CN111214663A

CN111214663A - Tmed2在作为埃博拉病毒病治疗靶点中的应用

Info

Publication number: CN111214663A
Application number: CN202010150317.9A
Authority: CN
Inventors: 曹诚; 杨伟洪; 高婷; 靳彦文; 朱林; 刘曜宁
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2040-03-06
Also published as: CN111214663B

Abstract

本发明公开了TMED2在作为埃博拉病毒病治疗靶点中的应用。本发明提供了TMED2作为靶点在如下任一中的应用：治疗埃博拉病毒感染、治疗埃博拉病毒病、抑制埃博拉病毒复制、抑制埃博拉病毒在细胞中增殖、抑制埃博拉病毒包涵体形成。TMED2可作为靶点利用TMED2抑制剂可作为埃博拉病毒病防治的候选药物用于埃博拉病毒感染的治疗。本发明对感染埃博拉病毒的治疗具有重大应用价值。

Description

TMED2在作为埃博拉病毒病治疗靶点中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及TMED2在作为埃博拉病毒病治疗靶点中的应用。

背景技术

埃博拉病毒病(以往称作埃博拉出血热)是由埃博拉病毒感染导致的一种严重且往往致命的疾病，病死率从25％到90％不等。埃博拉病毒被认为是病毒性出血热的原型病原体，病毒通过野生动物传到人，并在人际间传播蔓延。2014-2016年在西非出现的埃博拉疫情是有史以来发生的最大且最复杂的疫情，2018年，刚果再次爆发埃博拉疫情，截至2019年11月26日，共报告发生了3304例埃博拉病例，包括3186例确诊病例和118例可能病例，其中2199例死亡(总病死率约为67％)。虽然埃博拉病毒感染存在地域局限性，但伴随人类活动范围扩大及跨国交流日益频繁，大大增加了自然或人为感染埃博拉病毒的几率，加上治疗措施和疫苗接种选择的缺乏，使埃博拉病毒成为致命的生物威胁病原体。为保障人类健康和安全，提高对该病毒感染的防控能力，储备针对埃博拉病毒的防治药物具有重要意义。

埃博拉病毒是丝状病毒科成员，为单股负链、不分节段的RNA病毒，外有包膜，基因组大小约19kb，由七个基因组成，从3'头部到5'尾部依次为3’-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’，其中NP为病毒的核衣壳蛋白，VP30和VP35为病毒结构蛋白，GP为I型跨膜蛋白，VP24为小型膜蛋白，VP40是毒粒内膜相关的基质蛋白，L是一种RNA聚合酶。其中VP35作为聚合酶辅因子，在RNA的合成中起到了不可替代的作用，还可以抑制I型干扰素的产生及参与病毒包涵体的形成，最近有研究表明VP35具有NTPase活性，并进一步发现其还具有依赖于ATP的类解旋酶活性，此外，具有突变VP35的埃博拉病毒诱导的免疫反应足以保护非人类灵长类动物免受野生型埃博拉病毒的感染，是一种潜在的药物靶点。

包涵体是细胞感染病毒后胞浆或核中出现的特殊结构，常用于病毒病的诊断。埃博拉病毒包涵体在光学显微镜下可见，电子致密，多为圆形、卵圆形或不定型，位于胞质中。在埃博拉病毒感染的细胞中，病毒包涵体作为病毒复制和组装的位点，存储大量的病毒及宿主蛋白，从而促进病毒复制、翻译以及病毒粒子在细胞内与细胞间的运输。

TMED2，又称P24A、p24beta1，是p24蛋白家族的主要成员，主要位于顺式高尔基体和内质网膜以及中间隔室中。TMED2既作为货物受体又作为外壳蛋白受体，参与转运小泡的生物发生以及随后的内质网与高尔基体之间以及高尔基体内部的蛋白质运输，有研究表明蛋白酶激活受体PAR1、PAR2以及GPI锚定蛋白等都需要TMED2进行转运。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用于埃博拉病毒病治疗的策略，即TMED2在作为埃博拉病毒病治疗靶点中的应用。

第一方面，本发明要求保护TMED2作为靶点在如下任一中的应用：

(A1)制备用于治疗埃博拉病毒感染的产品，或治疗埃博拉病毒感染；

(A2)制备用于治疗埃博拉病毒病的产品，或治疗埃博拉病毒病；

(A3)制备用于抑制埃博拉病毒复制的产品，或抑制埃博拉病毒复制；

(A4)制备用于抑制埃博拉病毒在细胞中增殖的产品，或抑制埃博拉病毒在细胞中增殖；

(A5)制备用于抑制埃博拉病毒包涵体形成的产品，或抑制埃博拉病毒包涵体形成。

第二方面，本发明要求保护TMED2作为靶点在如下任一中的应用：

(B1)筛选用于治疗和/或预防由于埃博拉病毒感染所致疾病的候选药物；

(B2)筛选用于治疗和/或预防埃博拉病毒病的候选药物。

第三方面，本发明要求保护能够抑制TMED2表达的物质在如下任一中的应用：

其中，所述能够抑制TMED2表达的物质可为任何能够抑制TMED2表达的物质。

进一步地，所述能够抑制TMED2表达的物质可为敲除TMED2表达的物质或敲低TMED2表达的物质。

更进一步地，所述敲低TMED2表达的物质可为TMED2 siRNA。

在本发明的具体实施方式中，所述TMED2 siRNA为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA。

更进一步地，所述敲除TMED2表达的物质可为用于敲除TMED2表达的基因编辑工具。

在本发明的具体实施方式中，所述基因编辑工具为CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特异性切割的靶序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4。

第四方面，本发明要求保护TMED2在与埃博拉病毒蛋白VP35互作中的应用。

在所述应用中，还可以利用TMED2在与埃博拉病毒蛋白VP35中间的互作作用，以所述TMED2检测所述埃博拉病毒蛋白VP35，或以所述TMED2检测埃博拉病毒。

在上述各方面中，所述TMED2具体可为SEQ ID No.5所示蛋白质。

本发明通过对埃博拉病毒结构蛋白VP35与宿主蛋白TMED2相互作用及相关分子机制进行研究，发现了TMED2影响病毒复制的分子机制：通过免疫沉淀和免疫印迹实验证实埃博拉病毒蛋白VP35与TMED2存在相互作用，并用活细胞成像技术发现VP35与TMED2在细胞质中共定位，另外本发明在HepG2细胞中使用埃博拉病毒最小基因组感染细胞模型，通过免疫荧光技术发现VP35与TMED2共定位在病毒包涵体，在最小基因组系统中加入TMED2 siRNA干扰TMED2，结果发现病毒包涵体平均面积变小，在TMED2敲除细胞系中可更明显的观察到这种现象。同时发现TMED2 siRNA干扰TMED2抑制埃博拉病毒复制。向HepG2内源性TMED2敲除细胞系TMED2-KO-#1与TMED2-KO-#2转染最小基因组系统相关质粒，发现TMED2敲除细胞系可显著抑制埃博拉病毒在细胞中的复制，在TMED2敲除细胞系中回补外源GFP-TMED2质粒，病毒复制得到一定增加。以上结果提示TMED2可作为靶点利用TMED2抑制剂可作为埃博拉病毒病防治的候选药物用于埃博拉病毒感染的治疗。本发明对感染埃博拉病毒的治疗具有重大应用价值。

附图说明

图1为免疫沉淀及免疫印迹检测VP35与TMED2的相互作用。

图2为活细胞成像技术检测VP35与TMED2在细胞质中共定位。

图3为免疫荧光染色检测VP35与TMED2共定位在包涵体。A为VP35参与病毒包涵体形成；B为VP35与TMED2在病毒包涵体中存在共定位。DAPI表示细胞核染液。

图4为TMED2敲低及敲除影响埃博拉病毒包涵体形成。A为敲低TMED2抑制病毒包涵体形成；B为敲低TMED2使病毒包涵体平均面积减小；C为敲除TMED2显著抑制病毒包涵体形成；D为敲除TMED2显著使病毒包涵体平均面积减小。TMED2(NC)表示阴性对照(由如下两条单链退火形成：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’)；TMED2(Si)表示敲低TMED2；TMED2(WT)表示野生型组细胞；TMED2(KO)表示TMED2基因敲除组细胞。

图5为TMED2敲低及敲除抑制埃博拉病毒样颗粒的增殖。A为qRT-PCR检测TMED2siRNA的干扰效率；B为敲低TMED2抑制p0期细胞中病毒样颗粒的复制；C为敲低TMED2抑制p1期细胞中病毒样颗粒的复制；D为免疫印迹检测TMED2-KO效率；E为敲除TMED2抑制p1期细胞中病毒样颗粒的复制；F为在p1期TMED2-KO细胞中回补外源质粒pEGFP-TMED2，病毒样颗粒复制增加(#1表示TMED2-KO-1号细胞株；#2表示TMED2-KO-2号细胞株)。图中，ControlsiRNA由如下两条单链退火形成：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的TMED2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

1、细胞株与质粒

人胚肾细胞株(HEK293)、人肝癌细胞株(HepG2)均为本研究室保存。质粒pEGFP-TMED2、pcDNA3.0-Flag-VP35、pcDNA3.0-mcherry-VP35均为本研究室构建。

以pEGFP-C1为载体构建pEGFP-TMED2表达质粒，以pcDNA3.0为载体构建pcDNA3.0-Flag-VP35表达质粒，以pcDNA3.0-mcherry为载体构建pcDNA3.0-mcherry-VP35表达质粒。

以pEGFP-TMED2表达质粒构建为例，阐述相关实验步骤。如下：在数据库NCBI上查找TMED2基因序列，使用primer5设计出TMED2扩增引物，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成；PCR扩增目的片段，电泳检测后，切胶获取目的片段；酶切目的片段和质粒空载(37℃酶切过夜或者4h)，然后将酶切产物回收；目的基因与载体的连接(16℃1h)；对连接产物进行转化涂板(37℃培养过夜)；次日晚挑取单克隆，小试管揺过夜；对菌液进行质粒抽提，对抽提出的质粒进行酶切鉴定(一般酶切1μg质粒)；如有阳性结果，则送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序；对序列正确的质粒扩大培养，抽提质粒后转染至细胞中鉴定其蛋白表达情况。(pcDNA3.0-Flag-VP35及pcDNA3.0-mcherry-VP35表达质粒构建与上述步骤一致)

本发明所需引物(酶切位点以下划线标注)、反应体系和程序如下：

PCR反应扩增目的片段(TMED2)引物：

TMED2-F：5’-accaagatgggcctcatc-3’；

TMED2-R：5’-ttaaacaactctccggac-3’；

模板：人肝癌细胞株(HepG2)cDNA。

PCR反应扩增目的片段(VP35)引物：

VP35-F：5’-aacgacatcttctgtgat-3’；

VP35-R：5’-tcaaattttgagtccaag-3’；

模板：pCAGGS-VP35质粒。

pEGFP-TMED2表达质粒构建引物：

TMED2-F(XhoI)：5’-CCCTCGAGCTATGGTGACGCTTGCTGAACTGC-3’；

TMED2-R(EcoRI)：5’-CCGAATTCTTAAACAACTCTCCGGACTTCAAA-3’。

pcDNA3.0-Flag-VP35表达质粒构建引物：

VP35-F(BamHI)：5’-CCGGATCCaacgacatcttctgtgatattgag-3’；

VP35-R(EcoRI)：5’-CCGAATTCtcaCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCaattttgagtccaag-3’。

pcDNA3.0-mechrry-VP35表达质粒构建引物：

VP35-F(BamHI)：5’-CCGGATCCaacgacatcttctgtgat-3’；

VP35-R(EcoRI)：5’-CCGAATTCtcaaattttgagtccaag-3’。

PCR反应扩增目的片段反应体系：

PCR反应扩增目的片段反应程序：

95℃2分钟，(98℃10秒，58℃30秒，68℃30秒，35个循环)，72℃10分钟。

酶切体系配制：

连接体系配制：

埃博拉病毒最小基因组系统相关质粒(pCAGGS-NP、pCAGGS-VP35、pCAGGS-VP30、pCAGGS-L、p4cis-vRNA-RLuc、pCAGGS-T7、pCAGGS-Tim1)为军事医学研究院毒物药物研究所钟武研究员惠赠。均记载于“Hoenen T,et al.Modeling The Lifecycle Of Ebola VirusUnder Biosafety Level 2Conditions With Virus-like Particles ContainingTetracistronic Minigenomes.J Vis Exp,2014”一文中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

2、分子生物学试剂与抗体

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4连接酶缓冲液、T4PNK、CutSmart Buffer(10X)为NEB公司产品；DNA Marker2000、DNA Marker10000、质粒小提试剂盒、DH5α感受态细胞为天根生化科技有限公司产品；氨苄青霉素、卡那霉素为Sigma公司产品；PCR MIX为北京擎科新业生物技术有限公司产品；pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)质粒为addgene公司产品；KOD-Plus-Neo高保真PCR酶、cDNA反转录试剂盒、qPCR试剂盒为TOYOBO公司产品；DNA胶回收试剂盒、细胞RNA提取试剂盒、基因组提取试剂盒为QIAGEN公司产品；Renilla-Glo^TM荧光素酶检测试剂盒为Promega公司产品；转染试剂Lipofectamine3000、ViaFect^TM及腔室盖玻片培养系统为Thermo公司产品；蛋白酶抑制剂Cocktail为罗氏公司产品；DMEM培养基、opti-MEM培养基、胰酶、1XPBS、嘌呤霉素均为GIBCO公司产品；ECL化学发光显色液为GE公司产品。

HRP标记的anti-Flag抗体、HRP标记的anti-GFP抗体、anti-TMED2抗体均为Sigma公司产品；anti-VP35抗体为Creative Diagnostics公司产品；TRITC及FITC标记的荧光染料抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；anti-Flag琼脂糖珠为Sigma公司产品。

实施例1、免疫沉淀与免疫印迹检测VP35与TMED2的相互作用

在HEK293细胞中共转染pcDNA3.0-Flag-VP35和pEGFP-TMED2质粒，根据需要将细胞传代到细胞培养皿中，将培养皿转入CO₂培养箱中培养，待接种细胞生长至70～90％汇合度时进行转染，使用Thermo公司Lipofectamine^TM3000转染试剂，按照说明书进行质粒转染：以质粒：P3000＝1:2的比例将1μg pcDNA3.0-Flag-VP35质粒和1μg pEGFP-TMED2质粒及4μlP3000^TM加入100μl Opti-MEM^TM培养基中进行稀释，制备DNA预混液；按质粒：Lipo3000＝1:3将6μl Lipofectamine^TM3000加入到100μl Opti-MEM^TM培养基中进行稀释，在已稀释的Lipofectamine^TM3000试剂中加入稀释的DNA预混液，混匀后室温孵育10～15min，之后将DNA-脂质复合物加入至细胞中。

转染36～48h后收集细胞，以6cm培养皿培养的细胞为例，弃去培养上清，用5ml预冷的1×PBS清洗细胞2次，每皿加入1.5ml PBS，用细胞刮将细胞刮下，吹打均匀后转移至1.5ml离心管中，4℃、1000g离心3min后收集细胞。加入200μl细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl，含EDTA蛋白酶抑制剂1片/50ml，1％NP40)冰上裂解25～30min后，4℃、12000rpm离心10min；将上清转移至新的1.5ml离心管中，用酶标仪检测各管样品蛋白含量，用细胞裂解液调平后加入10μl偶联anti-Flag抗体的琼脂糖珠，4℃旋转孵育2～3h进行免疫共沉淀，之后4℃、1000g离心5min，使用1ml不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液洗涤珠子3次，离心去上清后加入40～60μL 1×SDS上样缓冲液，100℃煮样5min，4℃、1000g离心5min，最后取适量上清样品进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹。

取10μL样品加入到SDS-PAGE胶孔中进行电泳，初始电泳电压设置为80V，待溴酚兰进入分离胶时将电泳电压调整到120V，待溴酚蓝迁移至分离胶底部时，停止电泳，准备进行转膜操作。将PVDF膜用甲醇激活20～30s，然后将PVDF膜和滤纸一起浸泡在1×转膜缓冲液(Tris-HCl 24mM，甘氨酸5mM，20％甲醇)中15～20min。电泳结束后从下往上按照滤纸-PVDF膜-SDS胶-滤纸的顺序放置在半干转膜仪上，18V转膜约1～2小时。转膜完成后将PVDF膜用含5％脱脂奶粉的1×TBST封闭液室温封闭1h，之后用1×TBST洗涤3次，每次5min；加入HRP标记的anti-Flag抗体、HRP标记的anti-GFP抗体常温孵育PVDF膜1h，洗涤3次后进行ECL显影分析。

结果如图1所示，通过免疫沉淀和免疫印迹实验证实埃博拉病毒蛋白VP35与TMED2存在相互作用。

实施例2、活细胞成像检测VP35与TMED2的共定位

提前一天将HepG细胞接种到腔室盖玻片培养系统中，待到细胞生长至合适密度时，转染pcDNA3.0-mcherry-VP35质粒、pEGFP-TMED2质粒(操作方法见细胞转染)，转染24h后，将腔室盖玻片培养系统置于活细胞成像仪下观察并拍照。

结果如图2所示，活细胞成像技术发现VP35与TMED2在细胞质中共定位。

实施例3、免疫荧光染色检测VP35与TMED2共定位在包涵体

提前一天将HepG细胞接种到含无菌盖玻片的6孔板中，待细胞生长至合适密度时，转染埃博拉病毒最小基因组质粒：pCAGGS-NP(125ng)、pCAGGS-VP35(125ng)、pCAGGS-VP30(75ng)、pCAGGS-L(1000ng)、p4cis-vRNA-Rluc(250ng)与pCAGGS-T7(250ng)(操作方法见细胞转染)，转染48h后，将孔内培养基吸出，用处于常温的PBS洗涤细胞3次，最后一次吸尽残余PBS；每孔加入2ml 4％多聚甲醛室温条件下固定20～30min，吸尽多聚甲醛，PBS洗涤细胞3次；每孔加入2ml 0.3％Triton X-100(用1×PBS配制)在室温条件下穿孔15～20min，吸尽Triton X-100，PBS洗涤细胞3次；每孔加入2ml封闭液(含5％山羊血清或含1％BSA的1×PBS)，37℃封闭30min或者室温封闭1h，吸尽封闭液，PBS洗涤细胞3次；用封闭液1:50稀释anti-VP35与anti-TMED2抗体，每孔加入15～20μl稀释后的一抗，用封口膜覆盖盖玻片，室温孵育1h或4℃孵育过夜，吸尽一抗，PBS洗涤细胞10min，重复3次；用封闭液1:50稀释TRITC及FITC标记的荧光染料二抗(此步骤及后续操作需避光操作)，每孔加入15～20μl稀释后的二抗，用封口膜覆盖盖玻片，室温孵育1h，吸尽二抗，PBS洗涤细胞10min，重复3次；在载玻片上滴加10μl含有80％甘油的1μg/ml DAPI核染料，将细胞爬片取出，用吸水纸吸干后小心倒扣在载玻片上，周围需用指甲油封片，完成封片后，即可置于激光共聚焦显微镜63倍油镜下观察并拍照。

结果如图3所示，在HepG2细胞中使用埃博拉病毒最小基因组感染细胞模型，通过免疫荧光技术发现VP35与TMED2共定位在病毒包涵体。

实施例4、TMED2敲低及敲除影响埃博拉病毒包涵体形成

提前一天将HepG细胞接种到含无菌盖玻片的6孔板中，待细胞生长至合适密度时，转染埃博拉病毒最小基因组质粒：pCAGGS-NP(125ng)、pCAGGS-VP35(125ng)、pCAGGS-VP30(75ng)、pCAGGS-L(1000ng)、p4cis-vRNA-Rluc(250ng)与pCAGGS-T7(250ng)(操作方法见细胞转染)，转染48h后，将孔内培养基吸出，进行免疫荧光检测(操作方法见实施例3)。记录免疫荧光结果，并用image软件进行包涵体面积计算。

包涵体是细胞感染病毒后胞浆或核中出现的特殊结构，埃博拉病毒包涵体在光学显微镜下可见，电子致密，有文章报道称VP35可参与埃博拉病毒包涵体形成，本研究在感染病毒组细胞中通过免疫荧光标记VP35蛋白进而指示病毒包涵体，多为圆形、卵圆形或不定型，位于胞质中。文章名称及信息如下：《Inclusion bodies are a site of ebolavirusreplication》J Virol.2012Nov；86(21):11779-88.doi:10.1128/JVI.01525-12.Epub2012Aug 22.

siRNA干扰实验：

1、构建TMED2 siRNA：

其中，TMED2 siRNA由如下两条单链退火形成：

5’-CCAGCGGGAAGUACACAUUTT-3’(SEQ ID No.1)；

5’-AATGTGTACUUCCCGCTGGTT-3’(SEQ ID No.2)。

委托苏州吉玛基因股份有限公司合成；提前一天将目的细胞接种到6孔板中，待细胞生长至合适密度时，转染实验需求相关质粒(操作方法见细胞转染)，如不需转染质粒，细胞可直接进行siRNA干扰实验(本研究直接转染siRNA)；目的细胞转染6-8h后在100μlopti-MEM无血清培养基中依次加入10μl siRNA及10μl ViaFect^TM试剂，混合均匀，室温放置10min，转染siRNA，转染36～48h后收集细胞，提取RNA进行逆转录反应实验与实时荧光定量PCR。

2、RNA提取实验

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取细胞RNA样品，并严格按照说明书进行操作。

(1)准备好细胞样品，1XPBS清洗后转移至1.5ml离心管中。(2)向离心管中加入350μl RLT，吹打均匀。(3)向离心管中加入350μl 70％乙醇，吹打均匀。(4)将离心管中液体转移至RNA吸附柱RNeasy spin colum中，大于8000g离心15s，弃液体。(5)向RNeasy spincolum中加入700μlRW1，大于8000g离心15s，弃液体。(6)向RNeasy spin colum中加入500μlRPE，大于8000g离心15s，弃液体。(7)重复步骤(6)。(8)12000rpm空离5min，将RNeasy spincolum转移至新的无RNA酶的离心管中。(9)向RNeasy spin colum中加入40μl无RNA酶的ddH₂O，12000rpm离心2min，通过分光光度计Nanodrop进行RNA浓度测定。

3、逆转录反应实验

使用反转录试剂盒(TOYOBO)获得cDNA样品，并严格按照说明书进行操作。(1)取上述提取的RNA样品至无RNA酶的PCR管中，将PCR管放入65℃水浴锅变性5min，之后立即将PCR管放在冰上冷却。(2)去除基因组DNA：取新的无RNA酶的PCR管，向PCR管中加入4μl 4XDBMaster Mix，0.5μg RNA样品，并用Nuclease-free water补充至16μl体系，吹打均匀后将PCR管放入37℃水浴锅孵育5min。(3)取8μl上一步反应液至新的无RNA酶的PCR管中，向PCR管中加入2μl 5XRT-Master Mix，吹打均匀。(4)将PCR管放入PCR仪中，并按照以下程序进行逆转录反应：37℃ 15min，50℃ 5min，98℃ 5min，4℃维持。反应完成后即可将样品用于实时荧光定量PCR。

4、实时荧光定量PCR

使用SYBR Green法，并严格按照QRT-PCR说明书(TOYOBO)进行PCR扩增。(1)反应体系的配制：取新的无RNA酶的PCR管，向PCR管中加入1μl cDNA样品，0.4μl上游引物和0.4μl下游引物，10μl 2XSYBR Green Mix，并用ddH2O补至20μl，吹打均匀。(2)将PCR管放入QRT-PCR仪中进行扩增，并以GAPDH作为实验内参。(3)使用2^-△△CT方法分析基因相对表达量，计算siRNA敲低效率。

CRISPR-Cas9技术敲除目的基因

1、sgRNA的构建：通过sgRNA序列在线设计网站(http://crispr.mit.edu/)设计TMED2基因的sgRNA，向评分较高的sgRNA的正义链的5’端添加粘性末端CACCG，反义链的5’端添加粘性末端AAAC，将设计好的序列送往北京诺赛基因组研究中心有限公司进行合成。

2、按照《分子克隆实验指南》(第三版)相关操作，将合成好的sgRNA克隆至pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)质粒中。

3、将重组质粒转染到HepG2细胞中，同时转染空载体pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)作为对照。

4、转染48h后便可进行药物筛选，将培养基更换为含有1μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基，期间培养基颜色变黄即可更换新鲜培养基，直到筛选出单克隆。

5、将单克隆有限稀释至96孔板中，待单克隆细胞生长至足量时提取基因组，扩增带有目的基因的上下游片段(可自行在靶位点前后合适位置设计检测引物)。

6、对第5步初筛的阳性克隆进行测序验证，对于两个等位基因不同敲除的克隆再进行TA克隆后测序验证，序列比对分析基因敲除情况，筛选出想要的单克隆。

7、获得TMED2基因敲除的细胞株后，通过免疫印迹实验验证敲除效率(操作方法见实施例1)，并对敲除效果较好的菌株扩大培养、保存备用。

sgRNA靶向切割序列：

靶序列1：5’-CCTCCGCCACCTCGAAGATG-3’(SEQ ID No.3)。

TMED2-sgRNA-1号：正义链：5’-CACCGCCTCCGCCACCTCGAAGATG-3’；

反义链：5’-AAACCATCTTCGAGGTGGCGGAGGC-3’。

靶序列2：5’-TTCTTTGAGCGGGTCACCTC-3’(SEQ ID No.4)。

TMED2-sgRNA-2号：正义链：5’-CACCGTTCTTTGAGCGGGTCACCTC-3’；

反义链：5’-AAACGAGGTGACCCGCTCAAAGAAC-3’。

sgRNA退火体系配制：

sgRNA退火程序：37℃ 30分钟；95℃ 5分钟；然后保持每一分钟降低5℃，直至温度降为25℃。

TMED2-sgRNA鉴定引物：

TMED2-sgRNA-F1：5’-Atggtgacgcttgctgaactg-3’；

TMED2-sgRNA-R1：5’-caccagaacaagctagaagaa-3’；

TMED2-sgRNA-F2：5’-Atggtgacgcttgctgaactgctg-3’；

TMED2-sgRNA-R2：5’-caccagaacaagctagaagaa-3’；

PCR反应扩增目的片段体系配制：

PCR反应程序：

95℃ 5分钟，(95℃ 30秒，56℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环)，72℃ 10分钟。

最终获得HepG2内源性TMED2敲除细胞系TMED2 KO-#1(针对上述靶序列1所得)与TMED2 KO-#2(针对上述靶序列2所得)。

结果如图4所示，在最小基因组系统中加入TMED2 siRNA干扰TMED2，结果发现病毒包涵体平均面积变小，在TMED2敲除细胞系中可更明显的观察到这种现象(先转染最小基因组系统质粒再转染TMED2 siRNA/敲除TMED2)。

实施例5、利用埃博拉病毒最小基因组系统检测基因复制

本研究使用的是埃博拉最小基因组系统可在P2实验室条件下模拟埃博拉病毒的生命周期，应用于研究埃博拉病毒的复制和转录。实验操作流程简要如下：1、准备p0代细胞：将病毒生产细胞HepG2(简称p0)平均接种在6孔板中培养；2、转染p0代细胞：待细胞生长至合适密度时，将质粒pCAGGS-NP(125ng)、pCAGGS-VP35(125ng)、pCAGGS-VP30(75ng)、pCAGGS-L(1000ng)、p4cis-vRNA-Rluc(250ng)与pCAGGS-T7(250ng)转染到p0，第二天将p0上清更换为含5％FBS的培养基；3、准备病毒靶向细胞HepG2(简称p1)：将病毒靶向细胞p1平均接种在6孔板中培养；4、转染p1代细胞：待细胞生长至合适密度时，将质粒pCAGGS-NP(125ng)、pCAGGS-VP35(125ng)、pCAGGS-VP30(75ng)、pCAGGS-L(1000ng)与pCAGGS-Tim1(250ng)转染到p1；5、感染p1代细胞及p0代细胞测定：p1细胞转染后24h，将p1细胞上清更换为p0的细胞上清，将p0代细胞用250μl PLB裂解液(5×PLB用ddH₂O稀释)裂解15min，经离心处理后取40μl细胞上清加入到40μl Renilla Glo Reagent中，吹打混匀，室温放置10min后于酶标仪中测量荧光素酶相对活性(RLU)以评估病毒复制。6、制备及转染更髙代数的细胞：p1细胞继续培养48h后收取p1进行测定，如果需要继续传代病毒制备下一代靶细胞(p2)，则操作方法与p1代细胞获取流程一致，p1、p2的测量方法与p0相同。

构建TMED2 siRNA，p0、p1代细胞转染埃博拉病毒最小基因组系统相关质粒(具体细节如上所述)，转染6-8h后在100μl opti-MEM无血清培养基中依次加入10μl siRNA及10μl ViaFect^TM试剂，混合均匀，室温放置10min，转染TMED2 siRNA，按照上述方法及时间点收集p0、p1代细胞进行测定。

其中，TMED2 siRNA由如下两条单链退火形成：

5’-CCAGCGGGAAGUACACAUUTT-3’(SEQ ID No.1)；

5’-AATGTGTACUUCCCGCTGGTT-3’(SEQ ID No.2)。

向HepG2内源性TMED2敲除细胞系TMED2 KO-#1与TMED2 KO-#2(制备方法见前文)转染最小基因组系统相关质粒及回补质粒pEGFP-C1和pEGFP-TMED2，测定方法同上。

结果如图5所示，TMED2 siRNA干扰TMED2抑制埃博拉病毒复制。向HepG2内源性TMED2敲除细胞系TMED2-KO-#1与TMED2-KO-#2转染最小基因组系统相关质粒，发现TMED2敲除细胞系可显著抑制埃博拉病毒在细胞中的复制，在TMED2敲除细胞系中回补外源pEGFP-TMED2质粒，病毒复制得到一定增加。

以上结果提示TMED2可作为靶点利用TMED2抑制剂可作为埃博拉病毒病防治的候选药物用于埃博拉病毒感染的治疗。本发明对感染埃博拉病毒的治疗具有重大应用价值。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> TMED2在作为埃博拉病毒病治疗靶点中的应用

<130> GNCLN200480

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ccagcgggaa guacacauut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

aatgtgtacu ucccgctggt t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cctccgccac ctcgaagatg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ttctttgagc gggtcacctc 20

<210> 5

<211> 201

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Val Thr Leu Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Thr Val Ser Gly Tyr Phe Val Ser Ile Asp Ala His Ala Glu Glu Cys

20 25 30

Phe Phe Glu Arg Val Thr Ser Gly Thr Lys Met Gly Leu Ile Phe Glu

35 40 45

Val Ala Glu Gly Gly Phe Leu Asp Ile Asp Val Glu Ile Thr Gly Pro

50 55 60

Asp Asn Lys Gly Ile Tyr Lys Gly Asp Arg Glu Ser Ser Gly Lys Tyr

65 70 75 80

Thr Phe Ala Ala His Met Asp Gly Thr Tyr Lys Phe Cys Phe Ser Asn

85 90 95

Arg Met Ser Thr Met Thr Pro Lys Ile Val Met Phe Thr Ile Asp Ile

100 105 110

Gly Glu Ala Pro Lys Gly Gln Asp Met Glu Thr Glu Ala His Gln Asn

115 120 125

Lys Leu Glu Glu Met Ile Asn Glu Leu Ala Val Ala Met Thr Ala Val

130 135 140

Lys His Glu Gln Glu Tyr Met Glu Val Arg Glu Arg Ile His Arg Ala

145 150 155 160

Ile Asn Asp Asn Thr Asn Ser Arg Val Val Leu Trp Ser Phe Phe Glu

165 170 175

Ala Leu Val Leu Val Ala Met Thr Leu Gly Gln Ile Tyr Tyr Leu Lys

180 185 190

Arg Phe Phe Glu Val Arg Arg Val Val

195 200

Claims

1.TMED2作为靶点在如下任一中的应用：

2.TMED2作为靶点在如下任一中的应用：

(B2)筛选用于治疗和/或预防埃博拉病毒病的候选药物。

3.能够抑制TMED2表达的物质在如下任一中的应用：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述能够抑制TMED2表达的物质为敲除TMED2表达的物质或敲低TMED2表达的物质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述敲低TMED2表达的物质为TMED2siRNA。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述TMED2 siRNA为由SEQ ID No.1和SEQID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述敲除TMED2表达的物质为用于敲除TMED2表达的基因编辑工具。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述基因编辑工具为CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特异性切割的靶序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4。

9.TMED2在与埃博拉病毒蛋白VP35互作中的应用。

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用，其特征在于：所述TMED2为SEQ ID No.5所示蛋白质。