JP2002539073A

JP2002539073A - サービビン発現のアンチセンス・モジュレーション

Info

Publication number: JP2002539073A
Application number: JP2000572239A
Authority: JP
Inventors: ベネット，シー・フランク; アッカーマン，エリザベス・ジェイ; スウェイズ，エリック・イー; カウサート，レックス・エム
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-09-29
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2002-11-19
Anticipated expiration: 2019-09-23
Also published as: ATE446363T1; PT1117672E; EP1117672A1; CY1110633T1; WO2000018781A1; CA2343102C; EP1117672B1; EP1117672A4; DK1117672T3; CA2343102A1; ES2332296T3; AU6159899A; DE69941576D1; JP3745226B2; AU758545B2; US6165788A; US6077709A

Abstract

(57)【要約】サービビン発現をモジュレートするためのアンチセンス化合物、組成物及び方法を提供する。組成物は、サービビンをコードする核酸をターゲットとするアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを含む。サービビン発現をモジュレートするため及びサービビン発現に関連した疾患を治療するためにこれらの化合物を用いる方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本出願は１９９８年９月２９日出願の米国特許出願第０９／１６３，１６２号
の一部継続出願である。本発明はサービビン(Survivin)の発現をモジュレートするための組成物又は方
法を提供する。特に、本発明は、詳しくはヒトサービビンをコードする核酸とハ
イブリダイズ可能なアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチドに関する
。このようなオリゴヌクレオチドはサービビンの発現をモジュレートすることが
判明している。

【０００２】発明の背景癌細胞の特徴(hallmark feature)は制御されない増殖である。腫瘍と正常な細
胞との間に発見されている相違には、アポトーシスとしても知られる、プログラ
ムされた細胞死のプロセスに対する抵抗がある（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等，Ｎａｔ
．Ｍｅｄ．，１９９７，３，９１７−９２１）。アポトーシスは、多細胞生物が
制御されない細胞増殖を防止するため、並びに病気になった、劣化した又はもは
や必要ではない細胞を除去するために多細胞生物が発生させるプロセスである。
アポトーシスのプロセスは、細胞が内部からタンパク質分解酵素及びＤＮＡエン
ドヌクレアーゼの関係ある作用によって分解される多段階カスケードを含み、結
果としてアポトーシス体(apoptotic bodies)の形成を生じ、次にアポトーシス体
はスカベンジャー細胞によって除去される。現在までの研究は、細胞内分解の多
くが、アスパラギン酸残基に隣接して切断されるタンパク質分解酵素のファミリ
ーであるカスパーゼの作用によって行われることを示している（Ｃｏｈｅｎ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪｏｕｒｎａｌ，１９９７，３２６，１〜１６）。

【０００３】大抵の腫瘍細胞がアポトーシスプロセスに対して抵抗を示すという発見は、ア
ポトーシスに対する腫瘍細胞の抵抗を弱めることを目的とした治療方策が腫瘍性
(neoplastic)細胞の蔓延を停止させるための新規な手段を表しうるという見解を
生じている（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，９１７
−９２１）。腫瘍細胞がアポトーシスに対する抵抗を得ると考えられる機構の１
つは、ＩＡＰ（アポトーシスの阻害剤）カスパーゼ阻害剤ファミリーの最近発表
されたメンバーであるサービビンの過度発現によるものである。現在までに、サ
ービビンの過度発現は肺、結腸、膵臓、前立腺、胸部及び胃の腫瘍、非Ｈｏｄｇ
ｋｉｎ’ｓリンパ腫並びに神経芽細胞腫中に検出されている（Ａｄｉｄａ等，Ｌ
ａｎｃｅｔ，１９９８，３５１，８８２−８８３；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等，Ｎａ
ｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，９１７−９２１；Ｌｕ等，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ
．，１９９８，５８，１８０８−１８０２）。より詳細な分析が神経芽細胞腫に
おいて行われており、この場合に、サービビンの過度発現が、不良な予後に関連
することが知られている腫瘍組織学によって偏析する(segregate)ことが発見さ
れている（Ａｄｉｄａ等，Ｌａｎｃｅｔ，１９９８，３５１，８８２−８８３）
。最後に、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等は、そのコーディング配列がサービビンのコー
ディング鎖に広範囲に相補的であり（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈ
ｅｍ．，１９９８，２７３，１１１７７−１１１８２）、サービビン・アンチセ
ンスＲＮＡとして可能に作用する、エフェクター細胞プロテアーゼ受容体１（Ｅ
ＰＲ−１）をコードするヒトｃＤＮＡの７０８ｎｔフラグメントを含有する発現
ベクターによるＨｅＬａ細胞のトランスフェクションを述べている。この構築体
は細胞生存能力を低下させた。サービビンの量又は活性をモジュレートする作用
剤を用いて、アポトーシスをモジュレートし、サービビンによって仲介される病
的状態の重症度を減ずる方法は、ＷＯ９８／２２５８９に開示されており、ＷＯ
９８／２２５８９は、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等、上記文献によって述べられたＥＰ
Ｒ−１コーディング鎖／サービビンアンチセンス構築体をも開示している。

【０００４】サービビンが細胞周期調節に関与することが最近発見されている。サービビン
が細胞周期のＧ２／Ｍ期に周期調節的に発現されることが判明しており、サービ
ビンは紡錘体の微小管に関連する。この相互作用の崩壊はサービビンの抗アポト
ーシス機能の喪失と、有糸分裂中のカスパーゼ−３活性の増強とを生じる。カス
パーゼ−３はアポトーシス細胞死に関連する。それ故、サービビンがＧ２／Ｍ期
におけるアポトーシスのデフォールト誘導(default induction)を妨げうること
が考えられる。癌におけるサービビンの過度発現がこのアポトーシスチェックポ
イントを克服して、癌細胞の好ましくない生残と分裂を可能にしうることが考え
られる。上記でＡｍｂｒｏｓｉｎｉ等が述べているサービビンアンチセンス構築
体は、ＨｅＬａ細胞中の内因性サービビンをダウンレギュレートして、Ｇ２／Ｍ
期の細胞におけるカスパーゼ−３依存性アポトーシスを増加させることが発見さ
れた。Ｌｉ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９６，５８０−５８４。

【０００５】アポトーシスについてと、非常に多様な腫瘍細胞種類に増殖利益を与えること
にサービビン発現が果たすと考えられる役割りについての理解がこのように進歩
した結果として、サービビン発現をモジュレートすることができる物質の組成物
を提供することが非常に望まれる。動物におけるサービビンをコードする核酸を
診断し、検出する方法を提供することが非常に望まれる。サービビン発現に起因
する状態を診断して、治療する方法を提供することも望まれる。さらに、サービ
ビンをコードする核酸を検出し、研究するための改良された研究キット及び試薬
が望まれる。

【０００６】現在、サービビンの合成を効果的に阻害する治療剤は知られていない。したが
って、腫瘍細胞におけるサービビン発現を効果的に阻害することができる作用剤
の必要性が長い間感じられている。それ故、サービビンに対するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、多くの治療的、診断的及び研究的用途に特有に有用である
と実証されることができる。

【０００７】発明の概要本発明は、サービビンをコードする核酸をターゲットとして、サービビンの発
現をモジュレートするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬的及び他の組成物も提供す
る。さらに、細胞又は組織におけるサービビンの発現をモジュレートする方法で
あって、前記細胞又は組織を１種類以上の本発明のアンチセンス化合物又は組成
物と接触させることを含む前記方法を提供する。さらに、サービビン発現に関連
した疾患又は状態を有する又はこのような疾患又は状態に罹る傾向があると疑わ
れる動物、特にヒトを、本発明のアンチセンス化合物又は組成物の１種類以上の
治療的又は予防的有効量を投与することによって治療する方法を提供する。

【０００８】本発明の詳細な説明本発明は、サービビンをコードする核酸分子の機能のモジュレートに用いるた
めに、究極的にはサービビンの産生量のモジュレートに用いるために、オリゴマ
ーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを利用する。これは、サービビ
ンをコードする１つ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合
物を提供することによって、達成される。本明細書で用いる限り、“ターゲット
核酸”又は“サービビンをコードする核酸”なる用語は、サービビンをコードす
るＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡとｍＲＮ
Ａを包含する）、及びこのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡも包含する。オリゴ
マー化合物とそのターゲット核酸との特異的ハイブリダイゼーションは該核酸の
正常な機能を妨害する。ターゲット核酸に特異的にハイブリダイズする化合物に
よるターゲット核酸の機能のこのモジュレーションは一般に“アンチセンス”と
呼ばれる。妨害すべきＤＮＡの機能は複写と転写を包含する。妨害すべきＲＮＡ
の機能は、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロケーション、Ｒ
ＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプ
ライシング、ＲＮＡに予定される又はＲＮＡによって促進されうる触媒活性のよ
うな、総ての重要な機能を包含する。ターゲット核酸機能によるこのような妨害
の総合効果は、サービビン発現のモジュレーションである。本発明に関連して、
“モジュレーション”は遺伝子発現の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれか
を意味する。本発明に関連して、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好まし
い形態であり、ｍＲＮＡは好ましいターゲットである。

【０００９】アンチセンスのために特異的な核酸をターゲットにすることが好ましい。本発
明に関連して、特定の核酸にアンチセンス化合物を“ターゲッティング”するこ
とは多段階プロセスである。このプロセスは通常、その機能がモジュレートされ
るべきである核酸配列の同定によって開始する。これは例えば、その発現が特定
の障害若しくは疾患状態に関連する細胞遺伝子（又は該遺伝子から転写されたｍ
ＲＮＡ）、又は感染性因子(infectious agent)からの核酸分子でありうる。本発
明では、ターゲットはサービビンをコードする核酸分子である。ターゲッティン
グプロセスは、例えばタンパク質の発現の検出又はモジュレーションのような、
所望の効果が生ずるようにアンチセンス相互作用が起こるためのこの遺伝子内の
部位（単数又は複数）を決定することを包含する。本発明に関して、好ましい遺
伝子内部位は遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コド
ン又は終止コドンを包含する領域である。当該技術分野において知られているよ
うに、翻訳開始コドンは典型的に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子中で；
対応するＤＮＡ分子中では５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、
“ＡＵＧコドン”、“出発コドン”又は“ＡＵＧ出発コドン”とも呼ばれる。少
数の遺伝子がＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧを有する
翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧはｉｎ
ｖｉｖｏにおいて機能することが判明している。したがって、“翻訳開始コドン
”及び“出発コドン”なる用語は、各場合のイニシエーターアミノ酸が典型的に
メチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物において）
であるとしても、多くのコドン配列を包含しうる。真核遺伝子及び原核遺伝子が
２つ以上の代替え出発コドン(alternative start codons)を有することができ、
これらのいずれも特定の細胞種類又は組織において又は特定の組み合わせの条件
下で翻訳開始のために選択的に用いられうることも、当該技術分野において知ら
れている。本発明に関して、“出発コドン”及び“翻訳開始コドン”なる用語は
、このようなコドンの配列（単数又は複数）に関係なく、サービビンをコードす
る遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにｉｎｖｉｖｏで
用いられるコドン（単数又は複数）を意味する。

【００１０】遺伝子の翻訳終止コドン（又は“停止コドン”）が３種類の配列、即ち、５’
−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ又は５’−ＵＧＡ（対応ＤＮＡ配列はそれぞれ、５’−
ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ及び５’−ＴＧＡである）のいずれかを有しうることも、
当該技術分野において知られている。“出発コドン領域”及び“翻訳開始コドン
領域”なる用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（即ち、５’又は３’）
に約２５〜約５０の隣接ヌクレオチドを包含するようなｍＲＮＡ又は遺伝子の一
部を意味する。同様に、“停止コドン領域”及び“翻訳終止コドン領域”なる用
語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（即ち、５’又は３’）に約２５〜約
５０の隣接ヌクレオチドを包含するようなｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する
。

【００１１】翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが当該技術分野
で知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は“コーディング領
域”は、効果的にターゲットにされうる領域でもある。他のターゲット領域は、
翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡ部分を意味し、したがって５’キャップ
部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド若しくは遺伝子上の対応
ヌクレオチドを包含することが当該技術分野で知られた５’非翻訳領域（５’Ｕ
ＴＲ）と、翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡ部分を意味し、したがって翻
訳終止コドンとｍＲＮＡの３’末端との間のヌクレオチド若しくは遺伝子上の対
応ヌクレオチドを包含することが当該技術分野で知られた３’非翻訳領域（３’
ＵＴＲ）とを包含する。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’トリホスフェー
ト結合を介してｍＲＮＡの５’−最大残基に結合したＮ７−メチル化グアノシン
残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体と、このキ
ャップに隣接した最初の５０ヌクレオチドとを包含すると考えられる。５’キャ
ップ領域も好ましいターゲット領域でありうる。

【００１２】幾つかの真核ｍＲＮＡ転写体(transcripts)は直接翻訳されるが、多くの転写
体は“イントロン”として知られる１つ以上の領域を含有し、イントロンは転写
体が翻訳される前に転写体から削除される。残りの（したがって、翻訳される）
領域は“エキソン”として知られ、一緒にスプライスされて、連続ｍＲＮＡ配列
を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、即ち、イントロン−エキソン結合も好ま
しいターゲット領域であることができ、異常なスプライシングが疾患に関係して
いる状況、又は特定のｍＲＮＡスプライス産物の過度産生が疾患に関係している
状況に特に有用である。再編成又は欠失による異常な融合結合も好ましいターゲ
ットである。イントロンも、例えばＤＮＡ又はｐｒｅ−ｍＲＮＡをターゲットと
するアンチセンス化合物のために、効果的な、それ故、好ましいターゲット領域
であることも判明している。

【００１３】１つ以上のターゲット部位がひと度同定されたならば、該ターゲットに対して
充分に相補的である、即ち、所望の効果を生じるために充分に良好に、充分な特
異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選択する。

【００１４】本発明に関連して、“ハイブリダイゼーション”は、相補的ヌクレオシド又は
ヌクレオチド塩基間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ，Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ又は逆Ｈ
ｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合でありうる水素結合を意味する。例えば、アデニンと
チミンとは、水素結合の形成を通して対合する相補的核酸塩基である。本明細書
で用いる“相補性”は２つのヌクレオチド間の正確に対合する能力を意味する。
例えば、オリゴヌクレオチドのある一定の位置のヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮ
Ａ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができるならば、該オリゴ
ヌクレオチドと該ＤＮＡ又はＲＮＡとはその位置において相互に相補性であると
考えられる。該オリゴヌクレオチドと該ＤＮＡ又はＲＮＡとは、各分子中の充分
な数の対応する位置が相互に水素結合することができるヌクレオチドによって占
められるときに、相互に相補性である。したがって、“特異的にハイブリダイズ
可能な”及び“相補性”は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡターゲット
との間に安定で特異的な結合が生じるように、充分な相補性度又は正確な対合を
表すために用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列はそのターゲット
核酸の配列と、特異的にハイブリダイズ可能であるために、１００％相補性であ
る必要はないことが当該技術分野において理解される。ターゲットＤＮＡ又はＲ
ＮＡ分子へのアンチセンス化合物の結合がターゲットＤＮＡ又はＲＮＡの正常な
機能を妨害して有用性の喪失を生じるときに、アンチセンス化合物は特異的にハ
イブリダイズ可能であり、特異的結合が望ましい条件下で、即ち、ｉｎｖｉｖ
ｏアッセイ若しくは治療的処置の場合に生理的条件下で、又はｉｎｖｉｔｒｏ
アッセイの場合には、アッセイが行われる条件下で非ターゲット配列へのアンチ
センス化合物の非特異的結合を回避するために充分な相補性度が存在する。

【００１５】アンチセンス化合物は一般に研究試薬及び診断薬として用いられる。例えば、
精巧な特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオ
チドが、特定の遺伝子の機能を解明するために通常に熟練した人々によってしば
しば用いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の種々なメ
ンバーの機能を識別するためにも用いられる。それ故、アンチセンスモジュレー
ションは研究用途に利用されている。

【００１６】アンチセンスの特異性と感受性とは、治療用途にも当業者によって利用される
。アンチセンスオリゴヌクレオチドは動物及びヒトにおける疾患状態の治療に治
療法の一部(therapeutic moieties)として用いられている。アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは安全に及び効果的にヒトに投与されており、非常に多くの臨床ト
ライアルが現在行われている。したがって、細胞、組織及び動物、特にヒトの治
療のための治療計画に有用であるように設定することができる有効な治療モダリ
ティ(therapeutic modalities)でありうる。

【００１７】本発明に関連して、“オリゴヌクレオチド”なる用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）
又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はこれらの模倣体(mimetics)のオリゴマー又
はポリマーを意味する。この用語は、天然生成核酸塩基、糖及び共有ヌクレオシ
ド間（バックボーン）結合から成るオリゴヌクレオチド並びに、同様に機能する
、非天然生成部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。このような修飾され
た又は置換されたオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば強化された細胞取り
入れ、核酸ターゲットへの強化されたアフィニティ、及びヌクレアーゼの存在下
での安定性の増強のような望ましい性質のために、ネイティブ形態よりも好まし
い。

【００１８】アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態である
が、本発明は非限定的に例えば以下に述べるようなオリゴヌクレオチド模倣体を
含めて、他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセ
ンス化合物は好ましくは約８〜約３０の核酸塩基を含む。約８〜約３０の核酸塩
基（即ち、約８〜約３０の結合ヌクレオシド）を含むアンチセンスオリゴヌクレ
オチドが特に好ましい。好ましい実施態様は、サービビンの発現を阻害するアン
チセンス化合物の配列の少なくとも８−核酸塩基部分を含む。当該技術分野で知
られているように、ヌクレオシドは塩基−糖組み合わせである。ヌクレオシドの
塩基部分は通常は複素環式塩基である。このような複素環式塩基の２つの最も一
般的なクラスはプリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖
部分に共有結合したリン酸基(phosphate group)をさらに包含するヌクレオシド
である。ペントフラノシル糖を包含するヌクレオシドに関して、リン酸基は糖の
２’、３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリ
ゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接ヌクレオシドと相互に共有結合
して、線状ポリマー化合物を形成する。次に、この線状ポリマー構造の各端部が
さらに結合して、環状構造を形成することができるが、開放線状構造が一般に好
ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドの
ヌクレオシド間バックボーンを形成すると見なされる。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常
な結合又はバックボーンは３’〜５’ホスホジエステル結合である。

【００１９】本発明に有用な、好ましいアンチセンス化合物の特定の例は修飾バックボーン
又は非天然ヌクレオシド間結合を包含する。本明細書での定義によると、修飾バ
ックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーン中にリン原子を保有す
るものと、バックボーン中にリン原子を有さないものとを包含する。本明細書の
ために、また当該技術分野でときには参照されるように、ヌクレオシド間バック
ボーンにリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであ
ると見なすことができる。

【００２０】好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは例えばホスホロチオエート、
キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミ
ノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホス
ホネートを包含するメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３
’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを包含す
るホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネー
ト、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’−５’結合を有するボ
ラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、並びにヌクレオシド単位の
隣接対が３’−５’対５’−３’又は２’−５’対５’−２’結合している、逆
の極性を有するものを包含する。種々な塩、混合塩及び遊離酸形態も包含される
。

【００２１】上記リン含有結合の製造を教示する、代表的な米国特許は、非限定的に、米国
特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１
号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５,１８８,８９７号
；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号
；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号
；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号
；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号
；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号
；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号
；及び第５，６２５，０５０号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される
。

【００２２】それらのなかにリン原子を包含しない、好ましい修飾オリゴヌクレオチド・バ
ックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合
ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以
上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成されるバッ
クボーンを有する。これらは、モルホリノ結合を有するもの（一部は、ヌクレオ
シドの糖部分から形成される）；シロキサン・バックボーン；スルフィド、スル
ホキシド及びスルホン・バックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル
・バックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル・バックボー
ン；アルケン含有バックボーン；スルファメート・バックボーン；メチレンイミ
ノ及びメチレンヒドラジノ・バックボーン；スルホネート及びスルホンアミド・
バックボーン；アミド・バックボーン；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ₂構成成
分部分を有する他のバックボーンを包含する。

【００２３】上記オリゴヌクレオシドの製造を教示する、代表的な米国特許は、非限定的に
、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，
４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５,２３５，
０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，
９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，
９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，
２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，
２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，
２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，
３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；及び第５，６７
７，４３９号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。

【００２４】他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体では、ヌクレオチド単位の糖及びヌク
レオシド間結合、即ちバックボーンが新規な基によって置換される。塩基単位は
適当な核酸ターゲット化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。
このようなオリゴマー化合物の１つ、優れたハイブリダイゼーション性質を有す
ることが判明しているオリゴヌクレオチド模倣体はペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼
ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンがアミド含有
バックボーン、特にアミノエチルグリシン・バックボーンによって置換される。
核酸塩基は保持されて、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的に又
は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の製造を教示する代表的な米国特許は、非限
定的に、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号及び第５，
７１９，２６２号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。ＰＮＡ化合
物のさらなる教示はＮｉｅｌｓｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１
４９７−１５００に見出すことができる。

【００２５】本発明の最も好ましい実施態様は、ホスホロチオエート・バックボーンを有す
るオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシド
、特に、−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂−［
メチレン（メチルイミノ）若しくはＭＭＩバックボーンとして知られる］、上記
で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ ₂ −、−ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｃ
Ｈ₂−ＣＨ₂−［ネイティブ・ホスホロジエステル・バックボーンは−Ｏ−Ｐ−Ｏ
−ＣＨ₂−として表される］並びに上記で参照した米国特許第５，６０２，２４
０号のアミド・バックボーンを有するものである。さらに、上記で参照した米国
特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ・バックボーン構造を有するオリゴヌ
クレオチドも好ましい。

【００２６】修飾オリゴヌクレオチドは１つ以上の置換糖部分をも含有することができる。
好ましいオリゴヌクレオチドは２’位置に、下記：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しく
はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−
アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み、これらにおいてア
ルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換のＣ₁−Ｃ₁₀アルキル又は
Ｃ₂−Ｃ₁₀アルケニル及びアルキニルであることができる。Ｏ［（ＣＨ₂）_nＯ］_m ＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）_nＮＨ₂、Ｏ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃、Ｏ（Ｃ
Ｈ₂）_nＯＮＨ₂及びＯ（ＣＨ₂）_nＯＮ［（ＣＨ₂）_nＣＨ₃）］₂が特に好ましく、
これらにおいてｎ及びｍは１から約１０までである。他の好ましいオリゴヌクレ
オチドは２’位置において下記：Ｃ₁−Ｃ₁₀低級アルキル、置換低級アルキル、
アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣ
Ｈ₃、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、Ｏ
ＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール
、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基(cle
aving group)、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物
動態的性質を改良するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改良
するための基、並びに同様な性質を有する他の置換基の１つを含む。好ましい修
飾は２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃、２’−Ｏ−（２
−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる］（Ｍａｒｔｉｎ等，Ｈ
ｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、即ち、アル
コキシアルコキシ基を包含する。他の好ましい修飾は、本出願と共通に所有され
る米国特許出願第０９／０１６，５２０号（１９９８年１月３０日に出願、この
出願の内容は本明細書に援用される）に記載されるような、２’−ＤＭＡＯＥと
しても知られる、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ
Ｎ（ＣＨ₃）₂基を包含する。

【００２７】他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₃）、２’−アミノプ
ロポキシ（２’−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を
包含する。同様な修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置においても、特に糖の３
’−位置に、３’末端ヌクレオチドにおいて又は２’−５’結合オリゴヌクレオ
チドにおいて、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置において(3'position of t
he sugar on the 3'terminal nucleotide or in 2'-5'linked oligonucleotides
and the 5'position of 5'terminal nucleotide)も行うことができる。オリゴ
ヌクレオチドはペントフラノシル糖の代わりに例えばシクロブチル部分のような
糖模倣体を有することもできる。このような修飾糖構造の製造を教示する代表的
な米国特許は、非限定的に、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，
８００号、第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，
８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，
７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，
４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，
３００号；第５，６２７，０５３１号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６
，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；及び第５，７
００，９２０号を包含し、これらの各々はその全体において本明細書に援用され
る。

【００２８】オリゴヌクレオチドは核酸塩基（当該技術分野では簡単に“塩基”としばしば
呼ばれる）修飾又は置換を含むこともできる。本明細書で用いる限り、“未修飾
(unmodified)”又は“天然”核酸塩基はプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン
（Ｇ）と、ピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を
包含する。修飾核酸塩基は他の合成及び天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシ
ン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ハイポキサ
ンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアル
キル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２
−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及び
シトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン
及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ
、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８
−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメ
チル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチ
ルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び
７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを包含
する。他の核酸塩基は米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、
ＴｈｅＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＰｏｌｙｍｅｒ
ＳｃｉｅｎｃｅＡｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９頁，Ｋｒｏ
ｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編集，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９
０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ等，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅ
ｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ版，１９９１，３０，６１３によって開
示されているもの、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，第１５章，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９〜３０２頁，
Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編集，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１
９９３によって開示されているものを包含する。これらの核酸塩基のある一定の
ものは本発明のオリゴマー化合物の結合アフィニティを高めるために特に有用で
ある。これらは５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６
及びＯ−６置換プリンを包含し、これらは２−アミノプロピルアデニン、５−プ
ロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを包含する。５−メチルシトシン
置換は核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ高めることが判明しており（Ｓ
ａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，とＣｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編
集，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，２７６〜２７８頁
）、さらに特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にはいっそ
う、現在好まれている塩基置換である。

【００２９】上記修飾核酸塩基のある一定のもの並びに他の修飾核酸塩基の製造を教示する
代表的な米国特許は、非限定的に、上記米国特許第３，６８７，８０８号、並び
に米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，
０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，
２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，
９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，
５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，
０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；及び第５，７５
０，６９２号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。

【００３０】本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞
分配又は細胞取り込みを強化する１つ以上の部分又はコンジュゲートをオリゴヌ
クレオチドに化学的に結合させることを含む。このような部分は、非限定的に、
例えばコレステロール部分のような脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６
）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅ
ｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル
−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｂｉｏ
ｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、
チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ等，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ
．，１９９２，２０，５３３−５３８），脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール
又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ等，ＥＭＢＯＪ．，
１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ等，ＦＥＢＳＬｅｔｔ
．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ等，Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシ
ル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキ
サデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，
ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；
Ｓｈｅａ等，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３
７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６
９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部
分（Ｍｉｓｈｒａ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，
１２６４，２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ
−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）を包含する
。

【００３１】このようなオリゴヌクレオチド・コンジュゲートの製造を教示する代表的な米
国特許は、非限定的に、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８
２号、第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１
３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１
７号；第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８
４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４
５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３
９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４
４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７
９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６
３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１
３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３
６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３
６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０
６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７
３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２
３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７
５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５
２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８
１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９
６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号；及び第５，６８８，
９４１号を包含し、これらの各々は本明細書に援用される。

【００３２】特定化合物における総ての位置が均一に修飾されることは必ずしも必要ではな
く、実際に、上記修飾の１つより多くを単一化合物に又はオリゴヌクレオチド内
の単一ヌクレオシドにおいても組み入れることができる。本発明は、キメラ化合
物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明に関連して、“キメラ”アンチ
センス化合物又は“キメラ”は、各々が少なくとも１つのモノマー単位、即ち、
オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから構成された、２つ以上の
化学的に全く異なる(distinct)領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴ
ヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的に、ヌクレアーゼ分
解に対する増強された耐性、増強された細胞取り込み及び／又はターゲット核酸
への増強された結合アフィニティをオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌ
クレオチドが修飾されている、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレ
オチドの他の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂す
ることができる酵素の基質として役立ちうる。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮ
Ａ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。それ故
、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡターゲットの開裂を生じて、それによって遺伝
子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に高める。その結果、キメラ・オ
リゴヌクレオチドを用いる場合には、同じターゲット領域にハイブリダイズする
ホスホロチオエート・デオキシオリゴヌクレオチドに比べて、より短いオリゴヌ
クレオチドによって匹敵しうる結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡターゲ
ットの開裂は、ゲル電気泳動と、必要な場合には、当該技術分野において知られ
た関連ある核酸ハイブリダイゼーション方法とによってルーチンに検出すること
ができる。

【００３３】本発明のキメラ・アンチセンス化合物は２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾
オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又は上述したようなオリゴヌク
レオチド模倣体の複合構造として形成することができる。このような化合物は当
該技術分野においてハイブリッド又はギャップマーとしても呼ばれている。この
ようなハイブリッド構造の製造を教示する代表的な米国特許は、非限定的に、米
国特許第５，０１３，８３０号、第５，１４９，７９７号、第５，２２０，００
７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１
１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６
５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；及び第５，７００，
９２２号を包含し、これらの各々はその全体において本明細書に援用される。

【００３４】本発明によって用いるアンチセンス化合物は固相合成の周知の方法によって便
利にかつルーチンに作製することができる。このような合成のための装置は、例
えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ
）を含めた、幾つかの販売会社によって販売されている。当該技術分野において
知られた、このような合成のための任意の他の手段も付加的に又は代替的に用い
ることができる。例えばホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のようなオリ
ゴヌクレオチドの製造に同様な方法を用いることも周知である。

【００３５】本発明のアンチセンス化合物はｉｎｖｉｔｒｏで合成され、生物学的起源の
アンチセンス組成物を含まず、アンチセンス分子のｉｎｖｉｖｏ合成を操作す
るように設計された遺伝的ベクター構築体をも含まない。本発明の化合物は、取
り入れ、分配及び／又は吸収を助成するために、混合、カプセル封入、コンジュ
ゲート化、又は他の方法で他の分子、分子構造体若しくは化合物の混合物、例え
ばリポソーム、受容体をターゲットとする分子、経口的、直腸的、局所若しくは
他の製剤と結合させることができる。このような取り入れ、分配及び／又は吸収
を助成する製剤の製造を教示する、代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許
第５，１０８，９２１号、第５，３５４，８４４号、第５，４１６，０１６号、
第５，４５９，１２７号、第５，５２１，２９１号、第５，５４３，１５８号、
第５，５４７，９３２号、第５，５８３，０２０号、第５，５９１，７２１号、
第４，４２６，３３０号、第４，５３４，８９９号、第５，０１３，５５６号、
第５，１０８，９２１号、第５，２１３，８０４号、第５，２２７，１７０号、
第５，２６４，２２１号、第５，３５６，６３３号、第５，３９５，６１９号、
第５，４１６，０１６号、第５，４１７，９７８号、第５，４６２，８５４号、
第５，４６９，８５４号、第５，５１２，２９５号、第５，５２７，５２８号、
第５，５３４，２５９号、第５，５４３，１５２号、第５，５５６，９４８号、
第５，５８０，５７５号、及び第５，５９５，７５６号を包含し、これらの各々
は本明細書に援用される。

【００３６】本発明のアンチセンス化合物は、任意の製薬的に受容される塩、エステル若し
くはこのようなエステルの塩、又はヒトを含めた動物に投与するときに生物学的
に活性な代謝産物又はその残渣を（直接的又は間接的に）与えることができる、
任意の他の化合物を包含する。したがって、例えば、この開示は本発明のアンチ
センス化合物のプロドラッグ及び製薬的に受容される塩と、このようなプロドラ
ッグの製薬的に受容される塩と、他の生物学的等価物(bioequivalents)にも関す
る。

【００３７】 “プロドラッグ”なる用語は、不活性形で製造され、身体内又はその細胞内で
内因性酵素又は他の化学物質及び／又は条件の作用によって活性形（即ち、薬物
）に転化される治療剤を意味する。特に、本発明のアンチセンス化合物のプロド
ラッグ・バージョンは、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ等へのＷＯ９３／２４５１０（１９９
３年１２月９日公開）に又はＩｍｂａｃｈ等へのＷＯ９４／２６７６４に開示さ
れた方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート
］誘導体として製造される。

【００３８】 “製薬的に受容される塩”なる用語は、本発明の化合物の生理的及び製薬的に
受容される塩：即ち、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、それに望まし
くない毒物学的効果を与えない塩を意味する。製薬的に受容される塩基付加塩は金属又はアミン、例えばアルカリ金属、アル
カリ土類金属又は有機アミンによって形成される。カチオンとして用いられる金
属の例はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適当なア
ミンの例はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン
、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチ
ルグルカミン及びプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅ等，“Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌＳａｌｔｓ”，Ｊ．ｏｆＰｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９７７
，６６，１−１９参照）。前記酸性化合物(acidic compounds)の塩基付加塩は、
遊離酸形を充分な量の所望の塩基と接触させて、慣用的な方法で塩を得ることに
よって製造される。塩形を酸と接触させ、遊離酸を慣用的な方法で単離すること
によって、遊離酸形を再生することができる。遊離酸形はそれらのそれぞれの塩
形とは、例えば極性溶媒中の溶解性のような、ある一定の物理的性質において幾
らか異なるが、他の点では、本発明のために塩はそれらのそれぞれの遊離酸に等
しい。本明細書で用いる限り、“製薬的な付加塩”は本発明の組成物の構成成分
の１つの酸形の製薬的に受容される塩を包含する。これらはアミンの有機酸塩又
は無機酸塩を包含する。好ましい酸塩は塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩
及びリン酸塩である。他の適当な製薬的に受容される塩は当業者に周知であり、
多様な有機酸及び無機酸の塩基塩(basic salts)、例えば、塩酸、臭化水素酸、
硫酸又はリン酸のような無機酸による塩基塩、有機カルボン酸、スルホン酸、ス
ルホ若しくはホスホ酸(sulfo or phospho acids)、又はＮ−置換スルファミン酸
、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキ
シマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ
酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、シンナミン
酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸
、２−アセトキシ安息香酸、エムボン酸(embonic acid)、ニコチン酸、又はイソ
ニコチン酸による塩基塩、及び例えば、本質的にタンパク質の合成に関与する２
０α−アミノ酸、例えばグルタミン酸若しくはアスパラギン酸のようなアミノ酸
による塩基塩、並びにフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２
−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタ
レン−１，５−ジスルホン酸、２−若しくは３−ホスホグリセレート、グルコー
ス−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形
成を付随）による塩基塩、又は例えばアスコルビン酸のような、他の酸有機化合
物による塩基塩を包含する。化合物の製薬的に受容される塩は製薬的に受容され
るカチオンによっても製造することができる。適当な製薬的に受容されるカチオ
ンは当業者に周知であり、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類金属カチオン、
アンモニウムカチオン及び第４級アンモニウムカチオンを包含する。炭酸塩又は
炭酸水素塩(hydrogen carbonate)も可能である。

【００３９】オリゴヌクレオチドに関して、製薬的に受容される塩の好ましい例は、非限定
的に、（ａ）例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カ
ルシウム、ポリアミン、例えば、スペルミン及びスペルミジン等のようなカチオ
ンによって形成される塩；（ｂ）例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝
酸等のような無機酸によって形成される酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ
酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ
酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギニン酸、ポ
リグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスル
ホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸によっ
て形成される塩；及び（ｄ）例えば塩素、臭素及びヨウ素のような元素アニオン
(elemental anion)から形成される塩を包含する。本発明のアンチセンス化合物
は診断法、治療法、予防法のために、並びに研究試薬及びキットとして用いるこ
とができる。治療法のためには、サービビン発現をモジュレートすることによっ
て治療することができる疾患又は障害を有すると疑われる動物、好ましくはヒト
を、本発明によるアンチセンス化合物の投与によって治療する。本発明の化合物
は、適当な製薬的に受容される希釈剤又はキャリヤーにアンチセンス化合物の有
効量を加えることによって薬剤組成物として用いることができる。本発明のアン
チセンス化合物及び方法の使用は予防薬としても、例えば、感染、炎症又は腫瘍
形成を予防する又は遅延させるためにも有用でありうる。

【００４０】本発明のアンチセンス化合物は、サービビンをコードする核酸にハイブリダイ
ズし、この事実を利用して、サンドイッチ及び他のアッセイを容易に構成するこ
とを可能にするので、研究及び診断法のために有用である。本発明のアンチセン
スオリゴヌクレオチドとサービビンをコードする核酸とのハイブリダイゼーショ
ンは、当該技術分野で知られた手段によって検出することができる。このような
手段は、オリゴヌクレオチドへの酵素のコンジュゲーション、オリゴヌクレオチ
ドの放射性標識又は任意の他の適当な検出手段を包含しうる。サンプル中のサー
ビビンのレベルを検出するためにこのような検出手段を用いるキットも作成する
ことができる。

【００４１】本発明はさらに、本発明のアンチセンス化合物を包含する薬剤組成物及び製剤
をも包含する。本発明の薬剤組成物は、局所治療又は全身治療のどちらが必要で
あるかに依存して及び治療すべき領域(area)に依存して、多くの方法で投与する
ことができる。投与は局所的（眼に及び膣投与と直腸投与を含めて粘膜にを包含
する）、例えばネブライザーによるを含めて、粉末若しくはエーロゾルの吸入若
しくは吹き入れ(insufflation)による肺投与、気管内、鼻腔内、表皮及び経皮投
与、経口又は非経口投与でありうる。非経口投与は静脈内、動脈内、皮下、腹腔
内若しくは筋肉内注射若しくは注入；又は頭蓋内、例えば髄腔内(intrathecal)
若しくは脳室内投与(intraventricular)を包含する。少なくとも１つの２’−Ｏ
−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは経口投与に特に有用である
と考えられる。

【００４２】局所投与用の薬剤組成物及び製剤は経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム
、ゲル、滴剤、座薬、スプレイ、液体及び粉末を包含しうる。慣用的な製薬的キ
ャリヤー、水性基剤、粉末若しくは油性基剤、増粘剤等が必要であるか又は望ま
しいと考えられる。被覆コンドーム、グローブ(gloves)等も有用でありうる。

【００４３】経口投与用の組成物及び製剤は、粉末若しくは顆粒、水中若しくは非水性媒質
中の懸濁液若しくは溶液、カプセル、サシェ(sachet)は錠剤を包含する。増粘剤
、フレーバー剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいと考えられる
。

【００４４】非経口的、髄腔内又は脳室内投与用の組成物及び製剤は、緩衝剤、希釈剤及び
他の適当な添加剤、例えば、非限定的に透過促進剤、キャリヤー化合物(carrier
compounds)及び他の製薬的に受容されるキャリヤー又は賦形剤をも含有しうる
無菌水溶液を包含しうる。

【００４５】本発明のオリゴヌクレオチドを含む製薬的組成物及び／又は製剤は、オリゴヌ
クレオチドの消化器投与を強化するために透過促進剤を包含することもできる。
透過促進剤は５つの広範囲なカテゴリー、即ち、脂肪酸、胆汁塩(bile salts)、
キレート化剤、界面活性剤及び非界面活性剤のいずれかに属するとして分類する
ことができる（Ｌｅｅ等，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８，
９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎ
ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９
９０，７：１，１−３３）。これらの広範囲なカテゴリーの１つ以上からの１種
類以上の透過促進剤を包含することができる。

【００４６】透過促進剤として作用する種々な脂肪酸及びそれらの誘導体は、例えば、オレ
イン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸
、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンレエート(r
ecinleate)、モノオレイン（別名、１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール
）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸(arichidonic acid)、グリセリル
１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカル
ニチン、アシルコリン、モノ−及びジ−グリセリド、及びこれらの生理的に受容
される塩（即ち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミ
テート、ステアレート、リノレエート等）を包含する（Ｌｅｅ等，Ｃｒｉｔｉｃ
ａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉ
ｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９１−１９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈ
ｉ，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒ
ｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１、１−３３；Ｅｌ−
Ｈａｒｉｒｉ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６
５１−６５４）。幾つかの現在好ましい脂肪酸の例はカプリン酸ナトリウムとラ
ウリン酸ナトリウムであり、これらは単独で又は組み合わせて、０．５〜５％の
濃度で用いられる。

【００４７】胆汁の生理的役割りは脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を包含す
る（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａ
ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第
９版，Ｈａｒｄｍａｎ等編集，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ
Ｙ，１９９６，第３８章，９３４−９３５頁）。種々な天然胆汁塩及びそれらの
合成誘導体は透過促進剤として作用する。したがって、“胆汁塩”なる用語は、
胆汁の天然生成構成成分のいずれか並びにそれらの合成誘導体のいずれかを包含
する。現在好ましい胆汁塩の例はケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及び／又はウルソ
デオキシコール酸（ＵＤＣＡ）であり、これらは一般に０．５〜２％の濃度で用
いられる。

【００４８】１種類以上の透過促進剤を含む複合製剤を用いることができる。例えば、胆汁
塩を脂肪酸と組み合わせて用いて、複合製剤を製造することができる。好ましい
組み合わせは、カプリン酸ナトリウム又はラウリン酸ナトリウム（一般に、０．
５〜５％）と組み合わせたＣＤＣＡを包含する。

【００４９】キレート化剤は、非限定的に、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシ
サリチレート及びホモバニレート(homovanilate)）、コラーゲンのＮ−アシル誘
導体、ラウレス−９(laureth-9)、及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体
（エナミン）を包含する（Ｌｅｅ等，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎ
ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９
９１，８：２，９２−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖ
ｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓ
ｔｅｍｓ，１９９０，７：１，１−３３；Ｂｕｕｒ等，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌＲ
ｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。キレート化剤はＤＮアーゼ阻害剤とし
ても役立つという付加的利点を有する。

【００５０】界面活性剤は、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラ
ウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを包含する（Ｌ
ｅｅ等，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９１
）；及び例えばＦＣ−４３のようなペルフルオロケミカル・エマルジョン(perfl
uorochemical emulsions)（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２−２５７）を包含する。

【００５１】非界面活性剤は，例えば不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニル
アザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ等，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ
ｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ
，１９９１，８：２，９２−１９１）と；例えばジクロフェナクナトリウム、イ
ンドメタシン及びフェニルブタゾンのような非ステロイド系抗炎症剤（Ｙａｍａ
ｓｈｉｔａ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２
１−６２６）とを包含する。

【００５２】本明細書で用いる限り、“キャリヤー化合物”は核酸、又は不活性である（即
ち、それ自体は生物学的活性を有さない）が、例えば生物学的に活性な核酸を分
解することによって又は循環からのその除去を促進することによって、生物学的
活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを減ずるｉｎｖｉｖｏプロセスに
よって核酸として認識される、核酸の類似体を意味する。核酸とキャリヤー化合
物とを、典型的に後者の物質を過剰にして、同時投与すると、恐らく共通の受容
体に対する核酸とキャリヤー化合物との競合のために、肝臓、腎臓又は他の循環
外溜め(extracirculatory reservoir)中に回収される核酸量の実質的な減少が生
じうる。例えば、肝臓組織における部分的ホスホロチオエート化オリゴヌクレオ
チドの回収は、これがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸(pol
ycytidic acid)又は４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２
，２’−ジスルホン酸と同時投与されるときには、減少する（Ｍｉｙａｏ等，Ａ
ｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋ
ａｋｕｒａ等，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅ
ｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。

【００５３】キャリヤー化合物とは対照的に、“製薬的に受容されるキャリヤー”（賦形剤
）は１種類以上の核酸を動物に投与するための製薬的に受容される溶媒、懸濁化
剤又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。製薬的に受容されるキャ
リヤーは液体でも固体でもよく、特定の薬剤組成物の核酸及び他の構成成分と組
み合わされたときに、所望の嵩(bulk)、コンシステンシー等を生じることを念頭
において計画された投与方法によって選択される。典型的な、製薬的に受容され
るキャリヤーは，非限定的に，結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロ
コシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）
；充填剤（例えば、ラクトースと他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチ
ン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カル
シウム等）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コ
ロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コ
ーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム
等）；崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウム等）；又は湿潤剤（
例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）を包含する。経口投与される投与形のため
の持続放出経口投与系及び／又は腸溶性被膜は、米国特許第４，７０４，２９５
号；第４，５５６，５５２号；第４，３０９，４０６号；及び第４，３０９，４
０４号に記載されている。

【００５４】本発明の組成物は、薬剤組成物中に慣用的に見出される他の補助的構成成分を
、それらの技術上確立された使用レベルで付加的に含有することができる。した
がって、例えば、組成物は付加的な、相容性の、製薬的に活性な物質、例えばか
ゆみ止め剤、収斂薬(astringents)、局部麻酔薬若しくは抗炎症薬を含有するこ
とができる、又は本発明の組成物の種々な投与形を物理的に製剤化するために有
用な付加的な物質、例えば染料、フレーバー剤、保存剤、酸化防止剤、不透明化
剤、増粘剤及び安定剤を含有することができる。しかし、このような物質は、加
えたときに、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を不当に妨害してはなら
ない。

【００５５】本発明のアンチセンス化合物を患者に導入する方法に関係なく、コロイド状分
散系を投与ビヒクルとして用いて、化合物のｉｎｖｉｖｏ安定性を強化する及
び／又は化合物に特定の器官、組織若しくは細胞種類をターゲットとさせること
ができる。コロイド状分散系は、非限定的に、マクロ分子複合体、ナノカプセル
、微小球、ビーズ、並びに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソー
ム及び特徴のない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体を包含する脂質ベース
系(lipid-based systems)を包含する。好ましいコロイド状分散系は多くのリポ
ソームである。リポソームは、二層形状で配置された脂質から成る１つ以上の外
層（単数又は複数）によって囲まれた水性コアを有する顕微鏡的球(microscopic
spheres)である（一般に、Ｃｈｏｎｎ等，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ．，１９９５，６，６９８−７０８を参照のこと）。

【００５６】本発明のある一定の実施態様は、（ａ）１種類以上のアンチセンス化合物と、
（ｂ）非アンチセンス機構によって機能する１種類以上の他の化学療法剤とを含
有する、リポソーム及び他の組成物を提供する。このような化学療法剤の例は、
非限定的に、例えばダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレ
オマイシン、ミトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メル
ファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シ
タラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン(flo
xuridine)（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビン
クリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン及びジエ
チルスチルベストロール（ＤＥＳ）を包含する。一般的には、ＴｈｅＭｅｒｃ
ｋＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｈｅｒａｐｙ，第１
５版，Ｂｅｒｋｏｗ等編集，１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１２０６〜１
２２８頁参照。非限定的に非ステロイド系抗炎症薬及びコルチコステロイドを包
含する抗炎症薬と、非限定的にリビビリン(ribivirin)、ビダラビン、アシクロ
ビル(acyclovir)及びガンシクロビル(ganciclovir)を包含する抗ウイルス薬も本
発明の組成物に組み合わせることができる。一般的には、それぞれ、ＴｈｅＭ
ｅｒｃｋＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｈｅｒａｐｙ
，第１５版，Ｂｅｒｋｏｗ等編集，１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，２４９
９−２５０６頁と、４６−４９頁参照。他の非アンチセンス化学療法剤も本発明
の範囲内である。２種類以上の組み合わせた化合物を一緒に又は連続的に用いる
ことができる。

【００５７】他の関連実施態様では、本発明の組成物は第１核酸をターゲットとする１種類
以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドと、第２核酸ターゲットを
標的とする１種類以上の付加的なアンチセンス化合物とを含有することができる
。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、非限定的に、本出願と共通に所有さ
れ、本明細書に援用される上記米国特許又は係属出願、又は上記公開ＰＣＴ出願
に開示される下記ターゲットに向けられるものを包含する：ｒａｆ（ＷＯ９６／
３９４１５、ＷＯ９５／３２９８７と、米国特許第５，５６３，２５５号及び第
５，６５６，６１２号）、ｐ１２０核小体抗原（ＷＯ９３／１７１２５と米国特
許第５，６５６，７４３号）、タンパク質キナーゼＣ（ＷＯ９５／０２０６９、
ＷＯ９５／０３８３３及びＷＯ９３／１９２０３）、多重薬物耐性関連タンパク
質（ＷＯ９５／１０９３８と米国特許第５，５１０，２３９号）、転写因子ＡＰ
−１のサブユニット（係属出願の米国特許出願第０８／８３７，２０１号，１９
９７年４月１４日出願）、Ｊｕｎキナーゼ（係属出願の米国特許出願第０８／９
１０，６２９号，１９９７年８月１３日出願）、ＭＤＲ−１（多重薬物耐性糖タ
ンパク質；係属出願の米国特許出願第０８／７３１，１９９号，１９９７年９月
３０日出願）、ＨＩＶ（米国特許第５，１６６，１９５号と第５，５９１，６０
０号）、ヘルペスウイルス（米国特許第５，２４８，６７０号と第５，５１４，
５７７号）、サイトメガロウイルス（米国特許第５，４４２，０４９号と第５，
５９１，７２０号）、乳頭腫ウイルス（米国特許第５，４５７，１８９号）、細
胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（米国特許第５，５１４，７８８号）、５−
リポキシゲナーゼ（米国特許第５，５３０，１１４号）並びにインフルエンザウ
イルス（米国特許第５，５８０，７６７号）。２種類以上の組み合わせた化合物
を一緒に又は連続的に用いることができる。

【００５８】治療用組成物の製剤化とそれらのその後の投与とは、当業者の熟練の範囲内で
あると考えられる。投与は治療されるべき疾患状態の重症度と応答性(responsive
ness)とに依存し、治療経過は数日間から数か月間まで、又は治癒が生じるまで
、又は疾患状態の軽減が達成されるまで持続する。最適の投与計画は患者の体内の薬物蓄積の測定から算出されうる。通常に熟練した人は最適投与量
、投与方法及び反復速度(repetition rates)を容易に決めることができる。最適
投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化する可能性があ
り、一般にｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効である
と発見されたＥＣ₅₀ｓに基づいて見積もられうる。一般に、投与量は０．０１μ
ｇ〜１００ｇ／体重ｋｇであり、１日間に、１週間に、１か月間に若しくは１年
間に１回以上、又は２〜２０年間毎に１回でさえも投与されうる。当業者は体液
又は身体組織中の薬物の測定された滞留時間及び濃度に基づいて投与の反復速度
を容易に推定することができる。上首尾な治療後に、疾患状態の再発を防止する
ために、オリゴヌクレオチドを１日間に１回以上から２０年間毎に１回まで０．
０１μｇ〜１００ｇ／体重ｋｇの範囲内の維持用量で投与することから成る維持
療法を患者に受けさせることが望ましいと考えられる。

【００５９】本発明をある一定のその好ましい実施態様に従って詳しく説明したが、次の実
施例は本発明を例示するためにのみ役立つものであり、本発明を限定するとは意
図されないものである。

【００６０】実施例実施例１オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホロアミダイトデオキシ及び２’−アルコキシアミダイト２’−デオキシ及び２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホロ
アミダイトは商業的供給源（例えば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，ＮｅｅｄｈａｍＭ
Ａ又はＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，ＳｔｅｒｌｉｎｇＶＡ）から
購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書
に援用される米国特許第５，５０６，３５１号に記載されたように製造する。２
’−アルコキシアミダイトを用いるオリゴヌクレオチドの合成のために、テトラ
ゾールと塩基とのパルス投与(pulse delivery)後の待機段階(wait step)を３６
０秒間に高めた以外は、非修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを用いた。

【００６１】５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有す
るオリゴヌクレオチドを公開方法［Ｓａｎｇｈｖｉ等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，２１，３１９７−３２０３］に従って商業
的に入手可能なホスホロアミダイト（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌ
ｉｎｇＶＡ又はＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ＮｅｅｄｈａｍＭＡ）を用いて合成し
た。

【００６２】２’−フルオロアミダイト２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト２’−フルオロオリゴヌクレオチドを既述されたように［Ｋａｗａｓａｋｉ等
，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１及び本明細書に援
用される米国特許第５，６７０，６３３号］合成した。簡単に説明すると、保護
されたヌクレオシドＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデ
ノシンを商業的に入手可能な９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発物
質として用いて、２’−α−フルオロ原子を導入する文献方法を２’−β−トリ
チル基のＳ_N２−置換によって修飾することによって合成した。このようにして
、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−アラビノフラノシルアデニンは３’，５’−ジテ
トラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として中程度の収率で選択的に保護された
。ＴＨＰとＮ６−ベンゾイル基との脱保護は標準方法論を用いて達成され、標準
方法を用いて、５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）と５’−ＤＭＴ−３’−
ホスホロアミダイト中間体とを得た。

【００６３】２’−フルオロデオキシグアノシン２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成を、出発物質としてのテト
ライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシ
ルグアニンと、中間体のジイソブチリル−アラビノフラノシルグアノシンへの転
化とを用いて達成した。ＴＰＤＳ基の脱保護に続いて、ヒドロキシル基のＴＨＰ
による保護を行って、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニ
ンを得た。選択的Ｏ−デアシル化及びトリフラート化(triflation)に続いて、粗
生成物をフルオリド(fluoride)によって処理して、次にＴＨＰ基を脱保護した。
標準方法論を用いて、５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダ
イトを得た。

【００６４】２’−フルオロウリジン２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成を、２，２’−アンヒドロ−
１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジンによっ
て処理する文献方法の修飾によって達成した。標準方法を用いて、５’−ＤＭＴ
及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得た。

【００６５】２’−フルオロデオキシシチジン２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを２’−デオキシ−２’−フルオロ
ウリジンのアミノ化によって合成して、続いて選択的に保護して、Ｎ４−ベンゾ
イル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準方法を用いて、５
’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得た。

【００６６】２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト２’−Ｏ−メトキシエチル−置換ヌクレオシドアミダイトを次のように、又は
代替え的に、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，ＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃ
ｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４の方法によって製造する。

【００６７】２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウ
リジン］５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子市、日本から商業的に入
手可能）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ
，０．４２０Ｍ）及び炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ
（３００ｍｌ）に加えた。この混合物を撹拌しながら加熱還流させ、発生二酸化
炭素ガスを制御した方法で放出させた。１時間後に、やや暗色化した溶液を減圧
下で濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル（２．５リットル）中に撹
拌しながら注入した。生成物はガムを形成した。エーテルをデカントして、残渣
を最少量のメタノール（約４００ｍｌ）に溶解した。この溶液を新鮮なエーテル
（２．５リットル）中に注入して、硬質ガムを得た。エーテルをデカントして、
ガムを真空炉（１ｍｍＨｇ、６０℃において２４時間）で乾燥させて、固体を得
て、これを粉砕して、明黄褐色粉末（５７ｇ、８５％粗収率）を得た。ＮＭＲス
ペクトルはそのナトリウム塩としてのフェノール（約５％）によって汚染された
構造に一致した。この物質をさらなる反応のためにそのまま用いた（又は、この
物質を酢酸エチル中メタノールの勾配（１０〜２５％）を用いて、カラムクロマ
トグラフィーによってさらに精製して、白色固体、ｍｐ２２２〜４℃を得ること
ができる）。

【００６８】２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリ
ス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）及び２−メトキシ
エタノール（１．２リットル）を２リットルのステンレス鋼圧力容器に加えて、
１６０℃の予熱した油浴に入れた。１５５〜１６０℃において４８時間加熱した
後に、容器を開放して、溶液を蒸発乾燥させて、ＭｅＯＨ（２００ｍｌ）を加え
て摩砕した。残渣を熱アセトン（１リットル）中に懸濁させた。不溶性塩を濾過
し、アセトン（１５０ｍｌ）によって洗浄して、濾液を蒸発させた。残渣（２８
０ｇ）をＣＨ₃ＣＮ（６００ｍｌ）中に溶解して、蒸発させた。シリカゲルカラ
ム（３ｋｇ）を０．５％Ｅｔ₃ＮＨ含有ＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトン／ＭｅＯＨ（２０
：５：３）によって充填した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍｌ）中に溶解して、
シリカ（１５０ｇ）に吸着させてから、カラムに装填した。生成物を充填溶媒(p
acking solvent)によって溶出して、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。不純
な画分を再処理して(reworking)、付加的な物質を得た。

【００６９】２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリ
ジン２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）
をピリジン（２５０ｍｌ）と同時蒸発させ、乾燥した残渣をピリジン（１．３リ
ットル）中に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの第１アリコート（９４．
３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、混合物を室温において１時間撹拌した。ジメトキ
シトリチルクロリドの第２アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、反
応をさらに１時間撹拌した。次に、メタノール（１７０ｍｌ）を加えて、反応を
停止させた。ＨＰＬＣは約７０％生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ ₃ ＣＮ（２００ｍｌ）を加えて摩砕した。残渣をＣＨＣｌ₃（１．５リットル）中
に溶解し、２ｘ５００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃と２ｘ５００ｍｌの飽和ＮａＣｌ
とによって抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。
２７５ｇの残渣が得られた。この残渣を、０．５％Ｅｔ₃ＮＨ含有ＥｔＯＡｃ／
ヘキサン／アセトン（５：５：１）によって充填し、溶出する３．５ｋｇのシリ
カゲルカラム上で精製した。純粋な画分を蒸発させて、１６４ｇの生成物を得た
。不純な画分からさらに約２０ｇを得て、総収量１８３ｇ（５７％）を得た。

【００７０】３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリ
ジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍｌのＤＭＦと１
８８ｍｌのピリジンとから製造した３：１混合物、７５０ｍｌ）及び無水酢酸（
２４．３８ｍｌ，０．２５８Ｍ）を一緒にして、室温において２４時間撹拌した
。反応をｔｌｃによって、ｔｌｃサンプルにＭｅＯＨを添加して最初にクエンチ
することによって、モニターした。ｔｌｃによって判定される反応の完了時に、
ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）を加えて、混合物を３５℃において蒸発させた。残渣をＣ
ＨＣｌ₃（８００ｍｌ）中に溶解し、２ｘ２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム
と２ｘ２００ｍｌの飽和ＮａＣｌとによって抽出した。水層を２００ｍｌのＣＨ
Ｃｌ₃によって逆抽出した。一緒にした有機層(organic)を硫酸ナトリウムによっ
て乾燥させ、蒸発させて、１２２ｇの残渣（約９０％の生成物）を得た。残渣を
３．５ｋｇのシリカゲルカラム上で精製して、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）
を用いて溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させて、９６ｇ（８４％）を得た。
後の画分(later fractions)からさらに１．５ｇを回収した。

【００７１】３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（７００ｍｌ
）中に溶解することによって、第１溶液を製造して、かたわらに置いた。トリエ
チルアミン（１８９ｍｌ，１．４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（１リットル）中のトリア
ゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）の溶液に加えて、−５℃に冷却し、オーバーヘッド
スターラーを用いて０．５時間撹拌した。０〜１０℃に維持した撹拌溶液に、Ｐ
ＯＣｌ₃を３０分間にわたって滴加し、得られた混合物をさらに２時間攪拌した
。第１溶液を後者の溶液に４５分間にわたって滴加した。得られた反応混合物を
低温室内で一晩貯蔵した。この反応混合物から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。
残渣をＥｔＯＡｃ（１リットル）中に溶解し、不溶性固体を濾過によって除去し
た。濾液を１ｘ３００ｍｌのＮａＨＣＯ₃と２ｘ３００ｍｌの飽和ＮａＣｌとに
よって洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣にＥｔＯＡｃを
加えて、摩砕し、標題化合物を得た。

【００７２】２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ
ジンジオキサン（５００ｍｌ）とＮＨ₄ＯＨ（３０ｍｌ）中の３’−Ｏ−アセチル
−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４
−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）の溶液を室温において２時
間撹拌した。このジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍｌ
）と共沸蒸留した。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍｌ）中に溶解して、２リットルの
ステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ₃ガスによって飽和したＭｅＯＨ（４００
ｍｌ）を加えて、容器を１００℃に２時間加熱した（ｔｌｃは完了した転化を示
した）。容器内容物を蒸発乾燥させ、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）中に溶解
して、飽和ＮａＣｌ（２００ｍｌ）によって１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリ
ウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、８５ｇ（９５％）の標題化合物を得た。

【００７３】Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ
ジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍｌ）中に溶解し、無水安息香
酸（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間攪拌した後に、
ｔｌｃは反応がほぼ９５％完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅ
ＯＨ（２００ｍｌ）と共沸蒸留した。残渣をＣＨＣｌ₃（７００ｍｌ）中に溶解
し、飽和ＮａＨＣＯ₃（２ｘ３００ｍｌ）と飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍｌ）に
よって抽出し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、蒸発させて、残渣（９６ｇ）を得た。
残渣を溶離溶媒として０．５％Ｅｔ₃ＮＨ含有ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）
を用いて１．５ｋｇシリカカラム上でクロマトグラフィーした。純粋な生成物画
分を蒸発させて、９０ｇ（９０％）の標題化合物を得た。

【００７４】Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン−３’−アミダイトＮ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１リットル）中
に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）と２−シアノエト
キシ−テトラ（イソプロピル）ホスフィット（４０．５ｍｌ，０．１２３Ｍ）と
を窒素雰囲気下で撹拌しながら加えた。得られた混合物を室温において２０時間
攪拌した（ｔｌｃは反応が９５％完了したことを示した）。この反応混合物を飽
和ＮａＨＣＯ₃（１ｘ３００ｍｌ）と飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍｌ）によって
抽出した。水性洗液(aqueous washes)をＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍｌ）によって逆抽
出し、抽出物を一緒にして、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮した。得られた残渣
を溶離溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を用いて１．５ｋｇシリカカ
ラム上でクロマトグラフィーした。純粋な画分を一緒にして、９０．６ｇ（８７
％）の標題化合物を得た。

【００７５】２’−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトと２’−（ジメチルア
ミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトアミノオキシエチル及びジメチルアミノオキシエチルアミダイトを米国特許出
願第１０／０３７，１４３号（１９９８年２月１４日出願）と第０９／０１６，
５２０号（１９９８年１月３０日出願）との方法によって製造する、これらの出
願の各々は本出願と共通に所有され、本明細書に援用される。

【００７６】実施例２オリゴヌクレオチド合成非置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを自動化ＤＮ
Ａ合成装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）で、ヨ
ウ素による酸化に関する標準ホスホロアミダイト化学を用いて合成する。

【００７７】ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に、但し、標準酸化ボトルをホス
フィット結合(phosphite linkages)の段階的硫黄化(thiation)のためにアセトニ
トリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの
０．２Ｍ溶液に代えて、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を合成する。硫黄化待機
段階は６８秒間に延長し、この段階に続いて、キャッピング段階を行った。ＣＰ
Ｇカラムから切断し、５５℃の濃水酸化アンモニウム中で脱ブロックした（１８
時間）後に、オリゴヌクレオチドを０．５ＭＮａＣｌ溶液から２．５倍量のエ
タノールによって２回沈降させることによって、精製した。ホスフィネートオリ
ゴヌクレオチド(phosphinate oligonucleotides)を、本明細書に援用される米国
特許第５，５０８，２７０号に記載されるように製造する。

【００７８】アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許
第４，４６９，８６３号に記載されるように製造する。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを、本明細
書に援用される米国特許第５，６１０，２８９号又は第５，６２５，０５０号に
記載されるように製造する。

【００７９】ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許第
５，２５６，７７５号又は米国特許第５，３６６，８７８号に記載されるように
製造する。アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される公
開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６
（それぞれ、ＷＯ９４／１７０９３及びＷＯ９４／０２４９９として公開）に記
載されるように製造する。

【００８０】３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデートオリゴヌクレオチドを、本
明細書に援用される米国特許第５，４７６，９２５号に記載されるように製造す
る。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許第
５，０２３，２４３号に記載されるように製造する。

【００８１】ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，１３０，３０２号
と第５，１７７，１９８号（両方とも、本明細書に援用される）に記載されるよ
うに製造する。

【００８２】実施例３オリゴヌクレオシド合成ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合
オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレ
ンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及びアミド−３結合オリゴヌクレ
オシドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、
及びアミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカル
ボニル結合オリゴヌクレオシド、並びに例えば交互のＭＭＩとＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓ
結合を有する混合バックボーン化合物を、米国特許第５，３７８，８２５号、第
５，３８６，０２３号、第５，４８９，６７７号、第５，６０２，２４０号及び
第５，６１０，２８９号（これらの総ては本明細書に援用される）に記載される
ように製造する。

【００８３】ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドを、本明
細書に援用される、米国特許第５，２６４，５６２号と第５，２６４，５６４号
に記載されるように製造する。エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドを、本明細書に援用される米国特許
第５，２２３，６１８号に記載されるように製造する。

【００８４】実施例４ＰＮＡ合成ペプチド核酸（ＰＮＡ）：合成、性質及び可能な用途、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ
＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３に記
載される、種々な方法のいずれかによって、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を製造す
る。これらは、本明細書に援用される、米国特許第５，５３９，０８２号、第５
，７００，９２２号及び第５，７１９，２６２号によっても製造することができ
る。

【００８５】実施例５キメラオリゴヌクレオチドの合成本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又は混合オリゴヌク
レオチド／オリゴヌクレオシドは幾つかの異なる種類でありうる。これらは、結
合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの５’ウィングと
３’ウィングセグメントとの間に配置されている第１型と、“ギャップ”セグメ
ントがオリゴマー化合物の３’末端又は５’末端のいずれかに配置されている第
２“開放末端(open end)”型とを包含する。第１型のオリゴヌクレオチドは“ギ
ャップマー”又はギャップ化(gapped)オリゴヌクレオチドとしても当該技術分野
において知られる。第２型のオリゴヌクレオチドは“ヘミマー(hemimers)”又は
“ウィングマー(wingmers)”としても当該技術分野において知られる。

【００８６】［２’−Ｏ−Ｍｅ］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチド２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエート及び２’−デオキシホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドをＡｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化ＤＮＡ合成装置モデル３８０Ｂを用いて上
記のように合成する。自動化合成装置と、ＤＮＡ部分のための２’−デオキシ−
５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトと、５’及び３’ウ
ィングのための５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホス
ホロアミダイトとを用いて、オリゴヌクレオチドを合成する。テトラゾールと塩
基を供給した後の待機段階を６００秒間に延長することによって標準合成サイク
ルを改変して、ＲＮＡに対しては４回、２’−Ｏ−メチルに対しては２回繰り返
す。完全に保護されたオリゴヌクレオチドをサポートから切断して、リン酸基を
３：１アンモニア／エタノール中で室温において一晩脱保護してから、乾燥する
まで凍結乾燥する。次に、室温における２４時間のメタノール性アンモニア中で
の処理を行って、総ての塩基を脱保護して、サンプルを再び乾燥するまで凍結乾
燥させた。ペレットをＴＨＦ中１ＭＴＢＡＦ中に室温において２４時間再懸濁
させて、２’位置を脱保護する。次に、１ＭＴＥＡＡによって反応をクエンチ
し、次に、サンプルを回転蒸発させて(rotovac)、１／２量に減少してから、Ｇ
２５サイズ排除カラムで脱塩する(desalted)。次に、回収されたオリゴ(oligo)
を収量と純度に関して、毛管電気泳動と質量スペクトロメトリーとによって分光
測光的に分析する。

【００８７】［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−
（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−
（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、２’−
Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上記方法によって、２’−Ｏ−メ
チルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを用いて製
造した。

【００８８】［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２’−デオキシ
ホスホロチオエート］−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル
］キメラオリゴヌクレオチド［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２’−デオキシ
ホスホロチオエート］−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キ
メラオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドに関す
る上記方法によって、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メト
キシエチル）アミダイトを用い、キメラ構造のウィング部分内にホスホロチオエ
ートヌクレオチド間結合を形成するためにヨウ素によって酸化し、中央ギャップ
のためにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を形成するために３，Ｈ−１，
２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬
）を用いて硫化して製造する。

【００８９】他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオ
リゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書に援用される米国特許第５
，６２３，０６５号に従って合成する。

【００９０】実施例６オリゴヌクレオチド単離制御多孔質ガラスカラム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断
し、５５℃の濃水酸化アンモニウム中で１８時間脱ブロックした後に、オリゴヌ
クレオチド又はオリゴヌクレオシドを０．５ＭＮａＣｌから２．５倍量のエタ
ノールによって２回沈降させることによって精製する。合成されたオリゴヌクレ
オチドを変性ゲル(denaturing gels)上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって分析し、少なくとも８５％の全長物質であると判定した。合成で得られる
ホスホロチオエート結合とホスホジエステル結合との相対的量を³¹Ｐ核磁気共鳴
スペクトロメトリーによって定期的にチェックし、幾つかの研究のために、オリ
ゴヌクレオチドをＣｈｉａｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６
，１８１６２−１８１７１に記載されるように、ＨＰＬＣによって精製した。Ｈ
ＰＬＣ−精製物質によって得られた結果はｎｏｎ−ＨＰＬＣ精製物質によって得
られた結果に類似した。

【００９１】実施例７オリゴヌクレオチド合成−９６穴プレートフォーマット標準９６穴フォーマットにおいて９６配列を同時にアセンブルする(assemblin
g)ことができる自動化合成装置での固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミダイト化学に
よって、オリゴヌクレオチドを合成した。ヨウ素水溶液による酸化によって、ホ
スホジエステルヌクレオチド間結合を与えた。ホスホロチオエートヌクレオチド
間結合は、無水アセトニトリル中の３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オ
ン１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を用いた硫化によって形成し
た。標準塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは商業的
な販売者（例えば、ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅ
ｒＣｉｔｙ，ＣＡ，又はＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）
から購入した。非標準ヌクレオシドは既知文献又は特許化された方法によって合
成する。これらは塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト
として用いる。

【００９２】オリゴヌクレオチドをサポートから切断し、高温（５５〜６０℃）の濃ＮＨ₄
ＯＨ中で１２〜１６時間脱保護し、次に、放出された生成物を真空下で乾燥させ
た。次に、乾燥した生成物を無菌水中に再懸濁させて、マスタープレートを得て
、その後、これから総ての分析及び試験プレートサンプルを自動式ピペッター(r
obotic pipettors)を用いて希釈する。

【００９３】実施例８オリゴヌクレオチド分析−９６穴プレートフォーマット各穴中のオリゴヌクレオチドの濃度を、サンプルの希釈とＵＶ吸収スペクトロ
スコピーとによって評価した。個々の生成物の全長統合性(full-length integri
ty)を、９６穴プレートフォーマット（ＢｅｃｋｍａｎＰ／ＡＣＥ^TM ＭＤＱ
）又は、個別に調製されたサンプルに対しては、商業的ＣＥ装置（例えば、Ｂｅ
ｃｋｍａｎＰ／ＡＣＥ^TM ５０００，ＡＢＩ２７０）のいずれかにおける毛
管電気泳動（ＣＥ）によって評価した。エレクトロスプレイ−質量スペクトロス
コピーを用いた化合物の質量分析によって、塩基とバックボーン組成を確認した
。総てのアッセイ試験プレートを単一及びマルチ−チャンネル自動式ピペッター
を用いて、マスタープレートから希釈した。プレート上の化合物の少なくとも８
５％が少なくとも８５％全長である場合に受容されうると、プレートは判定され
た。

【００９４】実施例９細胞培養とオリゴヌクレオチド処理ターゲット核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は多様な細胞種類のい
ずれにおいても、ターゲット核酸が測定可能なレベルで存在する限り、試験する
ことができる。これは、例えば、ＰＣＲ又はノーザンブロット分析を用いてルー
チンに測定することができる。次の４細胞種類は例示のために提供するものであ
り、他の細胞種類もルーチンに使用可能である。

【００９５】Ｔ−２４細胞：移行上皮性膀胱癌(transitional cell bladder carcinoma)細胞系Ｔ−２４を
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ
Ｃ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃ
ｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
と、ペニシリン１００単位／ｍｌと、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ
（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ，ＭＤ）とを補充した完全ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で、Ｔ
−２４細胞をルーチンに培養した。細胞が９０％集密度(confluence)に達したと
きに、細胞をトリプシン処理と希釈とによって、ルーチンに継代培養した。細胞
をＲＴ−ＰＣＲ分析に用いるために７０００細胞／穴の密度において９６穴プレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）中に接種した。

【００９６】ノーザンブロッティング又は他の分析のためには、細胞を１００ｍｍ及び他の
標準組織培養プレート上に接種して、適当な量の培地とオリゴヌクレオチドとを
用いて、同様に処理した。

【００９７】Ａ５４９細胞：ヒト肺癌細胞系Ａ５４９をＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。１
０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と、ペニシリン１００単位／ｍｌと、ストレプト
マイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とを補充したＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂ
ｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
）中で、Ａ５４９細胞をルーチンに培養した。細胞が９０％集密度に達したとき
に、細胞をトリプシン処理と希釈とによって、ルーチンに継代培養した。

【００９８】ＮＨＤＦ細胞：ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。提供者によって
薦められたように補充した線維芽細胞増殖培地(Fibroblast Growth Medium)（Ｃ
ｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅＭＤ
）中に、ＮＨＤＦｓをルーチンに維持した。細胞を提供者によって薦められたよ
うに１０継代まで維持した。

【００９９】ＨＥＫ細胞：ヒト胚性ケラチノサイト（ＨＥＫ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＨＥＫｓを提供者に
よって薦められたように処方したケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中にルーチンに
維持した。細胞を提供者によって薦められたように１０継代まで維持した。

【０１００】アンチセンス化合物による処理細胞が８０％集密度に達したときに、細胞をオリゴヌクレオチドによって処理
した。９６穴プレートで増殖した細胞に関しては、穴を２００μｌＯＰＴＩ−
ＭＥＭ^TM−１還元血清培地(reduced-serum medium)（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）によ
って１回洗浄し、次に、３．７５μｇ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^TM（Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬ）と１５０ｎＭの最終濃度の望ましいオリゴヌクレオチドとを含有
するＯＰＴＩ−ＭＥＭ^TM−１１３０μｌによって処理した。４時間の処理後に
、培地を新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチド処理後１６時間に細胞を回
収した。

【０１０１】実施例１０サービビン発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析サービビン発現のアンチセンスモジュレーションは当該技術分野において知ら
れた多様な方法で分析することができる。例えば、サービビンｍＲＮＡレベルを
例えばノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリアル
タイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量することができる。リアルタイム定
量ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ分析は総細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ
に対して行うことができる。ＲＮＡ単離方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．
Ｍ．等，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ，１巻，４．１．１−４．２．９頁と４．５．１−４．５．３頁，
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示される。ノー
ザンブロット分析は当該技術分野においてルーチンであり、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１巻，４．２．１−４．２．９頁，ＪｏｈｎＷｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６に教示される。リアルタイム定量（Ｐ
ＣＲ）は、ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉ
ｔｙ，ＣＡから得られ、製造者の指示に従って用いられる、商業的に入手可能な
ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TM７７００配列検出系を用いて好都合に達成することができ
る。他のＰＣＲ方法も当該技術分野において知られている。

【０１０２】サービビンタンパク質レベルは当該技術分野において周知の多様な方法、例え
ば、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ
又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で定量することができる。サービ
ビンに対する抗体も同定することができ、多様な供給源、例えば、抗体のＭＳＲ
Ｓカタログ（ＡｅｒｉｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｍ
Ｉ）から入手可能であるが、又は慣用的な抗体作製方法によって製造することが
できる。ポリクローナル抗血清の製造方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ
．等，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ，２巻，１１．１２．１−１１．１２．９頁，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。モノクローナル抗体の製造
方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２巻，１１．４．１−１
１．１１．５頁，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に
教示される。

【０１０３】免疫沈降は当該技術分野において標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ
．Ｍ．等，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，２巻，１０．１６．１−１０．１６．１１頁，ＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８に見出すことができる。ウェスタン
ブロット（イムノブロット）分析は、当該技術分野において標準的であり、例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２巻，１０．８．１−１０．８．２１
頁，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に見出すことが
できる。酵素結合免疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］は、当該技術分野において標準的であ
り、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌ
ｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２巻，１１．２．１−１１．
２．２２頁，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１に見出
すことができる。

【０１０４】実施例１１ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡをＭｉｕｒａ等，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，４
２，１７５８−１７６４に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離の他の方
法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１巻，４．５．１−４．５
．３頁，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示され
ている。簡単に説明すると、９６穴プレートでの細胞増殖に関して、増殖培地を
細胞から除去して、各穴を２００μｌの冷ＰＢＳによって洗浄した。６０μｌの
ライシス緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭＥＤＴＡ
、０．５ＭＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２０ｍＭバナジル−リボヌクレオ
シド複合体）を各穴に加え、プレートを穏やかに撹拌し、次に、室温において５
分間インキュベートした。５５μｌの溶解産物(lysate)をＯｌｉｇｏｄ（Ｔ）
塗布９６穴プレート（ＡＧＣＴＩｎｃ．，ＩｒｖｉｎｅＣＡ）に移した。プ
レートを室温において６０分間インキュベートし、２００μｌの洗浄緩衝液（１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、１ｍＭＥＤＴＡ、０．３ＭＮａＣ
ｌ）によって３回洗浄した。最終洗浄後に、プレートをペーパータオル上にブロ
ットして、過剰な洗浄緩衝液を除去してから、５分間風乾させた。７０℃に予熱
した６０μｌの溶離緩衝液（５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６）を各穴に
加え、プレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートし、次に、
溶離液(eluate)を新たな９６穴プレートに移した。

【０１０５】１００ｍｍ又は他の標準プレート上に増殖させた細胞を適当な量のあらゆる溶
液を用いて同様に処理することができる。

【０１０６】実施例１２総ＲＮＡ単離ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．（ＶａｌｅｎｃｉａＣＡ）から購入したＲＮＥＡＳ
Ｙ９６^TMキットと緩衝液を用いて、製造者の薦める方法に従って、総ｍＲＮＡ
を単離した。簡単に説明すると、９６穴プレートで増殖した細胞に関して、増殖
培地を細胞から除去して、各穴を２００μｌの冷ＰＢＳによって洗浄した。１０
０μｌのＢｕｆｆｅｒＲＬＴを各穴に加え、プレートを激しく２０秒間撹拌し
た。次に、１００μｌの７０％エタノールを各穴に加え、上下に３回ピペッティ
ングすることによって、内容物を混合した。次に、サンプルを、廃棄物回収トレ
ーを備え、真空源に取り付けられたＱＩＡＶＡＣ^TMマニホルドに取り付けたＲＮ
ＥＡＳＹ９６^TM穴プレートに移した。真空を１５秒間適用した。１ｍｌのＢｕｆ
ｆｅｒＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ９６^TM穴プレートの各穴に加え、真空を再び１
５秒間適用した。次に、１ｍｌのＢｕｆｆｅｒＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ９６^TM プレートの各穴に加え、真空を１５秒間の期間適用した。次に、Ｂｕｆｆｅｒ
ＲＰＥ洗浄を繰り返し、真空をさらに１０分間適用した。次に、プレートをＱＩ
ＡＶＡＣ^TMマニホルドから取り出し、ペーパータオル上に乾式ブロットした。次
に、プレートを、１．２ｍｌ回収管を含有する回収管ラックを備えたＱＩＡＶＡ
Ｃ^TMマニホルドに再び取り付けた。次に、各穴中に６０μｌ水をピペッティング
し、１分間インキュベートしてから、３０秒間真空を適用することによって、Ｒ
ＮＡを溶離した。この溶離段階をさらなる６０μｌの水によって繰り返した。

【０１０７】実施例１３サービビンｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TM７７００配列検出系（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、製造者の指示に従っ
たリアルタイム定量ＰＣＲによって、サービビンｍＲＮＡレベルの定量を行った
。これは密閉管式非ゲル性蛍光検出系(closed-tube,non-gel-based,fluorescenc
e detection system)であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の高スル
ープット定量をリアルタイムで可能にする。ＰＣＲが完了した後に増幅生成物を
定量する標準ＰＣＲとは反対に、リアルタイム定量ＰＣＲでは生成物が累積する
(accumulate)につれて、生成物を定量する。これはＰＣＲ反応に、フォワードＰ
ＣＲプライマーとリバース(reverse)ＰＣＲプライマーとの間に特異的にアニー
ルし、２つの蛍光染料を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含めることによ
って、達成される。リポーター染料（例えば、ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓＩｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ又はＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡから入手される、ＪＯＥ又はＦ
ＡＭ）はプローブの５’末端に取り付けられ、クエンチャー(quencher)染料（例
えば、、ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ
，ＣＡ又はＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉ
ｔｙ，ＣＡから入手される、ＴＡＭＲＡ）はプローブの３’末端に取り付けられ
る。プローブと染料とが完全であるときに、リポーター染料放出は３’クエンチ
ャー染料の接近(proximity) によってクエンチされる。増幅中に、ターゲット配
列へのプローブのアニーリングが、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレア
ーゼによって切断されうる基質を形成する。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長段階中に
、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断がリポーター染料を残部のプローブ
から（したがって、クエンチャー部分から）放出して、配列特異性蛍光シグナル
が発生する。各サイクルによって、付加的なリポーター染料分子がそれらのそれ
ぞれのプローブから切断されて、蛍光強度が規則的な（６秒間）間隔で、ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ^TM７７００配列検出系に組み込まれたレーザー光学装置によってモ
ニターされる。各アッセイにおいて、非処理対照サンプルからのｍＲＮＡの連続
希釈物を含有する一連の平行反応が、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレ
オチド処理後の阻害％を定量するために用いられる標準曲線を作成する。

【０１０８】ＰＣＲ試薬はＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手された。２５μｌのＰＣＲカクテル（１ｘＴＡＱＭＡＮ ^TM 緩衝液Ａ、５．５ｍＭＭｇＣｌ₂、３００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄ
ＧＴＰの各々、６００μＭのｄＵＴＰ、１００ｎＭのフォワードプライマー、リ
バースプライマー及びプローブの各々、２０単位のＲＮＡｓｅ阻害剤、１．２５
単位のＡＭＰＬＩＴＡＱＧＯＬＤ^TM、及び１２．５単位のＭｕＬＶ逆トランス
クリプターゼ）を２５μｌのポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液を含有する９６穴プレート
に加えることによって、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ反応は４８℃における
３０分間のインキュベーションによって行った。ＡＭＰＬＩＴＡＱＧＯＬＤ^TM を活性化するための９５℃における１０分間のインキュベーション後に、二段階
ＰＣＲプロトコール：９５℃において１５秒間（変性）と、その後の６０℃にお
いて１．５分間（アニーリング／伸長）の４０サイクルを行った。サービビンプ
ローブとプライマーは公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｕ７５
２８５、配列番号：１として本明細書に援用）を用いて、ヒトサービビン配列に
ハイブリダイズするように設計された。

【０１０９】サービビンに関して、ＰＣＲプライマーは次の通りであった：フォワードプライマー：ＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡ（配列番
号：２）；リバースプライマー：ＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡＧ
Ｔ（配列番号：３）；及びＰＣＲプローブは次の通りであった：ＦＡＭ−ＣＧＡ
ＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号：４）、こ
の配列においてＦＡＭ（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓ
ｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）は蛍光リポーター染料であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）はクエ
ンチャー染料である。

【０１１０】ＧＡＰＤＨに関して、ＰＣＲプライマーは次の通りであった：フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号：
５）；リバースプライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列
番号：６）；及びＰＣＲプローブは次の通りであった：５’ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣ
ＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号：７）、この配列
においてＪＯＥ（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は蛍光リポーター染料であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）はクエンチャ
ー染料である。

【０１１１】実施例１４サービビンｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析アンチセンス処理後１８時間に、細胞単層を冷ＰＢＳによって２回洗浄してか
ら、１ｍｌＲＮＡＺＯＬ^TM（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ”Ｉｎｃ．Ｆｒｉｅｎｄｓ
ｗｏｏｄ，ＴＸ）中で溶解させた。製造者の薦めるプロトコールに従って、総Ｒ
ＮＡを調製した。２０μｇの総ＲＮＡをＭＯＰＳバッファー系（ＡＭＲＥＳＣＯ
，Ｉｎｃ．Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を用いて、１．１％ホルムアルデヒドを含有する
１．２％アガロースゲルを通しての電気泳動によって分画した。ＲＮＡをゲルか
らＨＹＢＯＮＤ^TM−Ｎ＋ナイロン膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に、ノーザン／サザントランス
ファーバッファー系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ”Ｉｎｃ．Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ
，ＴＸ）を用いた一晩毛管移送(overnight capillary transfer)によって移した
。ＲＮＡ移送はＵＶ視覚化によって確認した。ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ^TMＵＶ
Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ＵＶ架橋によって、膜を固定した。

【０１１２】フォワードプライマー：ＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡ（配列
番号：２）とリバースプライマー：ＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡ
ＧＴ（配列番号：３）とを用いたＰＣＲによって作製されたサービビン特異性プ
ローブによって、ＱＵＩＣＫＨＹＢ^TMハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、厳しい条件に関す
る製造者の勧告に従って膜を検査した。負荷及び移送効率の変動を標準化するた
めに、膜を細片化して(stripped)、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｅ，
ＣＡ）に関して検査した。ハイブリダイズした膜をＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥ
Ｒ^TMとＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ^TMソフトウェアＶ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、視覚化して、定量し
た。データを非処理対照におけるＧＡＰＤＨレベルに合わせて標準化した。

【０１１３】実施例１５サービビン発現のアンチセンス阻害−ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレ
オチド本発明によると、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｕ７５２８５
、配列番号：１として本明細書に援用）を用いて、ヒトサービビンＲＮＡの種々
な領域をターゲットとするように、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。これ
らのオリゴヌクレオチドは表１に示す。ターゲット部位は、配列源資料(sequenc
e source reference)（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号：Ｕ７５２８５）に記載さ
れるように、オリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号によって表示する
。表１の総ての化合物は、全体を通してホスホロチオエートバックボーン（ヌク
レオシド間結合）を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。これらの化合物
をサービビンｍＲＮＡレベルに対する効果に関して、本明細書の他の実施例に記
載したような定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは３回の実験
から平均する。存在する場合の“Ｎ．Ｄ．”は“データなし”を意味する。

【０１１４】表１ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによるサービビンｍＲＮＡレベ
ルの阻害

【表１】

【０１１５】表１に示すように、配列番号：１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、
２１、２３、２８、３１、３２、３４、３９、４０、４１、４２，４３及び４７
は、このアッセイにおいて、サービビン発現の少なくとも３０％阻害を示した、
それ故、好ましい。

【０１１６】実施例１６サービビン発現のアンチセンス阻害−ホスホロチオエート２’−ＭＯＥギャップ
マーオリゴヌクレオチド本発明によると、ヒトサービビンをターゲットとするオリゴヌクレオチドの第
２シリーズを合成した。これらのオリゴヌクレオチド配列は表２に示す。ターゲ
ット部位は、配列源資料（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号：Ｕ７５２８５）に記載
されるように、オリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号によって表示す
る。

【０１１７】表２の総ての化合物は、両側（５’方向と３’方向）で４ヌクレオチド“ウィ
ング”によって隣接される、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから成る中央
“ギャップ”領域から構成される、１８ヌクレオチド長さのキメラオリゴヌクレ
オチド（“ギャップマー”）である。これらのウィングは２’−メトキシエチル
（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン
）結合はオリゴヌクレオチドを通してのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。
２’−ＭＯＥウィング中のシチジン残基は５−メチルシチジンである。

【０１１８】データは、本明細書の他の実施例に記載したような定量的リアルタイムＰＣＲ
によって得て、３回の実験から平均する。存在する場合の“Ｎ．Ｄ．”は“デー
タなし”を意味する。

【０１１９】表２２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドによるサービビンｍＲＮＡレベルの阻害

【表２】

【０１２０】表２に示すように、配列番号：１１、１６、１９、２１、２３、２７、３１、
３４、３８、３９、４２及び４３は、この実験において、サービビン発現の少な
くとも３０％阻害を示した、それ故、好ましい。

【０１２１】実施例１７サービビンタンパク質レベルのウェスタンブロット分析ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）は標準方法を用いて実施する
。オリゴヌクレオチド処理後１６〜２０時間に、細胞を回収して、ＰＢＳによっ
て１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（１００μｌ／穴）中に懸濁させ、５
分間沸騰させてから、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷させる。ゲルを１５
０Ｖにおいて１．５時間ランし、ウェスタンブロッティングのために膜に移す。
サービビンに対する適当な一次抗体を、この一次抗体種に対する放射性標識した
又は蛍光標識した二次抗体と共に用いる。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^TM（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、
バンドを視覚化する。

【０１２２】実施例１８アポトーシスに対するサービビンアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果ＩＳＩＳ２３７２２と、不適正対照、ＩＳＩＳ２８５９８（ＴＡＡＧＣＴＧＴ
ＴＣＴＡＴＧＴＧＴＴ；配列番号：４８）とを、ＨｅＬａ細胞におけるアポトー
シスに対するそれらの効果に関して分析した。カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆ
ｍｋをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から購入して、製造者
の勧告に従って用いた。オリゴヌクレオチドなしのＨｅＬａ細胞では、約４％の
細胞が低二倍体である（ＤＮＡフラグメント化を意味し、アポトーシスの尺度で
ある）。ＩＳＩＳ２３７２２を添加すると、約２２％の細胞が低二倍体であり、
不適正オリゴヌクレオチドによる約１１％と対照的である。カスパーゼ阻害剤ｚ
−ＶＡＤ．ｆｍｋ（４２．８ｍＭ）の存在下では、低二倍体（アポトーシス）細
胞の％は、オリゴヌクレオチドなしの場合に３％に、ＩＳＩＳ２３７２２によっ
て６％に、及び不適正対照によって４％に低下する。このことは、サービビンの
アンチセンス阻害がアポトーシスを高めること、及びこの効果がカスパーゼによ
って仲介されることを実証する。

【０１２３】実施例１８細胞質分裂に対するサービビンのアンチセンス阻害の効果サービビンをターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ２
３７２２）によって処理したＨｅＬａ細胞が、不適当な細胞分割の結果として大
きい多核細胞(multinucleated cell)を形成することを観察することができる。
不適正対照オリゴヌクレオチドはこの効果を有さず、細胞は正常であるように見
えた（非処理対照に匹敵する）。この効果はフローサイトメトリーによって定量
化することができる。非処理細胞又は対照オリゴヌクレオチドによって処理された細胞は、細胞分割
のＧ１期とＧ２／Ｍ期の細胞集団を表す、２つの主要なピークを示す。Ｇ１細胞
はそれらのＤＮＡ（１ｘ）の単一コピーを有し、Ｇ２／Ｍ細胞は２コピー（２ｘ
）を有する。２４時間〜７２時間にかけて、これらの１ｘ及び２ｘピークは対照
オリゴヌクレオチドによって処理された又はオリゴヌクレオチドによって処理さ
れない細胞では実際に無変化に留まる。しかし、サービビンをターゲットとする
アンチセンスオリゴヌクレオチドによって処理された細胞では、細胞の大部分が
オリゴ処理後２４時間までＤＮＡの２コピーを有する。このことは、細胞分割が
阻止されることを意味する。このオリゴヌクレオチドによる処理後４８時間まで
、４ｘピークは１ｘ及び２ｘピークに大きさにおいてほぼ等しく、このことはＤ
ＮＡの１、２及び４コピーを有する細胞数が大体等しいことを意味する。７２時
間までに、最大ピークは１６ｘであり、このことは細胞がそれらのＤＮＡの１６
コピーを有し、したがって、細胞質の分割が多重世代(multiple generation)の
ために生じていないことを意味する。したがって、サービビンの阻害は細胞質分
裂を妨害することが実証される。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年５月２日（２００１．５．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アッカーマン，エリザベス・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州92075，ソラナ・ビーチ，サンタ・ビクトリア 519 (72)発明者スウェイズ，エリック・イーアメリカ合衆国カリフォルニア州92009，カールズバッド，パレンケ・ストリート 7789 (72)発明者カウサート，レックス・エムアメリカ合衆国カリフォルニア州92008，カールズバッド，ニューシャイア・ストリート 3008 Ｆターム(参考） 4C057 BB05 CC03 GG03 MM04 MM05 4C084 AA13 NA14 ZB26 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 NA14 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトサービビンをコードする核酸分子をターゲットとする長
さ８〜３０ヌクレオチドのアンチセンス化合物であって、ヒトサービビンの発現
を阻害する前記アンチセンス化合物。
【請求項２】アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載のア
ンチセンス化合物。
【請求項３】配列番号：１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、１
９、２０、２１、２３、２７、２８、３１、３２、３４、３８、３９、４０、４
１，４２、４３又は４７の少なくとも８−核酸塩基部分を含む、請求項２記載の
アンチセンス化合物。
【請求項４】配列番号：１６、２１、２３、３１、３４、３９、４２又は
４３を含む、請求項３記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請
求項２記載のアンチセンス化合物。
【請求項６】修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合で
ある、請求項５記載のアンチセンス化合物。
【請求項７】少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項２記載の
アンチセンス化合物。
【請求項８】修飾された糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である
、請求項７記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含む、請求項２記載
のアンチセンス化合物。
【請求項１０】修飾された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項
９記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】キメラオリゴヌクレオチドである、請求項２記載のアンチ
センス化合物。
【請求項１２】請求項１記載のアンチセンス化合物と、製薬的に受容され
るキャリヤー又は希釈剤とを含む組成物。
【請求項１３】コロイド状分散系をさらに含む、請求項１２記載の組成物
。
【請求項１４】アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドで
ある、請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】ヒト細胞又は組織におけるサービビンの発現を阻害する方
法であって、サービビンの発現を阻害するように、前記細胞又は組織を請求項１
記載のアンチセンス化合物と接触させることを含む前記方法。
【請求項１６】サービビンに関連する疾患又は状態を有するヒトの治療方
法であって、前記動物にサービビンの発現を阻害するために、治療的又は予防的
に有効な量の請求項１記載のアンチセンス化合物を投与することを含む前記治療
方法。
【請求項１７】疾患又は状態が過増殖性状態である、請求項１６記載の方
法。
【請求項１８】過増殖性状態が癌である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】アポトーシスの減少を特徴とする疾患又は状態を有するヒ
トの治療方法であって、予防的又は治療的に有効な量の請求項１記載のアンチセ
ンス化合物を投与することを含む前記治療方法。
【請求項２０】細胞におけるアポトーシスをモジュレートする方法であっ
て、アポトーシスがモジュレートされるように、前記細胞に請求項１記載のアン
チセンス化合物を接触させることを含む前記方法。
【請求項２１】細胞における細胞質分裂をモジュレートする方法であって
、細胞質分裂がモジュレートされるように、前記細胞に請求項１記載のアンチセ
ンス化合物を接触させることを含む前記方法。
【請求項２２】細胞における細胞周期をモジュレートする方法であって、
細胞周期がモジュレートされるように、前記細胞に請求項１記載のアンチセンス
化合物を接触させることを含む前記方法。