madre de alto título de cinco vectores adenovíricos recombinantes
que expresan el gen gag de VIH-1 en
asociación con una serie de epítopos neutralizantes y de linfocitos
T seleccionados. Para inmunizar, animales específicos recibirán
10^{9} ufp de cada virus recombinante (1 x 10^{9} ufp x 5 virus
recombinantes= 5 x 10^{9} ufp) en un volumen total de 500 \mul
(formulado con 500 \mul de coadyuvante).
3. Coadyuvante de oligodesoxinucleótido de
CpG (ODN): Se adquirieron oligodesoxinucleótidos de
fosforotioato purificados de secuencia
5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEC
ID Nº 26, secuencia sujeta a cambio). Se suspenderán 500 \mug de
este ODN en un volumen total de 500 \mul de PBS para formulación
con cada antígeno descrito anteriormente.
II. Inmunización: Se dividirán los
animales en 3 grupos (designados grupos 1-3),
conteniendo cada grupo un total de 6 macacos Rhesus. Se
enumera a continuación el programa de inmunización para cada grupo
de animales, incluyendo momento de inoculación, tipo y cantidad de
antígeno/coadyuvante y vía de inmunización intramuscular (im).
Grupo 1
- Semana 0- 500 \mul de antígeno de virus completo inactivado con 500 \mul de coadyuvante CpG i.m.
- Semana 4- 500 \mul de antígeno de rAd con 500 \mul de coadyuvante CpG i.m.
- Semana 8- 500 \mul de antígeno de rAd con con 500 \mul de coadyuvante CpG i.m.
- Semana 16- 500 \mul de antígeno de rAd con 500 \mul de coadyuvante CpG i.m.
Grupo 2
- Semana 0- 500 \mul de antígeno de rAd con 500 \mul de coadyuvante CpG i.m.
- Semana 4- 500 \mul de antígeno de rAd con 500 \mul de coadyuvante CpG i.m.
- Semana 8- 500 \mul de antígeno de rAd con con 500 \mul de coadyuvante CpG i.m.
- Semana 16- 500 \mul de antígeno de virus completo inactivado con 500 \mul de coadyuvante CpG i.m.
Grupo 3
- El grupo 3 actuará como grupo de control no inmunizado con los fines de estos experimentos.
III. Exposición: A las 24 semanas después
de la inmunización, se expondrán todos los animales a una mezcla de
100 TCID_{50} de VIHS^{SF162-P4} y 100
TCID_{50} de VIHS^{89.6} mediante inyección untravenosa.
IV. Recogida de muestras: Las semanas -1,
0, 4, 6, 8, 10, 16, 18 y 20 después de la inmunización (p.i.), se
recogerá sangre y se analizará la respuesta inmunitaria. Las semanas
1, 2 y 5 después de la exposición (p.c.), y mensualmente después de
ello, se recogerá sangre y se almacenará para estudios de carga
vírica y respuesta inmunitaria. A las 24 semanas p.c., se
sacrificarán los animales y se recogerán sangre y tejidos para la
determinación de la carga vírica y los anticuerpos
neutralizantes.
V. Análisis de la respuesta inmunitaria:
Para valorar la respuesta inmunitaria generada por ambas
vacunaciones y durante el periodo de exposición, se ensayará en
todas las muestras lo siguiente:
1. Producción de anticuerpo
anti-VIH: Se analizará en muestras de suero el
nivel de anticuerpos anti-Env y Gag de
VIH-1 mediante ensayo de inmunosorción ligado a
enzima (ELISA).
2. Proliferación de linfocitos T específicos
de VIH: Se medirán las respuestas proliferativas de linfocitos
T específicos de VIH-1 usando VIH-1
completo inactivo como estimulante antigénico.
3. Ensayo de linfocitos T citotóxicos: Se
valorará en los PBMC efectores estimulados por antígeno la actividad
citotóxica específica de VIH-1/VHIS.
VI. Análisis del efecto protector de la
vacunación: Para valorar la capacidad del protocolo de
vacunación de proteger frente a la exposición vírica, se ensayará
adicionalmente en todas las muestras tomadas p.c. lo siguiente:
1. Carga vírica (ARNv): Se analizarán en
las muestras de plasma los niveles de ARNv mediante un ensayo de
ADN ramificado cuantitativo.
2. Relación de linfocitos T CD4:CD8: Se
controlarán los niveles de linfocitos T tanto CD4 como CD8 p.c.
como marcador potencial de SIDAs.
3. Ensayo de neutralización de
anticuerpos: Se ensayará en muestras de suero termoinactivado su
capacidad de inhibir la entrada del virus de exposición en la línea
celular informadora sMAGI.
4. Secreción de
IFN-\gamma: Se determinará el número de
células secretoras de IFN-\gamma mediante ensayo
ELISPOT.
5. Producción de citocinas: Se controlará
la inducción de la expresión de ARNm de citocina mediante PCR por
transcriptasa inversa instantánea. Se valorará la presencia de las
citocinas IFN-\alpha, IFN-\beta,
Mx, IFN-\gamma, IL-2,
IL-4, IL-12, IL-6,
TNF-\alpha, MIP-1\alpha,
MIP-1\beta y MDC.
Aunque la presente invención se ha descrito con
referencia a lo que se considera actualmente que son los ejemplos
preferidos, ha de entenderse que la invención no está limitada a los
ejemplos dados a conocer. Por el contrario, se pretende que la
invención cubra diversas modificaciones y disposiciones equivalentes
incluidas dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (8)
1. Un lentivirus recombinante que tiene un
péptido señal de glucoproteína gp120, en el que dicho péptido señal
de glucoproteína 120 se selecciona del grupo constituido por las
secuencias polipeptídicas enumeradas como SEC ID Nº
3-6.
2. El lentivirus recombinante de la
reivindicación 1, lentivirus recombinante que se vuelve avirulento
mediante la deleción de una cantidad suficiente del gen
nef.
3. El lentivirus recombinante de la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es un virus de la
inmunodeficiencia humana recombinante.
4. El lentivirus recombinante de la
reivindicación 3, siendo dicho virus de la inmunodeficiencia humana
recombinante es VIH-1.
5. El lentivirus recombinante de la
reivindicación 3, lentivirus recombinante que es
VIH-1 vuelto avirulento mediante la deleción de una
cantidad suficiente del gen nef.
6. Una vacuna que comprende un lentivirus
recombinante según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes.
7. La vacuna de la reivindicación 6,
comprendiendo dicha vacuna adicionalmente un coadyuvante.
8. La vacuna de la reivindicación 6 o la
reivindicación 7 para uso en la prevención o el tratamiento de una
infección lentivírica en un paciente necesitado de ello.
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