ES2332296T3

ES2332296T3 - Modulacion antisentido de la expresion de survivina.

Info

Publication number: ES2332296T3
Application number: ES99948416T
Authority: ES
Inventors: C. Frank Bennett; Elizabeth J. Ackermann; Eric E. Swayze; Lex M. Cowsert
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-09-29
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2010-02-01
Anticipated expiration: 2019-09-23
Also published as: JP2002539073A; EP1117672B1; AU6159899A; DE69941576D1; PT1117672E; EP1117672A1; EP1117672A4; ATE446363T1; DK1117672T3; CA2343102C; CA2343102A1; WO2000018781A1; US6165788A; US6077709A; CY1110633T1; JP3745226B2; AU758545B2

Abstract

Un oligonucleótido antisentido con una longitud de hasta 30 nucleótidos dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la survivina humana, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:10, 12, 15, 16, 18, 20, 21, 23, 28, 31, 32, 34, 38, 39, 40, 41, 42, 43 y 47, o su sal farmacéuticamente aceptable.

Description

Modulación antisentido de la expresión de survivina.

Campo de la invención

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de la survivina. En particular, esta invención se refiere a compuestos antisentido, en particular oligonucleótidos, que se hibridan de forma específica con ácidos nucleicos que codifican la survivina humana. Estos oligonucleótidos han demostrado modular la expresión de la survivina.

Antecedentes de la invención

Una característica común de las células cancerosas es la proliferación incontrolada. Entre las diferencias que se han descubierto entre las células tumorales y las células normales está la resistencia al proceso de la muerte celular programada, también denominado apoptosis (Ambrosini et al., Nat. Med., 1997, 3, 917-921). La apoptosis es un proceso que ha evolucionado en organismos multicelulares para evitar la proliferación celular descontrolada, así como para eliminar células que se han vuelto enfermas, defectuosas o que ya no son necesarias. El proceso de la apoptosis implica una cascada de múltiples etapas en que las células se degradan desde el interior a través de la acción concertada de enzimas proteolíticas y ADN endonucleasas, dando como resultado la formación de cuerpos apoptóticos que entonces son eliminados por células captadoras. Hasta la fecha, las investigaciones han demostrado que la mayor parte de la degradación intracelular se realiza a través de la acción de las caspasas, una familia de enzimas proteolíticas que producen una ruptura adyacente a los restos aspartato (Cohen, Biochemistry Journal, 1997, 326, 1-16).

El descubrimiento de que la mayoría de las células tumorales muestran resistencia al proceso apoptótico ha conducido a la opinión de que las estrategias terapéuticas dirigidas a atenuar la resistencia de las células tumorales a la apoptosis podrían representar un medio nuevo para detener la diseminación de células neoplásicas (Ambrosini et al., Nat. Med., 1997, 3, 917-921). Uno de los mecanismos a través del cual se cree que las células tumorales adquieren resistencia a la apoptosis es mediante la sobreexpresión de survivina, un miembro de la familia de inhibidores de caspasa IAP ("inhibitor of apoptosis", inhibidor de la apoptosis) descrito recientemente. Hasta la fecha se ha detectado sobreexpresión de survivina en tumores de pulmón, colon, páncreas, próstata, mama, estómago, linfoma no de Hodgkin, y neuroblastoma (Adida et al., Lancet, 1998, 351, 882-883; Ambrosini et al., Nat. Med., 1997, 3, 917-921; Lu et al., Cancer Res., 1998, 58, 1808-1812). Se ha realizado un análisis más detallada en el neuroblastoma, en el que se ha descubierto que la sobreexpresión de survivina segrega con histologías tumorales conocidas por estar asociadas a una mala prognosis (Adida et al., Lancet, 1998, 351, 882-883). Por último, Ambrosini et al. describen la transfección de células HeLa con un vector de expresión que contenía un fragmento de 708 nt del ADNc humano que codifica el receptor-1 de proteasas de células efectoras (EPR-1), cuya secuencia codificadora es en gran medida complementaria con la hebra codificadora de la survivina (Ambrosini et al., J. Bio. Chem., 1998, 273, 11177-11182) y que actúa potencialmente como ARN antisentido de la survivina. Este constructo provoca una reducción de la viabilidad celular. En el documento WO 98/22589 se describen procedimientos para modular la apoptosis y para reducir la gravedad de un estado patológico mediado por survivina utilizando agentes que modulan la cantidad o la actividad de la survivina. Este documento también describe el constructo de hebra codificadora de EPR-1/survivina antisentido descrito por Ambrosini et al., supra.

Recientemente se ha descubierto que la survivina desempeña un papel en la regulación del ciclo celular. Se ha descubierto que se expresa en la fase G2/M del ciclo celular de una manera regulada por el ciclo, y que se asocia a microtúbulos del huso mitótico. La desorganización de esta interacción produce la pérdida de la función antiapoptótica de la survivina y aumenta la actividad caspasa-3 durante la mitosis. La caspasa-3 está asociada con la muerte celular apoptótica. Por tanto, se cree que la survivina puede contrarrestar una inducción defectuosa de la apoptosis en la fase G2/M. Se cree que la sobreexpresión de la survivina en el cáncer puede superar este punto de control apoptótico, permitiendo la supervivencia y la división no deseadas de las células cancerosas. Se ha descubierto que el constructo de survivina antisentido descrito por Ambrosini (véase anteriormente) infrarregula la survivina endógena en células HeLa y aumenta la apoptosis dependiente de caspasa-3 en las células en fase G2/M (Li et al., Nature, 1998, 396, 580-584).

Como resultado de estos avances en la comprensión de la apoptosis y del papel que parece desempeñar la expresión de la survivina para conferir una ventaja de crecimiento a una amplia variedad de tipos de células tumorales, existe un gran deseo de proporcionar composiciones de materia que puedan modular la expresión de la survivina. Se desea en gran medida proporcionar procedimientos de diagnóstico y de detección de ácidos nucleicos que codifiquen la survivina en animales. También se desea proporcionar procedimientos de diagnóstico y de tratamiento de trastornos que surgen de la expresión de survivina. Además, se desean mejores kits y reactivos de investigación para la detección y el estudio de los ácidos nucleicos que codifican la survivina.

En la actualidad no existen agentes terapéuticos conocidos que inhiban de forma eficaz la síntesis de survivina. Por consiguiente, existe una necesidad, largo tiempo sentida, de agentes capaces de inhibir de manera eficaz la expresión de la survivina en células tumorales. Por tanto, los oligonucleótidos antisentido contra survivina pueden demostrar ser excepcionalmente útiles en una serie de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación.

Sumario de la invención

La presente invención está dirigida a oligonucleótidos antisentido que están dirigidos a ácidos nucleicos que codifican la survivina y que modulan la expresión de la survivina. La presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido con una longitud de hasta 30 nucleótidos dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la survivina humana, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:10, 12, 15, 16, 18, 20, 21, 23, 28, 31, 32, 34, 38, 39, 40, 41, 42, 43 y 47, o su sal farmacéuticamente aceptable. Los oligonucleótidos antisentido o sus sales farmacéuticamente aceptables de la invención pueden utilizarse en terapia y, en particular, pueden utilizarse en el tratamiento del cáncer. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la invención en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La invencion proporciona también el uso de un oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Los oligonucleótidos antisentido o las composiciones de la invención son útiles en procedimientos para modular la expresión de survivina en células o tejidos, comprendiendo dichos procedimientos poner en contacto dichas células o tejidos con uno o más de dichos oligonucleótidos antisentido o composiciones. Además, los oligonucleótidos antisentido o las composiciones de la invención son procedimientos útiles para tratar a un animal, en particular a un ser humano, sospechoso o susceptible de padecer una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión de survivina, mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de dichos oligonucleótidos antisentido o composiciones de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención emplea oligonucleótidos antisentido para su uso para modular la función de moléculas de ácidos nucleicos que codifican la survivina, modulando, en último término, la cantidad de survivina producida. Esto se logra proporcionando oligonucleótidos antisentido que se hibridan de forma específica con uno o más ácidos nucleicos que codifican la survivina. Tal como se emplean en la presente, las expresiones "ácido nucleico diana" y "ácido nucleico que codifica la survivina" incluyen ADN que codifica la survivina, ARN (incluyendo pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de dicho ARN. La hibridación específica de un compuesto oligómero con su ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico diana por compuestos que se hibridan específicamente con él se denomina, en general, "antisentido". Las funciones del ADN que se interfieren incluyen la replicación y la transcripción. Las funciones del ARN que se interfieren incluyen todas las funciones vitales como, por ejemplo, la translocación del ARN hacia el sitio de traducción de proteínas, la traducción de la proteína a partir del ARN, la ruptura del ARN para producir una o más especies de ARNm, y

\hbox{la actividad catalítica en  la que pueda estar implicado
el ARN o que se vea facilitada por este ARN.}

El efecto global de esta interferencia con la función del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de la survivina. En el contexto de la presente invención, "modulación" significa un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) de la expresión de un gen. En el contexto de la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión del gen, y el ARNm es la diana preferida.

Se prefiere dirigir el compuesto antisentido a ácidos nucleicos específicos. En el contexto de esta invención, "dirigir" (o transporte "dirigido") un compuesto antisentido a un ácido nucleico concreto es un proceso de múltiples etapas. El proceso normalmente comienza con la identificación de una secuencia de ácido nucleico cuya función se va a modular. Ésta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o el ARNm transcrito a partir de este gen) cuya expresión está asociada con un trastorno o un estado de enfermedad concreto, o una molécula de ácido nucleico procedente de un agente infeccioso. En la presente invención, la diana es una molécula de ácido nucleico que codifica la survivina. El proceso de transporte "dirigido" también incluye la determinación del sitio o sitios dentro de este gen para que se produzca la interacción antisentido, de forma que se obtenga el efecto deseado, por ejemplo la detección o la modulación de la expresión de la proteína. Dentro del contexto de la presente invención, un sitio intragénico preferido es la región que incluye el codón de inicio o de fin de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Puesto que, tal como se conoce en la técnica, el codón de inicio de la traducción es, de forma típica, 5'-AUG (en las moléculas de ARNm transcritas; 5'-ATG en la correspondiente molécula de ADN), el codón de inicio de la traducción también se denomina "codón AUG", el "codón de inicio" o el "codón de inicio AUG". Una minoría de genes tiene un codón de inicio de la traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y los codones 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG han demostrado funcionar in vivo. Por tanto, las expresiones "codón de inicio de la traducción" y "codón de inicio" pueden incluir muchas secuencias de codones, aunque el aminoácido iniciador en cada caso es, de forma típica, metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se sabe en la técnica que los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, cualquiera de los cuales puede utilizarse de manera preferente para el inicio de la traducción en un tipo celular o tejido particular, o bajo un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la invención, el "codón de inicio" y el "codón de inicio de la traducción" se refieren al codón o codones que se emplean in vivo para iniciar la traducción de una molécula de ARNm transcrita a partir de un gen que codifica la survivina, independientemente de la secuencia o secuencias de dichos codones.

También se sabe en la técnica que un codón de terminación de la traducción (o "codón de fin") de un gen puede tener una de tres secuencias, a saber, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las correspondientes secuencias de ADN son 5-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente). Las expresiones "región de inicio del codón" y "región de inicio de la traducción del codón" se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que incluye de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de inicio de la traducción. De forma similar, las expresiones "región de fin del codón" y "región de fin de la traducción del codón" se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que incluye de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de fin de la traducción.

El marco de lectura abierto (ORF) o "región codificadora", que en la técnica se refiere a la región entre el codón de inicio de la traducción y el codón de fin de la traducción, también es una región diana para el transporte dirigido eficaz. Otras regiones diana incluyen la región no traducida 5' (5'UTR), conocida en la técnica como la porción de un ARNm en la dirección 5' desde el codón de inicio de la traducción, y que por tanto incluye los nucleótidos entre el sitio de casquete 5' y el codón de inicio de la traducción de un ARNm o los correspondientes nucleótidos en el gen, y la región no traducida 3' (3'UTR), conocida en la técnica como la porción de un ARNm en la dirección 3' desde el codón de fin de la traducción, y que por tanto incluye los nucleótidos entre el codón de fin de la traducción y el extremo 3' de un ARNm o los correspondientes nucleótidos en el gen. El casquete 5' de un ARNm comprende un resto guanosina N7-metilado unido al resto más 5' del ARNm a través de un enlace 5'-5' trifosfato. Se considera que la región de casquete 5' de un ARNm incluye la estructura de casquete 5' en sí misma, así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al casquete. La región de casquete 5' también puede ser una región diana preferida.

Aunque algunos transcritos de ARNm eucariota están directamente traducidos, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", que se escinden del transcrito antes de que sea traducido. El resto de las regiones (por tanto, traducidas) se conocen como "exones" y mediante su corte y empalme forman una secuencia de ARNm continua. Los sitios de corte y empalme del ARNm, es decir, las uniones entre intrón-exón, también pueden ser regiones diana preferidas, y son particularmente útiles en situaciones en las que un corte y empalme aberrante está implicado en la enfermedad, o en las que una sobreproducción de un producto de corte y empalme de un ARNm concreto está implicado en la enfermedad. La uniones de fusión aberrantes debidas a redisposiciones o deleciones también son dianas preferidas. También se ha descubierto que los intrones también pueden ser regiones diana eficaces y, por tanto, preferidas para los compuestos antisentido dirigidos, por ejemplo, a ADN o pre-ARNm.

Cuando ya se hayan identificado uno o más sitios diana, se eligen oligonucleótidos que sean suficientemente complementarios con la diana, es decir, que se hibriden suficientemente bien y con suficiente especificidad para producir el efecto deseado.

En el contexto de esta invención, "hibridación" significa enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inversas, entre bases de nucleótidos o nucleósidos complementarias. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno. "Complementario", tal como se emplea en la presente, se refiere a la capacidad para un apareamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en cierta posición de un oligonucleótido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces el oligonucleótido y el ADN o ARN se consideran complementarios entre sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada moléculas está ocupado por nucleótidos que pueden unirse entre sí mediante enlaces de hidrógeno. Por tanto, "específicamente hibridable" y "complementario" son expresiones que se emplean para indicar un grado suficiente de complementariedad o de apareamiento preciso, de forma que se produce una unión estable y específica entre el oligonucleótido y el ADN o ARN diana. Se entiende en la técnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto antisentido sea 100% complementaria con la de su ácido nucleico diana para poder ser específicamente hibridable. Un compuesto antisentido es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN diana interfiere con la función normal del ADN o ARN diana para provocar una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a secuencias que no son su diana bajo condiciones en que se desea una unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento

\hbox{terapéutico, o en el caso de
ensayos  in vitro , bajo condiciones en que se realizan los
ensayos.}

Los compuestos antisentido se utilizan habitualmente como reactivos de investigación y para diagnóstico. Por ejemplo, a menudo los expertos en la técnica utilizan oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con una especificidad exquisita, para aclarar la función de genes concretos. Los compuestos antisentido también se utilizan, por ejemplo, para distinguir entre las funciones de diversos miembros de una vía biológica. Por tanto, la modulación antisentido se ha aprovechado para su uso en investigación.

La especificidad y la sensibilidad de los compuestos antisentido también ha sido aprovechada por los expertos en la técnica para usos terapéuticos. Los oligonucleótidos antisentido se han empleado como restos terapéuticos en el tratamiento de estados de enfermedad en animales y en el ser humano. Los oligonucleótidos antisentido se han administrado con seguridad y eficacia a seres humanos y en la actualidad se están realizando numerosos ensayos clínicos. Por tanto, se ha comprobado que los oligonucleótidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para su uso en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, en especial seres humanos.

En el contexto de la invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o a un polímero de un ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o sus miméticos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases naturales, azúcares y enlaces internucleosídicos covalentes (esqueleto), así como oligonucleótidos que tienen porciones no naturales que funcionen de manera similar. Estos oligonucleótidos modificados o sustituidos a menudo se prefieren frente a las formas nativas por sus propiedades deseables, por ejemplo, una mayor captación celular, una mayor afinidad por la diana de ácido nucleico y una mayor estabilidad en presencia de
nucleasas.

Los oligonucleótidos antisentido según esta invención son oligonucleótidos antisentido que comprenden hasta 30 nucleótidos (es decir, de 18 a 30 nucleósidos unidos). Las realizaciones preferidas comprenden al menos una porción de 18 nucleótidos de una secuencia de un compuesto antisentido que inhibe la expresión de la survivina. Tal como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de base del nucleósido normalmente es una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de estas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto 2', 3' o 5' hidroxilo del azúcar. Para formar oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de esta estructura polimérica lineal también pueden unirse para formar una estructura circular, aunque en general se prefieren las estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura oligonucleotídica, habitualmente los grupos fosfato se designan como los que forman el esqueleto internucleosídico del oligonucleótido. El enlace normal o esqueleto del ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'.

Los ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que contienen esqueletos modificados o enlaces internucleosídicos no naturales. Como se define en esta memoria, los oligonucleótidos que tienen esqueletos modificados incluyen aquellos que mantienen un átomo de fósforo en el esqueleto y aquellos que no tiene un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los fines de esta memoria, y como a veces se hace referencia en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto internucleosídico también pueden considerarse oligonucleósidos.

Los esqueletos oligonucleotídicos modificados preferidos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros fosfonatos de alquilo incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tengan enlaces 3'-5' normales, sus análogos con enlace 2'-5', y los que tienen una polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades nucleosídicas están unidas 3'-5' a 5'-3', o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las patentes de EEUU representativas que indican la preparación de los anteriores enlaces que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a las patentes de EEUU 3.687.808; 4.469.863; 4.976.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677;
5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.

Los esqueletos oligonucleotídicos modificados preferidos que no incluyen un átomo de fósforo en su interior tiene esqueletos que están formados por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo y heteroátomos mixtos, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o hetercíclicos de cadena corta. Éstos incluyen los que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tiene partes componentes de N, O, S y CH_{2} mixtas.

Las patentes de EEUU representativas que indican la preparación de los anteriores oligonucleósidos incluyen, pero no se limitan a las patentes de EEUU 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240;
5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

Las realizaciones más preferidas de la invención son oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato.

Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos azúcar. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en el que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden estar sustituidos o no sustituidos con alquilo C_{1} a C_{10} o alquenilo y alquinilo C_{2} a C_{1}. Se prefieren particularmente O[(CH_{2})_{n}O]_{m}CH_{3}, O(CH_{2})_{n}OCH_{3}, O(CH_{2})_{n}NH_{2}, O(CH)_{2}CH_{3}, O(CH)_{2}ONH)_{2} y O(CH_{2})_{n}ON[(CH_{2})_{n}CH_{3})]_{2}, en los que n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C_{1} a C_{10}, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH_{3}, OCN, Cl, Br, CN, CF_{3}, OCF_{3}, SOCH_{3}, SO_{2}CH_{3}, ONO_{2}, NO_{2}, N_{3}, NH_{2}, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de ruptura de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH_{2}CH_{2}OCH_{3}, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación preferida incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH_{2})_{2}ON(CH_{3})_{2}, también conocido como 2'-DMAOE, según se describe en la solicitud de patente de EEUU nº de serie 09/016.520, presentada el 30 de enero, 1998, de propiedad común con la presente solicitud.

Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-OCH_{3}), 2'-aminopropoxi (2'-OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleótido, en particular en la posición 3' del azúcar sobre el nucleótido 3' terminal, o en los oligonucleótidos unidos 2'-5', y en la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Las patentes de EEUU representativas que indican la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a las patentes de EEUU 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300;
5.627.0531; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.

Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones en las nucleobases (que a menudo se denominan en la técnica simplemente "bases"). Tal como se emplean en la presente, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales, como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina, y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras nucleobases incluyen las descritas en la patente de EEUU 3.687.808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pp. 858-859, Kroschwitz, J.I., ed., John Wiley & Sons, 1990, las descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613, y las descritas por Sanghvi, Y.S., capítulo 15, Antisense Research and Applications, pp. 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligómeros de la invención. Éstas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas, y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que la sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex del ácido nucleico en 0,6-1,2ºC (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y son las sustituciones de bases que se prefieren en la presente, aún más particularmente cuando están combinadas con modificaciones de azúcares de 2'-O-metoxietilo.

Las patentes de EEUU representativas que indican la preparación de ciertas nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, así como de otras nucleobases modificadass incluyen, pero no se limitan a la patente de EEUU 3.687.808 mencionada anteriormente, así como las patentes de EEUU 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121;
5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; y 5.750.692.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica la unión química al oligonucleótido de uno o más restos o conjugados que potencien la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Estos restos incluyen, pero no se limitan a restos lipídicos, como un resto colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólido (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo restos dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glycero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una cadena de poliamina o de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantanacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o un resto octadecilamina o hexilaminocarboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).

Las patentes de EEUU representativas que indican la preparación de dichos conjugados oligonucleotídicos incluyen, pero no se limitan a las patentes de EEUU 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603;
5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263;
4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022;
5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241; 5.391.723; 5.416.203; 5.451.463;
5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696;
5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.

No es necesario que todas posiciones sobre un oligonucleótido dado estén modificadas de forma uniforme y, de hecho, pueden incorporarse más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente en un único oligonucléotido o incluso en un único nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente invención también incluye oligonucleótidos antisentido que son oligonucleótidos quiméricos. Los oligonucleótidos antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido que contienen dos o más regiones químicamente diferenciadas, formada cada una por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido. Estos oligonucleótidos contienen, de forma típica, al menos una región en que el oligonucleótido está modificado para conferir a este oligonucleótido una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, una mayor captación celular y/o una mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Otra región del oligonucleótido puede actuar como sustrato para enzimas capaces de romper los híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. Como ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que rompe la hebra de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Por tanto, la activación de la ARNasa H produce la ruptura de la diana de ARN, aumentando con ello en gran medida la eficacia de la inhibición del oligonucleótido de la expresión génica. Por consiguiente, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se emplean oligonucleótidos quiméricos, comparados con los fosforotioato desoxioligonucleótidos que se hibridan con la misma región diana. La ruptura del ARN diana puede ser detectada, de forma rutinaria, mediante una electroforesis en gel y, si es necesario, mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociados como se conoce en la
técnica.

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos como se describió anteriormente. Estos compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gápmeros. Las patentes de EEUU representativas que indican la preparación de dichas estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a las patentes de EEUU 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878: 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922.

Los oligonucleótidos antisentido que se emplean según esta invención pueden fabricarse, de modo conveniente y rutinario, mediante la técnica conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis es comercializado por varios vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Cualquier otro medio para dicha síntesis conocido en la técnica también puede emplearse o puede emplearse como alternativa. Se conoce el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos, como los derivados de fosforotioato y los derivados
alquilados.

Los oligonucleótidos antisentido de la invención se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones antisentido de origen biológico, o construcciones de vectores genéticos diseñados para dirigir la síntesis in vivo de moléculas antisentido. Los oligonucleótidos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otra manera con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo liposomas, moléculas dirigidas al receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras formulaciones, para ayudar a la captación, la distribución y/o la absorción. Las patentes de EEUU representativas que indican la preparación de dichas formulaciones que ayudan a la captación, la distribución y/o la absorción incluyen, pero no se limitan a las patentes de EEUU 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016;
5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.

Los oligonucleótidos antisentido de la invención incluyen cualquier sal farmacéuticamente aceptable que, tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o su resto. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se dirige a las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención.

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los oligonucleótidos de la invención, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto de origen y que no imparten efectos toxicológicos no deseados a éste.

Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Los ejemplos de metales utilizados como cationes son sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Los ejemplos de aminas adecuadas son N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina, y procaína (véase, por ejemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19). Las sales de adición de bases de los compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de una manera convencional. La forma de ácido libre puede regenerarse poniendo en contacto la forma salina con un ácido y aislando el ácido libre de una manera convencional. Las formas de ácido libre se diferencian de sus respectivas formas salinas en ciertas propiedades físicas, como la solubilidad en disolventes polares, pero en los demás aspectos las sales son equivalentes a su respectivo ácido libre para los fines de la presente invención. Tal como se emplea en la presente, una "sal farmacéuticamente aceptable" incluye una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de los componentes de las composiciones de la invención. Éstas incluyen las sales de ácidos orgánicos o inorgánicos de las aminas. Las sales de ácidos preferidas son los hidrocloruros, los acetatos, los salicilatos, los nitratos y los fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables adecuadas son muy conocidas por los expertos en la técnica e incluyen sales básicas de una diversidad de ácidos inorgánicos y orgánicos, como por ejemplo con ácidos inorgánicos, como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos orgánicos carboxílicos, sulfónicos o sulfoácidos o fosfoácidos o ácidos sulfámicos N-sustituidos, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o ácido isonicotínico; y con aminoácidos, como los 20 alfa-aminoácidos implicados en la síntesis de las proteínas en la naturaleza, por ejemplo ácido glutámico o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido 2-hidroxietansulfónico, ácido etan-1,2-disulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 4-metilbencensulfónico, ácido naftalen-2-sulfónico, ácido naftalen-1,5-disulfónico, 2- o 3-fosfoglicerato, glucosa-6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos), o con otros compuestos orgánicos ácidos, como ácido ascórbico. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos también pueden prepararse con un catión farmacéuticamente aceptable. Los cationes farmacéuticamente aceptables adecuados con muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos, de amonio y de amonio cuaternario. También son posibles los carbonatos o los bicarbonatos.

Los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a (a) sales formadas con cationes, como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas como espermina y espermidina, etc.; (b) sales de adición de ácidos formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con ácidos orgánicos, como por ejemplo ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánnico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfónico, ácido metansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalacturónico y similares; y (d) sales formadas a partir de aniones elementales, como cloro, bromo y yodo. Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención pueden utilizarse para un uso de diagnóstico, terapéutico y profiláctico, y como kits y reactivos de investigación. Para un uso terapéutico, un animal, preferiblemente un ser humano, sospechoso de padecer una enfermedad o un trastorno que puede tratarse mediante la modulación de la expresión de la survivina se trata mediante la administración de los compuestos antisentido según esta invención. Los oligonucleótidos de la invención pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un oligonucleótido antisentido a un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. El uso de los oligonucleótidos antisentido y de los procedimientos de la invención también puede ser profiláctico, por ejemplo para prevenir o retrasar una infección, una inflamación o la formación de un tumor, por ejemplo.

Los oligonucléotidos antisentido de la invención son útiles para la investigación y el diagnóstico porque estos compuestos se hibridan con ácidos nucleicos que codifican la survivina, permitiendo construir con facilidad ensayos de "sandwich" u otros ensayos para aprovechar esto. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido de la invención con un ácido nucleico que codifica la survivina puede detectarse mediante medios conocidos en la técnica. Estos medios pueden incluir la conjugación de una enzima al oligonucleótido, el radiomarcaje del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También pueden prepararse kits que utilicen estos medios de detección para detectar el nivel de survivina en una muestra.

La presente invención también incluye formulaciones y composiciones farmacéuticas que incluyen los oligonucleótidos antisentido de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante una serie de maneras, dependiendo si se desea un tratamiento local o sistémico y del área que se va a tratar. La administracón puede ser tópica (incluyendo la administración oftálmica y a las membranas mucosas, incluyendo la administración vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo un nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluyen una inyección o una infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o la administración intracraneal, por ejemplo intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación de 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para la administración
oral.

Las formulaciones y composiciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizados, líquidos y polvos. Pueden resultar necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, oleosas o en polvo, espesantes y similares. También pueden resultar útiles los condones revestidos, los guantes revestidos o similares.

Las composiciones y las formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o disoluciones en medios acuosos o no acuosos, cápsulas, sobres o comprimidos. Pueden resultar deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulgentes, adyuvantes para la dispersión o ligantes.

Las composiciones y las formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados, como por ejemplo, pero sin limitarse a potenciadores de la penetración, compuestos vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las formulaciones y/o composiciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos de la presente invención también pueden incluir potenciadores de la penetración para potenciar la administración alimentaria de los oligonucleótidos. Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse en una de cinco categorías amplias, a saber, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, tensioactivos y no tensioactivos (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33). Pueden incuirse uno o más potenciadores de la penetración de una o más de estas amplias categorías.

Diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, recinleato, monooleína (también conocida como 1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, mono- y diglicéridos y sus sales fisiológicamente aceptables (es decir, sales oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654). Los ejemplos de ácidos grasos preferidos en la presente son caprato de sodio y laurato de sodio, utilizados por sí solos o en combinación a unas concentraciones del 0,5% al 5%.

Los papeles fisiológicos de la bilis incluyen facilitar la dispersión y la absorción de lípidos y de vitaminas solubles en grasas (Brunton, capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ª ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, Nueva York, NY, 1996, pp. 934-935). Diversas sales biliares naturales y sus derivados sintéticos actúan como potenciadores de la penetración. Por tanto, la expresión "sal biliar" incluye cualquiera de los componentes naturales de la bilis, así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Los ejemplos de las sales biliares preferidas en la presente son el ácido quenodesoxicólico (CDCA) y/o ácido ursodesoxicólico (UDCA), empleados generalmente a una concentración del 0,5% al 2%.

Pueden utilizarse formulaciones complejas que comprendan uno o más potenciadores de la penetración. Por ejemplo, pueden emplearse sales biliares en combinación con ácidos grasos para fabricar formulaciones complejas. Las combinaciones preferidas incluyen CDCA combinado con caprato de sodio o laurato de sodio (en general del 0,5% al 5%).

Los agentes quelantes incluyen, pero no se limitan a etilendiaminatetraacetato de sodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados de N-acilo del colágeno, laureth-9 y derivados de N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51). Los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de servir también como inhibidores de ADNasa.

Los tensioactivos incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191); y emulsiones perfluoroquímicas, como FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252-257).

Los no tensioactivos incluyen, por ejemplo, ureas cícilicas insaturadas, derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191); y agentes antiinflamatorios no esteroideos, como diclofenaco sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Tal como se emplea en la presente, un "compuesto vehículo" se refiere a un ácido nucleico, o su análogo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica per se) pero que es reconocido como ácido nucleico por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o estimulando su retirada de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y de un compuesto vehículo, de forma típica con un exceso de esta última sustancia, puede producir una sustancial reducción en la cantidad del ácido nucleico recuperado en el hígado, el riñón u otros depósitos extracirculatorios, supuestamente debido a la competición entre el compuesto vehículo y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente fosforotioado en el tejido hepático se reduce cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico y ácido 4-acetamido-4'-isotiocianoestilben-2,2'-disulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

Por contraste con un compuesto vehículo, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" (excipiente) es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente suspensor o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser líquido o sólido, y se selecciona según la manera de administración planeada para proporcionar la masa, la consistencia, etc. deseadas, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los vehículos farmacéuticamente aceptables típicos incluyen, pero no se limitan a agentes ligantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o bifosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); disgregantes (por ejemplo, almidón, almidón glicolato de sodio, etc.); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.). Los sistemas de administración oral de liberación sostenida y/o los revestimientos entéricos para las formas de dosificación administradas por vía oral se describen en las patentes de EEUU 4.704.295; 4.556.552; 4.309.406; y 4.309.404.

Las composiciones de la presente invención también pueden contener otros componentes adjuntos que se encuentran, de forma convencional, en las composiciones farmacéuticas, a los niveles de utilización establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener otros materiales farmacéuticamente activos compatibles, como por ejemplo antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener otros materiales útiles para formular físicamente diversas formas de dosificación de la composición de la presente invención, como tintes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, estos materiales, cuando se añaden, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la invención.

Independientemente del procedimiento mediante el cual los oligonucleótidos antisentido de la invención se introducen en un paciente, pueden utilizarse sistemas de dispersión coloidal como vehículos de administración para potenciar la estabilidad in vivo de los oligonucleótidos y/o para dirigir los oligonucleótidos a un órgano, un tejido o un tipo celular concretos. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen, pero no se limitan a complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, esferas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, liposomas y complejos de lípido:oligonucleótido de estructura no caracterizada. Un sistema de dispersión coloidal preferido es una pluralidad de liposomas. Los liposomas son esferas microscópicas que tienen un núcleo acuoso rodeado por una o más capas externas formadas por lípidos dispuestos en una configuración en bicapa (véase, en general, Chonn et al., Current Op. Biotech., 1995, 6, 698-708).

Ciertas realizaciones de la invención proporcionan liposomas y otras composiciones que contienen (a) uno o más compuestos antisentido, y (b) uno o más agentes quimioterapéuticos que actúan mediante un mecanismo no antisentido. Los ejemplos de estos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a fármacos anticáncer, como daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, gas mostaza, clorambucilo, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, vincristina, vinblastina, etopósido, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ª ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pp. 1206-1228). También pueden mezclarse con las composiciones de la invención fármacos antiinflamatorios que incluyen, pero no se limitan a fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y fármacos antivíricos, que incluyen, pero no se limitan a ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir. Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ª ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pp. 2499-2506 y 46-49, respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos no antisentido también se encuentran dentro del alcance de la invención. Dos o más compuestos combinados pueden utilizarse juntos o de manera secuencial.

En otra realización relacionada, las composiciones de la invención pueden contener uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a un primer ácido nucleico, y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a una segunda diana de ácido nucleico. Los ejemplos de oligonucleótidos antisentido incluyen, pero no se limitan a los dirigidos a las siguientes dianas como se describe en las patentes de EEUU indicadas, o las solicitudes U.S. en tramitación, de propiedad común con la presente solicitud, o las solicitudes PCT publicadas indicadas: raf (documentos WO 96/39415, WO 95/32987, y patentes de EEUU 5.563.255 y 5.656.612), el antígeno nucleolar p120 (documento WO 93/17125, y patente de EEUU 5.656.743), proteína quinasa C (documentos WO 95/02069, WO 95/03833 y WO 93/19203), proteína asociada a la resistencia a múltiples fármacos (documento WO 95/10938, y patente de EEUU 5.510.239), subunidades del factor de transcripción AP-1 (solicitud en tramitación U.S. nº de serie 08/837.201, presentada el 14 de abril, 1997), quinasas Jun (solicitud en tramitación U.S. nº de serie 08/910,629, presentada el 13 de agosto, 1997), MDR-1 (glicoproteína de resistencia a múltiples fármacos; solicitud en tramitación U.S. nº de serie 08/731.199, presentada el 30 de septiembre, 1997), VIH (patentes de EEUU 5.166.195 y 5.591.600), herpesvirus (patentes de EEUU 5.248.670 y 5.514.577), citomegalovirus (patentes de EEUU 5.442.049 y 5.591.720), papilomavirus (patente de EEUU 5.957.189), molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1) (patente de EEUU 5.514.788), 5-lipooxigenasa (patente de EEUU 5,530,114) y virus de la gripe (patente de EEUU 5.580.767). Dos o más compuestos combinados pueden utilizarse juntos o de manera secuencial.

Se cree que la formulación de las composiciones terapéuticas y su posterior administración está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y de la capacidad de respuesta del estado de enfermedad que se va a tratar, y la duración del tratamiento es de varios días a varios meses o hasta que se logra la curación o una disminución del estado de enfermedad. Los programas de dosificación óptimos pueden calcularse a partir de las mediciones de acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos en la técnica pueden determinar con facilidad las dosificaciones óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales y pueden estimarse, en general, basándose en las EC_{50} que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, una dosificación es de 0,01 \mug a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una o más veces diarias, semanales, mensuales o anuales, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden estimar con facilidad las tasas de repetición para la dosificación basándose en los tiempos de residencia y las concentraciones del fármaco medidas en los fluidos corporales o los tejidos. Tras un tratamiento que haya tenido éxito puede ser deseable que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia del estado de enfermedad, en la que el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varían de 0,01 \mug a 100 g por kg de peso corporal, de una o más veces diarias a una vez cada 20 años.

Aunque la presente invención se ha descrito específicamente según ciertas de sus realizaciones preferidas, los siguientes ejemplos sirven sólo para ilustrar la invención y no pretenden limitarla.

Ejemplos

Ejemplo 1

Nucleósido fosforamiditas para la síntesis de oligonucleótidos de desoxi- y 2'-alcoxiamiditas

Las 2'-desoxi- y 2'-metoxi-beta-cianoetildiisopropil fosforamiditas se adquirieron de una fuente comercial (por ejemplo Chemgenes, Needham, MA o Glen Research, Inc. Sterling VA). Se preparan otras nucleósido amiditas 2'-O-alcoxi-sustituidas según se describe en la patente de EEUU 5.506.351, incorporada en la presente como referencia. Para los oligonucleótidos sintetizados utilizando 2'-alcoxiamiditas se utilizó el ciclo convencional para oligonucleótidos no modificados, excepto que la etapa de retención después de la administración pulsada del tetrazol y la base aumentó hasta 360 segundos.

Los oligonucleótidos que contienen nucleótidos de 5-metil-2'-desoxicitidina (5-Me-C) se sintetizaron según procedimientos publicados [Sanghvi, et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203] utilizando fosforamiditas disponibles en el mercado (Glen Research, Sterling, VA o ChemGenes, Needham, MA).

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2'-fluoroamiditas 2'-fluorodesoxiadenosina amiditas

Los 2'-fluorooligonucleótidos se sintetizaron como se describió previamente [Kawasaki, et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841] y la patente de EEUU 5.670.633, incorporada en la presente como referencia. Brevemente, el nucleósido protegido de N6-benzoil-2'-desoxi-2'-fluoroadenosina se sintetizó utilizando la 9-beta-D-arabinofuranosiladenina disponible en el mercado como material de partida y mediante procedimientos bibliográficos modificados, en los que el átomo 2'-alfa-flúor es introducido por un S_{N}2-desplazamiento de un grupo 2'-beta-tritilo. Por tanto, la N6-benzoil-9-beta-D-arabinofuranosiladenina se protegió selectivamente en rendimientos moderados como el intermedio de 3',5'-ditetrahidropiranilo (THP). La desprotección de los grupos THP y N6-benzoílo se realizó utilizando metologías convencionales, y se emplearon procedimientos convencionales para obtener los intermedios de 5'-dimetoxitritil- (DMT) y 5'-DMT-3'-fosforamidita.

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2'-fluorodesoxiguanosina

La síntesis de 2'-desoxi-2'-fluoroguanosina se realizó utilizando 9-beta-D-arabinofuranosilguanina protegida con tetraisopropildisiloxanilo (TPDS) como material de partida. y la conversión en el intermedio de diisobutirilarabinofuranosilguanosina. Tras la desprotección del grupo TPDS se realizó la protección del grupo hidroxilo con THP para producir arabinofuranosilguanina protegida con diisobutiril di-THP. Tras una O-desacetilación y triflación selectivas se realizó un tratamiento del producto bruto con fluoruro, y después una desprotección de los grupos THP. Se emplearon metodologías convencionales para obtener las 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.

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2'-fluorouridina

La síntesis de 2'-desoxi-2'-fluorouridina se realizó mediante la modificación de un procedimiento bibliográfico en que el 2,2'-anhidro-1-beta-D-arabinofuranosiluracilo se trató con fluoruro de hidrógeno al 70%-piridina. Se emplearon metodologías convencionales para obtener las 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.

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2'-fluorodesoxicitidina

La 2'-desoxi-2'-fluorocitidina se sintetizó mediante la aminación de 2'-desoxi-2'-fluorouridina, seguido de una protección selectiva para producir N4-benzoil-2'-desoxi-2'-fluorocitidina. Se emplearon procedimientos convencionales para obtener las 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.

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Amiditas modificadas con 2'-O-(2-metoxietilo)

Las nucleósido amiditas sustituidas con 2'-O-metoxietilo se prepararon como sigue o, como alternativa, mediante los procedimientos de Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504.

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2,2'-anhidro[1-(beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluridina]

Se añadieron 5-metiluridina (ribosiltimina, disponible en el mercado en Yamasa, Choshi, Japón) (72,0 g, 0,279 M), difenilcarbonato (90,0 g, 0,420 M) y bicarbonato de sodio (2,0 g, 0,024 M) a DMF (300 ml). La mezcla se calentó a reflujo, con agitación, dejando que el dióxido de carbono gaseoso producido se liberase de una manera controlada. Después de 1 hora la disolución ligeramente oscura se concentró a presión reducida. El jarabe resultante se vertió en éter dietílico (2,5 l) con agitación. El producto formó una goma. El éter se decantó y el residuo se disolvió en una cantidad mínima de metanol (aproximadamente 400 ml). La disolución se vertió en éter fresco (2,5 l) para producir una goma rígida. El éter se decantó y la goma se secó en un horno de vacío (60ºC a 1 mm de Hg durante 24 h) para producir un sólido que se trituró hasta obtener un polvo de color tostado claro (57 g, rendimiento bruto 85%). El espectro de RMN resultó coherente con la estructura, contaminada con fenol en forma de su sal sódica (aproximadamente 5%). El material se utilizó para posteriores reacciones (o puede purificarse aún más mediante una cromatografía en columna utilizando un gradiente de metanol en acetato de etilo (al 10-25%) para producir un sólido blanco, p.f.
222-224ºC).

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2'-O-metoxietil-5-metiluridina

Se añadieron 2,2'-anhidro-5-metiluridina (195 g, 0,81 M), borato de tris(2-metoxietilo) (231 g, 0,98 M) y 2-metoxietanol (1,2 l) a un recipiente de presión de acero inoxidable de 2 l y se colocó en un baño de aceite precalentado a 160ºC. Después de calentar durante 48 horas a 155-160ºC, el recipiente se abrió y la disolución se evaporó hasta la sequedad y se trituró con MeOH (200 ml). El residuo se suspendió en acetona caliente (1 l). Las sales insolubles se retiraron mediante filtración, se lavaron con acetona (150 ml) y el filtrado se evaporó. El residuo (280 g) se disolvió en CH_{3}CN (600 ml) y se evaporó. Una columna de gel de sílice (3 kg) se cargó con CH_{2}Cl_{2}/acetona/MeOH (20:5:3) que contenía Et_{3}NH al 0,5%. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (250 ml) y se adsorbió sobre sílice (150 g) antes de cargarlo a la columna. El producto eluyó con el disolvente de carga para producir 160 g (63%) del producto. Se obtuvo más material volviendo a tratar las fracciones impuras.

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2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina

La 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (160 g, 0,506 M) se coevaporó con piridina (250 ml) y el residuo secado se disolvió en piridina (1,3 l). Se añadió una primera parte alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Se añadió una segunda parte alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) y la reacción se agitó durante una hora más. Entonces se añadió metanol (170 ml) para detener la reacción. Una HPLC mostró la presencia de aproximadamente 70% del producto. El disolvente se evaporó y se trituró con CH_{2}CN (200 ml). El residuo se disolvió en CHCl_{3} (1,5 l) y se extrajo con 2 x 500 ml de NaHCO_{3} saturado y 2 x 500 ml de NaCl saturado. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. Se obtuvieron 275 g de residuo. El residuo se purificó sobre una columna de 3,5 kg de gel de sílice, se cargó y se eluyó con EtOAc/hexano/acetona (5:5:1) que contenía Et_{2}NH al 0,5%. Las fracciones puras se evaporaron para producir 164 g del producto. Se obtuvieron aproximadamente 20 g más a partir de las fracciones impuras, dando un rendimiento total de 183 g (57%).

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3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina

Se reunieron 2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (106 g, 0,167 M), DMF/piridina (750 ml de una mezcla 3:1 preparada a partir de 562 ml de DMF y 188 ml de piridina) y anhídrido acético (24,38 ml, 0,258 M) y se agitaron a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción se controló mediante TLC extinguiendo en primer lugar la muestra de TLC mediante la adición de MeOH. Tras haberse completado la reacción, según se considera mediante TLC, se añadió MeOH (50 ml) y la mezcla se evaporó a 35ºC. El residuo se disolvió en CHCl_{3} (800 ml) y se extrajo con 2 x 200 ml de bicarbonato de sodio saturado y 2 x 200 ml de NaCl saturado. Las capas acuosas se retroextrajeron con 200 ml de CHCl_{3}. Las capas orgánicas reunidas se secaron con sulfato de sodio y se evaporaron para producir 122 g de residuo (aproximadamente 90% del producto). El residuo se purificó sobre una columna de gel de sílice de 3,5 kg y se eluyó utilizando EtOAc/hexano (4:1). Las fracciones del producto puro se evaporaron para producir 96 g (84%). Se recuperaron 1,5 g más de las fracciones que eluyeron después.

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3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoluridina

Se preparó una primera disolución disolviendo 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (96 g, 0,144 m) en CH_{3}CN (700 ml ) y se dejaron aparte. Se añadió trietilamina (189 ml, 1,44 M) a una disolución de triazol (90 g, 1,3 M) en CH_{3}CN (1 l), se enfrió hasta -5ºC y se agitó durante 0,5 horas utilizando un agitador suspendido. Se añadío POCl_{3} gota a gota a lo largo de un periodo de 30 minutos a la disolución agitada mantenida a 0-10ºC, y la mezcla resultante se agitó durante 2 horas más. La primera disolución se añadió gota a gota, a lo largo de un periodo de 45 minutos, a la última disolución. La mezcla de reacción resultante se conservó durante la noche en una habitación fresca. Las sales se filtraron de la mezcla de reacción y la disolución se evaporó. El residuo se disolvió en EtOAc (1 l) y los sólidos insolubles se eliminaron mediante filtración. El filtrado se lavó con 1 x 300 ml de NaHCO_{3} y 2 x 300 ml de NaCl saturado, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó. El residuo se trituró con EtOAc para producir el compuesto del título.

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2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina

Una disolución de 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoluridina (103 g, 0,141 M) en dioxano (500 ml) y NH_{4}OH (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La disolución de dioxano se evaporó y el residuo se evaporó azeotrópicamente con MeOH (2 x 200 ml). El residuo se disolvió en MeOH (300 ml) y se trasladó a un recipiente de presión de acero inoxidable de 2 litros. Se añadió MeOH (400 ml) saturado con NH_{3} gaseoso y el recipiente se calentó hasta 100ºC durante 2 horas (una TLC mostró que la conversión había sido completa). Los contenidos del recipiente se evaporaron hasta la sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc (500 ml) y se lavó una vez con NaCl saturado (200 ml). Las fases orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio y el disolvente se evaporó para producir 85 g (95%) del compuesto del título.

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N4-benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina

Se disolvió 2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (85 g, 0,134 M) en DMF (800 ml) y se añadió anhídrido benzoico (37,2 g, 0,165 M) con agitación. Después de agitar durante 3 horas, una TLC mostró que la reacción se había completado en aproximadamente 95%. El disolvente se evaporó y el residuo se evaporó azeotrópicamente con MeOH (200 ml). El residuo se disolvió en CHCl_{3} (700 ml) y se extrajo con NaHCO_{3} saturado (2 x 300 ml) y NaCl saturado (2 x 300 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se evaporó para producir un residuo (96 g). El residuo se cromatografió sobre una columna de sílice de 1,5 kg utilizando EtOAc/hexano (1:1) que contenía Et_{3}NH al 0,5% como disolvente de elución. Las fracciones del producto bruto se evaporaron para producir 90 g (90%) del compuesto del título.

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N4-benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina-3'-amidita

Se disolvió N4-benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (74 g, 0,10 M) en CH_{2}Cl_{2} (1 l). Se añadieron tetrazoldiisopropilamina (7,1 g) y 2-cianoetoxi-tetra-(isopropil)fosfita (40,5 ml, 0,123 M) con agitación bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente (una TLC mostró que la reacción se había completado en 95%). La mezcla de reacción se extrajo con NaHCO_{3} saturado (1 x 300 ml) y NaCl saturado (3 x 300 ml). Los lavados acuosos se retroextrajeron con CH_{2}Cl_{2} (300 ml) y los extractos se reunieron, se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron. El residuo obtenido se cromatografió en una columna de sílice de 1,5 kg utilizando EtOAc/hexano (3:1) como disolvente de elución. Las fracciones puras se reunieron para producir 90,6 g (87%) del compuesto del título.

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2'-(aminooxietil)nucleósido amiditas y 2'-(dimetilaminooxietil)nucleósido amiditas

Las aminooxietil y dimetilaminooxietil amiditas se prepararon según los procedimientos de las solicitudes de patente de EEUU nº de serie 10/037.143, presentada el 14 de febrero, 1998, y nº de serie 09/016.520, presentada el 30 de enero, 1998, cada una de las cuales es de propiedad común con la presente solicitud.

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Ejemplo 2

Síntesis de oligonucleótidos

Se sintetizaron fosfodiéster (P=O) oligonucleótidos sustituidos y no sustituidos con un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems, modelo 380B) utilizando la química de las fosforamiditas convencional con oxidación mediante yodo.

Los fosforotioatos (P=S) se sintetizaron igual que los fosfodiéster oligonucleótidos excepto que la botella de oxidación convencional fue sustituida por una disolución 0,2 M de 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona en acetonitrilo para la tiación discontinua de los enlaces fosfita. La etapa de retención de la tiación aumentó hasta 68 segundos y tras ella se realizó una etapa de formación de casquete. Después de la escisión de la columna de CPG y de desbloquear en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC (18 horas), los oligonucleótidos se purificaron precipitando dos veces con 2,5 volúmenes de etanol a partir de una disolución de NaCl 0,5 M. Los fosfinato oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 5.508.270.

Los alquilfosfonato oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 4.469.863.

Los 3'-desoxi-3'-metilenfosfonato oligonucleótidos se prepararon como se describe en las patentes de EEUU 5.610.289 o 5.625.050.

Los fosforamidita oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 5.256.775 o en la patente de EEUU 5.366.878.

Los alquilfosfonotioato oligonucleótidos se prepararon como se describe en las solicitudes PCT publicadas PCT/
US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como documentos WO 99/17093 y WO 94/02499, respectivamente).

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Los 3'-desoxi-3'-aminofosforamidato oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 5.476.925.

Los fosfotriéster oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 5.023.243.

Los boranofosfato oligonucleótidos se prepararon como se describe en las patentes de EEUU 5.130.302 y
5.177.198.

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Ejemplo 3

Síntesis de oligonucleósidos

Los oligonucleósidos unidos con metilenmetilimino, también denominados oligonucleósidos unidos con MMI, los oligonucleósidos unidos con metilendimetilhidrazo, también denominados oligonucleósidos unidos con MDH, y los oligonucleósidos unidos con metilencarbonilamino, también denominados oligonucleósidos unidos con amida-3, y los oligonucleósidos unidos con metilenaminocarbonilo, también denominados oligonucleósidos unidos con amida-4, así como los compuestos de esqueleto mixto que tienen, por ejemplo, enlaces alternantes MMI y P=O o P=S se preparan como se describe en las patentes de EEUU 5.378.825, 5.386.023, 5.489.677, 5. 602.240 y 5.610.289.

Los oligonucleósidos unidos con formacetal y tioformacetal se preparan como se describe en las patentes de EEUU 5.264.562 y 5.264.564.

Los oligonucléosidos unidos con óxido de etileno se preparan como se describe en la patente de EEUU 5.223.618.

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Ejemplo 4

Síntesis de ANP

Se preparan ácidos nucleicos peptídicos (ANP) según uno de diversos procedimientos indicados en Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23. También pueden prepararse según las patentes de EEUU 5.539.082, 5.700.922, y 5.719.262.

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Ejemplo 5

Síntesis de oligonucleótidos quiméricos

Los oligonucleótidos quiméricos, los oligonucleósidos o los oligonucleótidos/oligonucleósidos mixtos de la invención pueden ser de varios tipos diferentes. Éstos incluye un primer tipo en que el segmento de "hueco" ("gap") de los nucleósidos enlazados está colocado entre los segmentos de "ala" 5' y 3' de los nucleósidos enlazados, y un segundo tipo de "extremo abierto" en que el segmento de "hueco" está colocado en el extremo 3' o 5' terminal del compuesto oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo también se denominan en la técnica gápmeros u oligonucléotidos con hueco. Los oligonucleótidos del segundo tipo también se denominan en la técnica "hemímeros" o "alámeros".

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Fosforotioato oligonucleótidos quiméricos de [2'-O-Me]-[2'-desoxi]-[2'-O-Me]

Se sintetizan oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos de 2'-O-alquilfosforotioato y 2'-desoxifosforotioato utilizando un sintetizador de ADN automático de Applied Biosystems, modelo 380B, como se indicó anteriormente. Los oligonucleótidos se sintetizan utilizando el sintetizador automático y la 2'-desoxi-5'-dimetoxitritil-3'-O-fosforamidita para la porción de ADN y la S5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita para las alas 5' y 3'. El ciclo de síntesis convencional se modifica aumentando la etapa de retención para la administración del tetrazol y de la base hasta 600 seg, repetido cuatro veces para el ARN y dos veces para el 2'-O-metilo. El oligonucleótido totalmente protegido se escinde del soporte y el grupo fosfato se desprotege en amoniaco/etanol 3:1 a temperatura ambiente durante la noche y después se liofiliza hasta la sequedad. Entonces se realiza un tratamiento en amoniaco metanólico durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger todas las bases, y la muestra de nuevo se liofiliza hasta la sequedad. El sedimento se resuspende en TBAF 1 M en THF durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger las posiciones 2'. La reacción entonces se extingue con TEAA 1 M y la muestra entonces se reduce hasta la mitad de su volumen con un Rotovac antes de desalarse en una columna de exclusión molecular G25. El oligómero recuperado entonces se analiza espectrofotométricamente para determinar el rendimiento y la pureza mediante electroforesis capilar y mediante espectrometría de masas.

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Fosforotioato oligonucleótidos quiméricos de [2'-O-(2-metoxietil)]-[2'-desoxi]-[2'-O-(metoxietil)]

Se prepararon fosforotioato oligonucleótidos quiméricos de [2'-O-(2-metoxietil)]-[2'-desoxi]-[2'-O-(metoxietil)] como en el procedimiento anterior para los oligonucleótidos quiméricos de 2'-O-metilo, con la sustitución de las 2'-O-metilamiditas por 2'-O-(metoxietil)amiditas.

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Oligonucleótidos quiméricos de [2'-O-(2-metoxietil) fosfodiéster]-[2'-desoxifosforotioato]-[2'-O-(metoxietil)fosfodiéster]

Los oligonucleótidos quiméricos de [2'-O-(2-metoxietil) fosfodiéster]-[2'-desoxifosforotioato]-[2'-O-(metoxietil) fosfodiéster] se prepararon como en el procedimiento anterior para los oligonucleótidos quiméricos de 2'-O-metilo, con la sustitución de las 2'-O-metilamiditas por 2'-O-(metoxietil)amiditas, una oxidación con yodo para genera los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster dentro de las porciones de ala de las estructuras quiméricas, y una sulfurización utilizando 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona (reactivo de Beaucage) para generar los enlaces internucleotídicos de fosforotioato para el hueco central.

Otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos y oligonucleótidos/oligonucleósidos mixtos se sintetizan según la patente de EEUU 5.623.065.

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Ejemplo 6

Aislamiento de oligonucleótidos

Después de la escisión de la columna de vidrio con tamaño de poro controlado (Applied Biosystems) y de desbloquear en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC durante 18 horas, los oligonucleótidos o los oligonucleósidos se purificaron precipitando dos veces en NaCl 0,5 M con 2,5 volúmenes de etanol. Los oligonucleótidos sintetizados se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida sobre geles desnaturalizantes y se consideró que eran al menos 85% de material de longitud completa. Las cantidades relativas de enlaces fosforotioato y fosfodiéster obtenidas en la síntesis se comprobaron periódicamente mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de ^{31}P, y en algunos estudios los oligonucleótidos se purificaron mediante HPLC, como se describe en Chiang et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con el material purificado mediante HPLC fueron similares a los obtenidos con el material no purificado mediante HPLC.

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Ejemplo 7

Síntesis de oligonucleótidos - formato de placa de 96 pocillos

Se sintetizaron oligonucleótidos mediante la química de las fosforamiditas P(III) en fase sólida en un sintetizador automático capaz de montar 96 secuencias de manera simultánea en un formato de 96 pocillos convencional. Los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster se lograron mediante la oxidación con yodo acuoso. Los enlaces internucleotídicos de fosforotioato se generaron mediante una sulfurización utilizando 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona (reactivo de Beaucage) en acetonitrilo anhidro. Las beta-cianoetildiisopropilfosforamiditas con bases protegidas convencionales se adquirieron de vendedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). Los nucleósidos no convencionales se sintetizaron según la bibliografía conocida o según procedimientos patentados. Se utilizan como beta-cianoetildiisopropilfosforamiditas con bases
protegidas.

Los oligonucleótidos se escindieron del soporte y se desprotegieron con NH_{4}OH a elevada temperatura (55-60ºC) durante 12-16 horas y el producto liberado entonces se secó al vacío. El producto secado entonces se resuspendió en agua estéril para producir una placa maestra a partir de la cual todas las muestras de las placas de ensayo y analíticas entonces se diluyen utilizando pipetas robóticas.

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Ejemplo 8

Análisis de oligonucleótidos - formato de placa de 96 pocillos

Se evaluó la concentración de oligonucleótido en cada pocillo mediante dilución de las muestras y espectroscopía de absorción de UV. Se evaluó la integridad de la longitud completas de los productos individuales mediante electroforesis capilar (CE) en el formato de 96 pocillos (Beckman P/ACE^{TM} MDQ) o, para las muestras preparadas de forma individual, con un aparato de CE comercial (por ejemplo Beckman P/ACE^{TM} 500, ABI270). Se confirmó la composición de las bases y del esqueleto mediante análisis de masas de los compuestos utilizando espectroscopía de masas de electronebulización. Todas las placas de ensayo se diluyeron a partir de la placa maestra utilizando pipetas robóticas de un solo canal y de múltiples canales. Se consideró que las placas eran aceptables si al menos 85% de los compuestos sobre la placa eran al menos 85% de longitud completa.

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Ejemplo 9

Cultivo celular y tratamiento de los oligonucleótidos

El efecto de los compuestos antisentido sobre la expresión del ácido nucleico diana puede ensayarse en una diversidad de tipos celulares, con la condición de que el ácido nucleico diana esté presente a niveles mensurables. Esto puede determinarse de forma rutinaria utilizando, por ejemplo, PCR o análisis de la transferencia Northern. Se proporcionan los siguientes cuatro tipos celulares con fines ilustrativos, pero también pueden utilizarse otros tipos celulares de forma rutinaria.

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Células T-24

La línea celular de carcinoma de vejiga de células de transición T-24 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Las células T-24 se cultivaron de forma rutinaria en medio basal 5A de McCoy completo (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), penicilina a 100 unidades por ml, y estreptomicina a 100 microgramos por ml (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se transfirieron mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria nº 3872) a una densidad de 7000 células/pocillo para su uso en un análisis de RT-PCR.

Para el análisis de la transferencia Northern u otros análisis, las células pueden sembrarse en placas de 100 mm u otras placas de cultivo de tejidos convencionales y tratarse de forma similar, utilizando los volúmenes apropiados de medio y de oligonucleótidos.

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Células A459

La línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Las células A549 se cultivaron de forma rutinaria en medio basal DMEM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), penicilina a 100 unidades por ml, y estreptomicina a 100 microgramos por ml (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se transfirieron mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia.

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Células NHDF

Se obtuvieron fibroblastos dérmicos neonatales humanos (NHDF) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). Las NHDF se mantuvieron de forma rutinaria en medio de crecimiento de fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) suplementado según recomienda el fabricante. Las células se mantuvieron hasta 10 transferencias según recomienda el fabricante.

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Células HEK

Se obtuvieron queratinocitos enbriónicos humanos (HEK) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). Las HEK se mantuvieron de forma rutinaria en medio de crecimiento de queratinocitos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) formulado según recomienda el fabricante. Las células se mantuvieron de forma rutinaria hasta 10 transferencias según recomienda el fabricante.

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Tratamiento con compuestos antisentido

Cuando las células alcanzaron 80% de confluencia se trataron con el oligonucleótido. Para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavaron una vez con 200 \mul. de medio sin suero OPTI-MEM^{TM}-1 (Gibco BRL) y después se trataron con 130 \mul. de medio OPTI-MEM^{TM}-1 que contenía 3,75 \mug/ml de LIPOFECTIN^{TM} (Gibco BRL) y el oligonucleótido deseado a una concentración final de 150 nM. Después de 4 horas de tratamiento, el medio se sustituyó por medio fresco. Las células se recogieron 16 horas después del tratamiento con el oligonucleótido.

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Ejemplo 10

Análisis de la inhibición de la expresión de survivina por los oligonucleótidos

La modulación antisentido de la expresión de survivina puede ensayarse mediante una diversidad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de survivina pueden cuantificarse, por ejemplo mediante análisis de la transferencia Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR), o PCR a tiempo real (RT-PCR). La PCR cuantitativa a tiempo real se prefiere en la presente. El análisis de ARN puede realizarse sobre el ARN celular total o sobre ARNm poli(A)^{+}. Los procedimientos para el aislamiento del ARN se indican, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, pp. 4.1.1-4.2.9 y 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. El análisis de la transferencia Northern se realiza de forma rutinaria en la técnica y se indica, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. La cuantificación a tiempo real (PCR) puede realizarse de forma conveniente utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM^{TM} 7700 disponible en el mercado en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, y empleado según las instrucciones del fabricante. Otros procedimientos de PCR también se conocen en la
técnica.

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Los niveles proteicos de survivina pueden cuantificarse de una diversidad de formas muy conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de la transferencia Western (inmunotransferencia), ELISA o selección de células activadas por fluorescencia (FACS). Pueden identificarse y obtenerse anticuerpos dirigidos a survivina a partir de una diversidad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante procedimientos de generación de anticuerpos convencionales. Los procedimientos para la preparación de antisueros policlonales se indican, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se indica, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.

Los procedimientos de inmunoprecipitación se realizan de forma convencional en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. El análisis de la transferencia Western (immunotransferencia) se realiza de forma convencional en la técnica y puede encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley Sons, Inc., 1997. Los ensayos inmunoabsorbentes de enzimas ligados (ELISA) se realizan de forma convencional en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.

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Ejemplo 11

Aislamiento de ARNm poli(A)^{+}

Se aisló ARNm poli(A)^{+} según Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764. Otros procedimientos para el aislamiento del ARNm poli(A)^{+} se indican, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, pp. 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. Brevemente, para células cultivadas en placas de 96 pocillos, el medio de crecimiento se retiró de las células y cada pocillo se lavó con 200 \mul de PBS frío. Se añadió 60 \mul de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, NP-40 al 0,5%, complejo de vanadilo-ribonucleósido 20 mM) a cada pocillo, la placa se agitó suavemente y después se incubó a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se trasladaron 55 \mul del lisado a placas de 96 pocillos revestidas con oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine, CA). Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 \mul de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,3 M). Después del lavado final, la placa se secó con toallitas de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado y después se dejó secar al aire durante 5 minutos. Se añadieron 60 \mul de tampón de elución (Tris-HCl 5 mM, pH 7,6) precalentado hasta 70ºC a cada pocillo, la placa se incubó sobre una placa caliente a 90ºC durante 5

\hbox{minutos, y el eluato entonces se trasladó
a una placa de 96 pocillos fresca.}

Células cultivadas en placas de 100 mm u otras placas convencionales pueden tratarse de forma similar utilizando volúmenes apropiados de todas las disoluciones.

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Ejemplo 12

Aislamiento de ARN total

El ARNm total se aisló utilizando un kit RNEASY 96^{TM} y tampones adquiridos en Qiagen Inc. (Valencia, CA), siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. Brevemente, para células cultivadas en placas de 96 pocillos, el medio de crecimiento se retiró de las células y cada pocillo se lavó con 200 \mul de PBS frío. Se añadieron 100 \mul de tampón RLT a cada pocillo y la placa se agitó vigorosamente durante 20 segundos. Entonces se añadieron 100 \mul de etanol al 70% a cada pocillo y los contenidos se mezclaron pipeteando tres veces arriba y abajo. Las muestras entonces se trasladaron a una placa de pocillos RNEASY 96^{TM} unida a un colector QIAVAC^{TM} equipado con un bandeja de recogida de residuos y unida a un fuente de vacío. El vacío se aplicó durante 15 segundos. Se añadió 1 ml de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96^{TM} y de nuevo se aplicó el vacío durante 15 segundos. Entonces se añadió 1 ml de tampón RPE a cada pocillo de la placa RNEASY 96^{TM} y de nuevo se aplicó el vacío durante un periodo de 15 segundos. Entonces se repitió el lavado con tampón RPE y se aplicó el vacío durante 10 minutos más. La placa entonces se retiró del colector QIAVAC^{TM} y se secó con toallitas de papel. La placa entonces se volvió a unir al colector QIAVAC^{TM} equipado con una rejilla de tubos de recolección que contenía tubos de recolección de 1,2 ml. Entonces el ARN se eluyó pipeteando 60 \mul de agua en cada pocillo, incubando durante 1 minuto y después aplicando un vacío durante 30 segundos. La etapa de elución se repitió con 60 \mul más de agua.

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Ejemplo 13

Análisis de PCR cuantitativa a tiempo real de los niveles de ARNm de survivina

Se cuantificaron los niveles de ARNm de survivina mediante una PCR cuantitativa a tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM^{TM} 7700 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Este es un sistema de detección de fluorescencia, no basado en gel, de tubo cerrado, que permite una cuantificación de alta capacidad de procesamiento de los productos de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) a tiempo real. En oposición a la PCR convencional, en que los productos de la amplificación se cuantifican después de haberse completado la PCR, los productos de la PCR cuantitativa a tiempo real se cuantifican a medida que se acumulan. Esto se logra incluyendo en la reacción de PCR una sonda oligonucleotídica que se asocia específicamente entre los cebadores de PCR directo e inverso, y que contiene dos tintes fluorescentes. Un tinte indicador (por ejemplo, JOE o FAM, obtenidos de Operon Technologies Inc., Alameda, CA, o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 5' de la sonda, y un tinte de extinción (por ejemplo, TAMRA, obtenido de Operon Technologies Inc., Alameda, CA, o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y los tintes están intactos, la emisión del tinte indicador es extinguida por la proximidad del tinte de extinción 3'. Durante la amplificación, la asociación de la sonda a la secuencia diana crea un sustrato que puede ser roto por la actividad 5'-exonucleasa de la Taq polimerasa. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación de la PCR, la ruptura de la sonda por la Taq polimerasa libera el tinte indicador del resto de la sonda (y, por tanto, del resto de extinción) y se genera una señal fluorescente específica de la secuencia. Con cada ciclo, se rompen más moléculas de tinte indicador de sus respectivas sondas, y se controla la intensidad de la fluorescencia a intervalos regulares (de seis segundos) mediante una óptica de láser que se encuentra en el interior del sistema de detección de secuencias ABI PRISM^{TM} 7700. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones en serie del ARNm procedente de muestras control no tratadas genera una curva patrón que se emplea para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento de las muestras de ensayo con el oligonucleótido antisentido.

Los reactivos de PCR se obtuvieron de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA. La reacciones de RT-PCR se realizaron añadiendo 25 \mul de cóctel de PCR (1 x tampón A TAQMAN^{TM}, MgCl_{2} 5,5 mM, 300 \muM de cada uno de dATP, dCTP y dGTP, 600 \muM de dUTP, 100 nM de cada uno de cebador directo, cebador inverso y sonda, 20 unidades de inhibidor de ARNasa, 1,25 unidades de AMPLITAQ GOLD^{TM}, y 12,5 unidades de transcriptasa inversa MuLV) a placas de 96 pocillos que contenían 25 \mul de disolución de ARN poli(A). La reacción de RT se realizó mediante una incubación durante 30 minutos a 48ºC. Después de una incubación de 10 minutos a 95ºC para activar el AMPLITAQ GOLD^{TM}, se realizaron 40 ciclos de un protocolo de PCR en dos etapas: 95ºC durante 15 segundos (desnaturalización), seguido de 60ºC durante 1,5 minutos (asociación/extensión). Se diseñaron sondas y cebadores de survivina para hibridarse con la secuencia de survivina humana, utilizando la información de la secuencia publicada (GenBank nº de registro U75285, incorporada en la presente como SEQ ID NO:1).

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Para la survivina, las sondas de PCR fueron:

Cebador directo: AAGGACCACCGCATCTCTACA: (SEQ ID NO:2)

Cebador inverso: CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT: (SEQ ID NO:3)

y la sonda de PCR fue: FAM-CGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA (SEQ ID NO: 4), en que FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte indicador fluorescente, y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte de extinción.

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Para el GAPDH, las sondas de PCR fueron:

Cebador directo: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC: (SEQ ID NO:5)

Cebador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTC: (SEQ ID NO:6)

y la sonda de PCR fue: 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 7), en que JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte indicador fluorescente, y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte de extinción.

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Ejemplo 14

Análisis de la transferencia Northern de los niveles de ARNm de survivina

Dieciocho horas después del tratamiento antisentido, se lavaron monocapas celulares dos veces con PBS frío y se lisaron en 1 ml de RNAZOL^{TM} (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). Se preparó el ARN total siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Se fraccionaron 20 microgramos del ARN total mediante electroforesis a través de geles de agarosa al 1,2% que contenían formaldehído al 1,1% utilizando un sistema de tampón MOPS (AMRESCO, Inc., Solon, OH). El ARN se trasladó desde el gel hasta membranas de nailon HYBOND^{TM}-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante transferencia capilar durante la noche utilizando un sistema de tampón de transferencia Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). La transferencia de ARN se confirmó mediante visualización de UV. Las membranas se fijaron mediante entrecruzamiento de UV utilizando STRATALINKER^{TM} UV Crosslinker 2400 (Stratagene, Inc., La Jolla, CA).

Se sondaron membranas utilizando una disolución de hibridación QUICKHYB^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando las recomendaciones del fabricante para condiciones estrictas con una sonda específica de survivina preparada mediante PCR utilizando el cebador directo AAGGACCACCGCATCTCTACA (SEQ ID NO:2) y el cebador inverso CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT (SEQ ID NO:3). Para normalizar las variaciones en la eficacia de carga y de transferencia, las membranas se extrajeron y se sondaron para ARN de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Clontech, Palo Alto, CA). Las membranas hibridadas se visualizaron y se cuantificaron utilizando un PHOSPHORIMAGER^{TM} y el programa informático IMAGEQUAN^{TM} V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Los datos se normalizaron a los niveles de GAPDH en los controles no tratados.

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Ejemplo 15

Inhibición antisentido de la expresión de survivina - fosforotioato oligodesoxinucleótidos

Según la presente invención, se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigirse a diferentes regiones del ARN de survivina humano, utilizando secuencias publicadas (GenBank, nº de registro U75285, incorporadas a la presente como SEQ ID NO:1). Los oligonucleótidos se muestran en la tabla 1. Los sitios diana se indican mediante el números de nucleótido, tal como se ofrece en la referencia fuente de la secuencia (GenBank, nº de registro U75285), al cual se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 1 son oligodesoxinucleótidos con esqueleto de fosforotioato (enlaces internucleosídicos) en toda su extensión. Los compuestos se analizaron para su efecto sobre los niveles de ARNm de survivina mediante PCR cuantitativa a tiempo real como se describe en otros ejemplos en la presente. Los datos son medias de tres experimentos. Si está presente, "N.D" indica "no hay datos".

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TABLA 1 Inhibición de los niveles de ARNm de survivina por los fosforotioato oligonucleótidos

1

Como se muestra en la tabla 1, las SEQ ID NO:10, 12, 15, 16, 18, 20, 21, 23, 28, 31, 32, 34, 39, 40, 41, 42, 43 y 47 demostraron una inhibición de al menos 30% de la expresión de survivina en este ensayo.

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Ejemplo 16

Inhibición antisentido de la expresión de survivina - fosforotioato 2'-MOE gápmero oligonucleótidos

Según la presente invención, se diseñó una segunda serie de oligonucleótidos para dirigirse a la survivina humana. Las secuencias de los oligonucleótidos se muestran en la tabla 2. Los sitios diana se indican mediante el números de nucleótido, tal como se ofrece en la referencia fuente de la secuencia (GenBank, nº de registro U75285), al cual se une el oligonucleótido.

Todos los compuestos en la tabla 2 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") con una longitud de 18 nucleótidos, compuestos de una región central de "hueco" ("gap") que consiste en diez 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de cuatro nucleótidos. Las alas están compuestas de 2'-metoxietil(2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) en toda la extensión del oligonucleótido. Los restos citidina en las alas de 2'-MOE son 5-metilcitidinas.

Los datos se obtuvieron mediante PCR cuantitativa a tiempo real como se describe en otros ejemplos en la presente y son las medias de tres experimentos. Si está presente, "N.D" indica "no hay datos".

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TABLA 2 Inhibición de los niveles de ARNm de survivina por los fosforotioato oligonucleótidos quiméricos que tienen alas de 2'-MOE y un hueco desoxi

2

3

Como se muestra en la tabla 2, las SEQ ID NO:16, 21, 23, 31, 34, 38, 39, 42 y 43 demostraron una inhibición de al menos 30% de la expresión de survivina en este experimento y, por tanto, se prefieren.

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Ejemplo 17

Análisis de la transferencia Western de los niveles proteicos de survivina

Se realizó un análisis de la transferencia Western (análisis de inmunotransferencia) utilizando procedimientos convencionales. Las células se recogieron 16-20 horas después del tratamiento con el oligonucleótido, se lavaron una vez con PBS, se suspendieron en tampón Laemmli (100 \mul/pocillo), se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron sobre un gel de SDS-PAGE al 16%. Los geles se ensayaron durante 1,5 horas a 150 V, y se trasladaron a membranas para la transferencia Western. Se emplea un anticuerpo primario apropiado dirigido contra survivina, con un anticuerpo secundario marcado de forma radiactiva o fluorescente dirigido contra la especie de anticuerpo primario. Las bandas se visualizaron utilizando un PHOSPORIMAGER^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

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Ejemplo 18

Efecto del oligonucleótido antisentido de survivina sobre la apoptosis

Se ensayaron ISIS 23722 y un control desapareado, ISIS 28598 (TAAGCTGTTCTATGTGTT; SEQ ID NO:48) para su efecto sobre la apoptosis de células HeLa. El inhibidor de caspasa z-VAD.fmk se adquirió en Calbiochem (La Jolla, CA) y se empleó según las recomendaciones del fabricante. En las células HeLa sin oligonucleótido, aproximadamente 4% de las células son hipodiploides (indicando una fragmentación del ADN, una medida de la apoptosis). Con la adición de ISIS 23722, aproximadamente 22% de las células son hipodiploides, comparadas con aproximadamente 11% con el oligonucleótidos desapareado. En presencia del inhibidor de caspasa z-vAD.fmk (42,8 mM), el porcentaje de células hipodiploides (apoptóticas) cae hasta 3% sin oligonucleótidos, 6% con ISIS 23722 y 4% con el control desapareado. Esto demuestra que la inhibición antisentido de la survivina aumenta la apoptosis y que este efecto está mediado por caspasa.

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Ejemplo 19

Efecto de la inhibición antisentido de la survivina sobre la citoquinesis

Se observa que células HeLa tratadas con un oligonucleótido antisentido dirigido a survivina (ISIS 23722) forman grandes células multinucleadas como resultado de una división células anómala. El oligonucleótido de control del apareamiento no produce este efecto y las células tienen una apariencia normal (comparables a los controles no tratados). Este efecto puede cuantificarse mediante citometría de flujo.

Las células no tratadas o las células tratadas con el oligonucleótido control muestran dos picos prominentes, representando poblaciones de células en la fase G1 y la fase G2/M de la división celular, respectivamente. Las células G1 tienen una sola copia de su ADN (1x), y las células G2/M tienen dos copias (2x). A lo largo del tiempo, desde las 24 horas a las 72 horas, estos picos 1x y 2x permanecen virtualmente sin cambios en células tratadas con el oligonucleótido control o sin oligonucleótido. Sin embargo, en células tratadas con el oligonucleótido antisentido dirigido a survivina, la mayoría de las células tiene dos copias de ADN a las 24 horas después del tratamiento con oligonucleótido. Esto indica que la división celular está detenida. A las 48 horas después del tratamiento con este oligonucleótido, un pico 4x tiene un tamaño aproximadamente igual al tamaño de los picos 1x y 2x, indicando un número aproximadamente igual de células con una, dos y cuatro copias de ADN. A las 72 horas, el pico más grande es 16x, indicando que las células tienen 16 copias de su ADN y, por tanto, que la división del citoplasma no se ha producido durante múltiples generaciones. Por tanto, la inhibición de la survivina ha demostrado interferir con la citoquinesis.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Bennett, C. Frank

\hskip1cm

Ackermann, Elizabeth J.

\hskip1cm

Swayze, Eric E.

\hskip1cm

Cowsert, Lex M.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> MODULACIÓN ANTISENTIDO DE LA EXPRESIÓN DE SURVIVINA

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<130> ISPH-0405

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<150> documento 09/286.407

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<151> 5 de abril de 1999

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<150> documento 09/163.162

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<151> 29 de septiembre de 1998

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<160> 47

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<210> 1

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<211> 1619

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (50)..(478)

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<400> 1

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\hskip0,8cm

4

\hskip0,8cm

5

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<210> 2

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Sonda PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggaccacc gcatctctac a

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagtctgg ctcgttctca gt

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Sonda PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaggctggc ttcatccact gcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda PCR

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<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggtgaag gtcggagtc

\hfill

19

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<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Sonda PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagatggtg atgggatttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagcttccc gttctcagcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgattcaaa tctggcgg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctctgccaa cgggtccc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgagaaaggg ctgccagg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcttgaatg tagagatg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgcagccc tccaagaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagtctggc tcgttctc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccagctcct tgaagcag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 18

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcgtcatc tggctccc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttcttgac agaaagga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttaattct tcaaactg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttggctct ttctctgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttattgtt ggtttcct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgcagtttc ctcaaatt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatggcacg gcgcactt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggaagtg gtgcagcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaggaaggc tggtggca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgaaaatg ttgatctc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagttgaaa catctaat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttcaagac aaaacagg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaggcagaa gcacctct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcagccac tgttacca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagagagag agagagag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccctcactt ctcacctg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agggacactg ccttcttc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacgcgaac aaagctgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgtggaag gctctgcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggactgtga cagcctca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagattcaa caggcacc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attctctcat cacacaca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgttaaa cagtagag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgctattc tgtgaatt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacttagaat ggctttgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtctcctc atccacct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaaggagta tctgccag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggagcggc cagcatgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctgacaga cacacggc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtgtggag aacgtgac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacgccagac ttcagccc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgacaggga ggagggcg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccgagatga cctccaga

\hfill

18

Claims

1. Un oligonucleótido antisentido con una longitud de hasta 30 nucleótidos dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la survivina humana, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:10, 12, 15, 16, 18, 20, 21, 23, 28, 31, 32, 34, 38, 39, 40, 41, 42, 43 y 47, o su sal farmacéuticamente
aceptable.

2. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 1, que comprende la SEQ ID NO:38.

3. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 1 ó 2, que es un oligómero de ADN.

4. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado.

5. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 4, en el que dicho enlace internucleosídico modificado es un enlace fosforotioato.

6. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 5, en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.

7. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende al menos un resto azúcar modificado.

8. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 7, en el que dicho resto azúcar modificado es un resto azúcar de 2'-O-(2-metoxietilo).

9. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que tiene al menos una nucleobase modificada.

10. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 9, en el que dicha al menos una nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

11. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 2, que consiste en la SEQ ID NO:38.

12. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 11, que es un oligómero de ADN.

13. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 11 ó 12, que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado.

14. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 13, en el que dicho enlace internucleosídico modificado es un enlace fosforotioato.

15. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 14, en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.

16. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, que comprende al menos un resto azúcar modificado.

17. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 16, en el que dicho resto azúcar modificado es un resto azúcar de 2'-O-(2-metoxietilo).

18. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 15, en el que los nucleótidos 1-4 y 15-18 comprenden cada uno una modificación de 2'-O-(2-metoxietilo).

19. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 11-18, que tiene al menos una nucleobase modificada.

20. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 19, en el que dicha al menos una nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

21. El oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en el que dicha sal farmacéuticamente aceptable es una sal sódica.

22. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

23. Un oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para su uso en terapia.

24. El uso de un oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

25. Un oligonucleótido antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para el tratamiento del cáncer.