CN102977195A - Hiv疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含无毒力和非细胞溶解性的重组HIV的新型HIV疫苗。

Description

HIV疫苗

本申请是申请日为2006年2月24日，申请号为200680021708.9的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

1.相关的申请

本申请要求2005年4月15日提交的美国申请系列号No.11/107,364的优先权；其是2001年4月2日提交的待决美国申请系列号NO.09/762,294的部分继续申请；其要求了1999年8月12日提交的国际申请NO.PCT/CA99/00746的提交日的权益；其要求了1998年8月12日提交的美国临时申请NO.60/096,235的提交日的权益；通过引用将所有这些的内容特别地合并在此。

2.发明领域

本发明涉及用于AIDS的预防和/或治疗的新的疫苗以及生产它的方法。更特别地，本发明涉及大量地生产AIDS病毒，用于非细胞溶解性和无毒力的HIV/AIDS疫苗的配制。

3.发明背景

尽管在抗病毒治疗中有新近的发展，对于AIDS或HIV感染没有不变的治愈方法。药物治疗对于提供有效的治疗而言是有前途的研究领域，然而由于副作用、顺应性和花费，进展不快。组合这些难处的事实是，这种药物的可用性在发展中国家受到限制，在那里估计将出现绝大多数的新HIV感染。

由于针对传染性疾病的疫苗已经获得的成功，最显著的是针对小牛痘和骨髓灰质炎，对于针对AIDS的有效疫苗的搜索在继续。已经尝试了多种方法。实际上，大多数HIV-1疫苗开发专注于亚单位疫苗。亚单位疫苗方法的困难是产生最佳的免疫性的能力。当前，不完全知道的是，HIV抗原和免疫系统的那个部分是自然感染的保护所必需的。

开发疫苗的优选的途径一般是使用完整的、钝化的或减毒的病毒，例如钝化的骨髓灰质炎病毒疫苗，或减毒的活病毒疫苗，例如口服骨髓灰质炎疫苗。不幸地，“Cutter事件”显示了这种方法是有问题的，其中骨髓灰质炎疫苗的不充分钝化引起了疫苗介导的临床骨髓灰质炎传播。

早期的疫苗试验已经考察了基于重组亚单位蛋白的免疫原，例如HIV-1包膜糖蛋白120(gp120)。这种方法的大多数结果是失望的，然而采用活的重组病毒和亚单位蛋白的免疫方式在某些个体中引发了包膜特异性CD8+CTL和针对HIV-包膜的中和抗体(Cooney，E.L.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1882-86(1993)；McElrath，M.J.et al.J.Infect.Dis.169：41-47(1994)；Graham，B.S.et al.J.Infect.Dis.166：244-52(1992)；和Graham，B.S.et al.J.Infect.Dis.167：533-37(1993))。

有趣地，被称为NSS(天然信号序列)的HIV-1gp 120的信号序列，被发现与gp 120的分泌程度相关。已经显示了，用蜜蜂mellitin或鼠白细胞介素-3(IL-3)的信号序列替换NSS引起了gp120的高水平产生和有效分泌(Li，Y.et al.Virology 204：266-278(1994)；和Li，Y.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.93：9606-9611(1996))。然而，未知的是HIV-1 gp120的信号序列是否在病毒的致病性中起到作用。

对于HIV疫苗，已经显示了缺失HIV nef基因使病毒减毒。Desrosiers和他的同事证明了使用缺失nef的SIV对恒河猴的免疫保护了野生型SIV攻击(Daniels，M.D.et al.Science 258：1938(1992)；Desrosiers，R.C.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6353(1989))，其他人证明了nef基因对于SIV和HIV复制是可有可无的(Daniels，M.D.et al.Science 258：1938(1992)；Gibbs，J.S.，et al.AIDS Res.and HumanRetroviruses 10：343(1994)；Igarashi，T.et al.J.Gen.Virol.78：985(1997)；Kestler III，H.W.et al.Cell 65：651(1991))。此外，已经发现缺失nef基因在通常易感的宿主中使病毒非致病化(Daniels，M.D.et al.Science258：1938(1992))。然而，已经发现这种缺失提供了一种可以大量产生的病毒的形式。

因此，需要一种无毒力的并且可以大量生产的疫苗。

4.发明概述

本发明的一个方面涉及重组人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)，其中所述病毒的HIV-1包膜糖蛋白120(gp120)的信号序列是如SEQ ID NO：3、4、5或6所列的多肽序列，或其功能片段或变体。在某些实施方式中，所述功能性片段或变体包含不超过一个(1)带正电的氨基酸。在其他实施方式中，所述信号序列不包含带正电的氨基酸。在其他实施方式中，所述病毒通过缺失足够数量的nef基因变得无毒力。

本发明的另一个方面涉及包含重组人类免疫缺陷病毒的疫苗。在某些实施方式中，所述疫苗进一步的包含佐剂。本发明的特征还在于在患者中预防或治疗慢病毒感染的方法，包括向需要的患者施用有效量的上述疫苗的任一种。

根据以下的详细说明和权利要求，本发明的进一步的特征和优点将更为显而易见。

5.附图的简要说明

附图1含有野生型和重组杆状病毒感染的S.frugiperda昆虫细胞的相差显微镜检查的照片(SF21)。画面A描绘了用野生型Autographicacalifornica核多角体病病毒(AcNPV)感染的细胞，其中观察到完整细胞；画面B描绘了用表达具有天然信号序列的人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)包膜糖蛋白120的重组AcNPV(vAc-gp120-NS)感染的细胞，其中观察到细胞裂解；画面C描绘了用表达没有其天然信号序列的HIV-1包膜gp120的重组AcNPV(vAc-gp120-ΔS)感染的细胞，其中观察到完整的细胞；画面D描绘了用表达天然信号序列被mellitin信号序列替代的HIV-1包膜gp120的重组ADNPV(vAc-gp120-MS)感染的细胞，其中观察到完整的细胞；画面E描绘了用表达水泡性口膜炎病毒糖蛋白G的重组AcNPV(vAc-VSV-G)感染的细胞，其中观察到完整的细胞；画面F描绘了用表达具有附加的HIV-1糖蛋白120天然信号序列的水泡性口膜炎病毒糖蛋白G(VSV-G)的重组AcNPV(vAcVSV-G-NS)感染的细胞，其中观察到细胞裂解。

附图2提供了图表，说明了HIV-1包膜糖蛋白120(gp120)信号序列对于细胞死亡的效果。附图2A描绘了在表达具有不同的信号序列的重组糖蛋白(rgp 120)或水泡性口膜炎病毒糖蛋白G(VSV-G)之后被台盼蓝穿透的细胞(死细胞)的百分比。附图2B描绘了乳酸脱氢酶(LDH)释放分析(Boehringer Mannheim的细胞毒性检测试剂盒)的结果。从用表达具有不同信号序列的rgp120或VSV-G的重组病毒感染的SF21细胞释放的LDH的数量，通过在490nm读取测定ELISA平板中形成的甲染料来测量。

附图3描绘了琼脂糖凝胶电泳结果，提供了S.frugiperda昆虫细胞(SF21)的DNA片段的分析，所述S.frugiperda昆虫细胞(SF21)用表达具有不同信号序列的HIV-1包膜糖蛋白120的Autographica californica核多角体病病毒(AcNPV)感染。在感染后48小时提取总细胞DNA(A)或低分子量DNA(B)并通过存在溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶电泳来分析：泳道M：DNA标志：泳道WT：用AcNPV感染的细胞；泳道ΔS：用表达除去天然信号序列的HIV-1包膜糖蛋白120的AcNPV重组体(vAc-gp120-ΔS)感染的细胞；泳道NS：用表达具有其完整天然序列的HIV-1包膜糖蛋白120的AcNPV重组体(vAc-gp120-NS)感染的细胞；泳道MS：描绘了用表达其天然序列被蜜蜂mellitin信号序列替代的HIV-1包膜糖蛋白120的AcNPV重组体(vAc-gp120-MS)感染的细胞。

附图4描绘了琼脂糖凝胶电泳结果，提供了S.frugiperda昆虫细胞(SF21)的DNA片段的分析，所述S.frugiperda昆虫细胞(SF21)用表达有或没有HIV-1包膜糖蛋白120(gp120)天然信号序列的水泡性口膜炎病毒糖蛋白G(VSV-G)的重组Autographica californica核多角体病病毒(AcNPV)感染。在感染后48小时提取总细胞DNA(A)或低分子量DNA(B)并通过存在溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶电泳来分析；泳道M：DNA标志；泳道VSV-G：用表达未修饰的水泡性口膜炎病毒糖蛋白G的AcNPV重组体感染的细胞；泳道VSV-G-NS：用表达被修饰以含有HIV-1包膜gp120天然信号序列的水泡性口膜炎病毒糖蛋白G的AcNPV重组体感染的细胞(vAc VSV-G-NS)。

附图5描绘了构建遗传修饰的HIV-1原病毒克隆。使用HIV-1分化体B原病毒pNL4-3作为主干载体，制备所述病毒的3种遗传修饰形式。这些包括pNL4-3^nef-，其含有nef基因的目标缺失，pNL4-3^SSR，其天然Env糖蛋白信号序列被替换为蜜蜂mellitin信号序列，以及pNL4-3^nef-/SSR，其含有nef缺失和信号序列替换突变的组合。pNL4-3^WT质粒代表亲本野生型原病毒。

附图6描绘了图表，其显示了延长的细胞存活引起A3.01细胞中提高的病毒产量。遗传修饰的HIV-1分化体B病毒包括NL4-3^nef-，其含有nef基因的目标缺失，NL4-3^SSR，其天然的Env糖蛋白信号序列被替换为蜜蜂mellitin信号序列，NL4-3^nef-/SSR，其含有nef缺失和信号序列替换突变的组合，以及NL4-3^WT，其代表亲本野生型原病毒。

附图7描绘了使用MAG1分析在A3.01和H9细胞中HIV-1NL4-3突变体的感染性。遗传修饰的HIV-1分化体B病毒包括NL4-3^nef-，其含有nef基因的目标缺失，NL4-3^SSR，其天然的Env糖蛋白信号序列被替换为蜜蜂mellitin信号序列，NL4-3^nef-/SSR，其含有nef缺失和信号序列替换突变的组合，以及NL4-3^WT，其代表亲本野生型原病毒。

附图8描绘了HIV-1NL4-3在H9感染的细胞中对细胞病变效应(合胞体形成)的诱导。遗传修饰的HIV-1分化体B病毒包括NL4-3^nef-，其含有nef基因的目标缺失，NL4-3^SSR，其天然的Env糖蛋白信号序列被替换为蜜蜂mellitin信号序列，NL4-3^nef-/SSR，其含有nef缺失和信号序列替换突变的组合，以及NL4-3^WT，其代表亲本野生型原病毒。

附图9描绘了gag-NE嵌合基因的构建，其将携带具有几个独特的V3编码序列的HIV gag基因，所述V3编码序列有或者没有主要HIV-1分化体的保守的中和表位。附图9a包括具有来自HIV-1分化体B、C和E的V3结构域的HIV-2 gag基因，附图9b包括具有来自HIV分化体A、D、F和G的V3结构域的HIV-2 gag基因。在附图9C中，来自分化体B、C和E的代表恒定区C3的gp120的表位，以及由6个氨基酸代表的gp41的保守的中和表位(CNE)(Muster，et al，J.Virol.67：6642，1993)，被选择来产生中和抗体，所述中和抗体将与大部分的HIV-1分离物交叉反应。

附图10描绘了具有来自HIV-1分化体B的gp41、Nef、gp120、逆转录酶(RT)、Tat和Rev蛋白的多个细胞毒T细胞表位(TCE)的gag-TCE嵌合基因的构建。

6.发明的详细说明

1.定义

为了方便，以下提供了在说明书、实施例和随附的权利要求中采用的某些术语和词语的含义。除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的一个普通技术人员通常所理解的相同含义。

在此使用的冠词“a”和“an”是指冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法上的目标。

术语“氨基酸”是本领域已知的。一般地，在此使用用于指代氨基酸和保护基团的缩写是基于IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclature的推荐(参见Biochemistry(1972)11：1726-1732)。在某些实施方式中，在本发明的应用中使用的氨基酸是那些在蛋白质中存在的天然发生的氨基酸，或含有氨基和羧基的、这些氨基酸的天然发生的合成代谢或分解代谢产物。特别适合的氨基酸侧链包括选自以下氨基酸的那些的侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

术语“氨基酸”进一步包括在此引述的任何特定氨基酸的类似物、衍生物和同源物(congeners)，以及C-末端或N-末端保护的氨基酸衍生物(例如，用N-末端或C-末端保护基团修饰的)。例如，本发明预期使用氨基酸类似物，其中侧链被延长或缩短而仍然提供了用于环化的羧基、氨基或其他反应性前体官能团，以及具有带有合适的官能团的变体侧链的氨基酸类似物)。例如，目标化合物可以包括氨基酸类似物，例如，氰丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氰酸、正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、二羟基-苯丙氨酸、5-羟色氨酸、1甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、二氨基庚二酸、鸟氨酸或二氨基丁酸。具有在此适合的侧链的其他天然发生的氨基酸代谢物或前体将被本领域的技术人员认识到，并包括在本发明的范围内。

当氨基酸的结构容许立体异构化形式时，还包括的是这些氨基酸的(d)和(l)立体异构体。在此的氨基酸和氨基酸残基的构型通过合适的符号(d)、(l)或(dl)来指代，此外当没有指定构型时，氨基酸或残基可以具有(d)、(l)或(dl)的构型。因而要理解的是，由这种不对称性产生的异构体被包括在本发明的范围内。这种异构体可以通过标准的分离技术和通过空间上控制的合成来以基本上纯的形式获得。对于本申请来说，除非相反地明确注明了，所称的氨基酸应当被视为包括(d)或(l)立体异构体。

在此使用的术语“抗体”意图包括完整的抗体，例如，任何同种型的抗体(IgG、IgA、IgM、IgE等等)，包括多克隆的、单克隆的、重组的和人源化的抗体和能够特异性识别并能够结合蛋白的表位的抗体片段。抗体可以使用常规技术片段化，按相同的方式为了实用性筛选片段。因而，该术语包括抗体分子的蛋白水解裂解的或重组制备的部分的片段，其能够与某些蛋白选择性地反应。这种蛋白水解的和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv，以及含有由肽接头连接的V［L］和/或V［H］结构域的单链抗体(scFv)。scFv可以共价地或非共价地连接来形成具有两个或多个结合位点的抗体。

术语“保守性替换”是指在广泛地相似的分子性质的氨基酸之间的变化。例如，在脂肪组丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间的互换可以认为是保守的。有时，甘氨酸对于这些之一的替换也可以认为是保守的。其他保守的互换包括在脂肪组天冬氨酸盐和谷氨酸之内；酰胺组天冬酰胺和谷氨酰胺之内；羟基组丝氨酸和苏氨酸之内；芳香组苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸之内；碱性组赖氨酸、精氨酸和组氨酸之内；和含硫组甲硫氨酸和半胱氨酸之内的那些。有时在甲硫氨酸和亮氨酸组内的替换也可以认为是保守的。优选的保守性替换组是天冬氨酸-谷氨酸；天冬酰胺-谷氨酰胺；缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸；丙氨酸-缬氨酸；缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-甲硫氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸；赖氨酸-精氨酸；和组氨酸-赖氨酸-精氨酸。

在此使用的术语“基本上非细胞溶解性”是指逆转录病毒不显著地损伤或杀死它感染的细胞。

当用于描述核酸或核苷酸序列时“等效物”是指编码功能上等效的多肽的核苷酸序列。等效核苷酸序列将包括差异在一个或多个核苷酸替换、添加或缺失的那些序列，例如等位变体；并且因而包括由于遗传密码的简并性而不同的序列。例如，核酸变体可以包括由核苷酸替换、缺失或添加所产生的那些。替换、缺失或添加可以涉及一个或多个核苷酸。这种变体可以在编码区、非编码区或两者中改变。在编码区中的改变可以产生保守性或非保守性氨基酸替换、缺失或添加。

变体肽可以使用本领域公知的方法通过直接化学合成来共价地制备。变体可以进一步的包括，例如，氨基酸序列内残基的缺失、插入或替换。也可以进行缺失、插入和替换的任何组合来得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有期望的活性。这些变体可以通过在编码肽分子的DNA中的核苷酸的定点诱变(如Adelman et al.，DNA 2：183(1983)所例示的)从而产生编码变体的DNA、以及此后在重组细胞培养物中表达所述DNA来制备。变体一般展现了与野生型多肽性质上相同的生物学活性。本领域已知的是，人们也可以合成已知多肽的所有可能的单个氨基酸替换(Geysen et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)18：3998-4002(1984))。虽然不同替换的效果不总是添加性的，但合理预期的是多肽中不同残基位置的两个有利的或中性的单个替换可以被安全地组合而不损失任何蛋白活性。简并多肽的制备方法在Rutter，美国专利No.5,010,175；Haughter et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)82：5131-5135(1985)；Geysen et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)18：3998-4002(1984)；WO86/06487；和WO86/00991中描述了。

在设计替换策略时，普通技术人员将确定要改变哪个残基以及哪个氨基酸或氨基酸种类是适合的替换。人们也可以考虑在家族或天然发生的同源蛋白中序列变异的研究。某些氨基酸替换比其他的常常更有耐受性，这些常常与原始氨基酸和它的替换之间在大小、电荷等等方面的相似性有关。如上所述，也可以进行氨基酸的插入或缺失。替换优选的是保守的，参见，例如，Schulz et al.，Principle of ProteinStructure(Springer-Verlag，New York(1978))；和Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties(W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco(1983))，通过完全引用将这两个合并在此。

在此使用的核酸的“功能性”片段是能够编码与该片段连接的基因的信号序列的核酸片段。因而，核酸的“功能性片段”意图包括能够在合适的条件下编码信号序列的核酸。

本领域技术人员已知的是术语“HIV”是指人类免疫缺陷病毒。存在两种类型的HIV：HIV-1和HIV-2。存在许多不同的HIV-1毒株。HIV-1的毒株可以分类为三个组：“主要”组M，“局外”组O，和“新”组N。这三个组可以代表猿免疫缺陷病毒对人类的三种独立的进入。在M组中，存在至少十种亚型或分化体：例如，分化体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K。“分化体(clade)”是一组有机体，例如物种，它的成员共享来自共同祖先的同源的特征。在本申请中对HIV-1的任何援引包括所有这毒株。

术语“多核苷酸”和“核酸”在此可互换地使用，是指任何长度的核苷酸的多聚形式，指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、根据连锁分析划定的基因座(locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，在聚合物的组装之前或之后，可以进行对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸部分打断。多核苷酸可以进一步在聚合之后修饰，例如，通过与标记部分结合。术语“重组”多核苷酸是指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，其或者存在于自然中，或者在非天然方案中与另一个多核苷酸连接。“寡核苷酸”是指具有低于约100个核苷酸、低于约例如75、50、25或10个核苷酸的单链多核苷酸。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”(如果是单链)在此可互换地使用，来指氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作，例如与标记部分结合。

在某些实施方式中，本发明的多肽可以化学地、在无细胞系统中核糖体地(ribosomally)、或在细胞内核糖体地合成。本发明的多肽的化学合成可以使用各种本领域公认的方法来进行，包括逐步的固相合成、通过肽片段的构象协助的重新连接的半合成、克隆的或合成的肽片段的酶学连接和化学连接。天然化学连接采用两个未保护的肽片段的化学选择性反应来产生短暂的硫酯连接的中间物。短暂的硫酯连接的中间物然后自发地经历重排来提供在连接位点具有天然肽键的全长连接产物。全长连接产物化学上相同于通过无细胞合成产生的蛋白质。全长连接产物可以被重折叠和/或氧化，如所容许的，来形成天然的含二硫化物的蛋白质分子(参见，例如，美国专利Nos.6,184,344和6,174,530；和T.W.Muir et al.，Curr.Opin.Biotech.(1993)：vol.4，p 420；M.Miller，et al，Science(1989)：vol.246，p 1149；A.Wlodawer，et al，Science(1989)：vol.245，p 616；L.H.Huang，et al，Biochemistry(1991)：vol.30，p 7402；M.Schnolzer，et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.(1992)：vol.40，p 180-193；K.Rajarathnam，et al.，Science(1994)：vol.264，p 90；R.E.Offord，″Chemical Approaches to Protein Engineering″，in Protein Design and theDevelopment of New therapeutics and Vaccines，J.B.Hook，G.Poste，Eds.，(Plenum Press，New York，1990)pp.253-282；C.J.A.Wallace，et al.，J.Biol.Chem.(1992)：vol.267，p 3852；L.Abrahmsen，et al，Biochemistry(1991)：vol.30，p 4151；T.K.Chang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91：12544-12548；M.Schnlzer，et al.，Science(1992)：vol.，3256，p 221；andK.Akaji，et al.，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)(1985)33：184)。

本领域技术人员已知的是，“逆转录病毒”是二倍体正链RNA病毒，其通过整合的DNA中间物(原病毒DNA)来复制。特别地，在RNA病毒感染时，通过在每种逆转录病毒中作为蛋白携带的病毒编码的逆转录酶，慢病毒基因组被逆转录成DNA。病毒DNA然后伪随机地(pesudo-randomly)整合到感染细胞的宿主细胞基因组中，形成被子代细胞遗传的“原病毒”。逆转录病毒基因组含有至少三个基因：gag编码病毒的核心和结构蛋白质；pol编码逆转录酶、蛋白酶和整合酶；env编码病毒表面蛋白质。在逆转录病毒家族中，HIV被分类为慢病毒，具有与动物慢病毒的遗传学和形态学相似性，例如感染猫(猫免疫缺陷病毒)、绵羊(绵羊髓鞘脱落病毒)、山羊(公山羊关节炎-脑炎病毒)和非人灵长类(猿免疫缺陷病毒)的那些。

如在此使用的，“充分的缺失”是指足够的核酸序列缺失以防止转录并因而产生相应的蛋白产物。

2.概述

本发明至少部分地基于令人惊讶的发现，用包含不超过一个带正电氨基酸的信号序列替换HIV-1的包膜糖蛋白gp 120的天然信号序列(NSS)产生了修饰的HIV-1，其是非细胞溶解性的并且因而能够高效地合成、糖基化和分泌gp120。特别地，观察到在gp 120信号序列中带正电氨基酸残基的改变不仅提高了表达水平，而且提高了分泌水平。随着正电荷的数量降低，分泌水平被提高。相比之下，除去HIV-1分化体B gp120信号序列中所有五个带正电氨基酸残基引起了细胞中大量非糖基化形式的gp120的积累。这种结果表明，最小数量的带正电氨基酸残基是蛋白跨越ER膜的有效转位所需的。

3.重组慢病毒

在一个方面，本发明提供了基本上非细胞溶解性的、能够高效复制的重组HIV-1，其中病毒包膜糖蛋白的NSS被替换为长度约20到约40个氨基酸的信号序列，其中所述信号序列含有不超过一个(1)带正电氨基酸。

通过用中性氨基酸取代天然的信号序列(M

V

E

TQHLW

WGW

WGTMLLGMLMICSA；SEQ ID NO：1)中的带正电氨基酸，可以产生修饰的gp120信号序列，这种修饰可以表示为：MX₁VX₂EX₃KTQHLWX₄WGWX₅WGTMLLGMLMICSA(SEQ ID NO：2)其中X₁、X₂、X₃、X₄和X₅是中性氨基酸。带正电残基以粗体和下划线显示。

示范性的修饰的信号序列包括：

M

VAEI

TQHLW

WGW

WGTMLLGMLMICSA(YL-1；SEQ ID NO：3)，

MIV

E

TQHLWTWGWIWGTMLLGMLMICSA(YL-2；SEQ ID NO：4)，

M

VVEI

TQHLWIWGWIWGTMLLGMLMICSA(YL-3；SEQ ID NO：5)，

MIVAEI

TQHLWIWGWIWGTMLLGMLMICSA(YL-4；SEQ ID NO：6)，

M

FLVNVALVFMVVYISYIYADPINM(修饰的mellitin信号肽，下划线的序列是接头插入的结果，指示在信号序列和成熟gp120蛋白之间的五个氨基酸；SEQ ID NO：7)，

MLLLLLMLFHLGLQASIS

(修饰的白细胞介素3信号肽，下划线的序列是接头插入的结果，指示在信号序列和成熟gp120蛋白之间的七个氨基酸；SEQ ID NO：8)，或其功能性片段或变体。

4.本发明的疫苗

本发明进一步阐述了包含有效量的如上所述无毒力和基本上非细胞溶解性慢病毒的疫苗。

本发明的疫苗组合物适合于以生物学相容形式向受试者体内施用。如在此使用的表述“适合于体内施用的生物学相容形式”是指要施用的物质的形式，其中任何有毒影响被治疗效果胜过。所述物质可以施用给任何动物，优选人类。

本发明的疫苗可以另外含有适合的稀释剂、佐剂和/或载体。优选的，所述疫苗含有可以增强疫苗的体内免疫原性的佐剂。所述佐剂可以选自本领域的多种已知佐剂，包括革兰氏阴性细菌内毒素的脂质A部分、分支杆菌的双分枝菌酸海藻糖(trehalose dimycolate)、磷脂溶血卵磷脂、二甲基十八烷基溴化铵(DDA)、某些线性聚氧化丙烯-聚氧乙烯(POP-POE)嵌段聚合物、氢氧化铝、脂质体和CpG(cytosine-phosphate-guanidine)聚合物。疫苗也可以包括已知增强免疫反应的细胞因子，包括GM-CSF、IL-2、IL-12、TNF和IFNγ。

疫苗的剂量可以根据一些因素变化，例如疾病状态、个体的年龄、性别和体重，以及抗体在个体中引发期望的反应的能力。可以调节给药方案来提供最佳的治疗反应。例如，可以每天施用几次分开的剂量，或剂量可以如治疗情况的需求所指示的成比例降低或提高。取决于环境，疫苗的剂量也可以被改变来提供最佳的预防性剂量反应

本发明的疫苗可以被配制并作为疫苗通过口服、皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的和阴道内的、或任何其他标准的免疫途径来导入。

在本发明疫苗的配制中，润湿剂、乳化剂和润滑剂例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包被剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂可以存在于配制的试剂中。

本发明组合物可以适合于口服、鼻部、局部(包括颊的和舌下的)、直肠、阴道、气雾剂和/或肠胃外的施用。制剂可以方便地以单位剂量形式存在，可以通过药学领域任何公知的方法来制备。与载体材料组合产生单剂量的组合物的数量可以取决于治疗的受试者和施用的特定模式而变化。

制备这些制剂的方法包括使本发明的组合物与载体和任选的一种或多种附加成分结合。一般地，通过均一地和紧密地使试剂与液体载体或细碎的固体载体、或这两者结合，然后如有必要，使产物成形，来制备制剂。

适合于口服施用的制剂可以是胶囊、扁囊剂、药丸、片剂、锭剂(使用调味的基质，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)、粉末、微粒，或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)，各自含有预定数量的本发明组合物作为活性成分。本发明的组合物也可以作为大丸剂、舔剂或糊剂来施用。

在用于口服施用的固体剂型中(胶囊、片剂、药丸、糖衣丸、粉未、微粒等等)，本发明组合物与一种或多种药学上可接受的载体，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或任何以下的混合：(1)填料或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(3)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯树胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂；例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如乙酰基醇类和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和班脱土；(9)润滑剂，这种滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，和其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，组合物还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以用作软和硬填充胶囊中的填料，使用这样的赋形剂如乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等等。

片剂可以通过压缩或模压，任选的与一种或多种配合剂来制成。压缩的片剂可以使用粘合剂(例如，明胶或羟基丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟基乙酸钠或交联的羧甲基纤维素钠盐)、表面活性剂或分散剂来制备。模压的片剂可以通过在适合的机器中模压使用惰性液体稀释剂湿润的本发明组合物的混合物来制成。片剂和其他固体剂型，例如糖衣丸、胶囊、丸剂以及微粒，可以任选的被核心化或使用包被和壳制备，例如肠溶衣和药物制剂领域中公知的其他包被。

用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除了本发明组合物之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂以及乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是，棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻以及芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇类、聚乙二醇以及山梨聚醇的脂肪酸酯，和其混合物。

除了本发明组合物之外，悬浮液可以含有悬浮剂，例如，乙氧基异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯，微晶纤维素、氧氢氧化铝、斑脱土、琼脂和黄芪胶，以及其混合物。

用于直肠或阴道施用的制剂可以作为栓剂存在，其可以通过混合本发明组合物与一种或多种适合的无刺激性赋形剂或载体来制备，包括例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸，其在室温下是固体的但在体温下是液体的，并因而在体腔中融化并释放活性试剂。适合于阴道施用的制剂还包括子宫栓、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂，含有本领域已知合适的这样的载体。

用于本发明组合物的穿表皮施用的剂型包括粉未、喷雾、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗液、凝胶剂、溶液、贴片和吸入剂。活性成分可以在无菌条件下与药学上可接受的载体、以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲液或推进剂混合。

除了本发明组合物之外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油剂、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、斑脱土、硅酸、滑石粉和氧化锌，或其混合物。

除了本发明组合物之外，粉未和喷雾可以含有赋形剂，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉未，或这些物质的混合物。喷雾可以另外含有惯用的推进剂，例如氯氟烃类以及挥发性未被取代的烃类，例如丁烷和丙烷。

做为选择本发明的组合物可以通过气雾剂施用。这伴随着制备含有化合物的水性气雾剂、脂质体制备物或固体颗粒。可以使用非水性(例如，碳氟化合物推进剂)悬浮液。可以使用声波喷雾器，因为它们将试剂对剪切的暴露最小化，这可以引起本发明组合物中含有的化合物的降解。

通常，水性气雾剂通过将本发明组合物的水溶液或悬浮液与常规的药学上可接受的载体和稳定剂配制来制备。载体和稳定剂随着特定本发明组合物的需求而变化，但一般包括非离子表面活性剂(Tweens、Pluronics或聚乙二醇)、无毒的蛋白样血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸例如甘氨酸、缓冲液、盐、糖类或糖醇。气雾剂一般从等渗溶液制备。

此外，疫苗可以作为针剂胃肠外地施用(静脉内的、肌肉内的或皮下的)。本发明的疫苗组合物任选的可以含有一种或多种佐剂。可以使用任何适合的佐剂，例如CpG聚合物、氢氧化铝、磷酸铝、植物和动物油，等等，佐剂的数量取决于采用的特定佐剂的性质。此外，抗感染的疫苗组合物还可以含有至少一种稳定剂，例如碳水化物，如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖，和蛋白质，例如白蛋白、酪蛋白，和缓冲液，例如碱金属磷酸盐等等。

适合于肠胃外施用的本发明的药物组合物保护本发明组合物，和一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳剂，或可以在即将使用之前恢复成无菌可注射溶液的无菌粉末，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与期望的接受者的血液等渗的溶质，或悬浮或增稠剂。

可以在本发明的药物组合物中采用的适合的水性和非水性载体的实例包括，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)、以及其适合的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如，通过使用包被材料例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒子大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。

进一步的，本发明的非细胞溶解性重组慢病毒可以密封在脂质体中并经由注射施用。商业上可获得的脂质体递送系统可以从Rockville，Md.的Novavax，Inc.，以名称Novasomes^TM来商业上获得。这些脂质体可以特别地配制用于免疫原或抗体递送。在本发明的实施方式中，可以使用含有与这些非磷脂带正电脂质体的表面结合的Isd肽或抗体分子的Novasomes^TM。

5.使用方法

本发明特征还在于在受试者中预防或治疗慢病毒感染的方法，包括向需要的受试者施用有效量的疫苗。

本发明的重组慢病毒可以使用本领域已知的技术来制备。在一个实施方式中，慢病毒可以在适合于慢病毒在宿主中复制和表达的条件下导入宿主细胞。因而，本发明还提供了用重组慢病毒转染的细胞，其中病毒的包膜糖蛋白gp120的天然信号序列被修饰以提供基本上无细胞毒性的病毒或被替换为基本上非细胞溶解性的信号序列。所述细胞优选的是T-淋巴细胞，更优选的是不来源于转化细胞系的T细胞。

因而，本发明还提供了预防或治疗慢病毒感染的方法，包括向需要的动物施用本发明的有效量的灭活重组基本上非细胞溶解性的无毒慢病毒。在此使用的术语“有效量”是指实现期望的效果所必需的有效数量和剂量和时段。在此使用的术语“动物”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，优选的人类。

在优选的实施方式中，本发明提供了预防或治疗慢病毒感染的方法，包括向需要的动物施用有效量的灭活重组基本上非细胞溶解性的无毒慢病毒，其中所述病毒的包膜糖蛋白，优选的gp120的天然信号序列被修饰以提供基本上非细胞溶解性的信号序列，优选的所述病毒通过缺失nef基因变得无毒力。

根据上述实施方式，提供非细胞溶解性NSS的修饰产生所述NSS序列中不超过一个带正电的氨基酸。最优选的，所述动物是人类，优选的所述慢病毒是HIV-1。

在进一步优选的实施方式中，本发明提供了预防或治疗慢病毒感染的方法，包括向需要的动物施用有效量的灭活重组基本上非细胞溶解性的无毒慢病毒，其中所述病毒的包膜糖蛋白，优选的gp120的天然信号序列被替换为基本上非细胞溶解性的信号序列，优选的所述病毒通过缺失nef基因变得无毒力。最优选的，所述动物是人类，优选的所述慢病毒是HIV-1。

本发明进一步包括杀死或破坏目标细胞、优选的癌细胞的方法，包括向所述细胞施用有效量的重组病毒，优选的水泡性口膜炎病毒(VSV)或任何其他载体RNA病毒，其特异于所述目标细胞，优选的含有HIV-1的NSS。

优选的，所述细胞处在有需要的动物中，最优选的在人类中。被感染的或癌性的细胞表达细胞特异性标志，针对所述细胞特异性标志的互补识别位点可以被掺入到适合的载体中，所述载体中掺入了HIV-1的NSS。这种方法已经在水泡性口膜炎病毒(VSV)上采用，所述病毒被工程化以包括CD4和CXCR4的基因，从而将修饰的VSV靶向感染性HIV-1感染的细胞(Schnell，M.J.et al.Cell 90：849-857(1997))。因而，本发明提供了杀死目标细胞，例如癌细胞的方法，包括向有需要的动物施用含有NSS和特异于所述目标细胞的识别位点的重组病毒。在一个实施方式中，所述HIV-1的NSS被掺入到修饰的VSV样载体中，所述载体根据特定的癌细胞表面抗原靶向特定的癌细胞类型，从而为所述VSV提供了在靶向的癌细胞中诱导细胞凋亡的能力。

7.实例

以下非限制性实例是本发明的例证。

实施例1a-重组杆状病毒的构建

早先Li等人(Virology 204：266-278(1994))已经描述了表达人类免疫缺陷病毒-1糖蛋白120的重组杆状病毒的构建，所述糖蛋白120具有其天然信号序列(gp120-NSS)，其天然信号序列被替换为蜜蜂mellatin信号序列(gp120-MSS)，以及其天然信号序列被除去(gp120-ΔS)。早先Bailey等人(Virology 169：323-331(1989))已经描述了表达水泡性口膜炎病毒糖蛋白G(VSV_Ind G)的重组杆状病毒的构建。

以下描述了表达具有HIV-1包膜糖蛋白gp120信号序列的VSV_Ind G蛋白(VSV-G-NSS)的重组杆状病毒的构建。

为了替换VSV-G蛋白的信号序列，本发明人通过使用两个引物的PCR首先构建了VSV-G-ΔS(没有其信号序列的水泡性口膜炎病毒糖蛋白G)：

引物#1 5′-GGC GGA TCC GGA TCA ACG TTC ACC ATA GTT-3′(SEQ ID NO：9)

(5′引物)      BamH    SphI    +1VSV-G

引物#2 5′-GGC GGA TCC TTA CTT TCC AAG TCG-3′(SEQ ID NO：10)

(3′引物)      BamHI   终止密码子

引物#2与VSV-G基因的C-末端互补。

质粒pwKl(其含有VSV_Ind全长G基因，由Dr.Robert R.Wagner，University of Virginia，U.S.A.好意地提供)用作模板，使用Geneamp试剂盒在Perkin Elmer Cetus热循环仪中30个PCR循环(循环是94℃ 1分钟；45℃ 2分钟；72℃ 3分钟)来扩增，20ng pwKl作为模板，1.0μM的每种引物。

所有引物在它们的5′末端具有BamHI位点，从而扩增的VSV-G-ΔS DNA片段可以被插入到质粒pBluescript SK VECTOR(Stratagene)的BamHI位点。选择其中VSV-G-ΔS的5′末端朝向T7启动子的克隆，用SphI+XhoI限制性内切酶消化。

实施例1b-通过聚合酶链式反应(PCR)的位点特异性诱变

为了将位于HIV-1包膜gp120的信号序列中的带正电氨基酸改变成无极性氨基酸，在Perkin-Elmer Cetus热循环仪中通过PCR进行寡核苷酸指导的诱变。设计四个突变寡核苷酸引物来产生HIV-1包膜gp120信号序列的编码区域中的一系列突变(YL-1、YL-2、YL-3和YL-4)：

YL-1 5′-ATT TCG GAT CCT ATA AAT ATG AGA GTC GCG GAG ATA TAT CATCAC-3′(SEQ ID NO：11)

YL-2 5′-ATT TCG GAT CCT ATA AAT ATG ATA GTC AAG GAG AAA TAT CAGCAC TTG TGG ATA TGG GGG TGG ATA TGG GGC-3′(SEQ ID NO：12)

YL-3 5′-ATT TCG GAT CCT ATA AAT ATG AGA GTC GTG GAG ATA TAT CAGCAC TTG TGG ATA TGG GGC-3′(SEQ ID NO：13)

YL-4 5′-ATT TCG GAT CCT ATA AAT ATG ATA GTG GCG GAG ATA TAT CAGCAC TTG TGG ATA TGG GGG TGG ATA TGG GGC-3′(SEQ ID NO：14)

下划线的核苷酸是改变的。

此外，使用与gp 120基因的C-末端互补的通用引物(YL-5：5′-AGCTTG GAT CCT TAT CTT TTT TCT CTC TGC TGC ACC-3′(SEQ ID NO：15))来获得全长突变gp120克隆。使用Geneamp试剂盒通过30个PCR循环(循环是94℃ 1分钟；45℃ 2分钟；72℃ 3分钟)扩增gp120编码序列，20ng HindIII-线性化的pUC19-gp120-NSS作为模板，1.0μM每种突变引物和通用引物。所有引物在它们的5′末端具有BamH1位点，从而扩增的gp120 DNA片段可以插入到pAcYM1的BamH1位点中。通过双脱氧链终止测序证实所有构建的突变体具有预期的突变。

实施例1c-HIV-1信号序列的扩增

env基因的HIV-1信号序列使用以下两个引物通过PCR从pBluescript-gp 120-NSS扩增：

引物#1            5′-AAT ACG ACT CAC TAT-3′(SEQ ID NO：16)

(T7引物)

引物#2            5′-GGC GCA TGC ACT ACA GAT CAT-3′(SEQ ID NO：17)

(与HIV-1信号序列          Sph I

基因的C-末端互补

Sph I)

含有HIV-1信号序列的扩增的DNA片段用XhoI加SphI限制性内切酶消化，插入到XhoI和SphI消化的载体pBluescript VSV-G-ΔS中。产生的质粒称为pBSK VSV-G-NSS，通过DNA测序进一步确认构建体。

VSV-G-NSS的BamHI片段插入到杆状病毒pAcYM1(Li，Y.et al.Virology 204：266-278(1994))的BamHI位点中，通过标准转染方法(Li，Y.et al.Virology 204：266-278(1994))产生表达VSV-G-NSS的重组杆状病毒。

实施例2-重组杆状病毒感染的细胞的显微镜检查

以5PFU/细胞的m.o.i.用重组AcNPV感染SF21细胞，在27℃孵育48小时。通过相差显微镜检查感染的细胞。结果在附图1中显示。这些结果表明，HIV-1 env信号序列快速地杀死细胞。

实施例3-HIV-1 env信号序列对细胞死亡的效果

I.台盼蓝分析：以5PFU/细胞的m.o.i.用重组AcNPV感染SF21细胞1小时，除去接种物，用含有10%胎牛血清(FBS)的完全培养基TNM-FH孵育。在感染后24、48和72小时，用台盼蓝(GIBCO，BRL)染色细胞5分钟。细胞通过显微镜来计数，通过使用以下公式确定死细胞百分比：

II.乳酸脱氢酶释放分析(LDRA)：根据厂家(BoehringerMannheim细胞毒性检测试剂盒)的说明进行LDRA。以5PFU/细胞的m.o.i.用重组AcNPV感染SF21细胞1小时，除去接种物并用完全培养基在27℃孵育，以12小时的间隔收集培养基，在12,000rpm离心1分钟。培养物上清液稀释10倍，在室温下将100μl上清液与100μl反应混合物(细胞毒性检测试剂盒)孵育30分钟。通过使用微板(ELISA)读数器(Bio-Rad 550)测定形成的formazen染料在490nm测量样品的吸光度。台盼蓝和乳酸脱氢酶释放分析的结果分别在附图2A和2B中说明。

总之，具有HIV-1 env天然信号序列的rgp120和VSV-G快得多地杀死细胞。没有HIV-1 env天然信号序列或有mellitin信号序列时细胞存活更长。HIV-1 env天然信号序列对快速的细胞死亡负责。

实施例4-细胞凋亡的检查

I.总DNA提取方法：以5PFU/细胞的m.o.i.用重组AcNPV感染SF21细胞(3×10⁶)1小时。除去接种物，在27℃用完全培养基孵育48小时。细胞在2500rpm团粒化10分钟，用TSE提取(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，1%SDS，添加蛋白酶K到70μg/ml的终浓度)。然后，样品在37℃孵育2小时，在孵育结束时添加NaCl到1M的终浓度，然后样品在4℃孵育过夜。用苯酚：氯仿(1：1)和氯仿提取DNA。最后，添加乙醇(100%)来沉淀DNA(80℃ 15分钟)，通过在12000rpm微离心15分钟来将DNA沉淀团粒化。用70%乙醇洗涤DNA团粒，在具有RNaseA(50μg/ml)的TE(10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA)中重悬浮，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭(N.Chejanovsky and E.Gershburg，Virology 209：519-525(1995))染色。结果在附图3中说明。上述的结果表明，HIV-1 env天然信号序列诱导细胞凋亡。

II.片断化DNA的提取：以5PFU/细胞的m.o.i.用vAc-VSV-G(VSV-G)或vAc-VSV-G-NSS(VSV-G-NSS)感染SF21细胞，在27℃孵育48小时。在感染后48小时，这些细胞(3×10⁶)在2,500rpm团粒化5分钟，在含有10mM Tris HCl(pH 8.0)、10mM EDTA和0.5%Triton X-100的溶液中裂解，在Eppendorf微离心机中在12,000rpm离心25分钟来团化染色体DNA。用0.1mg RNaseA每ml在37℃消化上清液1小时，然后用1mg蛋白酶K每ml在50℃在存在1%SDS的情况下消化2小时，用苯酚和氯仿提取，用冷乙醇沉淀。沉淀物重悬浮在TE中，在含有5μg溴化乙锭每ml的11.5%琼脂糖凝胶上电泳。通过UV透射来显现DNA(Rosario Leopardi and Bernard Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9583-9587(1996))。结果在附图4中示出。

实施例5-含有部分vpu和nef缺失和NSS替换的重组HIV-1的构建

I.含有NSS替换(用MSS、IL-3或任何其他信号序列)和vpu缺失的质粒pNL4-3的构建：感染性HIV-1原病毒DNA克隆，pNL4-3(由Dr.Malcolm Martin通过AIDS Research and Reference Reagent program，Division of AIDS，NIAID，NIH提供；Adachi，et al J.Virol.59：284-291(1986))含有两个独特的限制性内切酶位点：EcoRI(位置5744)和BamHI(位置8466)。env基因编码区在位置6221开始，在位置8785终止。为了用mellitin、IL-3或任何其他分泌蛋白信号序列替换HIV-1env的天然信号序列，从琼脂糖凝胶分离pNL4-3的EcoRI-BamHI片段并亚克隆到pBluescript SK(pBSK)载体的EcoRI-BamHI位点中。从这个产物中，设计四个引物如下

引物#1(正向)：

5′GGC GAA TTC TGC AAC AAC TGC TG-3′(SEQ ID NO：18)

       EcoRI

引物#2(反向)：

5′-GGC CTG CAG TCA TTA GGC ACT GTC TTC TGC TCT TTC-3′(SEQ ID NO：19)

           PstI  终止密码子

引物#3(正向)：

5′-GGC CTG CAG CCA TGG ACA GAA AAA TTG TTG GTC ACA GTC-3′(SEQ IDNO：20)

           PstI   NcoI

引物#4(反向)：

5′-GGC GGA TCC GTT CAC TAA TCG AAT GG-3′(SEQ ID NO：21)

         BamHI

使用pBSK-env作为模板加上引物#1和#2，进行PCR来扩增env区的左侧部分，477bp片段。类似地，采用引物#3和#4来扩增env的右侧部分，2245bp。用EcoRI+PstI消化EcoRI-PstI PCR产物(477bp片段)，而用PstI+BamHI切割PstI-BamHI PCR产物(2245bp片段)。然后，PstI-BamHI消化的2245bp片段克隆到pBSK载体的PstI+BamHI位点中。

在这之后，pBSK-2245用EcoRI+PstI消化并与EcoRI+PstI消化的PCR产物(445bp片段)连接，产生质粒pBSK-env-ΔS。

用PstI+NcoI消化质粒pBSK-env-ΔS，然后与编码MSS信号序列、IL-3信号序列、突变的天然信号序列或任何其他期望的信号序列的合成寡核苷酸连接。这种合成寡核苷酸在5′末端含有PstI位点，在3′末端含有NcoI位点。在连接到载体中之前，这些双链寡核苷酸首先用PstI+NcoI消化。

编码mellitin信号序列的合成寡核苷酸(仅显示正义)：

         PstI

5′-GGC CTG CAG ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCC CTT GTT TTT ATG GTC

GTG TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG GAT CCA TGG GCC-3′(SEQ ID NO：22)

                                      NcoI

编码白细胞介素-3信号序列的合成寡核苷酸(仅显示正义)：

              PstI

5′-GGC CTG CAG ATG CTG CTC CTG CTC CTG ATG CTC TTC CAC GGA CTC

CAA

GCT TCA ATC AGT GGC GAT CCA TGG GCC-3′(SEQ ID NO：23)

                         NcoI

在测序证实正确的修饰之后，用EcoRI+BamHI消化质粒来分离EcoRI-BamHI片段，其被重新克隆到pNL4-3原病毒DNA载体的EcoRI-BamHI位点中。产生的质粒称为pHIV-1-MSS(或pHIV-1-IL3SS)。

此外，在上述构建期间，不仅用MSS或IL-3信号序列替代NSS，还产生部分vpu基因缺失。vpu编码82个氨基酸，它的3′端与HIV-1 env基因的信号序列重叠，约28个氨基酸。然而，它处于不同的读码框中(-1读码框)。研究显示，vpu或nef基因的缺失不改变在黑猩猩PBMC、人类PBMC或在B/T细胞杂交系CEMx174中的病毒复制(James，et.alAIDS Res.Human Retrovirus 10：343-350(1994))。因而，在使用#1和#2引物对env的左侧部分455bp片段的PCR扩增期间，在env基因的起始密码子前添加两个终止密码子，其引起vpu的28个氨基酸的缺失(参见引物#2)。

II.含有nef缺失的质粒的构建：在pNL4-3原病毒DNA克隆中nef基因编码序列开始于位置8787，结束于位置9407。还存在两个独特的限制性内切酶位点：在env基因中的位置8466的BamHI位点，在nef基因中位置8887的XhoI位点。为了产生nef基因缺失，用BamHI和XhoI消化质粒HIV-1 MSS(或IL-3SS)。分离产生的421bpBamHI-XhoI片段，并亚克隆到pBSK载体的Bam HI-XhoI位点。

设计两个引物：

                 BamHI

引物#5：5′-GGC GGA TCC TTA GCA CTT ATC TGG-3′(SEQ ID NO：24)

(正向)

                    XhoI

引物#6：5′GCC CTC GAG TCA TTA ATA CTG CTC CCA CCC-3′(SEQ ID NO：25)

                       终止密码子

根据当前的设计，nef基因编码260个氨基酸。两个终止密码子插入到XhoI位点，其导致nef仅编码33个氨基酸。在PCR扩增和BamHI+XhoI消化之后，这个421bp的PCR DNA片段克隆回BamHI-XhoIpHIV-1-MSS(或IL-3SS)载体。产生的重组质粒含有NSS替换和部分vpu和nef缺失，其被用于疫苗测试。

实施例6-病毒产生的测量

A3.01细胞首先以1×10⁶个细胞/孔播种到6孔平板中，用10μg原病毒DNA转染。在转染后3天，和之后每2天，收获培养物，细胞1:2分开到没有添加补充的未转染细胞的新鲜培养基中。在每个时点集中收获的培养物上清液，通过ELISA显示和分析p24的存在作为病毒产生的指标。用NL4-3^WT或NL4-3^nef-病毒感染的细胞在转染后13天显示了最大的病毒产生，而到转染后17天培养中止时，细胞显示了高水平的CPE和细胞数量的快速降低。然而用NL4-3^SSR或NL4-3^nef-/SSR病毒感染的细胞显示了最小的CPE并且直到转染后29天保持了持续地感染，在这个时点细胞最终屈服于病毒诱导的CPE，培养被终止。在单个收获物中NL4-3^WT或NL4-3^nef-病毒培养物产生了最大1×10²μgp24，而NL4-3^SSR或NL4-3^nef-/SSR病毒产生了超过1×10⁶μg p24。结果在附图6中示出。

实施例7-测量感染性

在原病毒DNA转染之后，每2天分离细胞，收集培养物上清液的样品，通过p24 ELISA分析来监视病毒复制。为了评定产生的病毒颗粒的感染性，在A3.01和H9细胞中在转染后8天通过MAGI分析进一步分析样品，结果被标准化来代表每ng p24蛋白中存在的感染性病毒颗粒的数量。如上所示，Env信号序列替换突变体(NL4-3^SSR)和组合nef缺失的/env信号序列替换突变(NL4-3^nef-/SSR)都具有明显降低的感染性，替换突变体具有野生型病毒(NL4-3^WT)约1/2到1/3的感染性，组合突变展现了与野生型相比多达1/50的感染性降低。结果在附图7中显示。

实施例8-细胞病变效果的诱导

以3的感染复数用每种指明的病毒感染H9细胞。容许感染进行，每2天1：2分开培养物。在感染后6天，通过光学显微镜检查细胞，观察细胞病变效果(CPE)。参见附图8。如所示，用NL4-3^WT或NL4-3^nef-病毒(两者都含有天然的Env信号序列)感染的H9细胞展现了CPE的快速发作，包括细胞死亡和大的合胞体的形成(黑色箭头)。相比之下，用NL4-3^SSR或NL4-3^nef-/SSR病毒(其含有mellitin信号序列代替天然的Env信号序列)感染的细胞显示了很少的CPE病征，尽管有活跃的HIV复制(通过HIV-1 p24 ELISA测量的；未显示)。

实施例9-gag-NE嵌合基因的构建

我们使用来自所有主要HIV-1分化体(clade)的V3和C3序列的选择构建了嵌合的gag基因。我们假定，针对这多个线性表位产生的抗体将能够不仅与原始的V3区、而且与任何微小的变体相互作用，所述变体可能通过天然感染产生，或存在于HIV中、在整个群体中天然传播的那些。gp120和Gag蛋白的V3区域都含有中和表位(NE)以及细胞毒T-淋巴细胞表位(TCE)。这些表位能够作为免疫原独立地起作用。我们连接了多个V3环序列到HIV-2gag序列上，来提供用于表达的大抗原和形成病毒样颗粒(VLP)以提高诱导细胞毒效应物的可能性。我们连接多个V3表位的策略在附图9a和9b中说明。

通过将gag-V3和gag-TCE嵌合基因插入到Ad5的E1区域中，我们构建了复制缺陷的重组人类腺病毒5(rAd)。这些重组Ad5在组成性表达E1蛋白的人类2P3细胞中扩增(参见实施例11)。

中和抗体已经显示了不仅针对V3结构域，还针对HIV-1的其他区域(Luo，et al.，Virology 179：874，1990)。有趣地，不同的病毒分离物的交叉中和分析表明，保守的中和模式可能跨越HIV-1的亚型存在。例如，来自一种类型的HIV-1感染的个体的某些血清中和所有的HIV-1亚型，不论它们的分化体如何。这种中和的展现是保守的中和表位，例如存在于gp41中的那些(Muster，et al.，J.Virol.67：6642，1993)，或与gp120中的CD4结合位点相应的那些表位(Thali，M.et al.，J.Virol.66：5635，1992)的结果。与HIV-1变体的出现有关的差异选择压力与长期的无进展(non-progression)相关。因而，gp120的这些C3区域的存在可能提供额外的保护(Wang，W-K.Et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.93：6693，1996)。参见附图9c。

实施例10-gag-TCE嵌合基因的构建

HIV特异性CTL被认为在感染HIV的人中产生免疫学选择压力。然而，关于这种约束对于体内病毒序列变异的影响仅有很少的数据是可获得的。我们选择了HIV-1gp120、gp41、Nef、RT和Rev的主要的细胞毒T细胞表位(TCE)，将它们连接到HIV-1gag基因，来产生嵌合的gag-TCE基因，其可以由重组腺病毒表达。附图10a显示了使用来自HIV-1_HXB2毒株的gp 120的两种不同的TCE、来自Nef的两种不同的TCE和来自gp41的一种TCE构建HIV-1gag基因。此外，我们还构建了另一种HIV-1 gag-TCE嵌合基因，其将表达来自HIV-1^HXB2的RT、Tat和Rev蛋白的TCE。我们构建了携带这些HIV-2gag-NE和HIV-1gag-TCE的复制缺陷重组人类腺病毒(rAd)作为HIV/AIDS疫苗的一部分。

实施例11-产生含有HIV-2 gag-NE和HIV-1 gag-TCE的复制缺陷重组腺病毒作为HIV/AIDS疫苗的一部分

我们修饰了基因盒的末端DNA序列，所述基因盒含有侧翼是BamHI限制性位点的HIV-2 gag-NE和HIV-1 gag-TCE的编码序列，以将这些基因插入腺病毒载体中。早先已经描述了用于操作腺病毒载体的一般方案(Graham，et al.，J.Gen.Virol.36：59，1977)。我们使用了简化的系统用于根据Graham和同事(He，T.-C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：2509，1998)来产生重组腺病毒。这种新技术需要最小的酶操作，在细菌中而不是真核细胞中使用同源重组。我们采用了这种新策略，并且发现它是生产重组腺病毒的极其有效的系统。通过使用我们早先采用的技术，已经构建了复制缺陷重组腺病毒载体，其在人类腺病毒(Ad5)的E1a区域内具有HIV-2 gag-NE或HIV-1 gag-TCE嵌合基因的插入物。我们成功地产生了具有HIV-2 gag-NE的三种复制缺陷重组腺病毒，和具有HIV-1 gag-TCE的两种复制缺陷重组腺病毒。HIV-2gag-NE嵌合蛋白的表达和Gag-NE病毒样颗粒的形成已经使用抗Gag抗体通过免疫沉淀和Western印迹分析来鉴定(Luo，L，Li，Y，and KangC.Y.Budding and secretion of HIV Gag-Env virus-like particles fromrecombinant human adenovirus infected cells，Virus Research 92：75-82，2003)。

在人类腺病毒5的E1a区域中携带HIV-2 gag-NE或HIV-1 gag-TCE嵌合基因的复制缺陷重组腺病毒在组成性表达E1a蛋白的293细胞中增殖。这些重组腺病毒在293细胞中很好地复制，在CsCl纯化后很容易制备10¹²个噬斑形成单位(PFU)。

实施例12-用于新的激发-强化HIV-1/AIDS疫苗的测试的预言性接种方案

这个疫苗研究的测试受试者将是18个雄性恒河猴(Macacamulatto)。

I.抗原和佐剂：使用以下抗原和佐剂。

1.完整钝化病毒抗原：产生遗传修饰的HIV-1分化体B(NL4-3^nef-/SSR)，纯化并经历AT-2钝化。对于免疫，指定的动物将接受悬浮在500μl PBS中的500μg抗原(用500μl CpG寡脱氧核苷酸(ODN)佐剂配制)。

2.复制缺陷重组腺病毒(rAd)：制备并纯化5个重组腺病毒载体的高滴度储备物，其表达与多种选择的中和和T细胞表位相连的HIV-1gag基因。为了免疫，指定的动物将接受500μl总体积(用500μl佐剂配制)的1×10⁹pfu的每种重组病毒(1×10⁹pfu×5个重组病毒=5×10⁹pfu)。

3.CpG寡脱氧核苷酸(ODN)佐剂：购买序列5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′(SEQ ID NO：26；进行改变的序列)的纯化的硫代磷酯寡脱氧核苷酸。500μg的这种ODN悬浮在总体积500μl的PBS中用于与如上所述的每种抗原配制。

II.免疫：动物分成3个组(称为组1-3)，每个组含有总共6只恒河猴。每组动物的免疫程序如下列出，包括接种时间、抗原/佐剂的类型和数量、以及肌肉内(i.m.)免疫的途径。

组1

0周-500μl完整的钝化病毒抗原与500μl CpG佐剂-i.m.

4周-500μl rAd抗原与500μl CpG佐剂-i.m.

8周-500μl rAd抗原与500μl CpG佐剂-i.m.

16周-500μl rAd抗原与500μl CpG佐剂-i.m.

组2

0周-500μl rAd抗原与500μl CpG佐剂-i.m.

4周-500μl rAd抗原与500μl CpG佐剂-i.m.

8周-500μl rAd抗原与500μl CpG佐剂-i.m.

16周-500μl完整的钝化病毒抗原与500μl CpG佐剂-i.m.

组3

组3将作为用于这些实验的未免疫对照组。

III.攻击：免疫后24周，所有动物用100TCID₅₀的SHIV^SF162-P4和100TCID₅₀的SHIV^89.6通过静脉内注射来攻击。

IV.采样：在免疫后(p.i.)-1、0、4、6、8、10、16和20周采集血液并分析免疫反应。在攻击后(p.c.)1、2和5周和此后每个月，采集血液并保存用于病毒载荷和免疫反应研究。在p.c24周，处死动物，收集血液和组织用于病毒载荷和中和抗体测定。

V. 免疫反应分析：为了评定通过两种疫苗接种产生的免疫反应，在攻击期间对所有的样品测试以下的：

1.抗HIV抗体产生：通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血清样品的抗HIV-1 Env和Gag抗体水平。

2.HIV特异性T细胞增殖：使用完整的钝化HIV-1作为抗原性刺激剂测量HIV-1特异性T细胞增殖反应。

3.细胞毒T-淋巴细胞分析：将评定抗原刺激的效应物PBMC的HIV-1/SHIV特异性细胞毒活性。

VI.疫苗接种的保护效果分析：为了评定疫苗接种方案对病毒攻击的保护的能力，p.c采集的所有样品将进一步测试以下的：

1.病毒载荷(vRNA)：通过定量的分支DNA分析来分析血浆样品的vRNA水平。

2.CD4:CD8 T细胞比例：监视p.c.的CD4和CD8T细胞水平作为针对sAIDS的潜在标志。

3.抗体中和分析：热钝化的血清样品将测试它们抑制攻击病毒进入sMAGI报告细胞系的能力。

4.IFN-γ分泌：经由ELISPOT分析来测定IFN-γ分泌细胞的数量。

5.细胞因子产生：经由逆转录酶实时PCR来监视细胞因子mRNA表达的诱导。评定细胞因子IFN-α、IFN-β、Mx、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12、IL-6、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和MDC的存在。

8.等同物

虽然参考当前被认为的优选实施例描述了本发明，要理解的是本发明不限于公开的实施例。相反，本发明意图覆盖各种修饰和等效的方案，其包括在附随的权利要求的精神和范围内。

9.通过引用合并

引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用将其全部内容并入，其程度与特定地、单独地指示通过引用来合并每个单独的出版物、专利或专利申请的全部内容相同。

Claims (7)

1.经分离的肽，其中，所述的经分离的肽选自SEQ ID NO：3-6所示的序列。

2.具有权利要求1所述的肽的重组慢病毒。

3.权利要求2的重组慢病毒，其中，所述的重组慢病毒通过缺失足够数量的nef基因变为无毒力。

4.权利要求2的重组慢病毒，其中，所述的重组慢病毒是重组人免疫缺陷病毒。

5.权利要求2的重组慢病毒，其中，所述的重组人免疫缺陷病毒是HIV-1。

6.权利要求2的重组慢病毒，其中，所述的重组慢病毒是通过缺失足够数量的nef基因变为无毒力的HIV-1。

7.权利要求2的重组慢病毒，其中，所述的重组慢病毒是完整的重组慢病毒。

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