JP2004507263A - Vr1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はVR1に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、相応するヌクレオチド−構築物、これを含有する細胞、医薬品及び診断薬、疼痛治療のためのその使用、VR1と関連する症状の診断方法及び疼痛を引き起こす物質の同定方法に関する。
【0002】
疼痛の有効な治療は、分子医学にとって大きな挑戦である。急性の及び一過性の疼痛は、周囲環境又は身体の過負荷による重大な障害から身体を守るための身体の重要な信号である。これとは反対に、疼痛の原因よりも長く続きかつ治癒に期待される時間よりも長く続く慢性の疼痛は、既知の生物学的機能はなく、かつ世界中に一億人がこれに該当する。ドイツ連邦共和国内だけでも約750万人はが慢性の疼痛に苦しんでいる。不幸なことに、慢性の疼痛の薬理学的治療は未だに不十分であり、従って現在医学的研究に挑戦しているところである。現在研究されている鎮痛剤はあまり十分に有効であるとは言えず、部分的に重大な副作用を示してしまう。
【0003】
従って、特に慢性の疼痛の治療のために、疼痛を調節する作用、例えば低分子量の作用物質又は他の化合物、例えばアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を生じさせると考えられる新規のターゲットである身体固有の構造が探索された。Caterinaら(1997)によりクローニングされたバニロイド−レセプター−サブタイプ1(VR1、カプサイシンレセプターとも言われる)は、新規の疼痛医薬品の開発にとって有望な発端である。これは主に一次的感覚ニューロンにより発現するカチオンチャンネルである(Caterinaら1997)。VR1はカプサイシン(トウガラシ莢果の成分、熱(43℃を越える熱)及び低いpH値(プロトン)により、組織損傷の結果として活性化され、一次的輸入におけるカルシウム流入が生じる。VR1−ノックアウトマウスは組織損傷もしくは炎症による熱的痛覚過敏を生じない(Caterinaら,2000;Davisら,2000)。
【0004】
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、リボザイム及び他の触媒作用核酸は、選択されたターゲット(本発明の場合には前記したバニロイド−レセプター−サブタイプ1(VR1)(Caterinaら(1997)))のmRNAの分解及び変更による特に慢性の疼痛の治療のために使用することができ、この発現を下方調節し、それにより1細胞あたりのレセプターの数を減少することができる。このODNはmRNAに付着しており、一方で翻訳を遮断し、他方でDNA/RNA二本鎖内のRNAを切断するRNase HによるmRNAの分解を発動する。Porrecaら(1999)は、ラットにおいて髄腔内注入したODNがPN3/SNS−チャンネルに対して慢性の神経障害又は組織障害による痛覚過敏及び異痛症の発症を抑制することを示した。
【0005】
VR1の配列が公知であったとしても、mRNAの有効な遮断及び切断のためには特に正しいアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、リボザイム及び他の触媒作用核酸の選択が重要である。このターゲットのmRNAはたいていは折り畳まれており、付着及び引き続き切断するためにわずかな箇所があるだけである。しかしながらODNの正しい選択については、先行技術においても何も公知ではなかった。
【0006】
従って、本発明の課題は、バニロイドレセプターのmRNAに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及び触媒作用核酸並びに相応するリボザイムを開発することであった。従って、本発明の対象は、図1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15又は16のいずれか1つの図中のサブポイント(b)〜(j)のいずれか1つに記載された1つ又は複数の塩基配列、又は前記の塩基配列から最大で1個の塩基が異なるが、その際に、塩基の変異はサブポイント(a)に示された配列範囲には存在しない1つ又は複数の配列を有する、オリゴヌクレオチドである。この場合に、オリゴヌクレオチドとは本発明の範囲内で2〜40個のヌクレオチドを有する分子を意味する。
【0007】
本発明のもう一つの対象は、図1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15又は16のいずれか1つの図中のサブポイント(b)〜(j)のいずれか1つに記載された1つ又は複数の塩基配列を有するかもしくはそれに一致するオリゴヌクレオチドである。
【0008】
本発明のもう一つの対象は、図1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15又は16のいずれか1つの図中のサブポイント(k)に記載の1つ又は複数の塩基配列、又は前記の塩基配列から最大で2個の塩基が異なるが、その際に、この塩基の変異はサブポイント(a)に示された配列範囲には存在しない、有利に1つの塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致するオリゴヌクレオチドである。
【0009】
本発明のもう一つの対象は、図1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15又は16のいずれか1つの図中のサブポイント(k)に記載された1つ又は複数の塩基配列を有するかまたは前記の塩基配列に一致するオリゴヌクレオチドである。
【0010】
本発明の有利な対象は、オリゴヌクレオチドが15〜30ヌクレオチド、有利に15〜25ヌクレオチド、特に17〜19ヌクレオチド、正確に18ヌクレオチドの長さを有する、前記の本発明による実施形態の1つのオリゴヌクレオチドに記載された本発明によるオリゴヌクレオチドでもある。
【0011】
他の有利な対象は、前記の本発明による実施形態の1つのオリゴヌクレオチドに記載された本発明による特に有利なオリゴヌクレオチド(以後、オリゴヌクレオチドAと記載する)でもあり、その際、場合により1つの塩基が異なり、オリゴヌクレオチド中に含まれるオリゴヌクレオチドか又は前記のオリゴヌクレオチドに一致するオリゴヌクレオチドが、図1,2,3,4,9,10,11,12,15又は16のいずれか1つの図の塩基配列から取り出すことができる。従って、特に有効であると認識されたかもしくは相応する配列を場合によりわずかに変更されて有しているオリゴヌクレオチドは、VR1のmRNAとの高い結合率で結合すると考えられる(オリゴV15、V30、V2、V16及びV4もしくは相応するヒト配列参照)。
【0012】
他の特に有利な対象は、前記の本発明による実施形態の1つのオリゴヌクレオチドに記載された本発明による特に有利なオリゴヌクレオチド(以後、オリゴヌクレオチドBとする)でもあり、その際、場合により1つの塩基が異なり、オリゴヌクレオチド中に含まれるオリゴヌクレオチドか又は前記のオリゴヌクレオチドに一致するオリゴヌクレオチドが、図1,2,3,4,11又は12,有利に図1,3又は11、特に図1又は3のいずれか1つの図の塩基配列から取り出すことができる。
【0013】
本発明の有利な対象は、少なくとも1つの修飾された又は修飾されていないリボース、少なくとも1つの修飾された又は修飾されていないホスホジエステル結合及び/又は少なくとも1つの修飾された又は修飾されていない塩基を有する本発明によるオリゴヌクレオチドである。
【0014】
本発明のさらに特に有利な対象は、ヌクレオチドの少なくとも1つ、特に複数のヌクレオチドが「ロックド核酸」(“LNA”)であるか、又はヌクレオチドの少なくとも1つ、特に全てのヌクレオチドがホスホロチオエートであり、有利に複数のヌクレオチドが「ロックド核酸」(“LNA”)であることを特徴とする。「ロックド核酸」(“LNA”、Locked Nucleic Acid)とは、メチレン架橋を有するリボヌクレオチドであり、このメチレン架橋はリボースの2’−酸素を4’炭素とを結合している(図27参照)。LNAに関する概要は、Braasch D.A.及びCorey,D.R.(2001),Locked nucleic acids(LNA);fine−tuning the recognition of DNA and RNA.Chem.Biol.8,1−7に記載されている。この文献は、本願の発明の詳細な記載及び本願発明の開示の明確な構成要素である。LNAは例えばProligo,Boulder,CO社,USAにより提供されている。同様にホスホロチオエートは当業者に公知であり、例えばMWG−Biotech AG社,Ebersberg,Germanyで入手することができる。
【0015】
この場合、“LNA”がオリゴヌクレオチドの5’−末端及び3’−末端にあり、有利にオリゴヌクレオチドの3’−末端及び5’−末端のそれぞれ最後の2〜5個のヌクレオチド、特にそれぞれ最後の3又は4個のヌクレオチドが“LNA”であるか、
及び/又は
オリゴヌクレオチド中の6より多くの、特に8以上の連続するヌクレオチドが“LNA”ではなく、有利に図1から16のいずれか1つの図に記載されたオリゴヌクレオチドの、それぞれサブポイント(a)に記載された配列に示されたヌクレオチドの中で、サブポイント(b)〜(k)はそれぞれ多くても1つのヌクレオチドだけが“LNA”であるか、又はそのヌクレオチドのどれもが“LNA”ではないようなオリゴヌクレオチドが有利である。
【0016】
LNA又はホスホロチオエートで修飾されたオリゴヌクレオチドの場合には、本発明によるオリゴヌクレオチドA又は本発明によるオリゴヌクレオチドB、有利に本発明によるオリゴヌクレオチドB(上記参照)であるのが特に有利である。
【0017】
一般に、本発明の特別な単独の対象は、ヌクレオチドの複数が「ロックド核酸」(“LNA”)であり、このヌクレオチドの中でオリゴヌクレオチドの5’−末端及び3’−末端に“LNA”が存在し、有利にオリゴヌクレオチドの3’−末端及び5’−末端で、それぞれ最後の2〜5個のヌクレオチド、特にそれぞれ最後の3又は4個のヌクレオチドが“LNA”であり、及び/又は、その際、オリゴヌクレオチド中の6個より多くの連続するヌクレオチド、特に8以上の連続するヌクレオチドは“LNA”ではないような核酸、特にオリゴペプチドである。今までLNAに関して記載した実施形態は、この対象にも同様に通用する。
【0018】
本発明の別の有利な対象は、少なくとも1つの本発明によるオリゴヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド−構築物でもある。本願発明の範囲内で、ポリヌクレオチド−構築物とはきわめて広い意味であると解釈される。これには少なくとも20個のヌクレオチドの長さ以上のRNA及びDNA及びヌクレオチドが含まれる。この場合、(組み換え)ポリヌクレオチド−構築物とは、DNA分子もしくはRNA分子のそれぞれの種類に対する包括的な名称であると解釈され、これはDNA分子、RNA分子のインビトロ結合によって生じる。ポリヌクレオチドとは次の意味であると解釈される。基礎をなすヌクレオチドが、基本的にヌクレイン塩基、ペントース及びリン酸からなる、核酸の基本構成単位である。これは、リン酸−ペントース−エステル化によって相互に結合している複数のヌクレオチドからなる高分子量のポリヌクレオチドに相当する。本発明においては、しかしながら、塩基変更箇所を内包するが、リン酸−ペントースの代わりに変更された別の手段を提供する修飾されたポリヌクレオチドもこれに含める。
【0019】
別の有利な対象は、2つの相互に別個の領域に、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のサブポイント(l)〜(n)のいずれか1つに記載の、2つのヌクレオチド部分配列の断片I及び断片IIIを有するか、又はサブポイント(o)〜(q)のいずれか1つに記載の、2つのヌクレオチド部分配列のヘリックスI及びIIIを有するか、又は前記のヌクレオチド部分配列の中で最大で1つの塩基が異なるヌクレオチド部分配列を含有するポリヌクレオチド−構築物でもある。2つの領域の分割に関する詳細は、図24(ヘリックスI及びヘリックスIII/リボザイム)及びSantoroら(1997)の図2、第4264頁(断片I及び断片III/DNA−酵素)に記載されており、この場合に、後者の文献の内容は、本願明細書の開示に明確に内包される。
【0020】
他の有利な対象は、少なくとも1つの本発明によるオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド−構築物でもある。これには、特に読み取るべきDNA又はDNA又はRNAを含むベクターでも含まれ、この産物は本願発明によるオリゴヌクレオチドであることができる。
【0021】
他の有利な対象は、リボザイム、DNA−酵素、ベクター、特に発現ベクター又はPNAである、本発明によるポリヌクレオチド−構築物でもある。
【0022】
本発明の範囲内で、一般に次の意味を有する。
−(クローニング)ベクター:クローニングの際に外来遺伝子又はこの遺伝子の部分のキャリアとして利用する核酸−分子についての一般的な名称。
−発現ベクター:適当な宿主細胞中へ導入後にベクター内へクローニングされた外来遺伝子の転写及び翻訳を行うことができる特別に構築されたクローニングベクターについての名称。
−PNA:ペプチド核酸についての国際的に使用されている省略形。この場合、ペプチド結合したアミノ酸は1つの鎖を形成し、その際に、これらのアミノ酸は側鎖としてDNA又はRNAとハイブリダイズ可能な塩基を有している。
−配列:ヌクレオチド又はアミノ酸の連続体。本発明の特別な意味において、従って核酸配列を意味する。
−リボザイム:触媒活性のリボ核酸についての名称(例えばリガーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ)、例えば図24又は25記載のハンマーヘッド−リボザイム並びにこの図面の記載参照又はN.K.ら(1998),Nucl.Acid Res.26,5237−5242参照。
−DNA−酵素:触媒活性を有するDNA−分子についての名称(例えばリガーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ)、例えば図26記載のDNA−酵素10〜23並びにこの図面の記載参照又はSantaro and Joyce(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,4262−4266参照。
−触媒作用RNA/DNA:リボザイムもしくはDNA−酵素(上記参照)についての包括的名称。
【0023】
他の有利な対象は、2つの相互に別個の領域に、上記したような2つのヌクレオチド部分配列を有する本発明のポリヌクレオチド−構築物でもあり、これはリボザイム、有利に「ハンマーヘッド」リボザイム、又はDNA−酵素、有利にタイプ10−23又は12−32のDNA−酵素である。この場合に、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12又は13のいずれか1つの図、
有利に1,3,7又は11、特に1又は3のいずれか1つの図、又は
有利に4,6,8又は12、特に4又は12のいずれか1つの図中の
サブポイント(l)〜(n)のいずれか1つに、有利に(n)に記載のヌクレオチド部分配列の断片I及び断片IIIを少なくとも含有するDNA−酵素である場合が特に有利でありかつ選択される。同様に、ポリヌクレオチド構築物が、図1,3,4,5,6,8,11又は12のいずれか1つの図、
有利に1,3又は11のいずれか1つの図、特に図11、又は
有利に4,6,8又は12、特に4又は12のいずれか1つの図中の
サブポイント(o)〜(q)のいずれか1つに、有利に(o)に記載のヌクレオチド部分配列のヘリックスI及びヘリックスIIIを少なくとも含有するリボザイムである場合が特に有利でありかつ選択される。
【0024】
具体的に、有利な実施形態は特に図24及び25に記載されている。図24は一般的な図で、Vaish,N.K.ら(1998),Nucl.Acid Res.26,5237−5242による、「認識アーム」のヘリックスI及びヘリックスIIIを有する「ハンマーヘッド」−リボザイム(Hammerhead−Ribozym)を示しており、これらのヘリックス中へ図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のサブポイント(o)〜(q)による本発明によるヘリックスI及びIIIがそれぞれ導入されて、本発明による「ハンマーヘッド」−リボザイムになる。この場合に、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中の断片のヘリックスIは、図24によるヘリックスI中の任意のヌクレオチドに置き換えられており、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つのそれぞれの図中のヘリックスIの3’−末端の第1のヌクレオチドは、図24のヘリックスIの3’−末端の第1の任意のヌクレオチド「N」に置き換え、図24のヘリックスI中の次の任意のヌクレオチド「N」は、5’−末端方向で図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つのそれぞれの図中のサブポイント(o)〜(q)のそれぞれ1つのヘリックスIに示されているヌクレオチドに置き換えられる。図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のヘリックスIIIの5’−末端のヌクレオチド「A」及び「C」は図24中のヘリックスIIIのヌクレオチド「A」及び「C」をそれぞれ置き換え、図24のヘリックスIII中の次の任意のヌクレオチド「N」は、5’−末端の方向で図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つのそれぞれの図中のサブポイント(o)〜(q)のそれぞれ1つのヘリックIIIに示されているスヌクレオチドに置き換えられる。具体的な例は図25に示されている。「ハンマーヘッド」−リボザイムV16(7/7)は図24及び図11に由来する。酵素がオリゴV16のGUC−部位に対して結合性でありかつ「認識アーム」内にそれぞれ7個のヌクレオチド(ヘリックスI及びヘリックスIII)を含有し、この場合に図11中のサブポイント(o)のヘリックスI及びヘリックスIIIである場合に、リボザイムV16(7/7)といわれる。同様のことが図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つのぞれぞれの図中のサブポイント(o〜q)による全てのリボザイムにも通用する。
【0025】
具体的に、有利な実施形態は特に図26に記載されている。図26は一般的な図において、Santoroら,1997,図2、第4264頁に記載のタイプ10〜23のDNA−酵素を示している。上方の矢印で示された鎖は、分割すべきRNA−鎖であり、この場合に矢印は分割位置を表し、下側にはDNA−酵素が図示されている。本願明細書に関して、この場合に上側の鎖において「Y」=「U」であり、「R」=「G」であり、この場合、「Y」の3’−方向には「C」がある。従って、上側の鎖上の分割位置はいわゆるGUC−サイト(上記参照)である。相応して、下側の鎖中の「R」=「A」であり、下側の鎖中の「R」の5’−方向には対応する「G」が存在する。これに、5−方向に図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つのそれぞれの図中のサブポイント(l〜n)に記載された断片Iからの他のヌクレオチドが後続する、つまり、サブポイントIの場合には5つの他のヌクレオチドが、サブポイントmの場合には6つの他のヌクレオチドが及びサブポイントnの場合には7つの他のヌクレオチドが後続する。図25に記載された断片III(RNAと塩基対されていない第2の断片)において、断片IIIに隣接する対になっていない「A」に直接5’−方向から3’−方向で、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つのそれぞれの図中のサブポイント(l〜n)に記載された断片IIIからのヌクレオチドが後続し、つまり、サブポイントlの場合には7つの他のヌクレオチドが、サブポイントmの場合には8つの他のヌクレオチドが及びサブポイントnの場合には9つの他のヌクレオチドが後続する。断片III及び断片IはいわゆるDNA−酵素の「認識アーム」(後に記載する例3参照)である。
【0026】
本発明の範囲内で特に有利な、図1によるサブポイント(n)についてのタイプ10〜23のDNA−酵素は、従って次の配列を有し、この場合、下線の部分はRNAと塩基対している。
【0027】
【外1】
【0028】
このDNA−酵素はV15(9/9)といわれ、この場合にこの名称は、この酵素がオリゴV15のGUC−部位と結合性でありかつ、認識アーム内にそれぞれ9つのヌクレオチド(断片I及びIII)を有する、例えば図1中のサブポイント(n)の断片I及び断片IIIによるヌクレオチドを有することを表している。同様のことが、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つのそれぞれの図中のサブポイント(l〜n)に記載の全てのDNA−酵素にも通用する。
【0029】
他の有利な対象は本発明によるペプチド−構築物でもあり、この場合にこの構築物は少なくとも1つの修飾された又は修飾されていないリボース、少なくとも1つの修飾された又は修飾されていないホスホジエステル結合及び/又は少なくとも1つの修飾された又は修飾されていない塩基を有する。
【0030】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物であり、この場合に、これらは担体、特にタンパク質、有利にtet−、トランスポーチン又はフェリチンと結合しているか及び/又はリポソーム内に封入されている。
【0031】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド及び/又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物の少なくとも1つを含有する細胞でもある。
【0032】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び/又は本発明による細胞の少なくとも1つ、並びに場合により適当な助剤及び/又は添加剤を含有する医薬品でもある。本発明による医薬品は、液状の医薬形状として注射溶液、滴下薬又は液剤の形に加工することができ、半固体の医薬形状として顆粒剤、錠剤、ペレット剤、パッチ剤、カプセル剤、プラスター剤又はエアゾール剤の形に加工することができ、かつ少なくとも1つの本発明の対象物の他に、医薬形状に応じて場合により担持剤量、充填剤、溶剤、希釈剤、着色剤及び/又は結合剤を含有することができる。助剤並びにその使用すべき量の選択は、医薬品が、口腔内、経口、腸管外、静脈内、腹腔内、皮内、筋肉内、鼻腔内、バッカル、直腸又は局所的、例えば皮膚の感染箇所、粘膜及び目に適用するかどうかに依存している。経口投与のためには、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、滴下剤、液剤及びシロップ剤の形状の調製剤が適しており、腸管外、局所及び吸入適用のためには、溶液剤、懸濁剤、容易に再構成可能な乾燥調製剤並びにスプレーが適している。場合により皮膚浸透を促進する薬剤を添加した溶液の形のデポー剤又はプラスター剤の形の本発明による対象は、適当な経皮的用調製剤である。経口又は経皮適用可能な調剤形状は、本発明による対象物を遅延放出することができる。患者に投与される作用物質量は、患者の体重、投与経路、疾患の指標及び重度に依存して変えられる。通常は、少なくとも1つの本発明による対象物は2〜500mg/kgである。この医薬品を特に遺伝子治療のために使用する場合には、適当な助剤又は添加剤として、例えば生理食塩水、安定剤、プロテイナーゼ阻害剤、DNAアーゼ阻害剤などである。
【0033】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び/又は本発明による細胞の少なくとも1つ、並びに場合により適当な添加剤を含有する診断薬でもある。
【0034】
この場合に、次の意味を有する:
−医薬品:医薬品の流通に関するドイツ法(AMG)第1条第2章に相当する物質。つまり、ヒト又は動物の身体に適用することにより、
1.疾病、疾患、身体的損傷又は病的な苦痛を治癒、緩和、予防又は診断のため、
2.身体の性質、状態又は機能又は精神状態を診断するため、
3.ヒトの身体から生じた作用物質又は体液を交換するため、
4.病原体、寄生体又は体外物質を撃退、排除又は無害化するため、又は
5.身体の性質、状態又は昨日又は精神状態に影響を及ぼすため
に用いるように決められている物質又は物質からなる調製物。
−診断薬:疾病を診断するために使用することができる化合物又は方法。
【0035】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び/又は本発明による細胞の少なくとも1つの、疼痛、特に慢性の疼痛、触覚性異痛症(Allodynie)、熱により引き起こされる疼痛、及び/又は炎症性疼痛を治療するための医薬品の製造のための使用でもある。
【0036】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び/又は本発明による細胞の少なくとも1つの、ハルニン尿失禁(Harninkontinenz)、神経性水疱症状、そう痒、腫瘍、炎症、特に喘息のような症状を伴うVR1レセプターに関連する炎症、並びにVR1と関連する全ての疾患症状を治療する医薬品の製造のための使用でもある。
【0037】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び/又は本発明による細胞の少なくとも1つの、遺伝子治療、有利にインビボ又はインビトロの遺伝子治療のための使用でもある。遺伝子治療とは、細胞内へ核酸を導入することにより、エフェクター遺伝子、たいていはタンパク質、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現させる治療形態であると解釈される。原則としてインビトロ法とインビボ法とに分類される。インビトロ法では、器官から細胞を取り出し、エクスビボでベクターを用いてトランスフェクションし、引き続き同様の器官又は他の器官内へ再び導入する。インビトロ遺伝子治療の場合には、ベクターを例えば腫瘍に対抗させるために全身に(例えば血管を介して)又は直接腫瘍内へ適用する。
【0038】
他の有利な対象は、有利に標識した、本発明によるオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物の少なくとも1つとRNAとの結合の定量化に関する同定を行うことを特徴とする、疼痛を調節する物質を同定する方法でもある。
【0039】
他の有利な対象は、次の方法工程:
(a)本発明によるオリゴヌクレオチド及び/又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物の少なくとも1つを用いて、細胞(試験細胞)の少なくとも1つを遺伝子工学により操作する工程、
(a’)同じ細胞(対照細胞)の少なくとも1つを
・操作を行わないか、
・オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド−構築物なしで並行して操作を実施するか、又は
・本発明によるものとは異なるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド−構築物で並行して遺伝子工学により操作する工程、
(b)少なくとも1つの試験細胞と、少なくとも1つの対照細胞と及び/又はバニロイド−レセプター−ファミリー、有利にVR−1−レセプターから選択される少なくとも1種のレセプタータンパク質を合成したような細胞からの調製物を用いて適当な条件下で試験すべき物質とを並行してインキュベートする工程、
(c)試験物質と細胞から合成されたタンパク質との結合を測定するか、又は試験物質とタンパク質との結合により変更された機能パラメータの少なくとも1つを測定する工程、
(d)試験細胞における測定値と対照細胞における測定値との差異の程度によって物質を同定する工程
を有する、疼痛を調節する物質を同定する方法でもある。
【0040】
この場合に、疼痛を調節するとの概念は、生理学的疼痛現象に関して潜在的に調節する作用、特に鎮痛作用に関している。物質との概念は、医薬品−作用物質として適当な化合物、特に低分子量の作用物質、また同様に核酸、脂肪、糖、ペプチド又はタンパク質、例えば抗体を包括する。適当な条件下でのインキュベーションとは、この場合に、試験すべき物質は細胞又は相応する調製物と水性媒体中で測定の前に規定の時間反応することができることであると解釈される。この場合、水性媒体は、例えば4℃〜40℃の間に、有利に室温又は37℃で温度調節することができる。インキュベーション時間は、物質とレセプターとの間の相互作用に応じて数秒から数時間の間で変えることができる。しかしながら1分から60分の間の時間が有利である。この水性媒体は適当な塩及び/又は緩衝系を含有することができるため、インキュベーション時に例えば媒体はpH6〜8、有利にpH7.0〜7.5である。媒体に他の適当な物質、例えば補酵素、栄養素などを添加することもできる。方法においてできる限り明らかな測定値を得るために、適当な条件は、当業者によって、物質とレセプターとの試験すべき相互作用に依存して、経験、文献又はわずかな簡単な予備試験によって容易に確認することができる。レセプターを合成した細胞は、そのレセプターをすでに内在的に発現した細胞であるか又は、このレセプターを発現しかつ本発明による方法の開始の前に相応してレセプターを含有している遺伝子工学的に変更した細胞である。この細胞は、場合により樹立化細胞株からなる細胞であることもでき又は天然に組織から由来しかつこの組織から単離された細胞であることができ、この場合に、細胞の結合はたいていは解消されている。これらの細胞からの調製物は、特に細胞からなるホモジネート、細胞質ゾル、膜断片を有する細胞の膜フラクション、単離された細胞オルガネラの懸濁液などである。
【0041】
この方法が興味深い物質を探し出すことができる基準は、例えば公知のリガンドの排除によるか又は結合した物質の程度により検出することができるレセプターとの結合であるか、又は物質とレセプターとの相互作用による機能パラメータの変化である。この相互作用は、特にレセプター、イオンチャンネル及び/又は酵素の調整、阻害及び/又は活性化であることができ、変更される機能パラメータは例えば遺伝子発現、イオン環境、pH又は膜電位、もしくは酵素活性又は第2次情報伝達物質の濃度の変化であることができる。この場合に次の意味を有する:
−遺伝子工学による操作:遺伝子材料を導入することによる細胞、組織又は器官の操作。
−内因性発現:発現のための遺伝子工学的操作によりこの該当するタンパク質を誘導させることなしの、適当な培養条件下でセルラインを有するタンパク質の発現。
【0042】
この方法の他の有利な実施形態は、方法工程(a)及び(a’)の前にすでに細胞を遺伝子工学による操作することである。
【0043】
この方法の他の有利な実施形態は、遺伝子工学による操作が、試験物質により変更された機能パラメータの少なくとも1つの測定を可能にすることである。
【0044】
この方法の他の有利な実施形態は、遺伝子工学による操作によって、バニロイド−レセプター−ファミリー、有利にVR−1−レセプターの構成員を、細胞内で内因性に発現しない形で発現させるか又はレポーター遺伝子を導入することである。
【0045】
この方法の他の有利な実施形態は、バニロイド−レセプター−ファミリー、有利にVR−1−レセプターの構成員の既知の標識されたリガンドの変更によって結合の測定を行うことである。
【0046】
この方法の他の有利な実施形態は、並行する方法工程(a)及び(a’)と、方法工程(b)との間で8時間以上、有利に12時間以上、特に24時間以上経過させることである。
【0047】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド及び/又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物の少なくとも1つとRNAとの結合の定量化によって診断を行うことを特徴とする、バニロイド−レセプター−ファミリーの遺伝子の変更された発現と関連している疾患症状を診断する方法でもある。
【0048】
このオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド−構築物も当業者に公知の方法により製造される。この場合に、ヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドは、例えばメリフィールド−合成の方法によって、不溶性担体(H.G.Gassenら,Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments(Verlag Chemie,Weinheim 1982))上で又は他の方法(Beyer/Walter;Lehrbuch der Organischen Chemie,第20版(S.Hirzel Verlag,Stuttgart 1984)、第816頁以降)によって合成される。
【0049】
本発明の他の対象は、本発明による医薬品、特に本発明によるオリゴヌクレオチド及び/又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物を含有する医薬品の投与による、疼痛、特に慢性の疼痛の治療を必要としているヒト以外の哺乳動物又はヒトの治療のための、特に疼痛治療のための方法である。他の対象は、そう痒及び/又はハルニン抑制の治療のための相応する方法である。
【0050】
次の実施例及び図面は本発明を詳説するが、本発明の対象を制限するものではない。
【0051】
(図面及び実施例)
図面
図面及び図は同じ意味を表すものと見なされる。同様に、図との関連で、サブタイプ又はサブポイントは同じ意味を表す。図示された配列における「X」は、VR1のmRNAに関する相応する塩基に相補的な任意のヌクレオチドを表す。図面は次のことを表している:
【0052】
【図1】
ラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する一般的なヌクレオチド配列、本願明細書において頻繁にオリゴV15、オリゴヌクレオチド番号15又はV15と表される。サブポイント(a)〜(j)はこれらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列から短縮された断片を示し、サブポイント(k)は、「メッセンジャー ワーク スクリーニング」が実施された完全なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列を表し、サブポイント(l)〜(n)は、完全なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列から出発するヌクレオチド配列のそれぞれ2つの(断片I及び断片III)を表し、このヌクレオチド配列はそれぞれはこの配列のオーバーラップしない部分領域を有するかもしくはこの部分領域に相当し、たいていはGAC−領域に接してもしくはGAC−領域内で切断されており、所定のポリヌクレオチド構築物の形、特にDNA−酵素の形、2つの相互に別々の領域で、「認識アーム」の形になっており、サブポイント(o)〜(q)は完全なアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発するヌクレオチド部分配列(この場合いずれもRNAとして)のそれぞれ2つ(ヘリックスI及びヘリックスIII)を示し、これらはそれぞれこの配列のオーバーラップしない部分領域を有するかまたはこの部分領域に相当し、たいていはGAC−領域に接して又はGAC−領域内で切断されており、所定のポリヌクレオチド構築物の形、特にリボザイムの形、2つの相互に別々の領域で、「認識アーム」の形になっている。
【0053】
【図2】
mRNA上の位置中の図1中のオリゴV15に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ(a)〜(k)は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図1に記載したものに相当する。
【0054】
【図3】
ラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴV30、オリゴヌクレオチド番号30又はV30と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図1に記載したものに相当する。
【0055】
【図4】
mRNA上の位置中の図3中のオリゴV30に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ(a)〜(q)は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図1に記載したものに相当する。
【0056】
【図5】
ラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴV32、オリゴヌクレオチド番号32又はV32と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図1に記載したものに相当する。
【0057】
【図6】
mRNA上の位置中の図5中のオリゴV32に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ(a)〜(q)は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図1に記載したものに相当する。
【0058】
【図7】
ラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴV26、オリゴヌクレオチド番号26又はV26と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図1に記載したものに相当する。
【0059】
【図8】
mRNA上の位置中の図7中のオリゴV26に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列。このサブタイプ(a)〜(q)は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図1に記載したものに相当する。
【0060】
【図9】
ラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴV2、オリゴヌクレオチド番号2又はV2と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図1に記載したものに相当する。
【0061】
【図10】
mRNA上の位置中の図9中のオリゴV2に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列。このサブタイプ(a)〜(k)は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図1に記載したものに相当する。
【0062】
【図11】
ラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴV16、オリゴヌクレオチド番号16又はV16と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図1に記載したものに相当する。
【0063】
【図12】
mRNA上の位置中の図11中のオリゴV16に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ(a)〜(q)は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図1に記載したものに相当する。
【0064】
【図13】
ラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴV28、オリゴヌクレオチド番号28又はV28と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図1に記載したものに相当する。
【0065】
【図14】
mRNA上の位置中の図13中のオリゴV28に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ(a)〜(k)は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図1に記載したものに相当する。
【0066】
【図15】
ラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴV4、オリゴヌクレオチド番号4又はV4と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図1に記載したものに相当する。
【0067】
【図16】
mRNA上の位置中の図15中のオリゴV4に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列。このサブタイプ(a)〜(k)は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図1に記載したものに相当する。
【0068】
【図17】
図17)はメッセンジャー ワーク スクリーニングの結果を示す。それぞれのトレースにおいて、切断されていない基質の上方のバンドの他に、切断されたmRNAの2つの生成物バンド並びにいくつかの非特異的なバンドを見ることができる。このVR1 mRNAは33種のオリゴヌクレオチド(オリゴV1〜オリゴV33)のそれぞれ1つの存在でRNase Hによる分解後に見ることができる。各トレースにおいて切断されていない基質の上方のバンドの他に切断されたmRNAの2つの生成物バンド並びにいくつかの非特異的なバンドを見ることができる。
トレース1:VR1 mRNA、トレース2〜34:VR1 mRNAの33種のGUC−部位(オリゴV1〜オリゴV33)に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドを用いたRNase Hアッセイ。
【0069】
【図18】
メッセンジャー ワーク スクリーニングの定量的評価。図18中では個々のODNを用いたRNase Hアッセイによる切断されていないmRNAのパーセント表示による割合をプロットした。それぞれの値は、少なくとも3つの実験からの平均値を表すため、この標準偏差はいずれの場合も10%を上回らない。第15及び第30のGUC−部位に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドは最も有効にVR1 mRNAに結合するため、これは88±4もしくは97±1%までRNase Hによって分解される(オリゴV15及びオリゴV30)。
【0070】
【図19】
オリゴヌクレオチドV15、V15Ktr.(ミスマッチ)、V30及びV30Ktr.(ミスマッチ)を用いたRNase Hアッセイによるゲルの画像。オリゴデオキシヌクレオチドV15、V15Ktr.、V30及びV30Ktr.(トレース2〜5)。
【0071】
【図20】
「シングル−ターンオーバー」条件下でのリボザイム及びDNA−酵素によるmRNAの切断の定量的評価。
【0072】
【図21】
「シングル−ターンオーバー」条件下でのリボザイム及びDNA−酵素によるVR1 mRNAの切断の速度。
【0073】
【図22】
「マルチプル−ターンのバー」条件下でのリボザイム及びDNA−酵素によるVR1 mRNAの切断の速度。
【0074】
【図23】
VR1−アンチセンス(AS)−オリゴデオキシヌクレオチドとミスマッチ(MS)−オリゴデオキシヌクレオチド(V15及びV15Ktr.)による処理の間の触覚性異痛症の評価。
【0075】
【図24】
本発明による「ハンマーヘッド」リボザイムになるための、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13及び15のいずれか1つの図中のサブポイント(o)〜(q)に記載されたヘリックスI及びヘリックスIIIのそれぞれが組み込まれる「認識アーム」のヘリックスI及びヘリックスIIIを有する「ハンマーヘッド」リボザイムの一般的な図(図1の記載を参照)。この場合、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中に断片のヘリックスIは、図24に記載のヘリックスI中の任意のヌクレオチドを置き換えるため、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のヘリックスIの3’−末端にある最初のヌクレオチドは、図24のヘリックスIの3’−末端にある最初の任意のヌクレオチド「N」を置き換え、かつ図24中のヘリックスI中の次に続く任意のヌクレオチド「N」は5’−末端方向へ向かって、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のヘリックスIのサブポイント(o)〜(q)のいずれか1つに示されているヌクレオチドに置き換えられる。図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のヘリックスIIIの5’−末端にあるヌクレオチド「A」及び「C」は、それぞれ図24中のヘリックスIII中のヌクレオチド「A」及び「C」をそれぞれ置き換え、図24のヘリックスIII中の次に続く任意のヌクレオチド「N」は5’−末端の方向へ向かって図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のヘリックスIIIのサブポイント(o)〜(q)のいずれか1つに示されているヌクレオチドによりそれぞれ置き換えられる。具体的例は図25に示されている。
【0076】
【図25】
図24及び図11による(特に有利な)「ハンマーヘッド」−リボザイムV16(7/7)を示す図。この場合、リボザイムV16(7/7)は、オリゴV16のGUCに対して結合する酵素であり、かつ「認識アーム」中ではそれぞれ7個のヌクレオチド(ヘリックスI及びヘリックスIII)を有し、この場合、これらは図11)中のサブポイント(o)のヘリックスI及びヘリックスIIIに記載されている。同様のことが図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のサブポイント(o〜q)に記載の全てのリボザイムに通用する。
【0077】
【図26】
Santoroら,1997,図2,第4264頁に記載されたタイプ「10−23」のDNA−酵素を示す図。
【0078】
上側の、矢印で示された鎖は、分割されるべきRNA−鎖であり、この場合に、この矢印は切断位置を示し、下側の鎖はDNA−酵素の図である。本願明細書と関連して、この場合、上側の鎖中の「Y」は「U」であり、かつ「R」は「G」であり、この場合、「Y」の3’側には「C」がある。この上方の鎖上の切断位置は従っていわゆるGUC−部位(上記参照)である。相応して、下側の鎖中の「R」は「A」であり、下側の鎖中の「R」の5’側には相応して「G」が存在する。これの5側にさらに、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のサブポイント(l〜n)に記載の断片Iからなる他のヌクレオチドが後続する、つまりサブポイントlの場合には5個の他のヌクレオチドが後続し、サブポイントmの場合には6個の他のヌクレオチドが後続し、サブポイントnの場合には7個の他のヌクレオチドが後続する。図25の断片III(RNAと塩基対した第2の断片)では、次いで5’方向から3’側で断片IIIに隣接する対になっていない「A」に接して、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のサブポイント(l〜n)に記載の断片IIIからなるヌクレオチドが後続し、つまりサブポイントlの場合には7個の他のヌクレオチドが後続し、サブポイントmの場合には8個の他のヌクレオチドが後続し、サブポイントnの場合には9個の他のヌクレオチドが後続する。断片III及び断片IはDNA−酵素のいわゆる「認識アーム」である(例3参照)。図1に記載のサブポイント(n)に対するタイプ「10−23」のDNA−酵素は、次の配列を有すし、この場合に下線の部分はRNAと塩基対している。
【0079】
【外2】
【0080】
この(特に有利な)DNA−酵素はV15(9/9)として表され、この場合に、この酵素がオリゴV15のGUC−部位に対して結合しており、かつこの表示は「認識アーム」中にそれぞれ9個のヌクレオチド(断片I及びIII)を有していることを表し、これは例えば図1)中のサブポイント(n)の断片I及び断片IIIに記載されている。同様のことが、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13及び15のいずれか1つの図中のサブポイント(l〜n)に記載された全てのDNA−酵素に通用する。
【0081】
【図27】
「ロックド核酸」LNAを示す図式的な図。
【0082】
実施例
普遍的に適した切断箇所の同定:
アンチセンス−及びリボザイム−戦略の第1の段階は、オリゴヌクレオチドの結合のための、しかしながら特にリボザイムの結合のためのmRNAのアクセス可能な部位の同定である。このためには、この切断箇所に関するVR1のmRNAを調査しなければならない。VR1−mRNAの分析はコードする領域内でリボザイムに対して次の潜在的認識箇所が生じる:
33X GT(U)C−配列
28X GT(U)T−配列
12X GT(U)A−配列。
【0083】
VR1−mRNAのアクセス可能な箇所を探し出すために、第1の段階で、次の配列の3つの独立したヌクレオチド混合物を合成した:
混合物1:NNNAACNNN いわゆるGUU−ライブラリー
混合物2:NNNCACNNN いわゆるGUA−ライブラリー
混合物3:NNNGACNNN いわゆるGUC−ライブラリー
これらは、RNase H−発現において連続して使用され、かつGUC−ライブラリーとだけVR1−mRNAの言及に値する分解が観察されたことが明らかとなった。従ってリボザイムに対する潜在的な目標配列の中でVR1 mRNA中の33種のGUC−部位が最も良好にアクセス可能であり、これらをさらなる分析のために使用した。
【0084】
実施例2:
有効なアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの同定
メッセンジャー ワーク スクリーニング
アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドに対してアクセス可能なmRNAの領域の同定のために、これを系統的にRNase HアッセイにおいてODNを用いてスクリーニングした(メッセンジャー ワーク スクリーニング)。このODNは18個のヌクレオチドの長さであり、その中央に、mRNA中のGUC配列に対する逆−相補的であるGAC−配列を有する。このトリプレットがターゲットとして選択された、それというのもこれが良好な結果を示しかつハンマーヘッド−リボザイム及びDNA−酵素の発生のための2の段階において使用できるためである。全部で、V1〜V33として表した33種のODNが、VR1−mRNAの全てのGUC−部位に対して試験された。これらのODNは、mRNAにそれぞれ1つのODN及びRNase Hを添加することにより系統的にその性質に関してスクリーニングした。このRNase Hは、オリゴヌクレオチドがmRNAに常に結合できる、形成されたDNA/RNA−二重鎖を切断する(図17)。
【0085】
VR1 mRNAのインビトロトランスクリプション
まず最初に、バニロイド−レセプターのcDNAをInvitrogen社のベクターpcDNA3.1(+)中へクローニングした。引き続きこのmRNAのインビトロトランスクリプションを、Promega社のRiboMAX Large Scale RNA Production System−T7を用いて製造元の指示に従って行った。
RNase Hアッセイ
アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドがmRNAに結合したかどうかをテストするために、RNase Hアッセイを実施した。このために、VR1−mRNA(100mM)を、5倍の過剰量のODNと一緒に、Tris/HCl(pH7.2)40mM;MgCl2 4mM;DTT 1mM及びNaCl 150mMの総容量10μl中で7.5分間37℃でRNase H(Promega社)0.4uの存在でインキュベーションした。この反応をEDTA(65mM最終濃度)の添加により停止した。この試料を1.5%のアガロースゲルを用いて分離し、エチジウムブロミド(1μg/ml)で20分間染色した。このゲルを、Biorad社のGel Doc 2000 Gel Documentation Systemを用いて写真撮影し、Quantity Oneプログラムを用いて評価した。
【0086】
図17はこのメッセンジャー ワーク スクリーニングの結果を示す。各トレース中には切断されていない基質の上側のバンドの他に、切断されたmRNAの2つの生成物バンド並びに非特異的バンドが見られる。
【0087】
RNA−分解の定量化は、目的−mRNAに対して5倍の過剰量で使用した場合に、最も有効なアンチセンス−オリゴヌクレオチド(オリゴ番号30(V30))がVR1 mRNAの90%以上を切断/分解できることを示した(図18)。
【0088】
個々のバンドの強度を評価した。図18では、個々のODNに対して切断されていないmRNAの割合がRNase Hアッセイに対してプロットされている。この15番目及び30番目のGUC−部位(オリゴV15及びオリゴV30)に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドは最も有効にVR1−mRNAに結合し、その結果、これは88±4もしくは97±1%までRNase Hによって分解される。
【0089】
この試験において有効なアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列は、図1,3,5,7,9,11,13及び15に示されており、この場合、特にオリゴV15(図1)及びオリゴV30(図3)が参考として有利であると考えられる。
【0090】
このアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドに対するミスマッチ−対照として、次の発現のためにオリゴデオキシヌクレオチドが合成されかつ使用され、このオリゴデオキシヌクレオチドは5番目の塩基と6番目の塩基とがそれぞれ交換されている(もしくは、これらが同じ場合には、隣接する2つの塩基と交換されている)。この対照の配列のオリゴデオキシヌクレオチド(ミスマッチ)を次に記載する:
オリゴV15Ktr.:CAT GCT ATG AGC GTT GAG
オリゴV30Ktr.:ATC TGT TTG AGC GTC TAC
対照のために、RNase HアッセイをオリゴヌクレオチドV15、V15Ktr.、V30及びV30Ktr.を用いて実施した(図19参照)。期待通りにこのRNAはアンチセンス−ODNによってだけ分解され、ミスマッチ−対照によっては分解されなかった、それというのもmRNAに結合しなかったためである。
【0091】
要約:
VR1 mRNAの全てのGUC−トリプレットに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドを用いたRNase Hアッセイにおいて、GUC−トリプレット(2,4,15,16,26,28,30及び32)、特に15及び30番目のものに対するオリゴデオキシヌクレオチドが、最も良好に結合するODNであると同定することができた。このオリゴデオキシヌクレオチド並びに2つのミスマッチ−対照は、従って動物モデルでの試験のために及び他の使用のために提供する。
【0092】
相応して、図2,4,6,8,10,12,14,16に記載のヒト配列も重要であり、この位置に関してはラットにおいて見られたものに一致する。ラット及びヒトのmRNAは、著しく相同性(おそらくは折り畳みにおいても)であり、従って、ラットのmRNAに関する有利に達成可能な同定された切断位置はヒトの場合にも重要であることは明らかである。この場合に、GUC−トリプレットをも示す配列が特に有利であり、図4,6,8及び12及びラットに類似する局在化に基づきV15及びV30も図2及び4に記載されたものと同様に有利である。
【0093】
実施例3:
リボザイム及びDNA−酵素
さらに、見出された有効な結合箇所に基づく相応するリボザイム及びDNA−酵素を試験した。
【0094】
「ハンマーヘッド」−リボザイム及びタイプ「10−23」のDNA−酵素(Santoroら,1997)は、ODNに対してアクセス可能であった位置に対してmRNAを構築した。「認識アーム」の長さはそれぞれのサイドで、7又は9個のヌクレオチドであった。「シングル ターンオーバー」条件(10倍の過剰量のリボザイム及びDNA−酵素)下でのmRNA−分割/切断の定量的評価は、37℃で20分後に、より短い「認識アーム」(ヘリックスI及びヘリックスIII)を有するリボザイムが活性化されており、DNA−酵素の場合にはより長い「アーム」(断片I及び断片III)を有するものが活性化されていることを示した(図20)。ヘリックスI及びIIIを有するリボザイムの図式的な図は図24であり、その例は図25である。DNA−酵素10−23については、Santoroら(1997;第4264頁、図2)(触媒活性モチーフの5’側(断片I)及び3’側(断片III))、その図面に関する記載から推知できる(図26も参照)。
【0095】
リボザイム及びDNA−酵素を用いた試験は、Tris/HCl(pH7.5)50mM及びMgCl2 10mM中で37℃で実施した。「シングル−ターンオーバー」−試験のために、リボザイム及びDNA−酵素を10倍の過剰量で使用した。「マルチプル−ターンオーバー」−試験の場合には、基質のmRNAを10倍の過剰量で使用した。
【0096】
「シングル−ターンオーバー」−速度論
速度論分析を「シングル−ターンオーバー」−条件下で2つの最も有効なリボザイム及びDNA−酵素に対して実施した(図21)。このデータを表1にまとめた。DNA−酵素V15(9/9)(図26の記載を参照)(これはmRNAを二相性の速度論で切断)は最も速い速度(速度定数)を示し、これにリボザイムV16(7/7)(図25参照)、DNA−酵素V30(9/9)が続き、最も緩慢なのはリボザイムV15(7/7)であった。この場合に、例えばDNA−酵素V15(7/7)は、オリゴV15のGUC−部位に対して結合しかつ「認識アーム」においてそれぞれ7個のヌクレオチド(断片I及びIII)を含有する酵素を表し、これは例えば図1中のサブタイプ(l)の断片I及びIIIに記載されている。
【0097】
表1:「シングル−ターンオーバー」−条件下でのVR1 mRNAに対するリボザイム及びDNA−酵素の速度論的データ
【表1】
「マルチプル−ターンオーバー」−速度論
「マルチプル−ターンオーバー」−条件下(10倍の基質過剰量)でのmRNAの切断を図22に示した。ここでも、DNA−酵素V15(9/9)がリボザイムV16(7/7)(図2)よりも高い見掛け(apparente)速度(速度定数)(ファクター3.4)を示した。
【0098】
表2:「マルチプル−ターンオーバー」−条件下でのVR1 mRNAに対するリボザイム及びDNA−酵素の速度論的データ
【表2】
実施例4
インビボ実験
20匹のオスのSprague−Dawleyラット中で、左側のL5/L6脊髄神経に、Kim及びChung(1992)による脊髄神経−結紮を付けた。同じ時間にPogatzkiら6(2000)による脊髄カテーテルをインプラントした。手術の4〜6日後に、同側性及び対側性の後ろ脚についての触覚閾値−ベースライン(禁断−閾値/withdrawal thresholds)を電気的なvon Frey−麻痺計(IITC Life Science,USA)測定した。脊髄カテーテルの正確な配置は、リドカイン投与(10μl、2%)によって確認した。ベースラインの試験及び測定後に、VR−1アンチセンス−オリゴ(AS、n=10)又はミスマッチ−オリゴ(MS、n=10)をそれぞれ45μgを0.9%のNaCl中で初日に1回及び4日後に1日2回投与した。触覚禁断−閾値(withdrawal thresholds)は最初の1日のオリゴ投与後の30分に測定した。この結果を最大予想効果率(%MPE;maximal moglichen Effekts(%))として同側性の側で表し、その際、ベースラインは0%とし、対照グループの禁断−閾値は100%MPEとした。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしてV15(図1、サブタイプk)及びミスマッチオリゴヌクレオチドとしてすでに上記したようなV15Ktr.を使用した。
【0099】
モノニューロパシーラットをアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドを用いるがミスマッチ−オリゴデオキシヌクレオチドを用いない治療は、処理の第3日に始まる触覚性異痛症の低減及び治療の4及び5日のプラトーの達成を生じさせた。対側性の後ろ脚の禁断−閾値に関する作用は生じなかった。
【0100】
実施例5
「ロックド核酸」/分解に対して保護されたオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド−構築物
特に図1及び部分的に図3のサブグループ(k)による多様な本発明によるオリゴヌクレオチドを製造した。このほとんどはLNA−構築物であり、これはPROLIGO in Boulder,Co,USAにより入手され、かつこのLNAにおいて多様な位置に置かれていた(表3参照)。さらに、図1のサブグループ(k)による未変更のオリゴヌクレオチドを合成し、かつこの塩基配列から対応するホスホロチオエートはMWG Bioteck AG社(Ebersberg Deutschland在)で入手した。
【0101】
表3:使用したオリゴヌクレオチドのリスト。
小文字=DNA−モノマー、イタリック及びアンダーライン=ホスホロチオエート、ボールドの大文字=LNAモノマー
【0102】
【表3】
【0103】
このオリゴヌクレオチドを用いて多様な試験を実施した:
a)まず最初に、VR1の、オリゴヌクレオチドにより引き起こされたRNA−切断のパーセント範囲をRNAse Hにより試験し、その際、試験条件は主に例2に挙げられた条件と一致する。
【0104】
この結果は表3に記載されている。LNAを有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも6又はより良好に8個の連続するヌクレオチドがLNAを有していない場合に、最初に天然のオリゴヌクレオチドと比較可能な切断を示したことが明らかになった。
d)次いで、LNA/RNA:DNA−ハイブリッドの融点を標準法により測定した(表4)。意外にも、LNAは天然のオリゴヌクレオチド及びホスホロチオエートと比較して高い融点を示した。これは安定性にとってきわめて有利である。
【0105】
表4:LNA/RNA:DNA−ハイブリッドの融点Tm
c)次に、RNAse H−切断の速度論を上記したのと同じ条件下で試験するが、等モル量のRNA及びアンチセンス−オリゴヌクレオチド(それぞれ100nM)を使用した。この結果を表5に示した。意外にも、LNAを有するオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド及びホスホロチオエートと比較して活性の明らかな向上が示された。
表5:「フルレングス」VR1 mRNAのRNAse H−切断についての切断速度定数は多様なアンチセンス−オリゴヌクレオチドによって誘導する。
d)最後に、LNAを有するオリゴヌクレオチド並びに天然のオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートの半価時間を、放射能により標識して37℃でヒト血清中で2日までにわたり測定した。この結果を表6に示した。天然のDNAは1.5時間の半価時間を示し、ホスホロチオエートは10時間の半価時間を示したが、末端に3〜4個のLNAを有しているLNAを有するヌクレオチドは、約17時間のt1/2で明らかにより良好であった。
【0106】
表6:天然のホスホルチオエート、エンドブロックLNA/DNA−オリゴヌクレオチドのヒト血清中での半価時間
従って、約8個の連続するヌクレオチドがLNAを有しておらずかつ3’−末端及び5’末端に3又は4個のLNAを有しているようなLNAを有するヌクレオチドが最も優れていた。
【0107】
文献
【0108】
【外3】
【0109】
【外4】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1はラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する一般的なヌクレオチド配列を示す。
【図2】
図2はmRNA上の位置中の図1中のオリゴV15に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図3】
図3はラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図4】
図4はmRNA上の位置中の図3中のオリゴV30に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図5】
図5はラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図6】
図6はmRNA上の位置中の図5中のオリゴV32に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図7】
図7はラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図8】
図8はmRNA上の位置中の図7中のオリゴV26に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。
【図9】
図9はラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図10】
図10はmRNA上の位置中の図9中のオリゴV2に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。
【図11】
図11はラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図12】
図12はmRNA上の位置中の図11中のオリゴV16に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図13】
図13はラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図14】
図14はmRNA上の位置中の図13中のオリゴV28に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図15】
図15はラットからのVR1のmRNAに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図16】
図16はmRNA上の位置中の図15中のオリゴV4に相当する、ヒトVR1に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。
【図17】
図17はメッセンジャー ワーク スクリーニングの結果を示す。
【図18】
図18はメッセンジャー ワーク スクリーニングの定量的評価を示す。
【図19】
図19はオリゴヌクレオチドV15、V15Ktr.(ミスマッチ)、V30及びV30Ktr.(ミスマッチ)を用いたRNase Hアッセイによるゲルの画像を示す。
【図20】
図20は「シングル−ターンオーバー」条件下でのリボザイム及びDNA−酵素によるmRNAの切断の定量的評価を示す。
【図21】
図21は「シングル−ターンオーバー」条件下でのリボザイム及びDNA−酵素によるVR1 mRNAの切断の速度を示す。
【図22】
図22は「マルチプル−ターンのバー」条件下でのリボザイム及びDNA−酵素によるVR1 mRNAの切断の速度を示す。
【図23】
図23はVR1−アンチセンス(AS)−オリゴデオキシヌクレオチドとミスマッチ(MS)−オリゴデオキシヌクレオチド(V15及びV15Ktr.)による処理の間の触覚性異痛症の評価を示す。
【図24】
図24は本発明による「ハンマーヘッド」リボザイムになるための、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13及び15のいずれか1つの図中のサブポイント(o)〜(q)に記載されたヘリックスI及びヘリックスIIIのそれぞれが組み込まれる「認識アーム」のヘリックスI及びヘリックスIIIを有する「ハンマーヘッド」リボザイムの一般的な図である。
【図25】
図25は図24及び図11による(特に有利な)「ハンマーヘッド」−リボザイムV16(7/7)を示す。
【図26】
図26はSantoroら,1997,図2,第4264頁に記載されたタイプ「10−23」のDNA−酵素を示す。
【図27】
図27は「ロックド核酸」LNAを示す。
Claims (35)
- 図1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15又は16のいずれか1つの図中のサブポイント(b)〜(j)のいずれか1つに記載された1つ又は複数の塩基配列、又は前記の塩基配列から最大で1個の塩基が異なるが、その際に、この塩基の変異はサブポイント(a)に示された配列範囲には存在しない1つ又は複数の塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致する、オリゴヌクレオチド。
- 図1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15又は16のいずれか1つの図中のサブポイント(b)〜(j)のいずれか1つに記載された1つ又は複数の塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致する、オリゴヌクレオチド。
- 図1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15又は16のいずれか1つの図中のサブポイント(k)に記載の1つ又は複数の塩基配列、又は前記の塩基配列から最大で2個の塩基が異なるが、その際に、この塩基の変異はサブポイント(a)に示された配列範囲には存在しない、有利に1つの塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致する、オリゴヌクレオチド。
- 図1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15又は16のいずれか1つの図中のサブポイント(k)に記載された1つ又は複数の塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致する、オリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドが15〜30ヌクレオチド、有利に15〜25ヌクレオチド、特に17〜19ヌクレオチド又は正確に18ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、請求項1から4までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
- 場合により1つの塩基が異なり、オリゴヌクレオチド中に含まれるオリゴヌクレオチドか又は前記のオリゴヌクレオチドに一致するオリゴヌクレオチドが、図1,2,3,4,9,10,11,12,15又は16のいずれか1つの図の塩基配列から取り出すことができることを特徴とする、請求項1から5までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
- 場合により1つの塩基が異なり、オリゴヌクレオチド中に含まれるオリゴヌクレオチドか又は前記のオリゴヌクレオチドに一致するオリゴヌクレオチドが、図1,2,3,4,11又は12、有利に図1,3又は11、特に図1又は3のいずれか1つの図の塩基配列から取り出すことができることを特徴とする、請求項1から6までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つの修飾された又は修飾されていないリボース、少なくとも1つの修飾された又は修飾されていないホスホジエステル結合及び/又は少なくとも1つの修飾された又は修飾されていない塩基を有することを特徴とする、請求項1から7までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
- ヌクレオチドの少なくとも1つ、特に複数のヌクレオチドが「ロックド核酸」(“LNA”)であるか、又はヌクレオチドの少なくとも1つ、特に全てのヌクレオチドがホスホロチオエートであり、有利に複数のヌクレオチドが「ロックド核酸」(“LNA”)であることを特徴とする、請求項1から8までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
- “LNA”がオリゴヌクレオチドの5’−末端及び3’−末端にあり、有利にオリゴヌクレオチドの3’−末端及び5’−末端のそれぞれ最後の2〜5個のヌクレオチド、特にそれぞれ最後の3又は4個のヌクレオチドが“LNA”であるか、
及び/又は
オリゴヌクレオチド中の6より多くの、特に8以上の連続するヌクレオチドが“LNA”ではなく、有利に図1〜16のいずれか1つの図に記載されたオリゴヌクレオチドの、それぞれサブポイント(a)に記載された配列範囲に示されたヌクレオチドの中で、サブポイント(b)〜(k)はそれぞれ多くても1つのヌクレオチドだけが“LNA”であるか、又はそのヌクレオチドのどれもがLNAではないことを特徴とする、請求項9記載のオリゴヌクレオチド。 - 該当するオリゴヌクレオチドが請求項6又は7のいずれか1項記載の、有利に請求項7記載のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項9又は10のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1から11までのいずれか1項記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを有する、ポリヌクレオチド−構築物。
- 2つの相互に別個の領域に、図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13又は15のいずれか1つの図中のサブポイント(l)〜(n)のいずれか1つに記載の、2つのヌクレオチド部分配列の断片I及び断片IIIを有するか、又はサブポイント(o)〜(q)のいずれか1つに記載の、2つのヌクレオチド部分配列のヘリックスI及びIIIを有する、ポリヌクレオチド−構築物。
- 請求項1から7までのいずれか1項記載の、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド−構築物。
- リボザイム、DNA−酵素、ベクター、特に発現ベクター、又はPNAであることを特徴とする、請求項12から14までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物。
- リボザイム、有利に「ハンマーヘッド」−リボザイム又はDNA−酵素、特にタイプ10−23又は12−32のDNA−酵素であることを特徴とする、請求項13記載のポリヌクレオチド−構築物。
- 図1,3,4,5,6,7,8,9,11,12又は13のいずれか1つの図、
有利に図1,3,7又は11、特に図1又は3のいずれか1つの図、又は
有利に図4,6,8又は12、特に図4又は12のいずれか1つの図中の、
サブポイント(l)〜(n)の1つ、有利に(n)に記載されたヌクレオチド部分配列の断片I及び断片IIIを少なくとも含有するDNA−酵素であることを特徴とする、請求項16記載のポリヌクレオチド−構築物。 - 図1,3,4,5,6,8,11又は12のいずれか1つの図、
有利に図1,3又は11のいずれか1つ、特に図11の図、又は
有利に図4,6,8又は12、特に図4又は12のいずれか1つの図中の、
サブポイント(o)〜(q)の1つ、有利に(o)に記載されたヌクレオチド部分配列のヘリックスI及びヘリックスIIIを少なくとも含有するリボザイムであることを特徴とする、請求項16記載のポリヌクレオチド−構築物。 - 少なくとも1つの修飾された又は修飾されていないリボース、少なくとも1つの修飾された又は修飾されていないホスホジエステル結合及び/又は少なくとも1つの修飾された又は修飾されていない塩基を有することを特徴とする、請求項12から18までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物。
- 担体、特にタンパク質、有利にtet−、トランスポーチン又はフェリチンと結合しているか及び/又はリポソーム内に封入されていることを特徴とする、請求項1から11までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項12から19までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物。
- 請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド及び/又は請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物の少なくとも1つを含有する、細胞。
- 請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド、請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物及び/又は請求項21記載の細胞の少なくとも1つ、並びに場合により適当な助剤及び/又は添加剤を含有する、医薬品。
- 請求項6,7又は11のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド、請求項6又は7記載のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチドを有するベクター、及び/又は請求項18記載のリボザイム又は請求項17記載のDNA−酵素の少なくとも1つを含有する、請求項22記載の医薬品。
- 請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド、請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物及び/又は請求項21記載の細胞の少なくとも1つ、並びに場合により適当な添加剤を含有する、診断薬。
- 疼痛、特に慢性の疼痛、触覚性異痛症、熱により引き起こされる疼痛、及び/又は炎症性疼痛を治療する医薬品を製造するための、請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド、請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物及び/又は請求項21記載の細胞の使用。
- ハルニン尿失禁、神経性水疱症状、そう痒、腫瘍、炎症、特に喘息のような症状を伴うVR1レセプターに関連する炎症、並びにVR1と関連する全ての疾患症状を治療する医薬品を製造するための、請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド、請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物及び/又は請求項21記載の細胞の使用。
- 遺伝子治療、有利にインビボ又はインビトロの遺伝子治療のための、請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド、請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物及び/又は請求項21記載の細胞の使用。
- 有利に標識した、請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド及び/又は請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物の少なくとも1つとRNAとの結合の定量化に関する同定を行うことを特徴とする、疼痛を調節する物質を同定する方法。
- 次の方法工程:
(a)請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド及び/又は請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物の少なくとも1つ用いて、細胞(試験細胞)の少なくとも1つを遺伝子工学により操作する工程、
(a’)同じ細胞(対照細胞)の少なくとも1つを
・操作を行わないか、
・オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド−構築物なしで並行して操作を実施するか、又は
・請求項1から11又は20までのいずれか1項記載のものとは異なる変更されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド−構築物で並行して遺伝子工学により操作する工程、
(b)少なくとも1つの試験細胞と、少なくとも1つの対照細胞と及び/又はバニロイド−レセプター−ファミリー、有利にVR−1−レセプターから選択される少なくとも1種のレセプタータンパク質を合成したような細胞からの調製物とを用いて適当な条件下で試験すべき物質を並行してインキュベートする工程、
(c)試験物質と細胞から合成されたタンパク質との結合を測定するか、又は試験物質とタンパク質との結合により変更された機能パラメータの少なくとも1つを測定する工程、
(d)試験細胞における測定値と対照細胞における測定値との差異の程度によって物質を同定する工程
を有する、疼痛を調節する物質を同定する方法。 - 方法工程(a)及び(a’)の前にすでに細胞を遺伝子工学により操作することを特徴とする、請求項29記載の方法。
- 遺伝子工学による操作が、試験物質により変更された機能パラメータの少なくとも1つの測定を可能にすることを特徴とする、請求項30記載の方法。
- 遺伝子工学による操作によって、バニロイド−レセプター−ファミリー、有利にVR−1−レセプターの構成員を、細胞内で内因性に発現しない形で発現させるか又はレポーター遺伝子を導入することを特徴とする、請求項30から31までのいずれか1項記載の方法。
- バニロイド−レセプター−ファミリー、有利にVR−1−レセプターの構成員の既知の標識されたリガンドの変更によって結合の測定を行うことを特徴とする、請求項29から32までのいずれか1項記載の方法。
- 並行する方法工程(a)及び(a’)と、方法工程(b)との間で8時間以上、有利に12時間以上、特に24時間以上経過させることを特徴とする、請求項29から33までのいずれか1項記載の方法。
- 請求項1から11までの又は20のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチドの1つ及び/又は請求項12から20までのいずれか1項記載のポリヌクレオチド−構築物の少なくとも1つとRNAとの結合の定量化によって診断を行うことを特徴とする、バニロイド−レセプター−ファミリーの遺伝子の変更された発現と関連している疾患症状を診断する方法。
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