CN112014557A

CN112014557A - 一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点

Info

Publication number: CN112014557A
Application number: CN201910449804.2A
Authority: CN
Inventors: 曹诚; 杨莎莎; 朱林; 靳彦文; 高婷; 刘萱; 张部昌
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS; Anhui University
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA; Anhui University
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2020-12-01
Also published as: WO2020237909A1

Abstract

本发明公开了一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点。本发明提供了PKA、AKIP1和/或CREB作为靶点在制备具有如下任一功能的产品中的应用：治疗埃博拉病毒感染、治疗埃博拉病毒病、抑制埃博拉病毒复制、抑制埃博拉病毒在细胞中增殖。本发明证明了PKA抑制剂H89、敲低或敲除AKIP1基因、CREB抑制剂666‑15和KG‑501能够显著抑制埃博拉病毒在细胞中的增殖。本发明探索了PKA、AKIP1和CREB作为靶点在埃博拉病毒治疗中的潜力，为其在临床上用于防治埃博拉病毒提供了新的依据，在埃博拉的治疗领域将有广阔的应用前景。

Description

一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点。

背景技术

埃博拉病毒病又称埃博拉出血热，该病的病原体为埃博拉病毒。埃博拉病毒属于丝状病毒，是一种有包膜的单股负链RNA病毒，能够引起人类和非人灵长类急性出血性传染病，死亡率约在50％-90％。2013-2016年的埃博拉疫情在全球造成28000例感染，11000例死亡。2018年，埃博拉疫情再次在西非爆发，目前已报道1206例感染，764例死亡，死亡率约60％(截至2019年4月10日)。我国与西非国家合作往来日益密切，为保障出入境相关人员健康和安全，降低埃博拉病例输入风险，储备针对埃博拉病毒的防治药物非常必要。

埃博拉病毒基因组顺序为3’端非编码区-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’端非编码区，可以编码核蛋白NP、病毒粒子蛋白VP35、基质蛋白VP40、糖蛋白GP、VP30、VP24、RNA依赖的RNA聚合酶L共7个结构蛋白。埃博拉病毒尽管最初靶向巨噬细胞与树突状细胞，但最终它能够感染除淋巴细胞以外所有类型的细胞。VP35作为一种RNA聚合酶辅因子，其通过多种方式参与病毒复制和免疫逃避。最近研究结果VP35可以抑制I型干扰素的产生、破坏RNA沉默效应，在病毒复制中具有重要的作用。

A激酶相互作用蛋白1(AKIP1)是最初在乳腺癌和前列腺癌细胞系发现的蛋白质。AKIP1由五个外显子编码的210个氨基酸组成，分子量为23kDa。AKIP1是一种调控PKA信号通路的蛋白，作为衔接子或结构性胞内蛋白发挥作用，通过与人蛋白激酶A(PKA)催化亚基氨基端相互作用促进PKA催化亚基入核。PKA又称cAMP依赖性蛋白激酶A，作为cAMP信号的效应蛋白，接受cAMP刺激后被激活。PKA激活可导致一系列底物磷酸化，以CREB为例，作为一种转录因子，CREB磷酸化可促使诸如Bcl-2、CyclinA&D、IL-2、IL-6、等转录，进而调节细胞生长、代谢、免疫等一系列细胞活动。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点。

第一方面，本发明要求保护PKA、AKIP1和/或CREB作为靶点在如下任一中的应用：

(A1)制备用于治疗埃博拉病毒感染的产品，或治疗埃博拉病毒感染；

(A2)制备用于治疗埃博拉病毒病的产品，或治疗埃博拉病毒病；

(A3)制备用于抑制埃博拉病毒复制的产品，或抑制埃博拉病毒复制；

(A4)制备用于抑制埃博拉病毒在细胞中增殖的产品，或抑制埃博拉病毒在细胞中增殖。

第二方面，本发明要求保护PKA、AKIP1和/或CREB作为靶点在筛选埃博拉病毒病防治的候选药物中的应用。

第三方面，本发明要求保护能够抑制PKA表达的物质、能够抑制AKIP1表达的物质和/或能够抑制CREB表达的物质在如下任一中的应用：

其中，所述能够抑制PKA表达的物质可为任何能够抑制PKA表达的物质。

进一步地，所述能够抑制PKA表达的物质可为PKA抑制剂。

在本发明的具体实施方式中，所述能够抑制PKA表达的物质具体为PKA抑制剂——H89。

H89全名为H89 2HCl，是一种有效的PKA抑制剂，化学式为C₂₀H₂₀BrN₃O₂S.2HCl，分子量为519.28，结构式如式I所示。

其中，所述能够抑制AKIP1表达的物质可为任何能够抑制AKIP1表达的物质。

进一步地，所述能够抑制AKIP1表达的物质可为敲除AKIP1表达的物质或敲低AKIP1表达的物质。

更进一步地，所述敲低AKIP1表达的物质可为AKIP1siRNA。

在本发明的具体实施方式中，所述AKIP1siRNA具体为由SEQ ID No.1和SEQIDNo.2所示的两条单链退火形成的siRNA。

更进一步地，所述敲除AKIP1表达的物质可为用于敲除AKIP1表达的基因编辑工具。

在本发明的具体实施方式中，所述基因编辑工具为CRISPR/Cas9核酸酶，其特异性切割的靶序列具体为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4。

其中，所述能够抑制CREB表达的物质可为任何能够抑制CREB表达的物质。

进一步地，所述能够抑制CREB表达的物质可为CREB抑制剂。

在本发明的具体实施方式中，所述能够抑制CREB表达的物质具体为CREB抑制剂——666-15或者KG-501。

666-15是有效选择性的CREB抑制剂，IC₅₀值为81nM。结构式如式II所示。

KG-501是CREB抑制剂，破坏依赖于CREB的转录(Ki＝10μM)和CREB：CBP的相互作用(Ki＝50μM)。它还能破坏磷酸化CREB(Ser-133)与KIX的结合，Ki约为90μM。结构式如式III所示。

在上述各方面中，所述PKA均可具体为SEQ ID No.5所示蛋白质。所述AKIP1均可具体为SEQ ID No.6所示蛋白质。所述CREB均可具体为SEQ ID No.7所示蛋白质。

实验证实，埃博拉病毒结构蛋白VP35与AKIP1存在相互作用并激活PKA，促进其入核。且可促进PKA下游录因子cAMP-应答元件结合蛋白(CREB)的磷酸化以及转录活性。同时证明了PKA抑制剂H89、敲低或敲除AKIP1基因能够显著抑制埃博拉病毒在细胞中的增殖。本发明探索了PKA及AKIP1作为靶点在埃博拉病毒治疗中的潜力，为其在临床上用于防治埃博拉病毒提供了新的依据，在埃博拉的治疗领域将有广阔的应用前景。

本发明通过对埃博拉病毒蛋白VP35与AKIP1相互作用及相关分子机制的研究，阐明了VP35-AKIP1结合后促进PKA底物CREB磷酸化，同时发现VP35通过AKIP1促进埃博拉病毒的复制。因此，以PKA、AKIP1及CREB作为靶点在临床上用于防治埃博拉病毒提供了新的依据，其在埃博拉病毒病的治疗领域将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为免疫沉淀检及免疫印迹测VP35与AKIP1的相互作用。图中lysate指的是全细胞裂解液，IP之前的细胞产物。

图2为免疫荧光染色检测VP35促进PKA的细胞核定位。

图3为免疫印迹检测VP35促进CREB的磷酸化。

图4为双荧光素酶报告系统检测VP35促进CREB的转录水平。

图5为H89显著抑制埃博拉病毒样粒子trVLP的增殖。A和B分别为p1和p2细胞中加入PKA抑制剂H89检测病毒增殖。

图6为敲低或敲除AKIP1会显著抑制埃博拉病毒样粒子trVLP的增殖。A为使用AKIP1siRNA敲低AKIP1效果验证；B为使用AKIP1siRNA敲低AKIP1后埃博拉病毒在细胞中增殖情况鉴定；C和D分别为向HepG2内源性AKIP1敲除细胞系AKIP1KO1与AKIP1KO2转染最小基因组系统相关质粒检测病毒在p1和p0细胞中的增殖情况鉴定。

图7为666-15和KG-501显著抑制埃博拉病毒样粒子trVLP的增殖。A和B分别为p0和p1细胞中加入CREB抑制剂666-15检测病毒增殖。C为p1细胞中加入CREB抑制剂KG-501检测病毒增殖。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下实施例中的数据定量实验标准差使用SEM，数据间显著性差异采用t-检验(*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，**表示p≤0.001)

下述实施例中所涉及的PKA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；AKIP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；CREB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

1、细胞株质粒与病毒

HEK293细胞、HeLa细胞、HepG2细胞均为本实验室保存。质粒pcDNA3.0-Flag-VP35、pEGFP-VP35、pCMV-Myc-AKIP1、pGL3-CRE-Luc均为本研究构建pcDNA3.0-Flag-VP35、pEGFP-VP35、pCMV-Myc-AKIP1与pGL3-CRE-Luc均为本研究构建。其中VP35的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示，将序列连同Flag标签(DYKDDDDK)通过BamH I与EcoR I酶切位点克隆到pcDNA3.0载体中，进而得到重组载体pcDNA3.0-Flag-VP35。将VP35序列(SEQ ID No.8)通过EcoRI与BamHI酶切位点克隆到pEGFP-C1载体中，进而得到重组载体pEGFP-VP35。AKIP1的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，将序列通过酶切位点Xho I与Not I克隆到pCMV-Myc载体中，进而得到重组载体pCMV-Myc-AKIP1。腺病毒Ad-VP35为SEQ ID No.8序列克隆到腺病毒载体中进行表达纯化，纯度为1×10¹¹PFU/ml，委托北京百奥川生物科技有限责任公司进行病毒扩增。

质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-VP35、pCAGGS-VP30、pCAGGS-L、p4cis-vRNA-Rluc、pCAGGS-T7、pCAGGS-Tim1均记载于“Hoenen T,et al.Modeling TheLifecycle Of EbolaVirus Under Biosafety Level 2Conditions With Virus-like ParticlesContainingTetracistronic Minigenomes.J Vis Exp,2014”一文中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

2、分子生物学试剂与抗体

高保真DNA聚合酶KOD FX Neo、cDNA反转Mix、SYBR Green Mix为东洋纺公司(TOYOBO)产品；双荧光素酶检测试剂盒为Promega公司产品；转染试剂Lipofectamine3000为Thermo公司产品；蛋白酶抑制剂Cocktail为罗氏公司产品；DMEM培养基、RPMI1640培养基、MEM培养基、NEAA与FBS均为GIBCO产品；Forskolin(FSK)货号S2449，H89货号S1582均为Selleck公司产品；666-15(货号HY-101120)为MCE公司产品。KG-501(货号S8409)为Selleck公司产品。

HRP标记的anti-Flag抗体(Flag-HRP)、HRP标记的anti-Myc抗体(Myc-HRP)为Sigma公司产品；anti-AKIP1抗体为Sigma公司产品；anti-CREB、anti-pCREB-133抗体为Abcam公司产品；anti-Flag琼脂糖珠、anti-Myc琼脂糖珠为Sigma公司产品。

实施例1、免疫沉淀与免疫印迹检测VP35与AKIPI的相互作用

以在HEK293细胞中共转染pCMV-Myc-AKIP1和pcDNA3.0-Flag-VP35为例，使用Thermo公司Lipofectamine 3000，按照说明书进行质粒转染：以质粒：P3000＝1:2的比例将1μg pCMV-Myc-AKIP1和1μg pcDNA3.0-Flag-VP35及4μl P3000加入50μlopti-MEM稀释；按质粒：Lipo3000＝1:3即将6μl Lipofectamine3000加入到50μlopti-MEM稀释，将稀释的opti-MEM、稀释的Lipofectamine3000相对应的加入稀释的质粒中混匀，室温放置5-10min，将混合液均匀滴加在细胞培养基中。转染后36-48h后，将转染后的细胞用PBS重悬细胞，清洗2次后，4℃、1000g/min离心3min收集细胞；加入150μl细胞裂解液(150mM NaCl，50mMTris-HCl pH 8.0，含EDTA蛋白酶抑制剂1片/50ml，1％NP40，如果是磷酸化实验需按照每10ml再加入磷酸酶抑制剂1片)冰上裂解15min后，4℃12000rpm离心10min；将上清转移至1.5ml EP管中，加入15μl anti-Flag琼脂糖珠，4℃旋转孵育2h进行免疫共沉淀，4℃、1000g离心3min，使用800μl不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液洗涤细胞3次；加入适量1×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，4℃16000g/min离心5min，进行SDS-PAGE电泳及免疫沉淀。

取10μl样品进行SDS-PAGE电泳，电压初始设定为80V，待溴酚蓝迁移至分离胶后将电压调整至120V，继续电泳到溴酚蓝迁移至胶的底部停止电泳；将PVDF膜用甲醇激活30s，然后和滤纸在1×转膜缓冲液中(Tris-HCl 24mM，甘氨酸5mM，20％甲醇)浸泡20min；电泳结束后按照从上到下滤纸-胶-膜-滤纸的顺序放置于半干转膜仪上，18V转膜2h；将转膜完成后的PVDF膜室温封闭1h；1×TBST洗涤3次，每次5min(简称洗涤)；加入入Myc-HRP抗体和Flag-HRP抗体，室温孵育1h；洗涤后ECL显影。

结果如图1所示：通过Flag琼脂糖珠进行免疫沉淀，通过免疫印迹实验可检测到Myc-AKIP1条带，而对照Flag载体的免疫沉淀和IgG免疫沉淀则检测不到Myc-AKIP1条带。结果说明埃博拉病毒蛋白VP35与AKIP1存在相互作用。

实施例2、免疫荧光检测PKA的核定位

在HeLa细胞中转染pEGFP-VP35质粒，培养36-48h后将转染后的细胞用PBS洗涤3次，每次5min，吸尽残存液体后，加入4％多聚甲醛37℃固定30min；PBS洗涤后加入0.3％Triton X-100(用1×PBS配制)穿孔15min；PBS洗涤后加入2ml封闭液(含5％山羊血清的1×PBS)37℃封闭30min；PBS洗涤后加入孵育抗PRKACA(PKA催化亚基)抗体(BD Biosciences；货号：610980)(封闭液1:50稀释获得)，4℃孵育过夜；1×PBST洗涤细胞3次，每次10min(简称PBST洗涤)；向细胞上加入TRITC标记的山羊抗小鼠(二抗)(中杉金桥，货号为ZF-0313)(封闭液1:50稀释获得)，室温孵育1h(避光操作)；PBST洗涤后加入10μl含有DAPI(1μg/ml)的封片液，避光静置15min后在激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM800)下观察。

结果如图2所示，免疫荧光结果显示VP35存在时，会促进PRKACA的细胞核定位。

实施例3、免疫印迹检测VP35对CREB的磷酸化

用表达VP35的腺病毒Ad-VP35(MOI＝10)及对照Ad-GFP(MOI＝10)感染HepG2细胞；感染40小时后，加入PKA激活剂FSK(25μM)或PKA的抑制剂H89(10μM)处理3小时；细胞裂解后孵育CREB抗体(即anti-CREB抗体)及CREB第133位磷酸化抗体(即anti-pCREB-133抗体)进行免疫印迹。

其中，FSK和H89是溶于DMSO。实验同时设置了加入等量DMSO替代FSK和H89的对照。

结果如图3所示。用VP35的腺病毒Ad-VP35(MOI＝10)及对照Ad-GFP(MOI＝10)感染HepG2细胞，加入PKA激活剂FSK(25μM)或PKA的抑制剂H89处理三小时，免疫印迹结果显示：VP35会促进CREB第133位丝氨酸(pCREB-S133)的磷酸化，且FSK存在会促进CREB的磷酸化，而H89会抑制CREB的磷酸化。

实施例4、荧光素酶活性检测

将CRE启动子核心区TGACGTCA三个重复序列克隆到pGL3-Basic质粒(Promega；货号E1751)的多克隆位点Xho I与Bgl II之间，得到重组载体pGL-CRE-Luc。

随后，将不同含量的pcDNA3.0-Flag-VP35质粒(0μg、0.2μg、0.4μg与0.8μg)连同表达萤火虫荧光素酶质粒pGL3-CRE-Luc及表达海参荧光素酶的质粒pRL-TK(Promega公司；货号E2241)，按照50:1(质量比)共同转染到HepG2细胞中；转染36h后弃去培养上清(FSK处理组则在转染33h后，加入25μM的FSK处理3h)，1×PBS洗涤2次后，每孔加入100μl 1×PLB裂解液(Promega公司，Dual-Luciferase Report Assay System货号E1910中组分)。在摇床上室温裂解15min，16000g/min离心5min获得细胞裂解上清；在100μl室温平衡的LuciferaseAssay ReagentⅡ(Promega公司，Dual-Luciferase Report Assay System货号E1910中组分)中加入20μl细胞裂解上清，轻轻混匀后放入TD-20/20型荧光光度计测定发光值1(即萤火虫萤光素酶的发光值)，随后再加入100μl Stop&Glo Reagent(Promega公司，Dual-Luciferase Report Assay System货号E1910中组分)测定发光值2(即海肾萤光素酶的发光值)，最后记录1/2的比值即为荧光素酶相对活性。埃博拉病毒trVLP检测是通过海肾荧光素酶报告基因系统进行检测，操作方式与双萤光素酶报告系统一致，结果记录海肾萤光素酶的发光值。

结果如图4所示，VP35以剂量依赖的方式增加CREB的转录活性，而FSK处理会进一步增加CREB的转录活性。

实施例5、利用埃博拉病毒最小基因组系统检测埃博拉病毒样颗粒trVLP的复制

上述结果表明VP35通过与AKIP1相互作用，会影响PKA-CREB信号通路。为了探究AKIP1-PKA-CREB通路在埃博拉病毒的增殖中是否发挥重要的作用，本发明使用了埃博拉病毒最小基因组系统，可在生物安全二级实验室条件下表达埃博拉病毒样颗粒(trVLP)，通过荧光素酶的表达来模拟埃博拉病毒生命周期(Hoenen T,et al.Modeling The LifecycleOf Ebola Virus Under Biosafety Level 2Conditions WithVirus-like ParticlesContaining Tetracistronic Minigenomes.J Vis Exp,2014)。

实验操作流程简要如下：第1天，将病毒生产细胞HEK293细胞(或HepG2细胞)(简称p0)接种在6孔板中培养；第2天，将质粒pCAGGS-NP(125ng)、pCAGGS-VP35(125ng)、pCAGGS-VP30(75ng)、pCAGGS-L(1000ng)、p4cis-vRNA-Rluc(250ng)与pCAGGS-T7(250ng)转染到p0；第3天将p0上清更换为5％FBS的培养基；第4天将病毒靶向细胞(简称p1)接种到6孔板中；第5天，将质粒pCAGGS-NP(125ng)、pCAGGS-VP35(125ng)、pCAGGS-VP30(75ng)、pCAGGS-L(1000ng)与pCAGGS-Tim1(250ng)转染到p1；第6天将p1细胞上清更换为p0的细胞上清；第7天将p1上清更换为5％FBS的培养基继续培养72h收取p1，如果需要继续传代病毒获得p2，则方法与p1获取流程一致。

1、在最小基因组系统中加入PKA抑制剂H89(在细胞收集前12h加入10μM H89处理)，将p1及p2用250μl PLB裂解液(Promega公司，货号E194A)裂解15min，离心后取40μl细胞上清与40μl Renilla Glo Reagent(Promega公司：Renilla-GloLuciferase AssaySystem货号E2710中底物与缓冲液按照1:100混合)等比例混匀后室温放置10min后测海肾荧光素酶发光值RLU以评价病毒复制。p2的测量方法与p1相同。

2、构建AKIP1siRNA，在125μl opti-MEM无血清培养基中依次加入5μl AKIP1siRNA及3.75μl TransIT-X2试剂(Mirus，货号MIR 6000)，混合均匀，室温放置20min。AKIP1siRNA转染HepG2细胞6h后，1×PBS缓冲液洗涤后，更换新鲜培养基，并转染p0细胞相关质粒(即pCAGGS-NP 125ng、pCAGGS-VP35 125ng、pCAGGS-VP3075ng、pCAGGS-L 1000ng、p4cis-vRNA-Rluc 250ng与pCAGGS-T7 250ng)，转染24h后更换5％FBS培养基，72h后收集细胞根据上述方法测RLU值。

其中，AKIP1siRNA由如下两条单链退火形成：

5’-GCAGUUGAUUCUGGACAAATT-3’(SEQ ID No.1)；

5’-UUUGUCCAGAAUCAACUGCTT-3’(SEQ ID No.2)。

另外，在将AKIP1siRNA转染HepG2细胞，培养36-48h后，收细胞进行qPCR检测细胞中AKIP1的转录水平。检测引物为：

h-AKIP1-F：5’-AAggCTggCTCTAgAAgTgC-3’；

h-AKIP1-R：5’-CTgTTTCTCTAggTggggCg-3’。

3、构建HepG2内源性AKIP1敲除细胞系AKIP1KO1与AKIP1KO2，通过CRISPR-Cas9技术获得，靶向AKIP1的序列为如下两个：

靶序列1：5’-CATGCCCTGGAGCGTCCCAA-3’(SEQ ID No.3)；

靶序列2：5’-CATGTCTATCGTTATCACAG-3’(SEQ ID No.4)。

AKIP1KO1为针对靶序列1所得的HepG2内源性AKIP1敲除细胞系，AKIP1KO2为针对靶序列2所得的HepG2内源性AKIP1敲除细胞系。AKIP1KO1和AKIP1KO2经验证验证两者的内源性AKIP1已经被成功敲除。

向HepG2内源性AKIP1敲除细胞系AKIP1KO1与AKIP1KO2中转染最小基因组系统相关质粒，检测方法同上。此步与上述不同点在于用的是HepG2AKIP1敲除细胞系AKIP1KO1与AKIP1KO2，转染质粒，操作及检测与上述一致。

4、在最小基因组系统中加入CREB抑制剂666-15及KG-501检测对埃博拉病毒样颗粒增殖的影响。

HepG2细胞转染最小基因组系统相关质粒，转染后加入1μM的CREB抑制剂666-15处理48h或加入25μM的CREB抑制剂KG-501处理20min，随后收集细胞，裂解后并检测RLU，检测方法与上述一致。

结果显示：使用埃博拉病毒最小基因组感染细胞模型，在最小基因组系统中加入PKA抑制剂H89会显著抑制埃博拉病毒样颗粒trVLP的增殖(图5中A与B)。在最小基因组系统中加入AKIP1siRNA敲低HepG2细胞中内源性AKIP1(图6中A)，结果发现埃博拉病毒复制受到抑制(图6中B)。向HepG2内源性AKIP1敲除细胞系AKIP1KO1与AKIP1KO2转染最小基因组系统相关质粒，发现AKIP1敲除细胞系可显著抑制埃博拉病毒样颗粒trVLP在细胞中的增殖(图6中C和D)。在最小基因组系统中加入CREB抑制剂666-15和KG-501会显著抑制埃博拉病毒样颗粒trVLP的增殖(图7中A至C)。

综合以上结果：提示PKA、AKIP1可作为靶点利用PKA抑制剂或AKIP1的相互拮抗剂可作为埃博拉病毒病防治的候选药物用于埃博拉病毒感染的治疗。本发明对感染埃博拉病毒的治疗具有重大应用价值。

上述埃博拉最小基因组系统结果显示AKIP1-PKA-CREB通路在埃博拉病毒增殖过程中发挥重要的作用。这提示AKIP1-PKA-CREB信号通路可作为埃博拉病毒的靶点，利用PKA抑制剂H89、干扰AKIP1及使用CREB抑制剂666-15或KG-501可作为埃博拉病毒防控的候选药物用于埃博拉病毒感染病例的治疗。本发明对埃博拉病毒病的治疗发面具有重大的应用价值。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院；安徽大学

<120> 一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点

<130> GNCLN191039

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gcaguugauu cuggacaaat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

uuuguccaga aucaacugct t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

catgccctgg agcgtcccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

catgtctatc gttatcacag 20

<210> 5

<211> 351

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Gly Asn Ala Ala Ala Ala Lys Lys Gly Ser Glu Gln Glu Ser Val

1 5 10 15

Lys Glu Phe Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asp Phe Leu Lys Lys Trp Glu

20 25 30

Ser Pro Ala Gln Asn Thr Ala His Leu Asp Gln Phe Glu Arg Ile Lys

35 40 45

Thr Leu Gly Thr Gly Ser Phe Gly Arg Val Met Leu Val Lys His Lys

50 55 60

Glu Thr Gly Asn His Tyr Ala Met Lys Ile Leu Asp Lys Gln Lys Val

65 70 75 80

Val Lys Leu Lys Gln Ile Glu His Thr Leu Asn Glu Lys Arg Ile Leu

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Gln Ala Val Asn Phe Pro Phe Leu Val Lys Leu Glu Phe Ser Phe Lys

100 105 110

Asp Asn Ser Asn Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Val Pro Gly Gly Glu

115 120 125

Met Phe Ser His Leu Arg Arg Ile Gly Arg Phe Ser Glu Pro His Ala

130 135 140

Arg Phe Tyr Ala Ala Gln Ile Val Leu Thr Phe Glu Tyr Leu His Ser

145 150 155 160

Leu Asp Leu Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile Asp

165 170 175

Gln Gln Gly Tyr Ile Gln Val Thr Asp Phe Gly Phe Ala Lys Arg Val

180 185 190

Lys Gly Arg Thr Trp Thr Leu Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro

195 200 205

Glu Ile Ile Leu Ser Lys Gly Tyr Asn Lys Ala Val Asp Trp Trp Ala

210 215 220

Leu Gly Val Leu Ile Tyr Glu Met Ala Ala Gly Tyr Pro Pro Phe Phe

225 230 235 240

Ala Asp Gln Pro Ile Gln Ile Tyr Glu Lys Ile Val Ser Gly Lys Val

245 250 255

Arg Phe Pro Ser His Phe Ser Ser Asp Leu Lys Asp Leu Leu Arg Asn

260 265 270

Leu Leu Gln Val Asp Leu Thr Lys Arg Phe Gly Asn Leu Lys Asn Gly

275 280 285

Val Asn Asp Ile Lys Asn His Lys Trp Phe Ala Thr Thr Asp Trp Ile

290 295 300

Ala Ile Tyr Gln Arg Lys Val Glu Ala Pro Phe Ile Pro Lys Phe Lys

305 310 315 320

Gly Pro Gly Asp Thr Ser Asn Phe Asp Asp Tyr Glu Glu Glu Glu Ile

325 330 335

Arg Val Ser Ile Asn Glu Lys Cys Gly Lys Glu Phe Ser Glu Phe

340 345 350

<210> 6

<211> 210

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Met Asp Asn Cys Leu Ala Ala Ala Ala Leu Asn Gly Val Asp Arg Arg

1 5 10 15

Ser Leu Gln Arg Ser Ala Arg Leu Ala Leu Glu Val Leu Glu Arg Ala

20 25 30

Lys Arg Arg Ala Val Asp Trp His Ala Leu Glu Arg Pro Lys Gly Cys

35 40 45

Met Gly Val Leu Ala Arg Glu Ala Pro His Leu Glu Lys Gln Pro Ala

50 55 60

Ala Gly Pro Gln Arg Val Leu Pro Gly Glu Arg Glu Glu Arg Pro Pro

65 70 75 80

Thr Leu Ser Ala Ser Phe Arg Thr Met Ala Glu Phe Met Asp Tyr Thr

85 90 95

Ser Ser Gln Cys Gly Lys Tyr Tyr Ser Ser Val Pro Glu Glu Gly Gly

100 105 110

Ala Thr His Val Tyr Arg Tyr His Arg Gly Glu Ser Lys Leu His Met

115 120 125

Cys Leu Asp Ile Gly Asn Gly Gln Arg Lys Asp Arg Lys Lys Thr Ser

130 135 140

Leu Gly Pro Gly Gly Ser Tyr Gln Ile Ser Glu His Ala Pro Glu Ala

145 150 155 160

Ser Gln Pro Ala Glu Asn Ile Ser Lys Asp Leu Tyr Ile Glu Val Tyr

165 170 175

Pro Gly Thr Tyr Ser Val Thr Val Gly Ser Asn Asp Leu Thr Lys Lys

180 185 190

Thr His Val Val Ala Val Asp Ser Gly Gln Ser Val Asp Leu Val Phe

195 200 205

Pro Val

210

<210> 7

<211> 341

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Thr Met Glu Ser Gly Ala Glu Asn Gln Gln Ser Gly Asp Ala Ala

1 5 10 15

Val Thr Glu Ala Glu Asn Gln Gln Met Thr Val Gln Ala Gln Pro Gln

20 25 30

Ile Ala Thr Leu Ala Gln Val Ser Met Pro Ala Ala His Ala Thr Ser

35 40 45

Ser Ala Pro Thr Val Thr Leu Val Gln Leu Pro Asn Gly Gln Thr Val

50 55 60

Gln Val His Gly Val Ile Gln Ala Ala Gln Pro Ser Val Ile Gln Ser

65 70 75 80

Pro Gln Val Gln Thr Val Gln Ser Ser Cys Lys Asp Leu Lys Arg Leu

85 90 95

Phe Ser Gly Thr Gln Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Glu Asp Ser Gln

100 105 110

Glu Ser Val Asp Ser Val Thr Asp Ser Gln Lys Arg Arg Glu Ile Leu

115 120 125

Ser Arg Arg Pro Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Asn Asp Leu Ser Ser Asp

130 135 140

Ala Pro Gly Val Pro Arg Ile Glu Glu Glu Lys Ser Glu Glu Glu Thr

145 150 155 160

Ser Ala Pro Ala Ile Thr Thr Val Thr Val Pro Thr Pro Ile Tyr Gln

165 170 175

Thr Ser Ser Gly Gln Tyr Ile Ala Ile Thr Gln Gly Gly Ala Ile Gln

180 185 190

Leu Ala Asn Asn Gly Thr Asp Gly Val Gln Gly Leu Gln Thr Leu Thr

195 200 205

Met Thr Asn Ala Ala Ala Thr Gln Pro Gly Thr Thr Ile Leu Gln Tyr

210 215 220

Ala Gln Thr Thr Asp Gly Gln Gln Ile Leu Val Pro Ser Asn Gln Val

225 230 235 240

Val Val Gln Ala Ala Ser Gly Asp Val Gln Thr Tyr Gln Ile Arg Thr

245 250 255

Ala Pro Thr Ser Thr Ile Ala Pro Gly Val Val Met Ala Ser Ser Pro

260 265 270

Ala Leu Pro Thr Gln Pro Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys Arg Glu Val

275 280 285

Arg Leu Met Lys Asn Arg Glu Ala Ala Arg Glu Cys Arg Arg Lys Lys

290 295 300

Lys Glu Tyr Val Lys Cys Leu Glu Asn Arg Val Ala Val Leu Glu Asn

305 310 315 320

Gln Asn Lys Thr Leu Ile Glu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Asp Leu Tyr

325 330 335

Cys His Lys Ser Asp

340

<210> 8

<211> 1023

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

atgacaacta gaacaaaggg caggggccat actgtggcca cgactcaaaa cgacagaatg 60

ccaggccctg agctttcggg ctggatctct gagcagctaa tgaccggaag gattcctgta 120

aacgacatct tctgtgatat tgagaacaat ccaggattat gctacgcatc ccaaatgcaa 180

caaacgaagc caaacccgaa gatgcgcaac agtcaaaccc aaacggaccc aatttgcaat 240

catagttttg aggaggtagt acaaacattg gcttcattgg ctactgttgt gcaacaacaa 300

accatcgcat cagaatcatt agaacaacgc attacgagtc ttgagaatgg tctaaagcca 360

gtttatgata tggcaaaaac aatctcctca ttgaacaggg tttgtgctga gatggttgca 420

aaatatgatc ttctggtgat gacaaccggt cgggcaacag caaccgctgc ggcaactgag 480

gcttattggg ctgaacatgg tcaaccacca cctggaccat cactttatga agaaagtgcg 540

attcggggta agattgaatc tagagatgag actgtccctc aaagtgttag ggaggcattc 600

aacaatctag acagtaccac ttcactaact gaggaaaatt ttgggaaacc tgacatttcg 660

gcaaaggatt tgagaaacat tatgtatgat cacttgcctg gttttggaac tgctttccac 720

caattagtac aagtgatttg taaattggga aaagatagca attcattgga cattattcat 780

gctgagttcc aggccagcct ggctgaagga gactcccctc aatgtgccct aattcaaatt 840

acaaaaagag ttccaatctt ccaagatgct gctccacctg tcatccacat ccgctctcga 900

ggtgacattc cccgagcttg ccagaagagc ttgcgtccag tcccaccatc acccaagatt 960

gatcgaggtt gggtatgtgt ttttcagctt caagatggta aaacacttgg actcaaaatt 1020

tga 1023

<210> 9

<211> 633

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

atggacaact gtttggcggc cgcagcgctg aatggggtgg accgacgttc cctgcagcgt 60

tcagcaaggc tggctctaga agtgctggag agggccaaga ggagggcggt ggactggcat 120

gccctggagc gtcccaaagg ctgcatgggg gtccttgccc gggaggcgcc ccacctagag 180

aaacagccgg cagccggccc gcagcgcgtt ctcccgggag agagagaaga gagaccccca 240

acccttagtg cttccttcag aacaatggct gaattcatgg actatacttc aagtcagtgt 300

gggaaatatt attcatctgt gccagaggaa ggaggggcaa cccatgtcta tcgttatcac 360

agaggcgagt cgaagctgca catgtgcttg gacataggga atggtcagag aaaagacaga 420

aaaaagacat cccttggtcc tggaggcagc tatcaaatat cagagcatgc tccagaggca 480

tcccagcctg ctgagaacat ctctaaggac ctctacatag aagtatatcc agggacctat 540

tctgtcactg tgggctcaaa tgacttaacc aagaagactc atgtggtagc agttgattct 600

ggacaaagcg tggacctggt cttccctgtg tga 633

Claims

1.PKA、AKIP1和/或CREB作为靶点在如下任一中的应用：

2.PKA、AKIP1和/或CREB作为靶点在筛选埃博拉病毒病防治的候选药物中的应用。

3.能够抑制PKA表达的物质、能够抑制AKIP1表达的物质和/或能够抑制CREB表达的物质在如下任一中的应用：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述能够抑制PKA表达的物质为PKA抑制剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述能够抑制AKIP1表达的物质为敲除AKIP1表达的物质或敲低AKIP1表达的物质。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述能够抑制CREB表达的物质为CREB抑制剂。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PKA抑制剂为H89。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述敲低AKIP1表达的物质为AKIP1siRNA；

进一步地，所述AKIP1 siRNA为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA；

和/或

所述敲除AKIP1表达的物质为用于敲除AKIP1表达的基因编辑工具；

进一步地，所述基因编辑工具为CRISPR/Cas9核酸酶，其特异性切割的靶序列为SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述CREB抑制剂为666-15或者KG-501。

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用，其特征在于：所述PKA为SEQ ID No.5所示蛋白质；和/或

所述AKIP1为SEQ ID No.6所示蛋白质；和/或

所述CREB为SEQ ID No.7所示蛋白质。