CN108330131A - 抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的rna适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体。候选的RNA适配体统称为SEQ ID SKLPBY，分别命名为SKLPBY1‑SKLPBY5，目的RNA适配体统称为SEQ ID SKLPBT，分别命名为SKLPBT1‑SKLPBT5。本发明的RNA适配体能特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白并抑制丝状病毒的感染效率，可用作丝状病毒感染的诊断试剂以及抑制剂。

Description

抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体及其 应用
技术领域
本发明属于生物学领域中的核糖核苷酸(RNA)及其序列与结构，特别是涉及一种可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体及其序列、结构与其在制备丝状病毒感染的诊断试剂和治疗药物中的应用。
背景技术
丝状病毒(Filovirus)为单链负链RNA病毒，属于丝状病毒科(Filoviridae)，包括埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)和奎瓦病毒(Cueva virus)。埃博拉病毒和马尔堡病毒是可引发危害公共安全和人类健康的重大烈性传染病，被列为A类生化武器。埃博拉病毒和马尔堡病毒可造成高致死率出血热的爆发，至今还未有针对这两种病毒有效的抗病毒治疗方法和疫苗。其中，埃博拉病毒是流行程度最广的丝状病毒，可通过体液接触或飞沫等途径在人群中传播，致死率25％-90％。自1976年首次在非洲扎伊尔和苏丹出现至今，埃博拉病毒病已出现十余次有规模的爆发流行，2014年3月在西非爆发的新一轮埃博拉疫情是迄今为止最严重的一次。埃博拉病毒病的临床表现为高热、头痛、肌痛、多器官出血衰竭，目前尚无疫苗、药物上市，研发抗埃博拉病毒药物迫在眉睫。
埃博拉病毒有囊膜，表面有包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，GP是唯一负责病毒进入宿主的病毒蛋白，中心为螺旋状核衣壳，包括基因组RNA及其它6种病毒蛋白。目前已确定5种亚型，分别为扎伊尔型(Zaire-EBOV)、苏丹型(Sudan-EBOV)、莱斯顿型(Reston-EBOV)、科特迪瓦泰森林型( Forest-EBOV)和乌干达本迪布焦型(Bundibugyo-EBOV)，其中扎伊尔型恶性程度最强，死亡率50％-90％，苏丹型恶性程度次之，死亡率50％-70％。引起2014年埃博拉病毒病的病毒隶属于扎伊尔亚型。1976至2014年，不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸序列间的同源性为54％-65％，同亚型包膜糖蛋白氨基酸序列同源性为95％-100％。2014年在不同地域分离到的同亚型埃博拉病毒的包膜糖蛋白氨基酸序列并不完全一致，但是差异很小，同源性达到了99.7％-100％。2014年来自塞拉利昂的扎伊尔-埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸同源性达到了100％，但是来自几内亚的三条扎伊尔-埃博拉病毒糖蛋白氨基酸序列有一定差异。不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白分别在进化树的不同分支上：2014年分离自塞拉利昂的扎伊尔-埃博拉病毒包膜糖蛋白在一大分支上；1976至2014年分离自塞拉利昂以外国家的扎伊尔-埃博拉病毒糖蛋白在另一个大分支上。
核酸适体是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出的特异性与靶物质高度亲和的核酸分子，包括DNA适体和RNA适体。RNAs的特征在于它们能够釆用复杂而稳定的结构，特异地并且容易地结合目标蛋白，并且可以轻松地化学合成，使RNAs潜在地成为非常有用的诊断和/或治疗先导化合物。短RNA配体，称为RNA适体，采用被称为指数富集的配体系统进化(SELEX)的体外反复筛选技术，利用高亲和性和特异性结合到多种蛋白，从一个随机RNA文库中鉴别出来。适体是分子量约为20-50个碱基的寡核苷酸，与蛋白质或小分子物质能够特异性结合并有较高的亲和力。适体不具有免疫源性或低免疫源性，可通过化学修饰的方法增加其稳定性并增大其在体内的半衰期。一些适体已成功地用动物疾病模型进行评估，其中一些目前正处于治疗的临床开发阶段。值得注意的是，美国FDA最近批准了抑制抗血管内皮生长因子(VEGF)的RNA适配体，称为哌加他尼钠(Macugen)，用于治疗各种类型的新生血管性老年性黄斑变性，表明RNA适配体具有巨大的治疗潜力。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体。
本发明所提供的抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体，是能够特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白并抑制丝状病毒感染的RNA适配体，候选RNA适配体统称为SEQ ID SKLPBY，其为包含核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1(SKLPBY1)或SEQ NO.2(SKLPBY2)或SEQ NO.3(SKLPBY3)或SEQ NO.4(SKLPBY4)或SEQ NO.5(SKLPBY5)所示的RNA分子，或与序列表具有至少90％同源性的核苷酸序列的RNA分子。
进一步，所述的RNA适配体是用氟基团取代SEQ ID SKLPBY中U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基而得到的目的适配体，统称为SEQ ID SKLPBT，SEQ ID SKLPBT为核苷酸序列如序列表中SEQ NO.6(SKLPBT1)或SEQ NO.7(SKLPBT2)或SEQ NO.8(SKLPBT3)或SEQNO.9(SKLPBT4)或SEQ NO.10(SKLPBT5)所示的RNA分子，或与序列表具有至少90％同源性的核苷酸序列的RNA分子。氟基团是指-F，用氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基的目的是降低RNA水解酶对RNA的降解。
更进一步，所述的RNA适配体，为将所述目的适配体SEQ ID SKLPBT进一步用胆固醇基标记5'末端，用idT(反脱氧胸苷)标记3'末端得到的RNA适配体。胆固醇基是指对胆固醇进行的分子修饰，用胆固醇基标记5'末端的目的是增加RNA分子的脂溶性，以通过细胞膜。idT(反脱氧胸苷)是指反脱氧胸苷，其结构如下，用idT(反脱氧胸苷)标记3'末端的目的是保护RNA免受核酸酶的降解。
再进一步，所述的RNA适配体，为在所述目的适配体SEQ ID SKLPBT的5’末端进一步添加磷酸基团修饰键(保护RNA免受核酸酶的降解)或PEG(聚乙二醇)标签(延长适体在体内的半衰期)得到的RNA适配体。可以使RNA适配体能够抵抗核酸酶并且可以通过细胞膜，增加其稳定性和半衰期。
所述丝状病毒包括埃博拉病毒和马尔堡病毒。
本发明RNA适配体中所述RNA分子可通过化学方法合成。
本发明的第二个目的是提供一种用于诊断丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的试剂盒。
本发明所提供的用于诊断丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的试剂盒，包含上述可以抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体。通过探测RNA适配体是否与丝状病毒的包膜糖蛋白特异性结合实施诊断。
本发明的第三个目的是提供一种丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的抑制剂。
本发明所提供的丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的抑制剂，其主要成分为所述的抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体。该RNA适配体可以特异性地结合丝状病毒糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域的碳端，通过抑制丝状病毒与细胞膜的融合过程，达到抑制丝状病毒进入受体细胞的目的。
本发明提供了一种可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体。基于系统与合成生物学方法，发明人以丝状病毒包膜糖蛋白为靶点，通过人工设计与计算得到能够与其特异性结合的RNA适配体序列与结构，具体方法：从随机核苷酸序列的组合RNA文库中，釆用系统合成生物学技术初步设计出抗丝状病毒包膜糖蛋白的RNA适配体(候选RNA适配体统称为SEQ ID SKLPB)。经过进一步结构优化得到的目的RNA适配体(统称SEQ ID SKLPB)可以稳定地结合丝状病毒糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域的碳端。在此基础上，对该RNA适配体再进行结构优化，提高其与靶标蛋白的亲和力，能够更好地特异性结合靶标蛋白，然后，对优化后的RNA适配体结构进行了合成化学修饰，用氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基，以胆固醇基标记5'末端以及用idT标记3'末端，使其能够抵抗核酸酶并且可以通过细胞膜，增加其稳定性和半衰期，因此，当施用于细胞时，本发明的RNA适配体能有效地抑制丝状病毒感染。本发明的RNA适配体(SEQ ID SKLPB)能够以高亲和力特异性地结合丝状病毒的包膜糖蛋白。本发明RNA适配体的明显优势在于该适体可被直接转入靶细胞，类似于小的化合物，本发明优选的RNA适体(SEQ ID SKLPB)只有30个碱基大小，因而可以很容易地生物合成，在实际应用中将是非常有效的，并以高亲和力结合丝状病毒糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域的碳端，抑制病毒与细胞膜的融合过程，比全长的RNA适体更有效。在宿主体内，本发明的抗丝状病毒包膜糖蛋白的RNA适配体能够与丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域的碳端特异性地结合，可以通过抑制病毒与细胞膜的融合过程，达到抑制病毒进入受体细胞的目的，并可进一步根据RNA适配体与丝状病毒包膜糖蛋白的特异性结合的定量分析，诊断丝状病毒的感染情况。化学合成的RNA适配体可渗透到细胞中，当与丝状病毒包膜糖蛋白对接时，观察到经修饰的RNA适配体可特异性地结合丝状病毒糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域的碳端，可以更好地通过抑制丝状病毒与细胞膜的融合过程，达到抑制丝状病毒进入受体细胞的目的。本发明的RNA适配体能特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白并抑制丝状病毒的感染效率，除了用作治疗剂，还可用作丝状病毒感染的诊断试剂以及作为遗传学工具用于探讨在丝状病毒增殖期间包膜糖蛋白在细胞内的作用和研究丝状病毒与细胞膜的融合过程。本发明将在丝状病毒感染的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
图1为NCBI数据库中获得的丝状病毒包膜糖蛋白的三维结构图；
图2为经软件模拟后确定的丝状病毒包膜糖蛋白的稳定构象图；
图3A为候选适配体(SKLPBY1)的一个二级结构图；
图3B为候选适配体(SKLPBY1)的另一个二级结构图；
图4为候选适配体(SKLPBY1)的三级结构图；
图5为候选适配体(SKLPBY1)与靶标蛋白2个目的结合区域(A和E)的特异性结合能力的Le Dock软件对接结果结构图；
图6为候选适配体(SKLPBY1)与靶标蛋白2个目的结合区域(A和E)的特异性结合能力的HEX软件对接结果结构图；
图7为候选适配体(SKLPBY2)的二级结构图；
图8为候选适配体(SKLPBY2)的三级结构图；
图9为候选适配体(SKLPBY2)与靶标蛋白2个目的结合区域(A和E)的特异性结合能力的Le Dock软件对接结果结构图；
图10为候选适配体(SKLPBY2)与靶标蛋白2个目的结合区域(A和E)的特异性结合能力的HEX软件对接结果结构图；
图11A为优选适配体(SKLPBT1)的二级结构图；
图11B为优选适配体(SKLPBT2)的二级结构图；
图12A为优选适配体(SKLPBT1)的三级结构图；
图12B为优选适配体(SKLPBT2)的三级结构图；
图13A为适体分子6与GP2蛋白对接的结构图；
图13B为适体分子15与GP2蛋白对接的结构图；
图14A为适体分子1(SKLPBY1)与GP2蛋白对接的结构图；
图14B为适体分子1(SKLPBT1)与GP2蛋白对接的结构图。
具体实施方式
本发明旨在获得可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体。
发明人研究中了解到，丝状病毒包膜糖蛋白与HIV-1TM蛋白的同源性区域的小分子抑制剂已经被证明可以成功阻断HIV病毒的复制过程，并且这些小分子抑制剂已经是临床上抗HIV-1病毒的有效“武器”之一。发明人由此分析认为丝状病毒的包膜糖蛋白对于RNA适配体来说是一个非常好的靶标，其部分残基定位暴露于病毒体和感染细胞外，有利于RNA适配体与蛋白的靶标区域特异性结合。此外，发明人进一步研究分析发现丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域(也称作为七肽重复序列)在丝状病毒中高度保守，并且该区域被认为是松散的并且能够在融合前的糖蛋白结构中出现。基于以上认识，本发明基于系统与合成生物学方法，以丝状病毒包膜糖蛋白为靶点，通过人工设计与计算得到能够与其特异性结合的RNA适配体序列与结构。以下通过具体实施例详述本发明。
实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的所公开的内容不限于下述的实施例。
实施例1、获得可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体
本发明获得可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体，包括以下步骤：
1)获得靶标蛋白的稳定构象：从NCBI数据库获得丝状病毒包膜糖蛋白的三维结构(3CSY，如图1所示)，通过GROMACS(5.1releases)软件进行分子动力学模拟，待分子动力学轨迹稳定后，选择靶标蛋白的稳定构象(如图2所示)，用于后续分析。
2)适配体序列与结构的人工设计：基于系统与合成生物学方法，在设计各种生物调控元件和控制系统的基础上，针对获得靶标蛋白稳定构象(参见图2)中的结构特点，寻找适合适配体结合的区域。从稳定构象中，可以看出丝状病毒的包膜糖蛋白结构主要含有两段卷曲螺旋区域和连接两个区域的一个茎环结构适合适配体特异识别结合。因此，得到适合设计适配体的5个区域：A为丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分C端的卷曲螺旋区域，B为连接丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分两个卷曲螺旋区域的loop区，C和D为丝状病毒包膜糖蛋白胞外连接卷曲螺旋区域的反平行β片，E为丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域。
根据候选的5个区域进行分子模拟筛选，首先体外模拟生成一个随机碱基数为n(n为自然数)的单链寡核苷酸文库，该文库则含4n个不同的寡核苷酸序列，常用的寡核苷酸随机序列含30个碱基，库容量高达430(1018)；由于这种随机序列，而决定了库中每条链自然形成的空间构象，即二级结构的多样性，决定了库中潜在地存在能与各种蛋白和低分子靶物质有亲和力的核酸配体。一般筛选文库的容量巨大(可达1015)，理论上能筛选到自然界几乎所有靶分子的适配体。
3)候选适配体的筛选：根据靶标蛋白稳定构象中的结构特点，结合模拟生成的适配体库，选择能够特异结合至设计区域(A，B，C，D，E)的15个候选适配体(SKLPBY1、SKLPBY2、……到SKLPBY15)。使用mFold软件获得15个候选适配体的二级结构，在此基础上，通过Rosetta软件获得15个候选适配体的三级结构。然后，通过Le Dock和HEX软件分别进行分子对接实验，通过分子对接实验进一步确定候选适配体与靶标蛋白5个目的结合区域的特异性结合能力。
4)目标适配体序列与结构优化：在候选适配体序列中，用氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基，以使候选适配体具有核酸酶抗性，由此得到优化后的候选适配体结构，通过分子模拟来检测候选RNA适配体与丝状病毒包膜糖蛋白的特异性结合能力，将经修饰后特异性结合能力强的适配体确认为优选目标适配体(SKLPBT1、SKLPBT2、……到SKLPBT5)。通过优化从候选RNA适配体中获得的优选目标适体SKLPBT1到SKLPBT5，统称为SEQ ID SKLPBT，其序列长度均不超过30个碱基大小(适配体通常认为30个碱基左右)，在实际应用中易于生物合成。
本发明确定的适配体为：
修饰前(优选候选适配体)：
SKLPBY1：CSUUDCCCGGAAMGBGAUCSG(例如序列表中SEQ NO.1)
SKLPBY2：CGKAGAMCAURUVACG(例如序列表中SEQ NO.2)
SKLPBY3：GCRAGUUMGCUUDUCAYGC(例如序列表中SEQ NO.3)
SKLPBY4：VUUAMACKUARUC(例如序列表中SEQ NO.4)
SKLPBY5：MUAUCRGUS(例如序列表中SEQ NO.5)
修饰后(优选目标适配体)：
SKLPBT1：CASUUGSCCGGAAMGBGAUCSUG(例如序列表中SEQ NO.6)
SKLPBT 2：CGKGGAMCAURUGACMCG(例如序列表中SEQ NO.7)
SKLPBT 3：GCGCRAGUUMGCUUAKUCMUSGC(例如序列表中SEQ NO.8)
SKLPBT 4：YUAMACKUAR(例如序列表中SEQ NO.9)
SKLPBT 5：CMUWCAGKGCS(例如序列表中SEQ NO.10)
5)目标适配体的结构再修饰：优选目的适配体(SKLPBT1到SKLPBT5)再经胆固醇基在5'末端和idT在3'末端化学修饰得到的适配体结构，可以抵抗核酸酶并且可以通过细胞膜，因此，当施用于细胞时，本发明的适配体能有效地抑制丝状病毒感染。
本发明RNA适配体的进一步修饰，比如进一步在RNA适配体的5’末端添加磷酸基团修饰键(作用：保护RNA免受核酸酶的降解)或在5'末端添加PEG(聚乙二醇)标签(作用：延长适体在体内的半衰期)，将增加其治疗潜力。
实施例2、获得优选的可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体SKLPBT1
本发明优选的可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体(以SKLPBYT1为例)的获得方法，包括以下步骤：
1)获得靶标蛋白的稳定构象：与实施例1相同。
2)适配体序列与结构的人工设计：与实施例1相同。
3)候选适配体的筛选：根据靶标蛋白稳定构象中的结构特点，结合模拟生成的适配体库，选择能够特异结合至设计区域(A和E)的1个候选适配体(SKLPBY1)。使用mFold软件获得2个候选适配体(SKLPBY1)的二级结构(如图3A和图3B所示)，在此基础上，通过Rosetta软件获得1个候选适配体(SKLPBY1)的三级结构(如图4所示)。然后，通过Le Dock和HEX软件进行分子对接实验，通过分子对接实验进一步确定候选适配体(SKLPBY1)与靶标蛋白2个目的结合区域(A和E)的特异性结合能力。Le Dock软件的对接结果如图5所示，从图中可明显看出候选适配体(SKLPBY1)位于丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域，并与目的结合区域(A和E)特异性相结合。为了进一步验证候选适配体(SKLPBY1)与目的结合区域(A和E)的特异性结合，同步使用了HEX软件进行了对接实验，对接结果如图6所示，结果与LeDock软件的对接结果一致，候选适配体(SKLPBY1)明显位于丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域，并与目的结合区域(A和E)特异性相结合。
4)目标适配体序列与结构优化：候选适配体(SKLPBY1)的优选序列为CSAADCCCGGAAMGBGAACSG，其氨基酸序列如序列表中SEQ NO.1所示。用氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基，以使候选适配体具有核酸酶抗性，由此得到优化后的候选适配体结构，再次通过分子模拟来检测候选RNA适配体与丝状病毒包膜糖蛋白的特异性结合能力，将经修饰后特异性结合能力强的适配体确认为优选目标适配体(SKLPBT1)，目标适配体(SKLPBYT1)的优选序列为CASUUGSCCGGAAMGBGAUCSUG，其氨基酸序列如序列表中SEQNO.6所示。使用mFold软件获得优选目标适配体(SKLPBT1)的二级结构(如图11A所示)。在此基础上，通过Rosetta软件获得优选适配体(SKLPBT1)的三级结构(如图12A所示)。
5)目标适配体的结构再修饰：通过优化从候选RNA适配体中获得的优选目标适体(SKLPBT1)，序列长度只有30nt大小，在实际应用中易于生物合成。优选目的适配体(SKLPBT1)再经胆固醇基在5'末端和idT在3'末端化学修饰得到的适配体结构，可以抵抗核酸酶并且可以通过细胞膜，因此，当施用于细胞时，本发明的适配体(SKLPBT1)能有效地抑制丝状病毒感染。
本发明RNA适配体的进一步修饰，比如在RNA适配体的5’末端添加phosphothioate(中文：磷酸基团修饰)键(作用：保护RNA免受核酸酶的降解)或在5'末端添加PEG(聚乙二醇)标签(作用：延长适体在体内的半衰期)，将增加其治疗潜力。
实施例3、获得优选的可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体SKLPBT2
本发明优选的可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体(以SKLPBT2为例)的获得方法，包括以下步骤：
1)获得靶标蛋白的稳定构象：与实施例1相同。
2)适配体序列与结构的人工设计：与实施例1相同。
3)候选适配体的筛选：根据靶标蛋白稳定构象中的结构特点，结合模拟生成的适配体库，选择能够特异结合至设计区域(A和E)的1个候选适配体(SKLPBY2)。使用mFold软件获得1个候选适配体(SKLPBY2)的二级结构(如图7所示)，在此基础上，通过Rosetta软件获得1个候选适配体(SKLPBY2)的三级结构(如图8所示)。然后，通过Le Dock和HEX软件进行分子对接实验，通过分子对接实验进一步确定候选适配体(SKLPBY2)与靶标蛋白2个目的结合区域(A和E)的特异性结合能力。Le Dock软件的对接结果如图9所示，从图中可明显看出候选适配体(SKLPBY2)位于丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域，并与目的结合区域(A和E)特异性相结合。为了进一步验证候选适配体(SKLPBY2)与目的结合区域(A和E)的特异性结合，同步使用了HEX软件进行了对接实验，对接结果如图10所示，结果与Le Dock软件的对接结果一致，候选适配体(SKLPBY2)明显位于丝状病毒包膜糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域，并与目的结合区域(A和E)特异性相结合。
4)目标适配体序列与结构优化：候选适配体(SKLPBY2)的优选序列为CGKAGAMCAARAVACG，其氨基酸序列如序列表中SEQ NO.2所示。用氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基，以使候选适配体(SKLPBY2)具有核酸酶抗性，由此得到优化后的候选适配体结构。再次通过分子模拟来检测候选RNA适配体与丝状病毒包膜糖蛋白的特异性结合能力。使用mFold软件获得优选目标适配体(SKLPBT2)的二级结构(如图11B所示)。在此基础上，通过Rosetta软件获得优选适配体(SKLPBT2)的三级结构(如图12B所示)。将经修饰后特异性结合能力强的适配体确认为优选目标适配体(SKLPBT2)，目标适配体(SKLPBYT2)的优选序列为CGKGGAMCAARAGACMCG，其氨基酸序列如序列表中SEQ NO.7所示。
5)目标适配体的结构再修饰：通过优化从候选RNA适配体中获得的优选目标适体(SKLPBT2)，序列长度只有30nt大小，在实际应用中易于生物合成。
优选目的适配体(SKLPBT2)再经胆固醇基在5'末端和idT在3'末端化学修饰得到的适配体结构，可以抵抗核酸酶并且可以通过细胞膜，因此，当施用于细胞时，本实施例的适配体(SKLPBT2)能有效地抑制丝状病毒感染。
RNA适配体的进一步修饰，比如在RNA适配体的5’末端添加phosphothioate(中文：磷酸基团修饰)键(作用：保护RNA免受核酸酶的降解)或在5'末端添加PEG(聚乙二醇)标签(作用：延长适体在体内的半衰期)，将增加其治疗潜力。
用与实施例2或实施例3相同的方法，同样得到候选适配体SKLPBY3、SKLPBY4和SKLPBY5，其优选序列分别为：SKLPBY3：GCRAGAAMGCAADACAYGC，SKLPBY4：VAAAMACKAARAC，SKLPBY5：MAAACRGAS，其氨基酸序列分别如序列表中SEQ NO.3、SEQ NO.4和SEQ NO.5所示；进一步得到目标适配体SKLPBYT3、SKLPBT4和SKLPBT5，其优选序列分别为：SKLPBYT3：GCGCRAGAAMGCAAAKACMASGC，SKLPBT 4：YAAMACKAAR，SKLPBT 5：CMAWCAGKGCS，其氨基酸序列分别如序列表中SEQ NO.8、SEQ NO.9和SEQ NO.10所示。
实验例：计算机模拟功能验证
本实验以目标适配体SKLPBYT2为例，对其可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的功能进行验证。鉴于生物实验为严格控制的，本发明提供计算机模拟实验结果。
首先，分别将抗病毒包膜糖蛋白GP2蛋白的结构进行了分子动力学优化。将GP2蛋白用水球包裹，并在体系中加入离子以保证分子处于正常的生理环境及体系保持正常的电中性。其中，水分子的类型为TIP3P型，加入的离子为钠离子和氯离子，离子浓度为150mM/L。建模所用的软件是VMD，动力学优化所用的软件是开源的动力学计算软件NAMD。动力学过程所用的力场是CHARMM力场，体系的温度保持在310K，压强保持为正常1bar。另外，动力学过程还使用了截断函数，其中截断函数的计算开始于13埃，终止于15埃。实验中所用的GP2蛋白结构为pdb库下载的GP2结构，PDB ID：3CSY中的一部分。
3CSY结构中除了包含GP2蛋白结构外，还有包含SP结构域，GP1结构域，由于本发明研究的重点为GP2蛋白结构，所以将3CSY结构只保留了GP2蛋白结构进行优化。3CSY结构给出的是GP2蛋白三聚体结构，如图1所示。
然后，将前面分子动力学优化的GP2蛋白结构(图1)和适体分子6(SKPLBY6)和适体分子15(SKPLBY15)进行对接计算。用AutoDock分子对接软件进行分子对接的，对接所用的程序是AutoDock软件里的ADT程序，适体分子6和适体分子15分别与GP2蛋白的对接进行了100次，用以保证对接结果的可靠性和准确性。适体分子6对接的结构图见图13A，可以看出，适体分子6结合在了GP2蛋白N端的α螺旋区域，虽然这个α螺旋区域距离GP2蛋白C端的α螺旋区域距离很近，但是相关文献报道中提到GP2蛋白C端的α螺旋区域是保守的并且是分子结合的关键结构域，所以适体分子1与GP2蛋白的结合并不是很理想。适体分子15对接的结构图见图13B，适体分子15结合在了GP2蛋白N端的α螺旋区域和GP2蛋白C端的α螺旋区域中间，虽然这个结合区域距离GP2蛋白C端的α螺旋区域距离更近，但是相关文献报道中提到GP2蛋白C端的α螺旋区域是保守的并且是分子结合的关键结构域，所以适体分子1与GP2蛋白的结合并不是很理想。
最后，将前面分子动力学优化的GP2蛋白结构(图1)和适体分子1修饰前、后(SKPLBY1和SKLPBYT1)分别进行对接计算。用AutoDock分子对接软件进行分子对接，对接所用的程序是AutoDock软件里的ADT程序，适体分子1与GP2蛋白的对接进行了100次，用以保证对接结果的可靠性和准确性。对接的结构图见图14A和图14B，可以看出，适体分子1(SKPLBY1和SKLPBYT1)结合在了GP2蛋白N端的α螺旋区域。与相关文献报道中提到GP2蛋白C端的α螺旋区域是保守的并且是分子结合的关键结构域是吻合的，所以适体分子1可以特异性的与GP2蛋白结合且很理想。
计算机模拟实验显示，适体分子1(SKPLBY1和SKLPBYT1)能较强地特异地结合在GP2蛋白C端的α螺旋结构区，即：适体分子可以特异性地结合丝状病毒包膜蛋白。由于适体分子可以特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白，因为这个糖蛋白是进入宿主细胞的唯一途径，如果糖蛋白被分子特异性地结合了，病毒就不会进入宿舍细胞，进而就不会导致病毒感染。从而证明适配体SKPLBY1和SKLPBYT1可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体及其应用
<130> CGCNB185010W
<141> 2018-01-30
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBY1,人工序列Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Ser Asp Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Met Gly Asx Gly Ala Cys
1 5 10 15
Ser Gly
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBY2,人工序列Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Gly Lys Ala Gly Ala Met Cys Ala Ala Arg Ala Val Ala Cys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBY3,人工序列Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Cys Arg Ala Gly Ala Ala Met Gly Cys Ala Ala Asp Ala Cys Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Cys
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBY4,人工序列Artificial Sequence)
<400> 4
Val Ala Ala Ala Met Ala Cys Lys Ala Ala Arg Ala Cys
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBY5,人工序列Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Ala Ala Cys Arg Gly Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBT1,人工序列Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Ala Ser Ala Ala Gly Ser Cys Cys Gly Gly Ala Ala Met Gly Asx
1 5 10 15
Gly Ala Ala Cys Ser Ala Gly
20
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBT2,人工序列Artificial Sequence)
<400> 7
Cys Gly Lys Gly Gly Ala Met Cys Ala Ala Arg Ala Gly Ala Cys Met
1 5 10 15
Cys Gly
<210> 8
<211> 23
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBT3,人工序列Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Cys Gly Cys Arg Ala Gly Ala Ala Met Gly Cys Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala Cys Met Ala Ser Gly Cys
20
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBT4,人工序列Artificial Sequence)
<400> 9
Tyr Ala Ala Met Ala Cys Lys Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> RNA适配体(SKLPBT5,人工序列Artificial Sequence)
<400> 10
Cys Met Ala Trp Cys Ala Gly Lys Gly Cys Ser
1 5 10

Claims (10)

1.抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体，是能够特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白并抑制丝状病毒感染的RNA适配体，候选RNA适配体统称为SEQ ID SKLPBY，为以下SKLPBY1至SKLPBY5之一：
SKLPBY1：CSUUDCCCGGAAMGBGAUCSG，
SKLPBY2：CGKAGAMCAURUVACG，
SKLPBY3：GCRAGUUMGCUUDUCAYGC，
SKLPBY4：VUUAMACKUARUC，
SKLPBY5：MUAUCRGUS；
所述U包括但不限于A。
2.根据权利要求1所述的RNA适配体，其特征在于：其为包含如序列表中SEQ NO.1(SKLPBY1)或SEQ NO.2(SKLPBY2)或SEQ NO.3(SKLPBY3)或SEQ NO.4(SKLPBY4)或SEQ NO.5(SKLPBY5)所示的RNA分子，或与序列表具有至少90％同源性的核苷酸序列的RNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的RNA适配体，其特征在于：所述RNA适配体用氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基，得到的目的适配体统称为SEQ ID SKLPBT，为以下SKLPBT1至SKLPBT5之一:
SKLPBT 1：CASUUGSCCGGAAMGBGAUCSUG，
SKLPBT 2：CGKGGAMCAURUGACMCG，
SKLPBT 3：GCGCRAGUUMGCUUAKUCMUSGC，
SKLPBT 4：YUAMACKUAR，
SKLPBT 5：CMUWCAGKGCS；
所述U包括但不限于A。
4.根据权利要求3所述的RNA适配体，其特征在于：为包含如序列表中SEQ NO.6(SKLPBT1)或SEQ NO.7(SKLPBT2)或SEQ NO.8(SKLPBT3)或SEQ NO.9(SKLPBT4)或SEQ NO.10(SKLPBT5)所示的RNA分子，或与序列表具有至少90％同源性的核苷酸序列的RNA分子。
5.根据权利要求3或4所述的RNA适配体，其特征在于：为将所述目的适配体SEQ IDSKLPBT进一步用胆固醇基标记5'末端，用idT(反脱氧胸苷)标记3'末端得到的RNA适配体。
6.根据权利要求3或4或5所述的RNA适配体，其特征在于：为在所述目的适配体SEQ IDSKLPBT的5’末端进一步添加磷酸基团修饰键或PEG(聚乙二醇)标签得到的RNA适配体。
7.根据权利要求1至6任一所述的RNA适配体，其特征在于：所述丝状病毒包括埃博拉病毒和马尔堡病毒。
8.根据权利要求1-7任一所述的RNA适配体，其特征在于：所述RNA分子通过化学方法合成。
9.一种用于诊断丝状病毒的试剂盒，包含权利要求1-8任一所述的RNA适配体，通过探测RNA适配体是否与丝状病毒的包膜糖蛋白特异性结合实施诊断。
10.一种丝状病毒的抑制剂，其主要成分为权利要求1-8任一所述的抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体，该RNA适配体可以特异性地结合丝状病毒糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域的碳端，通过抑制丝状病毒与细胞膜的融合过程，达到抑制丝状病毒进入受体细胞的目的。
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