JP3745226B2 - サービビン発現のアンチセンス・モジュレーション - Google Patents

Description

【０００１】
発明の分野
本出願は１９９８年９月２９日出願の米国特許出願第０９／１６３，１６２号の一部継続出願である。
本発明はサービビン(Survivin)の発現をモジュレートするための組成物又は方法を提供する。特に、本発明は、詳しくはヒトサービビンをコードする核酸とハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチドに関する。このようなオリゴヌクレオチドはサービビンの発現をモジュレートすることが判明している。
【０００２】
発明の背景
癌細胞の特徴(hallmark feature)は制御されない増殖である。腫瘍と正常な細胞との間に発見されている相違には、アポトーシスとしても知られる、プログラムされた細胞死のプロセスに対する抵抗がある（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，９１７−９２１）。アポトーシスは、多細胞生物が制御されない細胞増殖を防止するため、並びに病気になった、劣化した又はもはや必要ではない細胞を除去するために多細胞生物が発生させるプロセスである。アポトーシスのプロセスは、細胞が内部からタンパク質分解酵素及びＤＮＡエンドヌクレアーゼの関係ある作用によって分解される多段階カスケードを含み、結果としてアポトーシス体(apoptotic bodies)の形成を生じ、次にアポトーシス体はスカベンジャー細胞によって除去される。現在までの研究は、細胞内分解の多くが、アスパラギン酸残基に隣接して切断されるタンパク質分解酵素のファミリーであるカスパーゼの作用によって行われることを示している（Ｃｏｈｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９７，３２６，１〜１６）。
【０００３】
大抵の腫瘍細胞がアポトーシスプロセスに対して抵抗を示すという発見は、アポトーシスに対する腫瘍細胞の抵抗を弱めることを目的とした治療方策が腫瘍性(neoplastic)細胞の蔓延を停止させるための新規な手段を表しうるという見解を生じている（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，９１７−９２１）。腫瘍細胞がアポトーシスに対する抵抗を得ると考えられる機構の１つは、ＩＡＰ（アポトーシスの阻害剤）カスパーゼ阻害剤ファミリーの最近発表されたメンバーであるサービビンの過度発現によるものである。現在までに、サービビンの過度発現は肺、結腸、膵臓、前立腺、胸部及び胃の腫瘍、非Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓリンパ腫並びに神経芽細胞腫中に検出されている（Ａｄｉｄａ等，Ｌａｎｃｅｔ，１９９８，３５１，８８２−８８３；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，９１７−９２１；Ｌｕ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，５８，１８０８−１８０２）。より詳細な分析が神経芽細胞腫において行われており、この場合に、サービビンの過度発現が、不良な予後に関連することが知られている腫瘍組織学によって偏析する(segregate)ことが発見されている（Ａｄｉｄａ等，Ｌａｎｃｅｔ，１９９８，３５１，８８２−８８３）。最後に、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等は、そのコーディング配列がサービビンのコーディング鎖に広範囲に相補的であり（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，１１１７７−１１１８２）、サービビン・アンチセンスＲＮＡとして可能に作用する、エフェクター細胞プロテアーゼ受容体１（ＥＰＲ−１）をコードするヒトｃＤＮＡの７０８ｎｔフラグメントを含有する発現ベクターによるＨｅＬａ細胞のトランスフェクションを述べている。この構築体は細胞生存能力を低下させた。サービビンの量又は活性をモジュレートする作用剤を用いて、アポトーシスをモジュレートし、サービビンによって仲介される病的状態の重症度を減ずる方法は、ＷＯ９８／２２５８９に開示されており、ＷＯ９８／２２５８９は、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等、上記文献によって述べられたＥＰＲ−１コーディング鎖／サービビンアンチセンス構築体をも開示している。
【０００４】
サービビンが細胞周期調節に関与することが最近発見されている。サービビンが細胞周期のＧ２／Ｍ期に周期調節的に発現されることが判明しており、サービビンは紡錘体の微小管に関連する。この相互作用の崩壊はサービビンの抗アポトーシス機能の喪失と、有糸分裂中のカスパーゼ−３活性の増強とを生じる。カスパーゼ−３はアポトーシス細胞死に関連する。それ故、サービビンがＧ２／Ｍ期におけるアポトーシスのデフォールト誘導(default induction)を妨げうることが考えられる。癌におけるサービビンの過度発現がこのアポトーシスチェックポイントを克服して、癌細胞の好ましくない生残と分裂を可能にしうることが考えられる。上記でＡｍｂｒｏｓｉｎｉ等が述べているサービビンアンチセンス構築体は、ＨｅＬａ細胞中の内因性サービビンをダウンレギュレートして、Ｇ２／Ｍ期の細胞におけるカスパーゼ−３依存性アポトーシスを増加させることが発見された。Ｌｉ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９６，５８０−５８４。
【０００５】
アポトーシスについてと、非常に多様な腫瘍細胞種類に増殖利益を与えることにサービビン発現が果たすと考えられる役割りについての理解がこのように進歩した結果として、サービビン発現をモジュレートすることができる物質の組成物を提供することが非常に望まれる。動物におけるサービビンをコードする核酸を診断し、検出する方法を提供することが非常に望まれる。サービビン発現に起因する状態を診断して、治療する方法を提供することも望まれる。さらに、サービビンをコードする核酸を検出し、研究するための改良された研究キット及び試薬が望まれる。
【０００６】
現在、サービビンの合成を効果的に阻害する治療剤は知られていない。したがって、腫瘍細胞におけるサービビン発現を効果的に阻害することができる作用剤の必要性が長い間感じられている。それ故、サービビンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの治療的、診断的及び研究的用途に特有に有用であると実証されることができる。
【０００７】
発明の概要
本発明は、サービビンをコードする核酸をターゲットとして、サービビンの発現をモジュレートするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬的及び他の組成物も提供する。さらに、細胞又は組織におけるサービビンの発現をモジュレートする方法であって、前記細胞又は組織を１種類以上の本発明のアンチセンス化合物又は組成物と接触させることを含む前記方法を提供する。さらに、サービビン発現に関連した疾患又は状態を有する又はこのような疾患又は状態に罹る傾向があると疑われる動物、特にヒトを、本発明のアンチセンス化合物又は組成物の１種類以上の治療的又は予防的有効量を投与することによって治療する方法を提供する。
【０００８】
本発明の詳細な説明
本発明は、サービビンをコードする核酸分子の機能のモジュレートに用いるために、究極的にはサービビンの産生量のモジュレートに用いるために、オリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを利用する。これは、サービビンをコードする１つ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによって、達成される。本明細書で用いる限り、“ターゲット核酸”又は“サービビンをコードする核酸”なる用語は、サービビンをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡとｍＲＮＡを包含する）、及びこのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡも包含する。オリゴマー化合物とそのターゲット核酸との特異的ハイブリダイゼーションは該核酸の正常な機能を妨害する。ターゲット核酸に特異的にハイブリダイズする化合物によるターゲット核酸の機能のこのモジュレーションは一般に“アンチセンス”と呼ばれる。妨害すべきＤＮＡの機能は複写と転写を包含する。妨害すべきＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡに予定される又はＲＮＡによって促進されうる触媒活性のような、総ての重要な機能を包含する。ターゲット核酸機能によるこのような妨害の総合効果は、サービビン発現のモジュレーションである。本発明に関連して、“モジュレーション”は遺伝子発現の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明に関連して、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、ｍＲＮＡは好ましいターゲットである。
【０００９】
アンチセンスのために特異的な核酸をターゲットにすることが好ましい。本発明に関連して、特定の核酸にアンチセンス化合物を“ターゲッティング”することは多段階プロセスである。このプロセスは通常、その機能がモジュレートされるべきである核酸配列の同定によって開始する。これは例えば、その発現が特定の障害若しくは疾患状態に関連する細胞遺伝子（又は該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、又は感染性因子(infectious agent)からの核酸分子でありうる。本発明では、ターゲットはサービビンをコードする核酸分子である。ターゲッティングプロセスは、例えばタンパク質の発現の検出又はモジュレーションのような、所望の効果が生ずるようにアンチセンス相互作用が起こるためのこの遺伝子内の部位（単数又は複数）を決定することを包含する。本発明に関して、好ましい遺伝子内部位は遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドン又は終止コドンを包含する領域である。当該技術分野において知られているように、翻訳開始コドンは典型的に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子中で；対応するＤＮＡ分子中では５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、“ＡＵＧコドン”、“出発コドン”又は“ＡＵＧ出発コドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子がＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧはｉｎ ｖｉｖｏにおいて機能することが判明している。したがって、“翻訳開始コドン”及び“出発コドン”なる用語は、各場合のイニシエーターアミノ酸が典型的にメチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物において）であるとしても、多くのコドン配列を包含しうる。真核遺伝子及び原核遺伝子が２つ以上の代替え出発コドン(alternative start codons)を有することができ、これらのいずれも特定の細胞種類又は組織において又は特定の組み合わせの条件下で翻訳開始のために選択的に用いられうることも、当該技術分野において知られている。本発明に関して、“出発コドン”及び“翻訳開始コドン”なる用語は、このようなコドンの配列（単数又は複数）に関係なく、サービビンをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにｉｎ ｖｉｖｏで用いられるコドン（単数又は複数）を意味する。
【００１０】
遺伝子の翻訳終止コドン（又は“停止コドン”）が３種類の配列、即ち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ又は５’−ＵＧＡ（対応ＤＮＡ配列はそれぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ及び５’−ＴＧＡである）のいずれかを有しうることも、当該技術分野において知られている。“出発コドン領域”及び“翻訳開始コドン領域”なる用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（即ち、５’又は３’）に約２５〜約５０の隣接ヌクレオチドを包含するようなｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する。同様に、“停止コドン領域”及び“翻訳終止コドン領域”なる用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（即ち、５’又は３’）に約２５〜約５０の隣接ヌクレオチドを包含するようなｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する。
【００１１】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが当該技術分野で知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は“コーディング領域”は、効果的にターゲットにされうる領域でもある。他のターゲット領域は、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡ部分を意味し、したがって５’キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド若しくは遺伝子上の対応ヌクレオチドを包含することが当該技術分野で知られた５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡ部分を意味し、したがって翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３’末端との間のヌクレオチド若しくは遺伝子上の対応ヌクレオチドを包含することが当該技術分野で知られた３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを包含する。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’トリホスフェート結合を介してｍＲＮＡの５’−最大残基に結合したＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体と、このキャップに隣接した最初の５０ヌクレオチドとを包含すると考えられる。５’キャップ領域も好ましいターゲット領域でありうる。
【００１２】
幾つかの真核ｍＲＮＡ転写体(transcripts)は直接翻訳されるが、多くの転写体は“イントロン”として知られる１つ以上の領域を含有し、イントロンは転写体が翻訳される前に転写体から削除される。残りの（したがって、翻訳される）領域は“エキソン”として知られ、一緒にスプライスされて、連続ｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、即ち、イントロン−エキソン結合も好ましいターゲット領域であることができ、異常なスプライシングが疾患に関係している状況、又は特定のｍＲＮＡスプライス産物の過度産生が疾患に関係している状況に特に有用である。再編成又は欠失による異常な融合結合も好ましいターゲットである。イントロンも、例えばＤＮＡ又はｐｒｅ−ｍＲＮＡをターゲットとするアンチセンス化合物のために、効果的な、それ故、好ましいターゲット領域であることも判明している。
【００１３】
１つ以上のターゲット部位がひと度同定されたならば、該ターゲットに対して充分に相補的である、即ち、所望の効果を生じるために充分に良好に、充分な特異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選択する。
【００１４】
本発明に関連して、“ハイブリダイゼーション”は、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ，Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合でありうる水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成を通して対合する相補的核酸塩基である。本明細書で用いる“相補性”は２つのヌクレオチド間の正確に対合する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある一定の位置のヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができるならば、該オリゴヌクレオチドと該ＤＮＡ又はＲＮＡとはその位置において相互に相補性であると考えられる。該オリゴヌクレオチドと該ＤＮＡ又はＲＮＡとは、各分子中の充分な数の対応する位置が相互に水素結合することができるヌクレオチドによって占められるときに、相互に相補性である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能な”及び“相補性”は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡターゲットとの間に安定で特異的な結合が生じるように、充分な相補性度又は正確な対合を表すために用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列はそのターゲット核酸の配列と、特異的にハイブリダイズ可能であるために、１００％相補性である必要はないことが当該技術分野において理解される。ターゲットＤＮＡ又はＲＮＡ分子へのアンチセンス化合物の結合がターゲットＤＮＡ又はＲＮＡの正常な機能を妨害して有用性の喪失を生じるときに、アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望ましい条件下で、即ち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療的処置の場合に生理的条件下で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合には、アッセイが行われる条件下で非ターゲット配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために充分な相補性度が存在する。
【００１５】
アンチセンス化合物は一般に研究試薬及び診断薬として用いられる。例えば、精巧な特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、特定の遺伝子の機能を解明するために通常に熟練した人々によってしばしば用いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の種々なメンバーの機能を識別するためにも用いられる。それ故、アンチセンスモジュレーションは研究用途に利用されている。
【００１６】
アンチセンスの特異性と感受性とは、治療用途にも当業者によって利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは動物及びヒトにおける疾患状態の治療に治療法の一部(therapeutic moieties)として用いられている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは安全に及び効果的にヒトに投与されており、非常に多くの臨床トライアルが現在行われている。したがって、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療のための治療計画に有用であるように設定することができる有効な治療モダリティ(therapeutic modalities)でありうる。
【００１７】
本発明に関連して、“オリゴヌクレオチド”なる用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はこれらの模倣体(mimetics)のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語は、天然生成核酸塩基、糖及び共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合から成るオリゴヌクレオチド並びに、同様に機能する、非天然生成部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。このような修飾された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば強化された細胞取り入れ、核酸ターゲットへの強化されたアフィニティ、及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増強のような望ましい性質のために、ネイティブ形態よりも好ましい。
【００１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は非限定的に例えば以下に述べるようなオリゴヌクレオチド模倣体を含めて、他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合物は好ましくは約８〜約３０の核酸塩基を含む。約８〜約３０の核酸塩基（即ち、約８〜約３０の結合ヌクレオシド）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。好ましい実施態様は、サービビンの発現を阻害するアンチセンス化合物の配列の少なくとも８−核酸塩基部分を含む。当該技術分野で知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常は複素環式塩基である。このような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスはプリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基(phosphate group)をさらに包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するヌクレオシドに関して、リン酸基は糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接ヌクレオシドと相互に共有結合して、線状ポリマー化合物を形成する。次に、この線状ポリマー構造の各端部がさらに結合して、環状構造を形成することができるが、開放線状構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると見なされる。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常な結合又はバックボーンは３’〜５’ホスホジエステル結合である。
【００１９】
本発明に有用な、好ましいアンチセンス化合物の特定の例は修飾バックボーン又は非天然ヌクレオシド間結合を包含する。本明細書での定義によると、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーン中にリン原子を保有するものと、バックボーン中にリン原子を有さないものとを包含する。本明細書のために、また当該技術分野でときには参照されるように、ヌクレオシド間バックボーンにリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
【００２０】
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを包含するメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを包含するホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、並びにヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’対５’−３’又は２’−５’対５’−２’結合している、逆の極性を有するものを包含する。種々な塩、混合塩及び遊離酸形態も包含される。
【００２１】
上記リン含有結合の製造を教示する、代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５,１８８,８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；及び第５，６２５，０５０号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。
【００２２】
それらのなかにリン原子を包含しない、好ましい修飾オリゴヌクレオチド・バックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ結合を有するもの（一部は、ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン・バックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホン・バックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル・バックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル・バックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメート・バックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ・バックボーン；スルホネート及びスルホンアミド・バックボーン；アミド・バックボーン；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ₂構成成分部分を有する他のバックボーンを包含する。
【００２３】
上記オリゴヌクレオシドの製造を教示する、代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５,２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；及び第５，６７７，４３９号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。
【００２４】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、即ちバックボーンが新規な基によって置換される。塩基単位は適当な核酸ターゲット化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の１つ、優れたハイブリダイゼーション性質を有することが判明しているオリゴヌクレオチド模倣体はペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンがアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシン・バックボーンによって置換される。核酸塩基は保持されて、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的に又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の製造を教示する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号及び第５，７１９，２６２号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。ＰＮＡ化合物のさらなる教示はＮｉｅｌｓｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
【００２５】
本発明の最も好ましい実施態様は、ホスホロチオエート・バックボーンを有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシド、特に、−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂−［メチレン（メチルイミノ）若しくはＭＭＩバックボーンとして知られる］、上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₂−［ネイティブ・ホスホロジエステル・バックボーンは−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ₂−として表される］並びに上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド・バックボーンを有するものである。さらに、上記で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ・バックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【００２６】
修飾オリゴヌクレオチドは１つ以上の置換糖部分をも含有することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは２’位置に、下記：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み、これらにおいてアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換のＣ₁−Ｃ₁₀アルキル又はＣ₂−Ｃ₁₀アルケニル及びアルキニルであることができる。Ｏ［（ＣＨ₂）_nＯ］_mＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）_nＮＨ₂、Ｏ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）_nＯＮＨ₂及びＯ（ＣＨ₂）_nＯＮ［（ＣＨ₂）_nＣＨ₃）］₂が特に好ましく、これらにおいてｎ及びｍは１から約１０までである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは２’位置において下記：Ｃ₁−Ｃ₁₀低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基(cleaving group)、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態的性質を改良するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改良するための基、並びに同様な性質を有する他の置換基の１つを含む。好ましい修飾は２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる］（Ｍａｒｔｉｎ等，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、即ち、アルコキシアルコキシ基を包含する。他の好ましい修飾は、本出願と共通に所有される米国特許出願第０９／０１６，５２０号（１９９８年１月３０日に出願、この出願の内容は本明細書に援用される）に記載されるような、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ（ＣＨ₂）₂ＯＮ（ＣＨ₃）₂基を包含する。
【００２７】
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₃）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。同様な修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置においても、特に糖の３’−位置に、３’末端ヌクレオチドにおいて又は２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおいて、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置において(3'position of the sugar on the 3'terminal nucleotide or in 2'-5'linked oligonucleotides and the 5'position of 5'terminal nucleotide)も行うことができる。オリゴヌクレオチドはペントフラノシル糖の代わりに例えばシクロブチル部分のような糖模倣体を有することもできる。このような修飾糖構造の製造を教示する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３１号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；及び第５，７００，９２０号を包含し、これらの各々はその全体において本明細書に援用される。
【００２８】
オリゴヌクレオチドは核酸塩基（当該技術分野では簡単に“塩基”としばしば呼ばれる）修飾又は置換を含むこともできる。本明細書で用いる限り、“未修飾(unmodified)”又は“天然”核酸塩基はプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）と、ピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を包含する。修飾核酸塩基は他の合成及び天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ハイポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを包含する。他の核酸塩基は米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編集，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ等，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ版，１９９１，３０，６１３によって開示されているもの、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，第１５章，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９〜３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編集，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されているものを包含する。これらの核酸塩基のある一定のものは本発明のオリゴマー化合物の結合アフィニティを高めるために特に有用である。これらは５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンを包含し、これらは２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを包含する。５−メチルシトシン置換は核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ高めることが判明しており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，とＣｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編集，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，２７６〜２７８頁）、さらに特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にはいっそう、現在好まれている塩基置換である。
【００２９】
上記修飾核酸塩基のある一定のもの並びに他の修飾核酸塩基の製造を教示する代表的な米国特許は、非限定的に、上記米国特許第３，６８７，８０８号、並びに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；及び第５，７５０，６９２号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分配又は細胞取り込みを強化する１つ以上の部分又はコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。このような部分は、非限定的に、例えばコレステロール部分のような脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８），脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ等，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）を包含する。
【００３１】
このようなオリゴヌクレオチド・コンジュゲートの製造を教示する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号；及び第５，６８８，９４１号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。
【００３２】
特定化合物における総ての位置が均一に修飾されることは必ずしも必要ではなく、実際に、上記修飾の１つより多くを単一化合物に又はオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにおいても組み入れることができる。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明に関連して、“キメラ”アンチセンス化合物又は“キメラ”は、各々が少なくとも１つのモノマー単位、即ち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから構成された、２つ以上の化学的に全く異なる(distinct)領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的に、ヌクレアーゼ分解に対する増強された耐性、増強された細胞取り込み及び／又はターゲット核酸への増強された結合アフィニティをオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオチドが修飾されている、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの他の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂することができる酵素の基質として役立ちうる。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。それ故、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡターゲットの開裂を生じて、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に高める。その結果、キメラ・オリゴヌクレオチドを用いる場合には、同じターゲット領域にハイブリダイズするホスホロチオエート・デオキシオリゴヌクレオチドに比べて、より短いオリゴヌクレオチドによって匹敵しうる結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡターゲットの開裂は、ゲル電気泳動と、必要な場合には、当該技術分野において知られた関連ある核酸ハイブリダイゼーション方法とによってルーチンに検出することができる。
【００３３】
本発明のキメラ・アンチセンス化合物は２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又は上述したようなオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成することができる。このような化合物は当該技術分野においてハイブリッド又はギャップマーとしても呼ばれている。このようなハイブリッド構造の製造を教示する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第５，０１３，８３０号、第５，１４９，７９７号、第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；及び第５，７００，９２２号を包含し、これらの各々はその全体において本明細書に援用される。
【００３４】
本発明によって用いるアンチセンス化合物は固相合成の周知の方法によって便利にかつルーチンに作製することができる。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含めた、幾つかの販売会社によって販売されている。当該技術分野において知られた、このような合成のための任意の他の手段も付加的に又は代替的に用いることができる。例えばホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドの製造に同様な方法を用いることも周知である。
【００３５】
本発明のアンチセンス化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物を含まず、アンチセンス分子のｉｎ ｖｉｖｏ合成を操作するように設計された遺伝的ベクター構築体をも含まない。本発明の化合物は、取り入れ、分配及び／又は吸収を助成するために、混合、カプセル封入、コンジュゲート化、又は他の方法で他の分子、分子構造体若しくは化合物の混合物、例えばリポソーム、受容体をターゲットとする分子、経口的、直腸的、局所若しくは他の製剤と結合させることができる。このような取り入れ、分配及び／又は吸収を助成する製剤の製造を教示する、代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第５，１０８，９２１号、第５，３５４，８４４号、第５，４１６，０１６号、第５，４５９，１２７号、第５，５２１，２９１号、第５，５４３，１５８号、第５，５４７，９３２号、第５，５８３，０２０号、第５，５９１，７２１号、第４，４２６，３３０号、第４，５３４，８９９号、第５，０１３，５５６号、第５，１０８，９２１号、第５，２１３，８０４号、第５，２２７，１７０号、第５，２６４，２２１号、第５，３５６，６３３号、第５，３９５，６１９号、第５，４１６，０１６号、第５，４１７，９７８号、第５，４６２，８５４号、第５，４６９，８５４号、第５，５１２，２９５号、第５，５２７，５２８号、第５，５３４，２５９号、第５，５４３，１５２号、第５，５５６，９４８号、第５，５８０，５７５号、及び第５，５９５，７５６号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。
【００３６】
本発明のアンチセンス化合物は、任意の製薬的に受容される塩、エステル若しくはこのようなエステルの塩、又はヒトを含めた動物に投与するときに生物学的に活性な代謝産物又はその残渣を（直接的又は間接的に）与えることができる、任意の他の化合物を包含する。したがって、例えば、この開示は本発明のアンチセンス化合物のプロドラッグ及び製薬的に受容される塩と、このようなプロドラッグの製薬的に受容される塩と、他の生物学的等価物(bioequivalents)にも関する。
【００３７】
“プロドラッグ”なる用語は、不活性形で製造され、身体内又はその細胞内で内因性酵素又は他の化学物質及び／又は条件の作用によって活性形（即ち、薬物）に転化される治療剤を意味する。特に、本発明のアンチセンス化合物のプロドラッグ・バージョンは、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ等へのＷＯ９３／２４５１０（１９９３年１２月９日公開）に又はＩｍｂａｃｈ等へのＷＯ９４／２６７６４に開示された方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として製造される。
【００３８】
“製薬的に受容される塩”なる用語は、本発明の化合物の生理的及び製薬的に受容される塩：即ち、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、それに望ましくない毒物学的効果を与えない塩を意味する。
製薬的に受容される塩基付加塩は金属又はアミン、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属又は有機アミンによって形成される。カチオンとして用いられる金属の例はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適当なアミンの例はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅ等，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９参照）。前記酸性化合物(acidic compounds)の塩基付加塩は、遊離酸形を充分な量の所望の塩基と接触させて、慣用的な方法で塩を得ることによって製造される。塩形を酸と接触させ、遊離酸を慣用的な方法で単離することによって、遊離酸形を再生することができる。遊離酸形はそれらのそれぞれの塩形とは、例えば極性溶媒中の溶解性のような、ある一定の物理的性質において幾らか異なるが、他の点では、本発明のために塩はそれらのそれぞれの遊離酸に等しい。本明細書で用いる限り、“製薬的な付加塩”は本発明の組成物の構成成分の１つの酸形の製薬的に受容される塩を包含する。これらはアミンの有機酸塩又は無機酸塩を包含する。好ましい酸塩は塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の適当な製薬的に受容される塩は当業者に周知であり、多様な有機酸及び無機酸の塩基塩(basic salts)、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸又はリン酸のような無機酸による塩基塩、有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ若しくはホスホ酸(sulfo or phospho acids)、又はＮ−置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、シンナミン酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エムボン酸(embonic acid)、ニコチン酸、又はイソニコチン酸による塩基塩、及び例えば、本質的にタンパク質の合成に関与する２０α−アミノ酸、例えばグルタミン酸若しくはアスパラギン酸のようなアミノ酸による塩基塩、並びにフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−若しくは３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を付随）による塩基塩、又は例えばアスコルビン酸のような、他の酸有機化合物による塩基塩を包含する。化合物の製薬的に受容される塩は製薬的に受容されるカチオンによっても製造することができる。適当な製薬的に受容されるカチオンは当業者に周知であり、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類金属カチオン、アンモニウムカチオン及び第４級アンモニウムカチオンを包含する。炭酸塩又は炭酸水素塩(hydrogen carbonate)も可能である。
【００３９】
オリゴヌクレオチドに関して、製薬的に受容される塩の好ましい例は、非限定的に、（ａ）例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えば、スペルミン及びスペルミジン等のようなカチオンによって形成される塩；（ｂ）例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等のような無機酸によって形成される酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギニン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸によって形成される塩；及び（ｄ）例えば塩素、臭素及びヨウ素のような元素アニオン(elemental anion)から形成される塩を包含する。本発明のアンチセンス化合物は診断法、治療法、予防法のために、並びに研究試薬及びキットとして用いることができる。治療法のためには、サービビン発現をモジュレートすることによって治療することができる疾患又は障害を有すると疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明によるアンチセンス化合物の投与によって治療する。本発明の化合物は、適当な製薬的に受容される希釈剤又はキャリヤーにアンチセンス化合物の有効量を加えることによって薬剤組成物として用いることができる。本発明のアンチセンス化合物及び方法の使用は予防薬としても、例えば、感染、炎症又は腫瘍形成を予防する又は遅延させるためにも有用でありうる。
【００４０】
本発明のアンチセンス化合物は、サービビンをコードする核酸にハイブリダイズし、この事実を利用して、サンドイッチ及び他のアッセイを容易に構成することを可能にするので、研究及び診断法のために有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとサービビンをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野で知られた手段によって検出することができる。このような手段は、オリゴヌクレオチドへの酵素のコンジュゲーション、オリゴヌクレオチドの放射性標識又は任意の他の適当な検出手段を包含しうる。サンプル中のサービビンのレベルを検出するためにこのような検出手段を用いるキットも作成することができる。
【００４１】
本発明はさらに、本発明のアンチセンス化合物を包含する薬剤組成物及び製剤をも包含する。本発明の薬剤組成物は、局所治療又は全身治療のどちらが必要であるかに依存して及び治療すべき領域(area)に依存して、多くの方法で投与することができる。投与は局所的（眼に及び膣投与と直腸投与を含めて粘膜にを包含する）、例えばネブライザーによるを含めて、粉末若しくはエーロゾルの吸入若しくは吹き入れ(insufflation)による肺投与、気管内、鼻腔内、表皮及び経皮投与、経口又は非経口投与でありうる。非経口投与は静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射若しくは注入；又は頭蓋内、例えば髄腔内(intrathecal)若しくは脳室内投与(intraventricular)を包含する。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは経口投与に特に有用であると考えられる。
【００４２】
局所投与用の薬剤組成物及び製剤は経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、座薬、スプレイ、液体及び粉末を包含しうる。慣用的な製薬的キャリヤー、水性基剤、粉末若しくは油性基剤、増粘剤等が必要であるか又は望ましいと考えられる。被覆コンドーム、グローブ(gloves)等も有用でありうる。
【００４３】
経口投与用の組成物及び製剤は、粉末若しくは顆粒、水中若しくは非水性媒質中の懸濁液若しくは溶液、カプセル、サシェ(sachet)は錠剤を包含する。増粘剤、フレーバー剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいと考えられる。
【００４４】
非経口的、髄腔内又は脳室内投与用の組成物及び製剤は、緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤、例えば、非限定的に透過促進剤、キャリヤー化合物(carrier compounds)及び他の製薬的に受容されるキャリヤー又は賦形剤をも含有しうる無菌水溶液を包含しうる。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドを含む製薬的組成物及び／又は製剤は、オリゴヌクレオチドの消化器投与を強化するために透過促進剤を包含することもできる。透過促進剤は５つの広範囲なカテゴリー、即ち、脂肪酸、胆汁塩(bile salts)、キレート化剤、界面活性剤及び非界面活性剤のいずれかに属するとして分類することができる（Ｌｅｅ等，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８，９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１，１−３３）。これらの広範囲なカテゴリーの１つ以上からの１種類以上の透過促進剤を包含することができる。
【００４６】
透過促進剤として作用する種々な脂肪酸及びそれらの誘導体は、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンレエート(recinleate)、モノオレイン（別名、１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸(arichidonic acid)、グリセリル １−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ−及びジ−グリセリド、及びこれらの生理的に受容される塩（即ち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等）を包含する（Ｌｅｅ等，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９１−１９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１、１−３３；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。幾つかの現在好ましい脂肪酸の例はカプリン酸ナトリウムとラウリン酸ナトリウムであり、これらは単独で又は組み合わせて、０．５〜５％の濃度で用いられる。
【００４７】
胆汁の生理的役割りは脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を包含する（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版，Ｈａｒｄｍａｎ等編集，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６，第３８章，９３４−９３５頁）。種々な天然胆汁塩及びそれらの合成誘導体は透過促進剤として作用する。したがって、“胆汁塩”なる用語は、胆汁の天然生成構成成分のいずれか並びにそれらの合成誘導体のいずれかを包含する。
現在好ましい胆汁塩の例はケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及び／又はウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）であり、これらは一般に０．５〜２％の濃度で用いられる。
【００４８】
１種類以上の透過促進剤を含む複合製剤を用いることができる。例えば、胆汁塩を脂肪酸と組み合わせて用いて、複合製剤を製造することができる。好ましい組み合わせは、カプリン酸ナトリウム又はラウリン酸ナトリウム（一般に、０．５〜５％）と組み合わせたＣＤＣＡを包含する。
【００４９】
キレート化剤は、非限定的に、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート(homovanilate)）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９(laureth-9)、及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を包含する（Ｌｅｅ等，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１，１−３３；Ｂｕｕｒ等，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。キレート化剤はＤＮアーゼ阻害剤としても役立つという付加的利点を有する。
【００５０】
界面活性剤は、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを包含する（Ｌｅｅ等，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９１）；及び例えばＦＣ−４３のようなペルフルオロケミカル・エマルジョン(perfluorochemical emulsions)（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２−２５７）を包含する。
【００５１】
非界面活性剤は，例えば不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ等，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９１）と；例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンのような非ステロイド系抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）とを包含する。
【００５２】
本明細書で用いる限り、“キャリヤー化合物”は核酸、又は不活性である（即ち、それ自体は生物学的活性を有さない）が、例えば生物学的に活性な核酸を分解することによって又は循環からのその除去を促進することによって、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを減ずるｉｎ ｖｉｖｏプロセスによって核酸として認識される、核酸の類似体を意味する。核酸とキャリヤー化合物とを、典型的に後者の物質を過剰にして、同時投与すると、恐らく共通の受容体に対する核酸とキャリヤー化合物との競合のために、肝臓、腎臓又は他の循環外溜め(extracirculatory reservoir)中に回収される核酸量の実質的な減少が生じうる。例えば、肝臓組織における部分的ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの回収は、これがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸(polycytidic acid)又は４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与されるときには、減少する（Ｍｉｙａｏ等，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ等，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
【００５３】
キャリヤー化合物とは対照的に、“製薬的に受容されるキャリヤー”（賦形剤）は１種類以上の核酸を動物に投与するための製薬的に受容される溶媒、懸濁化剤又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。製薬的に受容されるキャリヤーは液体でも固体でもよく、特定の薬剤組成物の核酸及び他の構成成分と組み合わされたときに、所望の嵩(bulk)、コンシステンシー等を生じることを念頭において計画された投与方法によって選択される。典型的な、製薬的に受容されるキャリヤーは，非限定的に，結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトースと他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウム等）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウム等）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）を包含する。経口投与される投与形のための持続放出経口投与系及び／又は腸溶性被膜は、米国特許第４，７０４，２９５号；第４，５５６，５５２号；第４，３０９，４０６号；及び第４，３０９，４０４号に記載されている。
【００５４】
本発明の組成物は、薬剤組成物中に慣用的に見出される他の補助的構成成分を、それらの技術上確立された使用レベルで付加的に含有することができる。したがって、例えば、組成物は付加的な、相容性の、製薬的に活性な物質、例えばかゆみ止め剤、収斂薬(astringents)、局部麻酔薬若しくは抗炎症薬を含有することができる、又は本発明の組成物の種々な投与形を物理的に製剤化するために有用な付加的な物質、例えば染料、フレーバー剤、保存剤、酸化防止剤、不透明化剤、増粘剤及び安定剤を含有することができる。しかし、このような物質は、加えたときに、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を不当に妨害してはならない。
【００５５】
本発明のアンチセンス化合物を患者に導入する方法に関係なく、コロイド状分散系を投与ビヒクルとして用いて、化合物のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化する及び／又は化合物に特定の器官、組織若しくは細胞種類をターゲットとさせることができる。コロイド状分散系は、非限定的に、マクロ分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、並びに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム及び特徴のない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体を包含する脂質ベース系(lipid-based systems)を包含する。好ましいコロイド状分散系は多くのリポソームである。リポソームは、二層形状で配置された脂質から成る１つ以上の外層（単数又は複数）によって囲まれた水性コアを有する顕微鏡的球(microscopic spheres)である（一般に、Ｃｈｏｎｎ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８−７０８を参照のこと）。
【００５６】
本発明のある一定の実施態様は、（ａ）１種類以上のアンチセンス化合物と、（ｂ）非アンチセンス機構によって機能する１種類以上の他の化学療法剤とを含有する、リポソーム及び他の組成物を提供する。このような化学療法剤の例は、非限定的に、例えばダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン(floxuridine)（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を包含する。一般的には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，第１５版，Ｂｅｒｋｏｗ等編集，１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１２０６〜１２２８頁参照。非限定的に非ステロイド系抗炎症薬及びコルチコステロイドを包含する抗炎症薬と、非限定的にリビビリン(ribivirin)、ビダラビン、アシクロビル(acyclovir)及びガンシクロビル(ganciclovir)を包含する抗ウイルス薬も本発明の組成物に組み合わせることができる。一般的には、それぞれ、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，第１５版，Ｂｅｒｋｏｗ等編集，１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，２４９９−２５０６頁と、４６−４９頁参照。他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内である。２種類以上の組み合わせた化合物を一緒に又は連続的に用いることができる。
【００５７】
他の関連実施態様では、本発明の組成物は第１核酸をターゲットとする１種類以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドと、第２核酸ターゲットを標的とする１種類以上の付加的なアンチセンス化合物とを含有することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、非限定的に、本出願と共通に所有され、本明細書に援用される上記米国特許又は係属出願、又は上記公開ＰＣＴ出願に開示される下記ターゲットに向けられるものを包含する：ｒａｆ（ＷＯ９６／３９４１５、ＷＯ９５／３２９８７と、米国特許第５，５６３，２５５号及び第５，６５６，６１２号）、ｐ１２０核小体抗原（ＷＯ９３／１７１２５と米国特許第５，６５６，７４３号）、タンパク質キナーゼＣ（ＷＯ９５／０２０６９、ＷＯ９５／０３８３３及びＷＯ９３／１９２０３）、多重薬物耐性関連タンパク質（ＷＯ９５／１０９３８と米国特許第５，５１０，２３９号）、転写因子ＡＰ−１のサブユニット（係属出願の米国特許出願第０８／８３７，２０１号，１９９７年４月１４日出願）、Ｊｕｎキナーゼ（係属出願の米国特許出願第０８／９１０，６２９号，１９９７年８月１３日出願）、ＭＤＲ−１（多重薬物耐性糖タンパク質；係属出願の米国特許出願第０８／７３１，１９９号，１９９７年９月３０日出願）、ＨＩＶ（米国特許第５，１６６，１９５号と第５，５９１，６００号）、ヘルペスウイルス（米国特許第５，２４８，６７０号と第５，５１４，５７７号）、サイトメガロウイルス（米国特許第５，４４２，０４９号と第５，５９１，７２０号）、乳頭腫ウイルス（米国特許第５，４５７，１８９号）、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（米国特許第５，５１４，７８８号）、５−リポキシゲナーゼ（米国特許第５，５３０，１１４号）並びにインフルエンザウイルス（米国特許第５，５８０，７６７号）。２種類以上の組み合わせた化合物を一緒に又は連続的に用いることができる。
【００５８】
治療用組成物の製剤化とそれらのその後の投与とは、当業者の熟練の範囲内であると考えられる。投与は治療されるべき疾患状態の重症度と応答性(responsiveness)とに依存し、治療経過は数日間から数か月間まで、又は治癒が生じるまで、又は疾患状態の軽減が達成されるまで持続する。最適の投与計画は患者の体内の薬物蓄積の測定から算出されうる。通常に熟練した人は最適投与量、投与方法及び反復速度(repetition rates)を容易に決めることができる。最適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化する可能性があり、一般にｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であると発見されたＥＣ₅₀ｓに基づいて見積もられうる。一般に、投与量は０．０１μｇ〜１００ｇ／体重ｋｇであり、１日間に、１週間に、１か月間に若しくは１年間に１回以上、又は２〜２０年間毎に１回でさえも投与されうる。当業者は体液又は身体組織中の薬物の測定された滞留時間及び濃度に基づいて投与の反復速度を容易に推定することができる。上首尾な治療後に、疾患状態の再発を防止するために、オリゴヌクレオチドを１日間に１回以上から２０年間毎に１回まで０．０１μｇ〜１００ｇ／体重ｋｇの範囲内の維持用量で投与することから成る維持療法を患者に受けさせることが望ましいと考えられる。
【００５９】
本発明をある一定のその好ましい実施態様に従って詳しく説明したが、次の実施例は本発明を例示するためにのみ役立つものであり、本発明を限定するとは意図されないものである。
【００６０】
実施例
実施例１
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホロアミダイト
デオキシ及び２’−アルコキシアミダイト
２’−デオキシ及び２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは商業的供給源（例えば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）から購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書に援用される米国特許第５，５０６，３５１号に記載されたように製造する。２’−アルコキシアミダイトを用いるオリゴヌクレオチドの合成のために、テトラゾールと塩基とのパルス投与(pulse delivery)後の待機段階(wait step)を３６０秒間に高めた以外は、非修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを用いた。
【００６１】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを公開方法［Ｓａｎｇｈｖｉ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，２１，３１９７−３２０３］に従って商業的に入手可能なホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ又はＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ）を用いて合成した。
【００６２】
２’−フルオロアミダイト
２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２’−フルオロオリゴヌクレオチドを既述されたように［Ｋａｗａｓａｋｉ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１及び本明細書に援用される米国特許第５，６７０，６３３号］合成した。簡単に説明すると、保護されたヌクレオシド Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを商業的に入手可能な９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発物質として用いて、２’−α−フルオロ原子を導入する文献方法を２’−β−トリチル基のＳ_N２−置換によって修飾することによって合成した。このようにして、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−アラビノフラノシルアデニンは３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として中程度の収率で選択的に保護された。ＴＨＰとＮ６−ベンゾイル基との脱保護は標準方法論を用いて達成され、標準方法を用いて、５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）と５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイト中間体とを得た。
【００６３】
２’−フルオロデオキシグアノシン
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成を、出発物質としてのテトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンと、中間体のジイソブチリル−アラビノフラノシルグアノシンへの転化とを用いて達成した。ＴＰＤＳ基の脱保護に続いて、ヒドロキシル基のＴＨＰによる保護を行って、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的Ｏ−デアシル化及びトリフラート化(triflation)に続いて、粗生成物をフルオリド(fluoride)によって処理して、次にＴＨＰ基を脱保護した。標準方法論を用いて、５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得た。
【００６４】
２’−フルオロウリジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成を、２，２’−アンヒドロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジンによって処理する文献方法の修飾によって達成した。標準方法を用いて、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得た。
【００６５】
２’−フルオロデオキシシチジン
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化によって合成して、続いて選択的に保護して、Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準方法を用いて、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得た。
【００６６】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト
２’−Ｏ−メトキシエチル−置換ヌクレオシドアミダイトを次のように、又は代替え的に、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４の方法によって製造する。
【００６７】
２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子市、日本から商業的に入手可能）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ）及び炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍｌ）に加えた。この混合物を撹拌しながら加熱還流させ、発生二酸化炭素ガスを制御した方法で放出させた。１時間後に、やや暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル（２．５リットル）中に撹拌しながら注入した。生成物はガムを形成した。エーテルをデカントして、残渣を最少量のメタノール（約４００ｍｌ）に溶解した。この溶液を新鮮なエーテル（２．５リットル）中に注入して、硬質ガムを得た。エーテルをデカントして、ガムを真空炉（１ｍｍＨｇ、６０℃において２４時間）で乾燥させて、固体を得て、これを粉砕して、明黄褐色粉末（５７ｇ、８５％粗収率）を得た。ＮＭＲスペクトルはそのナトリウム塩としてのフェノール（約５％）によって汚染された構造に一致した。この物質をさらなる反応のためにそのまま用いた（又は、この物質を酢酸エチル中メタノールの勾配（１０〜２５％）を用いて、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、白色固体、ｍｐ２２２〜４℃を得ることができる）。
【００６８】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２リットル）を２リットルのステンレス鋼圧力容器に加えて、１６０℃の予熱した油浴に入れた。１５５〜１６０℃において４８時間加熱した後に、容器を開放して、溶液を蒸発乾燥させて、ＭｅＯＨ（２００ｍｌ）を加えて摩砕した。残渣を熱アセトン（１リットル）中に懸濁させた。不溶性塩を濾過し、アセトン（１５０ｍｌ）によって洗浄して、濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ₃ＣＮ（６００ｍｌ）中に溶解して、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を０．５％Ｅｔ₃ＮＨ含有ＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）によって充填した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍｌ）中に溶解して、シリカ（１５０ｇ）に吸着させてから、カラムに装填した。生成物を充填溶媒(packing solvent)によって溶出して、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。不純な画分を再処理して(reworking)、付加的な物質を得た。
【００６９】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍｌ）と同時蒸発させ、乾燥した残渣をピリジン（１．３リットル）中に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの第１アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、混合物を室温において１時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの第２アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、反応をさらに１時間撹拌した。次に、メタノール（１７０ｍｌ）を加えて、反応を停止させた。ＨＰＬＣは約７０％生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ₃ＣＮ（２００ｍｌ）を加えて摩砕した。残渣をＣＨＣｌ₃（１．５リットル）中に溶解し、２ｘ５００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃と２ｘ５００ｍｌの飽和ＮａＣｌとによって抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。２７５ｇの残渣が得られた。この残渣を、０．５％Ｅｔ₃ＮＨ含有ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）によって充填し、溶出する３．５ｋｇのシリカゲルカラム上で精製した。純粋な画分を蒸発させて、１６４ｇの生成物を得た。不純な画分からさらに約２０ｇを得て、総収量１８３ｇ（５７％）を得た。
【００７０】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍｌのＤＭＦと１８８ｍｌのピリジンとから製造した３：１混合物、７５０ｍｌ）及び無水酢酸（２４．３８ｍｌ，０．２５８Ｍ）を一緒にして、室温において２４時間撹拌した。反応をｔｌｃによって、ｔｌｃサンプルにＭｅＯＨを添加して最初にクエンチすることによって、モニターした。ｔｌｃによって判定される反応の完了時に、ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）を加えて、混合物を３５℃において蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ₃（８００ｍｌ）中に溶解し、２ｘ２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムと２ｘ２００ｍｌの飽和ＮａＣｌとによって抽出した。水層を２００ｍｌのＣＨＣｌ₃によって逆抽出した。一緒にした有機層(organic)を硫酸ナトリウムによって乾燥させ、蒸発させて、１２２ｇの残渣（約９０％の生成物）を得た。残渣を３．５ｋｇのシリカゲルカラム上で精製して、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を用いて溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させて、９６ｇ（８４％）を得た。後の画分(later fractions)からさらに１．５ｇを回収した。
【００７１】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（７００ｍｌ）中に溶解することによって、第１溶液を製造して、かたわらに置いた。トリエチルアミン（１８９ｍｌ，１．４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（１リットル）中のトリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）の溶液に加えて、−５℃に冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて０．５時間撹拌した。０〜１０℃に維持した撹拌溶液に、ＰＯＣｌ₃を３０分間にわたって滴加し、得られた混合物をさらに２時間攪拌した。第１溶液を後者の溶液に４５分間にわたって滴加した。得られた反応混合物を低温室内で一晩貯蔵した。この反応混合物から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１リットル）中に溶解し、不溶性固体を濾過によって除去した。濾液を１ｘ３００ｍｌのＮａＨＣＯ₃と２ｘ３００ｍｌの飽和ＮａＣｌとによって洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣にＥｔＯＡｃを加えて、摩砕し、標題化合物を得た。
【００７２】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
ジオキサン（５００ｍｌ）とＮＨ₄ＯＨ（３０ｍｌ）中の３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）の溶液を室温において２時間撹拌した。このジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍｌ）と共沸蒸留した。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍｌ）中に溶解して、２リットルのステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ₃ガスによって飽和したＭｅＯＨ（４００ｍｌ）を加えて、容器を１００℃に２時間加熱した（ｔｌｃは完了した転化を示した）。容器内容物を蒸発乾燥させ、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）中に溶解して、飽和ＮａＣｌ（２００ｍｌ）によって１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、８５ｇ（９５％）の標題化合物を得た。
【００７３】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍｌ）中に溶解し、無水安息香酸（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間攪拌した後に、ｔｌｃは反応がほぼ９５％完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２００ｍｌ）と共沸蒸留した。残渣をＣＨＣｌ₃（７００ｍｌ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ₃（２ｘ３００ｍｌ）と飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍｌ）によって抽出し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、蒸発させて、残渣（９６ｇ）を得た。残渣を溶離溶媒として０．５％Ｅｔ₃ＮＨ含有ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を用いて１．５ｋｇシリカカラム上でクロマトグラフィーした。純粋な生成物画分を蒸発させて、９０ｇ（９０％）の標題化合物を得た。
【００７４】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１リットル）中に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）と２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスフィット（４０．５ｍｌ，０．１２３Ｍ）とを窒素雰囲気下で撹拌しながら加えた。得られた混合物を室温において２０時間攪拌した（ｔｌｃは反応が９５％完了したことを示した）。この反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ₃（１ｘ３００ｍｌ）と飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍｌ）によって抽出した。水性洗液(aqueous washes)をＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍｌ）によって逆抽出し、抽出物を一緒にして、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮した。得られた残渣を溶離溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を用いて１．５ｋｇシリカカラム上でクロマトグラフィーした。純粋な画分を一緒にして、９０．６ｇ（８７％）の標題化合物を得た。
【００７５】
２’−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトと２’−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
アミノオキシエチル及びジメチルアミノオキシエチルアミダイトを米国特許出願第１０／０３７，１４３号（１９９８年２月１４日出願）と第０９／０１６，５２０号（１９９８年１月３０日出願）との方法によって製造する、これらの出願の各々は本出願と共通に所有され、本明細書に援用される。
【００７６】
実施例２
オリゴヌクレオチド合成
非置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを自動化ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル３８０Ｂ）で、ヨウ素による酸化に関する標準ホスホロアミダイト化学を用いて合成する。
【００７７】
ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に、但し、標準酸化ボトルをホスフィット結合(phosphite linkages)の段階的硫黄化(thiation)のためにアセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液に代えて、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を合成する。硫黄化待機段階は６８秒間に延長し、この段階に続いて、キャッピング段階を行った。ＣＰＧカラムから切断し、５５℃の濃水酸化アンモニウム中で脱ブロックした（１８時間）後に、オリゴヌクレオチドを０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液から２．５倍量のエタノールによって２回沈降させることによって、精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチド(phosphinate oligonucleotides)を、本明細書に援用される米国特許第５，５０８，２７０号に記載されるように製造する。
【００７８】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように製造する。
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許第５，６１０，２８９号又は第５，６２５，０５０号に記載されるように製造する。
【００７９】
ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許第５，２５６，７７５号又は米国特許第５，３６６，８７８号に記載されるように製造する。
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれ、ＷＯ９４／１７０９３及びＷＯ９４／０２４９９として公開）に記載されるように製造する。
【００８０】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデートオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許第５，４７６，９２５号に記載されるように製造する。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許第５，０２３，２４３号に記載されるように製造する。
【００８１】
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，１３０，３０２号と第５，１７７，１９８号（両方とも、本明細書に援用される）に記載されるように製造する。
【００８２】
実施例３
オリゴヌクレオシド合成
ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及びアミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及びアミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、並びに例えば交互のＭＭＩとＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓ結合を有する混合バックボーン化合物を、米国特許第５，３７８，８２５号、第５，３８６，０２３号、第５，４８９，６７７号、第５，６０２，２４０号及び第５，６１０，２８９号（これらの総ては本明細書に援用される）に記載されるように製造する。
【００８３】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドを、本明細書に援用される、米国特許第５，２６４，５６２号と第５，２６４，５６４号に記載されるように製造する。
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドを、本明細書に援用される米国特許第５，２２３，６１８号に記載されるように製造する。
【００８４】
実施例４
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡ）：合成、性質及び可能な用途、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３に記載される、種々な方法のいずれかによって、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を製造する。これらは、本明細書に援用される、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７００，９２２号及び第５，７１９，２６２号によっても製造することができる。
【００８５】
実施例５
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又は混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは幾つかの異なる種類でありうる。これらは、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの５’ウィングと３’ウィングセグメントとの間に配置されている第１型と、“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の３’末端又は５’末端のいずれかに配置されている第２“開放末端(open end)”型とを包含する。第１型のオリゴヌクレオチドは“ギャップマー”又はギャップ化(gapped)オリゴヌクレオチドとしても当該技術分野において知られる。第２型のオリゴヌクレオチドは“ヘミマー(hemimers)”又は“ウィングマー(wingmers)”としても当該技術分野において知られる。
【００８６】
［２’−Ｏ−Ｍｅ］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエート及び２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化ＤＮＡ合成装置モデル３８０Ｂを用いて上記のように合成する。自動化合成装置と、ＤＮＡ部分のための２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトと、５’及び３’ウィングのための５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトとを用いて、オリゴヌクレオチドを合成する。テトラゾールと塩基を供給した後の待機段階を６００秒間に延長することによって標準合成サイクルを改変して、ＲＮＡに対しては４回、２’−Ｏ−メチルに対しては２回繰り返す。完全に保護されたオリゴヌクレオチドをサポートから切断して、リン酸基を３：１アンモニア／エタノール中で室温において一晩脱保護してから、乾燥するまで凍結乾燥する。次に、室温における２４時間のメタノール性アンモニア中での処理を行って、総ての塩基を脱保護して、サンプルを再び乾燥するまで凍結乾燥させた。ペレットをＴＨＦ中１Ｍ ＴＢＡＦ中に室温において２４時間再懸濁させて、２’位置を脱保護する。次に、１Ｍ ＴＥＡＡによって反応をクエンチし、次に、サンプルを回転蒸発させて(rotovac)、１／２量に減少してから、Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩する(desalted)。次に、回収されたオリゴ(oligo)を収量と純度に関して、毛管電気泳動と質量スペクトロメトリーとによって分光測光的に分析する。
【００８７】
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上記方法によって、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを用いて製造した。
【００８８】
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２’−デオキシホスホロチオエート］−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２’−デオキシホスホロチオエート］−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上記方法によって、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを用い、キメラ構造のウィング部分内にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を形成するためにヨウ素によって酸化し、中央ギャップのためにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を形成するために３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を用いて硫化して製造する。
【００８９】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書に援用される米国特許第５，６２３，０６５号に従って合成する。
【００９０】
実施例６
オリゴヌクレオチド単離
制御多孔質ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、５５℃の濃水酸化アンモニウム中で１８時間脱ブロックした後に、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドを０．５Ｍ ＮａＣｌから２．５倍量のエタノールによって２回沈降させることによって精製する。合成されたオリゴヌクレオチドを変性ゲル(denaturing gels)上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、少なくとも８５％の全長物質であると判定した。合成で得られるホスホロチオエート結合とホスホジエステル結合との相対的量を³¹Ｐ核磁気共鳴スペクトロメトリーによって定期的にチェックし、幾つかの研究のために、オリゴヌクレオチドをＣｈｉａｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，１８１６２−１８１７１に記載されるように、ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ−精製物質によって得られた結果はｎｏｎ−ＨＰＬＣ精製物質によって得られた結果に類似した。
【００９１】
実施例７
オリゴヌクレオチド合成−９６穴プレートフォーマット
標準９６穴フォーマットにおいて９６配列を同時にアセンブルする(assembling)ことができる自動化合成装置での固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミダイト化学によって、オリゴヌクレオチドを合成した。ヨウ素水溶液による酸化によって、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を与えた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を用いた硫化によって形成した。標準塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは商業的な販売者（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，又はＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。非標準ヌクレオシドは既知文献又は特許化された方法によって合成する。これらは塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして用いる。
【００９２】
オリゴヌクレオチドをサポートから切断し、高温（５５〜６０℃）の濃ＮＨ₄ＯＨ中で１２〜１６時間脱保護し、次に、放出された生成物を真空下で乾燥させた。次に、乾燥した生成物を無菌水中に再懸濁させて、マスタープレートを得て、その後、これから総ての分析及び試験プレートサンプルを自動式ピペッター(robotic pipettors)を用いて希釈する。
【００９３】
実施例８
オリゴヌクレオチド分析−９６穴プレートフォーマット
各穴中のオリゴヌクレオチドの濃度を、サンプルの希釈とＵＶ吸収スペクトロスコピーとによって評価した。個々の生成物の全長統合性(full-length integrity)を、９６穴プレートフォーマット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ^TM ＭＤＱ）又は、個別に調製されたサンプルに対しては、商業的ＣＥ装置（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ^TM ５０００，ＡＢＩ ２７０）のいずれかにおける毛管電気泳動（ＣＥ）によって評価した。エレクトロスプレイ−質量スペクトロスコピーを用いた化合物の質量分析によって、塩基とバックボーン組成を確認した。総てのアッセイ試験プレートを単一及びマルチ−チャンネル自動式ピペッターを用いて、マスタープレートから希釈した。プレート上の化合物の少なくとも８５％が少なくとも８５％全長である場合に受容されうると、プレートは判定された。
【００９４】
実施例９
細胞培養とオリゴヌクレオチド処理
ターゲット核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は多様な細胞種類のいずれにおいても、ターゲット核酸が測定可能なレベルで存在する限り、試験することができる。これは、例えば、ＰＣＲ又はノーザンブロット分析を用いてルーチンに測定することができる。次の４細胞種類は例示のために提供するものであり、他の細胞種類もルーチンに使用可能である。
【００９５】
Ｔ−２４細胞：
移行上皮性膀胱癌(transitional cell bladder carcinoma)細胞系Ｔ−２４をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と、ペニシリン １００単位／ｍｌと、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とを補充した完全ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で、Ｔ−２４細胞をルーチンに培養した。細胞が９０％集密度(confluence)に達したときに、細胞をトリプシン処理と希釈とによって、ルーチンに継代培養した。細胞をＲＴ−ＰＣＲ分析に用いるために７０００細胞／穴の密度において９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）中に接種した。
【００９６】
ノーザンブロッティング又は他の分析のためには、細胞を１００ｍｍ及び他の標準組織培養プレート上に接種して、適当な量の培地とオリゴヌクレオチドとを用いて、同様に処理した。
【００９７】
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞系Ａ５４９をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と、ペニシリン １００単位／ｍｌと、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とを補充したＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で、Ａ５４９細胞をルーチンに培養した。細胞が９０％集密度に達したときに、細胞をトリプシン処理と希釈とによって、ルーチンに継代培養した。
【００９８】
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。提供者によって薦められたように補充した線維芽細胞増殖培地(Fibroblast Growth Medium)（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）中に、ＮＨＤＦｓをルーチンに維持した。細胞を提供者によって薦められたように１０継代まで維持した。
【００９９】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胚性ケラチノサイト（ＨＥＫ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＨＥＫｓを提供者によって薦められたように処方したケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中にルーチンに維持した。細胞を提供者によって薦められたように１０継代まで維持した。
【０１００】
アンチセンス化合物による処理
細胞が８０％集密度に達したときに、細胞をオリゴヌクレオチドによって処理した。９６穴プレートで増殖した細胞に関しては、穴を２００μｌ ＯＰＴＩ−ＭＥＭ^TM−１還元血清培地(reduced-serum medium)（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によって１回洗浄し、次に、３．７５μｇ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^TM（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と１５０ｎＭの最終濃度の望ましいオリゴヌクレオチドとを含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ^TM−１ １３０μｌによって処理した。４時間の処理後に、培地を新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチド処理後１６時間に細胞を回収した。
【０１０１】
実施例１０
サービビン発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
サービビン発現のアンチセンスモジュレーションは当該技術分野において知られた多様な方法で分析することができる。例えば、サービビンｍＲＮＡレベルを例えばノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量することができる。リアルタイム定量ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ分析は総細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して行うことができる。ＲＮＡ単離方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，４．１．１−４．２．９頁と４．５．１−４．５．３頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示される。ノーザンブロット分析は当該技術分野においてルーチンであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，４．２．１−４．２．９頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６に教示される。リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから得られ、製造者の指示に従って用いられる、商業的に入手可能なＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^TM７７００配列検出系を用いて好都合に達成することができる。他のＰＣＲ方法も当該技術分野において知られている。
【０１０２】
サービビンタンパク質レベルは当該技術分野において周知の多様な方法、例えば、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で定量することができる。サービビンに対する抗体も同定することができ、多様な供給源、例えば、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）から入手可能であるが、又は慣用的な抗体作製方法によって製造することができる。ポリクローナル抗血清の製造方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２巻，１１．１２．１−１１．１２．９頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。モノクローナル抗体の製造方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２巻，１１．４．１−１１．１１．５頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。
【０１０３】
免疫沈降は当該技術分野において標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２巻，１０．１６．１−１０．１６．１１頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８に見出すことができる。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２巻，１０．８．１−１０．８．２１頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に見出すことができる。
酵素結合免疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］は、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２巻，１１．２．１−１１．２．２２頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１に見出すことができる。
【０１０４】
実施例１１
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡをＭｉｕｒａ等，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，４２，１７５８−１７６４に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離の他の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，４．５．１−４．５．３頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示されている。簡単に説明すると、９６穴プレートでの細胞増殖に関して、増殖培地を細胞から除去して、各穴を２００μｌの冷ＰＢＳによって洗浄した。６０μｌのライシス緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）を各穴に加え、プレートを穏やかに撹拌し、次に、室温において５分間インキュベートした。５５μｌの溶解産物(lysate)をＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）塗布９６穴プレート（ＡＧＣＴ Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）に移した。プレートを室温において６０分間インキュベートし、２００μｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＮａＣｌ）によって３回洗浄した。最終洗浄後に、プレートをペーパータオル上にブロットして、過剰な洗浄緩衝液を除去してから、５分間風乾させた。７０℃に予熱した６０μｌの溶離緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）を各穴に加え、プレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートし、次に、溶離液(eluate)を新たな９６穴プレートに移した。
【０１０５】
１００ｍｍ又は他の標準プレート上に増殖させた細胞を適当な量のあらゆる溶液を用いて同様に処理することができる。
【０１０６】
実施例１２
総ＲＮＡ単離
Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）から購入したＲＮＥＡＳＹ ９６^TMキットと緩衝液を用いて、製造者の薦める方法に従って、総ｍＲＮＡを単離した。簡単に説明すると、９６穴プレートで増殖した細胞に関して、増殖培地を細胞から除去して、各穴を２００μｌの冷ＰＢＳによって洗浄した。１００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴを各穴に加え、プレートを激しく２０秒間撹拌した。次に、１００μｌの７０％エタノールを各穴に加え、上下に３回ピペッティングすることによって、内容物を混合した。次に、サンプルを、廃棄物回収トレーを備え、真空源に取り付けられたＱＩＡＶＡＣ^TMマニホルドに取り付けたＲＮＥＡＳＹ９６^TM穴プレートに移した。真空を１５秒間適用した。１ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ ９６^TM穴プレートの各穴に加え、真空を再び１５秒間適用した。次に、１ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ ９６^TMプレートの各穴に加え、真空を１５秒間の期間適用した。次に、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ洗浄を繰り返し、真空をさらに１０分間適用した。次に、プレートをＱＩＡＶＡＣ^TMマニホルドから取り出し、ペーパータオル上に乾式ブロットした。次に、プレートを、１．２ｍｌ回収管を含有する回収管ラックを備えたＱＩＡＶＡＣ^TMマニホルドに再び取り付けた。次に、各穴中に６０μｌ水をピペッティングし、１分間インキュベートしてから、３０秒間真空を適用することによって、ＲＮＡを溶離した。この溶離段階をさらなる６０μｌの水によって繰り返した。
【０１０７】
実施例１３
サービビンｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^TM７７００配列検出系（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、製造者の指示に従ったリアルタイム定量ＰＣＲによって、サービビンｍＲＮＡレベルの定量を行った。これは密閉管式非ゲル性蛍光検出系(closed-tube,non-gel-based,fluorescence detection system)であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の高スループット定量をリアルタイムで可能にする。ＰＣＲが完了した後に増幅生成物を定量する標準ＰＣＲとは反対に、リアルタイム定量ＰＣＲでは生成物が累積する(accumulate)につれて、生成物を定量する。これはＰＣＲ反応に、フォワードＰＣＲプライマーとリバース(reverse)ＰＣＲプライマーとの間に特異的にアニールし、２つの蛍光染料を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含めることによって、達成される。リポーター染料（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ又はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手される、ＪＯＥ又はＦＡＭ）はプローブの５’末端に取り付けられ、クエンチャー(quencher)染料（例えば、、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ又はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手される、ＴＡＭＲＡ）はプローブの３’末端に取り付けられる。プローブと染料とが完全であるときに、リポーター染料放出は３’クエンチャー染料の接近(proximity) によってクエンチされる。増幅中に、ターゲット配列へのプローブのアニーリングが、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼによって切断されうる基質を形成する。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長段階中に、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断がリポーター染料を残部のプローブから（したがって、クエンチャー部分から）放出して、配列特異性蛍光シグナルが発生する。各サイクルによって、付加的なリポーター染料分子がそれらのそれぞれのプローブから切断されて、蛍光強度が規則的な（６秒間）間隔で、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^TM７７００配列検出系に組み込まれたレーザー光学装置によってモニターされる。各アッセイにおいて、非処理対照サンプルからのｍＲＮＡの連続希釈物を含有する一連の平行反応が、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害％を定量するために用いられる標準曲線を作成する。
【０１０８】
ＰＣＲ試薬はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手された。２５μｌのＰＣＲカクテル（１ｘＴＡＱＭＡＮ^TM緩衝液Ａ、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの各々、６００μＭのｄＵＴＰ、１００ｎＭのフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの各々、２０単位のＲＮＡｓｅ阻害剤、１．２５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ^TM、及び１２．５単位のＭｕＬＶ逆トランスクリプターゼ）を２５μｌのポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液を含有する９６穴プレートに加えることによって、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ反応は４８℃における３０分間のインキュベーションによって行った。ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ^TMを活性化するための９５℃における１０分間のインキュベーション後に、二段階ＰＣＲプロトコール：９５℃において１５秒間（変性）と、その後の６０℃において１．５分間（アニーリング／伸長）の４０サイクルを行った。サービビンプローブとプライマーは公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｕ７５２８５、配列番号：１として本明細書に援用）を用いて、ヒトサービビン配列にハイブリダイズするように設計された。
【０１０９】
サービビンに関して、ＰＣＲプライマーは次の通りであった：
フォワードプライマー：ＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡ（配列番号：２）；リバースプライマー：ＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡＧＴ（配列番号：３）；及びＰＣＲプローブは次の通りであった：ＦＡＭ−ＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号：４）、この配列においてＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は蛍光リポーター染料であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）はクエンチャー染料である。
【０１１０】
ＧＡＰＤＨに関して、ＰＣＲプライマーは次の通りであった：
フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号：５）；リバースプライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号：６）；及びＰＣＲプローブは次の通りであった：５’ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号：７）、この配列においてＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は蛍光リポーター染料であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）はクエンチャー染料である。
【０１１１】
実施例１４
サービビンｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理後１８時間に、細胞単層を冷ＰＢＳによって２回洗浄してから、１ｍｌ ＲＮＡＺＯＬ^TM（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ”Ｉｎｃ．Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）中で溶解させた。製造者の薦めるプロトコールに従って、総ＲＮＡを調製した。２０μｇの総ＲＮＡをＭＯＰＳバッファー系（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を用いて、１．１％ホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲルを通しての電気泳動によって分画した。ＲＮＡをゲルからＨＹＢＯＮＤ^TM−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に、ノーザン／サザントランスファーバッファー系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ”Ｉｎｃ．Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いた一晩毛管移送(overnight capillary transfer)によって移した。ＲＮＡ移送はＵＶ視覚化によって確認した。ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ^TMＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ＵＶ架橋によって、膜を固定した。
【０１１２】
フォワードプライマー：ＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡ（配列番号：２）とリバースプライマー：ＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡＧＴ（配列番号：３）とを用いたＰＣＲによって作製されたサービビン特異性プローブによって、ＱＵＩＣＫＨＹＢ^TMハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、厳しい条件に関する製造者の勧告に従って膜を検査した。負荷及び移送効率の変動を標準化するために、膜を細片化して(stripped)、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｅ，ＣＡ）に関して検査した。ハイブリダイズした膜をＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^TMとＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ^TMソフトウェア Ｖ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、視覚化して、定量した。データを非処理対照におけるＧＡＰＤＨレベルに合わせて標準化した。
【０１１３】
実施例１５
サービビン発現のアンチセンス阻害−ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド
本発明によると、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｕ７５２８５、配列番号：１として本明細書に援用）を用いて、ヒトサービビンＲＮＡの種々な領域をターゲットとするように、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドは表１に示す。ターゲット部位は、配列源資料(sequence source reference)（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号：Ｕ７５２８５）に記載されるように、オリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号によって表示する。表１の総ての化合物は、全体を通してホスホロチオエートバックボーン（ヌクレオシド間結合）を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。これらの化合物をサービビンｍＲＮＡレベルに対する効果に関して、本明細書の他の実施例に記載したような定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは３回の実験から平均する。存在する場合の“Ｎ．Ｄ．”は“データなし”を意味する。
【０１１４】
表１
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによるサービビンｍＲＮＡレベルの阻害
【表１】

【０１１５】
表１に示すように、配列番号：１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２３、２８、３１、３２、３４、３９、４０、４１、４２，４３及び４７は、このアッセイにおいて、サービビン発現の少なくとも３０％阻害を示した、それ故、好ましい。
【０１１６】
実施例１６
サービビン発現のアンチセンス阻害−ホスホロチオエート２’−ＭＯＥギャップマーオリゴヌクレオチド
本発明によると、ヒトサービビンをターゲットとするオリゴヌクレオチドの第２シリーズを合成した。これらのオリゴヌクレオチド配列は表２に示す。ターゲット部位は、配列源資料（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号：Ｕ７５２８５）に記載されるように、オリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号によって表示する。
【０１１７】
表２の総ての化合物は、両側（５’方向と３’方向）で４ヌクレオチド“ウィング”によって隣接される、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから成る中央“ギャップ”領域から構成される、１８ヌクレオチド長さのキメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー”）である。これらのウィングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチドを通してのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２’−ＭＯＥウィング中のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０１１８】
データは、本明細書の他の実施例に記載したような定量的リアルタイムＰＣＲによって得て、３回の実験から平均する。存在する場合の“Ｎ．Ｄ．”は“データなし”を意味する。
【０１１９】
表２
２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるサービビンｍＲＮＡレベルの阻害
【表２】

【０１２０】
表２に示すように、配列番号：１１、１６、１９、２１、２３、２７、３１、３４、３８、３９、４２及び４３は、この実験において、サービビン発現の少なくとも３０％阻害を示した、それ故、好ましい。
【０１２１】
実施例１７
サービビンタンパク質レベルのウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）は標準方法を用いて実施する。オリゴヌクレオチド処理後１６〜２０時間に、細胞を回収して、ＰＢＳによって１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（１００μｌ／穴）中に懸濁させ、５分間沸騰させてから、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷させる。ゲルを１５０Ｖにおいて１．５時間ランし、ウェスタンブロッティングのために膜に移す。サービビンに対する適当な一次抗体を、この一次抗体種に対する放射性標識した又は蛍光標識した二次抗体と共に用いる。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^TM（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、バンドを視覚化する。
【０１２２】
実施例１８
アポトーシスに対するサービビンアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
ＩＳＩＳ２３７２２と、不適正対照、ＩＳＩＳ２８５９８（ＴＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＡＴＧＴＧＴＴ；配列番号：４８）とを、ＨｅＬａ細胞におけるアポトーシスに対するそれらの効果に関して分析した。カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入して、製造者の勧告に従って用いた。オリゴヌクレオチドなしのＨｅＬａ細胞では、約４％の細胞が低二倍体である（ＤＮＡフラグメント化を意味し、アポトーシスの尺度である）。ＩＳＩＳ２３７２２を添加すると、約２２％の細胞が低二倍体であり、不適正オリゴヌクレオチドによる約１１％と対照的である。カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋ（４２．８ｍＭ）の存在下では、低二倍体（アポトーシス）細胞の％は、オリゴヌクレオチドなしの場合に３％に、ＩＳＩＳ２３７２２によって６％に、及び不適正対照によって４％に低下する。このことは、サービビンのアンチセンス阻害がアポトーシスを高めること、及びこの効果がカスパーゼによって仲介されることを実証する。
【０１２３】
実施例１８
細胞質分裂に対するサービビンのアンチセンス阻害の効果
サービビンをターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３７２２）によって処理したＨｅＬａ細胞が、不適当な細胞分割の結果として大きい多核細胞(multinucleated cell)を形成することを観察することができる。不適正対照オリゴヌクレオチドはこの効果を有さず、細胞は正常であるように見えた（非処理対照に匹敵する）。この効果はフローサイトメトリーによって定量化することができる。
非処理細胞又は対照オリゴヌクレオチドによって処理された細胞は、細胞分割のＧ１期とＧ２／Ｍ期の細胞集団を表す、２つの主要なピークを示す。Ｇ１細胞はそれらのＤＮＡ（１ｘ）の単一コピーを有し、Ｇ２／Ｍ細胞は２コピー（２ｘ）を有する。２４時間〜７２時間にかけて、これらの１ｘ及び２ｘピークは対照オリゴヌクレオチドによって処理された又はオリゴヌクレオチドによって処理されない細胞では実際に無変化に留まる。しかし、サービビンをターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドによって処理された細胞では、細胞の大部分がオリゴ処理後２４時間までＤＮＡの２コピーを有する。このことは、細胞分割が阻止されることを意味する。このオリゴヌクレオチドによる処理後４８時間まで、４ｘピークは１ｘ及び２ｘピークに大きさにおいてほぼ等しく、このことはＤＮＡの１、２及び４コピーを有する細胞数が大体等しいことを意味する。７２時間までに、最大ピークは１６ｘであり、このことは細胞がそれらのＤＮＡの１６コピーを有し、したがって、細胞質の分割が多重世代(multiple generation)のために生じていないことを意味する。したがって、サービビンの阻害は細胞質分裂を妨害することが実証される。
【配列表】

Claims (20)

1. 配列番号：３８を含む、ヒトサービビンをコードする核酸分子をターゲットとする長さ１８〜３０核酸塩基のアンチセンス化合物。
2. 配列番号：３８からなる、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
3. 少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１又は２に記載のアンチセンス化合物。
4. 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項３に記載のアンチセンス化合物。
5. 全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項４に記載のアンチセンス化合物。
6. 少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
7. 修飾された糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項６記載のアンチセンス化合物。
8. 少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
9. 修飾された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項８記載のアンチセンス化合物。
10. 核酸塩基１〜４及び１５〜１８が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含む、請求項２記載のアンチセンス化合物。
11. シチジン残基が５−メチル修飾を含む、請求項１０記載のアンチセンス化合物。
12. 配列番号：３８を含む、ヒトサービビンをコードする核酸分子をターゲットとする長さ１８〜３０核酸塩基のアンチセンス化合物であって、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、５’末端における４個の塩基が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含み、３’末端における４個の塩基が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含む、前記アンチセンス化合物。
13. 各シチジン残基が５−メチル修飾を含む、請求項１２記載のアンチセンス化合物。
14. 配列番号：３８からなるアンチセンス化合物であって、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、核酸塩基１〜４及び１５〜１８が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含む、前記アンチセンス化合物。
15. 各シチジン残基が５−メチル修飾を含む、請求項１４記載のアンチセンス化合物。
16. 製薬的に許容される塩である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
17. 該塩がナトリウム塩である、請求項１６に記載の製薬的に許容される塩。
18. 請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物のナトリウム塩。
19. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物又は請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の塩を、キャリヤー又は希釈剤と共に含む医薬組成物。
20. 請求項１、２及び１２〜１５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物又は請求項１８に記載の塩を、製薬的に許容されるキャリヤー又は希釈剤と共に含む医薬組成物。