JPS60193922A - 抗ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗ウィルス剤に関する。さらに、詳しく言え
ば本発明は、ウィルスの増殖に際して発生するメツセン
ジャーＲＮＡに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡ配
列の部分構造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドまた
はポリデオキシヌクレオチドを含有することを特徴とす
る抗ウィルス剤に関するものである。本発明者は、先に
、ウィルスの増殖に際して発生するメツセンジャーＲＮ
Ａに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構
造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオ
キシヌクレオチドをそのメツセンジャーＲＮＡの存在箇
所に供給するとウィルスの増殖が阻害されるとの知見を
得て、その知見に基づき、ウィルス増殖阻害方法を提供
したが（特願昭５８−１９２３５０号）、さらに、ウィ
ルスに感染された動物に対し、上記のオリゴヌクレオチ
ドまたは、ポリデオキシヌクレオチｒを適用する実験を
重ねた結果、本発明に係る抗ウィルス剤を提供するに至
った。すなわち、本発明は、先に、本発明者が提供した
前記のウィルス増殖阻害方法を実施する手段として、ウ
ィルスの増殖に際して発生するメツセンジャーＲＮＡに
対してハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部分構造に
等しいオリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシ
ヌクレオチドを含有することを特徴とする抗ウィルス剤
を提供するものである。

本発明を以下に、詳細に説明する。

本発明者は、先に、人工的に合成したＲＮＡを用いてこ
のＲＮＡに対してハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の
部分構造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドを直接、
無細胞蛋白合成系に加えることにより、このＲＮＡに基
づいて合成されるはずの蛋白が合成されなくなるという
事実を発見した（後記実験例１参照）。

１だ、この際、とのＲＮＡに対してハイブリッド形成し
えないＤＮＡ配列のオリゴデオキシヌクレオチドを用い
て、同様の実験を行うと、とのＲＮＡに基づく蛋白の合
成が行われることが確認された。

次いで、本発明者は、真核細胞内に存在するαグロビン
メソセンジャーＲＮＡおよびβグロビンメツセンジャー
ＲＮＡを用いて、生理条件下で、各種ＤＮＡを用いて、
それらがαグロビンおよびβグロビンの生成を阻害する
か否かを確かめる実験を行った（後記実験例２参照）。

その結果、αグロビンメツセンジャーＲＮＡに対してハ
イブリッド形成しうるＤＮＡを直接、無細胞蛋白合成系
に加えることにより、αグロビンの生成が阻害されるこ
と、およびβグロビンメツセンジャーＲＮＡに対してハ
イブリッド形成しうるＤＮＡを直接、無細胞蛋白合成系
に加えることにより、βグロビンの生成が阻害されるこ
とが見出された。また、αグロビンメツセンジャーＲＮ
Ａに対してハイブリッド形成しえないＤＮＡを用いたと
きには、αグロビンの生成が阻害されず、βグロビンメ
ツセンジャーＲＮＡに対してハイブリッド形成しえない
ＤＮＡを用いたときには、βグロビンの生成が阻害され
庁いという事実も確認された。

さらにまた、この実験系においては、使用するＤＮＡが
オリゴデオキシヌクレオチドである場合に、高い蛋白生
成阻害率を示していることが見出された。

これらの実験結果に基づき、ヘルはスシンプレツクスウ
イルスの感染初期に形成されるメツセンジャーＲＮＡと
二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレオチドをヘルペ
スシンプレックスウィルス感染細胞に投与したところ、
ヘル啄スンンプレツクスウイルスによる細胞のンンンチ
クム（細胞融合により、ブラック状の穴が培養間トリ皿
上の細胞群に形成すること）の形成が著しく阻害される
ことを確認した。

上記実験では、細胞内へのオリゴデオキシヌクレオチド
の取込みを高める為に塩化カルシウムが用いられている
が、塩化カルシウム使用しない場合でも細胞内へオリゴ
デオキシヌクレオチドが取シ込まれ、細胞培養系でヘル
ペスシンプレックスウィルスの増殖が阻害されることが
確認された。（後記実験例３参照） これらの実験により、ヘルペスシンプレックスウィルス
のメツセンジャーＲＮＡに対してハイブリッド形成しう
るＤＮＡをヘルペスシンプレックスウィルス感染細胞に
直接加えることにより、有効にヘルペスシンプレックス
ウィルスの増殖が阻害されることが明らかにされだが、
本発明者は、さらに、この事実に基づき、ヘルペスシン
プレックスウィルスのメツセンジャーＲＮＡに対してハ
イブリッド形成しうるＤＮＡを、ウィルス感染マウスに
適用し、ウィルス性疾患の治療試験をおこなったところ
、それが抗ウィルス剤として使用し得ることが確認され
た。

本発明は、かかる知見に基いてなされたものである。

本発明の抗ウィルス剤は、ウィルスに由来するメツセン
ジャーＲＮＡの塩基配列に対応するＤＮＡ配列の部分構
造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオ
キシヌクレオチドを用いるため、それは、他の遺伝子に
由来するメツセンジャーＲＮＡとは、ハイブリッド形成
せず、したがって、本発明の抗ウィルス剤の使用は、他
の遺伝子による蛋白合成には影響を与えない。

ウィルスｉｄ、ＤＮＡウィルス（ヘルペスウィルス、ア
デノウィルス、ワクシニアウィルス等）、！：　ＲＮＡ
ウィルス（インフルエンザウィルス、ラインウィルス、
ポリオウィルス等）に分類される。ＲＮＡウィルスには
、二重鎖のウィルスと単鎖のウィルスがあり、単鎖のウ
ィルスには、さらにシラス鎖つィルス表マイオス鎖ウィ
ルスが存在する。いづれにしても、ウィルスの蛋白合成
は、メツセンジャーＲＮＡとしてのプラス鎖ＲＮＡの存
在なしには行われない。すなわち、二重鎖ＤＮＡウィル
スでは、マイブス鎖ＤＮＡをもととして、プラス鎖ＲＮ
Ａが作られて、メツセンジャーＲＮＡとなシ、二重鎖Ｒ
ＮＡウィルスでは、またはマイナス鎖ＲＮＡをもととし
て、プラス鎖ＲＮＡが作られて、それがメツセンジャー
ＲＮＡとなる。単鎖ＲＮＡウィルスのうち、マイナス鎖
ＲＮＡウィルスでは、そのマイナス鎖ＲＮＡをもと表し
て、シラス鎖ＲＮＡが作られて、メツセンジャーＲＮＡ
となり、プラス鎖ＲＮＡウィルスでは、それ自身がメツ
センジャーＲＮＡとして働く。本発明においては、いづ
れのウィルスであっても、それぞれのウィルスのメツセ
ンジャーＲＮＡとしてのプラス鎖ＲＮＡとハイブリッド
を形成しうるＤＮＡの部分構造に等しいオリゴデオキシ
ヌクレオチＰまたはポリデオキシヌクレオチドを用いる
ことによって、対象とするウィルスに対する抗ウィルス
剤が提供される。

本明細書においては、以下に、二重鎖ＤＮＡウィルスで
あるヘル滅スシンプレツクスウイルスを例示して説明す
るが、本発明の抗ウィルス剤は、ウィルスの種を問うこ
となく、例えば、インフルエンザウィルス、アデノウィ
ルス、白血病ウィルス、デング熱ウィルス、思人病ウィ
ルス、肝炎ウィルス、はしかウィルス、脳炎ウィルス、
／Ｑラインフルエンザウイルス、ニューキャッスルウィ
ルス、ポリオウィルス、ライノウィルス、黄熱病ウィル
ス、ＥＢウィルス等全ての病原ウィルスを適用対象とす
ることができる。

したがって、本発明は、広く動物、植物のウィルスに由
来する各種の疾病の治療、予防に利用することができる
ので、各種の分野において極めて有用なものである。

本発明の抗ウィルス剤の使用により、ＤＮＡウィルス、
ＲＮＡウィルスを問うことなく、そのウィルスが存在し
ている生体の非感染細胞に影響を与えることなく、ウィ
ルスの増殖を停止させ、非感染細胞への感染を予防する
ことができる。

本発明の抗ウィルス剤において用いられるオリゴデオキ
シヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドの正常
細胞への影響については、本発明者がヘル啄スシンゾレ
ツクスウイルスのイミディエートアーリー遺伝子のメツ
センジャー　ＲＮＡとハイブリッド形成しうる単鎖ＤＮ
Ａの塩基配列を有するデオキシヌクレオチドを用いて、
・・ムスター胎児腎細胞に対する影響を調べたところ、
該デオキシヌクレオチドは、正常細胞の生存に影響を与
えず、かつ、その増殖能力にも影響を与えないことが判
明している。

サラニ、ヘルペスシンゾレツクスウイルス感染マウスに
対する治療実験の際、イミディエートアーリー遺伝子の
メツセンジャーＲＮＡ　、！：ハイブリッド形成しうる
単鎖ＤＮＡの塩基配列を有するデオキシヌクレオチＶ投
与群の挙動、外観に変化は見られなかった。

本発明の抗ウィルス剤に用いるオリゴデオキシヌクレオ
チドまたはポリデオキシヌクレオチドは、ウィルスのＤ
ＮＡ単鎖を酵素処理等により分解して得られるものか、
あるいは、所要のＤＮＡ配列の部分構造を合成して得ら
れるものなど、所望のＤＮＡ配列の部分構造を有するも
のであれば、その由来はいづれでもよい。

本発明の抗ウィルス剤に用いるオリゴデオキシヌクレオ
チドまたはポリデオキシヌクレオチドを調製する方法と
しては、例えば以下のような方法を例示することができ
る。すなわち、一つの方法は、ウィルスの遺伝子をクロ
ーン化し、そのＤＮＡ０都鎖をフラグメント化すること
である。

ウィルス遺伝子をクローン化するにあたり、ＲＮＡウィ
ルスの場合には、逆転写酵素を用いてＤＮＡに変えるか
、もしくはそのウィルス感染細胞内に存在するウィルス
ＤＮＡをもととする。

ウィルスの遺伝子をクロー／化する場合には、例えばλ
ファージ、あるいはｐＢＲ３２２等のプラスミドベクタ
ーを用いて二重鎖ＤＮＡを得るか、まだはＭ１３ファー
ジ等を用いて単鎖ＤＮＡを直接得る方法を使用する。ク
ローン化する遺伝子は、ウィルスに含まれる遺伝子の核
酸鎖のどの部分でもよいが、増殖に際し、早期に発現す
るアーリー（ｅａｒｌｙ　）遺伝子あるいはイミディエ
ートアーリー（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　）遺
伝子をクローン化することが好捷しい。

クローン化したＤＮＡを大量に複製するためには、例え
ば、ウィルスの遺伝子を組み込ませたファージ、あるい
はシラスミドを保有する大腸菌を必要に応じて抗生物質
を加えた適当な容積の培養液中で常法によシ培養し、集
菌した後クローン化したウィルスの遺伝子を含むＤＮＡ
を分離する。この分離に際しては、フェノール、フェノ
ール−クロロホルム等の有機溶媒処理によりＤＮＡを抽
出することができる。

分離したＤＮＡからウィルスのＤＮＡを取り出すには、
制限酵素で分解し、アガロースゲル電気泳動法、カラム
クロマトグラフィー等を用いる。

得られたウィルスのＤＮＡは、必要に応じてフラグメン
ト化する。このためには、例えばエンドヌクレアーゼ等
の制限酵素による処理あるいは超音波処理を行う。フラ
グメントの鎖長け、通常、１００ヌクレオチドから、９
ヌクレオチド位までの範囲に々るように考慮される。Ｍ
　１３フアージを用いて調製する場合は、直接単鎖のフ
ラグメントが得られるが、本発明の抗ウィルス剤の性質
から考えてあらかじめウィルスの遺伝子のメツセンジャ
ーＲＮＡと二重鎖を形成し得る単鎖ＤＮＡを選び、クロ
ーン化しておかなければならない。

ｐＢＲ３２２、λファージを用いて得られたウィルスの
ＤＮＡのフラグメントは、単鎖とするため、例えば、１
００’Ｃで１０分間加熱後、急冷する。生成物には、所
望のＤＮＡフラグメントの単鎖が存在しているのでこれ
をそのまま本発明の抗ウィルス剤に使用することができ
るが、また、この生成物中にはウィルスの遺伝子のメツ
センジャー　ＲＮＡに相補的でない単鎖フラグメントも
存在しているので、これをアフィニティークロマトグラ
フィー等を用いて除くことが好ましい。

捷だ、本発明の抗ウィルス剤に用いるオリゴデオキシヌ
クレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオチドは有機合
成によっても製造することができる。この場合は、その
オリゴデオキシヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌク
レオチドの塩基配列は、ウィルスの遺伝子のメツセンジ
ャーＲＮＡの塩基配列に対してハイブリッド形成しつる
塩基配列でなくてはならない。例えば、ヘル波スシンプ
レツクスウイルスでは、イミディエートアーリー（ｉｍ
ｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　）　ＤＮＡの一つが、プ
ラスＤＮＡ　（５’　−ＡＴＧ　−ＧＣ（）　−ＴＣ（
）・ＧＡＧ・・・）とマイナスＤＮＡ　（３’　−ＴＡ
Ｃ−ＣＧ、Ｃ・Ａ（）Ｃ−ＣＴＣ・　）の二重鎖を形成
しているが、こレラの内、メンセンジャーＲＮＡと二重
鎖を形成するＴＡＣ側（マイナス鎖ＤＮＡ　）のＤＮＡ
の配列を選び合成する。

また、例えば、インフルエンザウィルスの場合は、イン
フルエンザウィルスの遺伝子として、へ’？グルテン遺
伝子とＮＳ　（Ｎａｎ　５ｔｒｕｃｔｕａｌ　）遺伝子
があるが、ウィルスの増殖を阻害するためには、ＤＮＡ
の塩基配列にバリエーションがあるヘマグルテン遺伝子
よシも、ＮＳ遺伝子の発現を停止させるのが好ましく、
このＮＳ遺伝子のメツセンジャーＲＮＡに対して、ハイ
ブリッド形成しつる単鎖ＤＮＡの塩基配列を選ぶのがよ
い。例えば、ＮＳＩ遺伝子（Ｌａｍｂら、Ｃｅ１ｌ　２
１４７５　（１９８０））を例にとっていえば、このＮ
ＳＩ遺伝子のメツセンジャーＲＮＡに対して、ハイブリ
ット形成しうる単鎖ＤＮＡの塩基配列、例えば、５′−
・・ＡＣＴ・ＴＧＡ　−ＣＡＣ−ＡＧＴ　−ＧＴＴ　−
ＧＧＡ　−ＡＴＣ−ＣＡＴ　・・・−３′の塩基配列中
の適当な長さの塩基配列を選び合成する。

さらに、畜産関係のウィルス、例えばラウスのトリ肉腫
ウィルスの場合についていえば、ｇａｇ、　ｐｏｌ、　
ｅｎｖ、のいづれかの遺伝子の発現を阻害する。ここで
、ｇａｇ遺伝子の発現を阻害する場合、例えばｇａｇ遺
伝子の一部でらるＰ　１９の塩基配列から考えて、５′
−・・ＡＡＴ　−ＣＡＣ−ＣＴＴ・ＴＡＴ　−ＧＡＣ−
ＧＧＣ−ＴＴＣ・・・−３′の塩基配列中の適当な長さ
の塩基配列を選び合成する。

このようにして、他のいずれのウィルスの場合でも、増
殖を阻害しようとするウィルスのメツセンジャーＲＮＡ
に対して、ハイブリット形成しうる単鎖ＤＮＡの塩基配
列中の適当な長さの塩基配列を選び、その塩基配列のオ
リゴデオキシヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレ
オチドを合成し、そのオリゴ（またはポリ）デオキシヌ
クレオチドを用いることができる。

次に、本発明の抗ウィルス剤に用いるオリゴデオキシヌ
クレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドの調製につ
いて説明する。

具体例１ １　ヘルペスシンプレックスウィルスをクロロホルム−
フェノールの有機溶媒で処理して得られたＤＮＡを制限
酵素、ＢａｍＨＩで切り、あらかじめ制限酵素、Ｅａｍ
ＨＩで切っておいたベクターｐＢＲ３２２にＴ４ファー
ジリガーゼを用いて組み込んだ。得られたプラスミドを
大腸菌に与え、アンピシリンを含む寒天培地上でコロニ
ーを形成させた。これらのコロニーのうチカラヘルペス
ンンプレツクスウイルスの３２ＰでラベルしたＤＮＡに
ハイブリダイズするものをフィルターハイブリダイゼイ
ション法で選び、５０Ｉｇｉｍｌの濃度でアンピシリン
を含む２１ＩのＴＳＢ　（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ　Ｓｏｙ　
Ｅｒｏｔｈ　）培地で培養する。この培地１　ｍｌに対
し、上記プラスミドを含む大腸菌を１０’〜１０７個加
え、２０　ｍｌの試験管中で３７℃、１５時時間上う培
養した。培養液の５４０　ｎｍにおける吸光度が０．５
になるまで培養したところで、１００μｇ／ｍｌのクロ
ラムフェニコールを加え、更に１５時間培養を続けた。

こうして得られた大腸菌培養液を遠心処理することによ
シ得られた啄レットに２５チシヨ糖を含む５０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ＝８．０　）を加え、これを０℃以下で５
分間放置し、４　ｍｌのＴｒｉ−ｔｏｎ　−Ｘ　１００
を加えて生成した粘稠な液を０℃、３００００　Ｓ’で
３０分間遠心分離した。この上清８ｒｎｌ　ＫＣｓＣＩ
Ｉ８　ｆ及びＥｔｈｉｄｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ　（５
μｇ／ｍｌ　）　１　ｍｌを加えて更に１０００００　
ｆ、４８時間遠心分離することによシ生成した粗シラス
ミド分画を採取し、２倍量のイソプロピルアルコールを
加えて混和し、上清を除いた後、０．１Ｍトリス１０　
ｍＭ　ＫＤＴＡ　（ｐＨ＝８．０　）で−夜透析した。

透析内液を濃縮し、ＤＮＡ　２００μｇ相当量を取り、
過剰量の制限酵素（ＢａｍＨＩ　）を加えて反応させた
後、アガロース電気泳動法にょシ、ヘルペスシンプレッ
クスウィルスのＤＮｈｆ分離した。このＤＮＡを次にＤ
ＮＡａ　ｓ　ｅで部分分解した後、１００℃で１０分間
加熱後、急冷し、鎖長９〜ｌＯＯ位のオリゴ８デオキシ
ヌクレオチドないしポリデオキシヌクレオチドを得る。

具体例２ クローン用のＭ］３ファージの複製形二重鎖ＤＮＡ　ｆ
　ＢａｍＨＩで切断した。次に具体例１で分離シタヘル
ベスシンゾレソクスウィルスのＤＮＡと、この切断され
たＭ　１．３フアージの複製形二重鎖ＤＮＡをＴ４ファ
ージリガーゼを用いて結合した。この結合されたＤＮＡ
を常法により、ＣａＣｄ２の存在下、ｌａｃ　（−）大
腸菌内に入れ、ファージブラックをＸ　−ｇａｌ　（イ
ンジケーター）の存在下で作らせた。ヘルペスシンプレ
ックスウィルスＤＮＡを含有するＭ］３ファージは、２
４時間後に、青色を示さないファージブラックを形成し
た。これに３２Ｐでラベルしたヘルペスシンプレックス
ウィルスＤＮＡのプラス鎖（鎖長頷デオキシヌクレオチ
ド以上）とハイブリダイズするプラークを採取した。こ
れは、青色を示さないファージブラックにはヘルペスシ
ンプレックスウィルスの二重鎖ＤＮＡのそれぞれ片側の
ＤＮＡどちらかのみが含有されるためである。

このＭ］３ファーシヲフェノールークロロホルムで処理
しＤＮＡを分離した。

なお、上記で得られたＤＮＡは、ヘルペスシンプレック
スウィルス単鎖ＤＮＡを含むが、さらに精製を行い、こ
の中に含まれるＭ　１．３フアージのＤＮＡを除去して
もよく、あるいはＤＮＡａ　ｓ　ｅ部分分解し、鎖長９
〜１００位のオリゴデオキシヌクレオチドないしポリデ
オキシヌクレオチドとすることができる。

具体例３ ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
社製）ヲ用いテヘ、ルベスシンゾレツクスウイルスのイ
ミディエートアーリー（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌ
ｙ）ＤＮＡのマイナスＤＮＡの内、プラスＤＮＡと二重
鎖全形成するオリゴデオキシヌクレオチド（３′−・・
ＴＡＣ−ＣＧＣ−ＡＧＣ−ＣＴＣ、ＴＴＧ・ＴＴＣ−（
）ＴＣ−（）ＣＧ・・・−５′）の内の２０デオキシヌ
クレオチド（３’　−ＣＧＣ、ＡＧＣ−ＣＴＣ−ＴＴＧ
・ＴＴＣ−（）ＴＣ−ＧＣ−５’　）　を合成し、精製
した。

以下、この２０デオキシヌクレオチド’ｉ２０ｍｅｒと
略記する。この２０ｍｅｒのシーフェンスについては、
マキサム・ギルバート法により確認した。

具体例４ ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
社製）ヲ用いてヘルペスシンプレックスウィルス（７）
イミディエートアーリー（ｉｍｍｅｃｌｉａｔｅ　ｅａ
ｒｌｙ）ＤＮＡのマイナスＤＮＡの内、プラスＤＮＡと
二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレオチドの内の２
０デオキシヌクレオチド（３’−ｅｃＡ・ＣＣＣ−ＧＧ
Ｇ　−ＡＣＣ−ＴＴＴ　−ＡＣＣ’−ＧＣ−５’　）を
合成し、精製した。以下、この２０デオキシヌクレオチ
ドを２０Ｂと略記する。この２０Ｂのシーフェンスにつ
いては、マキサム・ギルバート法により確認した。

本発明の抗ウィルス剤は、前記のオリゴデオキシヌクレ
オチドないしポリデオキシヌクレオチドを、適宜、通常
、医薬品製剤に用いられている適渦な溶剤、賦形剤、補
助剤などを使用して、製剤製造の常法に従って液剤、注
射剤、層剤などの製剤として調製される。

処方にあたっては、所望のオリゴデオキシヌクレオチド
またはポリデオキシヌクレオチドを単独で、もしくは適
宜組合せて用いることができ、また他の医薬活性成分を
配合してもよい。

これらの組合せ、配合にあたっては、それら組合せある
いは配合の対象となる成分は、上記のオリゴデオキシヌ
クレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオチドの抗ウィ
ルス作用に対し、これを阻害するものであってはならな
い。

上記のオリコ″′デオキシヌクレオチドまたはポリデオ
キシヌクレオチドは、それらに対して不活性な適尚な基
剤と混和してクリーム、軟膏剤、−ξツブ剤などの外用
剤とすることができる。

液剤、注射剤として調製するときは、一般に注射用蒸留
水、生理食塩水、デキストロース水溶液、注射用植物油
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を
用いることができる。さらに必要に応じて、適宜等張化
剤、溶解補助剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて
もよい。また、この種の剤型の場合、滅菌された注射用
媒体に溶解することが望ましい。製剤の調製にあたって
使用される上記のごとき各種の基剤、添加剤、佐薬等が
上記のオリボデオキ／ヌクレオチド捷たはポリデオキシ
ヌクレオチドの抗ウィルス作用を阻害するものであって
はならないことは言う才でもない。

本発明の抗ウィルス剤は、それをウィルスに感染した生
体の患部に直接適用するか、または血管内に投与するな
どして、前記のオリゴデオキシヌクレオチドまたはポリ
デオキシヌクレオチドが結果的に患部に到達し得るよう
に生体に適応させる。

以下Ｋ、マウスを用いた本発明の抗ウィルス剤に関する
効果確認実験の例を掲げる。

例　Ｊ　−（１） ３週齢のＢＡＬＥ　／　Ｃマウスの脳室内に種々の濃度
の２０ｍａｒのＭＥＭ溶液３０μＡにＨ８Ｖ　−１（Ｆ
株）　（ｌＸｌ０’　ＰＦＵ　）を含んだものを注入し
、腹腔内に種々の濃度の２０ｍａｒのＭＥＭ溶液２００
μ７（］　ｑｂのベニソリン及びストレプトマイシンな
らびに２ｍＭのグルタミンを含有する。１’１Ｈ８Ｖ−
１（Ｆ株）注入翌日より、３日間連日投与し、Ｈ３Ｖ　
−１（Ｆ株）注入後７日月の死亡率を調べた。

第１図に示すとと（２０ｍｅｒ投与群では、濃度依存的
にＨ８Ｖ　−１による死亡率を減少させた。死亡率は、
２０ｍｅｒ無投与群の死亡率１１００％として表した。

例　１−（２＋ ３週齢のＢＡＬＢ　／　Ｃマウスの脳室内に種々の濃度
の２０ｍｅｒのＭＥＭ溶液３０＃Ｋ　Ｈ’５Ｖ−１（Ｆ
株）　（Ｉ　ＸＩＯ’　ＰＦＴＴ　）　ｉ含んだも（７
）’ｊｚＨｓＶ−１（Ｆ株）のＭＢＭ溶液３０μＡ’　
（Ｉ　ＸＩＯ’　ＰＦＵ　）を注入し、このマウスの腹
腔内に種々の濃度の２０ｍｅｒのＭＥＭ溶液２００μ７
（１係の啄二ンリン及びストレプトマイシンならびに２
ｍＭのグルタミンを含有する。）をＨ８Ｖ−１（Ｆ株）
注入翌日より、６日間連日投与し、Ｈ８Ｖ　−１（Ｆ株
）注入後６４〜６８時間目の死亡率を調べた。

その結果を第１表に示す。

第　１　表 第１衣に示すとと（２０ｍｅｒ非投与群では死亡率５／
１９を示すのに対し、２０ｍａｒ投与群では、死亡が認
められなかった。

例　１１３） ３週齢のＢＡＬＢ　／　Ｃマウスの脳室内に種々の濃度
の２０ｍａｒのＭＥＭ溶液加μｌにＨ８’Ｖ　−１（Ｆ
株）　（５ＸｌＯ’　ＰＦＵ　）を含んだものを注入し
、Ｈ８Ｖ　−１（Ｆ株）注入後６４〜６８時間目、７１
〜７８時間目の死亡率を調べた。その結果を第２表に示
す。

第　２　表 第２表に示すとと（２ｆ）ｍａｒ非投与群では死亡率３
　／　１０　（６４〜６８時間）、３／１ｏ（７１〜７
８時間）を示すのに対し、２０ｍａｒ投与群では、明ら
かに死亡率が減少していることが認められた。

例　１−（４１ ３週齢のＢＡＬＢ　／　ｃマウスの脳室内に種々の濃度
の２０ｍｅｒのＭＥＭ溶液３０／ｊＪＨ８Ｖ　−１（Ｆ
株）（５Ｘ１０’　ＰＦＵ　）を含んだものを注入し、
このマウスの脳室内に種々の濃度の２０ｍａｒのＭＥＭ
溶液３０μＬ（１％のベニ７リン及びストレプトマイシ
ンならびに２ｍＭのグルタミンを含有する。）をＨ８Ｖ
　−１（Ｆ株）注入翌日よシ、２日間連日投与し、Ｈ８
Ｖ−１（Ｆ株）注入後６４〜６８時間目、７１〜７８時
間目、８８〜９２時間目の死亡率を調べた。その結果を
第３表に示す。

第３表に示すとと＜　２０　ｍａｒ非投与群における死
亡率に対し、２０ｍｅｒ投与群では、８８−９２時間寸
で、明らかに死亡率が減少していることが認められた。

例　１　−（５） ３週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に、１．１２ｔｉ
ｇ／　ｍｌの２０ｍａｒのＭＥＭ溶液２ｏｏμｔにＨ８
Ｖ−１（Ｆ株）　（、ｉ　Ｘｌ０６ＰＦＵ　）　を含ん
だものを注入し、このマウスの腹腔内に種々の濃度の顆
ｍａｒのＭＥＭ溶液２００μｔ（１チの被ニジリン及び
ストレプトマイシンならびに２ｍＭのグルタミンを含有
する。）をＨ８Ｖ　−１（Ｆ株）注入３時間前および２
時間前ならびに翌日よシ３日間連日投与し、Ｈ８Ｖ　−
１（Ｆ株）注入後２１１時間目、２５９時間時間列亡率
を調べた。その結果を第４表に示す。

第４表に示すとと（２Ｑ　ｍｅｒ非投与群では、死亡率
１　／１０　（２１１時間）、２　／１０　（２５９時
間）を示すのに対し、２０ｍｅｒ投与群では死亡が認め
られなかった。

例　２ 麻酔下で鋭い針で五目傷つけた、３週齢のＥＡＬＢ　／
　Ｃマウスの角膜に、ＭＥＭ溶液加μｔ（ｉ係のベニ／
リン及びストレプトマイシンならびに２ｍＭのグルタミ
ンならびに５％の幼牛血清を含有する。）にＨ８Ｖ−１
（Ｆ株）（ＩＸＩＯ６ＰＦＵ　／ｍｌ　）を含んだもの
を滴下した。

上記のマウスを以下の４群に分けてその様子を観察した
。

Ａ、このマウスの角膜に２２．４　ｔｔｇ　／ｒｕｌの
２０ｍｅｒを含んだへｆＥＭ％液１（Ｊｔｔｌｆ　Ｈ８
Ｖ　−１（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日より隔日投
与で３回角膜に滴下し、Ｈ８Ｖ　−１（Ｆ株ン滴下１日
前、５時間前ならびに翌日より隔日投与で３回酢酸コル
チゾン溶液（２ｍｇ／Ｋｙ）３０１１１１を筋注した群
。

Ｂ、このマウスの角膜に２２．４　μｇ　／ｍｌの２０
ｍｅｒを含んだＭＥＭ溶液１０μｌをＨ８Ｖ−１ＣＦ株
）滴下２時間前ならびに戯日よシ隔日投与で３回角膜に
滴下した群。

Ｃ１このマウスの角膜にＭｇＭ溶液１０μｌをＨ８Ｖ−
１（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日より隔日投与で３
回角膜に滴下し、Ｈ８Ｖ　−１（Ｆ株）滴下１日前、５
時間前ならびに翌日より隔日投与で３回酢酸コルチゾン
溶液（２ｍＶ／Ｋｇ）　３０μＪ’ｅ筋注シタ群。

Ｄ２　このマウスの角膜Ｋ　ＭＥＭ溶液ｌＯμｌをＨ８
Ｖ−１（Ｆ株）滴下２時間前ならびに翌日よシ隔日投与
で３回角膜に滴下した群。

各群のマウスの目の状態及び目の周辺に見られる発疹に
注目してマウスの様子を４日肌７日目、１２日自修観察
したところ、２０ｍｅｒ’（ｉ７投与した群であるＡ群
、Ｂ群では非投与群である０群、Ｄ群に較べて明らかに
発疹が少なく目の状態も良好であった。

１だ、この際、２０ｍｅｒ投与の効果に対しては、コル
チゾン投与の影響は認められなかった。

上記の例１および例２から、本発明の抗ウィルス剤は、
明らかに、罹患動物においてウィルスの増殖を抑制し、
それによる死亡率の減少および症状の軽減が認められる
ので、非常に有用性の高いものであることが判る。

以下に、本発明の抗ウィルス剤の製剤例を掲げる。

製剤例１ 具体例３において得られた２０ｍｅｒと同様のものを液
層法で合成し、その２０ｍｅｒ２ｆを注射剤製造の常法
に従って、等張のＭＥＭ溶液を加えて１１としてアンプ
ルに封入し注射剤とする。

コノ注射剤は１　ｍｌ中に２０ｍｅｒ、２　ｍｇを含有
する。この注射剤は症状に合せて１回１〜５ｍ１を感染
患部になるべく近いところに注射する。

製剤例２ 具体例４において得られた２０Ｂと同様のものを液層法
で合成し、その２０　Ｂ　ｔｏ　９に等張のＭｇＭ溶液
を加えてＩｌとして１係点眼剤とする。

この点眼剤は、症状に合せて１回２〜３滴、１日数回点
眼する。

製剤例３ 具体例３において得られた２０ｍｅｒと同様のものを液
層法で合成し、その２０ｍｅｒｌ？を研磨して徴求とし
、これに精製カカオ脂９９９２を加えて６０°Ｃの水浴
上で練合し、整形して１個２７の層剤とする。

この層剤は１個中に２０　ｍｅｒ　ｆ　２　ｍｑ金含有
、症状に合せて使用する。

次に、本発明の抗ウィルス剤の安全性について、試験例
を示し説明する。

試験例Ｉ ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、１００　μｇ、／ＫＶ　２０　
ｍｅｒ　ｆ　ｉ。

ｐ−投与したところ死亡例を認めなかった。

試験例２ 前述の効果確認実験、例２においてＨ３Ｖ−１を使用せ
ず、他は同様にして行った実験では、２１Ｊｍｅｒ非投
与群と２０ｍａｒ投与群との間に差異は認められなかっ
た。

ここで示したように、本発明の抗ウィルス剤は、前述の
オリコゝデオキシヌクレオテドまたはポリオキシヌクレ
オチドの有効投与量において安全であることは明らかで
ある。

以下に、本発明に関連してなされた実験例を掲げる。

実験例Ｊ　メソセンジャーＲＮＡとしてポリウリジル酸
を用いたポリアデニル酸 ラニン合成反応のポリアデニル酸 及びデオキシポリアデニル酸によ る阻害作用 ポリウリジル酸（１４０μｇ）、１４０−フェニルアラ
ニン（ｌｏ５ｃｐｍ＋　３００　μｃｉ／μｍｏｌｅ　
）、Ｎｉ−ｅｒｅｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｍａｔｈａｅｉ
の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　４７１５８８　（１９６１）　
）により作成した大腸菌抽出液、１３　ｍＭ酢酸マグネ
７ウム塩、１ｍＭ　ＡＴＰ、　ｌ　ｍＭ燐酸クレアチン
、クレアチンホスホキナーゼ（１μｇ）を１０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７，５）に溶解して反応液系を作った。こ
の反応液系に第−表に列記した阻害剤を加え４０μｍと
し、１．５ｍｌのエラ啄ンドルフｔ　中で３７℃、加分
間反応させ、反応によシ得られた溶液中のポリフェニル
アラニンの量を１０係トリクロール酢酸に９５℃で不溶
の放射蛋白の量とし、液体シンチレーションカウンター
を用いて測定した。阻害度は、阻害剤を加えない時のポ
リフェニルアラニンの放射能と加えた時の放射能を比較
して算出した。その結果を第５表に示す。

第　５　表 第５表に示すごとく、ポリウリジル酸（ＲＮＡ）に対し
て、その塩基配列に対応するポリデオキシアデニル酸（
ＤＮＡ　）は、著しいポリフェニルアラニンの合成阻害
活性を示した。この実験においては、ＤＮＡ鎖は９ヌク
レオチド以上のオリゴデオキシアデニル酸（オリゴデオ
キシヌクレオチド）まで強い阻害活性を示した。

実験例２　ウサギの網状赤血球系におけるグロビン合成
のグロビン単鎖ＤＮＡに よる特異的阻害作用 この実験例は、真核細胞のメツセンジャーＨＮＡに対し
てハイブリッド形成するオリボデオキ／ヌクレオチドま
たはポリデオキシヌクレオチドを用いて生理的な条件下
で、蛋白の合成を阻害することを確かめた実験例である
。

４．２ｍＭリン酸カルシウム、２ｍＭジメチルチオスレ
イトール（ＤＴＴ）、０．０８　ｍＭ　アミノ酸（メチ
オニンを除く）、６ｍＭ酢酸カリウム、８　ｍＭ酢酸マ
グネシウム、スペルミジン４．５μｇ。

３５ｓ−メチオニン（０，１ａｃｌ）、およびＪａ−Ｃ
ｋＳｏｎとＰｅ　ｌｈａｍらの方法（Ｅｕｒ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ。

６７、２４７−２５６　（１９７６）　）にょシ作成し
た無細胞網状赤血球蛋白合成系ｌＯμｍ、α及びβグロ
ビンメツセンジャーＲＮＡ各７５μｇを２１　ｍＭＨＥ
ＰＥｓに溶解して第二衣に列記した阻害剤を加え、総量
間μｍとした後、１．５ｍｌのエッベンドルフ管中で３
０’Ｃ１（９）分間反応させた。

上記の反応により得られた溶液中の反応生成物は、Ｔｒ
ｉｔｏｎ−Ａｃｉｄ−Ｕｒｅａグルでαグロビン、βグ
ロビン、その他の蛋白に分け、ラジオオートグラフィー
で各分画の放射能を測定した。

阻害度は、阻害剤を加えない時の放射能と比較して算出
した。その結果を第６表に示す。

第　６　表 第６表に示すごとく、αグロビンのゲノムＤＮＡは、α
グロビンの合成のみを、βグロビンのゲノムＤＮＡは、
βグロビンの合成のみを特異的に阻害する。ウシ胸腺Ｄ
ＮＡは殆ど阻害活性を示さなかった。このことがら真核
細胞のメツセンジャーＲＮＡの塩基配列に相当するＤＮ
Ａの存在によってそのメンセンジャーＦｔＮＡに基づく
蛋白合成が特異的に阻害されることがわかる。さらに、
αグロビンのＮ末端アミノ酸に相当する１５オリゴデオ
ギシヌクレオチドがαグロビンの合成のみを阻害するこ
と及びＭ］３ファージの１５オリコゞデオキシヌクレオ
チドがαグロビン並びにβグロビンの合成にほとんど影
響を与えていないことから、メツセンジャーＲＮＡの塩
基配列に相当するＤＮＡ鎖が」５ヌクレオチド捷で短か
くなった場合でも、その阻害活性と特異性は失なわれな
いことがわかった。

実験例３　２０ｍｅｒのハムスター胎児腎細胞（ＢＨＫ
ｃｅｌｌ　）内ヘノ透過性 この実験例は、単鎖オリコ゛ヌクレオチドの細胞内への
透過性を確かめた実験である。

ハムスター胎児腎細胞（ＢＨＫｃｅｌｌ　、　４．４　
Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ　）にＨ８Ｖ　−１（７，６Ｘ１
０’　ＰＦＵ／ｍｌ）の脊椎々の時間接触させた。

溶媒を除き、細胞′ｆＩ：０．３ｍｌのＰＢＳ　Ｔ　Ｚ
　回洗浄し、さらに、３６℃で３０分間、０　、１　Ｍ
　ＮａＣ１＋３３μＭ　ＺｎＣｌ２，３３６０　ｕｎｉ
ｔ　ヌクレアーゼｓ１を含む３３．３ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４，５）の溶液中で放置した後、ヌクレ
アーゼｓ１を除いた上記酢酸ナトリウム緩衝液で２回洗
浄し、０．３ｍｌの１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．６％
ドデンル硫酸ナトリウムおよび、ｌ０ｍＭ１’Ｊス緩衝
液（ｐＨ７，５）で、細胞を溶壊した。

ここで、この溶液中のＴＣＡ不溶性物質および、ヌクレ
アーゼＳ１感受性の２０ｍａｒの量を測定したところ、
８時間で１細胞あた。９４．．６８ｘ　１０”　個の２
０ｍａｒが取シ込まれていることが判った。

実験例４　オリゴデオキ／ヌクレオチＰの配合による影
響 （ａ）　マイクロプレート（リンプロ社製、穴内径１．
５　ｆｆｉ　）に−穴あたり１．５Ｘ１０５個のハムス
ター胎児腎細胞（ＢＨＫ　ｃｅｌｌ　）を入れ、５係Ｃ
Ｏ２インキユベーター中で、３６℃で４７〜４８時間培
養し、この細胞に１型ヘル波スシンプレノクスウイルス
（Ｈ８Ｖ　−１）　（７，６Ｘｉ、ｏ’　ＰＦＵ／　ａ
ｌ　）　１６０μｔを加え、３６℃で３時間感染させた
。この感染細胞に、種々の量の２０ｍｅｒあるいは２０
ｍａｒと２０Ｂの混合物（２２４°１）を溶媒に溶解し
て０．３　ｍｌ　（ｃａｃＡ２濃度４．５５　ｍＭ　）
で８時間培養した。

（’ｂ）　別に、上記（ａｌの操作において、２０ｍｅ
ｒあるいは２（１ｍｅｒと２０Ｂの混合物を使用せずに
他は、すべて同様にして、培養操作を行った（ウィルス
コントロール）。上記（ａ）の培養細胞を固定し、染色
し、シンンチウムの数を計測した。この結果をウィルス
コントロール（ｂ）のシンシチウム数を１００係として
、第２図に示す。

第２図に示すごとく、２ｉ１ｍｅｒと２０　Ｂの混合物
を使用した場合、２０ｍｅｒ単独の時よりも強いウィル
ス増殖阻害作用を示すことが認められた。このことから
、阻害作用は、ヘルペスシンプレックスウィルスのマイ
ナス鎖ＤＮＡ　全構成する塩基配列のうちの異なる塩基
配列部分を併せて用いた場合その作用を増強することが
あるという事実が確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抗ウィルス剤に関する効果確認のだ
めの１実験例〔前述例１−（１））の結果を示すグラフ
である。グラフ縦軸に２０ｍｅｒ非投与群の死亡率に対
する２０　ｍａｒ投与群の死亡率の係をとり、横軸に２
０ｍｅｒの投与量（μｙ／ｍｏｕｓｅ）をとシ、示した
ものである。 第２図は、本明細書の実験例４において、加ｍａｒの単
独使用の場合と２０Ｂとの混合物を使用した場合とのウ
ィルス増殖阻害作用を比較するだめのグラフで、ｌ、縦
軸にウィルスコントロール群のンンシチウム数に対する
２０ｍｅｒ又は加ｍａｒと２０Ｂとの混合物使用群のシ
ンシチウム数の係をと９、横軸に２０　ｍｅｒの使用量
又は２０ｍｅｒと２０Ｂとの混合物の使用量をと９、示
したものである。 特許出願人　梶　昭 第２図　−→−、２０ｍａｒ −中１　＋２０ｍｅｒ＋　、２０　Ｂ Ｏ，／　０．、ｌ　Ｏ，３（ａｔ　ＤＮＡ／ｗｅｌｌ　
）手続補正書 昭和６０年６月１７日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４９３２１号 ２、発明の名称 抗　ウ　イ　ル　ス　剤 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　東東部東久留米市大門町１−１−９氏名　梶　昭 ４、代理人 ７、補正の内容 （ＩＪ明細書５頁６行の「塩化カルシウム使用し」の記
載を、１塩化カルシウムを使用し」に訂正する。 （２）同、６頁３行のｒ基いて」の記載を、「基づいて
」に訂正する。 〔３〕同、７頁５行〜６行の「または」の記載を削除す
る。 （４）同、１８頁３行の「培養する。」の記載を、「培
養した。」に訂正する。 （５）同、１６頁１４行及び１６行（計２箇所）のｒｇ
Ｊの記載を、「Ｇ」に訂正する。 （６）同、３０頁１１行のｒｌｏｏ　Ｐｇ　／Ｋｇ　２
０　ｍｅｔ　Ｊの記載を、ｒｌｏｏ　ｐ−ｇ　／Ｋｇの
２０　ｍｅｒＪに訂正する。 （７）同、３１頁１２行のｒ４７１５８８Ｊの記載を、
ｒ４７，１５８８　Ｊに訂正する。 （８）同、３４頁３行゛の「第二表」の記載を、「第６
表」に訂正する。 （８）同、３Ｂ頁末行のｒＸ１０１５Ｊの記載を、ｒＸ
１０３Ｊに訂正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ウィルスの増殖に際して発生するメツセンジャーＲＮＡ
   　Ｋ　ｔ４してハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列の部
   分構造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドまだはポリ
   デオキシヌクレオチドを含有することを特徴とする抗ウ
   ィルス剤