JP3328682B2 - ヘルペスウィルスの増殖阻害方法 - Google Patents
ヘルペスウィルスの増殖阻害方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ウイルスの増殖阻害方法に関す
る。さらに、詳しく言えば本発明は、ヘルペスウイルス
の増殖に際して発生するメッセンジャーＲＮＡに対して
ハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構造に等しい
オリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレ
オチドを、人体外においてそのメッセンジャーＲＮＡに
供給することを特徴とするヘルペスウイルスの増殖阻害
方法に関するものである。本発明者は、病原性ウイルス
の増殖に際して発生するメッセンジャーＲＮＡに対して
ハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構造に等しい
オリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレ
オチドをそのメッセンジャーＲＮＡの存在箇所に供給す
ると病原性ウイルスの増殖が阻害されるとの知見を得
て、さらに、ウイルスに感染された動物に対し、上記の
オリゴヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオチド
を適用する実験を重ねた結果、本発明は、ウイルス増殖
阻害方法を実施する手段として、ヘルペスウイルスの増
殖に際して発生するメッセンジャーＲＮＡに対してハイ
ブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構造に等しいオリ
ゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチ
ドを含有することを特徴とするヘルペスウイルスの増殖
阻害方法を提供することに成功した。 【０００２】本発明を以下に、詳細に説明する。本発明
者は、先に、人工的に合成したＲＮＡを用いてこのＲＮ
Ａに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構
造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドを直接、無細胞
蛋白合成系に加えることにより、このＲＮＡに基づいて
合成されるはずの蛋白が合成されなくなるという事実を
発見した（後記実験例１参照）。 また、この際、このＲＮＡに対してハイブリッド形成し
えないＤＮＡ配列のオリゴデオキシヌクレオチドを用い
て、同様の実験を行うと、このＲＮＡに基づく蛋白の合
成が行われることが確認された。次いで、本発明者は、
真核細胞内に存在するαグロビンメッセンジャーＲＮＡ
およびβグロビンメッセンジャーＲＮＡを用いて、生理
条件下で、各種ＤＮＡを用いて、それらがαグロビンお
よびβグロビンの生成を阻害するか否かを確かめる実験
を行った（後記実験例２参照）。 【０００３】その結果、αグロビンメッセンジャーＲＮ
Ａに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡを直接、無細
胞蛋白合成系に加えることにより、αグロビンの生成が
阻害されること、およびβグロビンメッセンジャーＲＮ
Ａに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡを直接、無細
胞蛋白合成系に加えることにより、βグロビンの生成が
阻害されることが見出された。また、αグロビンメッセ
ンジャーＲＮＡに対してハイブリッド形成しえないＤＮ
Ａを用いたときには、αグロビンの生成が阻害されず、
βグロビンメッセンジャーＲＮＡに対してハイブリッド
形成しえないＤＮＡを用いたときには、βグロビンの生
成が阻害されないという事実も確認された。 【０００４】さらにまた、この実験系においては、使用
するＤＮＡがオリゴデオキシヌクレオチドである場合
に、高い蛋白生成阻害率を示していることが見出され
た。これらの実験結果に基づき、ヘルペスシンプレック
スウイルスの感染初期に形成されるメッセンジャーＲＮ
Ａと二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレオチドをヘ
ルペスシンプレックスウイルス感染細胞に投与したとこ
ろ、ヘルペスシンプレックスウイルスによる細胞のシン
シチウム（細胞融合により、プラック状の穴が培養ペト
リ皿上の細胞群に形成すること）の形成が著しく阻害さ
れることを確認した。 【０００５】上記実験では、細胞内へのオリゴデオキシ
ヌクレオチドの取込みを高める為に塩化カルシウムが用
いられているが、塩化カルシウムを使用しない場合でも
細胞内へオリゴデオキシヌクレオチドが取り込まれ、細
胞培養系でヘルペスシンプレックスウイルスの増殖が阻
害されることが確認された（後記実験例３参照）。これ
らの実験により、ヘルペスシンプレックスウイルスのメ
ッセンジャーＲＮＡに対してハイブリッド形成しうるＤ
ＮＡをヘルペスシンプレックスウイルス感染細胞に直接
加えることにより、有効にヘルペスシンプレックスウイ
ルスの増殖が阻害されることが明らかにされた。本発明
は、かかる知見に基づいてなされたものである。 【０００６】本発明の方法では、ヘルペスウイルスに由
来するメッセンジャーＲＮＡの塩基配列に対応するＤＮ
Ａ配列の部分構造に等しいオリゴデオキシヌクレオチド
またはポリデオキシヌクレオチドを用いるため、それ
は、他の遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡとは、
ハイブリッド形成せず、したがって、本発明の方法は、
他の遺伝子による蛋白合成には影響を与えない。 【０００７】本発明においては、ヘルペスウイルスのメ
ッセンジャーＲＮＡとしてのプラス鎖ＲＮＡとハイブリ
ッドを形成しうるＤＮＡの部分構造に等しいオリゴデオ
キシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドが用
いられる。 【０００８】 【０００９】本発明のヘルペスウイルスの増殖阻害方法
を適用することにより、ウイルスが存在している生体の
非感染細胞に影響を与えることなく、ヘルペスウイルス
の増殖を停止させ、非感染細胞への感染を予防すること
ができる。本発明において用いられるオリゴデオキシヌ
クレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドの正常細胞
への影響については、本発明者がヘルペスシンプレック
スウイルスのイミディエートアーリー遺伝子のメッセン
ジャーＲＮＡとハイブリッド形成しうる単鎖ＤＮＡの塩
基配列を有するデオキシヌクレオチドを用いて、ハムス
ター胎児腎細胞に対する影響を調べたところ、該デオキ
シヌクレオチドは、正常細胞の生存に影響を与えず、か
つ、その増殖能力にも影響を与えないことが判明してい
る。さらに、ヘルペスシンプレックスウイルス感染マウ
スに対する治療実験の際、イミディエートアーリー遺伝
子のメッセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成しうる単
鎖ＤＮＡの塩基配列を有するデオキシヌクレオチド投与
群の挙動、外観に変化は見られなかった。 【００１０】本発明において用いるオリゴデオキシヌク
レオチドまたはポリデオキシヌクレオチドは、ウイルス
のＤＮＡ単鎖を酵素処理等により分解して得られるもの
か、あるいは、所要のＤＮＡ配列の部分構造を合成して
得られるものなど、所望のＤＮＡ配列の部分構造を有す
るものであれば、その由来はいずれでもよい。さらにオ
リゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオ
チドを調製する方法としては、例えば以下のような方法
を例示することができる。すなわち、一つの方法は、ウ
イルスの遺伝子をクローン化し、そのＤＮＡの単鎖をフ
ラグメント化することである。 【００１１】ウイルス遺伝子をクローン化するにあた
り、ＲＮＡウイルスの場合には、逆転写酵素を用いてＤ
ＮＡを変えるか、もしくはそのウイルス感染細胞内に存
在するウイルスＤＮＡをもととする。ウイルスの遺伝子
をクローン化する場合には、例えばλファージ、あるい
はｐＢＲ ３２２等のプラスミドベクターを用いて二重
鎖ＤＮＡを得るか、またはＭ１３ファージ等を用いて単
鎖ＤＮＡを直接得る方法を使用する。クローン化する遺
伝子は、ウイルスに含まれる遺伝子の核酸鎖のどの部分
でもよいが、増殖に際し、早期に発現するアーリー（ea
rly）遺伝子あるいはイミディエートアーリー（immedia
te early）遺伝子をクローン化することが好ましい。 【００１２】クローン化したＤＮＡを大量に複製するた
めには、例えば、ウイルスの遺伝子を組み込ませたファ
ージ、あるいはプラスミドは保有する大腸菌を必要に応
じて抗生物質を加えた適当な容積の培養液中で常法によ
り培養し、集菌した後クローン化したウイルスの遺伝子
を含むＤＮＡを分離する。この分離に際しては、フェノ
ール、フェノール−クロロホルム等の有機溶媒処理によ
りＤＮＡを抽出することができる。 【００１３】分離したＤＮＡからウイルスのＤＮＡを取
り出すには、制限酵素で分解し、アガロースゲル電気泳
動法、カラムクロマトグラフィー等を用いる。得られた
ウイルスのＤＮＡは、必要に応じてフラグメント化す
る。このためには、例えばエンドヌクレアーゼ等の制限
酵素による処理あるいは超音波処理を行う。フラグメン
トの鎖長は、通常、１００ヌクレオチドから、９ヌクレ
オチド位までの範囲になるように考慮される。Ｍ１３フ
ァージを用いて調製する場合は、直接単鎖のフラグメン
トが得られるが、本発明の抗ウイルス剤の性質から考え
てあらかじめウイルスの遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ
と二重鎖を形成し得る単鎖ＤＮＡを選び、クローン化し
ておかなければならない。 【００１４】ｐＢＲ ３２２、λファージを用いて得ら
れたウイルスのＤＮＡのフラグメントは、単鎖とするた
め、例えば、１００℃で１０分間加熱後、急冷する。生
成物には、所望のＤＮＡフラグメントの単鎖が存在して
いるのでこれをそのまま本発明の抗ウイルス剤に使用す
ることができるが、また、この生成物中にはウイルスの
遺伝子のメッセンジャーＲＮＡに相補的でない単鎖フラ
グメントも存在しているので、これをアフィニティーク
ロマトグラフィー等を用いて除くことが好ましい。 【００１５】また、本発明において用いるオリゴデオキ
シヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオチドは有
機合成によっても製造することができる。この場合は、
そのオリゴデオキシヌクレオチドまたは、ポリデオキシ
ヌクレオチドの塩基配列は、ウイルスの遺伝子のメッセ
ンジャーＲＮＡの塩基配列に対してハイブリッド形成し
うる塩基配列でなくてはならない。例えば、ヘルペスシ
ンプレックスウイルスでは、イミディエートアーリー
（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）ＤＮＡの一つが、
プラスＤＮＡ（５′−ＡＴＧ・ＧＣＧ・ＴＣＧ・ＧＡＧ
…）とマイナスＤＮＡ（３′−ＴＡＣ・ＣＧＣ・ＡＧＣ
・ＣＴＣ…）の二重鎖を形成しているが、これらの内、
メッセンジャーＲＮＡと二重鎖を形成するＴＡＣ側（マ
イナス鎖ＤＮＡ）のＤＮＡの配列を選び合成する。 【００１６】 【００１７】 【００１８】次に、本発明において用いるオリゴデオキ
シヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドの調製
について説明する。 【００１９】 【具体例】 具体例１ ヘルペスシンプレックスウイルスをクロロホルム−フェ
ノールの有機溶媒で処理して得られたＤＮＡを制限酵
素、BamHIで切り、あらかじめ制限酵素、BamHIで切って
おいたベクターｐＢＲ ３２２にＴ４ファージリガーゼ
を用いて組み込んだ。得られたプラスミドを大腸菌に与
え、アンピシリンを含む寒天培地上でコロニーを形成さ
せた。これらのコロニーのうちからヘルペスシンプレッ
クスウイルスの32ＰでラベルしたＤＮＡにハイブリダイ
ズするものをフィルターハイブリダイゼイション法で選
び、５０μｇ／mlの濃度でアンピシリンを含む２リット
ルのＴＳＢ（Tryptose Soy Broth）培地で培養した。こ
の培地１mlに対し、上記プラスミドを含む大腸菌を１０
6〜１０7個加え、２０mlの試験管中で３７℃、１５時間
振とう培養した。培養液の５４０nmにおける吸光度が
０.５になるまで培養したところで、１０μｇ／mlのク
ロラムフェニコールを加え、更に１５時間培養を続け
た。 【００２０】こうして得られた大腸菌培養液を遠心処理
することにより得られたペレットに２５％ショ糖を含む
５０mMトリス塩酸（pH＝８.０）を加え、これを０℃以
下で５分間放置し、４mlのTriton-X １００を加えて生
成した粘稠な液を０℃、３００００Ｇで３０分間遠心分
離した。この上清８mlにＣｓＣｌ ８ｇおよびEthidium
Bromide（５μｇ／ml）１mlを加えて更に１０００００
Ｇ、４８時間遠心分離することにより生成した粗プラス
ミド分画を採取し、２倍量のイソプロピルアルコールを
加えて混和し、上清を除いた後、０.１Ｍトリス１０mM
ＥＤＴＡ（pH＝８.０）で一夜透析した。透析内液を濃
縮し、ＤＮＡ ２００μｇ相当量を取り、過剰量の制限
酵素（BamHI）を加えて反応させた後、アガロース電気
泳動法により、ヘルペスシンプレックスウイルスのＤＮ
Ａを分離した。このＤＮＡを次にＤＮＡａｓｅで部分分
解した後、１００℃で１０分間加熱後、急冷し、鎖長９
〜１００位のオリゴデオキシヌクレオチドないしポリデ
オキシヌクレオチドを得る。 【００２１】具体例２ クローン用のＭ１３ファージの複製形二重鎖ＤＮＡをBa
mHIで切断した。次に具体例１で分離したヘルペスシン
プレックスウイルスのＤＮＡと、この切断されたＭ１３
ファージの複製形二重鎖ＤＮＡをＴ４ファージリガーゼ
を用いて結合した。この結合されたＤＮＡを常法によ
り、ＣａＣｌ2の存在下、１ac（−）大腸菌内に入れ、
ファージプラックをＸ−ｇａｌ（インジケーター）の存
在下で作らせた。ヘルペスシンプレックスウイルスＤＮ
Ａを含有するＭ１３ファージは、２４時間後に、青色を
示さないファージプラックを形成した。これに32Ｐでラ
ベルしたヘルペスシンプレックスウイルスＤＮＡのプラ
ス鎖（鎖長２０デオキシヌクレオチド以上）とハイブリ
ダイズするプラークを採取した。これは、青色を示さな
いファージプラックにはヘルペスシンプレックスウイル
スの二重鎖ＤＮＡのそれぞれ片側のＤＮＡどちらかのみ
が含有されるためである。このＭ１３ファージをフェノ
ール−クロロホルムで処理しＤＮＡを分離した。 なお、上記で得られたＤＮＡは、ヘルペスシンプレック
スウイルス単鎖ＤＮＡを含むが、さらに精製を行い、こ
の中に含まれるＭ１３ファージのＤＮＡを除去してもよ
く、あるいはＤＮＡａｓｅ部分分解し、鎖長９〜１００
位のオリゴデオキシヌクレオチドないしポリデオキシヌ
クレオチドとするこにとができる。 【００２２】具体例３ ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystem社製）を用いてヘ
ルペスシンプレックスウイルスのイミディエートアーリ
ー（immediate early）ＤＮＡのマイナスＤＮＡの内、
プラスＤＮＡと二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレ
オチド（3′−…TAC・CGC・AGC・CTC・TTG・TTC・GTC・
GCG…−5′）の内の２０デオキシヌクレオチド（3′−C
GC・AGC・CTC・TTG・TTC・GTC・GC−5′）を合成し、精
製した。以下、この２０デオキシヌクレオチドを２０me
rと略記する。この２０merのシークエンスについては、
マキサム・キルバート法により確認した。 【００２３】具体例４ ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystem社製）を用いてヘ
ルペスシンプレックスウイルスのイミディエートアーリ
ー(immediate early）ＤＮＡのマイナスＤＮＡの内、プ
ラスＤＮＡと二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレオ
チドの内の２０デオキシヌクレオチド（3′−GCA・CCC
・GGG・ACC・TTT・ACC・GC−5′）を合成し、精製し
た。以下、この２０デオキシヌクレオチドを２０Ｂと略
記する。この２０Ｂのシークエンスについては、マキサ
ム・ギルバート法により確認した。 【００２４】本発明の方法を適用するに当っては、前記
のオリゴデオキシヌクレオチドないしポリデオキシヌク
レオチドを、適宜、通常、医薬品製剤に用いられている
適当な溶剤、賦形剤、補助剤などを使用して、製剤製造
の常法に従って液剤、注射剤、坐剤などの製剤として調
製される。処方にあたっては、所望のオリゴデオキシヌ
クレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドを単独で、
もしくは適宜組合せて用いることができ、また他の医薬
活性成分を配合してもよい。 【００２５】これらの組合せ、配合にあたっては、それ
ら組合せあるいは配合の対象となる成分は、上記のオリ
ゴデオキシヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオ
チドの抗ウイルス作用に対し、これを阻害するものであ
ってはならない。上記のオリゴデオキシヌクレオチドま
たはポリデオキシヌクレオチドは、それらに対して不活
性な適当な基剤と混和してクリーム、軟膏剤、パップ剤
などの外用剤とすることができる。 【００２６】液剤、注射剤として調製するときは、一般
に注射用蒸留水、生理食塩水、デキストロース水溶液、
注射用植物油、プロピレングリコール、ポリエチレング
リコール等を用いることができる。さらに必要に応じ
て、適宜等張化剤、溶解補助剤、安定剤、防腐剤、無痛
化剤等を加えてもよい。また、この種の剤型の場合、滅
菌された注射用媒体に溶解することが望ましい。製剤の
調製にあたって使用される上記のごとき各種の基剤、添
加剤、佐薬等が上記のオリゴデオキシヌクレオチドまた
はポリデオキシヌクレオチドの抗ウイルス作用を阻害す
るものであってはならないことは言うまでもない。 【００２７】本発明の方法は、上記目的に合った剤型の
製剤をウイルスに感染した生体の患部に直接適用する
か、または血管内に投与するなどして、前記のオリゴデ
オキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドが
結果的に患部に到達し得るように生体に適応させる。以
下に、マウスを用いた本発明の方法に関する効果確認実
験の例を掲げる。 【００２８】 【例】 例 １−(１) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脳室内に種々の濃度の２
０merのＭＥＭ溶液３０μｌにＨＳＶ−１（Ｆ株）（１
×１０4PFU）を含んだものを注入し、腹腔内に種々の濃
度の２０merのＭＥＭ溶液２００μｌ（１％のペニシリ
ン及びストレプトマイシンならびに２mMのグルタミンを
含有する。）をＨＳＶ−１（Ｆ株）注入翌日より、３日
間連日投与し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）注入後７日目の死亡
率を調べた。第１図に示すごとく２０mer投与群では、
濃度依存的にＨＳＶ−１による死亡率を減少させた。死
亡率は、２０mer無投与群の死亡率を１００％として表
した。 【００２９】例 １−(２) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脳室内に種々の濃度の２
０merのＭＥＭ溶液３０μｌにＨＳＶ−１（Ｆ株）（１
×１０4PFU）を含んだものをＨＳＶ−１(Ｆ株)のＭＥＭ
溶液３０μｌ（１×１０4PFU）を注入し、このマウスの
腹腔内に種々の濃度の２０merのＭＥＭ溶液２００μｌ
（１％のペニシリン及びストレプトマイシンならびに２
mMのグルタミンを含有する。）をＨＳＶ−1（Ｆ株）注
入翌日より、６日間連日投与し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）注
入後６４〜６８時間目の死亡率を調べた。その結果を第
１表に示す。 【００３０】 【表１】第１表に示すごとく２０mer非投与群では死亡率５／１
９を示すのに対し、２０mer投与群では、死亡が認めら
れなかった。 【００３１】例 １−(３) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脳室内に種々の濃度の２
０merのＭＥＭ溶液３０μｌにＨＳＶ−１（Ｆ株)（５×
１０4PFU）を含んだものを注入し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）
注入後６４〜６８時間目、７１〜７８時間目の死亡率を
調べた。その結果を第２表に示す。 【表２】 第２表に示すごとく２０mer非投与群では死亡率３／１
０（６４〜６８時間）、３／１０（７１〜７８時間）を
示すのに対し、２０mer投与群では、明らかに死亡率が
減少していることが認められた。 【００３２】例 １−(４) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脳室内に種々の濃度の２
０merのＭＥＭ溶液３０μｌにＨＳＶ−１（Ｆ株）(５×
１０4PFU）を含んだものを注入し、このマウスの脳室内
に種々の濃度の２０merのＭＥＭ溶液３０μｌ（１％の
ペニシリン及びストレプトマイシンならびに２mMのグル
タミンを含有する。）をＨＳＶ−１（Ｆ株）注入翌日よ
り、２日間連日投与し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）注入後６４
〜６８時間目、７１〜７８時間目、８８〜９２時間目の
死亡率を調べた。その結果を第３表に示す。 【表３】 第３表に示すごとく２０mer非投与群における死亡率に
対し、２０mer投与群では、８８〜９２時間まで、明ら
かに死亡率が減少していることが認められた。 【００３３】例 １−(５) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に１.１２μｇ／m
lの２０merのＭＥＭ溶液２００μｌにＨＳＶ−１（Ｆ
株）（１×１０6PFU）を含んだものを注入し、このマウ
スの腹腔内に種々の濃度の２０merのＭＥＭ溶液２００
μｌ（１％のペニシリン及びストレプトマイシンならび
に２mMのグルタミンを含有する。）をＨＳＶ−１（Ｆ
株）注入３時間前および２時間前ならびに翌日より３日
間連日投与し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）注入後２１１時間
目、２５９時間目の死亡率を調べた。その結果を第４表
に示す。 【表４】 第４表に示すごとく２０mer非投与群では、死亡率１／
１０（２１１時間）、２／１０（２５９時間）を示すの
に対し、２０mer投与群では死亡が認められなかった。 【００３４】例 ２ 麻酔下で鋭い針で五回傷つけた、３週齢のＢＡＬＢ／Ｃ
マウスの角膜に、ＭＥＭ溶液３０μｌ（１％のペニシリ
ン及びストレプトマイシンならびに２mMのグルタミンな
らびに５％の幼牛血清を含有する。）にＨＳＶ−１（Ｆ
株)（１×１０6PFU／ml）を含んだものを滴下した。上
記のマウスを以下の４群に分けてその様子を観察した。 【００３５】Ａ. このマウスの角膜に２２.４μｇ／ml
の２０merを含んだＭＥＭ溶液１０μｌをＨＳＶ−１
（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日より隔日投与で３回
角膜に滴下し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）滴下１日前、５時間
前ならびに翌日より隔日投与で３回酢酸コルチゾン溶液
（２mg／kg）３０μｌを筋注した群。 Ｂ. このマウスの角膜に２２.４μｇ／mlの２０merを含
んだＭＥＭ溶液１０μｌをＨＳＶ−１（Ｆ株）滴下２時
間前ならびに翌日より隔日投与で３回角膜に滴下した
群。 【００３６】Ｃ. このマウスの角膜にＭＥＭ溶液１０μ
ｌをＨＳＶ−１（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日より
隔日投与で３回角膜に滴下し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）滴下
１日前、５時間前ならびに翌日より隔日投与で３回酢酸
コルチゾン溶液（２mg／kg）３０μｌを筋注した群。 Ｄ. このマウスの角膜にＭＥＭ溶液１０μｌをＨＳＶ−
１（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日より隔日投与で３
回角膜に滴下した群。 【００３７】各群のマウスの目の状態及び目の周辺に見
られる発疹に注目してマウスの様子を４日目、７日目、
１２日目に観察したところ、２０ｍｅｒを投与した群で
あるＡ群、Ｂ群では非投与群であるＣ群、Ｄ群に較べて
明らかに発疹が少なく目の状態も良好であった。また、
この際、２０ｍｅｒ投与の効果に対しては、コルチゾン
投与の影響は認められなかった。上記の例１および例２
から、本発明の方法は、明らかに、罹患動物においてウ
イルスの増殖を抑制し、それによる死亡率の減少および
症状の軽減が認められるので、非常に有用性の高いもの
であることが判る。以下に、本発明の方法に用いられる
抗ウイルス剤の製剤例を掲げる。 【００３８】 【製剤例】 製剤例１ 具体例３において得られた２０merと同様のものを液層
法で合成し、その２０mer ２ｇを注射剤製造の常法に従
って、等張のＭＥＭ溶液を加えて１リットルとしてアン
プルに封入し注射剤とする。この注射剤は１ml中に２０
mer、２mgを含有する。この注射剤は症状に合せて１回
１〜５mlを感染患部になるべく近いところに注射する。 【００３９】製剤例２ 具体例４において得られた２０Ｂと同様のものを液層法
で合成し、その２０Ｂ１０ｇに等張のＭＥＭ溶液を加え
て１リットルとして１％点眼剤とする。 【００４０】この点眼剤は、症状に合せて１回２〜３
滴、１日数回点眼する。 製剤例３ 具体例３において得られた２０ｍｅｒと同様のものを液
層法で合成し、その２０ｍｅｒ １ｇを研磨して粉末と
し、これに精製カカオ脂９９９ｇを加えて６０℃の水浴
上で練合し、整形して１個２ｇの坐剤とする。この坐剤
は１個中に２０ｍｅｒを２ｍｇ含有し、症状に合せて使
用する。次に、本発明の方法で用いられる抗ウイルス剤
の安全性について、試験例を示し説明する。 【００４１】 【試験例】試験例１ ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、１００μｇ／ｋｇの２０ｍｅｒ
をｉ．ｐ．投与したところ死亡例を認めなかった。 試験例２ 前述の効果確認実験、例２においてＨＳＶ−１を使用せ
ず、他は同様にして行った実験では、２０ｍｅｒ非投与
群と２０ｍｅｒ投与群との間に差異は認められなかっ
た。ここで示したように、本発明の方法で用いられる抗
ウイルス剤は、前述のオリゴデオキシヌクレオチドまた
はポリオキシヌクレオチドの有効投与量において安全で
あることは明らかである。以下に、本発明に関連してな
された実験例を掲げる。 【００４２】 【実験例】 実験例１ メッセンジャーＲＮＡとしてポリウリジル酸を用いたポ
リフェニルアラニン合成反応のポリアデニル酸及びデオ
キシポリアデニル酸による阻害作用 ポリウリジル酸(１４０μｇ)、14Ｃ−フェニルアラニン
（１０5cpm, ３００μCi／μmole）、Nierenberg and M
athaeiの方法（Proc. Nat. Acad. Sci. 47，1588 (196
1)）により作成した大腸菌抽出液、１３mM酢酸マグネシ
ウム塩、１mM ＡＴＰ、１mM燐酸クレアチン、クレアチ
ンホスホキナーゼ(１μｇ)を１０mMトリス塩酸(pH７.
５)に溶解して反応液系を作った。この反応液系に第５
表に列記した阻害剤を加え４０μｌとし、１.５mlのエ
ッペンドルフ管中で３７℃、３０分間反応させ、反応に
より得られた溶液中のポリフェニルアラニンの量を１０
％トリクロール酢酸に９５℃で不溶の放射蛋白の量と
し、液体シンチレーションカウンターを用いて測定し
た。阻害度は、阻害剤を加えない時のポリフェニルアラ
ニンの放射能と加えた時の放射能を比較して算出した。
その結果を第５表に示す。 【００４３】 【表５】第５表に示すごとく、ポリウリジル酸（ＲＮＡ）に対し
て、その塩基配列に対応するポリデオキシアデニル酸
（ＤＮＡ）は、著しいポリフェニルアラニンの合成阻害
活性を示した。この実験においては、ＤＮＡ鎖は９ヌク
レオチド以上のオリゴデオキシアデニル酸（オリゴデオ
キシヌクレオチド）まで強い阻害活性を示した。 【００４４】実験例２ ウサギの網状赤血球系におけるグロビン合成のグロビン
単鎖ＤＮＡによる特異的阻害作用 この実験例は、真核細胞のメッセンジャーＲＮＡに対し
てハイブリッド形成するオリゴデオキシヌクレオチドま
たはポリデオキシヌクレオチドを用いて生理的な条件下
で、蛋白の合成を阻害することを確かめた実験例であ
る。４.２mMリン酸カルシウム、２mMジメチルチオスレ
イトール（ＤＴＴ）、０.０８mMアミノ酸（メチオニン
を除く）、６mM酢酸カリウム、８mM酢酸マグネシウム、
スペルミジン４.５μｇ、35Ｓ−メチオニン（０.１μC
i）、およびJacksonとPelhamらの方法（Eur. Biochem.
67. 247-256 (1976)）により作成した無細胞網状赤血球
蛋白合成系１０μｌ、α及びβグロビンメッセンジャー
ＲＮＡ各７５μｇを２１mM ＨＥＰＥＳに溶解して第６
表に列記した阻害剤を加え、総量３０μｌとした後、
１.５mlのエッペンドルフ管中で３０℃、３０分間反応
させた。上記の反応により得られた溶液中の反応生成物
は、Triton-Acied-Ureaゲルでαグロビン、βグロビ
ン、その他の蛋白に分け、ラジオオートグラフィーで各
分画の放射能を測定した。阻害度は、阻害剤を加えない
時の放射能と比較して算出した。その結果を第６表に示
す。 【００４５】 【表６】 【００４６】第６表に示すごとく、αグロビンのゲノム
ＤＮＡは、αグロビンの合成のみを、βグロビンのゲノ
ムＤＮＡは、βグロビンの合成のみを特異的に阻害す
る。ウシ胸腺ＤＮＡは殆ど阻害活性を示さなかった。こ
のことから真核細胞のメッセンジャーＲＮＡの塩基配列
に相当するＤＮＡの存在によってそのメッセンジャーＲ
ＮＡに基づく蛋白合成が特異的に阻害されることがわか
る。さらに、αグロビンのＮ末端アミノ酸に相当する１
５オリゴデオキシヌクレオチドがαグロビンの合成のみ
を阻害すること及びＭ１３ファージの１５オリゴデオキ
シヌクレオチドがαグロビン並びにβグロビンの合成に
ほとんど影響を与えていないことから、メッセンジャー
ＲＮＡの塩基配列に相当するＤＮＡ鎖が１５ヌクレオチ
ドまで短かくなった場合でも、その阻害活性と特異性は
失なわれないことがわかった。 【００４７】実験例３ ２０merのハムスター胎児腎細胞（BHKcell）内への透過
性 この実験例は、単鎖オリゴヌクレオチドの細胞内への透
過性を確かめた実験である。ハムスター胎児腎細胞（BH
Kcell, ４.４×１０5 cells）にＨＳＶ−１（７.６×１
０4 PFU／ml）の存在下もしくは非存在下で３時間培養
した。これらの細胞に対して１７.６６pmoleの32Ｐラベ
ルした２０merを種々の時間接触させた。溶媒を除き、
細胞を０.３mlのＰＢＳで２回洗浄し、さらに、３６℃
で３０分間、０.１Ｍ ＮａＣｌ、３３μＭ ＺｎＣｌ2、
３３６０unitヌクレアーゼＳ１を含む３３.３mM酢酸ナ
トリウム緩衝液（pH４.５）の溶液中で放置した後、ヌ
クレアーゼＳ１を除いた上記酢酸ナトリウム緩衝液で２
回洗浄し、０.３mlの１０mMＥＤＴＡ、０.６％ドデシル
硫酸ナトリウムおよび、１０mMトリス緩衝液（pH７.
５）で、細胞を溶壊した。ここで、この溶液中のＴＣＡ
不溶性物質および、ヌクレアーゼＳ１感受性の２０mer
の量を測定したところ、８時間で１細胞あたり４.６８
×１０3個の２０merが取り込まれていることが判った。 【００４８】実験例４ オリゴデオキシヌクレオチドの配合による影響 (ａ) マイクロプレート（リンブロ社製、穴内径１.５c
m）に一穴あたり１.５×１０5個のハムスター胎児腎細
胞（ＢＨＫ cell）を入れ、５％ＣＯ2インキュベーター
中で、３６℃で４７〜４８時間培養し、この細胞に１型
ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ−１）（７.
６×１０4 PFU／ml）１６０μｌを加え、３６℃で３時
間感染させた。この感染細胞に、種々の量の２０merあ
るいは２０merと２０Ｂの混合物（２２４：１）を溶媒
に溶解して０.３ml（ＣａＣｌ2濃度４.５５mM）で８時
間培養した。 【００４９】(ｂ) 別に、上記(ａ)の操作において、２
０merあるいは２０merと２０Ｂの混合物を使用せずに他
は、すべて同様にして、培養操作を行った（ウイルスコ
ントロール）。上記(ａ)の培養細胞を固定し、染色し、
シンシチウムの数を計測した。この結果をウイルスコン
トロール(ｂ)のシンシチウム数を１００％として、第２
図に示す。第２図に示すごとく、２０merと２０Ｂの混
合物を使用した場合、２０mer単独の時よりも強いウイ
ルス増殖阻害作用を示すことが認められた。このことか
ら、阻害作用は、ヘルペスシンプレックスウイルスのマ
イナス鎖ＤＮＡを構成する塩基配列のうちの異なる塩基
配列部分を併せて用いた場合その作用を増強することが
あるという事実が確認された。
る。さらに、詳しく言えば本発明は、ヘルペスウイルス
の増殖に際して発生するメッセンジャーＲＮＡに対して
ハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構造に等しい
オリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレ
オチドを、人体外においてそのメッセンジャーＲＮＡに
供給することを特徴とするヘルペスウイルスの増殖阻害
方法に関するものである。本発明者は、病原性ウイルス
の増殖に際して発生するメッセンジャーＲＮＡに対して
ハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構造に等しい
オリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレ
オチドをそのメッセンジャーＲＮＡの存在箇所に供給す
ると病原性ウイルスの増殖が阻害されるとの知見を得
て、さらに、ウイルスに感染された動物に対し、上記の
オリゴヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオチド
を適用する実験を重ねた結果、本発明は、ウイルス増殖
阻害方法を実施する手段として、ヘルペスウイルスの増
殖に際して発生するメッセンジャーＲＮＡに対してハイ
ブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構造に等しいオリ
ゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチ
ドを含有することを特徴とするヘルペスウイルスの増殖
阻害方法を提供することに成功した。 【０００２】本発明を以下に、詳細に説明する。本発明
者は、先に、人工的に合成したＲＮＡを用いてこのＲＮ
Ａに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構
造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドを直接、無細胞
蛋白合成系に加えることにより、このＲＮＡに基づいて
合成されるはずの蛋白が合成されなくなるという事実を
発見した（後記実験例１参照）。 また、この際、このＲＮＡに対してハイブリッド形成し
えないＤＮＡ配列のオリゴデオキシヌクレオチドを用い
て、同様の実験を行うと、このＲＮＡに基づく蛋白の合
成が行われることが確認された。次いで、本発明者は、
真核細胞内に存在するαグロビンメッセンジャーＲＮＡ
およびβグロビンメッセンジャーＲＮＡを用いて、生理
条件下で、各種ＤＮＡを用いて、それらがαグロビンお
よびβグロビンの生成を阻害するか否かを確かめる実験
を行った（後記実験例２参照）。 【０００３】その結果、αグロビンメッセンジャーＲＮ
Ａに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡを直接、無細
胞蛋白合成系に加えることにより、αグロビンの生成が
阻害されること、およびβグロビンメッセンジャーＲＮ
Ａに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡを直接、無細
胞蛋白合成系に加えることにより、βグロビンの生成が
阻害されることが見出された。また、αグロビンメッセ
ンジャーＲＮＡに対してハイブリッド形成しえないＤＮ
Ａを用いたときには、αグロビンの生成が阻害されず、
βグロビンメッセンジャーＲＮＡに対してハイブリッド
形成しえないＤＮＡを用いたときには、βグロビンの生
成が阻害されないという事実も確認された。 【０００４】さらにまた、この実験系においては、使用
するＤＮＡがオリゴデオキシヌクレオチドである場合
に、高い蛋白生成阻害率を示していることが見出され
た。これらの実験結果に基づき、ヘルペスシンプレック
スウイルスの感染初期に形成されるメッセンジャーＲＮ
Ａと二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレオチドをヘ
ルペスシンプレックスウイルス感染細胞に投与したとこ
ろ、ヘルペスシンプレックスウイルスによる細胞のシン
シチウム（細胞融合により、プラック状の穴が培養ペト
リ皿上の細胞群に形成すること）の形成が著しく阻害さ
れることを確認した。 【０００５】上記実験では、細胞内へのオリゴデオキシ
ヌクレオチドの取込みを高める為に塩化カルシウムが用
いられているが、塩化カルシウムを使用しない場合でも
細胞内へオリゴデオキシヌクレオチドが取り込まれ、細
胞培養系でヘルペスシンプレックスウイルスの増殖が阻
害されることが確認された（後記実験例３参照）。これ
らの実験により、ヘルペスシンプレックスウイルスのメ
ッセンジャーＲＮＡに対してハイブリッド形成しうるＤ
ＮＡをヘルペスシンプレックスウイルス感染細胞に直接
加えることにより、有効にヘルペスシンプレックスウイ
ルスの増殖が阻害されることが明らかにされた。本発明
は、かかる知見に基づいてなされたものである。 【０００６】本発明の方法では、ヘルペスウイルスに由
来するメッセンジャーＲＮＡの塩基配列に対応するＤＮ
Ａ配列の部分構造に等しいオリゴデオキシヌクレオチド
またはポリデオキシヌクレオチドを用いるため、それ
は、他の遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡとは、
ハイブリッド形成せず、したがって、本発明の方法は、
他の遺伝子による蛋白合成には影響を与えない。 【０００７】本発明においては、ヘルペスウイルスのメ
ッセンジャーＲＮＡとしてのプラス鎖ＲＮＡとハイブリ
ッドを形成しうるＤＮＡの部分構造に等しいオリゴデオ
キシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドが用
いられる。 【０００８】 【０００９】本発明のヘルペスウイルスの増殖阻害方法
を適用することにより、ウイルスが存在している生体の
非感染細胞に影響を与えることなく、ヘルペスウイルス
の増殖を停止させ、非感染細胞への感染を予防すること
ができる。本発明において用いられるオリゴデオキシヌ
クレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドの正常細胞
への影響については、本発明者がヘルペスシンプレック
スウイルスのイミディエートアーリー遺伝子のメッセン
ジャーＲＮＡとハイブリッド形成しうる単鎖ＤＮＡの塩
基配列を有するデオキシヌクレオチドを用いて、ハムス
ター胎児腎細胞に対する影響を調べたところ、該デオキ
シヌクレオチドは、正常細胞の生存に影響を与えず、か
つ、その増殖能力にも影響を与えないことが判明してい
る。さらに、ヘルペスシンプレックスウイルス感染マウ
スに対する治療実験の際、イミディエートアーリー遺伝
子のメッセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成しうる単
鎖ＤＮＡの塩基配列を有するデオキシヌクレオチド投与
群の挙動、外観に変化は見られなかった。 【００１０】本発明において用いるオリゴデオキシヌク
レオチドまたはポリデオキシヌクレオチドは、ウイルス
のＤＮＡ単鎖を酵素処理等により分解して得られるもの
か、あるいは、所要のＤＮＡ配列の部分構造を合成して
得られるものなど、所望のＤＮＡ配列の部分構造を有す
るものであれば、その由来はいずれでもよい。さらにオ
リゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオ
チドを調製する方法としては、例えば以下のような方法
を例示することができる。すなわち、一つの方法は、ウ
イルスの遺伝子をクローン化し、そのＤＮＡの単鎖をフ
ラグメント化することである。 【００１１】ウイルス遺伝子をクローン化するにあた
り、ＲＮＡウイルスの場合には、逆転写酵素を用いてＤ
ＮＡを変えるか、もしくはそのウイルス感染細胞内に存
在するウイルスＤＮＡをもととする。ウイルスの遺伝子
をクローン化する場合には、例えばλファージ、あるい
はｐＢＲ ３２２等のプラスミドベクターを用いて二重
鎖ＤＮＡを得るか、またはＭ１３ファージ等を用いて単
鎖ＤＮＡを直接得る方法を使用する。クローン化する遺
伝子は、ウイルスに含まれる遺伝子の核酸鎖のどの部分
でもよいが、増殖に際し、早期に発現するアーリー（ea
rly）遺伝子あるいはイミディエートアーリー（immedia
te early）遺伝子をクローン化することが好ましい。 【００１２】クローン化したＤＮＡを大量に複製するた
めには、例えば、ウイルスの遺伝子を組み込ませたファ
ージ、あるいはプラスミドは保有する大腸菌を必要に応
じて抗生物質を加えた適当な容積の培養液中で常法によ
り培養し、集菌した後クローン化したウイルスの遺伝子
を含むＤＮＡを分離する。この分離に際しては、フェノ
ール、フェノール−クロロホルム等の有機溶媒処理によ
りＤＮＡを抽出することができる。 【００１３】分離したＤＮＡからウイルスのＤＮＡを取
り出すには、制限酵素で分解し、アガロースゲル電気泳
動法、カラムクロマトグラフィー等を用いる。得られた
ウイルスのＤＮＡは、必要に応じてフラグメント化す
る。このためには、例えばエンドヌクレアーゼ等の制限
酵素による処理あるいは超音波処理を行う。フラグメン
トの鎖長は、通常、１００ヌクレオチドから、９ヌクレ
オチド位までの範囲になるように考慮される。Ｍ１３フ
ァージを用いて調製する場合は、直接単鎖のフラグメン
トが得られるが、本発明の抗ウイルス剤の性質から考え
てあらかじめウイルスの遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ
と二重鎖を形成し得る単鎖ＤＮＡを選び、クローン化し
ておかなければならない。 【００１４】ｐＢＲ ３２２、λファージを用いて得ら
れたウイルスのＤＮＡのフラグメントは、単鎖とするた
め、例えば、１００℃で１０分間加熱後、急冷する。生
成物には、所望のＤＮＡフラグメントの単鎖が存在して
いるのでこれをそのまま本発明の抗ウイルス剤に使用す
ることができるが、また、この生成物中にはウイルスの
遺伝子のメッセンジャーＲＮＡに相補的でない単鎖フラ
グメントも存在しているので、これをアフィニティーク
ロマトグラフィー等を用いて除くことが好ましい。 【００１５】また、本発明において用いるオリゴデオキ
シヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオチドは有
機合成によっても製造することができる。この場合は、
そのオリゴデオキシヌクレオチドまたは、ポリデオキシ
ヌクレオチドの塩基配列は、ウイルスの遺伝子のメッセ
ンジャーＲＮＡの塩基配列に対してハイブリッド形成し
うる塩基配列でなくてはならない。例えば、ヘルペスシ
ンプレックスウイルスでは、イミディエートアーリー
（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）ＤＮＡの一つが、
プラスＤＮＡ（５′−ＡＴＧ・ＧＣＧ・ＴＣＧ・ＧＡＧ
…）とマイナスＤＮＡ（３′−ＴＡＣ・ＣＧＣ・ＡＧＣ
・ＣＴＣ…）の二重鎖を形成しているが、これらの内、
メッセンジャーＲＮＡと二重鎖を形成するＴＡＣ側（マ
イナス鎖ＤＮＡ）のＤＮＡの配列を選び合成する。 【００１６】 【００１７】 【００１８】次に、本発明において用いるオリゴデオキ
シヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドの調製
について説明する。 【００１９】 【具体例】 具体例１ ヘルペスシンプレックスウイルスをクロロホルム−フェ
ノールの有機溶媒で処理して得られたＤＮＡを制限酵
素、BamHIで切り、あらかじめ制限酵素、BamHIで切って
おいたベクターｐＢＲ ３２２にＴ４ファージリガーゼ
を用いて組み込んだ。得られたプラスミドを大腸菌に与
え、アンピシリンを含む寒天培地上でコロニーを形成さ
せた。これらのコロニーのうちからヘルペスシンプレッ
クスウイルスの32ＰでラベルしたＤＮＡにハイブリダイ
ズするものをフィルターハイブリダイゼイション法で選
び、５０μｇ／mlの濃度でアンピシリンを含む２リット
ルのＴＳＢ（Tryptose Soy Broth）培地で培養した。こ
の培地１mlに対し、上記プラスミドを含む大腸菌を１０
6〜１０7個加え、２０mlの試験管中で３７℃、１５時間
振とう培養した。培養液の５４０nmにおける吸光度が
０.５になるまで培養したところで、１０μｇ／mlのク
ロラムフェニコールを加え、更に１５時間培養を続け
た。 【００２０】こうして得られた大腸菌培養液を遠心処理
することにより得られたペレットに２５％ショ糖を含む
５０mMトリス塩酸（pH＝８.０）を加え、これを０℃以
下で５分間放置し、４mlのTriton-X １００を加えて生
成した粘稠な液を０℃、３００００Ｇで３０分間遠心分
離した。この上清８mlにＣｓＣｌ ８ｇおよびEthidium
Bromide（５μｇ／ml）１mlを加えて更に１０００００
Ｇ、４８時間遠心分離することにより生成した粗プラス
ミド分画を採取し、２倍量のイソプロピルアルコールを
加えて混和し、上清を除いた後、０.１Ｍトリス１０mM
ＥＤＴＡ（pH＝８.０）で一夜透析した。透析内液を濃
縮し、ＤＮＡ ２００μｇ相当量を取り、過剰量の制限
酵素（BamHI）を加えて反応させた後、アガロース電気
泳動法により、ヘルペスシンプレックスウイルスのＤＮ
Ａを分離した。このＤＮＡを次にＤＮＡａｓｅで部分分
解した後、１００℃で１０分間加熱後、急冷し、鎖長９
〜１００位のオリゴデオキシヌクレオチドないしポリデ
オキシヌクレオチドを得る。 【００２１】具体例２ クローン用のＭ１３ファージの複製形二重鎖ＤＮＡをBa
mHIで切断した。次に具体例１で分離したヘルペスシン
プレックスウイルスのＤＮＡと、この切断されたＭ１３
ファージの複製形二重鎖ＤＮＡをＴ４ファージリガーゼ
を用いて結合した。この結合されたＤＮＡを常法によ
り、ＣａＣｌ2の存在下、１ac（−）大腸菌内に入れ、
ファージプラックをＸ−ｇａｌ（インジケーター）の存
在下で作らせた。ヘルペスシンプレックスウイルスＤＮ
Ａを含有するＭ１３ファージは、２４時間後に、青色を
示さないファージプラックを形成した。これに32Ｐでラ
ベルしたヘルペスシンプレックスウイルスＤＮＡのプラ
ス鎖（鎖長２０デオキシヌクレオチド以上）とハイブリ
ダイズするプラークを採取した。これは、青色を示さな
いファージプラックにはヘルペスシンプレックスウイル
スの二重鎖ＤＮＡのそれぞれ片側のＤＮＡどちらかのみ
が含有されるためである。このＭ１３ファージをフェノ
ール−クロロホルムで処理しＤＮＡを分離した。 なお、上記で得られたＤＮＡは、ヘルペスシンプレック
スウイルス単鎖ＤＮＡを含むが、さらに精製を行い、こ
の中に含まれるＭ１３ファージのＤＮＡを除去してもよ
く、あるいはＤＮＡａｓｅ部分分解し、鎖長９〜１００
位のオリゴデオキシヌクレオチドないしポリデオキシヌ
クレオチドとするこにとができる。 【００２２】具体例３ ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystem社製）を用いてヘ
ルペスシンプレックスウイルスのイミディエートアーリ
ー（immediate early）ＤＮＡのマイナスＤＮＡの内、
プラスＤＮＡと二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレ
オチド（3′−…TAC・CGC・AGC・CTC・TTG・TTC・GTC・
GCG…−5′）の内の２０デオキシヌクレオチド（3′−C
GC・AGC・CTC・TTG・TTC・GTC・GC−5′）を合成し、精
製した。以下、この２０デオキシヌクレオチドを２０me
rと略記する。この２０merのシークエンスについては、
マキサム・キルバート法により確認した。 【００２３】具体例４ ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystem社製）を用いてヘ
ルペスシンプレックスウイルスのイミディエートアーリ
ー(immediate early）ＤＮＡのマイナスＤＮＡの内、プ
ラスＤＮＡと二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレオ
チドの内の２０デオキシヌクレオチド（3′−GCA・CCC
・GGG・ACC・TTT・ACC・GC−5′）を合成し、精製し
た。以下、この２０デオキシヌクレオチドを２０Ｂと略
記する。この２０Ｂのシークエンスについては、マキサ
ム・ギルバート法により確認した。 【００２４】本発明の方法を適用するに当っては、前記
のオリゴデオキシヌクレオチドないしポリデオキシヌク
レオチドを、適宜、通常、医薬品製剤に用いられている
適当な溶剤、賦形剤、補助剤などを使用して、製剤製造
の常法に従って液剤、注射剤、坐剤などの製剤として調
製される。処方にあたっては、所望のオリゴデオキシヌ
クレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドを単独で、
もしくは適宜組合せて用いることができ、また他の医薬
活性成分を配合してもよい。 【００２５】これらの組合せ、配合にあたっては、それ
ら組合せあるいは配合の対象となる成分は、上記のオリ
ゴデオキシヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオ
チドの抗ウイルス作用に対し、これを阻害するものであ
ってはならない。上記のオリゴデオキシヌクレオチドま
たはポリデオキシヌクレオチドは、それらに対して不活
性な適当な基剤と混和してクリーム、軟膏剤、パップ剤
などの外用剤とすることができる。 【００２６】液剤、注射剤として調製するときは、一般
に注射用蒸留水、生理食塩水、デキストロース水溶液、
注射用植物油、プロピレングリコール、ポリエチレング
リコール等を用いることができる。さらに必要に応じ
て、適宜等張化剤、溶解補助剤、安定剤、防腐剤、無痛
化剤等を加えてもよい。また、この種の剤型の場合、滅
菌された注射用媒体に溶解することが望ましい。製剤の
調製にあたって使用される上記のごとき各種の基剤、添
加剤、佐薬等が上記のオリゴデオキシヌクレオチドまた
はポリデオキシヌクレオチドの抗ウイルス作用を阻害す
るものであってはならないことは言うまでもない。 【００２７】本発明の方法は、上記目的に合った剤型の
製剤をウイルスに感染した生体の患部に直接適用する
か、または血管内に投与するなどして、前記のオリゴデ
オキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドが
結果的に患部に到達し得るように生体に適応させる。以
下に、マウスを用いた本発明の方法に関する効果確認実
験の例を掲げる。 【００２８】 【例】 例 １−(１) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脳室内に種々の濃度の２
０merのＭＥＭ溶液３０μｌにＨＳＶ−１（Ｆ株）（１
×１０4PFU）を含んだものを注入し、腹腔内に種々の濃
度の２０merのＭＥＭ溶液２００μｌ（１％のペニシリ
ン及びストレプトマイシンならびに２mMのグルタミンを
含有する。）をＨＳＶ−１（Ｆ株）注入翌日より、３日
間連日投与し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）注入後７日目の死亡
率を調べた。第１図に示すごとく２０mer投与群では、
濃度依存的にＨＳＶ−１による死亡率を減少させた。死
亡率は、２０mer無投与群の死亡率を１００％として表
した。 【００２９】例 １−(２) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脳室内に種々の濃度の２
０merのＭＥＭ溶液３０μｌにＨＳＶ−１（Ｆ株）（１
×１０4PFU）を含んだものをＨＳＶ−１(Ｆ株)のＭＥＭ
溶液３０μｌ（１×１０4PFU）を注入し、このマウスの
腹腔内に種々の濃度の２０merのＭＥＭ溶液２００μｌ
（１％のペニシリン及びストレプトマイシンならびに２
mMのグルタミンを含有する。）をＨＳＶ−1（Ｆ株）注
入翌日より、６日間連日投与し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）注
入後６４〜６８時間目の死亡率を調べた。その結果を第
１表に示す。 【００３０】 【表１】第１表に示すごとく２０mer非投与群では死亡率５／１
９を示すのに対し、２０mer投与群では、死亡が認めら
れなかった。 【００３１】例 １−(３) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脳室内に種々の濃度の２
０merのＭＥＭ溶液３０μｌにＨＳＶ−１（Ｆ株)（５×
１０4PFU）を含んだものを注入し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）
注入後６４〜６８時間目、７１〜７８時間目の死亡率を
調べた。その結果を第２表に示す。 【表２】 第２表に示すごとく２０mer非投与群では死亡率３／１
０（６４〜６８時間）、３／１０（７１〜７８時間）を
示すのに対し、２０mer投与群では、明らかに死亡率が
減少していることが認められた。 【００３２】例 １−(４) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脳室内に種々の濃度の２
０merのＭＥＭ溶液３０μｌにＨＳＶ−１（Ｆ株）(５×
１０4PFU）を含んだものを注入し、このマウスの脳室内
に種々の濃度の２０merのＭＥＭ溶液３０μｌ（１％の
ペニシリン及びストレプトマイシンならびに２mMのグル
タミンを含有する。）をＨＳＶ−１（Ｆ株）注入翌日よ
り、２日間連日投与し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）注入後６４
〜６８時間目、７１〜７８時間目、８８〜９２時間目の
死亡率を調べた。その結果を第３表に示す。 【表３】 第３表に示すごとく２０mer非投与群における死亡率に
対し、２０mer投与群では、８８〜９２時間まで、明ら
かに死亡率が減少していることが認められた。 【００３３】例 １−(５) ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に１.１２μｇ／m
lの２０merのＭＥＭ溶液２００μｌにＨＳＶ−１（Ｆ
株）（１×１０6PFU）を含んだものを注入し、このマウ
スの腹腔内に種々の濃度の２０merのＭＥＭ溶液２００
μｌ（１％のペニシリン及びストレプトマイシンならび
に２mMのグルタミンを含有する。）をＨＳＶ−１（Ｆ
株）注入３時間前および２時間前ならびに翌日より３日
間連日投与し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）注入後２１１時間
目、２５９時間目の死亡率を調べた。その結果を第４表
に示す。 【表４】 第４表に示すごとく２０mer非投与群では、死亡率１／
１０（２１１時間）、２／１０（２５９時間）を示すの
に対し、２０mer投与群では死亡が認められなかった。 【００３４】例 ２ 麻酔下で鋭い針で五回傷つけた、３週齢のＢＡＬＢ／Ｃ
マウスの角膜に、ＭＥＭ溶液３０μｌ（１％のペニシリ
ン及びストレプトマイシンならびに２mMのグルタミンな
らびに５％の幼牛血清を含有する。）にＨＳＶ−１（Ｆ
株)（１×１０6PFU／ml）を含んだものを滴下した。上
記のマウスを以下の４群に分けてその様子を観察した。 【００３５】Ａ. このマウスの角膜に２２.４μｇ／ml
の２０merを含んだＭＥＭ溶液１０μｌをＨＳＶ−１
（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日より隔日投与で３回
角膜に滴下し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）滴下１日前、５時間
前ならびに翌日より隔日投与で３回酢酸コルチゾン溶液
（２mg／kg）３０μｌを筋注した群。 Ｂ. このマウスの角膜に２２.４μｇ／mlの２０merを含
んだＭＥＭ溶液１０μｌをＨＳＶ−１（Ｆ株）滴下２時
間前ならびに翌日より隔日投与で３回角膜に滴下した
群。 【００３６】Ｃ. このマウスの角膜にＭＥＭ溶液１０μ
ｌをＨＳＶ−１（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日より
隔日投与で３回角膜に滴下し、ＨＳＶ−１（Ｆ株）滴下
１日前、５時間前ならびに翌日より隔日投与で３回酢酸
コルチゾン溶液（２mg／kg）３０μｌを筋注した群。 Ｄ. このマウスの角膜にＭＥＭ溶液１０μｌをＨＳＶ−
１（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日より隔日投与で３
回角膜に滴下した群。 【００３７】各群のマウスの目の状態及び目の周辺に見
られる発疹に注目してマウスの様子を４日目、７日目、
１２日目に観察したところ、２０ｍｅｒを投与した群で
あるＡ群、Ｂ群では非投与群であるＣ群、Ｄ群に較べて
明らかに発疹が少なく目の状態も良好であった。また、
この際、２０ｍｅｒ投与の効果に対しては、コルチゾン
投与の影響は認められなかった。上記の例１および例２
から、本発明の方法は、明らかに、罹患動物においてウ
イルスの増殖を抑制し、それによる死亡率の減少および
症状の軽減が認められるので、非常に有用性の高いもの
であることが判る。以下に、本発明の方法に用いられる
抗ウイルス剤の製剤例を掲げる。 【００３８】 【製剤例】 製剤例１ 具体例３において得られた２０merと同様のものを液層
法で合成し、その２０mer ２ｇを注射剤製造の常法に従
って、等張のＭＥＭ溶液を加えて１リットルとしてアン
プルに封入し注射剤とする。この注射剤は１ml中に２０
mer、２mgを含有する。この注射剤は症状に合せて１回
１〜５mlを感染患部になるべく近いところに注射する。 【００３９】製剤例２ 具体例４において得られた２０Ｂと同様のものを液層法
で合成し、その２０Ｂ１０ｇに等張のＭＥＭ溶液を加え
て１リットルとして１％点眼剤とする。 【００４０】この点眼剤は、症状に合せて１回２〜３
滴、１日数回点眼する。 製剤例３ 具体例３において得られた２０ｍｅｒと同様のものを液
層法で合成し、その２０ｍｅｒ １ｇを研磨して粉末と
し、これに精製カカオ脂９９９ｇを加えて６０℃の水浴
上で練合し、整形して１個２ｇの坐剤とする。この坐剤
は１個中に２０ｍｅｒを２ｍｇ含有し、症状に合せて使
用する。次に、本発明の方法で用いられる抗ウイルス剤
の安全性について、試験例を示し説明する。 【００４１】 【試験例】試験例１ ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、１００μｇ／ｋｇの２０ｍｅｒ
をｉ．ｐ．投与したところ死亡例を認めなかった。 試験例２ 前述の効果確認実験、例２においてＨＳＶ−１を使用せ
ず、他は同様にして行った実験では、２０ｍｅｒ非投与
群と２０ｍｅｒ投与群との間に差異は認められなかっ
た。ここで示したように、本発明の方法で用いられる抗
ウイルス剤は、前述のオリゴデオキシヌクレオチドまた
はポリオキシヌクレオチドの有効投与量において安全で
あることは明らかである。以下に、本発明に関連してな
された実験例を掲げる。 【００４２】 【実験例】 実験例１ メッセンジャーＲＮＡとしてポリウリジル酸を用いたポ
リフェニルアラニン合成反応のポリアデニル酸及びデオ
キシポリアデニル酸による阻害作用 ポリウリジル酸(１４０μｇ)、14Ｃ−フェニルアラニン
（１０5cpm, ３００μCi／μmole）、Nierenberg and M
athaeiの方法（Proc. Nat. Acad. Sci. 47，1588 (196
1)）により作成した大腸菌抽出液、１３mM酢酸マグネシ
ウム塩、１mM ＡＴＰ、１mM燐酸クレアチン、クレアチ
ンホスホキナーゼ(１μｇ)を１０mMトリス塩酸(pH７.
５)に溶解して反応液系を作った。この反応液系に第５
表に列記した阻害剤を加え４０μｌとし、１.５mlのエ
ッペンドルフ管中で３７℃、３０分間反応させ、反応に
より得られた溶液中のポリフェニルアラニンの量を１０
％トリクロール酢酸に９５℃で不溶の放射蛋白の量と
し、液体シンチレーションカウンターを用いて測定し
た。阻害度は、阻害剤を加えない時のポリフェニルアラ
ニンの放射能と加えた時の放射能を比較して算出した。
その結果を第５表に示す。 【００４３】 【表５】第５表に示すごとく、ポリウリジル酸（ＲＮＡ）に対し
て、その塩基配列に対応するポリデオキシアデニル酸
（ＤＮＡ）は、著しいポリフェニルアラニンの合成阻害
活性を示した。この実験においては、ＤＮＡ鎖は９ヌク
レオチド以上のオリゴデオキシアデニル酸（オリゴデオ
キシヌクレオチド）まで強い阻害活性を示した。 【００４４】実験例２ ウサギの網状赤血球系におけるグロビン合成のグロビン
単鎖ＤＮＡによる特異的阻害作用 この実験例は、真核細胞のメッセンジャーＲＮＡに対し
てハイブリッド形成するオリゴデオキシヌクレオチドま
たはポリデオキシヌクレオチドを用いて生理的な条件下
で、蛋白の合成を阻害することを確かめた実験例であ
る。４.２mMリン酸カルシウム、２mMジメチルチオスレ
イトール（ＤＴＴ）、０.０８mMアミノ酸（メチオニン
を除く）、６mM酢酸カリウム、８mM酢酸マグネシウム、
スペルミジン４.５μｇ、35Ｓ−メチオニン（０.１μC
i）、およびJacksonとPelhamらの方法（Eur. Biochem.
67. 247-256 (1976)）により作成した無細胞網状赤血球
蛋白合成系１０μｌ、α及びβグロビンメッセンジャー
ＲＮＡ各７５μｇを２１mM ＨＥＰＥＳに溶解して第６
表に列記した阻害剤を加え、総量３０μｌとした後、
１.５mlのエッペンドルフ管中で３０℃、３０分間反応
させた。上記の反応により得られた溶液中の反応生成物
は、Triton-Acied-Ureaゲルでαグロビン、βグロビ
ン、その他の蛋白に分け、ラジオオートグラフィーで各
分画の放射能を測定した。阻害度は、阻害剤を加えない
時の放射能と比較して算出した。その結果を第６表に示
す。 【００４５】 【表６】 【００４６】第６表に示すごとく、αグロビンのゲノム
ＤＮＡは、αグロビンの合成のみを、βグロビンのゲノ
ムＤＮＡは、βグロビンの合成のみを特異的に阻害す
る。ウシ胸腺ＤＮＡは殆ど阻害活性を示さなかった。こ
のことから真核細胞のメッセンジャーＲＮＡの塩基配列
に相当するＤＮＡの存在によってそのメッセンジャーＲ
ＮＡに基づく蛋白合成が特異的に阻害されることがわか
る。さらに、αグロビンのＮ末端アミノ酸に相当する１
５オリゴデオキシヌクレオチドがαグロビンの合成のみ
を阻害すること及びＭ１３ファージの１５オリゴデオキ
シヌクレオチドがαグロビン並びにβグロビンの合成に
ほとんど影響を与えていないことから、メッセンジャー
ＲＮＡの塩基配列に相当するＤＮＡ鎖が１５ヌクレオチ
ドまで短かくなった場合でも、その阻害活性と特異性は
失なわれないことがわかった。 【００４７】実験例３ ２０merのハムスター胎児腎細胞（BHKcell）内への透過
性 この実験例は、単鎖オリゴヌクレオチドの細胞内への透
過性を確かめた実験である。ハムスター胎児腎細胞（BH
Kcell, ４.４×１０5 cells）にＨＳＶ−１（７.６×１
０4 PFU／ml）の存在下もしくは非存在下で３時間培養
した。これらの細胞に対して１７.６６pmoleの32Ｐラベ
ルした２０merを種々の時間接触させた。溶媒を除き、
細胞を０.３mlのＰＢＳで２回洗浄し、さらに、３６℃
で３０分間、０.１Ｍ ＮａＣｌ、３３μＭ ＺｎＣｌ2、
３３６０unitヌクレアーゼＳ１を含む３３.３mM酢酸ナ
トリウム緩衝液（pH４.５）の溶液中で放置した後、ヌ
クレアーゼＳ１を除いた上記酢酸ナトリウム緩衝液で２
回洗浄し、０.３mlの１０mMＥＤＴＡ、０.６％ドデシル
硫酸ナトリウムおよび、１０mMトリス緩衝液（pH７.
５）で、細胞を溶壊した。ここで、この溶液中のＴＣＡ
不溶性物質および、ヌクレアーゼＳ１感受性の２０mer
の量を測定したところ、８時間で１細胞あたり４.６８
×１０3個の２０merが取り込まれていることが判った。 【００４８】実験例４ オリゴデオキシヌクレオチドの配合による影響 (ａ) マイクロプレート（リンブロ社製、穴内径１.５c
m）に一穴あたり１.５×１０5個のハムスター胎児腎細
胞（ＢＨＫ cell）を入れ、５％ＣＯ2インキュベーター
中で、３６℃で４７〜４８時間培養し、この細胞に１型
ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ−１）（７.
６×１０4 PFU／ml）１６０μｌを加え、３６℃で３時
間感染させた。この感染細胞に、種々の量の２０merあ
るいは２０merと２０Ｂの混合物（２２４：１）を溶媒
に溶解して０.３ml（ＣａＣｌ2濃度４.５５mM）で８時
間培養した。 【００４９】(ｂ) 別に、上記(ａ)の操作において、２
０merあるいは２０merと２０Ｂの混合物を使用せずに他
は、すべて同様にして、培養操作を行った（ウイルスコ
ントロール）。上記(ａ)の培養細胞を固定し、染色し、
シンシチウムの数を計測した。この結果をウイルスコン
トロール(ｂ)のシンシチウム数を１００％として、第２
図に示す。第２図に示すごとく、２０merと２０Ｂの混
合物を使用した場合、２０mer単独の時よりも強いウイ
ルス増殖阻害作用を示すことが認められた。このことか
ら、阻害作用は、ヘルペスシンプレックスウイルスのマ
イナス鎖ＤＮＡを構成する塩基配列のうちの異なる塩基
配列部分を併せて用いた場合その作用を増強することが
あるという事実が確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法の効果確認のための１実験例〔前述
例１−（１）〕の結果を示すグラフである。グラフ縦軸
に２０ｍｅｒ非投与群の死亡率に対する２０ｍｅｒ投与
群の死亡率の％をとり、横軸に２０ｍｅｒの投与量（μ
ｇ／ｍｏｕｓｅ）をとり、示したものである。 【図２】本明細書の実験例４において、２０merの単独
使用の場合と２０Ｂとの混合物を使用した場合とのウイ
ルス増殖阻害作用を比較するためのグラフであり、縦軸
にウイルスコントロール群のシンシチウム数に対する２
０mer又は２０merと２０Ｂとの混合物使用群のシンシチ
ウム数の％をとり、横軸に２０merの使用量又は２０mer
と２０Ｂとの混合物の使用量をとり、示したものであ
る。
例１−（１）〕の結果を示すグラフである。グラフ縦軸
に２０ｍｅｒ非投与群の死亡率に対する２０ｍｅｒ投与
群の死亡率の％をとり、横軸に２０ｍｅｒの投与量（μ
ｇ／ｍｏｕｓｅ）をとり、示したものである。 【図２】本明細書の実験例４において、２０merの単独
使用の場合と２０Ｂとの混合物を使用した場合とのウイ
ルス増殖阻害作用を比較するためのグラフであり、縦軸
にウイルスコントロール群のシンシチウム数に対する２
０mer又は２０merと２０Ｂとの混合物使用群のシンシチ
ウム数の％をとり、横軸に２０merの使用量又は２０mer
と２０Ｂとの混合物の使用量をとり、示したものであ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 31/70
A61K 48/00
A01N 63/00
C12N 15/09
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヘルペスウイルスの増殖に際して発生するメッセン
ジャーＲＮＡに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡ配
列の部分構造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドまた
はポリデオキシヌクレオチドを、人体外においてそのメ
ッセンジャーＲＮＡに供給することを特徴とするヘルペ
スウイルスの増殖阻害方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07540396A JP3328682B2 (ja) | 1996-03-06 | 1996-03-06 | ヘルペスウィルスの増殖阻害方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07540396A JP3328682B2 (ja) | 1996-03-06 | 1996-03-06 | ヘルペスウィルスの増殖阻害方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59049321A Division JPS60193922A (ja) | 1983-10-17 | 1984-03-16 | 抗ウイルス剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0977670A JPH0977670A (ja) | 1997-03-25 |
| JP3328682B2 true JP3328682B2 (ja) | 2002-09-30 |
Family
ID=13575186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07540396A Expired - Lifetime JP3328682B2 (ja) | 1996-03-06 | 1996-03-06 | ヘルペスウィルスの増殖阻害方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3328682B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0456804A (ja) * | 1990-06-25 | 1992-02-24 | Mitsubishi Cable Ind Ltd | 金属保護管付き光ファイバの貫通用口金 |
-
1996
- 1996-03-06 JP JP07540396A patent/JP3328682B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0456804A (ja) * | 1990-06-25 | 1992-02-24 | Mitsubishi Cable Ind Ltd | 金属保護管付き光ファイバの貫通用口金 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0977670A (ja) | 1997-03-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |