KR20010020405A - 키메라 및 교차 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해 - Google Patents

키메라 및 교차 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해 Download PDF

Info

Publication number
KR20010020405A
KR20010020405A KR1019997010029A KR19997010029A KR20010020405A KR 20010020405 A KR20010020405 A KR 20010020405A KR 1019997010029 A KR1019997010029 A KR 1019997010029A KR 19997010029 A KR19997010029 A KR 19997010029A KR 20010020405 A KR20010020405 A KR 20010020405A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
ras
oligonucleotides
phosphorothioate
chimeric
Prior art date
Application number
KR1019997010029A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100354610B1 (ko
Inventor
엑커데이비드제이
쿡필립단
모니아브렛피
프레이어수잔엠
생흐비요게쉬에스
Original Assignee
파샬 비. 린네
아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 파샬 비. 린네, 아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드 filed Critical 파샬 비. 린네
Publication of KR20010020405A publication Critical patent/KR20010020405A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100354610B1 publication Critical patent/KR100354610B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 정상 및 활성화된 형태를 갖는 사람의 ras 유전자 발현을 조절하기 위한 조성물 및 제조방법을 제공한다. 본 발명은 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 메틸렌(메틸리미노) 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또한 본 발명은 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 메틸렌(메틸리미노) 결합을 가지는 제1 영역 및 포스포로티오에이트 결합을 가지는 제2 영역을 가지는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 사람의 H-ras 유전자의 활성화로 인하여 생기는 질병의 진단, 검출 및 치료 방법을 포함하는 연구 목적용 뿐만 아니라 진단학에도 사용된다.

Description

키메라 및 교차 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해{Antisense Inhibition of ras Gene with Chimeric and Alternating Oligonucleotides}
관련 특허출원
미국특허출원 제411,734호(1995. 4. 13출원); PCT출원 PCT/US93/ 09346(1993. 10. 1출원); 미국특허출원 제715,196호(1991. 6. 14출원); 미국특허출원 제958,134호(1992. 10. 5출원); 미국특허 제5,582,986호로 공고된 미국특허출원 제292,086호(1994. 7. 19출원); 미국특허출원 제08/007,996호(1993. 1. 21출원); 미국특허 제5,576,208호로 공고된 미국특허출원 제297,248호(1994. 7. 26출원); 미국특허 제5,378,825호로 공고된 미국특허출원 제703,619호(1991. 5. 21출원); 미국특허 제5,386,023호로 공고된 미국특허출원 제040,903호(1993. 3. 31출원); 미국특허 제5,489,677호로 공고된 미국특허출원 제040,526호(1993. 3. 31출원); 미국특허 제5,541,307호로 공고된 미국특허출원 제174,379호(1993. 12. 28출원); 미국특허출원 제040,933호(1993. 3. 31출원); 미국특허 제5,618,704호로 공고된 미국특허출원 제300,072호(1994. 9. 2출원); 미국특허출원 제039,979호(1993. 3. 30출원); 미국특허 제5,623,070호로 공고된 미국특허출원 제395,168호(1995. 2. 27출원); 미국특허출원 제814,961호(1991. 12. 24출원); PCT출원 PCT/US92/11339(1992. 12. 23출원); 미국특허 제5,623,065호로 공고된 미국특허출원 제244,993호(1994. 6. 21출원); 및 미국특허출원 제468,037호(1995. 6. 6출원)는 본 발명에서 전체적으로 인용자료로 참조되었다.
세포성장 및 분화를 직접 또는 간접적으로 조절하는 세포질 유전자의 변형은 암의 주원인으로 생각되고 있다. 사람의 종양 형성을 야기하는 종양유전자(oncogene)라 불리는 유전자는 약 30족(family) 정도가 있다. 그러한 것 중의 하나인 ras 유전자 족은 종종 사람의 종양에서 돌연변이된 것으로 발견된다. 정상 상태에서, ras 유전자에 의해 생성된 단백질은 정상 세포 성장과 성숙에 관여하는 것으로 생각된다. 단백질 산물의 세 개의 중요한 위치 중 하나에서 아미노산의 변화를 야기하는 ras 유전자의 돌연변이는 암을 유발시킬 수 있는 형태로 전환된다. 그러한 돌연변이를 가지는 유전자를 활성화되었다고 한다. ras 활성화로 되는 점(point) 돌연변이는 발암물질이나 다른 환경 요소에 의해 유도되는 것으로 생각된다. 소장의 선암(adenocarcinomas)의 90% 이상, 대장의 선종(adenoma; 腺腫)과 선암의 약 50%, 폐 선암과 갑상선의 악성종양의 약 50% 및 급성 골수 백혈병과 골수이형성 증후군과 같이 피와 관련된 불치병의 대부분이 활성화된 ras 종양유전자를 포함하는 것으로 알려졌다. 전체적으로 사람 종양의 약 10 내지 20%가 세 개의 ras 유전자(H-ras, K-ras, 또는 N-ras) 중 하나의 돌연변이를 함유한다.
최근에는 특정의 종양 세포에서 활성화된 종양유전자의 발현을 저해하면 세포가 좀더 정상적인 성장으로 되돌아 올 수 있다고 여겨지고 있다. 예를 들어 퍼라미스코 등(Nature 1985, 314, 639-642)은 활성화된 ras 유전자로 인해 악성 상태로 전환된 세포에 ras 유전자의 단백질 산물에 결합하는 항체를 미세 주사로 주입시키면서 세포가 증식 속도를 늦추고 좀더 정상 형태를 가진다고 주장하였다. 이것은 전형적인 암세포의 비제어된 성장에 활성화된 ras 유전자의 산물이 관여한다는 사실을 지지하는 것으로 해석되고 있다.
최근에 H-ras 유전자는 즉시 치료하지 않으면 갑작스럽게 사망하는 유전병인 롱(long) Q-T 증후군이라 불리는 심각한 부정맥(不整脈) 심장병을 야기하고 있다. 종종 불규칙한 심장고동이 시작되기 전에 어떤 징후도 나타나지 않는다. H-ras 유전자가 롱 Q-T 증후군의 원인이 되는가는 불확실하다. 그러나 상기 증후군의 유전성과 H-ras 유전자를 둘러싸는 크로모좀 11 구역의 특이한 변형체의 존재 사이에 상당히 높은 상관 관계가 있다. 그러므로 H-ras 유전자는 롱 Q-T 증후군으로 인한 갑작스런 심장병 사망이라는 심각한 사태의 유용한 지표가 된다.
ras 유전자의 발현을 조절할 수 있는 조성물질, 특히 ras 유전자의 활성 형태의 발현을 조절할 수 있는 조성물질의 제공이 요청되고 있다. 동물에서 ras 유전자의 검출 및 진단방법의 제공도 요청된다. 또한 ras 유전자의 활성화로 인한 질병의 진단 및 치료 방법의 제공도 요구된다. 나아가 ras 유전자의 검출 및 연구를 위한 개선된 연구 키트 및 시약도 요청되고 있다.
종양유전자 발현의 저해는 안티센스 방향(orientation)으로 Ki-ras 원시 종양유전자(protooncogene) RNA의 2-킬로베이스(kilobase) 단편(segment)을 발현시키는 리트로비루스(retrovirus) 벡터 또는 플라스미드 벡터를 사용하여 수행할 수 있다(무코파디야 등, 1991. Cancer Research 51, 1744-1748; PCT 특허출원 PCT/US92/01852(WO92/15680); 죠오지 등, 1993. Cancer Research, 53, 1743-1746).
종양유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해는 다양한 종양 유전자 족의 역할을 이해하는데 유용한 수단이 된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유전자의 "센스" 또는 암호화 가닥에 상보적이며 또한 결과적으로 유전자의 mRNA 전사체에 상보적이어서 안정되고 특이하게 잡종화할 수 있는 작은 올리고뉴클레오티드이다. 홀트 등(Mol. Cell Biol. 1988, 8, 963-973)은 배양된 HL60 백혈병 세포에 종양유전자 c-myc의 mRNA 전사체와 특이적으로 잡종화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 첨가하면 증식을 억제하고 분화를 유도한다는 것을 보여주었다. c-myb 종양유전자의 mRNA 전사체와 특이 잡종화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 골수 백혈병 세포계의 증식을 억제한다는 사실도 알려졌다(안포시 등, Proc. Nat1. Acad. Sci. 1989, 86, 3379-3383). HL60 배양된 백혈병 세포증식 뿐만 아니라 c-myc 종양유전자의 단백질 산물의 발현도 c-myc mRNA와 특이하게 잡종화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 억제된다는 사실도 알려졌다(윅스트롬 등, Proc. Nat. Acad. Sci. 1988, 1028-1032). 미합중국 특허 제4,871,838호(보스 등)는 N-ras의 코돈 13에서의 돌연변이를 검출하기 위한 상기 돌연변이에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 미합중국 특허 제4,871,838호(보스 등)는 또한 ras 단백질을 암호화하는 DNA에서의 돌연변이를 검출하는 탐침(probe)으로서 유용한 분자를 개시하고 있다.
상기 모든 경우에 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드의 불안정성이 주요한 문제인데, 이것은 세포질 효소에 의해 분해되기 쉽기 때문이다. PCT/US88/01024(존 등)는 HL60 백혈병 세포성장 및 이들 세포내 DNA 합성을 저해하는 증폭된 c-myc 종양유전자의 해독 개시 구역에 잡종화할 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 티드 등은 Anti-Cancer Drug Design(1988, 3, 117-127)에서 활성화된 N-ras 종양유전자에 특이하게 잡종화하는 메틸포스포네이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 가치를 평가하였는데, 생화학적 분해에 내성이 있고 배양된 사람의 HT29 세포에서 비독성이었으나 N-ras 유전자 발현을 저해하지는 못하였고 이들 세포에 대해서도 어떠한 영향을 미치지 못한다는 것을 알아냈다. 쥐의 Balb-ras 유전자의 mRNA 전사체에 특이하게 잡종화할 수 있는 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 이들 유전자의 단백질 산물의 해독을 생체 외에서(in vitro) 저해할 수 있다는 것도 알려졌다(창 등, Anti-Cancer Drug Design 1989, 4, 221-232; 브라운 등, Oncogene Research 1989, 4, 243-252). Tm이 생체외에서 ras p21 단백질 산물의 해독에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성과 상관관계에 있지 않다는 것은 공지된 사실이다. 창 등에 의해 사용된 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ras 유전자의 해독 개시 구역과 특이하게 잡종화하기 때문에 상기 올리고뉴클레오티드가 활성화된 ras에 대한 선택성을 보이리라고는 기대되지 않았으며 정상(야생형)과 돌연변이된(활성화된) ras 유전자에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 결합력도 비교되지 않았었다.
헬렌과 그의 동료들은 아크리딘 인터칼레이팅제(intercalating agent) 및/또는 소수성 말단에 연결된 9-합체 포스포디에스테르를 이용하여 활성화된(코돈 12에서 G→T 전이(transition)) H-ras mRNA의 발현이 선택적으로 저해됨을 주장하였다. 이 화합물은 낮은 소량의 몰 농도에서 RNAse H 및 세포 증식 분석에서 돌연변이 ras 정보를 선택적으로 표적함을 보여주었다(새손-베모아라스 등 EMBO J. 1991, 10, 1111-1118). 창과 그의 동료들도 돌연변이 H-ras 정보의 선택적인 표적을 개시하였는데, 이때 상기 표적부위는 A→T 전환을 포함하는 H-ras 코돈 61이었으며, 사용된 올리고뉴클레오티드는 11-합체 메틸포스포네이트 또는 그것의 소랄렌(psoralen) 유도체이다. 활성을 나타내기 위해 7.5-150μM의 농도를 필요로 하는 이들 화합물은 정상적인 p21에 관련된 돌연변이 H-ras p21 발현을 선택적으로 저해하는 면역침전에 의해 보여졌다(창 등, Biochemistry 1991, 30, 8283-8286).
염기 부정합(mismatches)에 대한 ΔΔG°37을 증가시키는 변형된 뉴클레오티드는 선택성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. ΔΔG°37은 가장 안정된 부정합에 대한 1-2 kcal/mol에서 가장 불안정한 부정합에 대한 5-6 kcal/mol 까지의 범위를 가진다. 그러므로 가능하면 돌연변이 표적부위에 대한 선택성을 최대화하기 위해, 안정된 부정합(예를 들어 G→A)을 만들어내는 돌연변이가 불안정한 부정합(예를 들어 C→G, U→G, A→C)을 만들어내는 돌연변이보다 덜 바람직하다. 이러한 예로는 일가족에 나타나는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)과 관련된 상염색체 우세 돌연변이에서 발견될 수 있다. β-아밀로이드 전구체 유전자의 세 개의 서로 다른 점 돌연변이가 이 질병과 함께 분리된 것으로 알려졌다. 이들 돌연변이는 G→A(ΔΔG°37=+1.2 kcal/mol), G→T(ΔΔG°37=+3.9 kcal/mol), 및 T→G(ΔΔG°37=6.3 kcal/mol)를 포함한다(고아테 등, Nature 1991, 349, 704-706; 뮤렐 등, Science 1991, 254, 97-99, 채티어-할린 등, Nature 1991, 353, 844-846). 이 경우 T→G 돌연변이를 표적시키는 것은 안티센스 올리뉴클레오티드에 의해 돌연변이 β-아밀로이드에 대한 가장 큰 선택성을 생성시킨다고 여겨진다.
변형되지 않은 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합 또는 변형된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드가 세포질 RNAse H에 대한 기질이다; 예를 들어 이들 올리고뉴클레오티드는 RNAse H에 의해 표적 RNA의 절단을 활성화시킨다(다글레 등, Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751; 다글레 등, Antisense Research And Development 1991, 1, 11; 및 다글레 등, Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805). RNAse H는 RNA:DNA 이중가닥의 RNA가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제이다; 그러므로 이 효소의 활성으로 RNA 표적이 절단되며, 안타센스 올리고뉴클레오티드의 표적 RNA 발현을 저해하는 성능을 크게 증진시킨다.
발더 등은 Xenopus 배(embryo)에서 포스포디에스테르 결합 및 포스포로티오에이트 결합 모두 또한 엑소뉴클레아제 분해와 관련이 깊다는 것을 지적하였다. 그러한 뉴클레아제 분해는 RNAse H 활성화에 유용한 올리고뉴클레오티드를 급격히 고갈시키므로 유해한 것이다. 국제출원공개 제WO 89/05358호(발더 등)는 3' 말단 뉴클레오시드간 결합 위치에서 변형되어 RNAse H의 기질로 있는 동안 뉴클레아제에 내성이 있게 되는 DNA 올리고뉴클레오티드를 공개하고 있다.
RNAse H에 대한 기질 요구사항이 충족되는 한 올리고뉴클레오티드 변형의 유용한 특성을 이용하려는 시도는 결국 키메라 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것으로 진행되었다(길스 등, Anti-Cancer Drug Design 1992, 7, 37; 해아세 등, Biochemistry 1990, 29, 8793; 다글레 등, Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751; 다글레 등, Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1805). 키메라 올리고뉴클레오티드는 둘 또는 그 이상의 화학적으로 다른 구역을 포함하며 각각은 적어도 하나의 뉴클레오티드로 구성된다. 전형적으로 이들 올리고뉴클레오티드는 (예를 들어 뉴클레아제 내성 증가, 세포 포착 증가, RNA 표적에 대한 결합 친화도 증가와 같은) 하나 또는 그 이상의 유용한 특성을 제공하는 변형된 뉴클레오티드 구역과 RNAse H 분열을 유도하는 능력을 보유하는 변형되지 않은 구역을 포함한다. 이러한 접근법은 가장 흔한 메틸포스포네이트와 같은 다양한 주쇄 변형으로 이용되는데, 이것만으로는 RNAse H에 대한 기질이 될 수 없다. RNAse H-민감성 포스포디에스테르 결합을 포함하는 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 생체외에서 RNAse H에 의한 표적 RNA 절단을 유도할 수 있는 것으로 알려졌다. E. coli를 이용하여, 표적 RNA H 가닥의 RNAse H 절단을 유도하는데 필요한 최소한의 포스포디에스테르의 길이는 3이나 4 결합 중 하나인 것으로 보고되었다(쿠아틴 등, Nucleic Acids Research 1989, 17, 7253; 푸돈 등, Nucleic Acids Research 1989, 17, 9193). 생체외 포유류의 RNAse H 절단 분석법을 사용한 유사한 연구결과도 보고되었다(에그라월 등, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 1990, 87, 1401). 이들 경우에 메틸포스포네이트를 함유하거나 서로 상이한 포스포디에스테르 길이를 포함하는 일련의 주쇄 변형에 대해 절단 효능을 실험하였다. 이러한 특성을 가지는 올리고뉴클레오티드에 의해 유도되는 효과적인 RNAse H 절단을 위해 필요한 최소한의 포스포디에스테르 길이는 5결합 길이이다. 더 최근의 연구 기록에 의하면 메틸포스포네이트/포스포디에스테르 키메라는 생체외에서 대장균 RNAse H를 사용할 때에 표적 RNA 분열에 대한 증가된 특이성과 효능을 보였다(길스 등, Anti-Cancer Drug Design 1992, 7, 37). 이들 화합물은 또한 Xenopus 난모세포 및 포유류의 배양 세포에서 효과적인 안티센스 저해자라는 것도 보고되었다(다글레 등, Nucleic Acids Res. 1990, 18, 4751; 포트 등, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 1991, 88, 1516).
국제출원공개 제WO 90/15065호(프로엘더 등)는 RNAse H가 활성화되는 동안 엑소뉴클레아제에 안정성을 제공하기 (저항성을 부여하기)위해 3' 및/또는 5' 말단에서 포스포아미디트(phosphoamidite), 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 결합에 의해 캡이 형성된 키메라 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 국제출원공개 제WO 91/12323호(페더슨 등)는 RNAse H를 활성화시키지 않는 변형된 주쇄(메틸포스포네이트, 포스포로모폴리데이트(phosphoromorpholidate), 포스포로피레라지데이트(phosphoropiperazidate) 또는 포스포아미데이트(phosphoamidate)를 가지는 두 개의 구역이 RNAse H 절단을 활성화하는 중앙의 데옥시뉴클레오티드 구역 양 측면에 위치하는 키메라 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 2'-데옥시올리고뉴클레오티드는 포스포아디트, 알킬포스포네이트 또는 포스포트리에스테르 결합을 가지는 주쇄 변형된 올리고뉴클레오티드의 부분사이에 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오티드의 짧은 부분을 위치시킴으로써 RNAse H 활성화를 계속 제공하는 한편 뉴클레아제 분열에 대해 안정하였다(다글레 등, Nucleic Acids Research 1990, 18, 4751; 다글레 등, Antisense Research And Development 1991, 1, 11; 및 다글레 등, Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805). 포스포르아미데이트 함유 올리고뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에는 안정하였으나 각 포스포르아미데이트 결합은 포스포아미데이트 함유 올리고뉴클레오티드의 Tm측정값에 있어서 1.6℃ 손실된 것으로 나타났다(다글레 등, Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805). 그러한 Tm값의 손실은 올리고뉴클레오티드와 그것의 표적부위 가닥 사이에 잡종화의 감소를 나타내는 지표이다.
올리고뉴클레오티드가 RNAse H에 대한 기질임에도 불구하고 RNAse H에 의한 절단 효능은 mRNA에 약하게 잡종화되어 있기 때문에 낮은 것으로 관찰되었다(세손-베모아라 등, EMBO Journal 1991, 10, 1111).
RNAse H-민감성 데옥시 잔기와 혼합된 2' 리보스 변형을 함유하는 키메라 올리고뉴클레오티드가 주쇄 키메라만큼 특정되지는 않지만, 키메라 올리고뉴클레오티드가 주쇄의 변형에 한정되는 것은 아니다. 상보적인 RNA 가닥내의 특이 부위에서 대장균 RNAse H에 의한 생체외 절단을 유도하는 변형되지 않은 데옥시 갭을 포함하는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드(단독으로는 RNAse H에 대한 기질이 될 수 없다)도 사용되었다(유럽 특허공개 제260,032호(이노우에 등) 및 오트수카 등 FEBS Lett. 1987, 215, 327-330). 이들 화합물은 효과적인 표적 RNA 절단을 위한 4염기의 최소한의 데옥시 갭을 필요로 한다. 그러나 이런 성질을 가지는 올리고뉴클레오티드에 대해 포유류의 RNAse H를 사용하여 절단 효능은 실험되지 않았고, 세포에서의 안티센스 활성에 대해서도 시험되지 않았다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대해 불안정하였다.
O-메틸을 제외한 2' 리보스 변형의 RNAse H 분열 및 안티센스 활성을 유도하는 성능에 대한 연구는 지극히 제한되어 있었다(쉬미트 등, Biochem. Biophys. Acta 1992, 1130, 41).
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 RNAse H를 이용한 표적 RNA 가닥의 절단이 유용할 것이라고 인식되는 한편 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성 및 잡종화의 정확성(fidelity)도 또한 중요하다고 여겨진다. RNAse H를 활성화시킬 수 있고 동시에 잡종화 특성을 유지시키거나 증진시키고 뉴클레아제 내성을 제공하는 방법 또는 물질에 대한 요구가 오랫동안 있어 왔다. 또한 안티센스 활성을 증진시키는 물질 및 방법도 요청되고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 ras 유전자 발현을 저해하는 ras mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras 유전자의 활성화된(돌연변이) 형태의 발현을 특이적으로 억제하는 ras mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras 유전자 발현을 억제하는 안정된 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras mRNA에 상보적이며 ras mRNA 표적 부위에 대한 친화도를 증가시켜 ras 유전자의 발현을 억제하도록 변형되고 안정된 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras mRNA에 상보적이며 RNAse H의 기질인 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 세포의 증식을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이며, 또한 암세포의 증식을 억제하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras 유전자의 정상적(야생형)인 형태로부터 활성화된 형태로의 돌연변이의 검출을 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 형태학적으로 유사한 종양의 감별 진단 및 활성화된 ras 유전자의 존재에 기초한 위험한 질병의 규명을 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 야생형으로부터 ras 유전자의 활성화된 형태로 돌연변이 되어 발생하는 질병의 진단 및 치료 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 변형된 뉴클레오시드 단위로 이루어지며, DNA 또는 RNA에 상보적이다. 본 발명의 바람직한 한 구체예로서 사람의 H-ras 유전자에서 유도된 DNA 또는 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 교차결합을 가지는 올리고뉴클레오티드이거나 또는 교차결합을 가지는 키메라 올리고뉴클레오티드이다.
이들 올리고뉴클레오티드는 유전자의 해독 개시 코돈에 상보적인 것이 바람직하며, CAT 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 본 발명의 다른 구체예로서 활성화된 H-ras 유전자의 코돈 12에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 제공되며, 바람직하게 GAC 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 활성화된 H-ras 유전자의 돌연변이된 코돈 12에 상보적이며 우선적으로 잡종화할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 상기 예에서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 GAC 서열을 포함한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 약제학적으로 수용가능한 담체에서 용이하게 그리고 바람직하게 존재할 수 있다.
본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 갖는다. 바람직하기로는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 하나 이상의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 갖는다. 더 바람직하기로는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 선택된 DNA 또는 RNA와 특이적으로 잡종화하는 8 내지 30 개의 뉴클레오티드로 이루어지며, 제1 구역에 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 가지며, 제2 구역에 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 가지는 키메라 올리고뉴클레오티드이다. 더 바람직하기로는 이들 키메라 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 구역이 각각 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 가지는 두 개의 제1 구역의 양 측면에 위치한다.
더 바람직하기로는 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오티드는 제1 구역이 2' 위치에 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드를 함유하는 것이다. 상기 2 변형으로는 2'-O-알킬, 2'-O-치환된 알킬 또는 2'-플루오로 변형인 것이 바람직하다. 가장 바람직하기로는 2'-O-메톡시에틸 변형이다. 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오티드에서, 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2'데옥시뉴클레오티드로 이루어지는 제2 구역을 포함한다. 이러한 제2 구역에 대한 제1 구역의 바람직한 길이는 적어도 4개의 뉴클레오티드 길이이다. 더 바람직하기로는 5 내지 9개의 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명의 바람직한 키메라 올리고뉴클레오티드는 제1 구역이 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 포함한다. 더 바람직하기로는 제1 구역에 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 한 개, 두 개, 또는 세 개의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 포함한다.
다른 바람직한 구체적인 예에 따른 ras mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해하고, 동시에 뉴클레아제에 대한 증가된 내성을 가지며, ras mRNA 표적 부위에 증가된 결합 친화도를 가지고, 그리고 RNAse H에 대한 기질로 제공된다.
결합 친화도의 증가는 당 성분의 2' 위치에 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드의 변형에 의해 수행되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하기로는 2'-O-알킬, 2'-O-알킬아미노 또는 2'-플루오로 변형으로 구성되는 것이다.
몇몇 바람직한 예로서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상보적인 ras mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시키도록 변형된 적어도 하나의 구역, 및 RNAse H 분열에 대한 기질인 구역으로 이루어지는 키메라 올리고뉴클레오티드이다. 상기 예에서 RNAse H 기질인 구역의 양 측면에는 증가된 ras mRNA 결합 친화도를 가지는 두 구역이 존재한다.
본 발명의 다른 측면은 세포나 조직에서 사람의 ras 유전자 발현을 조절하고, 그리고 활성화를 유도하는 돌연변이를 보유하고 있는 것으로 생각되는 세포나 조직에서의 활성화된 ras 유전자 발현을 특이성 있게 조절하는 방법을 목적으로 한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는 ras 유전자의 발현을 억제하고, 활성화된 ras 유전자의 발현을 특이성 있게 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 부가적으로 세포나 조직에서 ras 유전자의 검출 및 상기 돌연변이 유전자를 보유하는 것으로 생각되는 세포나 조직에서 활성화된 ras 유전자의 특이적인 검출 방법을 제공한다. 상기 방법들은 상기의 유전자를 검출하기 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드로 사람의 ras 유전자를 포함하고 있는 것으로 여겨지는 세포나 조직을 접촉시키는 것으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 측면은 ras 유전자의 활성화를 유발하는 돌연변이를 보유한다고 여겨지는 동물의 진단 및 치료 방법을 목적으로 한다. 상기 방법은 상기의 유전자 발현을 억제하고, 상기 유전자의 활성화로 인한 질병을 치료하고, 또는 이들의 진단을 효율적으로 하기 위하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드로 동물, 세포, 조직 또는 동물에서 취한 체액을 접촉시키는 것으로 구성된다.
본 발명은 종양형성에 영향을 미치는 활성 형태로 간혹 전환하는 천연 발생 유전자인 ras 유전자의 발현 저해에 관한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 ras 유전자의 활성 형태 발현의 특이적 저해에도 관련된다. 더 나아가 본 발명은 세포나 조직에서 ras 유전자의 정상형과 활성형의 검출에 목적을 두고 있으며, 연구시약의 기초 및 연구와 진단에 대한 키트(kit)를 제공할 수 있다. 또한 본 발명은 ras 유전자의 활성에 의해 발생하는 질병의 치료에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 ras 유전자의 발현 저해를 위한 안정된 올리고뉴클레오티드, ras RNA 표적에 대한 친화도가 향상되도록 더 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 ras RNA 표적의 서열-특이성 제거를 위해 더욱 더 변형된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이기도 하다.
도 1은 H-ras 해독 개시 코돈(AUG)에 표적되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 ras-루시페라제 융합 단백질 발현의 투여량-감응 저해를 보여주는 막대 그래프이다. 발현정도는 루시페린 부가시 발광량에 의해 분석된 바와 같이 루시페라제 활성의 측정값에 의하여 평가하였다.
도 2는 활성화된 H-ras의 돌연변이된 코돈-12 구역에 표적되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 ras-루시페라제 융합 단백질 발현의 투여량-감응 저해를 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 안티센스 포스포로티오에이트 화합물에 의한 ras-루시페라제 융합 단백질 발현의 단일-투여량 저해를 보여주는 막대 그래프이다. 발현정도는 루시페린 첨가시 발광량에 의해 분석된 바와 같이 루시페라제 활성의 측정값에 의하여 평가하였다.
도 4는 활성화된 H-ras 유전자와 특이적으로 잡종화 가능한 13개의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해 얻어진 데이터를 요약한 표와 막대 그래프이다. 각 올리고뉴클레오티드의 길이, 특이적으로 잡종화되는 활성화된 ras 유전자 구역, 및 ras-루시페라제 융합 단백질의 발현을 저해하는 활성을 나타낸다.
도 5는 ras mRNA 표적 서열(5'에서 3'으로 보여짐) 및 H-ras 해독 개시 코돈(AUG) 및 코돈 12구역의 위치와 서열을 보여주고 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 3'에서 5'로 나타난다. 도 5a는 AUG에 표적되는 두 개의 20-합체(2502 및 2503) 및 코돈 12에 표적되며, 길이가 5 내지 25 뉴클레오티드인 일련의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 도 5b는 ras mRNA 표적 서열에 관계된 올리고뉴클레오티드 2502, 2503, 6186 및 2570을 나타낸다.
도 6은 올리고뉴클레오티드 2502, 2503, 6186 및 이들 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 균일하게 2'-O-메틸화된 변형의 다양한 투여량에 의한 ras-루시페라제 저해를 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 다양한 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 돌연변이 (빗금쳐진 막대) 및 정상(검은색 막대) ras-루시페라제의 안티센스 저해를 보여주는 막대 그래프이다.
도 8은 투여량-의존성 방법으로 ras의 저해를 나타내는 일련의 8개 패널(panel)이다. 실선은 야생형에 대한 저해 활성이며 점선은 활성화된 ras에 대한 저해 활성을 나타낸다.
도 9는 47-합체 H-ras RNA 헤어핀 표적에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 결합을 나타내는 두 개의 도면이다. 도 9a는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서, 균일한 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드(데옥시 넘버=0)로 이루어진 헤어핀 표적 및 9 염기 데옥시 갭을 갖는 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드(데옥시 넘버=9)로 이루어진 헤어핀 표적의 겔 이동 분석을 나타낸 도면이다. 레인 1-8은 하기 올리고뉴클레오티드 농도를 포함한다: (1) 0M; (2) 10-11M; (3) 10-10M; (4) 10-9M; (5) 10-8M; (6) 10-7M; (7) 10-6M; (8) 10-5M. 도 9b는 이동된 헤어핀 표적 분율 vs. 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도와의 비를 나타낸다. ◇: 데옥시 넘버=17; ●: 데옥시 넘버=9; ▲: 데옥시 넘버=7; O: 데옥시 넘버=5; △:데옥시 넘버=3; ■:데옥시 넘버=1; □: 데옥시 넘버=0. (삽입도면: 올리고뉴클레오티드 2570의 서열을 나타내는 47-합체 H-ras 헤어핀 표적의 구조)
도 10은 2'-O-메틸 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 상보적 H-ras RNA의 RNAse H 의존성 절단을 표시하는 겔을 나타낸다. 레인의 지정 명칭은 중심부 데옥시 갭의 길이를 의미한다.
도 11은 ras 코돈-12 RNA 서열에 표적되는 포스포로티오에이트 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성을 나타내는 두 개의 도면이다. 도 11a는 균일한 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드, 균일한 데옥시 올리고뉴클레오티드 및 중심부 1-, 3-, 5-, 7- 또는 9-염기 데옥시 갭을 포함하는 키메라 2'-O-메틸 올리고뉴클레어티드의 단일-투여량 활성(100nM)을 나타내는 막대 그래프이다. 도 11b는 균일한 데옥시(▼) 또는 중심부 4-(■, ◆), 5-(●), 7-(+) 또는 9-염기(▲) 데옥시 갭을 포함하는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드의 투여량-의존성 활성을 나타내는 선그래프이다.
도 12는 ras-루시페라제에 대한 균일한 데옥시 포스포로티오에이트 및 짧아진 키메라 올리고뉴클레오티드의 안티센스 저해 활성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은 ras에 표적되는 포스포로티오에이트 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드를 사용하여 데옥시 갭 길이와의 함수로서 안티센스 활성 및 RNAse H 활성능 사이의 상관관계를 나타낸 선 그래프이다.
도 14는 7-염기 데옥시 갭을 포함하는 포스포로티오에이트 2'-변형된 키메라 올리고뉴클레오티드의 투여량 감응 안티센스 활성을 나타낸 선그래프이다. (▲), 균일한 데옥시 포스포로티오에이트; (■), 2'-O-펜틸 키메라; (●), 2'-O-프로필 키메라; (◆), 2'-O-메틸 키메라; (▼), 2'-플루오로 키메라.
도 15는 포스포로티오에이트와 포스포디에스테르 주쇄 및 2'-O-메틸과 2'-데옥시 뉴클레오티드의 다양한 조합을 가지는 키메라 올리고뉴클레오티드에 의한 ras-루시페라제의 투여량-의존성 올리고뉴클레오티드 저해를 나타내는 막대 그래프이다.
도 16는 누드 마이스에서 사람의 A549 세포 종양에 대한 ISIS 2503의 항-종양 저해 활성을 나타내는 선그래프이다.
도 17은 누드 마이스에서 사람의 A549 세포 종양에 대한 양이온성 지질과 함께 투여된 ras 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503의 항-종양 저해 활성을 나타내는 선그래프이다.
도 18은 포스포로티오에이트(P=S) 주쇄를 가지는 2' 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교되는 다양한 2' 당 변형 및 포스포디에스테르(P=O) 주쇄를 가지는 올리고뉴클레오티드의 H-ras에 대한 저해 활성을 나타낸 막대 그래프이다.
도 19는 세 개의 사람의 대장암 세포주인, Calu1, SW480 및 SW620에서의 Ki-ras mRNA 발현의 안티센스 저해를 나타내는 막대 그래프이다.
도 20은 Ki-ras 특이성 올리고뉴클레오티드인 ISIS 6957 및 ISIS 6958에 의한 SW480 사람의 악성종양 세포주 증식의 저해를 나타내는 막대 그래프이다.
도 21은 돌연변이 Ki-ras 코돈-12에 표적되는 올리고뉴클레오티드로 처리될 때 야생형 Ki-ras를 발현시키는 HeLa 세포와 비교되는 돌연변이 Ki-ras를 발현시키는 사람의 악성종양 SW480 세포에서의 Ki-ras mRNA 발현의 선택적인 저해를 나타내는 막대 그래프이다.
도 22는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 바람직한 화학적 구조를 나타낸다.
도 23 및 도 24는 활성화된 H-ras 유전자 또는 scrambled controls와 특이적으로 잡종화할 수 있는 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 특성 및 저해 감응을 각각 종합하는 표 및 막대 그래프를 나타낸다. 상기 표는 올리고뉴클레오티드의 길이에 따른 각각의 위치에서 뉴클레오염기 조성 및 화학식을 나타낸다. 상기 막대그래프는 올리고뉴클레오티드의 각각의 투여량에 대한 T-24 세포에서의 H-ras mRNA의 투여량 감응 저해를 종합해준다.
악성 종양은 일련의 단계, 암 세포의 성장 조절 특성의 상실로 이르는 점차적인 변화, 즉 연속적인 조절되지 않는 증식, 주변 조직을 침투하는 능력, 및 다른 기관 부위로 전이하는 능력을 거쳐 발전한다. 생체외에서의 주의 깊은 연구에 의해 일반 세포와 암세포의 성장을 특징짓는 요소들을 규명하게 되었고 세포성장 및 분화를 조절하는 특정 단백질을 규명하게 되었다. 또한, 주의 깊게 조절된 정량적인 생체외 검증에서 세포 형질전환의 연구는 형질전환 세포의 표현형(phenotype)을 유도할 수 있는 특정 유전자를 규명하게 되었다. 그러한 암-유발 유전자 또는 종양유전자는 그들의 단백질 산물의 발현 조절의 변화를 일으키는 돌연변이를 통해 형질전환-유도 성질을 획득하는 것으로 보여진다. 몇몇 경우 그러한 변화는 증진제 및 강화제와 같은 비-암호화 DNA 조절 도메인에서 일어나, 종양유전자의 전사 활성을 변화시키고 그들의 유전자 산물의 발현을 지나치게 하거나 또는 저하시킨다. 다른 경우에, 유전자 돌연변이는 종양유전자의 암호화 구역내에서 일어나, 비활성, 과활성, 또는 정상적인(야생형) 유전자 산물과 다른 활성을 나타내는 변화된 유전자 산물을 생성하게 된다.
현재까지 30개 이상의 세포 종양유전자 족이 규명되었다. 이들 유전자는 그들의 하부 세포 위치 및 그들의 단백질 산물의 작용 추정 기작 양자에 의해 분류된다. ras 종양유전자는 원형질 막 내부에 위치한 관련 단백질을 암호화하는 유전자족의 하나이다. ras 단백질은 아미노산 수준에서 상당히 보존되어 있으며, GTP와 높은 친화도와 특이성을 갖고 결합하며, 그리고 GTP 분해효소(GTPase) 활성을 갖는다. ras 유전자 산물의 세포 작용은 알려지지 않았으나, GTP 결합 단백질 또는 G 단백질로 알려진 신호-전달 단백질류와 상당한 염기서열 동족성을 갖는 것과 같은, 그들의 생화학적 성질은 ras 유전자 산물이 원형질막을 통과하여 세포밖 신호의 전달에 관련된 기본적인 세포 조절작용에서 기초적인 역할을 한다는 것이 제시되었다.
H-ras, K-ras, N-ras로 표시되는 세 가지 ras 유전자는 포유류 게놈(genome)에서 규명되었다. 포유류 ras 유전자는 그들의 암호화 염기서열 내의 단일의 점 돌연변이에 의해 형질전환-유도 성질을 획득한다. 자연적으로 발생하는 ras 종양유전자의 돌연변이는 코돈 12, 13, 및 61에서 일어난다. H-ras, K-ras 및 N-ras의 염기서열이 알려져 있다(카폰 등, Nature 302 1983, 33-37; 칸 등, Anticancer Res. 1987, 7, 639-652; 할 및 브라운, Nucleic Acids Res. 1985, 13, 5255-5268). 사람의 종양에서 가장 일반적으로 검출되는 활성 ras 돌연변이는 GGC로부터 GTC로의 염기변화로 인하여 ras 단백질 산물의 GTP 분해효소 조절구역에서 글리신이 발린으로 치환되는 H-ras 유전자의 코돈 12에서 일어난다(타빈 등, Nature 1982, 300, 143-194; 레디외, Nature 1982, 300, 149-152; 타파로스키 등, Nature 1982, 300, 762-765). 이 하나의 아미노산 변화는 ras 단백질 기능의 정상적인 조절을 없애는 것이며 이에 의해 정상적으로 조절된 세포 단백질이 연속적으로 활성인 것으로 바뀌게 된다. 정상적인 ras 단백질 기능의 조절 해제는 정상적인 성장에서 악성 성장으로의 전환을 가져오게 하는 것으로 여겨진다.
본 발명은 사람의 ras 유전자의 발현을 저해하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 사람의 ras 유전자로부터 유도되는 선택된 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 잡종화할 수 있다. 본 발명은 또한 ras의 돌연변이 형태의 발현을 선택적으로 저해하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명에서 올리고뉴클레오티드는 리보핵산 또는 데옥시리보핵산의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 이 용어는 천연염기, 당 및 당간 (주쇄) 결합으로 구성되는 올리고머 및 유사한 기능을 하는 비-천연 부분을 함유하는 올리고머를 모두 포함하는 것이다. 그러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 자주 천연 형태보다 바람직한데 이는 예를 들어, 증가된 세포내 흡수성 및 뉴클레아제의 존재하에서의 증가된 안정성과 같은 성질 때문이다.
본 발명에 따른 몇몇 바람직한 올리고뉴클레오티드의 특별한 예로는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 헤테로원자 당간 결합, 또는 키메라 및/또는 이들 결합간 교차 혼합을 포함한다. 바람직한 헤테로원자 당간 결합은 CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-O-CH2, CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2및 O-N(CH3)-CH2-CH2주쇄(여기서 포스포디에스테르는 O-P(=O)-O-CH2임)를 가진 결합이다. CH2-N(CH3)-O-CH2결합이 가장 바람직하다. CH2-N(CH3)-O-CH2결합은 메틸렌(메틸리미노) 결합이나 또는 "MMI" 결합으로 축약할 수 있는 3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(메틸리미노)] 결합 같은 것을 포함하는 여러 방법으로 명명할 수 있다. 본 발명의 키메라 혼합된 주쇄에 있어서, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드의 구역은 헤테로원자 결합의 구역 또는 헤테로원자와 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합중의 하나를 교차하는 구역의 측면에 위치한다.
다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 알킬 및 할로겐-치환된 당 성분(moiety)을 함유할 수 있다. 바람직한 치환된 당 성분으로는 2' 위치에 하기에 열거된 것 중의 하나를 포함한다: F, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3또는 O(CH2)n-O-(CH2)nCH3(여기에서 n은 0에서 약 10까지임).
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실 및 시토신을 포함하는 퓨린-9-일 및 피리미드-1-일 헤테로고리에 국한되지 않고 표준의 핵산염기를 포함한다. 다른 바람직한 예는 적어도 하나 이상의 변형된 염기 형태를 포함한다. 그러한 변형된 염기의 몇몇 특정 예로는 2-(아미노)아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌, 7-데아자-프로피닐 아데닌 또는 구아닌, 7-데아자-8-아자 아데닌 또는 구아닌, 5-메틸시토신, 5-프로피닐 우라실, 2-티오우라실, 2-아미노우라실 및 슈도우라실이 있다.
본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키기 위해 변형된 뉴클레오티드, ras mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위해 변형된 뉴클레오티드, 및 RNAse H에 대한 기질인 뉴클레오티드를 동시에 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 ras mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시키도록 변형된 하나이상의 구역, 및 RNAse H에 대한 기질인 구역을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 보다 바람직한 예에서, RNAse H에 대한 기질인 구역의 양 측면에 ras mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시키도록 변형된 두 구역이 존재하게 된다. 그러한 변형의 효과는 ras 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해를 매우 증가시키는 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 50개의 핵산 염기로 구성되는 것이 바람직하다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 30개의 핵산 염기로 구성되는 것이 바람직하며 보다 바람직하게는 약 13 내지 25개의 핵산 염기로 구성된다. 알려진 바와 같이 핵산 염기단위는 포스포디에스테르 또는 다른 결합에 의해 인접한 핵산 염기 단위에 적절하게 결합된 염기-당 조합이다.
본 명세서에서 "잡종화"란 왓슨-크릭 염기쌍으로도 알려진, 반대 핵산 가닥 또는 하나의 핵산 가닥의 두 구역상의 상보적인 염기 사이의 수소결합을 의미한다. 구아닌과 시토신은 이들 사이에 세 개의 수소결합을 형성하도록 알려진 상보 염기의 예이다.
"특이적으로 잡종화가 가능한"이란 비-표적 염기서열에 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 피하기에 충분히 상보적이라는 것이다. 이것은 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 잡종화 가능한 그 표적 핵산의 염기서열에 100% 상보적일 필요는 없는 것이다.
ras-루시페라제 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해: H-ras 해독 개시 코돈 또는 활성화된 H-ras의 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 일련의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 실시예 2-5에 기재된 ras-루시페라제 수용체 유전자 계를 사용하여 검색하였다. 이 초기 계열중에서, 6개의 올리고뉴클레오티드는 ras-루시페라제 활성의 상당하고 재생가능한 저해를 가지는 것으로 밝혀졌다. 이들 올리고뉴클레오티드(모두 포스포로티오에이트)의 염기서열, 염기서열 참조 번호 및 염기 서열 ID 번호를 표 1에 나타내었다.
도 1은 정상인 ras-루시페라제 수용체 유전자 또는 돌연변이 ras-루시페라제 수용체 유전자를 발현하는 세포를 포스포로티오에이트 2503(서열번호: 2)으로 농도를 증가시키면서 처리하였을 때 투여량-감응 실험을 도시한 것이다. 이 화합물은 H-ras 전사의 해독 개시 코돈에 표적된다. 도 1에 나타냈듯이, 세포를 이 올리고뉴클레오티드로 처리하면 정상 및 돌연변이 ras 표적 양자에 약 50nM의 IC50값을 나타내면서, ras-루시페라제 활성의 투여량-의존성 저해를 나타낸다. 대조 올리고뉴클레오티드는 20염기 길이의 랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 결과는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 감염세포에서 루시페라제 활성의 %로 나타내었다. ras 해독 개시 코돈에 표적된 올리고뉴클레오티드가 정상 및 돌연변이 ras 발현을 유도하는데 효과적일 것으로 예측되는데 이는 두 표적이 AUG 해독 개시 부위 주변구역에 동일한 염기서열 조성을 가지기 때문이다.
도 2는 돌연변이된(활성화된) H-ras RNA의 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 화합물인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 2570(서열번호: 3)으로 처리한 세포에서 투여량-감응 실험을 도시한 것이다. 대조 올리고뉴클레오티드는 20 염기 길이의 랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 결과는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 감염세포에서 루시페라제 활성 %로 나타냈다. 도시한 바와 같이, 이 올리고뉴클레오티드의 농도를 증가시키면서 세포를 처리했을 때 ras-루시페라제의 돌연변이 형태 또는 정상 형태를 발현하는 세포에서 ras-루시페라제 활성의 투여량-의존성 저해를 가져왔다. 그러나 데이터를 주의 깊게 살펴보면 낮은 농도에서 올리고뉴클레오티드 2570이 정상 형태에 비해 돌연변이 형태에 거의 3배의 선택성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 사실, 2570은 ras-루시페라제의 돌연변이 형태에 대해 약 100 nM의 IC50값을 갖는데 비해, 돌연변이 되지 않은 형태에 대해서는 약 250 nM의 IC50값을 나타내었다.
도 3은 H-ras의 해독 개시 코돈 또는 코돈 12 점 돌연변이에 표적된 단일 투여량(0.5μM)의 올리고뉴클레오티드로 처리한 ras-루시페라제의 정상 형태 또는 돌연변이 형태를 발현하는 세포에서의 전형적인 실험결과를 도시한 것이다. 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타낸 것으로 시험하였다. 대조 올리고뉴클레오티드(2504)는 20염기 길이의 랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 결과는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 감염세포에서 루시페라제 활성 %로 나타냈다. 도 3에 도시한 바와 같이, ras 해독 개시 코돈에 표적된 화합물 2503(서열번호: 2)이 ras 루시페라제 활성을 저해하는데 가장 효과적이었다. 활성화된 H-ras의 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 세 화합물가운데 17-합체 올리고뉴클레오티드 2570(서열번호: 3)만이 정상 형태에 비하여 ras-루시페라제의 돌연변이된 형태에 대한 선택성을 나타냈다. 이것은 또한 도 4에도 나타나 있는데, 도 4에는 활성화된 H-ras 유전자에 상보적인 모든 13 안티센스 올리고뉴클레오티드와, 야생형 ras의 코돈-12 구역에 상보적인 스크램블된 대조 올리고뉴클레오티드(1966) 및 대조 올리고뉴클레오티드(2907)에서 얻은 데이터를 종합해 놓았다. 각 올리고뉴클레오티드의 길이, 상보되는 구역 및ras-루시페라제 융합 단백질의 발현 억제 활성을 도시하였다. 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 긴 포스포로티오에이트는 ras-루시페라제 발현에 대한 기본적인 안티센스 활성은 나타내지만, ras-루시페라제의 돌연변이 형태의 발현을 선택적으로 저해하지는 않았다. 17 뉴클레오티드 이하 길이의, 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 ras-루시페라제의 어떤 형태에도 활성을 나타내지 않았다. 이것은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과적인 안티센스 활성이 ras 염기서열에 표적되었다는 것을 나타낸다.
H-ras AUG와 특이적으로 잡종화가 가능한 안티센스 올리고뉴클레오티드: H-ras AUG 코돈에 표적된 세 개의 20-염기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 실시예 2-5에 기재된 일시적 감염 검증에 의해 ras-루시페라제 발현을 저해하는 능력을 비교하였다. 결과는 도 5a 및 도 5b에 나타냈다. 표 2에 나타낸 이들 올리고뉴클레오티드 ISIS 2502(서열번호: 1), 2503(서열번호: 2) 및 6168(서열번호: 7)은 HeLa 세포 중에서 단일-투여량(100nM)에서 ras-루시페라제 발현의 저해를 시험하였다. AUG-표적된 세 개의 올리고뉴클레오티드는 모두 ras-루시페라제 발현을 저해하는데 효과적이었다. 이들 세 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 각각의 당에서 2'-O-메틸 변형으로 제조되었다. ISIS 2503(서열번호: 2)의 2'-O-메틸화된 변형 또한 ras-루시페라제 발현을 저해했다. 이것을 도 6에 나타내었다.
올리고뉴클레오티드 길이는 안티센스 활성 및 특이성에 영향을 미친다: H-ras 코돈 12 점 돌연변이에 표적된 올리고뉴클레오티드도 ras-루시페라제의 발현을 저해하는데 효과적이었다. 5 내지 25 염기 길이 범위의 일련의 열 한 개의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하여 실시예 2-5에 기재된 일시적 감염 검증으로 돌연변이 및 야생형의 ras-루시페라제를 저해하는 능력을 시험하였다. 올리고뉴클레오티드는 표 2에 나타냈다. 100 nM 올리고뉴클레오티드 농도에서 15 염기 길이 이상의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이 H-ras 표적의 발현을 저해하였다. 야생형 ras-루시페라제 발현보다 돌연변이체의 선택적인 저해는 15 내지 19염기 길이에서 관찰되었다. 야생형에 대한 돌연변이의 ras-루시페라제의 저해에 대한 최대의 선택성은 17-합체 2570(서열번호: 3)에서 관찰되었으며 약 4배였다. 2570이 염기서열-특이성 방법으로 작용한다는 것을 확인하기 위해, 야생형 H-ras 표적에 완전히 상보적이도록 이러한 올리고뉴클레오티드를 만들고, 중심의 아데노신 잔기를 시토신으로 치환한 이 화합물의 변종(2907; 서열번호: 19)을 시험하였다. 따라서, 이 올리고뉴클레오티드는 돌연변이 H-ras 염기서열과 완전히 잡종화되었을 때, 올리고뉴클레오티드/RNA 이중나선의 중심에서 하나의 부정합을 포함하게 된다. 도 7에 도시한 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 2907은 돌연변이 ras-루시페라제에 비해 야생형 ras-루시페라제 발현을 선택적으로 저해하였으며, 올리고뉴클레오티드 투여량 100 nM에서 약 5배의 차이를 나타내었다.
돌연변이 코돈-12 구역에 상보적인 두 개의 16-합체 및 두 개의 18-합체(도 5 및 표 2)를 실시예 2-5에 기재한 대로 실험하였다. 도 8은 투여량-의존성 방법으로 올리고뉴클레오티드의 13, 15, 16, 17, 18 및 19 염기 길이에 대해 측정한 안티센스 활성 및 돌연변이 선택성 실험결과를 도시한 것이다. 이 실험결과는 돌연변이 H-ras 염기서열에 활성인 화합물이 선택성도 나타냄을 보여주었으며; 16 염기 길이의 올리고뉴클레오티드(서열번호: 14 및 서열번호: 15) 및 17 염기 길이의 올리고뉴클레오티드(서열번호: 3)가 최대의 선택성을 나타냈다(각각 4배 및 5배). 13 염기 화합물인 2568(서열번호: 12)은 어떤 시험 농도에서도 안티센스 활성을 나타내지 않았다. 돌연변이 H-ras에 표적되는 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고뉴클레오티드 염기서열은 5'에서 3'으로 나타내었음)를 표 2에 나타내었다.
데옥시 갭을 가진 키메라 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드: 돌연변이-선택성인 17-합체(2570)의 염기서열에 기초하여, 말단구역이 2'-O-메틸 뉴클레오시드로 구성되고 중심 잔기가 "데옥시 갭"을 형성한 일련의 키메라 포스포로티오에이트 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 데옥시 잔기의 수는 0 (완전히 2'-O-메틸) 내지 17(완전히 데옥시)이었다. 2'-O-메틸 말단(굵은 글씨)과 중심부 데옥시 갭(돌연변이 코돈-12 표적)을 가지는 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 표 3에 나타내었다.
이들 올리고뉴클레오티드는 실시예 6에 기재된 잡종화 효율, 실시예 8에 기재된 포유류 RNAse H를 사용한 생체외에서의 RNAse H 분해 유도 능력, 및 안티센스 활성에 대해 특정하였다. 전장의 H-ras mRNA에 대한 안티센스 활성은, 실시예 9에 기재된 대로, H-ras 유전자 발현을 수용체 유전자 루시페라제에 연결된 ras-감응 강화제 요소를 사용해 관찰하는 일시적인 동시-감염 수용체 유전자 계를 이용하여 측정하였다.
단일 가닥 25-합체 RNA 표적에 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 잡종화: 도 5 및 표 2에는 코돈 12 G→U 점 돌연변이를 포함하는 활성화된 H-ras mRNA에 표적된 15 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 나타내었다. 이들 올리고뉴클레오티드는 5 내지 25 염기 길이이고, 점 돌연변이 주변에 중심을 갖고 있다. 4μM 올리고뉴클레오티드 농도에서 돌연변이 및 야생형의 25-합체 RNA 표적을 저해하는 이들 안티센스 포스포로티오에이트의 녹는점(Tm)을 측정하였다. Tm은 사슬길이가 증가함에 따라 높아졌고, 일정 사슬길이에서 야생형 표적보다 돌연변이 표적에 대해 잡종화될 때 Tm이 더 높았다. 올리고뉴클레오티드 2907은 2570의 중심 아데노신 잔기를 시토신으로 치환하여 야생형 H-ras 표적에 완전히 상보적으로 만든 포스포로티오에이트 17-합체 변종이다. 예견된 바와 같이, 야생형 표적에 대한 이 올리고뉴클레오티드의 잡종화에 대한 녹는점은 돌연변이 표적에 대한 것보다 높고, 이제 이것은 점 돌연변이 부위에서 올리고뉴클레오티드/RNA 이중나선에 하나의 부정합을 포함하게 된다. 돌연변이 H-ras 표적에 완전히 상보적인 17-합체 포스포로티오에이트(2570)에 대해 올리고뉴클레오티드 농도에 대한 Tm의 의존성으로부터 열역학적 변수들을 또한 얻을 수 있다. 이들 데이터는 돌연변이 표적 및 야생형 표적에 대한 올리고뉴클레오티드들의 잡종화 사이의 자유에너지 차이(ΔΔG°37)를 측정하는데 사용되었다. 주어진 올리고뉴클레오티드에 대해, ΔΔG。37는 올리고뉴클레오티드 농도에 대한 Tm의존성으로부터 얻을 수 있다(보러 등, J. Mol. Biol. 1974, 86, 843-853). 2570에 대한 ΔΔG°37은 +1.8 kcal/mole로 계산되었다.
야생형 ras 보다도 돌연변이를 표적하는데 있어서, 최대 선택도는 ΔΔG°37이 증가할수록 증가한다. 따라서, ΔΔG°37을 증가시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형은 선택성을 증가시킨다. 그러한 변형중의 하나는 2,6-디아미노퓨린으로서, 이것은 dA가 U에 결합하는 것보다 강하게 결합하고 dA가 G에 결합하는 것보다 약하게 결합하여 A-U → A-G 부정합에 대한ΔΔG°37을 증가시키게 되는 것으로 여겨진다. RNAse H의 기질 요건 또한 본 발명에 따른 선택성을 얻도록 정립할 수 있다. 효소가 부정합을 제거하거나 결합할 수 없으면, 부정합에 RNAse H 인식부위를 위치시키는 키메라 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것에 의해 ΔΔG°37에 따라 얻어지는 것 이상으로 부가적인 선택성을 얻을 수 있다. 이것은 RNAse H가 완전히 합치된 이중나선과 하나의 부정합을 포함한 것을 구별할 수 있는 경우에도 발견되었다.
짧은 올리고뉴클레오티드 표적에 "데옥시 갭" 올리고뉴클레오티드의 잡종화: 실시예 6에 기재된 대로, 25-합체 합성 올리고리보뉴클레오티드 전체에 대한 2'-O-메틸 데옥시 갭 계열의 잡종화 분석을 행한 결과 주어진 올리고뉴클레오티드에 대한 Tm값이 2'-O-메틸 함량과 직접적으로 상관관계에 있다는 것을 알 수 있었다. 2'-O-메틸 변형은 데옥시 치환기로 대치했을 때 Tm값이 변형당 1.5℃씩 감소했다. 이 실험에서 2'-O-메틸 변형을 포함한 올리고뉴클레오티드의 Tm값은 동일한 염기서열의 완전한 데옥시 화합물의 Tm값보다 높았다.
구조적인 RNA 표적에 "데옥시 갭" 올리고뉴클레오티드의 잡종화: 코돈 12 구역에 안정한 스템 루프 구조를 포함하는 큰 H-ras 표적에 올리고뉴클레오티드를 잡종화하는 실험을 더 행하였다. 구조적인 H-ras 표적에 대한 안티센스 잡종화의 2'-O-메틸 변형 효과는 실시예 7에 기재된 겔 이동 분석으로 측정하였다.
도 9에 나타냈듯이, 완전한 데옥시 17-합체는 헤어핀 표적으로 가장 불안정한 이중나선을 형성하였고; 완전한 2'-O-메틸 17-합체는 가장 안정한 이중나선을 형성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드에서 데옥시 갭 크기가 감소함에 따라, 2'-O-메틸 잔기의 수의 증가는 이중나선의 안정성을 증대시켰다.
RNA 표적의 2차 및 3차 구조는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 잡종화에 영향을 준다. ras 헤어핀 표적의 여러 구역에 잡종화하는 일련의 11-합체 키메라 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. ISIS 5055는 스템 구역의 왼쪽에 잡종화된다(도 9에 헤어핀이 도시된 바와 같음). ISIS 5056은 루프의 왼쪽에 잡종화된다. ISIS 5091은 루프의 오른쪽에, 그리고 ISIS 5147은 스템의 오른쪽에 잡종화된다. 이들은 모두 2'-O-메틸 구역이 양 측면에 존재하는 중심의 5-데옥시 갭을 가진 균일한 포스포로티오에이트이다. 루프의 왼쪽에 표적된 11-합체만이 표적에 측정가능하도록 결합하였다. 다른 11-합체는 측정가능하도록 결합하지 않았다. 이들 올리고뉴클레오티드를 길게 전환시키기도 했는데; 이들 13-합체 올리고뉴클레오티드는 모두 헤어핀 표적에 측정가능하게 결합했으며 루프의 왼쪽에 표적된 올리고뉴클레오티드가 겔 이동 분석에서 가장 강한 결합을 한 것으로 나타났다.
데옥시 갭된 올리고뉴클레오티드에 의해 유도된 RNAse H 분해: 상보적 RNA의 RNAse H 분해를 유도하는 2'-O-메틸 데옥시 갭 올리고뉴클레오티드의 능력을 실시예 8에 기재된 대로 RNAse H의 공급원으로서 HeLa 핵 추출물을 사용해 생체외 측정을 하였다. 도 10에 도시한 바와 같이, 완전히 변형된 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드 또는 하나의 데옥시 잔기를 포함하는 것에서는 어떠한 분해도 관찰되지 않았다. 3, 4, 5, 7 또는 9의 데옥시 길이를 가진 올리고뉴클레오티드는 RNAse H 분해를 유도할 수 있다. 5, 7, 또는 9의 데옥시 갭이 바람직하고, 7 또는 9의 갭이 가장 바람직하다.
전장(full length) ras mRNA에 대한 데옥시-갭된 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성: 2'-O-메틸 변형에 의해 부여되는 증가된 표적 친화도를 증가시키는 유익한 특성을 적정 길이의 RNAse H-민감성 데옥시 갭을 가진 이들 화합물에 의해 제공되는 안티센스 저해로 알아낼 수 있다. 2'-O-메틸 데옥시 갭 올리고뉴클레오티드에 대해 실시예 9에 기재된 H-ras 트랜스 활성화 수용체 유전자계를 사용해 전장의 H-ras mRNA에 대한 안티센스 활성시험을 행했다. 안티센스 실험은 처음에는 단일 올리고뉴클레오티드 농도(100 nM)에서 행했다. 도 11에 도시한 바와 같이, 5 또는 그 이상의 잔기 이상의 데옥시 갭을 함유하는 키메라 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드는 H-ras 유전자 발현을 저해하였다. 이들 화합물은 완전한 데옥시 모 화합물보다 더 큰 활성을 나타냈다.
투여 반응 실험은 네 개의 데옥시 잔기를 포함하는 2'-O-메틸 키메라와 함께, 이들 활성 화합물을 사용하여 행하였다. 도 11b에 나타난 바와 같이, 이들 올리고뉴클레오디드에 의한 전장의 H-ras의 올리고뉴클레오티드-매개된 저해는 투여량에 의존한다. 가장 활성인 화합물은 7-잔기의 데옥시 키메라로서, 이것은 완전한 데옥시 올리고뉴클레오티드의 활성보다 약 5배의 활성을 나타낸다.
짧아진 키메라 올리고뉴클레오티드: 2'-O-메틸 변형에 의해 부여된 증가된 표적 친화도는 짧은 키메라 올리고뉴클레오티드에 활성을 부여하는 것으로 알려졌다. 일련의 짧은 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드를 실시예 9에 기재된 대로 Tm및 안티센스 활성 vs 전체길이의 ras에 대해 시험하였다. 표 4는 5 염기 또는 7 염기 길이의 데옥시 갭을 가진 11, 13, 15 및 17 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드에 대한 Tm값을 나타낸 것이다. 완전한 데옥시 13-합체와는 대조적으로, 2'-O-메틸 키메라 13-합체는 양자 모두 ras 발현을 저해하였고, 11-합체 중 하나가 활성을 나타냈다. 이것을 도 12에 나타냈다.
상대적인 안티센스 활성 및 키메라 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드에 의해 생체외에서의 RNAse H 분해를 활성화시키는 능력은 데옥시 길이와 상관관계가 있다(도 13).
비대칭 데옥시 갭: 키메라 분자의 중심에 데옥시 갭이 있을 필요는 없다. 결합을 증가시키는 2' 위치에서 변형된 한 말단에 그 구역의 뉴클레오티드를 갖고 나머지는 변형되지 않은(2' 데옥시) 분자도 ras 발현을 저해시킬 수 있는 것으로 나타났다. 7-데옥시 갭이 17-합체의 5' 또는 3' 측면 또는 분자의 중간에 있는 다른 부위에 위치한 올리고뉴클레오티드 (염기서열 ID번호: 3)(돌연변이 코돈 12에 상보적인 17-합체)는 모두 RNAse H 활성화 및 안티센스 활성을 나타냈다. 그러나, 5-염기 갭은 위치에 보다 민감하였으며, 몇몇의 갭 위치는 RNAse H의 활성화 및 안티센스 저해에 나쁜 영향을 주었다. 따라서, 7-염기 데옥시 갭이 바람직하다.
다른 당 변형: 키메라 올리고뉴클레오티드에서 안티센스 활성에 대한 2'-O-메틸외의 다른 당 변형의 영향을 조사하였다. 이들 변형은 표 5에 나타냈으며, 실시예 6에 기재된 바와 같이 7-염기 데옥시 갭의 양 측면에 위치하는 2'-변형된 뉴클레오티드를 갖는 17-합체 올리고뉴클레오티드를 25-합체 올리고뉴클레오티드 상보물과 잡종화했을 때 얻어지는 Tm값도 기재하였다. 이들 올리고뉴클레오티드에 대해 2' 위치에서의 알킬 길이와 Tm사이에 어떠한 관계가 관찰되었는데, 알킬 길이가 증가하면 Tm이 감소하였다. 2'-플루오로 키메라 올리고뉴클레오티드가 가장 높은 Tm을 나타냈다.
2' 변형 Tm(℃) IC50(nM)
데옥시 64.2 150
O-펜틸 68.5 150
O-프로필 70.4 70
O-메틸 74.7 20
플루오로 76.9 10
실시예 9에 기재된 트랜스 활성화 수용체 유전자 분석을 사용하여 H-ras에 대한 이들 2' 변형된 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성을 시험하였다. 도 14 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 이들 2'-변형된 키메라 화합물은 모두 ras 발현을 저해하였으며, 2'-플루오로 7-데옥시 갭 화합물이 가장 활성이 있었다. 중심에 5-데옥시 갭을 가진 2'-플루오르 키메라 올리고뉴클레오티드도 활성이 있었다.
5-염기 또는 7-염기 데옥시 갭 주변에 2'-O-프로필 구역을 갖는 서열번호 3의 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드와 비교하였다. T24 세포내에서의 ras 발현은 7-데옥시 갭 및 균일한 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 2'-O-메틸 및 2'-O-프로필 키메라 올리고뉴클레오티드 모두에 의해 저해되었다. 데옥시 갭이 5 뉴클레오티드로 감소되었을 때는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드만이 ras 발현을 저해하였다.
암세포에서 H-ras 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해: ras AUG 구역에 상보적인 두개의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(2502, 2503)를 2'-O-메틸 구역이 양측에 존재하는 7-염기 데옥시 갭 및 동일한 염기서열을 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드(4998, 5122)와 함께 실시예 10에 기재된 시험을 하였다. 2'-O-메틸 말단(굵은 글씨)과 중심의 데옥시 갭(AUG 표적)을 가지는 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 표 6에 나타내었다.
화합물 2503은 T24 세포에서의 ras 발현을 71%까지 저해하였고 키메라 화합물(4998)은 ras mRNA를 84%까지 저해하였다. AUG 구역에 또한 상보적인 화합물 2502는 ras RNA 수준을 26%까지 감소시켰고 이 올리고뉴클레오티드의 키메라 변형(5122)은 15% 저해를 나타냈다. 이 검증에는 또한 돌연변이 코돈 12에 표적된 두개의 올리고뉴클레오티드도 포함되었다. 화합물 2570(서열번호: 3)은 ras RNA를 82%까지 감소시켰고, 7-데옥시 갭을 가진 이 올리고뉴클레오티드의 2'-O-메틸 키메라 변형(3985)은 ras RNA를 95%까지 감소시켰다.
올리고뉴클레오티드 2570 및 2503에 대해서도 야생형(즉, 활성화되지 않은) H-ras 코돈 12를 갖는 HeLa 세포에서 ras 발현에 대한 효과를 측정했다. 상기 올리고뉴클레오티드 모두가 (활성화된 코돈 12를 갖는) T24 세포에서 ras 발현을 저해하지만, ras AUG와 특이적으로 잡종화 가능한 올리고뉴클레오티드(2503)만이 HeLa 세포에서 ras 발현을 저해하였다. 활성화된 코돈 12와 특이적으로 잡종화 가능한 올리고뉴클레오티드 2570(서열번호: 3)은 HeLa세포에서 ras 발현을 저해하지 않았는데, 이것은 이들 세포에서 활성화된 코돈-12 표적이 결여되었기 때문이다.
활성화된 H-ras의 코돈 12구역에 상보적인 17-합체 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드인 2570과, 2570과 동일한 염기서열을 갖고 각각 5, 7 및 9 염기의 데옥시 갭을 갖는 키메라 포스포로티오에이트 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드 3980, 3985 및 3984(표 3에 기재됨)에 대해 (실시예 10에 기재된 대로) T24 세포에서 ras 발현의 저해를 시험하였다. 완전한 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드 2570 및 세 키메라 올리고뉴클레오티드는 T24 세포에서 ras mRNA 수준을 감소시켰다. 화합물 3985 (7-데옥시 갭) 및 3984 (9-데옥시 갭)은 ras mRNA를 81%까지 감소시켰고; 화합물 3980 (5-데옥시 갭)은 ras mRNA를 61%까지 감소시켰다. 이 염기서열을 가지지만, 5-데옥시(4689) 또는 7-데옥시(4690) 갭의 양 측면에 위치하는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 가지는 키메라 올리고뉴클레오티드는 T24 세포에서 ras mRNA 발현을 저해하였고, 7-데옥시 갭이 바람직하였다(82% 저해, vs 5-데옥시 갭을 가지는 2'-플루오로 키메라에 대해서는 63% 저해).
암세포 증식의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해: 활성화된 ras의 코돈 12 구역에 상보적인, 동일 염기서열(서열번호: 3)을 갖는 세 17-합체 올리고뉴클레오티드에 대해 실시예 11에 기재된 T24 암세포 증식에 대한 효과 실험을 하였다. 3985는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 양 측면에 존재하는 7-데옥시 갭을 가지며, 4690은 2'-F 뉴클레오티드가 양 측면에 존재하는 7-데옥시 갭을 갖는다(모두 포스포로티오에이트). 암세포 증식에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 효과는 노던 블롯 분석에 의해 나타난 ras mRNA 발현에 대한 그들의 효과와 상관관계가 있다: 올리고뉴클레오티드 2570은 세포증식을 61%까지 저해하였고, 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드 3985는 82%까지 세포증식을 저해했으며, 2'-플루오로 키메라 유사체는 93%까지 세포증식을 저해하였다.
세포증식에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 투여량-감응 연구에서, 저해는 25nM-100nM 범위에서 투여량에 의존함을 나타내었다. 올리고뉴클레오티드 4690, 3985 및 2570의 IC50값은 각각 44nM, 61nM 및 98nM이었다. 랜덤 올리고뉴클레오티드 대조군은 시험된 투여량에서 이러한 효과를 나타내지 않았다.
세포증식에 대한 ISIS 2570의 효과는 세포형태에 특이적이었다. 이 올리고뉴클레오티드에 의한 T24 세포증식의 저해는 동일 올리고뉴클레오티드(100nM 올리고뉴클레오티드 농도)에 의한 HeLa 세포의 저해보다 4배나 강했다. ISIS 2570은 T24에 존재하지만 야생형의 코돈 12를 갖는 HeLa 세포에서는 없는 활성화된(돌연변이) ras 코돈 12에 표적된다.
주쇄가 변형된 키메라 올리고뉴클레오티드: 상기에서 논의된 올리고뉴클레오티드는 균일한 포스포로티오에이트 주쇄를 가졌다. 상기 2' 변형된 키메라 올리고뉴클레오티드는 균일한 포스포디에스테르 주쇄에서는 활성을 나타내지 않는다. 갭 구역이 P=S 주쇄를 가지며, 양측에 P=O 주쇄를 가지며, 5-뉴클레오티드 데옥시 갭의 양 측면에 존재하는 2'-O-메틸 구역을 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(ISIS 4226). 갭에서 P=O 주쇄를, 그리고 양 측면 구역에서 P=S 주쇄를 가지는 다른 키메라 올리고뉴클레오티드를 제조하였다(ISIS 4223). 이들 올리고뉴클레오티드를 표 7에 나타냈다.
완전히 2'-데옥시이고 하나의 포스포디에스테르(ISIS 4248), 두 개의 포스포디에스테르(ISIS 4546), 세 개의 포스포디에스테르(ISIS 4551), 네 개의 포스포디에스테르(ISIS 4593), 다섯 개의 포스포디에스테르(ISIS 4606) 또는 열 개의 포스포디에스테르 결합(ISIS 4241)을 분자 중심에 포함하는 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 또 다른 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 이들 올리고뉴클레오티드도 표 7에 나타내었다. 하기 표 7은 2'-O-메틸 말단(굵은 글씨)과 중심 데옥시 갭(주쇄 결합은 s (P=S) 또는 o (P=O) 돌연변이 코돈-12 표적으로 표시됨)을 가지는 키메라 주쇄 (P=S/P=O) 올리고뉴클레오티드에 대한 서열을 나타낸 것이다.
그남 등(Nucleic Acids Res. 1983, 11, 1475-1489)은 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 분해에 대한 감도 측정을 위해 37℃에서 HeLa 세포 조추출물에서 배양했다. 포스포로티오에이트/2'-O-메틸 윙(wing) 사이에 5-디에스테르 갭을 가진 올리고뉴클레오티드(4233)의 T1/2는 7시간이었다. 포스포로티오에이트/2'-O-메틸 분자에서 5-포스포로티오에이트 갭을 가진 올리고뉴클레오티드의 T1/2은 30시간이었다. 1 내지 10의 디에스테르 결합을 가진 올리고뉴클레오티드의 세트에서, 하나의 포스포디에스테르 결합을 가진 올리고뉴클레오티드(4248)는 완전한 포스포로티오에이트 분자인 ISIS 2570과 같이 뉴클레아제에 대해 안정하여 HeLa 세포 추출물 중에서 5시간 경과 후에도 분해되지 않았다. 2, 3 및 4-디에스테르 갭을 가진 올리고뉴클레오티드의 T1/2은 각각 5.5시간. 3.75시간 및 3.2시간이었고 5 및 10 데옥시 결합을 가진 올리고뉴클레오티드의 T1/2은 각각 1.75시간 및 0.9시간이었다.
주쇄 변형된 키메라 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성: 안티센스 활성에는 균일한 포스포로티오에이트 주쇄가 필요하지 않다. ISIS 4226 및 ISIS 4233을 ISIS 2570(완전히 포스포로티오에이트/모두 데옥시), ISIS 3980(완전히 포스포로티오에이트/데옥시 갭을 가진 2'-O-메틸 윙) 및 ISIS 3961(완전히 포스포디에스테르/데옥시 갭을 가진 2'-O-메틸 윙)과 함께 실시예 2-5에 기재된 대로 ras 발현에 대한 영향을 ras-루시페라제 수용체계로 시험하였다. P=S(즉, 뉴클레아제 내성) 갭 구역을 갖는 모든 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해하였다. 이것은 도 15에 나타냈다. 분자 중심에 하나의 포스포디에스테르(ISIS 4248) 또는 열 개의 포스포디에스테르 결합(ISIS 4241)을 포함하는 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 두 개의 완전히 2' 데옥시인 올리고뉴클레오티드에 대해서도 활성 검증을 행하였다. 하나의 P=O를 포함하는 화합물은 완전한 P=S 분자와 같이 활성이 있었으나, 열 개의 P=O를 포함하는 동일화합물은 완전히 비활성이었다.
7-염기 데옥시 갭 구역에만 포스포로티오에이트 주쇄를 갖고, 양 측면 구역의 각각이 2'-O-메틸 또는 2'-O-프로필인 포스포디에스테르를 갖는 서열번호 3의 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 2'-O-프로필 디에스테르 양 측면 구역을 갖는 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해할 수 있었다.
변형된 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 ras-루시페라제 유전자 발현의 저해: 돌연변이된 코돈 12의 우라실에 상보적인 위치에 2-(아미노)아데닌을 가지며, 활성화된 ras의 코돈-12 점 돌연변이에 상보적인 일련의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 아데닌의 2-위치에서 아미노기는 우라실의 2-위치의 산소와 수소결합을 형성할 수 있기 때문에, 일반적인 두 개의 수소결합 대신 세 개의 수소결합이 형성된다. 이것은 활성화된 ras 유전자에 대한 2-(아미노)아데닌-변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 잡종화를 매우 안정화시키는 반면, 야생형 코돈 12에 대한 이 올리고뉴클레오티드의 안정성에는 아무 효과가 없거나 불안정화시키는데, 이는 이 위치에서의 변형된 A-G 부정합 때문이다. 이것은 바람직하게 표적에 대한 변형된 올리고뉴클레오티드의 특이성을 증가시키게 된다.
달리 변형되지 않은 균일한 포스포로티오에이트 17-합체에서 이 위치에 단일의 2,6-(디아미노)아데노신을 갖는 올리고뉴클레오티드(염기서열은 2570, 서열번호: 3과 동일)는 최소한 2570 염기서열만큼 RNAse H 기질로서 효과적이었다. 따라서, 효과적인 안티센스 분자가 될 것으로 예견된다. 동일 염기서열의 데옥시 갭된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에서 이 위치에 단일의 2,-(디아미노)아데노신을 갖는 올리고뉴클레오티드도 RNAse H 활성화를 보여준다.
생체내 항-암 데이터: ISIS 2503(서열번호: 2)을 실시예 13 및 14에 기재된 대로 생체내 사람의 종양에 대한 활성을 평가하였다. 이 연구는 쥐(nude mice)의 피하에 이식되어, 이식부위에 종양을 성장시키는 사람의 폐 선암 세포주(A549)를 사용하였다. 이들 세포는 Ha-ras 유전자에 돌연변이를 포함하지 않으나 정상 Ha-ras는 발현시키므로, AUG-배향된 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503만 항-암 활성을 평가하였다.
첫 번째 연구에서, 식염수 중의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 20 mg/kg의 투여량으로 복강내 주사에 의해 투여했다. 투약 처리는 종양이 처음으로 보였을 때(종양세포 접종 후 28일) 시작했고, 2일에 한번씩 처리하였다. 도 16에 도시한 바와 같이, 비연관 대조 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 1082로 처리한 후, 종양 성장에 대한 효과는 나타나지 않았다. 그러나, Ha-ras-특이성 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503(서열번호: 2)에 대해서는 현저한 종양 성장의 저해가 관찰되었다. Ha-ras 화합물의 항암 효과는 투약 후 20일째에 처음 관찰되었고 실험기간동안 계속 지속되었다.
두 번째 연구에서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 양이온 지질 조성물(DMRIE:DOPE)로 제조되어, 실시예 15에 기재된 대로 피하주사로 투여되었다. 투약은 종양 세포 접종 후 일주일에 시작하였고 4주동안만 일주일에 세 번씩 시행하였다. 첫 번째 연구에서 관찰된 바와 같이, Ha-ras-특이성 화합물 ISIS 2503(서열번호: 2)은 종양 성장에 현저한 감소를 일으키는 반면, 비연관 대조 올리고뉴클레오티드(ISIS 1082)는 뚜렷한 효과를 나타내지 않았다(도 17). 종양 부피의 감소는 종양이 가시적으로 나타난 후 20일에 처음 관찰되었고, 연구의 잔여기간에 걸쳐 계속되었다.
세포에서 2'-변형된 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 안정성: 세포에서 안티센스 활성을 위해서는 뉴클레아제 안전성을 부여하는 올리고뉴클레오티드의 변형이 필요하다. 당의 2' 위치에서의 어떤 변형은 어떠한 주쇄 변형없이 세포에서 안티센스 효과를 나타내기에 충분한 뉴클레아제 내성을 부여하는 것을 알 수 있었다. 도 18에 도시한 바와 같이, 균일하게 2'-프로폭시 변형된 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드(서열번호: 3)는 같은 염기서열을 갖는 포스포로티오에이트 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드와 동일한 수준에서 투여 후 24시간에 T24 세포의 Ha-ras 발현을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 균일한 2'-에폭시 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드도 동일한 활성을 나타냈다. 2'-펜톡시 변형도 적어도 2'-프로폭시만큼의 활성을 나타냈다.
Ki-ras에 대해 활성인 안티센스 올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 사람의 Ki-ras 종양유전자의 5'-비해독역, 3'-비해독역 및 암호화 구역에 상보적이 되도록 고안되었다(맥그라쓰 등, 1983, Nature 304, 501-505). 상기 암호화 구역에 상보적인 올리고뉴클레이티드는 Ki-ras-매개된 형질전환을 일으키는 돌연변이 부위로 알려진 코돈 12 및 61, 그리고 형절전환에 관련되지 않는 것으로 알려진 코돈 38에 표적된다. 올리고뉴클레오티드는 표 8에 나타냈다.
i-ras 종양유전자에 있어서, 코돈 12에서 돌연변이를 포함하는 세 개의 대장암 세포주를 저해하는 안티센스 활성에 대해 12개의 Ki-ras-특이성 올리고뉴클레오티드를 검색하여, Ki-ras mRNA 수준을 측정, 평가하였다. 도 19에 도시한 바와 같이, 시험 화합물의 절반이 Ki-ras 전사에 대한 현저한 활성(적어도 40% 저해)을 나타냈고 가장 활성인 화합물은 5'- 및 3'-비해독역에 표적된 것이다. 그러나 Ki-ras 발현의 현저한 저해는 야생형 코돈 12 및 61에 대해 유도된 화합물에서도 관찰되었다. 뚜렷한 활성을 나타내는 화합물은 모두 시험된 세 개의 암 세포주에 대해 효과적이었다.
이 화합물의 투여량 감응 분석은 5'-UTR에 표적된 ISIS 6958 및 ISIS 6957이 이 계열의 올리고뉴클레오티드 가운데 가장 강력한 Ki-ras 저해자라는 것을 나타낸다. 이들 올리고뉴클레오티드에 대해 Ki-ras 형절전환된 세포주의 증식을 저해하는 능력을 관찰하였다. 대장암 세포주 SW480을 단일 투여량의 올리고뉴클레오티드(200nM)로 처리하고, 5일에 걸쳐 세포수를 측정하였다. 도 20에 도시한 바와 같이, Ki-ras 특이성을 나타내는 올리고뉴클레오티드는 양자 모두 SW480 세포의 증식에 대해 효과적인 저해자이며, ISIS 6957(서열번호: 21)이 ISIS 6958(서열번호: 20) 보다 더 큰 활성을 나타낸다. 이러한 활성의 차이는 Ki-ras mRNA 발현의 저해와 상관관계가 있다(도 19).
정상 Ki-ras와 비교한 돌연변이 Ki-ras의 저해 선택성: Ki-ras에 표적된 올리고뉴클레오티드를 관찰하여 정상 Ki-ras에 비해 돌연변이 Ki-ras를 선택적으로 저해하는 능력을 살펴보았다. 두 개의 세포주는 돌연변이 Ki-ras를 발현하는 SW480 세포주(코돈 12, G→T 전환) 및 정상 Ki-ras를 발현하는 세포주(HeLa)를 사용하였다. Ki-ras의 5'-비해독역에 표적된 20-합체 포스포로티오에이트인 ISIS 6957(서열번호: 21)과 Ki-ras 코돈 12 구역에 표적된 15-합체 포스포로티오에이트인 ISIS 7453(서열번호: 32)의 두 올리고뉴클레오티드를 시험했다. 처리 후 24시간에 Ki-ras mRNA 수준을 측정하였다. 코돈-12 유도된 화합물을 돌연변이 Ki-ras를 발현하는 세포주에 효과적이다. 그러나 도 21에 도시된 바와 같이, 5'-비해독역에 표적된 Ki-ras 올리고뉴클레오티드는 두 세포주에서 모두 Ki-ras 발현에 대한 유력한 저해자이다. 돌연변이 Ki-ras에 대한 선택성은 올리고뉴클레오티드 농도와 RNA 표적에 대한 친화도에 의존하는 것을 알 수 있었다.
데옥시 갭을 가지는 Ki-ras 올리고뉴클레오티드: 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(서열번호: 21, Ki-ras의 5'-비해독역에 표적됨)를 6 또는 8 뉴클레오티드 길이의 중심 2'-데옥시 갭 구역의 양 측면에 2'-O-메틸 변형을 갖도록 합성하였다. 갭이 형성된 올리고뉴클레오티드는 노던 블롯 분석으로 측정했을 때 양자 모두 Ki-ras 발현에 대해 활성을 나타냈다. 균일하게 2'-O-메틸화된 화합물(데옥시 갭 없음)은 비활성이었다. 다른 올리고뉴클레오티드, ISIS 7679(서열번호: 33, Ki-ras의 5' 비해독/AUG 구역에 상보적임)도 6- 또는 8- 뉴클레오티드 데옥시 갭을 갖도록 합성하였을 때 활성을 나타냈다.
본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 공지의 고체상 합성기술을 이용해 용이하게 합성할 수 있다. 그러한 합성에 필요한 장치는 Applied Biosystem사를 비롯한 여러 회사들에 의해 판매되고 있다. 그러한 합성에는 다른 방법들도 사용할 수 있으나, 올리고뉴클레오티드의 실질적인 합성은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이는 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것과 유사한 방법을 이용하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 H-ras 유전자로부터 유도된 mRNA에 상보적이어서 잡종화 가능하도록 고안된다. 그러한 잡종화는 mRNA의 정상적인 기능을 저해하여 세포에서 그 기능을 상실하게 한다. 저해받는 mRNA의 기능은 단백질 해독을 위한 RNA의 전좌(translocation), RNA로부터 단백질의 실질적 해독, 하나 또는 그 이상의 mRNA 종을 생성하기 위한 RNA의 접속(splicing), 및 RNA에 의해 개입될 수 있는 가능한 독립적인 촉매 활성과 같은 중대한 기능들을 포함한다. 그러한 RNA 기능을 저해하는 전체적인 효과는 H-ras 유전자의 발현을 간섭하는 것이다. 본 발명의 몇몇 올리고뉴클레오티드는 ras mRNA의 RNAse H 분해를 활성화하도록 고안된다.
다른 포유류 ras 유전자, N-ras 및 K-ras의 단백질 생성은 처음 85 아미노산에 대해서는 H-ras와 동일하다. 세 ras 유전자의 핵산 염기서열은 동일하지 않다고 알려져 있으나, 업자는 본 발명을 이용해 N-ras 및 K-ras 유전자와 특이적으로 잡종화 가능한 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 H-ras mRNA의 코돈 12와 특이적으로 잡종화 가능한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이나, 당업자는 본 발명을 이용해 ras 유전자의 다른 점 돌연변이, 특히 염기서열이 공지되었고 잘 규명된 H-ras, N-ras 및 K-ras의 코돈 12, 코돈 13 및 코돈 61에서의 점 돌연변이와 특이적으로 잡종화 가능한 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다.
도 22에는 본 발명의 바람직한 키메라 올리고뉴클레오티드의 키메라 구조적 측면을 보여준다. 왼편의 구조는 각각의 당-뉴클레오시드 염기 단위를 모두 연결시키는 MMI 결합으로 축약된 헤테로 원자 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이러한 MMI 결합을 제조하기 위한 특정의 방법은 미국특허 제5,378,825호(1995. 1. 3 공고), 제5,386,023호(1995. 1. 31 공고), 제5,489,243호(1996. 2. 6 공고), 제5,541,307호(1996. 7. 30 공고), 제5,618,704호(1997. 4. 8 공고) 및 제5,623,070호(1997. 4. 22 공고)에 제시되어 있으며, 상기 각각의 특허는 본 발명에 참조되었다. MMI는 복잡한 화학 명칭인 "3'-데(옥시포스피니코)-3'[메틸렌(메틸리미노)]"를 순서대로 축약시킨 단어인 메틸렌(메틸리미노)에 대한 약자이다. 화학적 명칭과는 달리, 이들 특허에서는 결합으로 개시되어 있다. 이들 특허에서의 결합은 또한 매트 등(J. Org. Chem., 1996, 61, 8186-8199)의 발명자 및 공동 저자들에 의해 다양한 과학 간행물에 개시되어 있으며, 여러 발명에서 인용되고 있다.
도 22의 가운데에 있는 올리고뉴클레오티드는 꼬여진 또는 교차하는 결합을 갖는다. 이들은 MMI와 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합을 교차시킴으로써 형성된다. 도 22의 오른편에 있는 올리고뉴클레오티드는 혼합된 또는 그림 중앙에 있는 꼬인 결합과 같은 교차시킨 결합이 양 측면에 존재하는 중심의 "갭"에 포스포로티오에이트 결합의 구역에 의해 형성된 키메라 구조를 갖는다.
도 22에서 그림 왼편에 있는 "갭" 구역이 있는 올리고뉴클레오티드를 제외한 MMI를 함유하는 올리고뉴클레오티드에서, 여러 올리고뉴클레오티드의 "측면" 구역의 뉴클레오시드 단위의 잔기는 2'-OMe 뉴클레오시드와 같은 2'-O-메틸 뉴클레오시드 단위로서 표시된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 다른 2'-치환된 뉴클레오시드 단위는 2'-플루오로, 2'-O-일킬 및 2'-O 치환된 알킬 뉴클레오시드를 포함한다. 더 바람직한 치환체로는 에테르와 같은 알콕시 치환체이다. 가장 바람직하기로는 2'-O-메톡시에틸 치환된 뉴클레오시드이다(마틴 등 Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504).
도 22에 나타나 있는 특이 화학 구조를 갖는 서열번호: 2의 다양한 올리고뉴클레오티드에 대하여 T-24 세포에서 H-ras mRNA의 생성을 저해하는 성능을 시험하였다. 이 시험을 위하여, T-24 세포를 6-웰 플레이트에 놓고, 양성 지질(리포펙틴, GIBCO)의 존재하에서 올리고뉴클레오티드 100nM당 리포펙틴 2.5㎍/ml의 정량으로 올리고뉴클레오티드의 농도를 점차 증가시키면서 처리하였다. 올리고뉴클레오티드는 혈청 없는 배지에서 4시간동안 처리하였다. 처리 후 18시간에, 전체 RNA를 얻어서 H-ras mRNA 및 대조 유전자 G3PDH에 대한 노던 블롯 분석을 실시하였다. 도 23 및 도 24에는 각각 올리고뉴클레오티드의 구조 및 시험 데이터를 나타내었다. 데이터는 G3PDH 부호에 대하여 표준화된 % 대조로서 막대 그래프로 표시하였다. 도 23 및 24에서와 같이, 본 발명의 각각의 올리고뉴클레오티드의 투여량 범위에 따른 투여량 감응을 나타내었다. MMI 뉴클레오시드 단위를 결합시킨 키메라 올리고뉴클레오티드는 이 시험에 있어서 양성 대조로서 사용된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드와 동일한 또는 그 이상의 감응을 나타내었으며, 측면 구역의 각각에 1 또는 2 MMI 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드(올리고 14896, 14897 및 14898)는 H-ras mRNA의 최대 감소를 보여주었다. 포스포로티오에이트 결합과 교차하는 세 개의 MMI 결합을 가지는 올리고(14900)는 양성 대조인 올리고와 실질적으로 동일하며, 포스포디에스테르 결합과 교차하는 세 개의 MMI 결합을 가지는 올리고(14899)는 양성 대조인 올리고보다 더 낮은 효능을 나타내었다. 양성 대조와 동일한 효능을 갖는 올리고뉴클레오티드(13920)는 양 측면 구역에 2'-O-메톡시에틸 치환체를 갖는다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 진단, 치료 및 연구시약과 키트(kit)로 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 ras 유전자와 잡종화하므로, 이 사실을 입증하기 위해 샌드위치(sandwich) 및 다른 검증을 용이하게 행할 수 있다. 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 ras 종양유전자의 돌연변이(활성화)된 형태에 우선적으로 잡종화하므로, 그러한 검증은 야생형으로부터 활성화된 형태로의 ras 전환에 대해 세포 및 조직을 검색하는데 이용될 수 있다. 그러한 검증은 형태학적으로 유사한 종양의 감별진단 및 ras 유전자 활성화로부터 일어나는 암 발생의 증가된 위험을 검출하는데 이용할 수 있다. ras 유전자와 올리고뉴클레오티드의 잡종화를 검출하기 위한 수단의 제공이 가능하다. 그러한 수단은 효소 결합, 방사능 표지화 또는 다른 적절한 검출수단을 포함할 수 있다. ras 또는 활성화된 ras의 존부를 검출하는 키트를 제조할 수도 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
올리고뉴클레오티드 합성
치환된 그리고 비치환된 데옥시올리고뉴클레오티드들은 오요드에 의해 산화된 표준 포스포아미데이트 캐미스트리를 이용한 자동화된 DNA 합성기(Applied Biosystems model 380B)상에서 합성되었다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 있어서, 표준 산화 용기는 포스파이트 결합의 단계적 티에이션(thiation)을 위하여 아세토니트릴에 용해된 3H-1,2-벤조디티올-3-원 1,1-디옥사이드의 0.2M 용액으로 교환되었다. 티에이션 정지 단계는 68초까지 증가되었고, 캡핑 단계가 뒤따라 이어졌다. CPG로부터 절단하고 55℃에서 18시간 동안 농축된 수산화암모늄 내에서 차단(deblocking)시킨 후, 올리고뉴클레오티드는 2.5 vol의 에탄올과 함께 0.5M NaCl로 두 번 침전되어 정제되었다. 분석적 젤 전기영동은 20% 아크릴아마이드, 8M 우레아, 454mM 트리스-보레이트 완충액, pH 7.0에서 행해졌다. 올리고데옥시뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 전기영동에 의하여 80% 이상이 전장 물질임이 확인되었다.
올리고뉴클레오티드는 자동화된 합성기와 5'-디메톡시-트리틸 2'-tert-부틸디메틸실릴 3'-O-포스포아미디트(3'-O-phosphoamidites) (American Bionetics, Hayward, CA)를 이용하여 합성되었다. A,C 및 G의 엑소시클릭 아민상의 보호기는 페녹시아세틸이다(Wu, T., Oglivie, K.K. 및 R.T., Nucl. Acids Res. 1989, 17, 3501-3517). 표준 합성 순환은 테트라졸의 펄스 전달 후 정지 단계가 90초까지 상승됨으로써 변환되었다. 올리고뉴클레오티드는 메타놀릭 암모니아가 존재하는 상태하에서 상온으로 밤새 인규베이션(incubation)됨으로써 차단되었다. 진공상태로 건조된 후에, 2'-실릴 기를 테트라하이드로퓨란내에 용해된 1M의 테트라부틸암모늄플루오라이드(Aldrich; Milwaukee, WI)내에서 밤새 인큐베이션하여 제거하였다. 올리고뉴클레오티드는 C-18 Sep-Pak 카트리지(Waters; Milford, MA)를 사용해 정제하고 에탄올로 침전시켰다. 변성 폴리아크릴아미드 전기영동 분석에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 90% 이상이 전장 물질인 것으로 나타났다.
실시예 2
ras-루시페라제 수용체 유전자의 조립(assembly)
본 연구에 있어서 ras-루시페라제 수용체 유전자는 PCR 기술을 이용하여 조립되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 돌연변이(코돈 12) 및 비-돌연변이(야생형)의 사람 H-ras 유전자 모두의 엑손 1의 5'-구역의 PCR 클로닝에 프라이머로 사용했다. c-H-ras1 활성화된 종양유전자(코돈 12, GGC→GTC)를 포함하는 플라스미드 pT24-C3, 및 c-H-ras 원시-종양유전자를 포함하는 pbc-N1을 ATCC(Bethesda, MD)로부터 입수하였다. 1.9kb 루시페라제 유전자(firefly)를 포함하는 플라스미드 pT3/T7 luc는 Clontech Laboratories(Palo Alto, CA)로부터 입수하였다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 돌연변이 및 비-돌연변이 H-ras 유전자를 주형으로 사용하였다. 상기 프라이머는 NheⅠ 및 HindⅢ 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 양 측면이 둘러싸인 정상 및 돌연변이 H-ras의 염기서열 -53 내지 +65(해독개시 자리에 해당)에 상응하는 145 염기쌍의 DNA 생성물을 생성한다. 표준절차에 따라 PCR 생성물을 젤 정제하여 침전시키고 세척하여 물에 재현탁시켰다.
P. pyralis 루시페라제 유전자의 클로닝을 위한 PCR 프라이머는 PCR 생성물이 아미노 말단 메티오닌 잔기가 두 개의 아미노산, 아미노-말단 리신 잔기와 그 뒤의 루이신 잔기로 대치되는 것을 제외하고는 전장의 루시페라제 단백질에 대해 암호화하도록 고안되었다. 루시페라제 유전자의 클로닝에 사용되는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 주형으로, 루시페라제 수용체 유전자를 포함하는, 상업적으로 입수 가능한 플라스미드(pT3/T7-Luc)(Clontech)를 이용한 표준 PCR 반응에 사용되었다. 이들 프라이머는 유일한 HindⅢ 및 BsshⅡ 제한 엔도뉴클레아제 자리가 양 측면에 존재하는, 루시페라제 유전자에 상응하는 약 1.9kb의 생성물을 생성시켰다. 표준절차에 따라 이 분절을 정제하고 침전시키고 세척하여 물에 재현탁시켰다.
ras-루시페라제 융합 수용체 유전자의 조립를 완성하기 위하여, ras 및 루시페라제 PCR 생성물을 적당히 제한 엔도뉴클레아제로 절단하였고, 그리고 제한 엔도뉴클레아제 NheⅠ, HindⅢ 및 BsshⅡ를 이용하여 스테로이드-유도 가능한 쥐의 유방암 비루스 프로모터 MMTV를 함유하는 발현 벡터에 세 부분을 리게이션(ligation)하여 클론시켰다. 그 결과로 생성된 클론은 개똥벌레의 루시페라제 유전자로 프레임에 융합된 H-ras 5' 염기서열(-53 내지 +65)의 삽입을 가져온다. 이렇게 생성된 발현 벡터는 스테로이드-유도 가능한 MMTV 프로모터의 조절하에 발현되는 ras-루시페라제 융합 생성물을 암호화한다. 상기 플라스미드 구조는 개똥벌레의 루시페라제를 암호화하는 염기서열을 가진 프레임에 융합된 활성화된(RA2) 또는 정상(RA4) H-ras 단백질의 아미노산 1-22를 암호화하는 염기서열을 포함한다. ras-루시페라제 융합 mRNA의 해독 개시 코돈은 야생형 H-ras AUG 코돈에 의존한다. 돌연변이 및 정상 H-ras 루시페라제 융합 구조는 표준 절차를 이용한 DNA 염기서열 분석법에 의해 확인되었다.
실시예 3
플라스미드 DNA 세포의 감염
감염은 Greenberg, M.E., Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman 및 K. Strahl, eds), John Wiley and Sons. NY에 기재된 바를 다음의 변형을 가해 수행하였다. HeLa 세포를 60mm 접시에 한 접시당 5×10 세포만큼을 평면배양하고 10μg 또는 12μg의 DNA를 각 접시에 첨가하였는데, 그 중 1μg은 라우스 육종 비루스(RSV) 프로모터의 조절하의 쥐의 글루코코르티코이드 수용체를 발현하는 벡터였고 그 나머지는 ras-루시페라제 수용체 플라스미드였다. 칼슘 포스페이트-DNA 공침전물을 3mM EGTA를 함유하는 트리스-완충된 식염수[50mM 트리스-C1(pH7.5), 150mM NaCl]로 세척함으로써 16∼20 시간 후에 제거하였다. 10% 우 태아 혈청을 포함한 새 배양액을 세포에 첨가하였다. 이때, 세포는 덱사메타손에 의해 수용체 유전자 발현의 활성화 전에 미리 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리되었다.
실시예 4
세포의 올리고뉴클레오티드 처리
플라스미드 감염 후, 세포를 37℃로 예열된 인산염 완충된 식염수로 세척하고 5μg/mL N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTMA)를 포함하는 Opti-MEM을 각 배양판에 가했다(웰 당 1.0ml씩). 각 배양판에 50μM 용량의 올리고뉴클레오티드를 가하고 37℃에서 4시간 동안 배양했다. 배양액을 제거하고 10% 우 태아 혈청을 함유하는 DMEM으로 교환하고 지정된 농도의 적정 올리고뉴클레오티드와 세포를 37℃에서 2시간 더 배양한 후, 덱사메타손으로 세포를 최종 농도가 0.2μM이 되도록 처리하여 수용체 유전자 발현을 활성화시켰다. 세포를 회수하여 덱사메타손 자극 후 15시간에 루시페라제 활성을 검증하였다.
실시예 5
루시페라제 검증
루시페라아제는 Greenberg, M.E., Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman 및 K. Strahl, eds), John Wiley and Sons, NY에서 기재된 대로 세제 트리톤 X-100으로 분해되어 세포로부터 추출하였다. Dynatech ML1000 발광계를 사용해 625μM로 루시페린(Sigma) 부가에 따라 피크 발광을 측정했다. 각 추출물에 대해 추출물의 양을 달리 하여 여러 번 루시페라제 검증을 실시했는데 데이터는 검증의 선형 범위로 모아졌다.
실시예 6
용융점 곡선
IBM PC 컴퓨터와 Gilford Response Ⅱ 분광기를 연결한 Gilford 260 분광기를 이용하여 260nm에서 흡광도 대 온도 곡선을 측정했다. 완충액은 100mM Na+, 10mM 인산염 및 0.1mM EDTA(pH7.0)를 포함했다. 85℃에서 흡광도로부터 측정된 올리고뉴클레오티드 농도는 4μM이었고 흡광계수는 Methods in Enzymol. 1989, 180, 304-325(Puglisi and Tinoco)에 기재된 바에 따라 계산했다. Tm 값, 이중나선 형성의 자유에너지 및 결합 상수는 선형 기울기의 기본선을 갖는 두 상태 모형에 데이터를 일치시킴으로써 얻는다(Petersheim. M Turner, D.H., Biochemistry, 1983, 22, 256-263). 기록된 변수들은 최소한 세 실험의 평균치이다. 여러 개의 올리고뉴클레오티드에 대해 이중나선 형성의 자유에너지도 또한 Tm-1대 log10(농도)의 플롯으로부터 얻었다(Borer P.N., Dengler B., Tinoco I. Jr. 및 Uhlenbeck O.C., J. Mol. Biol. 1974, 86, 843-853).
실시예 7
젤 이동 분석
돌연변이된 코돈 12를 포함하는 47-뉴클레오티드 헤어핀 구조의 ras 표적 전사체를 Lima 외, Biochemistry, 1991, 31, 12055-12061에 기재된 바에 따라 제조하고 검출하였다. 100mM 나트륨, 10mM 인산염, 0.1mM EDTA, 100 CPM의 T7-생성 RNA(약 10pM) 및 1 pM 내지 10μM 범위 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 20㎕에서 잡종화 반응이 이루어지도록 하였다. 반응물은 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 잡종화 후에 생성물을 45mM 트리스-보레이트 및 1mM MgCl2(TBM)를 사용하여 20% 변성되지 않은 폴리아크릴 아미드 젤 상에서 분석결정하였다. 전기영동은 10℃에서 수행하였으며 Molecular Dynamics phosphorimager를 사용하여 정량하였다.
실시예 8
RNase H 분석
활성화된(코돈 12, G→U) H-ras mRNA의 +23에서 +47의 염기에 대응하는 화학적으로 합성한 25-염기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RNase H 분석을 행하였다. 5' 말단-표지된 RNA를 20nM의 농도로 사용하여 20mM 트리스-Cl(pH7.5), 100mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨, 10μg tRNA 및 4U RNasin을 함유하는 최종 부피가 10㎕인 반응액에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 10배 과량으로 하여 배양하였다. 반응 성분들을 15분 동안 37℃에서 예열시킨 후 서서히 실온으로 온도가 내려가도록 하였다. HeLa 세포 핵 추출액을 포유류 RNase H의 공급원으로 사용하였다. 반응은 핵 추출액 2μg(5㎕)의 첨가에 의해 개시되었으며 37℃에서 10분간 지속되도록 하였다. 페놀/클로로포름 추출에 의해 반응이 종료되었으며 RNA 성분을 에탄올로 침전시켰다. 7M 우레아를 함유하는 20% 폴리아크릴아마이드 젤 상에 동일 CMP을 부하시켰고, RNA 분해 산물을 전기영동 후 자동방사선법으로 결정하고 가시화시켰다. 분해 산물의 정량은 Molecular Dynamics Densitometer를 사용함으로써 행해졌다.
실시예 9
ras 트랜스활성화 수용체 유전자계
향상성 SV40 프로모터의 조절하에서 활성화된(코돈 12, GGC→GTC) H-ras cDNA 삽입을 포함하는, 발현 플라스미드 pSV2-oil은 Dr. Bruno Tocque(Rhone-Poulenc Sante, Vitry, France)로부터 기증 받은 것이다. 이 플라스미드는 스테로이드-유도 가능한 쥐의 유방암 비루스(MMTV) 프로모터의 조절하에 H-ras 발현 플라스미드를 PCR에 의해 제조하기 위한 주형으로 사용되었다. H-ras 암호화 서열을 얻기 위하여, H-ras 유전자의 570bp 암호화 구역을 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 프라이머는 클로닝을 용이하게 하기 위해 5'-구역에 유일한 제한 엔도뉴클레아제를 갖도록 고안하였다. H-ras 코돈 12 돌연변이 종양유전자의 암호화 구역을 포함하는 PCR 산물을 젤 정제하고, 분해하여 클로닝 전에 다시 한번 젤 정제하였다. 이 구조는 발현 플라스미드 pMAMneo(clontech Laboratories, CA)내로 삽입제를 클로닝함으로써 완성되었다.
ras-감응 수용체 pRD053은 ras 발현을 검출하기 위해 사용되었다(Owen 외, Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 1990, 87, 3877-3870).
실시예 10
생체내 ras 발현의 노던 블랏(Northern blot) 분석
사람의 방광암 세포주 T24를 ATCC(Rockville MD)로부터 분양 받았다. 10% 열-활성화된 우 태아 혈청 및 페니실린과 스트렙토마이신이 각각 50 U/㎖로 보충된 L-글루타민(Gibco BRL, Gaithersburg MD)으로 McCoy's 5A 배지에서 세포를 성장시켰다. 세포를 100mm 평판에 접종하였다. 70%가 채워졌을 때, 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 평판을 예열된 PBS 10ml 및 2.5㎕ DOTMA를 함유하는 Opti-MEM 감소된-혈청 배지 5㎖로 세척하였다. 그 다음 올리고뉴클레오티드를 필요한 농도로 첨가하였다. 처리한지 4시간 후 배지를 McCoy's 배지로 대치하였다. 올리고뉴클레오티드 처리 후 48시간 후 세포를 회수하고 표준 CsCl 정제 방법을 사용하여 RNA를 분리하였다(Kingston R.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.), John Wiley and Sons, NY).
사람의 상피 암 세포주인 HeLa 229를 ATCC(Bethesda, MD)로부터 입수하였다. 10% 우 태아 혈청 및 100U/㎖ 페니실린이 보충된 Dullbecco 변성된 Eagle 배지(DMEM)에서 6-웰 평판에 단일층으로 HeLa 세포를 유지시켰다. 올리고뉴클레오티드 처리 및 RNA 분리는 상기 T24 세포에 기재된 바와 같다.
노던 잡종화: 각 RNA 10μg을 1.2% 아가로스/포름알데히드 젤 상에서 전기영동을 하였고 표준방법에 따라 GeneBind 45 나일론 막(Pharmacia LKB)에 하룻밤동안 전이시켰다(Kingston, R.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.) JohnWiley and Sons, NY). RNA는 막에 UV-교차결합시켰다. 이중-가닥32P-표지된 프로브를 프라임 유전자 표지 키트(Promega)를 사용하여 합성하였다. ras 프로브는 코돈-12에서 GGC가 GTC로 변화되는 돌연변이를 가진 활성화된(돌연변이된) H-ras mRNA의 cDNA 클론의 SalⅠ-NheⅠ분절이다. 대조 프로브는 G3PDH이었다. 블랏을 QuickHyb 잡종화 용액(Stratagene, La Jolla, CA)으로 68℃에서 15분 동안 예비 잡종화시켰다. 10mg/㎖ 연어 혈청 DNA 100㎕와 혼합된 열-변성된 방사성 프로브(2.5×10 계수/2㎖ 잡종화 용액)를 첨가하여 1시간 동안 68℃에서 막을 잡종화시켰다. 블랏을 실온에서 2×SSC/0.1% SDS에서 15분 동안 두 번 세척하였고 60℃에서 0.1×SSC/0.1% SDS로 30분 동안 한번 세척하였다. 블랏을 자동방사선 사진을 찍고 신호의 강도를 ImageQuant PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 정량하였다. 노던 블랏은 ras 프로브로 우선 잡종화시킨 후, 0.1×SSC/0.1% SDS 내에서 15분 동안 끓여서 떼어버리고, 그리고 대조 G3PDH 프로브로 재잡종화하여 올바르게 샘플이 로딩되었는지를 체크하였다.
실시예 11
암세포 증식에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
실시예 10에 기재된 대로 세포를 배양해 올리고뉴클레오티드로 처리했다. 세포를 60mm 배양판에 접종해 70%가 채워졌을때 DOTMA의 존재하에서 올리고뉴클레오티드로 처리했다. 시간 경과 실험: 첫 날, 세포를 100nM을 최종 농도에서 올리고뉴클레오티드를 단 한번 처리했다. 3일째 성장 배지를 교환하고 5일간 매일 계수 챔버를 사용해 세포를 계수했다. 투여-반응 실험: 여러 가지 농도의 올리고뉴클레오티드(10, 25, 50, 100 또는 250nM)를 세포에 첨가하고 3일후 세포를 회수하여 계수했다. T24 암세포 증식에 대한 올리고뉴클레오티드 2570, 3895 및 4690의 효과를 시험했다.
실시예 12
2-(아미노)아데닌-치환된 올리고뉴클레오티드의 합성
하기 사항을 제외하고는 실시예 1에 기재한 대로 올리고뉴클레오티드를 합성하였다: 2-(아미노)아데닌이 바람직한 위치에서, 포스포아미디트 (phosphoramidite)를 상업적으로 입수가능한 2-아미노데옥시아데노신 포스포아미디트(Chemgenes)로 치환했다.
실시예 13
A549 세포의 배양
A549 세포(ATCC로부터 입수함)를 1g 글루코스/ℓ 및 10% 우 태아 혈청(FCS, Irvine Scientific)을 함유하는 Dulbecco 변성된 Eagle 배양액(DME) 중에서 6-웰 배양판(Falcon Labware)에서 채워지도록 성장시켰다.
실시예 14
누드 마우스(nude mice)내에 있는 사람의 종양 세포를 올리고뉴클레오티드로 처리 - 복강내로 주사함
사람의 폐암 세포 A549를 채취하여 5×106세포(200㎕)를 누드 마우스의 안쪽 대퇴에 피하 주사하였다. 뚜렸한 종양이 약 한달 후에 나타났다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503 및 제조된 비상관 대조 올리고뉴클레오티드 1082(투여량 20mg/kg)를 쥐의 복강내로 투여했다. 10주간 격일간격으로 투여했으며 이 기간동안 종양의 성장을 관찰했다.
실시예 15
누드 마우스에 있는 사람의 종양세포의 올리고뉴클레오티드 처리 - 양이온성 지질로 피하 주사함
사람의 폐암 세포 A549를 채취하여 5×10 세포(200㎕)를 누드 마우스의 안쪽 대퇴에 피하 주사하였다. 뚜렷한 종양이 약 한달 후 나타났다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503 및 양이온성 지질 조성물(DMRIE/DOPE, 60mg/kg)에서 제조된 비상관대조 올리고뉴클레오티드 1082(투여량 5mg/kg)를 종양부위에서 쥐의 피하로 투여했다. 암세포 접종 후 일주일에 투약을 시작했으며 4주간만 일주일에 두 번씩 행했고 총 9주 동안 종양 성장을 관찰했다.
실시예 16
T24 세포에서 2' 변형된 올리고뉴클레오티드의 안정성
T24 방광암 세포를 실시예 10에 기재된 대로 성장시켰다. 세포를 단일 투여량(1μM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고 24시간 후 노던 블랏 분석에 의해 Ha-ras mRNA 발현을 검증했다. 시험을 거친 올리고뉴클레오티드는 Ha-ras 코돈 12에 표적된 17-합체, ISIS 2570(서열번호: 3)의 유사체였다.
실시예 17
세 개의 대장암 세포주에 대한 Ki-ras 올리고뉴클레오티드의 활성
사람의 대장암 세포주 Calu1, SW480 및 SW620은 ATCC로부터 분양받아 실시예 10에서의 HeLa 세포에 대해 기재된 대로 배양하고 보관하였다. 세포를 단일 투여량(200mM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고 24시간 후 노던 블랏 분석에 의해 Ki-ras mRNA 발현이 측정되었다. 증식연구를 위해 0일에 세포를 올리고뉴클에오티드의 단일 투여량(200mM)으로 처리하고 5일 간격으로 세포수를 관찰했다.
실시예 18
돌연변이체 대 야생형 Ki-ras의 올리고뉴클레오티드 저해
SW480 세포를 상기 실시예에서 기재한 대로 배양했다. HeLa 세포는 실시예 10에서 기재한 대로 배양했다. 세포를 단일 투여량(100nM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고 24시간 후 노던 블랏 분석에 의해 mRNA의 수준을 측정하였다.
실시예 19
일반 정보
다른 언급이 없다면 물질들은 상업적인 공급체로부터 구입된 것이며 제공되어 있는 것으로써 사용되었다. 2'-O-메틸-5-메틸루리딘, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-2'-O-메틸-5-메틸루리딘, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸메틸)-N-2-이소부티릴-2'-O-메틸구아노신 및 N-6-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-2'-O-메틸아미노신은 RI Chemicals, CA(714-288-1548)로부터 구입하였다. 2'-O-메틸구아노신 및 2'-O-메틸아데노신은 Summit Pharmaceuticals Corp., N. J.(201-585-9687)로부터 구입하였다.
NMR 분광법. 모든 화합물에 대한1H NMR 스펙트럼은 Varian Unity 400 NMR 분광기 상에서 399.94 MHz에서 또는 Varian Gemini 200 NMR 분광기 상에서 199.975 MHz에서 기록되었다. 모든 다차원의 그리고 다양한 온도 스펙트럼들은 Unity 400 NMR에서 수집되었다. 화합물 19d는 600㎕의 DMSO-d6내에서 1.6mM 농도로 조사되었다. 1차원1H NMR 스펙트럼은 293, 310, 333 및 353K의 샘플 온도로 기록되었다. 모든 1차원 측정들은 동일한 조건에서 행하여졌으며, 동일한 방법으로 행해졌다: 5200Hz 범위(sweep width), 34K 타임 도메인, 64K까지의 제로-필링(zero-filling to 64K). 가능하다면, 상기 결과들은 명백하게 연구되지는 않았지만, -1.01의 라인 브로드닝(line broadening) 및 0.945의 가우스 필터(gaussian filter)를 이용함으로써 여러 경우에 있어서 표준 Varian VnmrS 해상도를 해상시키는 방법을 이끌어 냈다. 양자 공명들(proton resonances)은 310 및 353에서 2차원 스펙트럼을 흘려보냄으로써 주어졌고, K. TOCSY 및 NOESY 스펙트럼을 310K에서 20ms 스핀락(spinlock) 및 650ms 혼합 시간을 갖고 흘려보냈으며, 각각은 상-민감 방식(phase-sensitive manner)으로 수집된 512 콤플렉스 포인트에 의해서는 각각 1K로 작동되었다. 이와 유사하게 353K에서는 상-민감 방식으로 모아진 512 콤플렉스 포인트에 의해 2K로 수행되었다. 각각의 경우에, 결과들은 코사인 제곱하였고, 푸리에 변형 전에서 2k×1k 콤플렉스 포인트까지 제로-필링되었다. 상기13C 스펙트럼은 100.57 MHz 도수에서, 30441Hz 범위 및 0.50s 획득 시간을 이용하여 동일한 장치에서 기록되었으며, 2Hz 라인-브로드닝 및 32K까지의 제로-필링에 의하여 수행되었다.13C 스펙트럼은 293K에서1H{13C}HMQC로 정해졌다. 이러한 실험을 위하여, 1K 콤플렉스 포인트들은 3200Hz의 범위에 걸쳐서 직접적으로 검파된 디멘션(dimension)으로 수집되었다. 총 240의 증가분은 22kHz의 범위에 걸쳐서 간접적으로 검파된 디멘션으로 상-민감 방식을 이용하여 수집되었다. 결과들은1H 디멘션에서의 코사인 제곱 및 t1에서의 가우스(gaussian)로 되었다.
12h, 12i, 12j, 18a, 20a 및 20b에 대한 1차원1H 스펙트럼들은 획득을 위한 동일한 변수를 이용하여 293K에서 모두 기록되었으며, 다음과 같은 방법으로 행해졌다: 14336 콤플렉스 포인트들은 7kHz 범위에 걸쳐서 모아졌다. 결과는 푸리에 변형이 일어나기 전에 64K 포인트들까지로 제로-필링되었으며 0.30Hz 라인-프로드닝되었다. 2차원 스펙트럼은 동일한 샘플에서 스펙트럼 범위에 걸친 해상도를 최적화하는 범위, 즉 각각의 디멘션(dimension)에 있어서 4kHz 내지 5200Hz의 범위에서 획득되었다. 256 포인트들에 의한 1K의 결과들(data sets)이 12h 및 12j에 대해서 얻어졌고, 512 포인트들에 의한 1K의 결과들은 12i 및 20b에 대하여 얻어졌다. 18 및 20b에 있어서, 512 결과 포인트들에 의한 2K의 결과들(data sets)은 충분한 해상도를 허용하는 것으로 얻어졌다. 20a 및 20b에 있어서는 313K에서 결과가 수집되었으며 화학적 이동 분산(Chemical shift dispersion)을 향상시키는 것이었다. 모든 결과들은 상-민감적이었으며, 상기 지적한 TOCSY 및 NOESY 연구에서 이용된 방식과 동일한 조건하에서 이루어진 것들이었다. 19b에 대한1H NMR 결과는 디우터리움 옥사이드(deuterium oxide)내에서 310K에서 수집된 것이었다. 다른 일반적인 실험 절차들은 앞서 언급한 Perbost, M.; Hoshiko, T.; Morvan, F.; Swayze, E.; Griffey, R.H.; Sanghvi, Y.S., J. Org. Chem. 1995, 60, 5150-5156에 기재된 대로 행하였다.
실시예 19
일반 절차 A, 3'-이오도-2'-O-메틸-뉴클레오시드 (11→12)
불활성 대기 상태하의 -10℃에서 건조 상태의 CH2Cl2(5mL/mmol)내에 용해된 피리딘(4.3eq) 용액에 CH2Cl2(5mL/mmol)에 용해된 트리플루오로메탄술포닉 안하이드리드(2eq) 용액을 30분 동안 한 방울씩 첨가하였다. 15분 동안 더 교반한 후에, 건조 상태의 CH2Cl2(5mL/mmol)에 용해되어 있는 보호된 3'-히드록실 뉴클레오시드 용액(1eq, 건조 상태의 피리딘으로 공비혼합됨)을 30분 동안에 걸쳐서 한 방울씩 떨어뜨리면서 첨가하였다. 반응 혼합물은 동량의 차갑게 냉각된 10% 수성 NaHCO3과 함께 격렬한 교반을 통해 희석되었고, 그 혼합물은 상온에서 따뜻하게 되도록 방치되었다. 유기 상은 제거되었으며, MgSO4로 건조되었고, 톨루엔(5mL/mmol)으로 희석되었으며, 농축되어 톨루엔(3×5mL/mmol)으로 공비혼합되었다. 생성된 거품에 Bu4NI(2eq) 및 건조 상태의 톨루엔(30mL/mmol)을 첨가하였으며, 생성된 혼합물을 격렬하게 교반하면서 오일 배스에서 80℃로 30분 동안 가열하여 모든 고체들이 용해되는 지점에서, 탁한 붉은 색의 오일들이 분리되었다. 생성된 혼합물은 EtOAc로 희석되어 용해되었고, 그 후 물(15mL/mmol), 및 1:1 5% 수성 NaHSO3및 5% 수성 Na2SO3(2×15mL/mmol)으로 세척되었으며, MgSO4로 건조되어 농축되었고, 그리고 요오드화물이 제공되도록 크로마토그래피되었다.
실시예 20
3'-데옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-3'-이오도-2'-O-메틸-5-메틸루리딘 (12a)
일반 절차 A에 따라서 제조된 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-메틸-5-메틸루리딘(5.75g, 10mmol)로부터 크로마토그로피(30∼50%의 EtOAc/헥산) 후에 4.41g(64%)의 12a를 얻었다: Rf0.38(50% EtOAc/헥산);1H NMR(CDCl3) δ 9.91(s, 1H), 7.55∼7.20(m, 10H), 6.85(d, 4H), 5.85(s, 1H, H-1'), 4.37(s, 1H), 4.31(d, 1H), 3.93(m, 1H), 3.79(s, 6H), 3.60∼3.50(m, 1H), 3.56(s, 3H), 3.20(m, 1H), 1.83(s, 3H);13C NMR(CDCl3) δ 164.16, 158.53, 150.35, 144.23, 136.14, 135.44, 135.25, 130.06, 128.12, 127.77, 126.88, 113.06, 110.06, 92.48, 90.17, 86.55, 80.00, 68.56, 58.32, 55.09, 26.84, 12.32. Anal. Calcd for C32H33N2O7I·0.4CH2Cl2: C, 54.16; H, 4.74; N, 3.90. Found: C, 54.27; H, 4.58; N, 3.73.
실시예 21
3'-데옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-3'-이오도-2-N-이소부티릴-2'-O-메틸구아노신 (12c)
일반 절차 A에 따라서 제조된 5g(8.26mmol)의 11c로부터 크로마토그로피(80%의 EtOAc/헥산) 후에 3.8g(59%)의 12b를 얻었다:1H NMR(DMSO-d6) δ 12.14(s, 1H), 11.67(s, 1H), 7.96(s, 1H), 7.42∼7.20(m, 9H), 7.17∼6.86(m, 4H), 5.85(d, J=2.1Hz, 1H), 4.74(bs, 2H), 3.87∼3.86(m, 1H), 3.73(s, 6H), 3.32∼3.08(m, 5H), 2.85∼2.70(m, 1H), 1.12∼1.03(m, 6H); MS(FAB+) m/e 780(M+H). Anal. Calcd for C36H38N5O7I·0.25C6H14: C, 56.25; H, 5.16; N, 8.75. Found: C, 56.48; H, 5.24; N, 8.68.
실시예 22
6-N-벤조일-3'-데옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-3'-이오도-2'-O-메틸아데노신 (12k)
일반 절차 A에 따라서 제조된 N-6-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-메틸아데노신(0.69g, 1mmol)으로부터 크로마토그로피(50∼70%의 EtOAc/헥산) 후에 0.47g(58%)의 12k를 얻었다: Rf0.34(50% EtOAc/헥산);1H NMR(CDCl3) δ 9.12(s, 1H), 8.81(s, 1H), 8.37(s, 1H), 8.03(d, 2H), 7.65∼7.15(m, 1H), 6.85(d, 4H), 6.18(s, 1H, H-1'), 4.68(s, 1H), 4.39(d, 1H), 3.94(dd, 1H), 3.80(s, 6H), 3.66(dd, 1H), 3.63(s, 3H), 3.21(dd, 1H);13C NMR(CDCl3) δ 164.52, 158.61, 158.57, 152.71, 151.09, 149.37, 144.36, 141.46, 135.64, 135.35, 133.61, 132.72, 130.10, 130.03, 128.81, 128.10, 127.86, 127.79, 126.96, 123.38, 113.10, 130.03, 128.81, 128.10, 127.86, 127.79, 126.96, 123.38, 113.16, 92.76, 89.73, 86.61, 80.48, 68.58, 58.38, 55.20, 26.60. Anal. Calcd for C39H36N6O6I·0.4CH2Cl2·0.5EtOAc: C, 56.79; H, 4.70; N, 8.00. Found: C, 56.60; H, 4.64; N, 8.01.
실시예 23
5'-O-(tert-부틸디페닐실릴)-3'-데옥시-3'-이오도-5-메틸-2'-O-메틸루리딘 (12e)
11e 용액(7.0g, 13.7mmol) 및 안하이드러스 CH2Cl2(80mL)에 용해되어 있는 건조 상태의 피리딘 용액(1.9g, 24.6mmol)을 약 20분 동안 불활성 대기 상태하에서 -10℃로 격렬하게 교반하면서 냉각시켰다. 트리플릭 안하이드리드(triflic anhydride) 용액(5.1g, 17.7mmol)을 주입기를 통하여 천천히(15분간) 첨가하였다. 반응은 첨가 후 35분만에 종결되었다. 이 냉각 용액에 MeOH(1mL)를 첨가한 후 포화 NaHCO3를 첨가하였으며, 유기 층이 분리되어 소금물(2×15mL)로 세척되었고 Na2SO4로 건조되었다. 용매는 감소된 압력하에서 제거되었으며, 잔여물은 톨루엔(2×20mL)으로 공비혼합되었다. 남은 고무질을 p-크실렌(100mL)내에서 용해시키고, 여기에 Bu4NI(5.6g, 15.1mmol)을 첨가하였고, 그리고 반응 혼합물을 예열된 배스 안에서 140℃까지 가열하였다. 상기 반응은 30분만에 종결되었다. 상온에서 냉각시킨 후에, EtOAc(250mL)로 희석하였고, 그리고 나트륨 설파이트 및 나트륨 바이설파이트(1:1)의 5% 수용액으로 세척하였다. 유기 층은 Na2SO4로 건조되어 농축되었고, 60% EtOAc/헥산을 이용한 실리카 젤상에서 플래쉬 크로마토그래피되었다. 용매의 잔여물은 무색의 거품 상태인 6.8g(80%)의 12e를 제공하였다:1H NMR(DMSO-d6) δ 11.50(s, 1H), 7.23∼7.43(m, 11H), 5.78(d, J=4.0Hz, 1H), 4.6(bs, 1H), 4.40∼4.43(m, 1H), 3.89(bs, 2H), 3.42(s, 3H), 1.59(s, 3H), 1.04(s, 9H); MS (FAB+) m/e 621 (M+H). Anal. Calcd for C27H33N2O5SiI: C, 52.26; H, 4.51. Found: C, 52.55; H, 5.41; N, 4.48.
실시예 24
5'-O-(tert-부틸디페닐실릴)-3'-데옥시-6-N-(디메틸아미노)메틸렌-3'-이오도-2'-O-메틸아데노신 (12f)
12e에 이용된 방법에 따른 EtOAc:헥산에 용해된 MeOH가 80:15:3∼5%의 비율인 용액을 이용한 실리카 젤상에서 크로마토그래피한 후에, 11h(5.3g, 9.2mmol), 피리딘(3.65g, 46.1mmol), 트리픽 안하이드리드(3.0g, 11mol) 및 Bu4NI(5.2g, 14.0mmol)로부터 3.8g(60%)의 12f를 얻었다:1H NMR(DMSO-d6) δ 8.93(s, 1H), 8.45(s, 1H), 8.24(s, 1H), 7.73∼7.39(m, 10H), 6.07(d, J=2.8Hz, 1H), 4.76∼4.74(m, 1H), 3.98∼3.93(m, 3H), 3.46(s, 3H), 3.21(s, 3H), 3.14(s, 3H), 1.03(s, 9H); MS (FAB+) m/e 685 (M+H). Anal. Calcd for C30H37N6O3SiI·C6H12: C, 53.61; H, 5.71; N, 11.91. Found: C, 53.20; H, 5.58; N, 12.24.
실시예 25
5'-O-(tert-부틸디페닐실릴)-3'-데옥시-2-N-(디메틸아미노)메틸렌-3'-이오도-2'-O-메틸아데노신 (12g)
12e에 이용된 방법에 따른 EtOAc:헥산에 용해된 MeOH가 80:15:3∼5%의 비율인 용액을 이용한 실리카 젤상에서 크로마토그래피한 후에, 11j(5.0g, 8.46mmol), 피리딘(3.36g, 46mmol), 트리픽 안하이드리드(3g, 11mol) 및 Bu4NI(5.2g, 14.0mmol)로부터 2.5g(43%)의 12g를 얻었다:1H NMR(DMSO-d6) δ 11.43(s, 1H), 8.58(s, 1H), 7.87(s, 1H), 7.70∼7.64(m, 10H), 5.90(d, J=2Hz, 1H), 4.88(bs, 1H), 4.70(bs, 1H), 3.46(s, 3H), 3.12(s, 3H), 3.04(s, 3H), 1.02(s, 9H); MS (FAB+) m/e 701 (M+H). Anal. Calcd for C30H37N6O4SiI: C, 51.43; H, 5.32; N, 11.99. Found: C, 51.56; H, 5.37; N, 11.98.
실시예 26
일반 절차 B, 뉴클레오시드의 Mitsunobu 반응(10→13)
바람직한 뉴클레오시드(1eq), 트레페닐포스핀(1.15eq) 및 N-히드로프탈리미드(1.15eq)의 혼합물을 사용하기 전에 18시간 동안 P2O5를 이용하여 진공 상태하에서 건조하였다. 불활성 대기 상태하에서 상기 혼합물에 건조 상태의 THF(T를 위한) 또는 DMF(A 및 Gdmf를 위한)(10mL/mmol)을 첨가한 후에, 디에틸아조디카르복실레이트(1.15eq)를 상온에서 교반하면서 상기 용액에 한 방울씩 떨어뜨리면서 첨가하였다. 첨가 비율은 생성된 짙은 빨강 색이 다음 한 방울을 첨가하기 전에 바래질 때까지 계속된다. 첨가를 완료시킨 후에(5∼45분, 출발 뉴클레오시드 및 규모에 따라서), TLC에 의해 반응이 완료된 것이 나타날 때까지 상기 반응물을 교반하였다. 용매는 진공 상태하에서 건조시켜 약 출발물질의 1/3이 되었으며, 고체가 (T, Gdmf)로 얻어진 경우 수집되었으며, 반면에 (A)가 생성된 용액은 물과 에테르로 분리되었으며, 상기 생성된 고체는 수집되어 에테르로 잘 세척되었으며, 바람직한 생성물을 생산하기 위하여 건조되었다. 이러한 바람직한 물질들은 여러 경우에 순수한 것이었으나, 일반적으로 트리페닐포스핀 디옥사이트 및/또는 디에틸 히드라진디카르복실레이트의 흔적을 함유하는 것이었고, 이것들은 칼럼 크로마토그래피에 의하여 제거될 수 있었다. 그러나, 상기 불순물들은 차후의 반응들(일반 절차 C)을 방해하지는 않으며, 초기 물질들을 다음 단계로 직접 가져갈 수 있다.
실시예 27
2'-O-메틸-5'-O-프탈리미도-5-메틸루리딘 (13a)
일반 절차 B에 의하여 2'-O-메틸-5-메틸루리딘(4.08g, 15mmol)이 반응되었다. 반응이 완결된 후에(TLC에 의해 나타남), 고체들이 모아졌으며 에테르로 세척되었고, 3.06g(49%)의 순수한 생성물을 생성시키기 위하여 건조하였다. 결합된 여과물들을 농축시킨 후, 칼럼 크로마토그래피(0∼4%의 MeOH/CH2Cl2)에 의하여 정제하였고, 그 결과 부가적인 2.50g(40%)가 제공되었으며, 13a가 5.56g(89%)의 결합된 수율로 제공되었다:1H NMR(DMSO-d6) δ 11.36(s, 1H), 7.87(br s, 4H), 7.58(s, 1H), 5.89(d, J=5.7Hz, 1H), 5.43(d, J=5.7Hz, 1H), 4.5∼3.8(m, 6H), 3.34(s, 3H), 1.79(s, 3H). Anal. Calcd for C19H19N3O8·0.5H2O: C, 53.52; H, 4.73; N, 9.85. Found: C, 53.51; H, 4.49; N, 9.84.
실시예 28
2'-O-메틸-5'-O-프탈리미도아데노신 (13b)
얼음 물(3L)과 에테르(3L)로 농축된 반응 혼합물을 분리시킨 후 그리고 생성된 고체를 회수하고 건조시킨 후, 일반 절차 B에 의해 제조된 2'-O-메틸-아데노신(50.0g, 178mmol)으로부터 74.3g(98%)의 생성물이 얻어졌다. 상기 생성물은 실릴화 반응을 방해하지 않는 Ph3P=O의 흔적들(1H NMR 및 연소(combustion) 분석에 의한 0.125eq)을 함유한다: Rf0.38(10% MeOH/CH2Cl2);1H NMR(DMSO-d6) δ 8.36(s, 1H), 8.12(s, 1H), 7.81(s, 4H), 6.02(d, J=5.0Hz, 1H), 5.50(d, J=5.0Hz, 1H), 4.6∼4.3(m, 4H), 4.3∼4.2(m, 1H), 3.33(s, 3H); HRMS(FAB+, CsI/NBA) Calcd for C19H18N6O6+Cs+559.0342, found 559.0355. Anal. Calcd for C19H18N6O6·0.125Ph3P=O(1H NMR에서 명백히 나타남): C, 55.34; H, 4.34; N, 18.22. Found: C, 55.07; H, 4.45; N, 17.98.
실시예 29
2-N-(디메틸아미노)메틸렌-2'-O-메틸-5'-프탈리미도구아노신 (13c)
2-N-(디메틸아미노)메틸렌-2'-O-메틸렌구아노신(10f, 6.39g, 18.2mmol)을 완전히 건조한 후(0.01mmHg, 45℃, P2O5로 며칠동안 건조함), 일반 절차 B와 같은 방법으로 반응시켰다. 반응이 완결된 후에(TLC에 의해 나타남), 초기 부피의 1/3으로 감소되었으며, 고체가 회수되어 건조된 결과 8.85g(93%)의 수산화된 13c가 생성되었다: Rf0.23(10% MeOH/CH2Cl2);1H NMR(DMSO- d6) δ 11.39(s, 1H), 8.53(s, 1H), 8.05(s, 4H), 7.84(br s, 4H), 5.92(d, J=5.8Hz, 1H), 5.52(d, J=5.3Hz, 1H), 4.5∼4.1(m, 5H), 3.14(s, 3H), 3.01(s, 3H), 2.88(s, 3H); HRMS(FAB+, CsI/NBA) Calcd for C22H23N7O7+Cs+630.0713, found 630.0725. Anal. Calcd for C22H23N7O7·1.5H2O: C, 50.38; H, 5.00; N, 18.69. Found:C, 50.57; H, 5.12; N, 18.81.
실시예 30
일반 절차 C, 뉴클레오시드의 실릴화 (13→14)
필수적인 뉴클레오시드(1eq, 진공 상태에서 P2O5로 건조함) 및 이미다졸(4.5eq)을 불활성 대기 상태하에서 건조 상태의 DMF(5mL/mmol)내에서 용해시켰고, TBDPSCl(1.5eq)를 첨가하였다. 상기 반응물을 TLC에 의해 반응이 완결된 것이 나타날 때까지(16∼48 시간), 상온에서 교반한 후, EtOAc(15mL/mmol) 및 물(15mL/mmol)을 부었다. 유기 층은 물(3×10mL/mmol)로 세척되었으며, MgSO4로 건조되어 농축되었다. 대규모인 경우에, 초기 반응 혼합물이 묽은 시럽으로 농축되기 더 용이하며, 에테르와 물로 분리되었고 그 다음 생성된 고체들이 수집되었다. 상기 물질들은 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있으나, 불순물은 실릴 부산물이고 일반 절차 D를 통하여 옥심(oximes)으로 변환되는 것을 방해하지 않는다.
실시예 31
3'-tert-부틸디페닐실릴-2-N-(디메틸아미노)메틸렌-2'-O-메틸렌구아노신 (14c)
실리카 플러그를 통하여 초기 물질을 여과(0∼10% MeOH/CH2Cl2)한 후에 일반 절차 C에 의해 제조된 13c(8.85g, 16.9mmol)로부터 10.6g(84%)의 14c를 얻었다: Rf0.36(10% MeOH/CH2Cl2);1H NMR(DMSO-d6) δ 11.35(s, 1H), 8.43(s, 1H), 8.04(s, 1H), 7.84(br s, 4H), 7.5∼7.7(m, 4H), 7.3∼7.4(m, 6H), 6.02(d, J=6.1Hz, 1H), 4.5∼4.7(m, 1H), 4.0∼4.5(m, 4H), 3.05(s, 3H), 3.03(s, 3H), 2.88(s, 3H), 1.06(s, 9H); HRMS(FAB+, CsI/NBA) Calcd for C38H41N7O7+Cs+868.1891, found 868.1899. Anal. Calcd for C38H41N7O7Si·0.5H2O: C, 61.27; H, 5.68; N, 13.16. Found: C, 61.27; H, 5.82; N, 13.38.
실시예 32
일반 절차 D, 뉴클레오시드 5'-포름알독심의 합성 (14→15)
5'-O-프탈리미도 뉴클레오시드에 대응하는 실릴화로부터 얻어진 초기 물질은 건조 상태의 CH2Cl2(10mL/mmol)에 용해되었고, 메틸히드라진(1.2eq)을 -10∼0℃에서 한 방울씩 첨가하였다. 1시간 후에, 상기 혼합물을 여과하였으며, 상기 여과물들을 CH2Cl2로 세척하였고, 결합된 유기물들을 물, 소금물로 세척하여, Na2SO4로 건조하고, 그리고 용액을 농축하여 5'-O-아미노 뉴클레오시드를 생성시켰으며 상기 뉴클레오시드는 정제 없이 즉시 이용되었다. (5'-O-아미노 뉴클레오시드들은 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있지만, 걸려있는 상태에서 분해되는 것으로 관찰되었다.) 상기 잔여물은 첨가된 1:1 EtOAc/MeOH(15mL/mmol), 포름알데히드(20% w/w 수성, 1:eq)에 용해되었고, 그 혼합물은 상온에서 1시간 동안 교반되었다. 용액이 농축된 후, 크로마토그래피 또는 결정화를 통하여 3'-실릴-5'-포름알독심이 제공되었다.
실시예 33
3'-O-tert-부틸디페닐실릴-2-N-(디메틸아미노)메틸렌-2'-O-메틸-5'-O-(메틸아미노)구아노신 (15e)
일반 절차 D에 의한 방법으로 제조된 14c(10.6g, 14.4mmol)로부터 실리카 플러그를 통하여 초기 물질이 여과된 후(0∼10% MeOH/CH2Cl2) 실질적으로 정량된 수율 상에서 9.21g의 15e가 얻어졌다: Rf0.43(10% MeOH/CH2Cl2);1H NMR(DMSO-d6) δ 11.19(s, 1H), 8.47(s, 1H), 7.94(s, 4H), 7.4∼7.5(m, 6H), 6.96(d, J=7.27Hz, 1H), 6.55(d, J=7.27Hz, 1H), 6.02(d, J=6.13Hz, 1H), 4.4∼4.5(m, 1H), 4.0∼4.3(m, 4H), 3.06(s, 3H), 3.01(br s, 6H), 1.06(s, 9H) ppm. Anal. Calcd for C31H39N7O5Si·0.5H2O: C, 59.40; H, 6.43; N, 15.64. Found: C, 59.59; H, 6.33; N, 15.61.
실시예 34
일반 절차 E, 라디칼 커플링(radical coupling) 반응
바람직한 3'-데옥시-3'-이오도-뉴클레오시드(1eq) 및 5'-포름알독심(3eq)을 건조 상태의 벤젠(10mL/mmol)으로 공비혼합하였고, 비스(트리메틸스탄닐)벤조피나콜레이트(2eq) 및 건조 상태의 벤젠(5mL/mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물의 가스가 제거되었으며(아르곤, 30분 동안), 16∼24시간 동안 오일 배스 내에서 80℃로 가열되었고, 모든 요오드화물이 소비되었다(TLC에 의하여 보여짐). 상기 용액은 냉각되었고, 2시간 동안 EtOAc(50mL/mmol) 및 10% 수성 KF(20mL/mmol)로 격렬하게 교반되었다. 유기 층을 5% 수성 NaHCO3(20mL/mmol)로 세척하고, MgSO4로 건조시켜 농축하고, 최소량의 CH2Cl2에 용해시켜 실리카 칼럼에 걸었다. 30%의 EtOAc/헥산(5 칼럼 부피)으로 용출시켜 주석의 부산물 및 벤조페논이 제공되었다. 미반응된 옥심(회수된 미반응된 물질의 75∼99%) 및 히드록실아미노 연결된 이량체는 바람직한 용매계로 계속 용출시켜 얻어졌다.
실시예 35
3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸렌이미노)-5'-O-(트리페닐메틸)티미딜릴-(3'→5')-3'-O-(tert-부틸디페닐실릴)-2'-데옥시아데노신 (9d)
일반 절차 F에 의한 방법으로 제조된 6b(297mg, 0.5mmol) 및 7b(775mg, 1.5mmol)로부터 515mg의 출발 옥심(83%의 미반응된 물질) 및 292mg(59%)의 9d가 4:1의 EtOAc/헥산에 용해된 0∼5% MeOH로 칼럼에 용출시킨 후 얻어졌다: Rf0.41(4:1 EtOAc/헥산에 용해된 5% MeOH);1H NMR(DMSO-d6) δ 12.50(s, 1H), 8.34(s, 1H), 8.23(s, 1H), 7.70∼7.10(m, 26H), 6.55(t, J=6.8Hz, 1H), 6.45(bs, 2H), 6.08(t, J=5.6Hz, 1H), 5.98(s, 1H), 4.50(m, 1H), 4.07(m, 1H), 3.94(m, 1H), 3.47(m, 2H), 3.28(dd, 1H), 3.20(dd, 1H), 2.84(m, 2H), 2.45(m, 3H), 2.19(t, 2H), 1.52(s, 1H), 1.09(s, 9H). Anal. Calcd for C56H60N8O7Si·0.5H2O: C, 67.65; H, 6.18; N, 11.27. Found: C, 67.77; H, 6.06; N, 11.35.

Claims (34)

  1. 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 적어도 하나의 CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-O-CH2, CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2또는 O-N(CH3)-CH2-CH2결합으로 구성되는 적어도 하나의 부분을 가지는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-O-CH2, CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2또는 O-N(CH3)-CH2-CH2결합 중의 적어도 하나는 메틸렌(메틸리미노) 결합인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 사람의 H-ras 유전자로부터 유도되는 선택된 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 잡종화할 수 있는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 사람의 H-ras 유전자의 해독 개시 부위 또는 코돈 12와 특이적으로 잡종화할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 3으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오시드 단위는 2' 위치에서 변형되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 2' 변형은 2'-플루오로, 2'-O-알킬 또는 2'-O-치환된 알킬인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 2' 변형은 2' 치환된 알킬인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 2' 치환된 알킬은 2'-O-메톡시에틸인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제2항에 있어서, 상기 메틸렌(메틸리미노) 결합은 포스포로티오에이트 결합과 교차하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  11. 제2항에 있어서, 상기 메틸렌(메틸리미노) 결합은 포스포디에스테르 결합과 교차하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 한 개, 두 개 또는 세 개의 메틸렌(메틸리미노) 결합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합과 교차하는 한 개 또는 두 개의 메틸렌(메틸리미노) 결합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  14. 선택된 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 잡종화할 수 있고, RNAse H에 대한 기질이며, 그리고 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 가지는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 사람의 H-ras 유전자로부터 유도되는 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 잡종화할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  17. 선택된 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 잡종화할 수 있고, 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 가지는 제1 구역 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 가지는 제2 구역을 함유하는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 구역이 각각 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 가지는 두 개의 상기 제1 구역의 양 측면에 위치하는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  19. 제17항에 있어서, 상기 제1 구역은 2' 위치에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오시드 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 2' 위치에서의 변형은 2'-O-알킬, 2'-O-치환된 알킬 또는 2'-플루오로 변형인 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  21. 제15항에 있어서, 상기 제2 구역은 2'-데옥시뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제2 구역은 적어도 4 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  23. 제21항에 있어서, 상기 제2 구역은 5 내지 9 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  24. 제17항에 있어서, 상기 제1 구역은 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제1 구역은 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합과 교차하는 한 개, 두 개 또는 세 개의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제1 구역은 포스포로티오에이트 결합과 교차하는 한 개, 두 개 또는 세 개의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  27. 제25항에 있어서, 상기 제1 구역은 포스포디에스테르 결합과 교차하는 한 개, 두 개 또는 세 개의 메틸렌(메틸리미노) 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  28. 사람의 H-ras 유전자로부터 유도되는 선택된 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 잡종화할 수 있고, 적어도 하나의 메틸렌(메틸리미노) 내부 뉴클레오시드 결합을 가지는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 사람의 H-ras 유전자의 해독 개시 부위 또는 코돈 12와 특이적으로 잡종화할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  30. 사람의 H-ras 유전자로부터 유도되는 선택된 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 잡종화할 수 있고, 2' 위치에서 2'-O-메톡시에틸 치환체로 변형된 적어도 하나의 뉴클레오시드 단위를 가지는 제1 구역 및 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 가지는 제2 구역을 함유하는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 구역은 2' 위치에서 2'-O-메톡시에틸 치환체로 변형된 적어도 세 개의 뉴클레오시드 단위를 가지는 것을 특징으로 한 올리고뉴클레오티드.
  32. 제30항에 있어서, 상기 제2 구역은 포스포로티오에이트 결합으로 함께 연결된 적어도 네 개의 뉴클레오시드 단위를 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  33. 제31항에 있어서, 상기 제2 구역의 각각의 뉴클레오시드 단위는 2'-데옥시뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  34. 제33항에 있어서, 상기 제2 구역이 각각 2' 위치에서 2'-O-메톡시에틸 치환체로 변형된 적어도 하나의 뉴클레오시드 단위를 포함하는 상기 두 개의 제1 구역의 양 측면에 위치하는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
KR1019997010029A 1997-04-30 1998-04-30 키메라 및 교호결합 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해 KR100354610B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/848,840 US5965722A (en) 1991-05-21 1997-04-30 Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US8/848,840 1997-04-30
US08/848,840 1997-04-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010020405A true KR20010020405A (ko) 2001-03-15
KR100354610B1 KR100354610B1 (ko) 2002-10-04

Family

ID=25304423

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019997010029A KR100354610B1 (ko) 1997-04-30 1998-04-30 키메라 및 교호결합 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해

Country Status (7)

Country Link
US (2) US5965722A (ko)
EP (1) EP0981648A4 (ko)
JP (1) JP2001500530A (ko)
KR (1) KR100354610B1 (ko)
AU (1) AU731088B2 (ko)
CA (1) CA2289454A1 (ko)
WO (1) WO1998049349A1 (ko)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7015315B1 (en) * 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5965722A (en) * 1991-05-21 1999-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US6368855B1 (en) * 1996-06-11 2002-04-09 Antigen Express, Inc. MHC class II antigen presenting cells containing oligonucleotides which inhibit Ii protein expression
AU3465599A (en) * 1998-04-01 1999-10-18 Hybridon, Inc. Mixed-backbone oligonucleotides containing pops blocks to obtain reduced phosphorothioate content
CA2391004A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method for quantitating oligonucleotides
EP1352089B1 (en) * 2000-08-25 2006-12-06 Lovelace Respiratory Research Institute Nested methylation-specific polymerase chain reaction cancer detection method
US7511131B2 (en) 2002-11-13 2009-03-31 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US20060009410A1 (en) * 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
US20040214198A1 (en) * 2002-11-15 2004-10-28 University Of Massachusetts Allele-targeted RNA interference
US7713738B2 (en) 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
US20040198640A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-07 Dharmacon, Inc. Stabilized polynucleotides for use in RNA interference
EP2821085B1 (en) * 2003-09-12 2020-04-29 University of Massachusetts Rna interference for the treatment of gain-of-function disorders
US8680063B2 (en) 2003-09-12 2014-03-25 University Of Massachusetts RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders
WO2005078094A2 (en) * 2004-02-06 2005-08-25 Dharmacon, Inc. Stabilized rnas as transfection controls and silencing reagents
US20090280567A1 (en) * 2004-02-06 2009-11-12 Dharmacon, Inc. Stabilized sirnas as transfection controls and silencing reagents
KR101147147B1 (ko) * 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
JP5107047B2 (ja) 2004-11-09 2012-12-26 サンタリス ファーマ アー／エス Ｌｎａオリゴヌクレオチドおよび癌の処置
US7923207B2 (en) 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Apparatus and system having dry gene silencing pools
US7923206B2 (en) 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Method of determining a cellular response to a biological agent
US7935811B2 (en) 2004-11-22 2011-05-03 Dharmacon, Inc. Apparatus and system having dry gene silencing compositions
US20060223777A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Dharmacon, Inc. Highly functional short hairpin RNA
WO2007022506A2 (en) * 2005-08-18 2007-02-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating neurological disease
WO2007143315A2 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceutical, Inc. Compounds and methods for modulating expression of pcsk9
WO2008036841A2 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Dharmacon, Inc. Tripartite oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference
CN101679979A (zh) 2007-03-24 2010-03-24 基酶有限公司 施用与人载脂蛋白b互补的反义寡核苷酸
WO2008143774A2 (en) * 2007-05-01 2008-11-27 University Of Massachusetts Methods and compositions for locating snp heterozygosity for allele specific diagnosis and therapy
US8188060B2 (en) 2008-02-11 2012-05-29 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation
US20110059111A1 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Mammalian receptors as targets for antibody and active vaccination therapy against mold infections
US8841429B2 (en) 2009-11-03 2014-09-23 Vivonics, Inc. Nucleic acid ligands against infectious prions
US8236570B2 (en) 2009-11-03 2012-08-07 Infoscitex Methods for identifying nucleic acid ligands
EP3702460A1 (en) 2010-11-12 2020-09-02 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
SG192869A1 (en) * 2011-02-24 2013-09-30 Pharmaxis Ltd Oligonucleotide inhibitors with chimeric backbone and 2-amino-2'-deoxyadenosine
DK2742135T4 (da) 2011-08-11 2020-07-13 Ionis Pharmaceuticals Inc Bindingsmodificerede gapped oligomeriske forbindelser og anvendelser deraf
EP2756080B1 (en) 2011-09-14 2019-02-20 Translate Bio MA, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
KR20150030205A (ko) 2012-05-16 2015-03-19 라나 테라퓨틱스, 인크. Smn 유전자 패밀리 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
CN104583401A (zh) 2012-05-16 2015-04-29 Rana医疗有限公司 用于调节atp2a2表达的组合物和方法
US20150152410A1 (en) 2012-05-16 2015-06-04 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
CA2873769A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating hemoglobin gene family expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
WO2013173645A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating utrn expression
US20150247141A1 (en) 2012-09-14 2015-09-03 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
US10858650B2 (en) 2014-10-30 2020-12-08 The General Hospital Corporation Methods for modulating ATRX-dependent gene repression
WO2016130943A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Rana Therapeutics, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
EP3271460A4 (en) 2015-03-17 2019-03-13 The General Hospital Corporation INTERACTOME RNA OF COMPLEX REPRESSIVE POLYCOMB 1 (PRC1)

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) * 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4511713A (en) * 1980-11-12 1985-04-16 The Johns Hopkins University Process for selectively controlling unwanted expression or function of foreign nucleic acids in animal or mammalian cells
NZ209840A (en) * 1983-10-17 1988-11-29 Kaji Akira A method of inhibiting viral propagation by hybridising dna with the viral rna thus blocking its action
US4707440A (en) * 1984-01-30 1987-11-17 Enzo Biochem, Inc. Nucleic acid hybridization assay and detectable molecules useful in such assay
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4871838A (en) * 1985-07-23 1989-10-03 The Board Of Rijks Universiteit Leiden Probes and methods for detecting activated ras oncogenes
JPH0725788B1 (ko) * 1985-09-09 1995-03-22 Teijin Ltd
JPS638396A (ja) * 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) * 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
JPH0723394B2 (ja) * 1986-11-27 1995-03-15 日本臓器製薬株式会社 新規アデノシン誘導体及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物
US4908307A (en) * 1986-12-19 1990-03-13 Karin D. Rodland Hybridization method and probe for detecting nucleic acid sequences
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
CA1340645C (en) * 1987-04-17 1999-07-13 Victor E. Marquez Acid stable dideoxynucleosides active against the cytopathic effects of human immunodeficiency virus
US5085983A (en) * 1988-08-19 1992-02-04 City Of Hope Detection of human tumor progression and drug resistance
WO1989005358A1 (en) * 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5403711A (en) * 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US4867187A (en) * 1988-03-22 1989-09-19 Rainsinger Enterprises, Inc. Umbrella with removable radio handle
DE68911648T2 (de) * 1988-03-24 1994-06-23 Univ Iowa Res Found Katalytische hybridisierungs-systeme zum nachweis von nukleinsäuresequenzen, die auf deren aktivität als kofaktoren in katalytischen reaktionen basieren in denen eine komplementäre, markierte nukleinsäureprobe gespalten wird.
DE3814095A1 (de) * 1988-04-26 1989-11-09 Hans F W Spradau Verfahren zur herstellung von ethylacetat
DE68929361T2 (de) * 1988-04-27 2002-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonukleotid-Derivate und Verwendung davon als Antiviral Arzneimittel
IL90359A0 (en) * 1988-05-26 1989-12-15 University Patents Inc Nucleoside and polynucleotide thiophosphoramidite and phosphorodithioate compounds and their production
US5216141A (en) * 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
JPH0725785B2 (ja) * 1989-01-11 1995-03-22 日本臓器製薬株式会社 アデノシン誘導体及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物
FR2642074B1 (fr) * 1989-01-20 1994-04-29 Oris Ind Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide
GB8902041D0 (en) * 1989-01-31 1989-03-22 Tanabe Seiyaku Co Antiviral agent and novel nucleoside
US5087617A (en) * 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
DE3915462A1 (de) * 1989-03-03 1990-09-06 Europ Lab Molekularbiolog Verwendung von 2-tert.-alkylimino-2-di-c(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)-(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)4(pfeil abwaerts)-alkylamino- 1,3-di-c(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)-(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts)-alkyl-perhydro-1,3,2-diazaphosphorin fuer 0-substituierungsreaktionen von ribonukleosiden
DE3916871A1 (de) * 1989-05-24 1990-11-29 Boehringer Mannheim Gmbh Modifiziertes phosphoramidit-verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren
CA2058632C (en) * 1989-06-05 2004-08-24 Brian C. Froehler Exonuclease-resistant oligonucleotides and methods for preparing the same
US5256775A (en) * 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
WO1990015814A1 (en) * 1989-06-20 1990-12-27 Meiogenics, Inc. Nuclease resistant, single-stranded, non-naturally occurring nucleic acid molecules
US5134066A (en) * 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
GB8920534D0 (en) * 1989-09-11 1989-10-25 Wellcome Found Antiviral compounds
ATE269870T1 (de) * 1989-10-24 2004-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte oligonukleotide
CA2073500C (en) * 1990-01-11 2008-03-25 Phillip Dan Cook Compositions and methods for detecting and modulating rna activity and gene expression
US5578718A (en) * 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5212295A (en) * 1990-01-11 1993-05-18 Isis Pharmaceuticals Monomers for preparation of oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
JPH03240795A (ja) * 1990-02-15 1991-10-28 Ajinomoto Co Inc 新規オリゴヌクレオチド誘導体及び抗ウイルス剤への使用
US5149797A (en) * 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) * 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
DE4037363A1 (de) * 1990-04-09 1991-10-10 Europ Lab Molekularbiolog 2-0-alkylnukleotide sowie polymere, die solche nukleotide enthalten
US5658731A (en) * 1990-04-09 1997-08-19 Europaisches Laboratorium Fur Molekularbiologie 2'-O-alkylnucleotides as well as polymers which contain such nucleotides
DE69126530T2 (de) * 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5386023A (en) * 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5223618A (en) * 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) * 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5138045A (en) * 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5618704A (en) * 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5541307A (en) * 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
BR9106729A (pt) * 1990-08-03 1993-07-20 Sterling Winthrop Inc Composto,processos para inibir a degradacao por nuclease de compostos e para estabilizar sequencias de nicleotideos ou oligonucleosideos,composicao utilizavel para inibir expressao de genes e processo para inibir expressao de genes em um mamifero necessitando de tal tratamento
DK0549615T3 (da) * 1990-08-13 2006-07-03 Isis Pharmaceuticals Inc Sukkermodificerede oligonukleotider der påviser og modulerer genekspression
US5214134A (en) * 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
CA2092002A1 (en) * 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
WO1992007065A1 (en) * 1990-10-12 1992-04-30 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Modified ribozymes
CA2108144A1 (en) * 1991-03-06 1992-09-07 Jack A. Roth Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
DE4110085A1 (de) * 1991-03-27 1992-10-01 Boehringer Ingelheim Int 2'-o-alkyl-oligoribonukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als antisense-oligonukleotide
US5965722A (en) * 1991-05-21 1999-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
WO1994008003A1 (en) * 1991-06-14 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
US5582986A (en) * 1991-06-14 1996-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene
CA2111472A1 (en) * 1991-06-14 1992-12-23 Brett P. Monia Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene
EP0655088B1 (en) * 1991-10-15 2002-07-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5359044A (en) * 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
DE69331543T2 (de) * 1992-03-05 2002-09-26 Isis Pharmaceutical, Inc. Kovalent vernetzte oligonukleotide
US5652355A (en) * 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
JP3240795B2 (ja) 1993-12-22 2001-12-25 トヨタ自動車株式会社 Ｅｇｒガス冷却構造

Also Published As

Publication number Publication date
KR100354610B1 (ko) 2002-10-04
CA2289454A1 (en) 1998-11-05
WO1998049349A1 (en) 1998-11-05
JP2001500530A (ja) 2001-01-16
AU7563898A (en) 1998-11-24
US5965722A (en) 1999-10-12
EP0981648A1 (en) 2000-03-01
AU731088B2 (en) 2001-03-22
US6359124B1 (en) 2002-03-19
EP0981648A4 (en) 2002-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100354610B1 (ko) 키메라 및 교호결합 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해
US5576208A (en) Antisense oligonucleotide inhibition of the RAS gene
KR100363475B1 (ko) ｒａｓ의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
JP3131222B2 (ja) ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド
JP4293636B2 (ja) 糖修飾ギャップ付オリゴヌクレオチド
US5623065A (en) Gapped 2' modified oligonucleotides
US5955589A (en) Gapped 2' modified oligonucleotides
US5856455A (en) Gapped 2'-modified oligonucleotides
KR100199247B1 (ko) Ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee