JP4293636B2 - 糖修飾ギャップ付オリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は向かい合っている鎖の鎖切断のためのＲＮａｓｅ Ｈ活性を惹起するオリゴヌクレオチドの合成および使用に関する。本発明に含まれるものは、オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオシド単位がヌクレアーゼ耐性であるように機能化され、オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオシド単位が核酸の相補的鎖へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを強化する置換基を含み、およびオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオシド単位が２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を含むオリゴヌクレオチドである。
背景技術
オリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子にハイブリダイズすることが知られている。ハイブリダイゼーションとは標的ＤＮＡまたはＲＮＡの核酸塩基へのオリゴヌクレオチド核酸塩基の配列特異的塩基対水素結合形成である。そのような核酸塩基対はお互いに相補的であると言われている。
相補的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度を決定するとき、相補的核酸へ結合するオリゴヌクレオチドの相対的能力は特定のハイブリダイゼーション複合体の融解温度を決定することにより比較されるであろう。二重らせんの特徴的な物理的特性である融解温度（Ｔ_m）とは、コイル（ハイブリダイズしていない）形に対して５０％らせん（ハイブリダイズしている）形が存在している温度（摂氏度で）を示している。ハイブリダイゼーション複合体の形成および分解（融解）を決定するため、Ｔ_mはＵＶスペクトルを用いて測定される。ハイブリダイゼーション間に起こる塩基の積み重なりはＵＶ吸収の減少（淡色効果）を伴っている。その結果、ＵＶ吸収の減少はより高いＴ_mを示す。Ｔ_mがより高くなると、鎖間の結合の強さがより大きい。
細胞内酵素、ＲＮａｓｅ Ｈを用いることにより標的ＲＮＡの酵素的切断を達成するためにオリゴヌクレオチドが使用できる。そのようなＲＮａｓｅ Ｈ切断の機構は、標的ＲＮＡへハイブリダイズする２’−デオキシリボフラノシル オリゴヌクレオチドを必要とすると信じられている。生じるＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅ Ｈを活性化し、活性化された酵素がＲＮＡ鎖を切断する。ＲＮＡの切断はＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはこの型の機構で働くと信じられている。しかしながら、ＲＮａｓｅ Ｈの細胞活性化に有用であるＤＮＡオリゴヌクレオチドについては、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化に十分な時間細胞中で生き残るために、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対して好適には適度に安定である。研究試薬としてのオリゴヌクレオチド使用のような非細胞系での使用には、そのようなヌクレアーゼ安定性は必要ないであろう。
いくつかの報文がＲＮａｓｅ Ｈおよびオリゴヌクレオチドの相互作用を記載している。特に興味が持たれるものは：（Ｄａｇｌｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，１８，４７５１；（２）Ｄａｇｌｅ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９１，１，１１；（３）Ｅｄｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９１，２６６，６４７２；および（４）Ｄａｇｌｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，１９，１８０５である。これらの報文によると、非修飾ホスホジエステルヌクレオシド間結合および修飾ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の両方を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドが細胞性ＲＮａｓｅ Ｈの基質である。それらは基質であるので、ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの切断を活性化する。しかしながら、筆者らはアフリカツメガエル胎児において、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合の両方もまたエキソヌクレアーゼ分解を受けることを認めた。そのようなヌクレアーゼ分解はＲＮａｓｅ Ｈ活性化に利用可能なオリゴヌクレオチドを急速に枯渇させるので有害である。
参照文献（１）、（２）および（４）に記載されているように、ヌクレアーゼ分解に対してオリゴヌクレオチドを安定化させ、一方、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化は依然として提供するようにするため、ホスホロアミデート、アルキル ホスホネートまたはホスホトリエステル結合の区画間に位置しているホスホジエステル結合ヌクレオシドの短い区画を有する２’−デオキシオリゴヌクレオチドが構築された。ホスホロアミデート−含有オリゴヌクレオチドはエキソヌクレアーゼに対して安定化されているが、参照文献（４）において著者らは各々のホスホロアミデート結合はホスホロアミデート含有オリゴヌクレオチドのＴ_m値測定において１．６℃の損失を生じていることを銘記している。そのようなＴ_m値の減少は、オリゴヌクレオチドおよびその標的鎖間のハイブリダイゼーション減少を示している。
別の著者もオリゴヌクレオチドおよびその標的鎖間のハイブリダイゼーションのそのような損失が起こる影響について論評している。Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓらは（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９１，１０，１１１１）、オリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈの基質でありうるが、ｍＲＮＡへの弱いハイブリダイゼーションのためＲＮａｓｅ Ｈによる切断効率は低かったことを観察している。筆者らはオリゴヌクレオチド３’末端にアクリジン置換を包含させるとオリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼから保護することも示している。
１９９１年５月７日に公開された米国特許第５，０１３，８３０号はホスホジエステル結合を通してＤＮＡオリゴマーに結合されたＲＮＡオリゴマーまたはそれらの誘導体から成る混合オリゴマーを開示している。ＲＮＡオリゴマーはまた２’−Ｏ−アルキル置換基も有する。しかしながら、ホスホジエステルであるため、オリゴマーはヌクレアーゼ切断を受けやすい。
１９８９年４月１３日に出願された欧州特許出願第３３９，８４２号は２’−Ｏ−メチルリボオリゴヌクレオチド ホスホロチオエート誘導体を含む２’−Ｏ−アルキル置換ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示している。上記の出願はまた、ヌクレアーゼ耐性を欠く２’−Ｏ−メチル ホスホジエステルオリゴヌクレオチドも開示している。
１９９２年９月２２日に公開された米国特許第５，１４９，７９７号は、ホスホジエステル結合により連結されたデオキシヌクレオチドの内的部分および各々の側面に修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が隣接した部分を含む混合リン酸主鎖オリゴヌクレオチドを開示している。隣接配列はメチルホスホネート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートまたはホスホロアミデート結合を含む。
１９９３年１０月２６日に公開された米国特許第５，２５６，７７５号は、ホスホロアミデート結合およびホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートを取り込んだ混合オリゴヌクレオチドを記載している。
オリゴヌクレオチドおよびＲＮａｓｅ Ｈを用いた標的ＲＮＡ鎖の切断が有用であろうことは認められているが、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性およびハイブリダイゼーションの忠実度がオリゴヌクレオチド治療の開発において特に重要である。従って、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化でき、且つ同時にハイブリダイゼーション特性を維持または改良し、およびヌクレアーゼ耐性を提供する方法および物質に対する長い間の要求がまだ満たされていない。そのようなオリゴヌクレオチドはまた研究試薬および診断試薬としても望まれている。
発明の概要
本発明の一つの態様に従うと、ヌクレオシド単位の配列から形成されるオリゴヌクレオチドが提供される。本オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させるように機能化されている少なくとも一つのヌクレオシド単位を取り込んでいる。さらに、標的ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるためにオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオシド単位が機能化されており、および少なくともヌクレオシド単位のいくつかは２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を有する。
本発明の好適なオリゴヌクレオチドにおいて、結合親和性を増加させるために機能化されているヌクレオシド単位は２’−置換基を含む。好適な態様において、２’−置換基としてはフルオロ、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₉アミノアルコキシ（アミノプロポキシを含む）、アリルオキシ、イミダゾリルアルコキシおよびポリエチレングリコールが含まれる。好適なアルコキシ置換基にはメトキシ、エトキシおよびプロポキシが含まれる。好適なアミノアルコキシ単位はアミノプロポキシである。好適なイミダゾリルアルコキシ置換基はイミダゾリルプロポキシである。好適なポリエチレングリコール置換基は−Ｏ−エチル−Ｏ−メチルまたはメトキシエトキシ（−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃）である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合から成る群より選択される荷電リン結合により連結されたヌクレオシド単位を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸の相補的鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる置換基を有する多数の連結されたヌクレオシド単位を含む。ある好適な態様において、そのような置換基を含むヌクレオシド単位を有するオリゴヌクレオチドの配列は第一の部分配列および第二の部分配列に分割でき、第一の部分配列は２’−置換−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を含む連結されたヌクレオシド単位を有しており、および第二の部分配列は２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を含む連結されたヌクレオシド単位を有する。好適には、該第二の部分配列は少なくとも三つのヌクレオシド単位を有しており、より好適には少なくとも五つのヌクレオシド単位を有する。さらに好適な態様においては、第一の部分配列に対して選択可能であるヌクレオシド単位から選択されたヌクレオシド単位の第三の部分配列が存在する。第二の部分配列は第一および第三の部分配列の間に位置しているのが望ましい。本発明のそのようなオリゴヌクレオチドはまた”キメラ”または”キメラの”または”ギャップ付（ｇａｐｐｅｄ）”オリゴヌクレオチドともいわれている。
本発明のさらに好適な態様において、結合親和性を増加させる置換基を有するヌクレオシド単位はオリゴヌクレオチドの３’または５’末端の一つまたは両方に位置している。置換基で置換されている１から約８のヌクレオシド単位が存在しうる。好適には、少なくとも５つのヌクレオシド単位が２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートのようなリン結合により２’−置換および２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基へ連結された核塩基を含む。本発明の好適な核酸塩基にはアデニン、グアニン、シトシン、ウリジンおよびチミンのようなプリンおよびピリミジン、並びにキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル ウラシルおよびシトシン、６−アゾ ウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオーツ、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシンおよび７−メチルグアニンのような他の合成および天然核酸塩基が含まれる。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第３，６８７，８０８号に記載されているもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に記載されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈｅｔ．ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に記載されているものが含まれる。
本発明はまた、望まれないタンパク質の生成により特徴付けられる疾患を有する生物体の処置のための方法も提供する。これらの方法は、生物体と、核酸の相補的鎖に特異的にハイブリダイズできるヌクレオシド単位の配列を有しており、ヌクレオシド単位の少なくとも一つはヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させるように機能化されているオリゴヌクレオチドを接触させることを含み、ここでヌクレオシド単位上には核酸の相補的鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるために置換基が位置しており、複数のヌクレオシド単位は２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を有する。
さらに本発明に従うと、核酸の相補的鎖に特異的にハイブリダイズできるヌクレオシド単位の配列を有しており、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させるように機能化されている少なくとも一つのヌクレオシド単位を有する医薬として有効量のオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供され、ここで複数のヌクレオシド単位は核酸の相補的鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるためにその上に位置されている置換基を有しており、およびここで複数のヌクレオシド単位は２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を有する。本組成物はさらに医薬として受容可能な希釈剤または担体も含む。
さらに本発明に従うと、配列特異的核酸のインビトロ修飾のための方法が提供され、本方法はＲＮａｓｅ Ｈ酵素および該核酸を含む試験溶液と、核酸の相補的鎖に特異的にハイブリダイズできるヌクレオシド単位の配列を有するオリゴヌクレオチドを接触させることを含み、ここでヌクレオシド単位の少なくとも一つはヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させるように機能化されており、ここで複数のヌクレオシド単位は核酸の相補的鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるためにその上に位置されている置換基を有しており、およびここで複数のヌクレオシド単位は２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を有する。
また生物体においてハイブリダイゼーションおよびＲＮａｓｅ Ｈ酵素活性化を同時に促進する方法が提供され、本方法は、生物体と、核酸の相補的鎖に特異的にハイブリダイズできるヌクレオシド単位の配列を有するオリゴヌクレオチドを接触させることを含み、ここでヌクレオシド単位の少なくとも一つはヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させるように機能化されており、ここで複数のヌクレオシド単位は核酸の相補的鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるためにその上に位置されている置換基を有しており、およびここで複数のヌクレオシド単位は２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を有する。
本発明はさらに生物体または細胞において異常ＲＮＡ分子の存在または不在、または正常ＲＮＡ分子の異常なまたは適当でない発現を検出するための診断法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明のオリゴヌクレオチドおよび参考化合物の用量応答活性を示している折れ線グラフである。
図２は本発明のオリゴヌクレオチドおよび参考化合物の用量応答活性を示している棒グラフである。
図３はＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対するいくつかの２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドの効果を示している棒グラフである。斜線が入ったグラフは８．５ｋｂ転写体を表しており、白棒は４．０ｋｂ転写体を示している。
図４はＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対するいくつかの２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドの効果を示している棒グラフである。斜線が入ったグラフは８．５ｋｂ転写体を表しており、白棒は４．０ｋｂ転写体を示している。
図５はＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対する別の２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドの効果を示している棒グラフである。斜線が入ったグラフは８．５ｋｂ転写体を表しており、白棒は４．０ｋｂ転写体を示している。
図６ａおよび６ｂは、Ａ５４９細胞におけるＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対する配列ＩＤ番号：３０を有する２’メトキシエトキシ修飾オリゴヌクレオチドの効果を示している折れ線グラフである。図６ａはデオキシホスホロチオエート化合物ＩＳＩＳ３５２１と比較したＩＳＩＳ９６０５の効果を示している。図６ｂはデオキシホスホロチオエート化合物ＩＳＩＳ３５２１と比較したＩＳＩＳ９６０６の効果を示している。
図７ａおよび７ｂはヌードマウスにおけるヒト結腸癌腫（Ｃｏｌｏ２０５）腫瘍移植片の増殖に対する配列ＩＤ番号：３０を有するオリゴヌクレオチドの効果を示している折れ線グラフである。図７ａはデオキシホスホロチオエート化合物、ＩＳＩＳ３５２１の効果を示している。図７ｂは２’メトキシエトキシ修飾化合物、ＩＳＩＳ１２７２３の効果を示している。
図８ａおよび８ｂはヌードマウスにおけるＡ５４９肺腫瘍移植片の増殖に対するＩＳＩＳ５１３２（図６ａ）およびＣＧＰ６９８４５、同じ配列の２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃）体（図６ｂ）の効果を示している折れ線グラフである。
図９は対照化合物および本発明の二つの化合物のマウス血漿濃度を示している折れ線グラフである。血漿濃度は時間に対してプロットされている。
図１０はマウスの種々の組織における対照化合物の分布を示している三次元棒グラフである。特定の組織が一つの軸に、時間が第二の軸におよび用量のパーセントが第三の軸に示されている。化合物は静脈注射により送達された。
図１１はマウスの種々の組織における本発明の化合物の分布を示している三次元棒グラフである。特定の組織が一つの軸に、時間が第二の軸におよび用量のパーセントが第三の軸に示されている。化合物は静脈注射により送達された。
図１２はマウスの種々の組織における本発明の別の化合物の分布を示している三次元棒グラフである。特定の組織が一つの軸に、時間が第二の軸におよび用量のパーセントが第三の軸に示されている。化合物は静脈注射により送達された。
発明の詳細な説明
本発明の目的に従うと、強められたヌクレアーゼ耐性、核酸の相補的鎖に対する強められた結合親和性を有しており、およびＲＮａｓｅ Ｈの基質である新規オリゴヌクレオチドが提供された。本発明のオリゴヌクレオチドは複数のヌクレオシド単位から組み立てられている。本発明の各々のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性が増加するように機能化されている少なくとも一つのヌクレオシド単位を含む。さらに、本発明のある態様では、ヌクレオシド単位の少なくともいくつかは核酸の相補的鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる置換基を有する。さらに、ヌクレオシド単位の少なくともいくつかは２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を含む。
上記のガイドラインに関して、本発明のオリゴヌクレオチドに各々のヌクレオシド単位は（もしくは”ヌクレオシド”または”サブユニット”と称される）”天然の”または”合成の”残基のどちらでもよい。従って、本発明の文脈において、用語”オリゴヌクレオチド”は複数の連結されたヌクレオシド単位から形成されたオリゴマーを意味している。ヌクレオシド単位はお互いにホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合のようなリン結合を通して連結されている。ヌクレオシド単位は天然のまたは非天然の核酸塩基およびペントフラノシル糖残基から形成される。用語”オリゴヌクレオチド”は従って実際上、天然に存在する化学種または天然に存在するヌクレオシド単位から形成された合成化学種を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは修飾されたサブユニットを含むこともできる。修飾はヌクレオシドの核酸塩基部分、ヌクレオシドの糖部分または次のヌクレオシドを連結している結合に起こり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位に置換基を取り込むことにより増加できることが本発明において見いだされた。好適な置換基は２’置換基である（すなわち、本発明によるオリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位のペントフラノシル糖残基の２’位に位置された置換基）。現在の所、好適な置換基にはフルオロ、アルコキシ、アミノアルコキシ、イミダゾリルアルコキシおよびポリエチレングリコールが含まれる。アルコキシおよびアミノアルコキシ基には一般的に低級アルキル基、特にＣ₁−Ｃ₉アルキルが含まれている。ポリエチレングリコールは（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−Ｏ−アルキルの構造である。特に好適な置換基は式（−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−Ｏ−アルキル（式中、ｎ＝１およびアルキル＝ＣＨ₃）のポリエチレングリコール置換基である。
本発明のオリゴヌクレオチドを作り上げるヌクレオシド単位にある種の修飾核酸塩基を使用することによっても結合親和性を増加させることができる。そのような修飾核酸塩基には５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれるであろう（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれている）。他の修飾ピリミジンおよびプリン塩基も核酸の相補的鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させることが期待される。
２’−置換基の使用は本発明の置換オリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる。発表されている研究（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ２’−ｄＲＩＢＯ−Ｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｌｅａｗａｔｅｒ，ＦＬ，１９９１年１月１３日）では、オリゴヌクレオチドの５つのヌクレオシド単位上に２’−フルオロ置換基を有する、１５−ｍｅｒホスホジエステルオリゴヌクレオチドの置換ヌクレオシド単位当たり、１．６℃の結合親和性の増加を報告している。オリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位の１１が２’−フルオロ置換基を有していた場合、置換ヌクレオシド単位当たり１．８℃へ結合親和性が増加した。
上記の研究において、１５−ｍｅｒホスホジエステルオリゴヌクレオチドは対応するホスホロチオエート類似体へ誘導化された。１５−ｍｅｒホスホジエステルオリゴヌクレオチドとそのホスホロチオエート類似体を比較した場合、ホスホロチオエート類似体は１５−ｍｅｒホスホジエステルオリゴヌクレオチドの結合親和性の約６６％のみの親和性しか有していなかった。別の言い方をすると、結合親和性はオリゴヌクレオチドのそのホスホロチオエート類似体への誘導化により失われた。しかしながら、２’−フルオロ置換体が１５−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの１１のヌクレオシドに位置している場合、２’−置換基の結合親和性は、１５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドのそのホスホロチオエート類似体への誘導化により示された減少をより以上に打ち負かせた。この化合物において、すなわち２’−フルオロ置換基で置換された１１のヌクレオシド単位を有する１５−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、結合親和性は置換基当たり２．５℃上昇した。この研究においては、そのオリゴヌクレオチドに相補的であるＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ Ｈ酵素的切断を惹起するであろう２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を有するヌクレオシド単位の適当な連続的配列を含ませるような試みは行われなかった。
標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ酵素的切断を惹起するため、本発明のオリゴヌクレオチドはそのなかにＤＮＡ型セグメントのセグメントまたは配列を含んでいなければならない。別の言い方をすると、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位の少なくともいくつかは２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を有していなければならない。３つ以上の連続的に連結された２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド単位を有する配列は、標的ＲＮＡと本発明のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによりＲＮａｓｅ Ｈ活性を惹起するために必須である。現在の所、本発明のオリゴヌクレオチド中に３つまたはそれ以上の連続した２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド単位の配列を有するのが好適である。少なくとも５つの連続した２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド単位の使用が特に好適である。
ＲＮａｓｅ Ｈの作用機構は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖の認識に続いてのこの二重鎖のＲＮＡ鎖の切断である。”背景技術”で示したように、本分野の他の研究者は、ＤＮＡ鎖にヌクレアーゼ安定性を与えるために修飾ＤＮＡ鎖を使用した。このことを行うのに、彼らは増加されたヌクレアーゼ安定性を与えるがハイブリダイゼーション特性を減少させる修飾リン結合を使用した。
本発明はＲＮＡ鎖の切断を認識および惹起するためにＲＮａｓｅ Ｈが直面するある種の範疇を同定した。これらの第一は切断部位でのＲＮＡ鎖は、陰性荷電を有するリン結合を通して結合されたヌクレオシド単位を有していなければならない。従って、切断部位のヌクレオシドの糖残基はβ−ペントフラノシル糖残基であらねばならず、および２’エンドコンホメーションでなければならない。この範疇に合致するヌクレオシドはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート結合で結合されている２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル β−ヌクレオシドのみである。
そのような構造単位の製造で使用するために適した核酸塩基にはアデニン、グアニン、シトシン、ウリジンおよびチミンのようなプリンおよびピリミジン、並びにキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル ウラシルおよびシトシン、６−アゾ ウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオーツ、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシンおよび７−メチルグアニンのような他の合成および天然核酸塩基が含まれる。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第３，６８７，８０８号に記載されているもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に記載されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈｅｔ．ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に記載されているものが含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも一つのヌクレオシドの２’位にメトキシエトキシ（−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃）修飾を含む。この修飾は標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の両方を増加させることが示されている。本発明のオリゴヌクレオチドは好適には約５から約５０のヌクレオシド単位からなっている。本発明の文脈において、このことは５から５０のヌクレオシド単位を有する、前に記載したような非天然のオリゴマーを包含することを理解されたい。本発明のオリゴヌクレオチドは約１５から約２５のヌクレオシド単位からなっていることがより好適である。察知されるであろうように、”ヌクレオシド単位”とはリン結合を通して隣接するサブユニットに適切に結合された核酸単位および糖の組み合わせである。用語”サブユニット”は”ヌクレオシド単位”と相互交換的に使用される。ＲＮａｓｅ Ｈ応答を惹起するためには、前に特定したように、オリゴヌクレオチドのこの総配列長内には３つより多くの（しかし好適には５またはそれ以上の）連続的に連結された２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド単位の配列が存在するがあろう。
オリゴヌクレオチド内の２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド配列の両側に別の２’−置換ペントフラノシル含有ヌクレオシド配列が位置するように、オリゴヌクレオチド中に２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド配列を組み込むのが現在のところ好適である。そのような構築において、２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド配列は”中心領域”とも称され、および２’−置換ペントフラノシル含有ヌクレオシド配列は”隣接領域”と称される。
本発明のある態様において、結合親和性増加のためのヌクレオシドの残りの各々が２’−置換基を含む場合、２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド部分配列は、２’−置換基を有するヌクレオシド単位の第一の部分配列および２’−置換基を有するヌクレオシド単位の第二の部分配列の間に位置しているであろう。２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレオシド部分配列を本発明のオリゴヌクレオチドの３’かまたは５’末端に位置させることを含む他の構築もまた可能である。
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られた技術により都合よくおよび日常的に製造されるであろう。［Ｍａｒｔｉｎ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４］。そのような合成の装置はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの売り主により販売されている。そのような合成のための他の手段を用いてもよい。オリゴヌクレオチドの実際の合成は当業者の手腕である。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを製造するために類似の技術を使用することもよく知られている。蛍光標識された、ビオチニル化されたまたは他の複合オリゴヌクレオチドを合成するために類似の技術および市販品として入手可能なビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはソラリン修飾アミダイトおよび／または制御孔ガラス（ＣＰＧ）のような修飾アミダイトおよびＣＰＧ製品を使用することもよく知られている。
本発明の化合物は診断、治療および研究試薬およびキットとして利用できる。それらは適切な医薬として受容可能な希釈剤または担体に有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを添加することにより医薬組成物で利用できる。それらはさらに、タンパク質の望まれない産生により特徴付けられる疾患を有する生物体を処置するために使用できる。生物体は、望まれないタンパク質をコードしている標的核酸の鎖と特異的にハイブリダイズできる配列を有する本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることができる。
治療組成物の処方および続いてのそれらの投与は当業者の裁量でできると信じられている。治療にためには一般に、そのような治療を必要とする患者に本発明のオリゴヌクレオチドは、通常医薬として受容可能な担体中で、患者の年齢および処置されている疾患状態の重態度に依存して体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの用量範囲で投与される。さらに、処置投与計画は患者の特定の疾患の性質、その重態度および全体的状態に依存するであろう期間続けられるであろうが、一日一度から２０年に一度まで延長してもよい。処置後、患者の状態の変化および疾患状態の徴候の軽減がモニターされる。オリゴヌクレオチドの用量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しなければ増加させ、またはもし疾患状態の徴候の軽減が観察されれば、または疾患状態が除去されていれば減少されるであろう。
いくつかの場合は、本発明のオリゴヌクレオチドと共に他の伝統的治療様式で患者を処置するのがより有効であろう。例えば、ＡＩＤＳの処置を受けている患者には、オリゴヌクレオチドと共にＡＺＴが投与されるであろうし、アテローム性動脈硬化症の患者は処置された動脈の再閉塞を防止するため、血管形成術に続いて本発明のオリゴヌクレオチドで処置されるであろう。
処置が成功した後、疾患状態の再発を防止するために患者は維持治療を受けるのが望ましく、その際オリゴヌクレオチドは一日一回またはそれ以上から２０年毎に一度まで、体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの範囲の維持用量で投与される。
本発明の医薬組成物は局所的または全身的処置が望まれるかおよび処置されるべき範囲に依存して多くの方法で投与されるであろう。投与は局所（眼、膣、直腸、鼻孔内、経皮を含む）、経口または非経口であろう。非経口投与には静脈内滴加、皮下、腹腔内または筋肉内注射または鞘内または脳室内投与が含まれる。
局所投与のための処方には経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、座剤、スプレー剤、液剤および散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましいであろう。被覆コンドーム、グローブなどもまた有用であろう。
経口投与のための組成物には粉末または顆粒、水または非水性媒質中の懸濁剤または液剤、カプセル、サッシェまたは錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましいであろう。
鞘内または脳室内投与のための組成物には無菌溶液が含まれるが、それは緩衝液、希釈剤および他の適した添加物を含んでいてもよい。
非経口投与のための処方には無菌水性溶液が含まれるが、それは緩衝液、希釈剤および他の適した添加物を含んでいてもよい。
用量は処置される疾患状態の重態度および応答性に依存しており、処置過程は数日から数カ月、または治療が達成されるまでまたは疾患状態の軽減が達成されるまで続く。至適投与計画は患者の体の薬剤蓄積の測定から計算できる。当業者は至適投与量、投与法および反復率を容易に決定できる。至適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化するであろうし、インビトロおよびインビボ動物モデルで有効であることが観察されたＥＣ₅₀に基づいて一般的には見積もることができる。一般に、投与量は体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇであり、１日１回またはそれ以上、１週間毎、１月毎または１年毎または２から２０年に１回である。
そのような治療的処置は、単細胞原核動物および真核生物体多細胞真核生物体の範囲の種々の生物体で実施できる。その遺伝、代謝または細胞機関の基本的部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−タンパク質翻訳を利用している生物体はそのような治療的および／または予防的処置に影響を受ける。明らかに、細菌、酵母、原生動物、藻類、植物および温血動物を含む高等動物のような多様な生物体がこの方法で処置できる。さらに、多細胞真核生物の細胞は各々、その細胞活性の不可欠な部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−タンパク質翻訳の両方を含むので、そのような細胞集団に対しても本治療および／または診断が実行できる。さらに、真核生物細胞の多くの細胞小器官（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体）も転写および翻訳機構を含む。単一細胞それ自体、細胞集団または細胞小器官もまた、本発明の治療または診断オリゴヌクレオチドで処置できる生物体の定義に含まれているであろう。本明細書で使用される場合、治療とは疾患状態の根絶、生物体の殺傷（例えば、細菌、原生動物または他の感染）または異常または望まれない細胞性増殖または発現の制御を含むことを意味している。
本発明の文脈において、”ハイブリダイゼーション”とは相補的核酸塩基間の水素結合形成（ワトソンークリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合形成）を意味するであろう。例えば、アデニンおよびチミンは相補的な核酸塩基であり、水素結合の形成により対を形成する。本明細書で使用される場合、”相補的”および”特異的にハイブリダイズ可能”とはヌクレオシド単位を含む二つの核酸間の配列相補性を意味しており、一つの核酸はオリゴヌクレオチドでありおよび他の核酸は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。例えば、もしオリゴヌクレオチドのある位置の核酸塩基が、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置の核酸塩基と水素結合形成ができるなら、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ分子はその位置でお互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、各々の分子の対応する位置の十分な数がお互いに水素結合できる核酸塩基により占有されている場合、お互いに相補的である。従って、”特異的にハイブリダイズ可能”および”相補的”は、オリゴヌクレオチドおよび標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子間に安定なおよび特異的結合が起きるような十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であるその標的ＤＮＡ配列と１００％相補的である必要はないことを理解されたい。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害して効用の消失を起こし、および特異的結合が望まれる条件下（すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合の生理学的条件下、またはインビトロアッセイの場合のアッセイが実行される条件下）、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。
例示の目的で、本発明の化合物がｒａｓ−ルシフェラーゼトランス活性化を使用するｒａｓ−ルシフェラーゼ融合系で使用された。１９９２年１２月２３日に公開され本出願と共通して譲渡されている国際特許公開番号ＷＯ９２／２２６５１（その全内容は本明細書において援用される）に記載されているように、ｒａｓ癌遺伝子は、細胞質膜の内部表面に極在している関連タンパク質をコードしている遺伝子ファミリーの一員である。ｒａｓタンパク質はアミノ酸レベルで高度に保存的であり、高い親和性および特異性でＧＴＰを結合し、およびＧＴＰａｓｅ活性を有することが示されている。ｒａｓ遺伝子生成物の細胞性機能は知られていないが、それらの生化学的特性、ならびにＧＴＰ結合タンパク質またはＧタンパク質として知られている信号伝達タンパク質の組との著しい配列相同性は、ｒａｓ遺伝子産物が細胞質膜を通過する細胞外信号の伝達に関連する基礎的細胞制御機能における基本的役割を果たしていることを示唆している。
Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓと称される３つのｒａｓ遺伝子が哺乳類ゲノムで同定されている。哺乳類ｒａｓ遺伝子はそのコード配列内に単一点突然変異により形質転換誘導特性を獲得している。天然に存在するｒａｓ癌遺伝子中の突然変異はコドン１２、１３および６１に局在している。ヒト腫瘍中に観察される最も普通に検出された活性化ｒａｓ突然変異はＨ−ｒａｓ遺伝子のコドン−１２にあり、ＧＧＣからのＧＴＣへの塩基変化はｒａｓタンパク質生成物のＧＴＰａｓｅ制御ドメインのグリシンからバリンへの置換を生じる。この単一のアミノ酸変化はｒａｓタンパク質機能の正常な制御を破壊し、それにより正常では制御されている細胞タンパク質を連続的に活性にするように変換すると考えられている。そのような正常なｒａｓタンパク質機能の脱制御は正常増殖から悪性増殖への形質転換の原因となると信じられている。
本発明のオリゴヌクレオチドは、異常細胞増殖および腫瘍形成に暗示されてきた活性型に時折変換される天然に存在する細胞性遺伝子であるｒａｆ遺伝子の発現の調節にも使用された。
本発明のオリゴヌクレオチドはまたプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に関連する核酸とも特異的にハイブリダイズ可能である。これらのオリゴヌクレオチドはＰＫＣ発現を調節することが観察された。
以下の実施例および方法は本発明を例示するものであり、これらに制限することを意図しているわけではない。
実施例１
オリゴヌクレオチド合成
非置換および置換オリゴヌクレオチドはヨウ素酸化による標準ホスホロアミダイト化学を用いる自動化ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）で合成された。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対しては、亜リン酸結合の段階的チオ化のために標準酸化ボトルは３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液に置き換えられた。チオ化待ち工程は６８秒に伸ばされ、続いてキャップ化工程が行われた。ＣＰＧカラムから切断後、５５℃にて濃水酸化アンモニウム中で脱保護され（１８時間）、オリゴヌクレオチドは０．５ＭＮａＣｌ溶液から２．５容量のエタノールで２度沈澱させることにより精製された。分析ゲル電気泳動は２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５４ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で行われた。オリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートはポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づいて、８０％以上の完全長物質であると判断された。
実施例２
中心２’−デオキシホスホロチオエート領域に隣接する２’−置換領域を有するオリゴヌクレオチド
配列５’ＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧ ３’（配列ＩＤ番号：２８）の１５−ｍｅｒ ＲＮＡ標的はＲＮＡプロトコールを用いてＤＮＡシークエンサー上、通常の様式で製造された。２’−デオキシ領域に隣接する領域に２’−置換ヌクレオシド単位を有する一連の相補的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは既知の文献の方法により、または１９９２年３月５日に公開された国際特許出願番号ＷＯ９２／０３５６８の方法により合成された２’−置換ヌクレオシド前駆体（即ち、２’−Ｏ−メチル）を利用して合成された。２’−置換ヌクレオシドはＤＮＡシンセサイザー上、通常の様式で５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ホスホロアミダイトとして加えられた。相補的オリゴヌクレオチドは５’ＣＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＣＧ Ｃ ３’（配列ＩＤ番号：２９）を有する。２’−置換基はこれらのオリゴヌクレオチドのＣＧＣおよびＣＧ領域に位置された。以下の２’−Ｏ−置換基が使用された；２’−フルオロ；２’−Ｏ−メチル；２’−Ｏ−プロピル；２’−Ｏ−アリル；２’−Ｏ−アミノプロポキシ；２’−Ｏ−（メチキシエトキシエチル）；２’−Ｏ−イミダゾールブトキシおよび２’−Ｏ−イミダゾールプロポキシ。
実施例３
ｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子組立
本研究で記載されているＲａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子はＰＣＲ技術を使用して組み立てられた。突然変異体（コドン−１２）および非突然変異体（野生型）ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子両方のエキソンの５’−領域のＰＣＲクローニングのためのプライマーとして使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーが合成された。Ｈ−ｒａｓ鋳型はＢｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ番号４１０００および４１００１）から購入された。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー＃＃５’−ＡＣＡ−ＴＴＡ−ＴＧＣ−ＴＡＧ−ＣＴＴ−ＴＴＴ−ＧＡＧ−ＴＡＡ−ＡＣＴ−ＴＧＴ−ＧＧＧ−ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＧＡＣ−ＣＣＴ−ＧＴ−３’（センス）（配列ＩＤ番号：１５）および５’−ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＴＧＡ−ＡＧＣ−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＡＴＧ−ＧＴＣ−ＡＧＣ−ＧＣ−３’（アンチセンス）（配列ＩＤ番号：１６）が鋳型として突然変異体および非突然変異体Ｈ−ｒａｓ遺伝子を用いる標準ＰＣＲ反応に使用された。これらのプライマーはＮｈｅＩおよびＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接する正常および突然変異体Ｈ−ｒａｓの−５３から＋６５（翻訳開始部位に関して）の配列に対応する１４５塩基対のＤＮＡ産物を生成することが期待される。ＰＣＲ生成物は標準法を用いてゲルで精製し、沈澱させ、洗浄して水に再懸濁した。
Ｐ．ピラリス（ホタル）ルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのためのＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ生成物が完全長ルシフェラーゼタンパク質（ただしアミノ末端メチオニン残基を除いて、それは二つのアミノ酸、アミノ末端のリジン残基に続くロイシン残基により置換されているであろう）をコードするように設計されていた。ルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのために使用されたオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、５’−ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＴＧＡ−ＡＧＣ−ＴＴＧ−ＡＡＧ−ＡＣＧ−ＣＣＡ−ＡＡＡ−ＡＣＡ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’（センス）（配列ＩＤ番号：１７）および５’−ＡＣＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＧＣＧ−ＣＧＣ−ＣＧＡ−ＴＡＣ−ＣＧＴ−ＣＧＡ−ＣＣＴ−ＣＧＡ−３’（アンチセンス）（配列ＩＤ番号：１８）であり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む市販品として入手可能なプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌｕｃ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する標準ＰＣＲ反応で鋳型として使用された。これらのプライマーはＨｉｎｄIIIおよびＢｓｓＨII制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接するルシフェラーゼ遺伝子に対応する約１．９ｋｂの生成物が得られると期待された。この断片は標準法を用いてゲルで精製し、沈澱させ、洗浄して水に再懸濁した。
ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の組立を完成させるため、ｒａｓおよびルシフェラーゼＰＣＲ生成物は適当な制限エンドヌクレアーゼで消化され、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIIIおよびＢｓｓＨIIを使用してステロイド誘導可能マウス乳癌ウイルスプロモーターＭＭＴＶを含む発現ベクター内へ３部分結合によりクローン化された。生じたクローンではホタルルシフェラーゼ遺伝子の読み枠に融合したＨ−ｒａｓ ５’配列（−５３から＋６５）が挿入されている。得られた発現ベクターは、ステロイド誘導可能ＭＭＴＶプロモーターの制御下で発現されるｒａｓ−ルシフェラーゼ融合生成物をコードしている。
実施例４
プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション
トランスフェクションは以下の条件下、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ．ａｌ．，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に記載されているように実行された：ヒーラー細胞は６０ｍｍ皿に５ｘ１０⁵細胞／皿で播種された。総量で１０μｇのＤＮＡが各々の皿に加えられ、その９μｇはｒａｓ−ルシフェラーゼレポータープラスミドであり、および１μｇは構成性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの制御下でラットグルココルチコイドレセプターを発現するベクターであった。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱物は、３ｍＭ ＥＧＴＡを含むトリス緩衝液［５０ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で洗浄することにより１６−２０時間後に除去された。続いて１０％ウシ胎児血清を補給した新鮮な培地を細胞に加えた。この時点で、デキサメタソンによるレポーター遺伝子発現の活性化に先立ち、細胞はアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理された。
実施例５
細胞のオリゴヌクレオチド処理
プラスミドトランスフェクション直後に、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で３回洗浄し、前もって３７℃に温められた。１０μｇ／ｍＬ Ｎ−［１−（２，３−ジオェイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む２ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭを各々の皿に加え、およびオリゴヌクレオチドが直接的に加えて、３７℃で４時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭは続いて除去され、オリゴヌクレオチドを含む適当な細胞増殖培地で置き換えられた。この時点で、０．２μＭの最終濃度のデキサメタソンで細胞を処理することによりレポーター遺伝子発現が活性化された。ステロイド処理して１０−１６時間後に細胞は採取された。
実施例６
ルシフェラーゼアッセイ
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）により記載されているように、界面活性剤トリトンＸ−１００での細胞溶解により、細胞からルシフェラーゼが抽出された。Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ１０００ルミノメーターが６２５μＭのルシフェリン（Ｓｉｇｍａ）の添加によるルミネッセンスのピークの測定に使用された。各々の抽出物に対し、アッセイの直線範囲にデータが集まることを確実にするため、異なった量の抽出物を使用してルシフェラーゼアッセイが複数回実施された。
実施例７
ｒａｓ−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害
活性化Ｈ−ｒａｓのコドン−１２点突然変異を標的とした一連のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが上記のｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを用いて試験された。この一連のものには基本的配列および基本的配列の類似体が含まれている。基本的配列は前記の国際特許出願番号ＷＯ９２／２２６５１に報告されているような既知の活性を有する。基本的配列およびその類似体の両方とも、ヌクレオシド単位はヌクレアーゼ耐性を提供するためにホスホロチオエート結合が組み込まれている。類似体の各々には２’−Ｏ−メチル置換基および２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基を含むヌクレオシド単位が組み込まれている。類似体において、２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖含有サブユニットの部分配列は両方の末端に２’−Ｏ−メチル置換サブユニットの部分配列が隣接している。類似体は２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖含有ヌクレオシド配列の長さの点においてお互いに異なっている。２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシド部分配列は、活性化ｒａｓのコドン−１２点突然変異の点突然変異を中心にするように置かれている。
オリゴヌクレオチド配列、配列参照番号および配列ＩＤ番号（すべてホスホロチオエート類似体である）が表１に示されている。この表において、”^M”で同定されるヌクレオシドは２’−Ｏ−メチル置換基を含み、”_d”で同定されるヌクレオシドは２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシドである。

図１は細胞が表１のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処理された場合の用量応答データを示している。オリゴヌクレオチド２５７０は突然変異体（活性化）Ｈ−ｒａｓ ＲＮＡのコドン−１２点突然変異を標的にしている。他のヌクレオシドは結合親和性を増加させるために２’−Ｏ−メチル置換基を有しており、空間を置かれた２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシドの種々の長さの部分を有する。対照オリゴヌクレオチドはランダム２０−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。結果は、オリゴヌクレオチドで処理されていないトランスフェクト細胞のルシフェラーゼ活性のパーセントとして表現されている。図が示しているように、オリゴヌクレオチド２５７０の濃度を増加させて細胞を処理すると、ｒａｓ−ルシフェラーゼの突然変異型を発現している細胞中のｒａｓ−ルシフェラーゼ活性を用量依存的に阻害した。オリゴヌクレオチド２５７０は通常型と比較した場合、ｒａｓ−ルシフェラーゼの突然変異型に対して約３倍の選択性を示した。
図１からさらに解るように、オリゴヌクレオチド３９８０、３９８５および３９８４の各々はオリゴヌクレオチド２５７０が行ったよりも大きなｒａｓ−ルシフェラーゼ活性の阻害を示した。２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシドの７−ｍｅｒ配列を有するオリゴヌクレオチド３９８５が最大の阻害を示した。２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシド単位の５−ｍｅｒ配列を有するオリゴヌクレオチド３９８０が次に大きな阻害を示し、２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシド単位の９−ｍｅｒ配列を有するオリゴヌクレオチド３９８４が続いている。
図２は図１と同様の結果を示しているが、棒グラフの形である。図２でさらにわかるのは、オリゴヌクレオチド３９７５およびオリゴヌクレオチド３９７９の活性である。これらのオリゴヌクレオチドは各々１および３ヌクレオシドの長さの２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシド単位の部分配列を有する。図２から明らかなように、これらのオリゴヌクレオチドは有意な活性を示さなかった。３−ｍｅｒデオキシ部分配列を有するオリゴヌクレオチド３９７９では最も高い濃度量で測定可能な活性が観察された。
オリゴヌクレオチド２５７０と比較してオリゴヌクレオチド３９８０、３９８５および３９８４の活性の増加は、化合物上に位置する２’−Ｏ−メチル置換基によりこれらの化合物に与えられた結合親和性の増加、およびヌクレオシドの主配列内への２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシド配列の取り込みによりこれらの化合物に与えられたＲＮａｓｅ Ｈ活性化が寄与している。本発明の活性化合物と対照的に、本発明の活性オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート結合の代わりにホスホジエステル結合を有する、活性オリゴヌクレオチド２５７０、３９８０、３９８５および３９８４と同一の配列が活性を示さなかったことは興味を引かれる。このことは、ホスホジエステル化合物はヌクレアーゼ（ホスホジエステル化合物を分解する）の基質であるため、それらのＲＮａｓｅＨ活性化の可能性が妨害されるためである。
他の糖修飾：キメラオリゴヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル置換基以外の他の２’糖修飾の効果が試験された。これらの修飾は、７−ｍｅｒデオキシ部分配列（または７−ｍｅｒデオキシギャップ）に隣接した、２’−修飾ヌクレオシドを有する１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドが実施例８に記載したような２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチド補体とハイブリダイズされた場合に得られたＴ_m値と共に表２に掲げられている。これらのオリゴヌクレオチドにおいて、２’位のアルキル長とＴ_mの間に相関が観察された。アルキル長が増加するにつれてＴ_mが減少した。２’−フルオロ キメラオリゴヌクレオチドは一連のものの中で最も高いＴ_mを示した。

これらの２’修飾オリゴヌクレオチドは、実施例９に記載されたトランス活性化レポーター遺伝子アッセイを用いてＨ−ｒａｓに対するアンチセンス活性が試験された。これら２’修飾キメラ化合物のすべてがｒａｓ発現を阻害し、２’−フルオロ ７−ｍｅｒギャップ付化合物が最も活性であった。５−ｍｅｒ中心デオキシギャップを有する２’−フルオロ キメラオリゴヌクレオチドもまた活性であった。
５−ｍｅｒまたは７−ｍｅｒデオキシ部分配列が隣接する２’−Ｏ−プロピル部分配列を有する配列ＩＤ番号：１のキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル キメラオリゴヌクレオチドと比較された。Ｔ２４細胞でのｒａｓ発現は７−ｍｅｒデオキシギャップおよび均一のホスホロチオエート主鎖を有する２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドの両方で阻害された。デオキシギャップを５ヌクレオシドに減少させた場合は、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのみがｒａｓ発現を阻害した。
癌細胞におけるＨ−ｒａｓ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害：
ｒａｓ ＡＵＧ領域に相補的な二つのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（２５０２、２５０３）、ならびに同一の配列および２’−Ｏ−メチル部分配列が隣接した７−ｍｅｒデオキシ部分配列を有するキメラオリゴヌクレオチド（４９９８、５１２２）が実施例１０に記載したように試験された。これらのキメラオリゴヌクレオチドは表３に示されている。

化合物２５０３はＴ２４細胞においてｒａｓ発現を７１％阻害し、キメラ化合物（４９９８）はｒａｓ ｍＲＮＡをいくぶん強く阻害した（８４％阻害）。化合物２５０２（これもまたＡＵＧ領域に相補的）はｒａｓ ＲＮＡレベルを２６％減少させ、このオリゴヌクレオチドのキメラ体（５１２２）は１５％阻害を示した。またこのアッセイには突然変異体コドン−１２を標的とする二つのオリゴヌクレオチドも含まれていた。化合物２５７０（配列ＩＤ番号：１）はｒａｓ ＲＮＡを８２％減少させ、７−ｍｅｒデオキシ部分配列を有するこのオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル キメラ体（３９８５）はｒａｓ ＲＮＡを９５％減少させた。
オリゴヌクレオチド２５７０および２５０３はまた野生型（即ち、活性化されていない）Ｈ−ｒａｓコドン−１２を有するヒーラー細胞におけるｒａｓ発現に対するそれらの効果を決定するために試験された。Ｔ２４細胞（活性化コドン−１２を有する）においてはこれらのオリゴヌクレオチドの両方がｒａｓ発現を阻害したが、ヒーラー細胞においてはｒａｓ ＡＵＧと特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド（２５０３）のみがｒａｓ発現を阻害した。活性化されたコドン−１２と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド２５７０（配列ＩＤ番号：１）はヒーラー細胞においてｒａｓ発現を阻害しなかった（なぜなら、これらの細胞では活性化されたコドン−１２標的が欠けている）。
活性化Ｈ−ｒａｓのコドン−１２と相補的な１７−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド２５７０、ならびに２５７０と同一の配列であるが、各々５、７および９ヌクレオシド単位のデオキシ部分配列を有するキメラホスホロチオエート２’−Ｏ−メチル置換オリゴヌクレオチド３９８０、３９８５および３９８４（表１に示されている）のＴ２４細胞におけるｒａｓ発現の阻害が試験された（実施例８に記載されているように）。均一の２’−デオキシオリゴヌクレオチド２５７０および３つのキメラオリゴヌクレオチドはＴ２４細胞においてｒａｓ ｍＲＮＡレベルを減少させた。化合物３９８５−（７−ｍｅｒデオキシギャップ）および３９８４（９−ｍｅｒデオキシギャップ）はｒａｓ ｍＲＮＡを８１％減少させ；化合物３９８０（５−ｍｅｒデオキシギャップ）はｒａｓ ｍＲＮＡを６１％減少させた。この配列であるが、５−ｍｅｒデオキシ（４６８９）または７−ｍｅｒデオキシ（４６９０）が隣接する２’−フルオロ置換ヌクレオシドを有するキメラオリゴヌクレオチドはＴ２４細胞においてｒａｓ ｍＲＮＡ発現を阻害し、５−ｍｅｒデオキシ部分配列を有する２’−フルオロキメラの６３％阻害に対し、７−ｍｅｒデオキシ部分配列を有するものがより好適な阻害（８２％）であった。
癌細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害：活性化ｒａｓのコドン−１２に相補的な同一の配列を有する（配列ＩＤ番号：１）３つの１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの、実施例１１に記載されたようなＴ２４癌細胞増殖に対する効果が試験された。オリゴヌクレオチド３９８５は２’−Ｏ−メチル置換ヌクレオシドが隣接する７−ｍｅｒデオキシ部分配列を有する均一なホスホロチオエートであり、４６９０は２’−Ｏ−フルオロ置換ヌクレオシドが隣接する７−ｍｅｒデオキシ部分配列（ギャップ）を有する均一なホスホロチオエートである（Ｃ^FＣ^FＡ^F Ｃ^FＡ^FＣ_d Ｃ_dＧ_dＡ_d Ｃ_dＧ_dＧ_d Ｃ^FＧ^FＣ^F Ｃ^FＣ^F、配列ＩＤ番号：１、”^F”で同定されるヌクレオシドは２’−フルオロ置換基を含み、”_d”で同定されるヌクレオシドは２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオシドである）。癌細胞増殖に対するこれらのオリゴヌクレオチドの影響はノーザンブロット分析により示されたｒａｓ ｍＲＮＡ発現に対するそれらの影響とよく相関した：オリゴヌクレオチド２５７０は細胞増殖を６１％阻害し、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチド３９８５は細胞増殖を８２％阻害し、２’−フルオロキメラ類似体は細胞増殖を９３％阻害した。
細胞増殖に対するこれらのオリゴヌクレオチドの用量−応答研究において、阻害は２５μＭから１００μＭの範囲において用量−依存であることが示された。４４ｎＭ、６１ｎＭおよび９８ｎＭのＩＣ₅₀値を各々オリゴヌクレオチド４６９０、３９８５および２５７０に割り当てることができた。ランダムオリゴヌクレオチド対照は試験された用量では影響を与えなかった。
細胞増殖に対するＩＳＩＳ２５７０の効果は細胞型特異的であった。このオリゴヌクレオチドによるＴ２４細胞増殖の阻害は、同一のオリゴヌクレオチドによるヒーラー細胞の阻害よりも４倍強烈であった（１００ｎＭオリゴヌクレオチド濃度）。ＩＳＩＳ２５７０は、Ｔ２４には存在するが、野生型コドン−１２を有するヒーラー細胞には欠けている活性化（突然変異体）ｒａｓコドン−１２を標的にしている。
キメラ主鎖修飾オリゴヌクレオチド：前の実施例で議論されたオリゴヌクレオチドは均一のホスホロチオエート主鎖を有していた。前に議論した２’修飾キメラオリゴヌクレオチドは均一のホスホジエステル主鎖では活性でない。５−ｍｅｒデオキシギャップに隣接した２’−Ｏ−メチル置換領域を有し、ギャップ領域がＰ＝Ｓ結合を有し、および隣接領域がＰ＝Ｏ結合を有するキメラオリゴヌクレオチドが合成された（ＩＳＩＳ４２２６）。Ｐ＝Ｏ主鎖をギャップにおよびＰ＝Ｓを隣接領域に有する別のキメラオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ４２２３）もまた作製された。これらのオリゴヌクレオチドは表４に示されている。
均一の２’−デオキシヌクレオシド単位を有するオリゴヌクレオチドもまた合成された。これらのオリゴヌクレオチドは分子の中心領域が１つのホスホジエステル結合（ＩＳＩＳ４２４８）、２つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４５４６）、３つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４５５１）または１０のホスホジエステル結合（ＩＳＩＳ４２４１）のホスホロチオエート結合を有する。これらのオリゴヌクレオチドもまた表４に示されている。

Ｄｉｇｎａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８３，１１，１４７５−１４８９に記載されているように、ヌクレアーゼ分解への感受性を決定するため、オリゴヌクレオチドは粗ヒーラー細胞抽出物中、３７℃でインキュベートされた。５−ｍｅｒホスホジエステル中心領域およびホスホロチオエート／２’−Ｏ−メチル置換隣接領域を有するオリゴヌクレオチド（４２３３）は７時間のＴ_1/2を有していた。５−ｍｅｒホスホロチオエート中心領域およびホスホロチオエート／２’−Ｏ−メチル置換隣接領域を有するオリゴヌクレオチドは３０時間のＴ_1/2を有していた。１から１０のホスホジエステル ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドの組において、１つのホスホジエステル結合のオリゴヌクレオチド（４２４８）は均一のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ２５７０が安定だったようにヌクレアーゼに対して安定であり、ヒーラー細胞抽出物中で５時間後も何の分解も示さなかった。２−ｍｅｒ、３−ｍｅｒおよび４−ｍｅｒホスホジエステル中心領域を有するオリゴヌクレオチドは各々約５．５時間、３．７５時間および３．２時間のＴ_1/2を有しており、５−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒホスホジエステル中心領域を有するオリゴヌクレオチドは各々１．７５時間および０．９時間のＴ_1/2を有していた。
キメラ主鎖修飾オリゴヌクレオチドのアンチセンス活性：均一のホスホロチオエート主鎖はアンチセンス活性には必要とされない。ＩＳＩＳ４２２６およびＩＳＩＳ４２３３が、ＩＳＩＳ２５７０（均一のホスホロチオエート／均一のデオキシ）、ＩＳＩＳ３９８０（均一のホスホロチオエート、デオキシ中心領域を有する２’−Ｏ−隣接領域）およびＩＳＩＳ３９６１（均一ホスホジエステル、デオキシ中心領域を有する２’−Ｏ−隣接領域）と共にｒａｓ発現に対する効果についてｒａｓ−ルシフェラーゼ系で試験された。Ｐ＝Ｓ（すなわち、ヌクレアーゼ耐性）中心領域を有するすべてのオリゴヌクレオチドがｒａｓ発現を阻害した。分子の中心に１つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４２４８）かまたは１０のホスホジエステル結合（ＩＳＩＳ４２４１）を含むホスホロチオエート結合を有する２つの均一の２’−デオキシオリゴヌクレオチドの活性も試験された。１つのＰ＝Ｏを含むオリゴヌクレオチドはすべてにホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチド（均一のＰ＝Ｓオリゴヌクレオチド）とちょうど同じように活性であったが、１０のＰ＝Ｏ結合を含む同じオリゴヌクレオチドは完全に不活性であった。
７−ｍｅｒデオキシ中心領域（ギャップ）にホスホロチオエート主鎖を有し、および隣接領域にホスホジエステル結合を有する（それらは２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−プロピル置換されている）配列ＩＤ番号：１のキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが作製された。２’−Ｏ−プロピル置換ホスホジエステル隣接領域を有するオリゴヌクレオチドはｒａｓ発現を阻害することができた。
実施例８
融解曲線
温度に対する吸収曲線がＩＢＭ ＰＣコンピューターおよびＧｉｌｆｏｒｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＩＩ分光光度計と接続したＧｉｌｆｏｒｄ ２６０分光光度計を用いて２６０ｎｍで測定された。緩衝液は１００ｍＭ Ｎａ⁺、１０ｍＭリン酸および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた（ｐＨ７）。オリゴヌクレオチド濃度は４μＭであり、各々の鎖は８５℃での吸光度およびＰｕｇｌｉｓｉおよびＴｉｎｏｃｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８９，１８０，３０４−３２５に従って計算された吸光係数から決定された。Ｔ_m、二重鎖形成の自由エネルギーおよび会合定数はデータを直線勾配ベースラインを有する二状態モデルへ適合させることにより得られた。Ｐｅｔｅｒｓｈｅｉｍ，Ｍ．およびＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８３，２２，２５６−２６３。報告されているパラメーターは少なくとも３回の実験の平均である。いくつかのオリゴヌクレオチドについては、ｌｏｇ₁₀（濃度）に対するＴ_m ^-1のプロットから二重鎖形成の自由エネルギーも得られた。Ｂｏｒｅｒ，Ｐ．Ｎ．，Ｄｅｎｇｌｅｒ，Ｂ．，Ｔｉｎｏｃｏ，Ｉ．，Ｊｒ．，ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７４，８６，８４３ − ８５３。
実施例９
ｒａｓトランス活性化レポーター遺伝子システム
構成性ＳＶ４０プロモーター制御下にある活性化（コドン−１２、ＧＧＣ→ＧＴＣ）Ｈ−ｒａｓ ｃＤＮＡ挿入物を含む発現プラスミドｐＳＶ２−ｏｌｉはＢｒｕｎｏ Ｔｏｃｑｕｅ博士（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｓａｎｔｅ，Ｖｉｔｒｙ，Ｆｒａｎｃｅ）から贈与された。このプラスミドは、ステロイド誘導可能マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターの制御下にあるＨ−ｒａｓ発現プラスミドを構築するための（ＰＣＲによる）鋳型として使用された。Ｈ−ｒａｓコード配列を得るために、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の５７０ｂｐコード領域がＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲプライマーは、クローニングを容易にするためそれらの５’−領城中に特有のエンドヌクレアーゼ部位を有するように設計された。Ｈ−ｒａｓコドン−１２突然変異体癌遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ生成物はゲルで精製され、消化され、クローニングに先だってもう一度精製された。この構築は、挿入物を発現プラスミドｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）内へクローニングすることにより完成した。
ｒａｓ応答性レポーター遺伝子ｐＲＤＯ５３がｒａｓ発現を検出するために使用された。Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９０，８７，３８６６−３８７０。
実施例１０
インビボでのｒａｓ発現のノーザンブロット分析
ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）から入手した。細胞は１０％熱不活性化ウシ胎児血清および各々５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシンを補給した、Ｌ−グルタミンを含むマッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）中で増殖させた。細胞は１００ｍｍプレートに播種した。それらが７０％コンフルエントに達した時、オリゴヌクレオチドで処理した。プレートは１０ｍＬの前もって温めたＰＢＳおよび２．５μＬのＤＯＴＭＡを含む５ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ還元血清培地で洗浄した。続いてオリゴヌクレオチドを所望の濃度まで加えた。処置して４時間後、培地をマッコイ培地に置き換えた。オリゴヌクレオチド処置４８時間後に細胞を集め、ＲＮＡは標準ＣｓＣｌ精製法を用いて単離した。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ’，ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ。
ヒト上皮様癌腫細胞株ヒーラー２２９はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した。ヒーラー細胞は１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍＬペニシリンを補給したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、６−ウェルプレート上に単層で維持された。オリゴヌクレオチドによる処理およびＲＮＡの単離は本質的にＴ２４細胞で説明した通りである。
ノーザンハイブリダイゼーション：各々のＲＮＡの１０μｇを１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、常法を用いてＧｅｎｅＢｉｎｄ ４５ナイロン膜（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ一夜移動させた。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ’，ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ。ＲＮＡは膜へＵＶ−架橋させた。二本鎖³²Ｐ標識プローブはＰｒｉｍｅ ａ Ｇｅｎｅ標識キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて合成された。ｒａｓプローブはコドン−１２にＧＧＣからＧＴＣへの突然変異を有する活性化（突然変異体）Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンのＳａｌＩ−ＮｈｅＩ断片であった。対照プローブはＧ３ＰＤＨであった。ブロットは６８℃で１５分間ＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で前もってハイブリダイズされた。１００μＬの１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡと混合した熱変性放射活性プローブ（２．５ｘ１０⁶カウント／２ｍＬハイブリダイゼーション溶液）を加え、膜は６８℃で１時間、膜をハイブリダイズさせた。ブロットは２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温にて１５分で二度、および０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６０℃にて３０分の一度の洗浄を行った。ブロットはオートラジオグラフィーを行い、信号の強度はＩｍａｇｅＱｕａｎｔホスホロイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した。ノーザンブロットは最初にｒａｓプローブとハイブリダイズさせ、続いて０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分煮沸することにより剥ぎ取り、正しい試料の負荷を検査するために対照Ｇ３ＰＤＨプローブと再ハイブリダイズされた。
実施例１１
癌細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害
細胞は本質的には実施例１０で説明したように培養およびオリゴヌクレオチドで処理された。細胞は６０ｍｍプレートに播種され、７０％コンフルエントに達した時、ＤＯＴＭＡ存在下でオリゴヌクレオチドにより処理された。時間経過実験：１日目、細胞は１００ｎＭの最終濃度のオリゴヌクレオチドで一度処理された。３日目に増殖培地が一度交換され、計数チャンバーを使用して細胞は５日に渡って毎日計数された。用量−応答実験：種々の濃度のオリゴヌクレオチド（１０、２５、５０、１００または２５０μＭ）が細胞に加えられ、細胞は３日後に採取され計数された。オリゴヌクレオチド２５７０、３９８５および４６９０のＴ２４癌細胞増殖に対する効果が試験された。
実施例１２
キメラ（デオキシギャップ付）２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドによるＰＫＣ−α ｍＲＮＡ発現の阻害
配列ＩＤ番号：４を有するオリゴヌクレオチドは、デオキシ中心領域または２’−Ｏ−メチル置換部分配列が隣接する種々の長さのデオキシギャップを有する均一のホスホロチオエートキメラオリゴヌクレオチドとして合成された。これらのオリゴヌクレオチド（５００ｎＭ濃度）はノーザンブロット分析によりＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対する効果が試験された。８ヌクレオシドまたはそれ以上のデオキシギャップがすべての場合においてＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベル（両方の転写体）の最大の減少を与えた。これらのオリゴヌクレオチドはＰＣＫ−α ｍＲＮＡを減少させ、４ヌクレオシドのデオキシギャップ長では約８３％、および６またはそれ以上のヌクレオシドのデオキシギャップではＰＣＫ−α ｍＲＮＡのほとんど完全な減少を与えた。
４−ｍｅｒまたは６−ｍｅｒデオキシギャップを有する２’−Ｏ−メチル置換キメラオリゴヌクレオチドはＰＫＣ−α ｍＲＮＡの減少に対し、均一デオキシオリゴヌクレオチド（すべて均一のホスホロチオエートである）が行うように２００ｎＭから２５０ｎＭのＩＣ₅₀（ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを５０％減少を与えるのに必要とされるオリゴヌクレオチドの濃度）を有する。８−ｍｅｒデオキシギャップを有する２’−Ｏ−メチル置換キメラオリゴヌクレオチドは約８５ｎＭのＩＣ₅₀を有していた。
このキメラオリゴヌクレオチドのいくつかの変異体（配列ＩＤ番号：４）のＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを低くする能力が比較された。これらのオリゴヌクレオチドは表５に示されている。

ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対するこれらのオリゴヌクレオチドの効果は図３に示されている。オリゴヌクレオチド７００８、３５２２および５３５２はＰＫＣ−α ｍＲＮＡの減少を示し、５３５２が最も活性であった。
配列ＩＤ番号：４を有する一連の２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドが合成された。これらのオリゴヌクレオチドは表６に示されている。

これらの２’−Ｏ−プロピル置換キメラオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル置換キメラオリゴヌクレオチドと比較された。オリゴヌクレオチド７２７３および７２９４はＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを下げることで対応する２’−Ｏ−メチル相当物よりも活性であった。このことは図４および５に示されている。
実施例１３
ＰＫＣ−α ｍＲＮＡ発現アンチセンス減少させる別のオリゴヌクレオチド
ヒトＰＫＣ−α非翻訳領域を標的とする別のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが設計されおよび合成された。

オリゴヌクレオチド６６３２、６６５３、７０８２および７０８３はＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを下げることで最も活性であった。
実施例１４
ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対する配列ＩＤ番号：３０を有するオリゴヌクレオチドの効果
Ａ５４９細胞は陽イオン性脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ存在下、５００ｎＭのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで４時間処理され、洗浄し、さらに２０時間放置して回復させた。全ＲＮＡが抽出され、各々の２０μｇが１．２％ゲルで分離され、ナイロン膜へ移された。これらのブロットは³²Ｐ放射性標識ＰＫＣ−α ｃＤＮＡプローブで探索され、続いて取り出され、等しいＲＮＡ負荷を確認するため放射性標識Ｇ３ＰＤＨプローブで再探索された。各々のオリゴヌクレオチド［３５２０（配列ＩＤ番号：３１）、３５２１（配列ＩＤ番号：３０）、３５２２（配列ＩＤ番号：４）および３５２７（配列ＩＤ番号：３２）］は二重に試験された。二つの主ＰＫＣ−α転写体（８．５ｋｂおよび４．０ｋｂ）が試験されＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）で定量された。ＩＳＩＳ３５２１（配列ＩＤ番号：３０）はより小さい転写体の約８０％の減少およびより大きな転写体の９０％を超える減少を与えた。
配列ＩＤ番号：３０および２’−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃修飾を含むヌクレオシドが各々の端に隣接する８−ｍｅｒデオキシ中心領域を有する二つのオリゴヌクレオチドが合成された。合成を容易にするため、最後のヌクレオシドはデオキシヌクレオシドであった。表８に示されたこれらの化合物は異なっており、その一つＩＳＩＳ９６０６は均一なホスホロチオエート主鎖を有し、他のもの（ＩＳＩＳ９６０６）は中心領域にホスホロチオエート主鎖（主鎖結合７−１４）および隣接領域にホスホジエステル主鎖を有する。これらの化合物はＡ５４９細胞におけるＰＫＣ−α ｍＲＮＡ発現の阻害能力が試験され、ホスホロチオエート化合物、ＩＳＩＳ３５２１と比較された。結果は図６ａおよび６ｂに示されている。３つの化合物に対してＩＣ₅₀（５０％阻害が得られるオリゴヌクレオチド濃度）が計算された。ホスホロチオエート化合物、ＩＳＩＳ３５２１は約１７０ｎＭのＩＣ₅₀を示した。ＩＳＩＳ９６０５および９６０６の両方のメトキシエトキシ化合物とも約２５ｎＭのＩＣ₅₀を示した。メトキシエトキシ修飾によるこの６から７倍の能力の増加は驚くような活性のしるしである。それらの非常に低いＩＣ₅₀のため、メトキシエトキシ化合物９６０５および９６０６は好適である。

実施例１５
ヌードマウスにおけるヒトＣｏｌｏ−２０５結腸腫瘍増殖に対する２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２７２３の効果
ヌードマウスにおける皮下ヒトＣｏｌｏ−２０５結腸癌腫異種移植片は５ｘ１０⁶Ｃｏｌｏ−２０５細胞を皮下に注射することにより確立された。２’−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃修飾を含む６−ｍｅｒ部分配列が両端に隣接した８−ｍｅｒデオキシ中心領域、中心領域（主鎖結合７−１４）にホスホロチオエート主鎖および隣接領域にホスホジエステル主鎖を有するオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１２７２３（配列ＩＤ番号：３０）、または均一なデオキシホスホロチオエート、ＩＳＩＳ３５２１（配列ＩＤ番号：３０）を１日１回０．００６、０．０６、０．６または６．０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与してマウスが処理された。この研究において、ＩＳＩＳ１２７２３は塩溶液プラセボ対照と比較して９５％を超える腫瘍増殖の阻害を示した（図７ａ）。従って、メトキシエトキシ化合物、ＩＳＩＳ１２７２３は好適である。
実施例１６
キメラオリゴヌクレオチドによるｃ−ｒａｆ発現の阻害
配列ＩＤ番号：７を有するキメラオリゴヌクレオチドがＧｅｎｂａｎｋ ｃ−ｒａｆ配列ＨＵＭＲＡＦＲ（Ｇｅｎｂａｎｋリストｘ０３４８４）を使用して設計され、合成され、およびノーザンブロットアッセイを使用してＴ２４膀胱癌腫細胞におけるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現の阻害が試験された。これらのキメラオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドの２つの領域が隣接した６、８または１０デオキシヌクレオシドの中心”ギャップ”領域を有しており、表９に示されている。主鎖は均一なホスホロチオエートであった。実施例２０に記載したようなノーザンブロット分析において、これらのオリゴヌクレオチド３つすべて（ＩＳＩＳ６７２０、６−ｍｅｒデオキシギャップ；ＩＳＩＳ６７１７、８−ｍｅｒデオキシギャップ；ＩＳＩＳ６７２９、１０−ｍｅｒデオキシギャップ）がＴ２４細胞において７０％を超えるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現の阻害を示した。これらのオリゴヌクレオチドは好適である。８−ｍｅｒデオキシギャップを有するオリゴヌクレオチド（６７１７）が９０％を超える阻害を示したので、より好適である。

一つまたはそれ以上の２’−Ｏ−メチル修飾および均一なホスホロチオエート主鎖を有する別のキメラオリゴヌクレオチドが合成された。これらは表１０に示されている。すべてがホスホロチオエートであり；ボールド体の領域は２’−Ｏ−メチル修飾領域を示している。

ノーザンブロット分析によりｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡを阻害するこれらの能力が試験され、ＩＳＩＳ７８４８、７８４９、７８５１、７８５６、７８５５、７８５４、７８４７および７８５３が７０％より良好な阻害を与え、従って好適である。これらの内、７８５１、７８５５、７８４７および７８５３が９０％を超える阻害を与え、より好適である。
種々の２’修飾を有する別のキメラオリゴヌクレオチドが製造され、試験された。これらは表１１に示されている。すべてがホスホロチオエートであり；ボールド体の領域は２’−修飾領域を示している。

これらの内、オリゴヌクレオチド６７２０、６７１７、６７２９、９７２０および９０５８が好適である。オリゴヌクレオチド６７１７、６７２９、９７２０および９０５８がより好適である。
実施例１７
ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現に対する、配列ＩＤ番号：７を有する２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドの効果
配列ＩＤ番号：７および２’−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃修飾を含む６ヌクレオシドが各々の端に隣接する、２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖残基含有中心８−ヌクレオシド単位部分配列を有する二つのオリゴヌクレオチドが合成された。これらの化合物は異なっており、その一つＩＳＩＳ１０７５５（ＣＩＢＡ１４４０として知られている）は均一なホスホロチオエート主鎖を有し；他のもの、ＩＳＩＳ１０７５４（ＣＩＢＡ１３３９またはＣＧＰ６９８４５として知られている））は中心領域にホスホロチオエート主鎖（主鎖結合７−１４）および隣接領域にホスホジエステル主鎖を有する。これらの化合物はＴ２４細胞におけるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現を阻害する能力が試験された。ＩＣ₅₀（５０％阻害が得られるオリゴヌクレオチド濃度）が計算され、これらの補体に対するオリゴヌクレオチドの親和性を示すＴ_mデータと共に表１２に示されている。それらの非常に低いＩＣ₅₀のため、ＩＳＩＳ１０７５５およびＩＳＩＳ１０７５４の両方が好適である。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは固相合成のよく知られた技術により便利よくおよび日常的に作製されるであろう。（Ｍａｒｔｉｎ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４。）そのような合成のための装置はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの製造元から販売されている。そのような合成のためには任意の他の手段を用いてもよい；オリゴヌクレオチドの実際の合成は当業者の才能によるものである。

実施例１８
ヒト肺腺癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３２およびＣＧＰ６９８４５の効果
オスＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて皮下ヒトＡ５４９肺腺癌異種移植片が確立され、ＩＳＩＳ５１３２（配列ＩＤ番号：７）または配列ＩＤ番号：７のメトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃）体で処置された（両方とも０．００６から６．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で静脈内注射により毎日投与された）。図６ａおよび６ｂに示されているように、ＩＳＩＳ５１３２はすべての用量で、用量依存的に腫瘍サイズを減少させた。メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃）オリゴヌクレオチド、ＣＧＰ６９８４５、はより少ない用量でＩＳＩＳ５１３２と類似の、および６．０ｍｇ／ｋｇの用量ではＩＳＩＳ５１３２よりも大きな効果を有していた。
実施例１９
Ａ５４９異種移植片
５ｘ１０⁶Ａ５４９細胞がヌードマウスの内腿の皮下に移植された。塩溶液に懸濁したオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ５１３２およびＣＧＰ６９８４５、ＩＳＩＳ１０７５４としても知られている）が０．００６から６．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で静脈内注射により１日１回投与された。生じた腫瘍は９、１２、１７および２１日目に測定され、腫瘍容量が計算された。
実施例１０
ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現阻害のノーザンブロット分析
ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）から入手した。細胞は１０％熱不活性化ウシ胎児血清および各々５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシンを補給した、Ｌ−グルタミンを含むマッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）中で増殖させた。細胞は１００ｍｍプレートに播種した。それらが７０％コンフルエントに達した時、オリゴヌクレオチドで処理した。プレートは１０ｍＬの前もって温めたＰＢＳおよび２．５μＬのＤＯＴＭＡを含む５ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ還元血清培地で洗浄した。続いてリポフェクチンとともにオリゴヌクレオチドを所望の濃度まで加えた。処置して４時間後、培地をマッコイ培地に置き換えた。オリゴヌクレオチド処置２４から７２時間後に細胞を集め、ＲＮＡは標準ＣｓＣｌ精製法を用いて単離した。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ’，ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ。全ＲＮＡはＣｓＣｌクッションを用いる細胞溶解液の遠心分離により単離した。ＲＮＡ試料は１．２％アガロース−ホルムアルデヒドゲルを通して電気泳動し、１２−１４時間かけてキャピラリー拡散によりハイブリダイゼーション膜へ移した。ＲＮＡはＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中でＵＶ光に暴露することにより膜へ架橋させ、ランダム−プライムト³²Ｐ−標識ｃ−ｒａｆ ｃＤＮＡプローブ（ＡＴＣＣから得られた）または対照としてＧ３ＰＤＨプローブへハイブリダイズさせた。ＲＮＡはＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量した。
実施例２１
Ｒｅｖ遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害
このアッセイに使用されたキメラオリゴヌクレオチドは下記の表１３に示されている。

トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ：３Ｔ３細胞はグルコース、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよび１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を加えたＤＭＥＭ中で維持された。すべての実験において、細胞は前夜、６−ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に７５，０００細胞／ウェルで播種された。トランスフェクションは標準ＣａＰＯ₄法を使用して実施された。複製物の各々の組に対し、１５μｇ／ｍＬのｐＳＧ５／ｒｅｖプラスミド、１８μｇ／ｍＬのｐＨＩＶｅｎｕ−ｌｕｃおよび２μｇ／ｍＬのＲｅｐ ６を沈澱させ、この２００μＬを各々のウェルに滴加した。沈澱物は３７℃にて７時間、細胞上でインキュベートさせた。次に培地を吸引し、細胞はＰＢＳで一度洗浄し、新鮮な完全培地を加えて一夜インキュベーションを行った。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を２ｍＬのＯＰＴＩＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で洗浄して、２．５μｇ／ｍＬのリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）およびオリゴヌクレオチドを含む１ｍＬのＯＰＴＩＭＥＭを加えた。混合物は３７℃にて４時間インキュベートし、その後細胞培養液を吸引して除き、完全培地を加えた。この処理を行って２時間後、０．２μＭ／ｍＬのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）をすべてのウェルに加え、ｐＨＩＶｅｎｕ−ｌｕｃのＭＭＴＶプロモーターを誘導した。
ルシフェラーゼアッセイは２４時間後に以下のように実行された：ウェルを二度ＰＢＳで洗浄し、２００μＬの溶解緩衝液（１％トリトン、２５ｍＭグリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、４ｍＭ ＥＧＴＡおよび１ｍＭ ＤＴＴ）中でひっかくことにより細胞を採取した。溶解物は１１，５００ｒｐｍで５分間の冷却微量遠心分離により清澄化させた。続いてマイクロタイタープレート中、１００μＬの溶解物と５０μＬのアッセイ緩衝液（２５ｍＭグリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８、１ｍＭ ＤＴＴおよび７．５ｍＭ ＡＴＰ）と混合した。Ｌｕｃ検出はマイクロタイタールミネセンスリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して実施された。反応は５０μＬの１ｘルシフェラーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ）を注入することにより開始された。１ｘ溶液は１０ｘ保存液（１０ｍＭルシフェリンの１０ｍＭ ＤＴＴ溶液）からの使用に先だってルシフェリン緩衝液（２５ｍＭグリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、４ｍＭ ＥＧＴＡおよび４ｍＭ ＤＴＴ）に希釈された。試料は２０秒間計数された。ホタルｌｕｃ発光の動力学は数秒持続するフラッシュ期間により特徴付けられ、続いてより低い強度の発光の期間が数分持続する。
ＲｅｖおよびＲＲＥ ＲＮＡ合成：ｐＳＧ％−ＲｅｖはＴ７プロモーターに隣接するＲｅｖ遺伝子を含む。ＢｇｌＩＩ直線化ｐＳＧ５−ＲｅｖがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写のＤＮＡ鋳型として使用された。ＲＲＥ ＲＮＡ生成のための鋳型はＰＣＲにより製造された。ＲＮＡ合成のため、ＤＮＡ鋳型は０．２から１．０ｍｇ／ｍＬで、５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰの各々、０．５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６ｍＭのＭｇＣｌ₂、４ｍＭのスペルミジン、５００Ｕ／ｍＬのＲＮＡｓｉｎ（２０Ｕ／μＬで）、２５００μＣｉ／ｍＬの³²Ｐ ＵＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬで）および１０００Ｕ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼとともに使用された。反応液は３７℃にて１時間インキュベートした。転写反応はホルムアミド負荷緩衝液を加えることにより終結させ、８Ｍ尿素を含む変性ポリアクリルアミドゲルを通した。ＲＮＡはＳｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ，１９９０，８８，１９７）の方法に従ってゲルから溶出された。
実施例２２
抗ウイルススクリーニングのためのイムノアッセイ
ＮＨＤＦ細胞は無血清ＦＧＭ中に１５，０００細胞／ウェルの密度で９６−ウェル培養プレートに播種された。確立された単層は感染に先だってＦＧＭ中で一夜オリゴヌクレオチドで前処理された。前処理後、細胞を新鮮な前もって温めたＦＧＭで３回すすぎ、０．０５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩを達成するため、ウイルスを含む１００μＬのＦＧＭ／ウェルを加えた。３７℃で２時間インキュベーションを行った後、ウイルスを除去し、オリゴヌクレオチドを含む新鮮培地（１００μｌ／ウェル）を加えた。培地は感染２日後にオリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地と交換し、６日後、抗体染色のために細胞を無水エタノールで固定して乾燥させた。いくつかのアッセイでは改良プロトコールが使用され、そこでは、ＦＧＭに低レベルのＦＢＳ（０．２％）が補給され、感染後のインキュベーション時間を６日から３日に短くした。このより短いアッセイでは感染２日後の培地交換の必要性が除かれた。両方のアッセイとも５０％有効濃度（ＥＣ５０）については同じ様な値が得られた。
固定された細胞は２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ溶液で遮断し、マウスモノクローナル抗体（ｌＨ１０、Ｅｉｓａｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎから供給された）をＰＢＳ−１％ＢＳＡで１：２０００に希釈して加えた。ｌＨ１０抗体は約６５ｋＤａの大きさの豊富な後期ＨＣＭＶポリペプチドを認識する。結合モノクローナル抗体の検出はビオチニル化ヤギ抗マウスイムノグロブリンＧ ａｂｄ ストレプトアビジン−結合β−ガラクトシダーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）により容易に行えた。β−ガラクトシダーゼの基質としてクロロフェノールレッドβ−ガラクトピラノシドが使用され、活性はＢｉｏＴｅｘモデルＥＬ３１２ｅマイクロプレートリーダーを用いて個々のウェルの５７５ｎｍでの光学密度を測定することにより決定された。
このアッセイにおいて使用されたオリゴヌクレオチドは下記の表１４に示されている。

実施例２３
ＨＣＶ Ｈ８Ａｄ１７タンパク質アッセイにおけるオリゴヌクレオチド２７０および３３０の評価
ＨＣＶコアタンパク質レベルに対するオリゴヌクレオチドの効果を評価するために従来使用されているＥＬＩＳＡアッセイの代わりに、アフィニティ精製ヒトポリクローナル抗ＨＣＶ血清および¹²⁵Ｉ−結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いるウェスタンブロットアッセイが開発された。６−ウェルプレートに３．５ｘ１０⁵細胞／ウェルでＨ８細胞が播種された。５μｇ／ｍＬリポフェクチンを含むＯｐｔｉｍｅｍに溶解したオリゴヌクレオチドで細胞を４時間処理した。細胞は２ｍＬのＨ８培地を加えて一夜回復させた。細胞を採取するため、細胞を一度２ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１００μＬラエムリ緩衝液中で溶解させ、かきとって採取した。電気泳動のために細胞溶解液を煮沸し、１０−１４μＬの細胞溶解液を１６％ポリアクリルアミドゲルの各々のレーンに負荷した。電気泳動した後、タンパク質は電気泳動的にＰＶＤＦ膜上に移動させた。膜は２％ヤギ血清および０．３％トゥイーン−２０を含むＰＢＳ中でブロックし、一次抗体（ヒト抗コア抗体２２４３およびウサギ抗Ｇ３ＰＤＨ抗体）と一夜インキュベートした。膜を緩衝液で５ｘ５分洗浄し、次に二次抗体（¹²⁵Ｉ−結合ヤギ抗ヒトおよび¹²⁵Ｉ−結合ヤギ抗ウサギ）と４−８時間インキュベートした。膜を緩衝液で５ｘ５分洗浄し、プラスチックに封入してＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒカセット中で一夜暴露した。バンドはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で定量し、Ｇ３ＰＤＨ発現レベルで規格化して結果を対照非処理細胞に対してのパーセントとしてプロットした。
このウェスタンブロットアッセイにより評価されたオリゴヌクレオチドは表１５に示されている。示されている配列において、大文字は塩基配列を表しており、小文字（ｏまたはｓ）はヌクレオシド間結合、各々ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）またはホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を表している。ボールド＝２’−Ｏ−プロピル。＊＝２’−Ｏ−ブチルイミダゾール。＋＝２’−Ｏ−プロピルアミン。

実施例２４
２，６−ジアミノ−９−（２−Ｏ−オクタデシル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン
２，６−ジアミノ−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（５０ｇ，１８０ｍｍｏｌ）および水素化ナトリウム（７ｇ）のＤＭＦ（１Ｌ）溶液を２時間加熱して沸騰させた。ヨードオクタデカン（１００ｇ）を１５０℃で加え、反応混合物は放置して室温まで冷却した。反応混合物はＲＴで１１日撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣はシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物は５％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出された。適切な分画を蒸発させると生成物が得られた（１１ｇ）。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ０．８４（ｔ，３，ＣＨ₂）；１．２２（ｍ，３２，Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−（ＣＨ₂）₁₆）；１．８６（ｍ，２，Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂）；３．２５（ｍ，２，Ｏ−ＣＨ₂）；３．９３（ｄ，１，４’Ｈ），４．２５（ｍ，１，３’Ｈ）；４．３８（ｔ，１，２’Ｈ）；５．０８（ｄ，１，３’−ＯＨ）；５．４８（ｔ，１，５’−ＯＨ）；５．７５（ｓ，２，６−ＮＨ₂）；５．８４（ｄ，１，ｌ’−Ｈ）；６．８（ｓ，２，２−ＮＨ₂）；および７．９５（ｓ，１，８−Ｈ）。
実施例２５
２’−Ｏ−オクタデシルグアノシン
２，６−ジアミノ−９−（２−Ｏ−オクタデシル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１０ｇ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＬ，ｐＨ７．４）、０．１Ｍトリス緩衝液（１０００ｍＬ，ｐＨ７．４）およびＤＭＳＯ（１０００ｍＬ）に溶解し、ＲＴにてアデノシンデアミナーゼ（１．５ｇ）で処理した。３、５および７日目に追加のアデノシンデアミナーゼ（各々５００ｍｇ、８８０ｍｇおよび２００ｍｇ）を加えた。反応液は総計で９日間撹拌し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製すると生成物を得た（２ｇ）。分析用試料はＭｅＯＨから再結晶した。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ０．８４（ｔ，３，ＣＨ₃），１．２２［ｓ，３２，Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−（ＣＨ₂）₁₆］，５．０７（ｍ，２，３’−ＯＨおよび５’−ＯＨ）；５．７８（ｄ，１，１’−Ｈ）；６．４３（ｓ，２，ＮＨ₂），７．９７（ｓ，１，８−Ｈ）および１０．６４（ｓ，１，ＮＨ₂）。元素分析：Ｃ₂₈Ｈ₄₉Ｎ₅Ｏ₅として計算値：Ｃ，６２．８０；Ｈ，９．１６；Ｎ，１２．９５。実測値：Ｃ，６２．５４；Ｈ，９．１８；Ｎ，１２．９５。
実施例２６
Ｎ ² −イソブチリル−２’−Ｏ−オクタデシルグアノシン
２’−Ｏ−オクタデシルグアノシン（１．９ｇ）のピリジン（１５０μＬ）溶液を氷浴で冷却し、トリメチルシリル クロリド（２ｇ，５当量）およびイソブチリル クロリド（２ｇ，５当量）で処理した。反応混合物は４時間撹拌し、その間に放置して室温まで温めた。溶液を冷却し、水（１０ｍＬ）を加えてさらに３０分撹拌した。濃水酸化アンモニウム（１０ｍＬ）を加えて、真空下溶液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製すると（３％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃで溶出）、１．２ｇの生成物が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ ０．８５（ｔ，３，ＣＨ₃），１．１５（ｍ，３８，Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂（ＣＨ₂）₁₆，ＣＨ（ＣＨ₃）₂），２．７７（ｍ，１，ＣＨ（ＣＨ₃）₂），４．２５（ｍ，２，２’−Ｈおよび３’−Ｈ）；５．０８（ｔ，ｌ，５’−ＯＨ），５．１２（ｄ，１，３’−ＯＨ），５．８７（ｄ，１，１’−Ｈ），８．２７（ｓ，１，８−Ｈ），１１．６８（ｓ，１，ＮＨ₂）および１２．０８（ｓ，１，ＮＨ₂）。元素分析：Ｃ₃₂Ｈ₅₅Ｎ₅Ｏ₆として計算値：Ｃ，６３．４７；Ｈ，９．０９；Ｎ，１１．５７。実測値：Ｃ，６３．５３；Ｈ，９．２０；Ｎ，１１．５２。この生成物をオリゴヌクレオチドに取り込ませるのに先立ち、１９９４年２月３日に公開された国際特許公開番号ＷＯ９４／０２５０１に記載されている方法に従って、Ｎ²−イソブチリル−５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−オクタデシルグアノシンおよびホスホロアミダイトへ変換された。
実施例２７
ｍＲＮＡ過剰発現検出のための診断的アッセイ
オリゴヌクレオチドは合成後、５’末端がポリヌクレオチドキナーゼを用いる³²Ｐ標識化により放射性標識された。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐｇ．１１．３１−１１．３２］。放射性標識されたオリゴヌクレオチドは特異的ハイブリダイゼーションが起こる条件下、患者からの試料のようなｍＲＮＡ過剰発現が疑われる組織または細胞試料と接触させ、非結合オリゴヌクレオチドを除去するために試料を洗浄する。放射性標識オリゴヌクレオチドを、特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で正常細胞または組織と接触させ、非結合オリゴヌクレオチドを除去するために試料を洗浄した同様な対照試料が保存される。試料中に残存する放射活性は結合オリゴヌクレオチドを示しており、シンチレーションカウンターまたは他の常用手段を用いて定量される。正常および疾患細胞からの試料中に残存する放射活性の比較により問題とするｍＲＮＡの過剰発現が示される。
本発明の放射性標識オリゴヌクレオチドはオートラジオグラフィーにおいても有用である。組織切片が放射性標識オリゴヌクレオチドで処理され、上記のように洗浄した後、標準オートラジオグラフィー法に従って写真感光乳剤へ暴露される。正常細胞または組織試料による対照もまた保存される。感光乳剤は現像された場合、ｍＲＮＡを過剰発現している領域の銀粒子のイメージが得られ、それは定量される。ｍＲＮＡ過剰発現の程度は正常および疾患細胞で観察された銀粒子の比較により決定される。
ｍＲＮＡ発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、フルオレセインまたは他の蛍光標識で標識された本発明のオリゴヌクレオチドを使用する。標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヨード酸化による標準ホスホロアミダイト化学を用いて自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル３８０Ｂ）により合成される。β−シアノエチルジイソプロピル ホスホロアミダイトはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入された。フルオレセイン標識アミダイトはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から購入された。オリゴヌクレオチドおよび生物学的試料のインキュベーションは放射性標識オリゴヌクレオチド試料で説明したように実施されるが、ただし、蛍光を検出するためにシンチレーションカウンターの代わりに蛍光顕微鏡が使用される。正常および疾患細胞からの試料で観察された蛍光の比較によりｍＲＮＡ過剰発現の検出が可能である。
実施例２８
異常ｍＲＮＡの検出
異常ｍＲＮＡの発現が疑われる組織または細胞は、野生型（正常）ｍＲＮＡを標的とする第一の³²Ｐまたは蛍光標識オリゴヌクレオチドとインキュベートされる。細胞または組織の同一試料は、特異的ハイブリダイゼーションが起こり得る条件下、異常ｍＲＮＡを標的とする第二の標識オリゴヌクレオチドとインキュベートし、非結合オリゴヌクレオチドを除去するために試料を洗浄する。試料中に残存する標識は結合オリゴヌクレオチドを示し、シンチレーションカウンター、蛍光計または他の常用手段を用いて定量できる。もし結合が第二の試料で観察されるが第一の試料では観察されないならば、異常ｍＲＮＡの存在が指摘される。
異常ｍＲＮＡの発現を特異的に検出するため、本発明のオリゴヌクレオチドおよび方法による二重標識も使用できる。単一組織試料が、特異的ハイブリダイゼーションが起こり得る条件下、野生型ｍＲＮＡを標的とする第一の³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドおよび異常ｍＲＮＡを標的とする第二のフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドとインキュベートされる。非結合オリゴヌクレオチドを除去するために試料を洗浄し、標識はシンチレーション計測および蛍光定量法により検出する。もし試料が³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドに結合しないが（すなわち、放射活性ではない）蛍光標識を保持している（すなわち、蛍光性である）ならば異常ｍＲＮＡの存在が指摘される。
実施例２９
マウスにおけるオリゴヌクレオチドの血漿吸収および組織分布
以下のオリゴヌクレオチドが製造された：

式中、各オリゴヌクレオチドにおいてボールド型は２’−Ｏ−プロピル置換基、”ｓ”はホスホロチオエート結合を示し、”ｓ”がない場合はホスホジエステル結合を示している。図９、１０、１１および１２において、第一のオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ３０８２、第二のオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ９０４５、および第三のものはＩＳＩＳ９０４６と同定された。オリゴヌクレオチドはＧｒａｈａｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，１６，３７３７−３７４３の方法に従ってトリチウム化された。
動物および実験方法：各々のオリゴヌクレオチド研究のため、２０匹のオスＢａｌｂ／ｃマウス（ＣＨａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、体重約２５ｇ、が４つの処置群の一つに無作為に割り当てられた。一週間の環境順応後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）として投与される³Ｈ−放射性標識オリゴヌクレオチドの１回尾静脈注射を受けた（約７５０ナノモル／ｋｇ；１２４−１７０μＣｉ／ｋｇの範囲）。投与溶液中のオリゴヌクレオチドの濃度は約６０μＭであった。一つの眼窩後方血（各々投与後０．２５、０．５、２または４時間）およびターミナル血（各々投与後１、３、８または２４時間）が各々の群から集められた。ターミナル血はケタミン／キシラジン麻酔後の心臓穿刺により集められた。各々の血液試料の一部は放射活性決定のために保存され、残りの血液はＥＤＴＡ被覆採集管へ移され、遠心分離して血漿を得た。尿および排泄物は２４時間で終えた群から（０−４、４−８および８−２４時間）の時間間隔で採取した。
終了時、各々のマウスから肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、脳、骨格筋の試料、小腸の一部、皮膚試料、膵臓、骨（骨髄を含む両方の大腿骨）および２つのリンパ節を集め、秤量した。排泄物は秤量し、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を用い、蒸留水で１：１としてホモジナイズした。血漿、組織、尿および排泄物ホモジネートは、燃焼による放射活性の分析および無傷のオリゴヌクレオチド含量決定のために分割された。すべての試料は収集直後にドライアイスで凍結させ、分析まで−８０℃で保存した。
血漿、組織および排泄物中の放射活性の分析：血漿および尿試料はシンチレーションバイアル内で直接秤量し、１５ｍＬのＢｅｔａＢｌｅｎｄ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）を添加して液体シンチレーション計数により直接分析した。すべての他の試料（組織、血液およびホモジナイズした排泄物）は燃焼皿内で秤量し、生物試料オキシダイザー（モデルＯＸ−１００；Ｒ．Ｊ．Ｈａｒｖｅｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．，Ｈｉｌｌｓｄａｌｅ，ＮＪ）で酸化した。³Ｈ₂Ｏは１５ｍＬのＢｅｔａＢｌｅｎｄおよび５ｍＬのＨａｒｖｅｙトリチウムカクテル（Ｒ．Ｊ．Ｈａｒｖｅｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．，Ｈｉｌｌｓｄａｌｅ，ＮＪ）からなる２０ｍＬのカクテルに集められた。燃焼効率は³Ｈ−マンニトールの溶液を加えた試料の燃焼により毎日決定され、７３．９−８８．３％の範囲であった。液体シンチレーション計数はＢｅｃｋｍａｎ ＬＳ９８００またはＬＳ６５００液体シンチレーションシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて実施された。試料は自動クエンチ補正により１０分間計数した。分当たりの壊変値は燃焼過程の効率で補正された。
データの分析：試料中の放射活性は試料グラム当たり、分当たりの壊変として表現された。これらの値は試料グラム当たりの全オリゴヌクレオチドのナノモル当量でデータを表現するため、放射標識の比活性で割られ、器官または組織当たりの投与された用量のパーセントに変換された。組織密度を１ｇ／ｍＬと仮定して、ナノモル／ｇのデータは全μＭ濃度へ変換された。各時点での血漿、肝臓または腎臓中の無傷のオリゴヌクレオチド濃度を計算するため、平均全μＭ濃度は投与溶液中の無傷のオリゴヌクレオチドのパーセントで割られ、次にＣＧＥまたはＨＰＬＣにより決定された各時点での無傷のオリゴヌクレオチドの平均パーセントを掛けた。このデータは直線回帰による組織半減期の計算に使用され、異なった修飾オリゴヌクレオチドの血漿薬動力学が比較された。薬動力学のパラメーターはＰＣＮＯＮＬＩＮ４．０（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｐｅｘ，ＮＣ）を使用して決定された。データの試験後、一コンパートメントボウラスインプット、一次アウトプットモデル（ライブラリーモデル１）が使用するために選択された。
動物血漿取り込みおよび組織分布試験の結果は図として図９、１０、１１および１２に示されている。図９から見て取れるように、各々の試験オリゴヌクレオチドの血漿濃度は最初の注射レベルから試験した２４時間に渡ってより低いレベルへ減少した。本発明のオリゴヌクレオチドの血漿レベルはホスホロチオエートを有する非複合物と等しいレベルで維持されていた。試験化合物のすべてが血漿から組織へ移行しており、それは図１０、１１および１２に示されている。本発明の化合物は種々の組織間で異なった分布を有していた。図１０は対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３０８２として同定される、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）の分布パターンを示している。図１１は本発明の第一の化合物（オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ９０４５として同定される、各々のヌクレオシドに２’−置換基を有する）の分布パターンを示している。図１２は本発明の別の化合物（”ギャップ付”オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ４０９６として同定される、オリゴヌクレオチドの”隣接”部分の各々のヌクレオシドに２’−置換基およびホスホジエステル結合を、中心またはギャップ領域中に２’−デオキシ、ホスホロチオエートヌクレオシドを有する）の分布パターンを示している。
実施例３０
２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン、Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎから市販品として入手可能）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、炭酸ジフェニル（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ）および炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。混合物は撹拌しながら加熱還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された様式で放出させる。１時間後、減圧下でわづかに黒くなった溶液を濃縮した。得られたシロップ状物は撹拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。生成物はゴム状物となった。エーテルをデカントし、残渣は最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解させた。この溶液に新しいエーテル（２．５Ｌ）内に注ぐと硬いゴムが得られた。エーテルをデカントし、ゴムは真空オーブンで乾燥させると（６０℃、１ｍｍＨｇで２４時間）、固形物が得られ、それを砕くとうすい黄褐色粉末となった（５７ｇ，８５％粗収率）。ＮＭＲスペクトルは構造と一致し、フェノールがナトリウム塩として混入していた（５％）。この物質はそのまま次の反応に使用された（または、酢酸エチル中、メタノールの濃度勾配を用いる（１０％−２５％）カラムクロマトグラフィーによりさらに精製でき、白色固形物、ｍｐ２２２−４℃が得られる）。
実施例３１
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−５−メチルウルジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼圧力容器に加え、前もって１６０℃に加熱した油浴に入れる。１５５−１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開き、溶液を蒸発乾固させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と摩砕した。残渣を熱アセトン（１Ｌ）に懸濁させた。不溶性塩を濾過して除き、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄して濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ₃ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋＧ）は０．５％Ｅｔ₃ＮＨを含むＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）で充填した。残渣はカラムに充填する前にＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍＬ）に溶解してシリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を充填溶液で溶出させると１６０ｇ（６３％）の生成物が得られた。不純な分画を再処理すると追加の物質が得られた。
実施例３２
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共沸させ、乾燥残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの一部（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、混合物は室温で１時間撹拌した。さらにジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、反応液はさらに１時間撹拌した。次に反応を停止させるためにメタノール（１７０ｍＬ）を加えた。ＨＰＬＣは約７０％の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ₃ＣＮ（２００ｍＬ）と摩砕した。残渣をＣＨＣｌ₃（１．５Ｌ）に溶解し、２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ₃および２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相はＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過して蒸発させた。２７５ｇの残渣が得られた。残渣は３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、０．５％Ｅｔ₃ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトンで充填および溶出した。純粋な分画を蒸発させると１６４ｇの生成物が得られた。不純な分画からさらに約２０ｇが得られ、総収量で１８３ｇ（５７％）が得られた。
実施例３３
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（７５０ｍＬ、５６２ｍＬのＤＭＦおよび１８８ｍＬのピリジンから調製された３：１混合物）および無水酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を混合し、室温で２４時間撹拌した。最初にＭｅＯＨの添加でクエンチさせたｔｌｃ試料を用いたｔｌｃにより反応をモニターした。反応が完了したら（ｔｌｃで判断）、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、混合物は３５℃で蒸発させた。残渣はＣＨＣｌ₃（８００ｍＬ）に溶解し、２ｘ２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層は２００ｍＬのＣＨＣｌ₃で逆抽出した。合併した有機相は硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させると１２２ｇの残渣が得られた（約９０％の生成物）。残渣は３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出した。純粋な分画を蒸発させると９６ｇ（８４％）が得られた。後ろの分画からさらに約１．５ｇが回収された。
実施例３４
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
第一の溶液は３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解することにより調製され、脇に置かれた。トチエチルアミン（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ）をトリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）のＣＨ₃ＣＮ（１Ｌ）溶液に加え、−５℃に冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて０．５時間撹拌した。ＰＯＣｌ₃を撹拌溶液に３０分以上かけて滴加し（０−１０℃に維持する）、得られた混合物はさらに２時間撹拌した。この溶液に第一の溶液を４５分以上かけて滴加した。得られた反応混合物は低温室で一夜貯蔵した。塩を反応混合物から濾過して除き、溶液は蒸発させた。残渣はＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性の固形物は濾過して除いた。濾液を１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ₃および２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃと摩砕すると表記化合物が得られた。
実施例３５
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ₄ＯＨ（３０ｍＬ）溶液を室温で２時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣はＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）と共沸させた。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、２リットルのステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ₃ガスで飽和したＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、容器を１００℃に２時間加熱した（ｔｌｃは完全な変換を示した）。容器内容物を蒸発乾固し、残渣はＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で一度洗浄した。有機相は硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させると８５ｇ（９５％）の表記化合物が得られた。
実施例３６
Ｎ ⁴ −ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、撹拌しながら無水安息香酸（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を加えた。３時間撹拌後、ｔｌｃは反応が約９５％完了していることを示した。溶媒を蒸発させ、残渣はＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ₃（７００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ₃（２ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発させると残渣（９６ｇ）が得られた。残渣は０．５％Ｅｔ₃ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として用いる１．５ｋｇのシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物分画を蒸発させると９０ｇの表記化合物が得られた。
実施例３７
Ｎ ⁴ −ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ⁴−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１Ｌ）に溶解した。テトラゾール ジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を窒素雰囲気下、撹拌しながら加えた。生じた混合物は室温で２０時間撹拌した（ｔｌｃは反応が９５％完了していることを示した）。反応混合物は飽和ＮａＨＣＯ₃（１ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。水性洗液はＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍＬ）で逆抽出し、抽出液を合併してＭｇＳＯ₄で乾燥させて濃縮した。得られた残渣はＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出溶媒として用いる１．５ｋｇのシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物分画を合併させると９０．６ｇ（８７％）の表記化合物が得られた。
【配列表】

Claims (7)

1. ＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能な、共有結合で結合された１５〜２５のヌクレオシド単位の直線状配列を含むオリゴヌクレオチドであって、
   前記配列は２’−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖部分を有する第一のヌクレオシド部分配列、２’−デオキシ糖部分を有する第二の部分配列、および２’−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃糖部分を有する第三のヌクレオシド部分配列を含んでなり、ここで、前記第二の部分配列は、少なくとも５つのヌクレオシド単位を含んでなり、そして前記第一および第三の部分配列の間に位置しており；
   前記第一および第二の部分配列のヌクレオシド単位はホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により共有結合されているオリゴヌクレオチド。
2. 前記第一および第二の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホロチオエート結合により共有結合されている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記第一の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホジエステル結合により共有結合されており、そして前記第二の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホロチオエート結合により共有結合されている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
4. 前記第一の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホロチオエート結合により共有結合されており、そして前記第二の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホジエステル結合により共有結合されている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記第一、第二および第三の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホロチオエート結合により共有結合されている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
6. 前記第一および第三の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホジエステル結合により共有結合されており、そして前記第二の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホロチオエート結合により共有結合されている、請求項１項に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 前記第一および第三の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホロチオエート結合により共有結合されており、そして前記第二の部分配列の前記ヌクレオシド単位がホスホジエステル結合により共有結合されている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。

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