KR970005274B1 - 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 a형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보스트레인(ann arbor strain) h2n2의 억제 - Google Patents

안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 a형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보스트레인(ann arbor strain) h2n2의 억제 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 A형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보스트레인(ANN ARBOR STRAIN) H2N2의 억제
[도면의 간단한 설명]
제1도는 분획 5로부터 합성된 A형 인플루엔자 바이러스(Ann Arbor H2N2)로부터의 (+)RNA (mRNA)를 보여주는 것이다.
제2도는 분획 5로부터 합성된 A형 인플루엔자 바이러스(Ann Arbor H2N2)로부터의 (-)RNA (vRNA)를 보여주는 것이다.
제3도는 분획 7로부터 합성된 A형 인플루엔자 바이러스(Ann Arbor H2N2)로부터의 (+)RNA (mRNA)를 보여주는 것이다.
제4도는 분획 7로부터 합성된 A형 인플루엔자 바이러스(Ann Arbor H2N2)로부터의 (-)RNA (vRNA)를 보여주는 것이다.
제5도는 분획 8로부터 합성된 A형 인플루엔자 바이러스(Ann Arbor H2N2)로부터의 (+)RNA (mRNA)를 보여주는 것이다.
제6도는 분획 8로부터 합성된 A형 인플루엔자 바이러스(Ann Arbor H2N2)로부터의 (-)RNA (vRNA)를 보여주는 것이다.
제7도는 실시예 2에 기술된 바와 같이 세포의 RNA 개시제(primer)를 모방하여 인플루엔자 바이러스를 억제하는 2'-치환 올리고뉴클레오티드의 결합을 보여주는 것이다.
[발명의 상세한 설명]
발명의 분야
본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 진단법, 검색약 및 치료법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여된 특정의 바이러스 리보핵산 및 메신저 리보핵산과의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 상호 작용에 관한 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNA 폴리머라제, 헤마글루타닌, 뉴클레오프로테인 또는 뉴라미니다아제를 포함하며, 인플루엔자 바이러스의 바이러스 RNA 분획과, 또는 NP, M1, M2, NS1, NS2 또는 인플루엔자 바이러스의 다른 키이 단백질을 암호화하는 특정의 mRNA와 교잡가능하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드들은 역시 RNA 스플라이싱 또는 바이러스 패키징(packaging)에 있어서 중요한 특정의 바이러스 RNA 서열과 교잡 가능하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드들은 RNA 활성의 조절, 감염의 조절, 진단, 질병의 경감 및 치료효과를 낳는 것으로 밝혀졌다.
발명의 배경
인플루엔자 바이러스들은 인간에게 있어서 죽음으로 질병의 주요한 원인이어 왔다. 유행성 질환은 아주 널리 퍼지고 항상 대량의 사망 및 질병을 야기하면서 특히 노년층에서 주기적으로 발생한다. 인플루엔자 유행성 질환의 원인은 우선 알.이.숍(R.E. Shope)에 의해 발견된 바이러스이다. 그는 인플루엔자 유행성 질환이 배출된 점액질에 의해 옮겨질 수 있다는 것을 증명하였다. 인플루엔자 바이러스는 내부 항원 단백질에 있어서의 차이에 의해 A, B 및 C의 세가지 형태로 분류되고 있다.
인플루엔자 감염은 두통, 기침, 열 및 통상의 불쾌감등의 증상을 낳느나. 폐 또는 심장 질환과 합병된 심한 경우에는 병원 치료를 받아야 한다. 직접적인 바이러스 감염에 기인하거나 이차적인 세균 또는 바이러스 전염에 의한 폐렴이 가장 흔한 합병증이다. 인플루엔자 바이러스 감염의 증상에 대하여는(Douglas, R.G. New England Journal of Medicine, 322 : 443-450(1990)을 참조할 수 있다.
항원의 표류(drift)에 의하여 야기되는 인플루엔자의 새로운 기질들은 통상 1년마다 규칙적으로 나타나며 지구를 돌면서 감염 사이클을 이행한다. 개인에 있어서 유행성 질환이 어떻게 개시되어지는지는 거의 알려져 있지 않다. 인플루엔자의 새로운 형태는 자주 발생되지는 않지만, 전국적인 유행병을 가져다 줄 수 있는 것이다.
합병증의 위험때문에 인플루엔자 바이러스에 대처하는 가장 효과적인 방법은 예방이다. 인류에 있어서 유행성 질환에 의한 사망을 줄이기 위해 인플루엔자 백신을사용하는 것도 효과적인 방법이다. 그러나 바이러스의 끊임없이 변화하는 성질때문에 그때 그때 유행하는 바이러스 기질에 대처할 수 있는 적합한 조성으로 백신을 개발한다는 것은 복잡하고 비용이 많이드는 일이다. 또한 백신을 받아들이는 환자의 호응도는 통상 매우 낮다. 따라서 많은 환자들이 인플루엔자 바이러스에 의한 심각한 합병증에 노출되어 있는 형편이다. 예방적으로 인플루엔자 바이러스에 대해 약간의 활성을 가진 몇가지 의약이 시판되고 있다. 그러나 그중 어느것도 B형 인플루엔자 바이러스에 대해 약간의 활성을 가진 몇가지 의약이 시판되고 있다. 그러나 그중 어느것도 B형 인플루엔자에 대해서는 효력이 없다. 또한 그들은 치료제로서는 극히 한정적으로 사용될 tn 있으며 증상의 발현후에 질병을 치료하기 위한 것으로는 널리 이용되고 있지 못하다. 따라서 인플루엔자 바이러스 감염의 치료를 위한 치료제 개발이 전세계적으로 요구되어 왔다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인플루엔자 바이러스를 억제하기 위한 시도들이 보고되어 왔다. 라이터(Leiter) 일행은 A형 인플루엔자 및 C형 인플루엔자 바이러스에 대한 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트를 목표로 하였다(Leiter, J.m Agrawal, S., Palese, P. Zamecnik, P.C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 3430-3434(1990)). 이들 연구자들은 각각의 vRNA 3' 영역 및 mRNA 5' 영역에 있어서 단지 폴리머라제 PBI 유전자 및 mRNA를 목표로 하였다. C형 인플루엔자의 일부 특이적 억제가 발견되긴 하였지만 A형 인플루엔자에 대한 서열-특이적 억제는 관찰되지 않았다. 또한 다른 어떤 인플루엔자 바이러스 분획이나 mRNA도 목표로 하지 않았다.
제리알(Zerial) 일행은 인터켈레이팅(intercalating)제와 동시적으로 결합된 올리고뉴클레오티드에 의한 A형 인플루엔자 바이러스 억제를 보고하였다(Zerial, A., Thoung, N.T. Helene, C., Necleic Acids Res. 57 : 9909-9919(1987)). 제리알 일행은 8 vRNA 분획의 3' 종료 서열을 표적으로 하였다. 그들의 올리고뉴클레오티드 유사체가 세포 배양에 있어서 바이러스 세포질 파괴 현상을 억제한다고 보고되었다. 유럽특허 제169787호(Helene 일행)는 인터켈레이팅기에 공유결합되고 핵산의 복제 및 하나 또는 그 이상의 유전자들의 전사 및/또는 해독에 관여된 핵산 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드 화합물; 인터켈레이팅기에 공유결합되고 바이러스 또는 세균 또는 기생충을 복제하고 증식시키는 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드들; 및 인터켈레이팅기와 공유되고 인플루엔자 또는 헤르메스 바이러스를 복제하고 증식시키는 서열 또는 발암유전자와 상보적인 올리고뉴클레오티드들을 개시하고 있다.
유럽특허 출원 제82110494.0호(Krug 일행)는 인플루엔자 바이러스의 엔도뉴클레아제 및 전사효소에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화력을 증가시키는 5' 메틸레이티드 캡 구조를 함유하는 올리고뉴클레오티드들을 개시하고 있다. 또한 캡 올리고뉴클레오티드들은 개시제(primer)로서 작용하지 못하도록 변형되어 있다. 예를들면 길이에 있어서 10 뉴클레오티드 이하로 되거나; 3' 종료 데옥시모노뉴클레오티드 또는 3' 종료 3'-0-메틸레이티드 리보뉴클레오티드를 포함하도록 확장되거나; 당 및/또는 염기 부분에서 및/또는 뉴클레오티드 결합내에서 개질된 적어도 14 뉴클레오티드 이상은 가지도록 변형되어 있다.
카바노프 일행은 RNA 폴리머라제 3을 암호화하는 RNA의 루프 형성 자리와 상보적인 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(Kabanov, A.V., Vinogradov, S.V., Ovcharenko, A.V., Melik-Nubarov, N.S., Kiselev, V.I. Severin, E.S., FEBS, 259 : 3270330(1990)). 이들 올리고뉴클레오티드들은 5' 종료 인산기에서 언데실 잔기와 결합되었다. 그들은 이들 올리고뉴클레오티드가 MDCK 세포들내에서 A형 바이러스 감염을 억제한다는 것을 발견하였다.
상기의 연구자들이 인플루엔자 바이러스의 일부 기능을 억제함에 있어서 어느 정도의 성공을 거두었지만, 인플루엔자 바이러스를 표적으로 한 일반적인 치료 체계는 밝혀내지 못하였다. 따라서 인플루엔자 바이러스 치료에 있어서 개선된 효과가 요구되어져 왔으며, 치료제 용도로 효력있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체의 설계가 오랜동안 숙원이 되어 왔다. 인플루엔자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드치료법 분야에 있어서 이러한 요구는 오랜동안 충족되지 못하였다. 다른 연구자들은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 치료학적으로 상당한 효력을 주는 표적자리를 확인하는데 실패하였다.
발명의 목적
본 발명의 일차적 목적은 동물, 특히 인간에 있어서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 바이러스들의 RNA 기능을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 바이러스 형태들의 치료를 위한 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 이들 및 다른 목적들이 명세서 전반으로부터 더욱 명백해질 것이다.
발명의 요약
본 발명에 따르면 인플루엔자 바이러스에 대해 RNA와 특이적으로 교자할 수 있는 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체가 제공되어진다. 상기 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 안티센스 관계로 인플루엔자 RNA에 직접 결합하도록 설계되어진다. 상기 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체들은 RNA의 기능, 즉 그의 단백질로의 해독, 그의 세포질로의 전이 또는 전체 생체적 기능에 필요한 다른 활성을 억제할 수 있다. 이들 기능의 전부 또는 일부를 RNA가 실행하지 못하게 되면 게놈의 일부가 바이러스의 정상적인 생장 사이클을 조절할 수 없게 된다.
안티센스 공격을 위해 특이적 바이러스 RNA를 표적으로 하는 것이 바람직하다. NP, M1, M2, NS1 및 NS2를 암호화하는 유전자들이 이러한 접근에 특히 유용하다. NP, M1, M2, NS1 또는 NS2 발현을 억제하는 것은 인플루엔자 바이러스 감염의 치료를 위해 매우 유용한 것이라고 믿어진다. 그러한 억제는 진단 방법 및 장비의 기초를 형성할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 RNA 폴리머라제, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다아제를 암호화하는 유전자들을 억제하는 것은 역시 그러한 감염의 치료를 위해 매우 유용한 것으로 믿어진다. 인플루엔자 바이러스 RNA의 스플라이싱 또는 패키징 기능이나 바이러스 뉴클레오프로테인을 방해하는 것도 마찬가지다. 그러한 억제 또는 방해는 역시 진단법의 기초를 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스의 핵산과 교잡가능한 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 동물에 접종시키는 것으로 이루어지는 바이러스 감염 조절 방법이 제공된다. 본 발명에 있어서 NP, M1, M2, NS1 또는 NS2 단백질을 암호화하는 mRNA 또는 어떤 vRNA 분획으로부터 RNA와 교잡가능한 올리고뉴클레오티드 또는 그 유사체가 바람직하다.
[발명의 상세한 설명]
안티센스 올리고뉴클레오티드는 많은 인간의 질병 치료에 있어서 치료제로 좋은 전망을 보여준다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 와트슨-크리크 염기 짝짓기에 규정된 바와 같이 전(pre)-mRNA 또는 성숙 mRNA의 상보적 서열과 결합하며 DNA로부터 단백질로의 유전자 정보 흐름을 억제한다. 인플루엔자 바이러스의 경우에는 단백질을 암호화하는 정보는 DNA에 있지 않고 게놈 물질의 안티센스 표적을 허용하는 RNA 게놈내에 있다. 최근의 많은 연구는 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 기구로서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다.(Rothenberg 일행, J. Natl. Cancer Inst., 81 : 1539-1544(1989); Zon, G., Pharmaceutical Res. 5 : 539-549(1988)
). 올리고뉴클레오티드 화학, 항 뉴클레아제 올리고뉴클레오티드의 합성 및 세포 동화를 증대시키는 올리고뉴클레오티드 유사체 연구에 있어서의 최근의 진전에 힘입어 새로운 형태의 치료제로서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것을 고려할 수 있게 되었다.
인플루엔자 바이러스는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스이다. 이들 게놈은 분리된 (-)RNA 분획, 즉 vRNA라 불리우는 것으로 구성되어 있다. 예를들면, A형 인플루엔자는 8분획 (-)RNA로 구성되어 있다.
표 1은 공지 분획들의 부분적인 목록이다.
vRNA 분획들은 바이러스 mRNA((+)RNA) 합성 장소로서 제공되는 유전자 정보의 저장소이다. 따라서 인플루엔자 바이러스에 있어서 RNA는 DNA 대신에 전사 장소로 이용된다.
세포에 영향을 주는 인플루엔자 바이러스의 라이프싸이클이 요약될 수 있다. 바이러스는 세포 표면상의 수용체(receptor)에 스스로 부착되어 흡수된다. vRNA 게놈 분획들이 세포핵에 거주하게 된다. 바이러스는 RNA-의존 RNA 폴리머라제를 만드는데 단백질(PB1, PB2, PA) 및 새로운 RNA 합성에 있어서 세개의 RNA 폴리머라제 단백질과 함께 참여하는 뉴클레오프로테인(NP)을 함유하는 새롭게 감염된 세포내로 그것과 함께 많은 단백질을 도입한다. 상기 바이러스는 RNA 폴리머라제의 활동을 통하여 감염된 세포내에 있는 새로운 단백질 및 현존하는 세포 기구와 협동하는 뉴클레오프로테인을 제조하기 위하여 그 유전자를 발현시킨다. 상기 바이러스 폴리머라제는 mRNA 합성을 개시시키거나 메시지를 캡핑하고 메틸레이팅하기 위한 활동을 하지 않는다. 이들은 유전자 발현에 통상적으로 요구되는 과정들이다. 대신에 바이러스는 세포 mRNA를 이용하며 캡자리로부터 약 10 내지 15 뉴클레오티드들로 상기 메시지의 5'-캡 말단을 분열시킨후 그것을 개시제로 하여 그 자체내 mRNA 합성을 개시시킨다. 이 유일한 메카니즘은 이 발명에서 인플루엔자 바이러스의 특이적 억제를 성취하는데 있어서 큰 도움이 되었다.
치료법에 있어서, 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 여겨지는 동물이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 투여됨으로써 처리되었다. 당업자라면 쉽게 최적 투여량, 투여방법 및 반복 투여 주기를 결정할 수 있을 것이다. 치료효과가 나타나거나 질병 완화가 성취돌 때까지 그러한 처리가 계속되어진다.
여러가지 인플루엔자 바이러스들 사이에 종 변이가 일어나는 것으로 판명되어질 것이다. 많은 영역들이 종들 사이에 유사한 반면에 일부 분화가 발생한다. 본 발명에 있어서 이러한 변이를 설명하기 위해 올리고뉴클레오티드 및 그 유사체들에 있어서 개조가 특히 고려되어진다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 RNA 기능의 안티센스 억제에 있어서의 사용을 위해 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 채용한다. 본 발명의 명세서에서 용어 올리고뉴클레오티드는 천연의 포스포디에스테르 결합에 의하여 결합된 자연발생적 염기들 및 푸라노실기들로 형성된 폴리뉴클레오티드를 말하는 것이다. 이 용어는 자연발생종 또는 자연발생적 서브유니트 또는 그들의 밀접한 상동체(homolog)로 형성된 합성종을 효과적을 지칭하는 것이다.
본 발명에서 사용되어진 용어 올리고뉴클레오티드 유사체는 올리고뉴클레오티드와 유사한 역할을 하지만 비자연발생적 부분을 가지는 부분을 언급하는 것이다. 따라서 올리고뉴클레오티드 유사체는 당부분 또는 당내 결합을 변경시킬 수 있다. 그들의 예로서 공지되어 있는 포스포로티오에이트 및 다른 황함유종들을 들 수 있다. 바람직한 실시예들에 따르면 상기 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 결합의 일부는 상기 화합물들이 그 활섣ㅇ이 조절되어지는 RNA 또는 DNA가 위치하는 세포영역내로 침투하는 능력을 증대시키는 역할을 하는 구조로 치환되어졌다. 그러나 치환체들은 포스포로티오에이트 결합, 메틸 포스포네이트 결합 또는 짧은 체인의 알킬이나 시클로알킬구조로 구성되는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시예에 따르면 상기 포스포디에스테르 결합은 실질적으로 비이온계 및 논-키랄(non-chiral)인 다른 구조로 치환되어지며 또 다른 실시예에 있어서는 키랄 및 길항적으로 특이적인 구조로 치환되어진다. 당업자라면 본 발명의 실제에 있어서의 사용을 위해 다른 결합들을 선택할 수 있을 것이다.
올리고뉴클레오티드 유사체들은 적어도 일부의 변형된 염기 부분을 포함하는 종을 함유할 수 있다. 따라서 자연에서 발견되어지는 이들외에 퓨린 및 피리미딘이 채용되어질 수 있다. 유사하게 본 발명의 범위내에서 상기 뉴클레오티드 서브유니트의 펜토푸라노실 부분의 개질도 역시 일어날 수 있다. 그러한 유사체들은 기능적으로 천연 올리고뉴클레오티드들(또는 천연 라인을 따라 합성한 올리고뉴클레오티드들)과 상호교환되어질 수 있지만 천연구조와는 하나 또는 그 이상의 다른 부분을 가진다. 그들이 효과적으로 인플루엔자와 RNA와 교잡될 수 있는 한 모두 그러한 유사체들이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체들은 약 3 내지 50 서브유니트로 구성되는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드 및 그 유사체들은 약 8 내지 25 서브유니트로 구성되는 것이 더욱 바람직하며, 가장 바람직하기로는 약 10 내지 20 서브유니트로 되는 것이다, 상기 서브유니트는 포스포디에스테르 또는 다른 결합을 통하여 인접 서브유니트에 적합하게 결합된 염기-당 조합이다.
본 발명에 있어서 사용된 올리고뉴클레오티드 및 그 유사체는 고상(固相) 합성의 공지돈 기술에 의해 편리하게 그리고 통상적으로 제조될 수 있다. 그러한 합성을 위한 설비는 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)을 포함한 몇몇의 공급자에 의해 판매되어지고 있다. 그러한 합성에 대해서 또다른 수단이 채용되어질 수도 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 실제적인 합성은 당업계에서 통상의 기술 범위내에 있는 것이다.
당업자라면 매신저 RNA가 세문자로 된 유전자 코드를 사용한 단백질을 암호화하는 정보 뿐만 아니라 알려진 어떤 영역을 5'-미해독 영역, 3'-미해독 영역 및 인트론/엑손 접합 리보뉴클레오티드로서 형성시키는 연관 리보뉴클레오티드도 포함한다는 사실을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체들은 이들 연관 리보뉴클레오티드 뿐만아니라 정보 리보뉴클레오티드도 전체로 또는 부분으로 표적으로 하여 조성되어질 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 유사체는 전사 개시 자리, 해독 개시 자리 또는 3' 미해독 영역내의 인트론/엑손 접합부 및 서열들과 특이적으로 교잡가능하다.
본 발명에 따르면 상기 올리고뉴클레오티드는 인플루엔자 바이러스 핵산과 특이적으로 교잡 가능하다. 바람직한 실시예에 있어서 상기 핵산들은 A형 또는 B형 인플루엔자의 8 게놈 vRNA 분획들 중 어느 하나 또는 C형 인플루엔자로부터의 7 게놈 RNA 분획들중의 어느 하나 또는 이들 유전자들의 어느것으로부터 유도된 해당(+)RNA(mRNA) 종들을 포함한다. 연관 서열 또는 그들의 부분으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 또는 유사체들은 본 발명에 있어서 유용하다.
A형 인플루엔자 바이러스 분획 5의, 제1도는 (+)RNA (mRNA) 서열이고 제2도는 (-)RNA (vRNA) 서열이다. 인플루엔자 바이러스 분획 7의, 제3도는 (+)RNA (mRNA) 서열이고 제4도는 (-)RNA (vRNA) 서열이다. 인플루엔자 바이러스 분획 8의, 제5도는 (+)RNA (mRNA) 서열이고 제6도는 (-)RNA (vRNA) 서열이다.
본 발명의 실제에 있어서 유용한 올리고뉴클레오티드 및 그 유사체들은 다소 변경된 메카니즘도 가능하지만 RNA의 하나의 형태와 상보적이며 RNA 서열들 또는 그중 일부분, 특히 NP, M1, M2, NS1 및 NS2 단백질과 관련된 분획 5,7 또는 8의 연관 서열중의 하나에 대해서 안티센스로 되도록 설계되어진다. 본 발명에 있어서 유용한 올리고뉴클레오티드 및 그 유사체들은 특히 RNA 폴리머라제, 뉴라미니다아제 또는 헤마글루티닌 단백질과 관련된 분획 1,2,3,4, 또는 6과 상보적이 되도록(즉, 안티센스로 되도록), 또는 RNA 스플라이싱 또는 바이러스 패키징에 있어서 중요한 RNA 서열들과 상보적이 되도록 (즉 안티센스로 되도록) 설계되어진다. 따라서 상술한 바와 같은 올리고뉴클레오티드 또는 그들의 유사체들 중 어느것 또는 인플루엔자 바이러스 감염 조절에 대한 바람직한 안티센스 표적에 대한 지식을 이용하여 당업자로서 제조할 수 있는 유사한 뉴클레오티드들중 어느 것을 채용하는것이바람직하다. 본 발명에서는 이하에서 몇가지 비제한적이고도 바람직한 실시예들을 예시할 것이다. 조절을 위한 바람직한 목표 게놈 및 mRNA 종들은 일플루엔자 바이러스의 NP, M1, M2, NS1 및 NS2 단백질을 포함한다. 다른 바람직한 목표 RNA들은 폴리머라제 3, 폴리머라제 1, 폴리머라제 2, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다아제 유전자들과 관련한 분획 1,2,3,4, 또는 6, 또는 스플라이스(splice) 접합부 또는 패키징 서열들로 구성된다. 당업자라면 발명이 비제한저깅며 일반적으로 응용되어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이들 인플루엔자 RNA의 억제는 질병의 치료에 있어서 큰 치료학적 이점을 가지는 것으로 기대되어진다.
실시예
실시예 1
A형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보 스트레인(Ann Arbor Strain) H2N2의 억제
A형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보 스트레인 H2N2와 상보적인 일련의 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열들이 선택되어졌다.
상기 선택된 올리고뉴클레오티드 서열들은 분획 5,7,8,로부터의 인플루엔자 스트레인 vRNA 및 동일 분획으로부터 유도된 mRNA와 상보적이며 NP 단백질 (분획 5), M1 및 M2 단백질 (분획 7) 및 NS1, NS2 단백질(분획 8)을 암호화한다. 선택된 서열들에 대한 요약 및 상세한 목표 영역들이 표 2에 나타나 있다.
표 2
A형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보 스트레인 H2N2를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들.
서열번호 서열(5'-3') 표적 RNA 영역
1250 TTA TCT ACC CTG CTT TTG CT 분획 5 (+)RNA 최후의 5' 말단
1251 TGG GAC GCC ATG ATT TTG AT 분획 5 (+)RNA 해독의 개시부
1252 TTT GGT GCC TTG GGA CGC CA 분획 5 (+)RNA 해독의 개시부
1253 GGA TCC TTC CCC GCG CTG GG 분획 5 (+)RNA 292 위치
1254 AGT AGA AAC AAG GGT ATT TT 분획 5 (+)RNA 최후의 3'말단
1255 AAA ATA CCC TTG TTT CTA CT 분획 5 (-)RNA 최후의 5'말단
1256 TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG 분획 5 (-)RNA 3' 말단 부위
1257 AGC AAA AGC AG GTA GAT AA 분획 5 (-)RNA 최후의 3'말단
1258 AAT ATC TAC CTG CTT TTG CT 분획 5 (+)RNA 최후의 5'말단
1260 GAG AGA ACG TAC GTT TCG AC 분획 7 (+)RNA 5'스플라이스
1259 TAG AAG ACT CAT CTT TCA AT 분획 7 (+)RNA 해독개시부
1260 GAG AGA ACG TAC GTT TCG AC 분획 7 (+)RNA 5'스플라이스접합부
1261 TCG GCT TTG AG GGG CCT GA 분획 7 (+)RNA 74 위치
1262 CTG ATA GGC CTG CAA ATT TT 분획 7 (+)RNA 3'스플라이스
접합부
1263 AGT AGA AAC AAG GTA GTT TT 분획 7 (+)RNA 최후의 3'말단
1264 AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT 분획 7 (-)RNA 최후의 5'말단
1265 TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA 분획 7 (-)RNA 3' 말단부위
1266 AGC AA AGC AGG TAG ATA TT 분획 7 (-)RNA 최후의 3'말단
1267 TTT GTC ACC CTG CTT TTG CT 분획 8 (+)RNA 최후의 5'말단
1268 GTG TTA GGA TCC ATT ATG TC 분획 8 (+)RNA 해독개시부
1269 AGC AAT CTA CCT GAA AGC TT 분획 8 (+)RNA 5'스플라이스
접합부
1270 TAG TAT GTC CTG GAA GAG AA 분획 8 (+)RNA 3'스플라이스
접합부
1271 AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT 분획 8 (+)RNA 최후의 3'말단
1272 AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT 분획 8 (-)RNA 최후의 5'말단
1273 GCC TCC GCA CCT GCT TCG CG 분획 8 (-)RNA 3' 말단부위
1274 AGC AA AGC AGG GTC ACA AA 분획 8 (-)RNA 최후의 3'말단
인플루엔자 바이러스의 억제는 당업자에게 알려진 표준적인 방법에 의하여분석되었다. 예를들어 인간의 유아 허파(MRC5) 또는 마딘-다비(Madin-
Darby)개의 신장 세포(MDCK)들은 세포 구조상 인플루엔자 바이러스에 쉽게 감염된다. 세포들은 배양된 후 0.001 내지 0.01의 감염도(multiplicity of infection, M.O.I)로 바이러스로 처리된다. 감염후에 과잉 바이러스는 제거되고 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체가 25 내지 50μM 농도로 부가되어 희석된다. 5 내지 7일의 처리기간이 경과한 후에 바이러스 감염 세포들은 제거되고 균질화된후 추출물의 희석액이 MRC5 세포층에 접종될 때 발생되는 반점수를 측정함으로써 인플루엔자 바이러스의 감염율이 정량화된다. 양성 의약 효과는 의약 처방의 결과 바이러스의 감염율의 감소로 규정된다. 미처리 대조군과 비교하여 적어도 10배 이상의 바이러스 감염율 감소가 기대된다.
실시예 2
RNA 개시제(Primer) 복제
인플루엔자 감염 세포들에 있어서의 바이러스-암호화 mRNA의 전사는 세포 RNA 폴리머라제와 바이러스 RNA 폴리머라제가 상호 협동하여야 가능하다는 것은 공지의 사실이다. 이러한 협동은 바이러스 RNA 폴리머라제가 전사 또는 적합한 캡핑을 직접 개시하고 mRNA 5' 말단을 메틸레이팅할 능력이 없기 때문에 필요하다. 상기 바리어스 폴리머라제 복합물은 세포 RNA 폴리머라제에 의하여 합성된 세포 mRNA를 모집하고 상기 세포 mRNA의 최초 10 내지 15 뉴클레오티드들을 분열시키며 그것을 그 자체 mRNA 전사를 개시하는데 이용한다. 상기 세포 RNA는 개시제(primer)를 형성한다. 바이러스 대사의 이러한 독특한 형태는 3' 말단에서 (-)RNA (vRNA) 분획과상보적이고 제7도에 나타나 있는 바와 같이 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 측쇄상에 10 내지 15 뉴클레오티드가 더 확장된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 상기 과정을 억제시킬 수 있는 여지를 제공한다.
이들 실시예에 있어서 선호되어지는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-치환 올리고뉴클레오티드들로 구성되며 RNA 구조를 복제하여 바이러스 폴리머라제와의 결합력을 증대시킨다. 본 발명에 있어서 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들의 적어도 일부분에 있어서 결합당 부분의 2' 위치는 치환되어지는 것이 바람직하다. 그러한 2' 치환제로서는 n이 1 내지 10정도일 때 OH, SH, F, OCH3, OCH, O(CH2)CH3 및 유사한 성질을 지니는 다른 치환체가 유용하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 전형적인 세포 mRNA와 유사한 형태 또는 캡 유사체로 선택적으로 캡핑(capping)된다. 캡핑된 올리고뉴클레오티드에 대한 일부 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면 일부의 캡핑된 올리고뉴클레오티드 제조방법이(Yisraeli 및 Melton, Methods in Enzymology, 180 : 42-50(1989)) 및 본 명세서에서 인용되어진 참고 문헌들에 개시되어 있다. 선택적으로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은, 효소에 의해 RNA 체인이 확장되는데 사용되는 3' 히드록실기가 없기 때문에, RNA 폴리머라제에 의해 확장될 수 없는 3' 데옥시뉴클레오티드 또는 다른 뉴클레오티드 유사체를 선택적으로 함유한다. 그러한 체인-종료 억제제의 사용은 많은 생화학 과정에서 통상적인 것이다. 예를 들어 체인 종료 뉴클레오티드는 산저(Sanger)의 방법에 의하여 DNA를 배열하는데 사용되어진다(Sanger, F., Nicklen, S., A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci., 74 : 5463-5467(1977)). 이 방법을 사용하여 다음의 올리고뉴클레오티드들은 안티센스 치료법에 있어서 좋은 표적으로 되며 실시예 1에 기술된 바와 같이 항바이러스 활성을 얻기 위해 합성되고 분석되어질 것이다.
UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTCAAUU AU;
UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGCAAACC AU;
UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTACTGA TT;
UCUCCCUCUC AGCAAAACCU UCCCGGAAAU GA;
UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUAGAU AA;
UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGAGUGAA AA;
UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGUAGAUA UU; 또는
UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUGACA AA.
실시예 3
올리고뉴클레오티드 및 그 유사체들의 합성, 특성화
미개질 DNA 올리고뉴클레오티드들은 요오드 산화에 따른 표준 포스포아미다아트 화학을 이용하여 자동 DNA 합성(Applied Biosystems model 380 B)에서 합성되어졌다. β-시아노에틸디이소프로필-포스포아미다아트 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)(Foster City, CA)으로부터 구입되었다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 대해 표준 산화보틀이 포스파이트 결합의 단걔적 티에이션을 위해 아세토니트릴내의 3H-1,2-벤조디티올-3-은-1, 1-디옥사이드 0.2M 용액으로 대체되었다. 티에이션 사이클 웨이트 스텝이 68초로 증가하였고 캡핑스텝이 이어서 수행되었다. 테트라졸 및 염기의 펄스디리버리후의 웨이트 스텝이 360초로 증가된 것을 제외하고는 2'-0-메틸-β-시아노에틸디이소프로필포스포로아미다이트(Chemgenes, Needham MA) 및 미개질 올리고뉴클레오티드의 표준 사이클을 이용하여 합성되었다. 합성을 시작하기 위하여 사용된 3'-염기는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이었다. 조절된 포어 글래스 칼럼(Applied Biosystems)에서 분열되고 55℃에서 18시간동안 진한 수산화암묘늄내에서 디블로킹된 후 상기 올리고뉴클레오티드는 2.5볼륨 에탄올로 0.5M NaCl내에서 2번 침간시킴으로써 정제되었다. 분석 겔 전기영동이 pH 7.0, 20% 아크릴 아미드, 8M 우레아, 45mM 트리스-보레이트 완충액내에서 이행되었다. 올리고뉴클레오티드 및 그들의 포스포로티오에이트 유사체들이 80% 전체길이 물질 이상으로 전기영동에 의해 분석되었다.
이 합성에 의해 수득된 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 결합의 상대적인 양이 31P NMR 분광계에 의해 측정되었다. 용제로서 산화 중수소 또는 디메틸 설폭사이드-d6을 사용하여 대기온도에서 스펙트럼이 얻어졌다. 전형적으로 포스포로티오에이트 시료들은 1% 이하의 포스포디에스테르 결합을 함유하였다.
실시예 4
바이러스 유도 세포 질환(CPE)을 억제할 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 유사체의 검색
안티센스 화합물의 항바이러스 활성이 인플루엔자 바이러스에 의해 유도된 세포 질환의 억제를 검색하기 위하여 신속하게 측정되어진다. 이러한 분석은 단층(monolayer)의 현미경 검사를 필요로 하기 때문에 초기 검색에 필요한 올리고뉴클레오티드 양을 감소시키면서 마이크로미터 웰내에서 수행되어질 수 있다. 우리는 이러한 분석 시스템을 항바이러스성 활성에 대한 신속한 1차 검색으로서 이용하였다.
A/PR/8/34형 인플루엔자 바이러스가 이글스(Eagles') MEM 2% 유태아 혈청내의 미리 성장된 MDCK 세포 단층 배지내로 통과되고 분석되었다.
항바이러스 연구를 위해, 상기 바이러스는 배양웰당 0.1㎖ 기준으로 32CCID50(세포 배양 감염 투여량, 50%)를 얻기 위하여 배지내에 희석되어졌다.
실시예 3에서와 같이 전체 32 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트 유사체들이 제조되어 -20℃에서 보관되었다. 사용 직전에 상기 화합물들은 20, 6.4, 2.0, 0.6, 0.2 및 0.06μM의 일련의 0.5log10 농도에서 배지내에 용해되고 희석되었다.
공지의 활성 화합리바비린(Ribavirin)이 양성 대조 표준으로서 상기 올리고뉴클레오티드와 함께 평가 되어졌다.
MDCK 세포들이 적합한 세포 배지를 이용하여 코스타(COSTAR) 96-웰 조직 배양 플레이트 웰에서 단층(monolayer)으로 미리 배양되었다. 상기 항바이러스 분석은 도전 바이러스에 대하여 3회 반복으로 각 화합물의 6가지 농도에 대해 평가되도록 설계되었다. 배지만 포함하는 세포 대조군, 배지로만 처리된 바이러스 감염 세포 대조군 및 미감염 의약 세포 독성 대조군(세포들 및 의약)이 각 시험 플레이트에 위치되었다.
주 세포 배양물(시험 웰들 및 의약 세포 독성 대조군)은 2% 이산화탄소를 포함하고 습기가 있는 조건으로 37℃에서 18시간동안 웰당 0.2㎖의 각 약물 농도로 사전 처리되었다. 바이러스 대조군 및 세포 대조군이 될 세포 배양물은 18시간 동안 실험배지(MEN+2% 유태아혈청)에서 사전처리되었다.
18시간 처리후에 액체는 플레이트 웰에서 제거되고, 세포 단층은 배지와 함께 세척되었다. 그 다음에 각 시험 및 바이러스 대조군 배양 웰은 37℃에서 1시간동안 0.1㎖의 바이러스 현탁액에 노출되었다. 약물독성 및 세포 대조군 배양물은 웰달 0.1㎖ 배지와 함께 감염에 노출시켰다.
바이러스 흡착시간이 지난후 액체는 플레이트 웰에서 증발도고, 세포단층은 미흡착 바이러스를 제거하기 위해 배지와 함께 세척되었다. 3개씩의 바이러스-감염 배양물 및 두 개의 세포 독성 대조군 배양물에 0.2㎖의 정수배 농도의 각 약물이 첨가되었다. 미처리 바이러스 대조군 및 세포 대조군 배양물은 0.2㎖의 실험배지에 투입되었다. 플레이트들은 바이러스 대조군 배양물내에서 최대 CPE(세포파괴효과)가 관찰되어질 때까지(3일) 배양되었다.
세포 배양 웰들은 CPE 및 약물 세포 독성에 대해 현미경으로 관찰되었다. 항바이러스 활성이 바이러스 레이팅(virus rating, VR)에 의해 약물처리되고 감염된 세포 배양물내의 바이러스 유도 CPE 억제도를 산출함에 의해 결정되었다. VR은 CPE 억제 및 약물 세포 독성 정도를 모두 참작한 항바이러스 활성의 표준 가중 측정방법이며, 하기와 같이 에리히(Ehrlich) 일행의 방법(Ann. N.Y. Acad. Sci. 130 : 5-16, 1965)을 변형시킨 것이다. CPE는 다음의 척도에 따라 각 플레이트 웰내에 있는 각 개개의 배양물에 대해 평가되었다.
4=세포중 100%가 바이러스에 감염됨
3=세포중 75%가 바이러스에 감염됨
2=세포중 50%가 바이러스에 감염됨
1=세포중 25%가 바이러스에 감염됨
0=DPE 없음; 정상의 세포단층
U=테스트 불능(오염/누설)
t=약물 독성이 있음; CPE 판별 불능
p=일부 약물 독성 있음;CPE 판별 가능할 정도로 세포단층이 손상되지 않음
VR이 배양 플레이트내에서 각 테스트 웰의 보고된 CPE 등급과 해당 바이러스 대조군의 등급사이의 수차합의 0.1배로 산출되었다. 부분적으로 세포 독성(p)을 가지는 약물 농도를 함유한 시험 웰의 점수와 해당 바이러스 대조군들의 점수 사이의 수차가 반분되었다.
과거 경험으로 미루어 보아, 우리는 1.0 또는 그 이상의 VR은 생체의 실험에서 확실하게 높은 정도의 재현성을 가지는 큰 항바이러스 활성을 확인해 주는 것이라는 점을 알고 있다. 따라서 우리는 활성(f)을 가진 1.0 또는 그 이상의 VR을 가진 화합물을 발견하고자 하는 것이다. 우리의 시험 시스템에서 0.5 내지 0.9의 VR을 가진 화합물은 한계적 활성(±)을 가지는 것이고, 0.5 이하의 VR을 가진 화합물을 무활성(-)인 것으로 간주된다.
CPE를 50%(MIC50 또는 ID50)까지 감소시키는 최소 억제 의약 농도가 세미로그 커브 피팅(semilog curve fitting)을 위한 희귀 분석 프로그램에 의해 계산되어졌다. 각 적용 가능한 바이러스에 대해 각 활성 화합물의 치료학적 인덱스(TI)가 시험 화합물의 최소 세포 독성 농도를 MIC50 으로 나눔으로써 결정되어졌다.
처음에 8개의 인플루엔자 RNA표적자리를 지향하여 포스포로티오에니트 올리고뉴클레오티드 유사체들이 두개의 비감작 대조군과 함께 시험되었다. 이들 올리고뉴클레오티드 유사체들이 서열 및 표적들은 표 3에 보여지는 바와 같다.
이들 올리고뉴클레오티드들에 대한 CPE 억제 분석 결과가 표 4에 요약되어 있다.
1VR=바이러스 레이팅 : 에리히(Ehrlich) 일행의 방법의 변형(Ann. N.Y Acad. Sci., 130 : 5-16(1965))에 의한 것이며, 바이러스 유도 세포 파괴 효과(CPE)의 억제도 및 시험 화합물에 의해 유도된 세포 독성의 정도를 참작한 선택적 항바이러스 활성의 측정치. 경험적으로 1.0 또는 그 이상의 VR은 (+) 항바이러스 활성을 나타내고, 0.5 내지 0.9의 VR은 한계 (±) 항바이러스 활성을 나타내며, 0.5 이하의 VR은 통상 비(-) 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 규정될 수 있다.
2ID50(MIC50)=세미로그 커브 피팅에 의한 희구 분석 프로그램에 의해 계산된, CPE를 50%까지 억제시키는 최소 약물농도.
3MTC=세포 독성을 야기하는 최소 약물 농도(현미경으로 관찰됨). MTT 분석에 의해 결정되는 약물 세포 독성은 표 7에 나타나 있다.
4TI=최소 세포 독성 약물 농도를 ID50으로 나누어 계산된 치료학적 인덱스.
세가지 화합물들, 즉 ISIS 2792(서열 ID 번호 : 1), ISIS 2794(서열 ID 번호 : 3) 및 ISIS 2800(서열 ID 번호 : 9)이 1.0 또는 그 이상의 VR을 나타내었다. 그러나 최고의 레이팅(rating)을 보여준 화합물(ISIS 2800, 서열 ID 번호 : 9)은 무감작 대조군이었다.
제2군으로서 22 올리고뉴클레오티드 유사체들이 제조되고 시험되었다. 이들 올리고뉴클레오티드들의 서열 및 표적들이 표 5에 보여진다.
CPE-억제 분석의 결과가 표 6에 요약되어 있다.
1VR=바이러스 레이팅 : 에리히(Ehrlich) 일행의 방법의 변형(Ann. N.Y Acad. Sci., 130 : 5-16(1965))에 의한 것이며, 바이러스 유도 세포 파괴 효과(CPE)의 억제도 및 시험 화합물에 의해 유도된 세포 독성의 정도를 참작한 선택적 항바이러스 활성의 측정치. 경험적으로 1.0 또는 그 이상의 VR은 (+) 항바이러스 활성을 나타내고, 0.5 내지 0.9의 VR은 한계 (±) 항바이러스 활성을 나타내며, 0.5 이하의 VR은 통상 비(-) 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 규정될 수 있다.
2ID50(MIC50)=세미로그 커브 피팅에 의한 희구 분석 프로그램에 의해 계산된, CPE를 50%까지 억제시키는 최소 약물농도.
3MTC=세포 독성을 야기하는 최소 약물 농도(현미경으로 관찰됨). MTT 분석에 의해 결정되는 약물 세포 독성은 표 7에 나타나 있다.
4TI=최소 세포 독성 약물 농도를 ID50으로 나누어 계산된 치료학적 인덱스.
모든 화합물들이 A형 인플루엔자 바이러스에 대하여 활성이 있었다. 단지 2개의 화합물, ISIS 3303(서열 ID 번호 : 12) 및 ISIS 3304(서열 ID 번호 : 13)만이 바이러스 레이팅(VR)이 1.0보다 작았다. 가장 활성이 큰 화합물들은 ISIS 3307(서열 ID 번호 : 16; VR 3.2) 및 ISIS 3319(서열 ID 번호 : 28, VR 3.6)이었다. ISIS 3311(서열 ID 번호 : 20; VR 2.8, ID50 1.0μM, 및 TI19.8) 및 ISIS 3319(서열 ID 번호 : 28; VR 28, ID50 0.9μM, 및 TI23.5)는 가장 유력하고 선택할만한 것으로 밝혀졌다. ID50 및 TI는 0.1 부근의 값이 많았다. 양성 대조군 약물 리바비린(Ribavirin)이 VR에 따라서 시험 화합물보다 더 활성이 있는 것으로 나타났지만 화합물 ISIS 3311(서열 ID 번호 : 20) 및 ISIS 3319(서열 ID 번호 : 28)가 양성 대조군 약물보다 더 높은 치료학적 인덱스를 보여줌으로써 바이러스에 대하여 더 효과적이었다.
실시예 5
올리고뉴클레오티드 세포 독성의 MTT 분석
약물 세포 독성 세포 대조군 배양물의 전체 형태변화를 현미경으로 관찰하는 것에 부가하여 약물 세포 독성이 MTT 방법에 의해 정량적 측정되었다. 이 방법은 세포의 생명력을 측정하는 것이며, 살아있는 호스트 세포 미토콘드리아 효소에 의하여 테트로졸륨 염, 3-(4,5-디메틸-티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT)가 MTT 포르마잔(formazan)으로 환원되는 것에 기초하고 있다(T. Mossmann, J.Immunol. Methods., 65 : 55, 1983). diranf 세포 독성 대조군 및 세포 대조군이 MTT로 처리된 후 MTT 포르마잔의 결정을 용해하기 위하여 SDS로 처리되었다. MTT 포르마잔의 청색이 자동 플레이트 판독기에 의해 570㎚에서 분광광도측정법으로 측정되었다. 약물 세포 독성(생존 능력)이 각 약물 세포 독성 대조군의 흡수력(광밀도, O.D)을 세포 대조군 배양물의 평균 O.D와 비교함으로써 측정되었고 대조군에 대한 퍼센트로 표현되었다. 32개의 화합물중 어느것도 가장 높은 투여량인 20μM에서 독성이 없음이 현미경 평가에 의해(표 4 및 6)또는 MTT분석에 의해(표 7 및 8) 밝혀졌다.
1생존능력(Viability)(약물 세포 독성)은 각 약물 세포 독성 대조군의 흡수력(광밀도, OD)을 미처리 세포 대조군 배양물의 평균 OD와 비교함으로써 결정되고 대조군에 대한 퍼센트로 표현됨.
1생존능력(Viability)(약물 세포 독성)은 각 약물 세포 독성 대조군의 흡수력(광밀도, OD)을 미처리 세포 대조군 배양물의 평균 OD와 비교함으로써 결정되고 대조군에 대한 퍼센트로 표현됨.
따라서 이들 활성물질들의 선택가능성은 이들 분석에 의하여 증명되어진 것보다 클 수 있다.
실시예 6
비리온(virion) 어셈블리를 억제하기 위한 RNA 복제
인플루엔자 라이프사이클의 중요한 양상중의 하나는 비리온 어셈블리이다. 이 과정에서 바이러스는 완전한(감염성의) 비리온으로 패키징하기 위해 8개의 독특한 바이러스 RNA(vRNA)중에 하나를 선택할 필요가 있다. 바이러스 단백질에 의한 vRNA 분획의 인지는 이 과정에 있어서 필수적인 부분이다. vRNA 분획의 5' 말단은 바이러스 단백질의 결합자리로 확인되었다. vRNA의 5' 말단에 있는 리보뉴클레오티드 서열은 표 9에서 보여지는 바와 같이 상기 8개의 분획들에서 유지되어진다.
표 9
(A/PR/8/34형 인플루엔자의 서열임; 처음의 30 뉴클레오티드가 나타나 있다)
분획 1 AGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAATATG
분획 2 AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGAT
분획 3 AGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAA
분획 4 AGCGAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCA
분획 5 AGCGAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACTG
분획 6 AGCGAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATCCAA
분획 7 AGCGAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGAG
분획 8 AGCGAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGG
또한 이들 서열들은 인플루엔자 바이러스으 다른 기질들 사이에 유지되어 있다.
이들 서열들에서 볼 수 있는 바와 같이, 최초 12염기들은 8개 분획들의 각각에 모두 존재한다. 따라서 이들 공통 영역을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드(예를 들어 서열 ID 번호 : 33)가 효과적일 것이다.
인플루엔자 vRNA들의 5' 말단들의 RNA 2차 구조 분석은 단백질 인자에 있어서 중요한 역할을하는 각분획의 말단에 강한 2차 구조가 존재한다는 것을 암시한다.
모두가 본 발명의 양수인에게 양도되고, 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용된 것들로서 1990년 3월 21일에 출원된 미합중국 특허출원 제497,090호 및 1991년 3월 19일 출원돈 국제특허출원 제 PCT/US 91/01822호에 개시되어진 바와 같이 특정의 RNA와 단백질과의 상호 작용은 RNA의 적어도 일부를 복제하는 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드 유사체들을 채용함으로써 억제되어질 수 있다.
이는 상기 RNA가 RNA 복제에 공헌하는 강한 2차 구조를 가질 때 특히 효과적이라는 것을 뜻하는 것이다. 유전자 발현 및 질병 상태의 유지는 그러한 RNA-단백질 상호작용을 억제함으로써 조절되어질 수 있는 것이다. 본 발명을 실현하기 위하여 실제의 RNA 구조를 알아야 할 필요는 없으며, 단지 특이적 RNA서열이 RNA-결합 단백질에 의하여 인식되어진다는 것과 이러한 상호 작용이 중요한 생체학적 결과라는 것만 알면 된다.
표 10에서 보여진 RNA 복제 올리고뉴클레오티드들은 실시예 3에서 기술되어진 바와 같이 균일한 2'-O-메틸 또는 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 유사체로서 합성되어지고, 실시예 4에서 기술된 바와 같이 항바이러스 활성이 검색되어질 수 있다.
표 10
서열 ID 번호 :
34 AGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAATATG
35 AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGAT
36 AGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAA
37 AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCA
38 AGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACTG
39 AGCGAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATCCAA
40 AGCGAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGAG
41 AGCGAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGG
서열목록
(1) 일반정보
(ⅰ) 출원인 : 렉스 엠. 카우서트
데이비드 제이. 엑커
(ⅱ) 발명의 명칭 : 인플루엔자 바이러스의 억제
(ⅲ) 시퀸스의 수 : 41
(ⅳ) 주소 :
(a) 받는이 : 우드콕 워시번 쿠르쯔 매키빅쯔 노리스
(b) 거리명 : 원 리버티 플레이스-제46층
(c) 도시명 : 필라델피아
(d) 주명 : 팬실베니아
(e) 국명 : 미합중국
(f) 우편번호 : 19103
(ⅴ) 컴퓨터 해독 형태 :
(a) 중간형 : 디스켓 3.5인치, 1.44Mb 용량
(b) 컴퓨터 : IBM PS/2
(c) 작동 시스템 : PC-DOS
(d) 소프트웨어 : 워드퍼팩트 5.0
(ⅵ) 현행 출원 데이타 :
(a) 출원번호 : 미확인
(b) 출원인 : 본 특허출원의 출원일
(c) 분류 :
(ⅶ) 선행 기술 자료
(ⅷ) 대리인 정보 :
(a) 성명 : 제인 마세이 리카타
(b) 등록번호 : 32,257
(c) 참고/서류번호 : ISIS-0359
(ⅸ) 통신 연락처 :
(a) 전화번호 : (215) 568-3100
(b) TELEFAX : (215) 568-3439
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(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
(b) 유형 : 핵산
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(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
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AGCAAAAGCA GGGTGACAAA
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(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
(b) 유형 : 핵산
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(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
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(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
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(2) 서열 ID NO : 13에 관한 정보 :
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TCTTCCATTT TGGATCAGTA
(2) 서열 ID NO : 15에 관한 정보 :
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(2) 서열 ID NO : 16에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
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GACGCCATGA TTTTGATGTC
(2) 서열 ID NO : 17에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
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(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 17 :
GGATTCATTT TAAACCCCTG
(2) 서열 ID NO : 18에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
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AGACTCATCT TTCAATATCT
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GATAGAGAGA ACGTACGTTT
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GGATCCATTA TGTCTTTGTC
(2) 서열 ID NO : 22에 관한 정보 :
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CATGTCGGTT AGGTAACGCG
(2) 서열 ID NO : 23에 관한 정보 :
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(2) 서열 ID NO : 24에 관한 정보 :
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AGCAGTATGT CCTGGAAGAG
(2) 서열 ID NO : 25에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
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(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
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(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 25 :
AAAACGACCT TGTTTCTACT
(2) 서열 ID NO : 26에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
(b) 유형 : 핵산
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(2) 서열 ID NO : 27에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
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(2) 서열 ID NO : 28에 관한 정보 :
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(2) 서열 ID NO : 29에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
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(2) 서열 ID NO : 30에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
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(ⅲ) 가정 : 없음
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(2) 서열 ID NO : 31에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
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(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 31 :
AAAACTACCT TGTTTCTACT
(2) 서열 ID NO : 32에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 20염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 32 :
AAAACACCCT TGTTTCTACT
(2) 서열 ID NO : 33에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 12염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 33 :
AGCRAAAGCA GG
(2) 서열 ID NO : 34에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 30염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 34 :
AGCGAAAGCA GGTCAATTAT ATTCAATATG
(2) 서열 ID NO : 35에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 30염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 35 :
AGCGAAAGCA GGCAAACCAT TTGAATGGAT
(2) 서열 ID NO : 36에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 30염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 36 :
AGCGAAAGCA GGTACTGATC CAAAATGGAA
(2) 서열 ID NO : 37에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 30염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 37 :
AGCAAAAGCA GGGGAAAATA AAAACAACCA
(2) 서열 ID NO : 38에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 30염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 38 :
AGCAAAAGCA GGGTAGATAA TCACTCACTG
(2) 서열 ID NO : 39에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 30염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 39 :
AGCGAAAGCA GGGGTTTAAA ATGAATCCAA
(2) 서열 ID NO : 40에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 30염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 40 :
AGCGAAAGCA GGTAGATATT GAAAGATGAG
(2) 서열 ID NO : 41에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(a) 길이 : 30염기쌍
(b) 유형 : 핵산
(c) 스트랜디드니스 : 싱글
(d) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자형태 : 다른 핵산
(ⅲ) 가정 : 없음
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스아님
(?) 서열 기재 : 서열 ID 번호 : 41 :
AGCAAAAGCA GGGTGACAAA GACATAATGG.

Claims (18)

  1. 하기 서열들중 어느 하나의 적어도 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
    UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTCAAUU AU;
    UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGCAAACC AU;
    UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTACTGA TT;
    UCUCCCUCUC AGCAAAACCU UCCCGGAAAU GA;
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUAGAU AA;
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGAGUGAA AA;
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGUAGAUA UU; 또는
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUGACA AA.
  2. 하기 서열들중 어느 하나의 적어도 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
    5' 3'
    TTA TCT ACC CTG CTT TTG CT;
    TGG GAC GCC ATG ATT TTG AT;
    TTT GGT GCC TTG GGA CGC CA:
    GGA TCC TTC CCC GCG CTG GG;
    AGT AGA AAC AAG GGT ATT TT;
    AAA ATA CCC TTG TTT CTA CT;
    TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG;
    AGC AAA AGC AG GTA GAT AA;
    AAT ATC TAC CTG CTT TTG CT;
    TAG AAG ACT CAT CTT TCA AT;
    GAG AGA ACG TAC GTT TCG AC;
    TCG GCT TTG A GGG CCT GA;
    CTG ATA GGC CTG CAA ATT TT;
    AGT AGA AAC AAG GTA GTT TT;
    AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT;
    TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA;
    AGC AAA AGC AGG TAG ATA TT;
    TTT GTC ACC CTG CTT TTG CT;
    GTG TTA GGA TCC ATT ATG TC;
    AGC AAT CTA CCT GAA AGC TT;
    TAG TAT GTC CTG GAA GAG AA;
    AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT;
    AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT;
    GCC TCC GCA CCT GCT TCG CG; 또는
    AGC AAA AGC AGG GTC ACA AA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 황-함유 종으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 포스포로티오에이트 부분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  5. 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 황-함유 종으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 포스포로티오에이트 부분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  7. 하기 서열들중 어느 하나의 적어도 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 유효량으로 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는 인플루엔자 바이러스에 감염된 인간을 제외한 동물의 치료방법.
    UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTCAAUU AU;
    UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGCAAACC AU;
    UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTACTGA TT;
    UCUCCCUCUC AGCAAAACCU UCCCGGAAAU GA;
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUAGAU AA;
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGAGUGAA AA;
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGUAGAUA UU; 또는
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUGACA AA.
  8. 하기 서열들중 어느 하나의 적어도 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 유효량으로 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는 인플루엔자 바이러스에 감염된 인간을 제외한 동물의 치료방법.
    5' 3'
    TTA TCT ACC CTG CTT TTG CT;
    TGG GAC GCC ATG ATT TTG AT;
    TTT GGT GCC TTG GGA CGC CA:
    GGA TCC TTC CCC GCG CTG GG;
    AGT AGA AAC AAG GGT ATT TT;
    AAA ATA CCC TTG TTT CTA CT;
    TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG;
    AGC AAA AGC AG GTA GAT AA;
    AAT ATC TAC CTG CTT TTG CT;
    TAG AAG ACT CAT CTT TCA AT;
    GAG AGA ACG TAC GTT TCG AC;
    TCG GCT TTG A GGG CCT GA;
    CTG ATA GGC CTG CAA ATT TT;
    AGT AGA AAC AAG GTA GTT TT;
    AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT;
    TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA;
    AGC AAA AGC AGG TAG ATA TT;
    TTT GTC ACC CTG CTT TTG CT;
    GTG TTA GGA TCC ATT ATG TC;
    AGC AAT CTA CCT GAA AGC TT;
    TAG TAT GTC CTG GAA GAG AA;
    AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT;
    AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT;
    GCC TCC GCA CCT GCT TCG CG; 또는
    AGC AAA AGC AGG GTC ACA AA.
  9. 제7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 황-함유 종으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 포스포로티오에이트 부분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 황-함유 종으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 포스포로티오에이트 부분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  13. 본 출원 명세서의 발명의 상세한 설명중 표 3, 표 5 또는 표 10에 기재된 서열들중 어느 하나의 적어도 일부분 또는 서열 ID 번호 : 33의 적어도 일부분으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 황-함유 종으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드.
  15. 제13항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 포스포로티오에이트 부분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드.
  16. 본 출원 명세서의 발명의 상세한 설명중 표 3, 표 5 또는 표 10에 기재된 서열들중 어느 하나의 적어도 일부분 또는 서열 ID 번호 : 33의 적어도 일부분으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 치료학적 유효량으로 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는 인플루엔자 바이러스에 감염된 인간을 제외한 동물의 치료방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 황-함유 종으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유니트들 사이의 결합기들 중 적어도 일부가 포스포로티오에이트 부분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
KR1019930700440A 1990-08-14 1991-08-13 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 a형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보스트레인(ann arbor strain) h2n2의 억제 KR970005274B1 (ko)

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