DK168061B1 - Med mrna hybridiserbart anti-viralt middel - Google Patents

Description

i DK 168061 B1

Den foreliggende opfindelse angår et farmaceutisk præparat, der i det væsentlige består af en effektiv anti-viral mængde af et oligo-eller polydeoxynukleotid, som har en sekvens, der er identisk med en del af DNA, som er hybridiserbar med mRNA hos herpes-virus, hvilket oligo-5 eller polydeoxynukleotid kan hybridiseres med mRNA'en, samt en farmaceutisk acceptabel bærer.

På det tidlige stade i behandlingen af virusforårsagede sygdomme anvendtes kemisk syntetiserede lægemidler og antibiotika som anti-virale midler for at hæmme formeringen af virus. For de kemisk syntetiserede 10 lægemidlers vedkommende er deres anti-virale spektrum dog temmelig snævert og skadelige bivirkninger forårsaget af sådanne lægemidler optræder hyppigt. I tilfælde af antibiotika er der den ulempe, at der til stadighed kræves udvikling af antibiotika af nye typer ligesom man må forsøge at reducere eventuelle skadelige bivirkninger ved antibiotika, eftersom 15 virus bliver resistente over for de anvendte antibiotika og endelig med tiden bliver immune over for disse.

Med den seneste udvikling inden for bioteknologien, især gensplejsningsteknikken, er identifikation af de strukturelle gener hos virus blevet et stort forskningsobjekt inden for studiet af mikroorganismer. I 20 1977 rapporterede S.C. Inglis et al in vitro translation af cytoplasmisk RNA, der var ekstraheret fra kyllinge-embryo fibrobi aster inficerede med influenza A virus i et hvedekimcelle-frit protein-syntesesystem, med det resultat, at syntesen af det vi rus-specifikke polypeptid svarende til det hybridiserede v-RNA-segment blev reduceret (Virology 78, 522-536 25 (1977)). De i denne reference omtalte forsøg blev imidlertid udført med et celle-frit system uden relation til studiet af lægemidler. En sådan strukturel gen-identifikation er også rapporteret af B.M. Paterson et al. i Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 4370-4374 (1977). Paterson et al.'s forsøg blev også udført i et celle-frit system. I disse to refe-30 rencer anvendtes i virkeligheden til inhibering af proteinsyntesen en enorm genetisk struktur såsom i den først omtalte reference selve den fra influenza-virus ekstraherede RNA eller i den anden reference kanin /3-globin klon PØGl. En sådan enorm struktur kunne ikke forventes at in-hibere den intracellulære proteinsyntese.

35 I 1978 rapporterede P.C. Zamecnik et al., at et tridecamer oligode-oxynukloetid, der var komplementært med de gentagne 3'- og 5'-terminale nukleotider fra Rous sarkoma virus (RSV), var en effektiv inhibitor for syntesen af protein, der specificeres af den virale RNA i hvedecelle- DK 168061 B1 2 frit system (Proc. Natl. Acad. $ci.} USA, 75, 285-288 (1978)) samt i et in vitro vævskultursystem (ibid. 75, 280-284 (1978)). For den første references vedkommende anvendtes fortsat det celle-frie system som tidligere, men en vis forbedring blev erkendt med hensyn til anvendelse af en 5 DNA med en mindre molekylær struktur til inhibering af proteinets translation. I den anden reference udførtes forsøgene under anvendelse af tridecameren i et vævskultursystem til inhibering af formering af virus og transformation af celler. Den i disse referencer til inhibering af formering og transformation anvendte DNA var udvalgt fra en anden region 10 end en specifik kodningsregion, og den var derfor ikke ønskelig. Samme år rapporterede N.D. Hastie et al. endvidere, at hybridisering af gi obi n mRNA til den tilsvarende cDNA viste sig specifikt at inhibere translation af mRNA'en i et celle-frit system (ibid. 75, 1217-1221 (1978)). Det nye i denne reference var kun, at en vis kodningsregion af DNA blev ud-15 valgt til inhibering af translationen ved hybridisering af mRNA. De omtalte forsøg blev imidlertid fortsat udført i et celle-frit system. Der har været et behov for udvikling af lægemidler baseret på denne teori siden publiceringen af disse referencer i 1978. Hidtil har der dog ikke være rapporteret nogen reference i forbindelse med en praktisk anvendel-20 se af denne teori på forsøg in vivo.

I 1983 publiceredes en PCT-patentansøgning vedrørende et oligo-nu-kleotid terapeutisk middel og fremgangsmåder til fremstilling deraf (Molecular Biosystems INC., Inti. Publn. No. W083/01451). I denne patentansøgning findes dog blot en angivelse af, at (-)-streng DNA udvælges fra 25 en vis kodningsregion, som inhiberes af SV 40 transformeret celle.

Selvom udtrykket "in vivo" hyppigt er anvendt i eksempel 1 i denne reference, tyder sammenhængen på, at de angivne beskrivelser vedrører forsøg i et in vitro cellekultursystem. Selvom sådanne forsøg in vitro betragtedes som forsøg in vivo, mangler der konkrete betingelser og om-30 talen kan kun opfattes som en forventning om ønskelige virkninger.

Bortset herfra foreslår denne reference for første gang anvendelse af RNA-DNA hybridiseringteknik på et lægemiddel, men der mangler detaljerede beskrivelser, som kan underbygge anvendelsen som lægemidler og referencen er intet mere end en sammenfatning af den viden, man havde på det 35 pågældende tidspunkt. Den omtalte patentansøgning involverer derfor intet ud over den tekniske viden, som allerede er omtalt i de foran anførte referencer.

I GB-A-1.170.929 beskrives et farmaceutisk præparat, der indeholder Η I ^^— ---- DK 168061 B1 3 antiviralt nukleinsyremateriale aktivt mod både DNA- og RNA-viruser.

I US-A-3.829.567 beskrives et terapeutisk præparat, der indeholder et alkalimetalsalt af et polynukleotid eller oligonukleotid af RNA eller DNA og er aktivt mod det fibrinolytiske system.

5 I FR-A-1.605.535 beskrives polynukleotider, der kan anvendes som induktorer af produktionen af interferoner.

Der er ingen omtale af, at de i de ovennævnte skrifter omhandlede nukleotider skulle opvise en sekvens som er identisk med en del af strukturen af DNA, som kan hybridiseres til en mRNA hos herpes virus, 10 hvilket nukleotid kan hybridiseres til mRNA'en, til inhibering af formeringen af virus.

Under de foreliggende omstændigheder er der et stort behov for tilvejebringelse af et anti-viralt middel af en helt ny type baseret på udvikling af teorien om inhibering af mRNA-transi ation af virus på basis 15 af RNA-DNA hybridiseringteknikken med henblik på inhibering af formeringen af virus in vivo.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således et middel til inhibering af formeringen af virus, som omfatter et specifikt oligo- eller polydeoxynukleotid, der afgives til det af virus inficerede sted, 20 hvilket middel udgør en ny type af et anti-viralt middel, som omfatter et specifikt oligo- eller polydeoxynukleotid, som i DNA-sekvens er identisk med en del af strukturen af DNA, som kan hybridiseres til en mRNA dannet ved formeringen af virus, hvilken struktur er i stand til at hybridisere til mRNA'en, til inhibering af formeringen af virus.

25 Opfindelsen beskrives i det følgende nærmere under henvisning til tegningen, hvor figur 1 afbilder en kurve, der viser resultatet af forsøg, som påviser de inhibitoriske virkninger af oligodeoxynukleotidet (20 A) på de cytopatiske virkninger af HSV-1, 30 figur 2 afbilder en kurve, som viser resultatet af forsøg, der påviser de inhibitoriske virkninger af oligodeoxynukleotidet (20 A) på formeringen af virus, figur 3 afbilder en kurve, der viser virkningen af en vis kombination af oligodeoxynukleotiderne til inhibering af formeringen af virus 35 samt den patogene virkning deraf sammenlignet med et enkelt oligodeoxy-nukleotid, og figur 4 er en kurve, der viser resultatet af forsøg, som var udformet for at påvise in vivo effektiviteten (i et levende dyr) af det anti- 4 DK 168061 B1 virale middel ifølge opfindelsen.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at formeringen af virus effektivt inhiberes, når et oligodeoxynukleotid eller polydeoxynukleotid, som i DNA-sekvens er identisk med en del af 5 strukturen af DNA, som kan hybridisere til mRNA dannet ved formering af virussen, hvilken struktur er i stand til at hybridisere til mRNA'en, afgives til det sted, hvor mRNA'en eksisterer. Ved at administrere oli-go- og polydeoxynukleotiderne til dyr, der var inficeret med en virus, lykkedes det at tilvejebringe et anti-viralt middel, som var i stand til 10 effektivt at inhibere formeringen af virus in vivo. Den foreliggende opfindelse er baseret herpå.

Som beskrevet ovenfor er hybridiseri ngen af viral eller gi obin RNA til den tilsvarende DNA til inhibering af proteinsyntesen kendt fra de ovenfor nævnte referencer. Størsteparten af de tilhørende forsøg udfør-15 tes imidlertid i et celle-frit system med undtagelse af Zamecniks anden reference (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 280-284) og Molecular Biosystem Inc. referencen (PCT, Inti. Publn. nr. W083/01451), hvor inhibering af formeringen af virus er beskrevet i et in vitro cellekultur-system. I Zamecniks in vitro forsøg udvælges denne imidlertid fra en 20 anden region end en specifik kodningsregion for virussen. Med utrykket "kodningsregion" menes her regioner af virale gener, der giver anledning til (bestemmer aminosyresekvensen af) virale proteiner og som undergår transkriptionen ved hjælp af en RNA-polymerase til dannelse af mRNA. Omvendt mangler Molecular Biosystem Inc. referencen omtale af de konkrete 25 betingelser i forsøgene. Som et led i den foreliggende opfindelse er der udført omfattende undersøgelser og forsøg i både in vitro og in vivo systemer under anvendelse af specifikke oligodeoxynukleotider eller polydeoxynukleotider udvalgt fra en specifik kodningsregion og det blev herved for første gang muligt at udvikle teorien om inhibering af forme-30 ringen af virus på basis af RNA-DNA hybridiseringsteknikken til et praktisk anvendeligt terapiniveau, hvorved det er blevet muligt at anvende oligodeoxynukleotiderne eller polydeoxynukleotiderne som lægemidler til inhibering af formeringen af virus. Den foreliggende opfindelse afviger således væsentligt fra den kendte teknik i to henseender, nemlig ved ud-35 vælgeisen af DNA fra en specifik kodningsregion, som kan hybridiseres til mRNA for virus og anvendelsen af et enkeltstrenget deoxynukleotid med en kort kædelængde som den fra den specifikke kodningsregion udvalgte DNA, ligesom den foreliggende opfindelse udmærker sig ved, at de DK 168061 B1 5 ovennævnte forhold udvikles til et praktisk anvendeligt niveau ved hjælp af talrige in vivo forsøg.

Den foreliggende opfindelse angår således et farmaceutisk præparat, som er ejendommeligt ved, at det i det væsentlige består af en effektiv 5 anti-viral mængde af et oligo- eller polydeoxynukleotid, som har en sekvens, der er identisk med en del af DNA, som er hybridiserbart med mRNA hos herpes-virus, hvilken oligo- eller polydeoxynukleotid kan hy-bridiseres med mRNA, samt en farmaceutisk acceptabel bærer.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse muliggøres føl -10 gelig inhibering af formeringen af virus ved, at et eller flere oligode-oxynukleotider eller polydeoxynukleotider afgives til et sted, hvor der findes en mRNA dannet ved formeringen af virussen, hvorved oligodeoxy-nukleotiderne eller polydeoxynukleotiderne i DNA-sekvens er identisk med en del af strukturen af DNA, som kan hybridiseres til en ved formering 15 af virussen dannet mRNA, hvilken struktur er i stand til at hybridisere til mRNA'en.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse blev det først fundet, at proteinsyntesen, når en syntetisk RNA såsom mRNA transiateres i et in vitro proteinsyntesesystem, inhiberes af et oligodeoxynukleotid, 20 som hybridiserer til den syntetiske RNA (se eksempel 25 nedenfor).

Oligodeoxynukleotider, som ikke hybridiserer til RNAén, inhiberer ikke proteinsyntesen i dette system.

Det blev dernæst fundet, at oligodeoxynukleotider af (-)-streng sekvensen af α-globin eller Ø-globin DNA inhiberer translationen af den 25 tilsvarende mRNA (se eksempel 26 nedenfor).

På grundlag af forsøget blev det fundet, at α-globin DNA specifikt inhiberer translationen af α-globin mRNA i in vitro systemet. Endvidere blev det fundet, at /f-globin DNA specifikt inhiberer translationen af β-globin mRNA i dette system. Endvidere blev dannelsen af α-globin ikke 30 inhiberet, når der anvendtes DNA, som ikke hybridiserer til or-globin mRNA'en. På tilsvarende måde inhiberedes /l-globin-dannelsen ikke af DNA, som ikke hybridiserer til /5-globin mRNA. Endvidere blev det fundet, at ikke kun DNA med en lang kæde, men også oligodeoxynukleotider har en stærk inhibitorisk virkning i dette system p.g.a. hybridisering.

35 På grundlag af disse forsøg foretoges yderligere forsøg vedrørende herpes simplex virus (HSV) infektion*. Når DNA eller oligodeoxynukleotider, som kan hybridisere til den umiddelbart tidlige mRNA for HSV, blev indgivet til celler inficeret med denne virus, viste det sig, at antal- 6 DK 168061 B1 let af syncytia (et plaque-lignende hul, som blev fremkaldt af HSV p.g.a. fusionen af inficerede celler) forårsaget af HSV, blev markant reduceret.

I de ovennævnte forsøg anvendtes CaClg og Ca-phosphat sammen med 5 DNA'en for at stimulere indtrængning af DNA'en i celler. I separate forsøg blev det dog fundet, at oligodeoxynukleotidet kan optages selv uden disse calciumsalte og at det således inhiberer formeringen af HSV og dens cytopatiske virkninger (se eksempel 7 nedenfor).

Ud fra disse forsøg blev det klart, at minus-strengen af DNA, som 10 hybridiserer til en mRNA af HSV-1, inhiberer syncytium-dannelse af denne virus. Baseret på denne iagttagelse blev sådan DNA yderligere tilført mus, der var inficeret med HSV, og det blev påvist, at denne DNA kan anvendes som et anti-viralt middel in vivo til behandling af virale sygdomme.

15 Det er her væsentligt, at kun den negative streng af DNA'en, som er specifik for mRNA'en af det særlige virale gen, anvendes som en effektiv komponent i midlet og fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Biosyntesen af cellulært protein, der programmeres af andre mRNA'er, bør derfor ikke påvirkes ved anvendelse af den ovenfor omtalte DNA.

20 Der er to grupper af virus, nemlig DNA-virus (herpes simplex virus, adeno virus, vaccinia virus, etc.) og RNA-virus (influenza virus, rhino virus og polio virus, etc.). RNA-virus bærer enten enkelt-strenget RNA eller dobbelt-strenget RNA som et genom. Enkelt-strenget RNA-virus klassificeres i sådanne, der bærer plus-strenget RNA og sådanne, der bærer 25 minus-strenget RNA som genom.

Virale proteiner må altid syntetiseres ved translation af en viral mRNA, der er en plus-strenget RNA. Virus med et dobbelt-strenget DNA-genom danner mRNA (plus-streng) ud fra deres minus-strengede DNA-streng.

I de dobbelt-strengede RNA-virus dannes mRNA'en (plus-strenget) ud fra 30 den minus-strengede RNA. Genomet af plus-strengede RNA-virus fungerer i sig selv som en mRNA, mens de minus-strengede RNA-virus anvender deres RNA som tempi ater for dannelsen af plus-strenget RNA (mRNA).

Iht. den foreliggende opfindelse er translationen af en viral mRNA og således syntesen af virale proteiner uafhængig af mekanismen for syn-35 tesen af mRNA, som inhiberes af en hybridiserende minus-strenget DNA.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan formeringen af RNA- eller DNA-virus og disses cytopatiske virkninger standses uden at influere på værts-celler. Endvidere kan infektion af uinficerede værts-celler fore- DK 168061 B1 7 bygges ved hjælp af midlet ifølge opfindelsen. Som et led i den foreliggende opfindelse viste det sig, at oligodeoxynukleotider, der alene hy-bridiserer til den direkte tidlige mRNA af herpes simplex virus, hverken har virkning på normale uinficerede hamsterunge-nyreceller (BHK-celler) 5 eller på mus. Det konkluderedes derfor, at oligodeoxynukleotiderne hverken har særlig virkning på normale celler og dyr eller overhovedet indvirker på væksthastigheden af disse celler.

De negativt-strengede deoxynukleotider, som anvendes ifølge opfindelsen, kan opnås ved enzymatisk hydrolyse af DNA, denaturering og 10 efterfølgende separering ved affinitetskromatografi. Alternativt kan syntetiske negativt-strengede oligodeoxynukleotider anvendes. Det er således klart, at de negativt-strengede deoxynukleotider, som anvendes i de her beskrevne forsøg, kan opnås ved en række forskellige fremgangsmåder.

15 Ved kloningen af RNA-virus-gen kan anvendes revers transkriptase. I nogle tilfælde kan anvendes viral DNA, som er til stede i inficerede celler, og som hidrører fra RNA-virus genomet. Som en kloningsvehikel kan fx. anvendes lambda-fag (Charon-fag) eller plasmid pBR 322 som vektor. Til opnåelse af en enkelt-strenget (-) DNA, anvendes M 13 fag som 20 vektor. Iht. den foreliggende opfindelse kan anvendes den klonede DNA fra kloningsregionen for enhver del af de totale virale genomer. Tidlige eller umiddelbart tidlige gener, hvis ekspression iagttages i tidlige infektionsstadier, er dog særlig ønskelige til hindring af virusforme-ring og de ledsagende cytopatiske virkninger.

25 En rekombinant M 13 fag indeholdende en negativt-strenget viral DNA eller en rekombinant DNA-vektor indeholdende den dobbelt-strengede virale DNA, kan fremstilles ved at dyrke store mængder E. coli indeholdende disse vektorer eller E. Coli inficeret med M 13 fag. Vektorer indeholdende de virale gener isoleredes og behandledes med restriktions-30 endonuklease til afskæring af de virale gener. Blandingen af de afskårne virale gener og vektor-DNA'en underkastedes dernæst agarose-gel elektro-forese eller kromatografi på Sephadex-kolonne til adskillelse af virus-gen-DNA'en fra vektor-DNA'en. De således opnåede DNA-molekyler forkortedes ved partiel fordøjelse med DNA-restriktions-endonuklease eller 35 ved ultralyd-behandling. Kædelængden af de virale DNA-fragmenter juste-redes til et vilkårligt sted mellem 9 og 100 nukleotider ved at isolere disse DNA-strenge ved gel-elektroforese og Sephadex-kromatografi.

Det skal bemærkes, at kun den negative streng af viral DNA er ef- 8 DK 168061 B1 fektiv til i nhi bering af den virale proteinsyntese. DNA'en af vektorer såsom pBR 322 eller lambda-fag som den repli kerende form af M 13 fag er en dobbelt-strenget DNA. Denne dobbelt-strengede DNA må derfor omdannes til en enkelt-strenget DNA efterfulgt af isolering af negativt-strenget 5 DNA. Til dette formål kan forskellige fremgangsmåder anvendes. Fx denatureres DNA ved opvarmning til 100°C i 10 minutter og hurtig afkøling.

Fra en blanding af den separerede negative og positive streng af DNA kan den negativt-strengede DNA isoleres, fx. ved affinitetskromatografi. Til dette formål fremstilles først den positivt-strengede DNA ved 10 kloning i M 13 fag. Denne konjugeres dernæst til et bærermateriale til kromatografisk brug. En blanding af negative og positive strenge af DNA ledes dernæst gennem den konjugerede positive DNA-kolonne. Den negative streng af DNA bindes til denne kolonne, mens den positive streng af DNA passerer gennem kolonnen. Den bundne negative streng af DNA elueres der-15 næst fra kolonnnen.

Ved en alternativ fremgangsmåde til opnåelse af den negative streng af DNA syntetiseres den kemisk i form af oligo- eller polydeoxynukleo-tider ved en passende organisk-kemisk syntesemetode.

I tilfælde af herpes simplex virus har et af de umiddelbart tidlige 20 DNA-gener, Vmw 175, eksempelvis en dobbelt streng bestående af en plus- DNA (5'-ATG.GCG.TCG.GAG.....) og en minus-DNA (3'-TAC.CGC.AGC.CTC.....).

Kun minus-DNA'en med en sekvens, der begynder med TAC, kan hybridisere til en mRNA af Vmw 175. En DNA, som er identisk i en partiel struktur med minus-DNA-strengen, skal derfor udvælges og syntetiseres som et oli-25 godeoxynukleotid. Influenza virus-genomet indeholder hæmaglutinin-genet og NS (ikke-strukturelle) gener. Da hæmaglutinin-genet af forskellige serotyper af influenza virus varierer i RNA-sekvens, foretrækkes sekvensen af en enkelt-strenget DNA, der hybridiserer til mRNA'en af NS-gener-ne. (-)-streng-DNA, som hybridiserer til mRNA'en fra NS-generne, er mere 30 ønskelig end den, som hybridiserer til mRNA'en fra hæmaglutiningenet, fordi hæmaglutinin-genet meget ofte muterer og minus-streng-DNA'en, som hybridiserer til mRNA'en fra hæmaglutinin-genet af en enkelt stamme af influenza virus, kan eventuelt ikke kryds-hybridisere til mRNA'en fra hæmaglutinin-genet af en anden serotype-stamme af influenza virus.

35 Yderligere forklaring om NS-1 genet af influenza virus er fx givet af Lamb et al., (Cell 21 47 (1980)). DNA-sekvensen, der hybridiserer til en mRNA fra NS-1 gen, er 5'.....ACT.TGA.CAC.AGT.GTT.GGA.ATC.CAT.....-3'.

Derfor kan hele denne sekvens eller en del deraf udvælges og syntetise- DK 168061 B1 9 res.

Det fremgår af de foregående forklaringer, at man til inhibering af virus-formeringen med en enkelt-strenget minus-streng-DNA principielt bør vælge en effektiv enkelt-strenget DNA, som hybridiserer til en mRNA 5 af denne virus.

Generelt står betegnelsen "oligodeoxynukleotid" for et molekyle, der har et mindre antal deoxynukleotid-enheder, mens betegnelsen "poly-deoxynukleotid" står for et molekyle, der har et større antal deoxynukleotid-enheder. I forbindelse med den foreliggende opfindelse er fx.

10 antallet af nukleotid-enheder af oligodeoxynukleotiderne sædvanligvis op til 25. Således kan deoxynukleotider, der her mere end 25 deoxynukleotid-enheder, i forbindelse med den foreliggende opfindelse betegnes som "polydeoxynukleotider".

De anti-virale midler ifølge den foreliggende opfindelse, som inde-15 holder oligo- og/eller polydeoxynukleotiderne sammen med en passende flydende bærer eller excipient og eventuelt en hjælpetilsætning eller -tilsætninger, fremstilles i form af flydende præparater, injektioner, suppositorier, etc. iht. kendte fremgangsmåder. Ved ordination kan de ønskede oligodeoxynukleotider og polydeoxynukleotider anvendes enkeltvis 20 eller i kombination med andre farmakologisk aktive bestanddele. I dette tilfælde er det klart, at de andre bestanddele ikke bør modvirke oligo-og polydeoxynukleotidernes anti-virale aktivitet.

Oligo- og polydeoxynukleotiderne kan om ønsket forarbejdes til præparater til udvortes brug såsom cremer, salver, væsker og plastre ved 25 blanding af oligo- og polydeoxynukleotiderne som den aktive bestanddel med en passende inert bærer eller excipient.

De flydende bærere eller exeipienter samt de eventuelle hjælpetilsætninger, som anvendes i de anti-viral midler ifølge opfindelsen, er konventionelle og kommercielt tilgængelige.

30 Eksempler på flydende bærere, excipienter og hjælpetilsætninger, som kan anvendes til fremstilling af de anti-virale midler, er fx destilleret vand til injektionsbrug, fysiologisk saltvand, en vandig opløsning af dextrose, vegetabilske olier til injektionsbrug, pro-pylenglycol, polyethylenglycol og benzylalkohol (til injektioner og 35 flydende præparater), vaseline, vegetabilske olier, animalsk fedt og polyethylenglycol (til præparater til udvortes brug) og isotoniske midler, opløseligheds-fremmende midler, stabilisatorer, farvningsmidler, antiseptiske midler, dulmende midler og lignende tilsætninger (som 10 DK 168061 B1 almindelige hjælpetilsætninger til farmaceutiske præpater). I tilfælde af injektions-præparater kan det være ønskværdigt, at den aktive bestanddel er opløselig i steriliserede flydende bærere. Det er klart, at de ovenfor nævnte forskellige flydende bærere, excipienter og hjælpe-5 tilsætninger hverken bør inhibere eller forstyrre oligo- og polydeoxy-nukleotidernes anti-virale virkning.

Oligo- og polydeoxynukleotiderne forarbejdes sammen med de ovenfor anførte bærere eller excipienter og eventuelt sammen med de ovenfor anførte hjælpetilsætninger iht. kendte fremgangsmåder. Injektionspræpara-10 ter og suppositorier kan sædvanligvis indeholde 1-10 mg oligo- og poly-deoxynukleotid per ampul eller kapsel. For human-patienter er den daglige dosis ca. 0,1-1.000 mg, fortrinsvis 1-100 mg (fra 10-20 øg/kg til 1000-2000 /ig/kg legemsvægt). Den specielle dosis for hver patient afhænger imidlertid af et stort antal faktorer, fx af effektiviteten af de 15 specielle oligo- eller polydeoxynukleotider, der anvendes, af alder, vægt, almenbefindende, køn, spisevaner, tidspunktet og arten af administrationen, udskilningshastigheden, kombination med andre samtidig anvendte medikamenter og omfanget af de specielle sygdomme, mod hvilke terapien anvendes.

20 De anti-virale midler ifølge opfindelsen administreres intravenøse eller påføres direkte til den del af patientens krop, som er inficeret med virus, således at oligo- eller polydeoxynukleotidet effektivt kan tilføres den inficerede del.

Den foreliggende opfindelse vil nu blive belyst nærmere ved hjælp 25 af de efterfølgende eksempler og referenceeksempler.

Eksempel 1-5 angår fremstillingen af oligo- og polydeoxynukleotiderne, som anvendes i præparatet ifølge den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1 30 Herpes simplex virus DNA blev isoleret ved phenol-chloroform ekstraktion. Den isolerede DNA blev fordøjet med restriktions-enzymet BamHI.

Den fordøjede DNA blandedes dernæst i nærværelse af T 4 fag ligase med pBR 322 plasmid-DNA, som forud var blevet behandlet med BamHI.

35 Den resulterende blanding, der indeholdt ligerede pi asmider, blev tilført til E. coli og de bakterier, der indeholdt rekombinantplasmidet, blev udvalgt ved at inkubere dem på ampicillin-holdige agar-plader til dannelse af kolonier og ved at screene dem for tetracyclin-følsomhed.

DK 168061 B1 11

Blandt de tetracyclin-føl somme kolonier blev de bakterier, der havde herpes simplex virus-DNA'en, udvalgt ved filter-hybridiseringsmetoden 32 med P-mærket herpes viral DNA som probe. Til opnåelse af rekombinant- 6 7 plasmid-DNA'en blev 2 x 10 - 10 E. coli celler, som indeholdt rekombi-5 nant-plasmidet, anbragt i 2 ml TSB (tryptose-soya-næringssubstrat).

Det podede medium rystedes i et 20 ml testrør ved 37°C i ca. 15 timer indtil den optiske absorption (optisk tæthed : OD) af kulturmediet ved 540 nm nåede 0,5 (ODg^=0,5). På dette tidspunkt tilsattes chloramphenicol til en slutkoncentration på 100 /tg/ml og inkubation fortsattes 10 i 15 timer.

Bakteriesuspensionen centrifugeredes dernæst og pelleten resuspen-deredes i et puffer indeholdende 25¾ saccharose og 50 mM tris HC1 (pH

8,0). Suspensionen henstod ved 0°C i 5 minutter. Til denne suspension sattes 4 ml "Triton X 100“ og den resulterende viskose opløsning centri -15 fugeredes i 30 minutter ved 0°C ved 30.000 g. Til supernatanten af denne opløsning (8 ml) sattes 8 g CsCl, 1 ml af en opløsning af ethidiumbromid (/ig ethidiumbromid/ml). Blandingen centrifugeredes i yderligere 48 timer ved 100.000 g. Den rå pi asmidfraktion, som blev opnået efter denne centrifugering, blandedes med 2 volumendele isopropyl al kohol og henstod i 20 få minutter. Det øvre lag fjernedes og den DNA-holdige opløsning dialyseredes mod 0,1 M tris HC1 og 10 mM EDTA (pH 8,0) natten over.

Den dialyserede opløsning koncentreredes og opløsningen, der indeholdt 200 øg DNA, behandledes med en overskydende mængde restriktionsenzym (BamHI). DNA-fordøjelsesproduktet fraskiltes ved agarose-elektro-25 forese og DNA'en af herpes simplex virus isoleredes fra gelen ved hjælp af elektroelueringsmetoden. DNA'en fordøjedes yderligere delvist med DNase og opvarmedes til 100°C i 10 minutter efterfulgt af hurtig afkøling. På denne måde opnåedes DNA med en kædelængde på 9 til 100 oli godeoxynukleot ider.

30

Eksempel 2

Den replikative form af M 13 fag DNA (dobbelt-strenget DNA) blev overskåret med BamHI. Denne fordøjede M 13 DNA blandedes med herpes simplex virus DNA, der var blevet fordøjet med BamHI, og isoleredes som 35 beskrevet ovenfor. De ligeredes med T 4 fag ligase. E. coli transficere-des med den ligerede DNA i nærværelse af CaCl2. De transficerede bakterier anbragtes på agarplader under anvendelse af en top-agar, der indeholdt IPTG (isopropyl-Ø-D-thio-galactopyranosid) og X-gal (som indi- DK 168061 B1 12 kator). Rekombinant-M 13-fag, der indeholdt herpes simplex virus DNA, danner farveløse fag-plaque inden for 24 timer. M 13 fag uden indføring danner blå plaque. Derfor valgtes de farveløse fag-plaque. For at vælge rekombinant-M 13-fag, som indeholder (-)-strenget HSV-DNA, undersøgtes 5 fag for deres evne til at hybridisere med mærket (+)-HSV-DNA, som syntetiseres kemisk. På denne måde udvalgtes M 13 fag indeholdende en del af (-)-strengen af HSV-DNA. Mængden af den ønskede rekombinant-M 13-fag forøgedes og en enkelt-strenget DNA blev isoleret fra denne fag. Til yderligere rensning af den enkelt-strengede HSV-DNA kan M 13 fag DNA 10 fjernes fra denne blanding ved restriktionsenzym-fordøjelse i nærværelse af visse oligodeoxynukleotider. Alternativt kan DNA-bl andingen uden rensning delvist fordøjes med DNase og der kan isoleres oligodeoxynukleotider med en kædelængde mellem 9 og 100.

15 Eksempel 3

Et DNA-syntetiseringsmiddel (Applied Biosystem Company) anvendtes til syntetisering af mi nus-strenget DNA af det umiddelbart tidlige gen (Vmw 175 eller ICP 4) af herpes simplex virus. I dette eksempel syntetiseredes DNA-sekvensen S'-CGC.AGC.CTC.TTG.TTC.GTC.GC-S', som hybridiserer 20 med mRNA af Vmw 175. Dette deoxynukleotid er eicosamert og betegnes herefter kort 20 A.

Eksempel 4

Et DNA-syntetiseringsmiddel (Applied Biosystem Company) anvendtes 25 til syntetisering af minus-strenget DNA af det umiddelbart tidlige gen (Vmw 12) af herpes simplex virus. I dette eksempel syntetiseredes DNA-sekvensen 3'-GCA.CCC.GGG.ACC.TTT.ACC.GC-5', som hybridiserer med mRNA af Vmw 12. Dette deoxynukleotid er eicosamert og betegnes herefter kort 20 B.

30

Eksempel 5

Et DNA-syntetiseringsmiddel (Applied Biosystem Company) anvendtes til syntetisering af minus-strenget DNA af NS 1 genet af influenza virus. I dette eksempel syntetiseredes DNA-sekvensen 3'-CTA.AGT.TTG.

35 TGA.CAC.AGT.TCA-5', som hybridiserer med mRNA af NS 1. Dette deoxynukleotid er heneicosamert og betegnes herefter kort 20 C.

M I - ΓΤΊ^^" — DK 168061 B1 13

Eksempel 6

Dette eksempel angår et forsøg, ved hvilket det bliver bekræftet, at oligodeoxynukleotidet inhiberer syntesen af virus-protein in vitro.

Tabel I belyser den inhibitoriske virkning af 20 A på Vmw 175 dan-5 nelse og den tilsvarende cytopatiske virkning (syncytium-dannelse) af HSV 1.

Tabel I

20 A/fordybning Relative mængder Relative cytoptiske af Vmw 175 virkninger/syncytium) 10 _ ------------- 1 1 33,6 jug 0,48 0,35 5 BHK-celler (1,5 x 10 ) blev anbragt i hver pladefordybning (1,5 cm 15 i diameter) af en Limbro-plade og der tilsattes MEM med 10% kalveserum. Cellerne inkuberedes dernæst i en 5% COg-atmosfære ved 36°C. Herefter inficeredes cellerne med 5 dele HSV-1 i nærværelse eller fravær af 20 A.

Efter 5 timer fjernedes mediet. Cellerne bragtes dernæst i 1 time i kon- 35 takt med S-methionin (100 μΟί/μΊ) og 20 A blev afbrudt, og proteinerne 20 analyseredes ved polyacrylamidgel-elektroforese efterfulgt af autoradiografi. Til vurdering af den relative cytopatiske virkning var forsøgsbetingelserne identiske med de ovenfor anførte med undtagelse af, at antallet af syncytia blev talt 13 timer efter inficeringen. Der iagttoges ingen formindskelse af cellulær proteinsyntese under disse betingelser.

25

Eksempel 7

Dette eksempel angår et forsøg, ved hvilket det blev bekræftet, at oligodeoxynukleotidet bliver optaget af celler.

Forsøget viser, at det enkelt-strengede oligodeoxynukleotid 20 A 30 faktisk trænger ind i dyrkede celler. BHK-celler (hamsterungenyreceller, 4,4 x 10^ celler) inficeredes med 7,6 x 10^ PFU af HSV-l/ml. Kontrolceller blev ikke inficeret, men fik den samme mængde dyrkningsmedium. Cellerne inkuberedes i 3 timer i en C09-inkubator ved 37°C. Efter inkuba- ^ 32 tionen udsattes cellerne for 7,66 p mol af P-mærket 20 A. Efter udsæt-35 ningen for mærket 20 A fjernedes dyrkningsmediet og cellerne vaskedes to gange med 0,3 ml PBS.

Cellerne henstod herefter i 30 minutter ved 36°C i en opløsning indeholdende 0,1 M NaCl, 33 μΜ ZnC^, 3360 enheder nuklease SI og 33,3 14 DK 168061 B1 mM natriumacetatpuffer (pH 4,5).

Herefter vaskedes cellerne to gange med den ovenfor beskrevne puffer, men uden nuklease SI. De vaskede celler blev sprængt i 0,3 ml opløsning indeholdende 10 mM EDTA, 0,6% natriumdodecylsulfat og 10 mM 5 tris-HCl puffer (pH 7,5). På dette tidspunkt måltes TCA-uopløselig, nuklease Sl-følsom, radioaktiv 20 A. Det blev fundet, at mindst 4,68 x 3 10 molekyler af 20 A var blevet optaget per celle i udsætningsperioden på 8 timer. Den virkelige mængde er sandsynligvis 10 gange større end 32 denne værdi p.g.a. den hurtige hydrolyse af P-terminale phosphater.

10

Det efterfølgende eksempel 8 belyser, at 20 A har en inhiberende virkning på formeringen af virus.

Eksempel 8 5 15 Ca. 1,5 x 10 BHK-celler blev anbragt i hver pladefordybning (1,5 cm i diameter) af en Limbro-plade. Disse celler inkuberedes i 5% C02 ved 36°C i 48 timer og inficeredes med HSV-1 (7,6 x 104 PFU/ml) i 160 μΐ MEM. Inficeringen gennemførtes i 3 timer ved 36°C i 5% COg. Efter inficeringen tiIførtes 20 A til de inficerede celler. Efter 8 timer udskif-20 tedes mediet med normal MEM med 10% kalveserum. 15 timer efter inficeringen høstedes dyrkningsvæsken og virus-titeren måltes. Resultaterne er vist i tabel II nedenfor.

Tabel II

25 Mængde af 20 A/fordybning Relativ mængde af virus 0 100 0,112 jig 45 0,224 μg 35 30

Eksempler 9-13 angår forsøg, ved hvilke det bliver bekræftet, at oligodeoxynukleotidet inhiberer ødelæggelsen af dyreceller p.g.a. virus in vitro.

35 Eksempel 9 c (a) Ca. 1,5 x 10 BHK-celler anbragtes i hver fordybning (1,5 cm i diameter) af en Limbro-plade til celle-dyrkning. Cellerne inkuberedes i 47 timer ved 36°C i 5% C02 og inficeredes dernæst med 160 /il HSV-1 (7,6 DK 168061 B1 15 x 104 PFU/ml) i 3 timer ved 36°C. Til disse inficerede celler sattes et kompleks af calciumphosphat og 20 A i forskellige mængder. Mediets calcium-koncentration varierede fra 1,36 mmol til 24,8 mmol i afhængighed af koncentrationen af 20 A. Komplekset fremstilledes som beskrevet af 5 Ruddle-gruppen (Loiter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 79 422, 1982). De inficerede celler udsattes for 20 A i 8 timer. Dyrkningsmediet fjernedes dernæst og erstattedes af et normalt dyrkningsmedium uden 20 A og cellerne dyrkedes i yderligere 13 timer.

(b) Kontrol cell erne behandledes på identisk måde med undtagelse af 10 tilsætningen af 20 A (Ca-phosphat-kontrol).

(c) Som yderligere kontrol fremstilledes en inficeret kultur, som hverken behandledes med Ca-phosphat eller 20 A (viruskontrol). De ovenfor fremstillede vævskulturceller (a), (b) og (c) fikseredes, plettedes og antallet af syncytia taltes.

15 Resultatet af dette forsøg er vist i figur 1, hvor X-aksen (abscissen) står for mængden af DNA i /ig, der blev tilsat til hver fordybning (dvs. "/ig DNA/fordybning"), og Y-aksen (ordinaten) står for antallet af syncytia i procent (dvs. "% antal af syncytia"), der dannes i en cellekultur i sammenligning med den i tilfælde af forsøg (c) for "viruskon-20 trol" opnåede værdi, som i dette tilfælde altid sættes som 100 og hvori en kurve, der er tegnet som en gennemgående linie (a) (--), viser det med forsøg (a) opnåede resultat, mens en kurve tegnet som en stiplet linie (b) (----), viser det ved forsøg (b) opnåede resultat. Som vist i figur 1, i nhi berede 20 A syncytium-dannelsen betydeligt. Calciumphosphat 25 eller calciumchlorid havde ingen indflydelse på antallet af syncytia.

Eksempel 10 c (a) Ca. 1,5 x 10 BHK-celler per fordybning (1,5 cm i diameter) anbragtes på en Limbro-plade. Cellerne inkuberedes ved 36°C i 47 timer 30 under 5% COg. Til disse celler sattes 160 /il HSV-1 (7,6 x 10^ PFU/ml) og inficering blev tilladt i 3 timer ved 36°C, Til disse inficerede celler sattes forskellige mængder 20 A i form af et calciumchloridkompleks til en calciumion-slutkoncentration på 4,55 mM. Behandlingen fortsattes i 8 timer. Cellerne inkuberedes dernæst i yderligere 14 timer.

35 (b) Derudover fremstilledes en kultur, som var identisk med den oven for under (a) beskrevne, med undtagelse af, at der fremstilledes og inkuberedes et oligodeoxynukleotid, som ikke er beslægtet med HSV-1 sekvens 5'-CAC.GAC.AGA.GGG.CGA-3'. Alle andre betingelser var identiske DK 168061 Bl 16 med tilfælde (a).

(c) Der fremstilledes og inkuberedes en lignende kultur, hvori 20 A blev udeladt, under de samme betingelser som ovenfor. Den betegnes her som "viruskontrol".

5 De ovenfor i (a), (b) og (c) beskrevne celler fikseredes, plettedes og antallet af syncytia taltes. Resultaterne af dette forsøg er vist i figur 2, hvor X-aksen (abscissen) står for mængden af DNA i øg, der blev tilsat til hver fordybning (dvs. "øg DNA/fordybning"), og Y-aksen (ordinaten) står for antallet af syncytia i procent (dvs. "% antal af syncy-10 tia"), der dannes i en cellekultur i sammenligning med den i tilfælde af forsøg (c) for "viruskontrol" opnåede værdi, som i dette tilfælde altid sættes som 100 og hvori en kurve, der er tegnet som en gennemgående linie (a) (--), viser det med forsøg (a) opnåede resultat, mens en kurve tegnet som en stiplet linie (b) (----) viser det med forsøg 15 (b) opnåede resultat.

Som vist i figur 2, har 20 A en inhiberende virkning på antallet af syncytia, der fremstilles af HSV-1. Af dette forsøg kan man konkludere, at 20 A inhiberer syncytium-dannelsen i nærværelse af 4,55 mM calcium-ion. Oligodeoxynukleotider, som ikke er beslægtede med de kendte DNA-20 sekvenser af herpes simplex virus, havde ingen inhibitorisk virkning.

Det fremgik klart af dette forsøg, at minus-strengen af herpes simplex virus DNA specielt inhiberer den cytopatiske virkning af herpes simplex virus.

25 Eksempel 11 I eksempel 9 belystes den virkning, der opnås ved anvendelse af den syntetiske eicosamer 20 A, der er relateret til minus-strengen af HSV-DNA. Dette forsøg angår effektiviteten af klonet herpes simplex DNA. Ved at anvende den HSV-1 DNA-holdige pBR 322 vektor (1,45 megadalton, opnået 30 ved fordøjelse af HSV-1 DNA med BamHI), var det muligt at inhibere syncytium-dannelsen ved HSV-1. I dette forsøg blev HSV-1 DNA ikke udskåret fra rekombinant-plasmidet. Det denaturerede og delvist fordøjede rekom-binant-pBR 322, der indeholdt HSV-1 DNA (0,16 øg), blev anbragt i hver af Limbro-pladens fordybninger som i eksempel 9. Virkningen undersøgtes 35 som beskrevet i eksempel 9 og der iagttoges en inhibering af syncytium-dannelse. Som kontrol for dette forsøg anvendtes DNA af pBR 322 alene. I dette kontrolforsøg blev ingen inhibering fundet.

t --- DK 168061 B1 17

Eksempel 12

Dette eksempel belyser en synergetisk virkning af en blanding af oligodeoxynukleotider.

Ca. 1,5 x 105 BHK-celler blev anbragt i hver fordybning (1,5 cm i 5 diameter) af en Limbro-plade. Cellerne inkuberedes i 5% COg ved 36°C i 47 til 48 timer og inficeredes med HSV1 (7,6 x 10* PFU/ml) i 160 /il MEM. Inficeringen gennemførtes i 3 timer ved 36°C i 5% C02. Efter inficeringen opløstes 20 A alene eller i blanding med 20 B (224 : 1) i et opløsningsmiddel og 0,3 ml af denne opløsning tilførtes cellerne i nærværelse 10 af 4,55 mM calciumion. Disse celler udsattes for 20 A og 20 B i 8 timer.

Modsat blev cellerne behandlet på samme måde som beskrevet ovenfor, med undtagelse af, at 20 A og 20 B manglede. Dette betegnes her som viruskontrol.

Cellerne fikseredes, plettedes og antallet af syncytia taltes.

15 Resultaterne af disse forsøg er vist i figur 3, hvor X-aksen (abscissen) står for mængden af DNA i /ig, der blev tilsat til hver fordybning (dvs.

"/tg DNA/fordybning"), og Y-aksen (ordinaten) står for antallet af syncytia i procent (dvs. "% antal af syncytia"), der dannes i en cellekultur i sammenligning med den i tilfælde af forsøg (c) for "viruskontrol" op-20 nåede værdi, som i dette tilfælde altid sættes som 100 og hvori en kurve, der er tegnet som en gennemgående linie kaldet "20 A" (--), viser det resultat, der opnås ved forsøget under anvendelse af 20 A alene, mens en kurve tegnet som en gennemgående linie kaldet "20 A + 20 B (224 : 1)" (--) viser det resultat, der opnås ved forsøget 25 under anvendelse af 20 A og 20 B i et forhold på 224 :1. Som vist i figur 3, var den iagttagne in vitro virkning stærkere, når blandingen af 20 A og 20 B blev anvendt, sammenlignet med det tilfælde, hvor der anvendtes 20 A alene. Af dette resultat kan der konkluderes, at den samtidige anvendelse af minus-strenget DNA svarende til en portion med DNA-30 sekvens, som er forskellig fra den minus-strengede DNA af herpes simplex virus kan forøge dens virksomhed som anti-viralt middel signifikant.

Eksempel 13

Dette eksempel belyser virkningen af (-)-strengede oligodeoxynukle-35 otider af NS 1 på den cytopatiske virkning af influenza virus. Resultaterne af dette forsøg er vist i tabel III og fremgangsmåden i forsøget er beskrevet mere detaljeret nedenfor.

DK 168061 B1 18

Tabel III

Oligodeoxynukleotider Relativ værdi i forhold til (/ig/ml) antallet af levedygtige celler 5 O 0,21 0,02 0,49 1,30 0,49 5,00 0,49 10 Kitazato-svinenyre (SKK) celler (1,5 x 10^/0,1 ml) dyrkedes i MEM, der indeholdt 5% kalvefosterserum, og anbragtes i hver pladefordybning (0,5 cm i diameter) af en mikroplade. Cellerne inkuberedes i 24 timer ved 35,5°C i 5% CO^-atmosfære i det ovenfor nævnte medium. Mediet fjernedes dernæst og der sattes 100 /il af et medium, som indeholdt forskel -15 lige mængder af oligodeoxynukleotidet (20 C), til hver fordybning og cellerne inkuberedes i 24 timer i 5% CO^-atmosfære. Opløsningen fjernedes dernæst og der sattes 50 μ1 af et medium, som indeholdt 10 TCID50 enheder af influenza A, til hver fordybning. Derudover sattes 50 øg af et dyrkningsmedium, der indeholdt forskellige mængder 20 C, til hver 20 fordybning. Cellerne inkuberedes i yderligere 48 timer. Mediet fjernedes dernæst og 100 /il Hank's opløsning indeholdende 0,1% neutralt rødt sattes til hver fordybning og cellerne inkuberedes i 1 time ved 35,5°C i en 5% C02-inkubator. Opløsningen fjernedes dernæst og cellerne vaskedes med 10 /il 80% ethanol efterfulgt af tilsætningen af 50 μΐ 0,1 N HC1. Det re-25 lative antal levedygtige celler måltes ved optisk absorption ved 577 nm med "ELISA". De levedygtige celler optager neutralt rødt, mens de ikke levedygtige celler ikke gør det. Derfor er antallet af levedygtige celler højere, jo højere den optiske tæthed er.

30 De efterfølgende eksempler 14-20 viser in vivo effektiviteten, når man anvender oligodeoxynukleotiderne som et anti-viralt middel.

Eksempel 14

Ca. 1 x 104 PFU af HSV1 (F-stamme) i 30 /il MEM-suspension injicere-35 des i det intra-cerebrale hulrum på 3 uger gamle BALB/C-mus. Virus-suspensionen indeholdt forskellige mængder 20 A. Desuden injiceredes 200 /il MEM-opløsning indeholdende 1% penicillin, streptomycin og 2 mM glutamin-syre og forskellige mængder 20 A dagligt i 3 dage i det intra-peritonea- i > DK 168061 B1 19 le hulrum, begyndende én dag efter injektionen med HSV-1. Den procentvise dødelighedsrate beregnedes på syvende-dagen. Resultatet af dette forsøg er vist i figur 4, hvor X-aksen (abscissen) står for mængden af DNA i pq injiceret i hver mus (dvs. "/tg DNA/mus") og Y-aksen (ordinaten) 5 står for dødelighedsraten i procent i sammenligning med den i "kontrolgruppen" opnåede rate, hvor mus fik injiceret den samme opløsning, men ingen 20 A, idet dødelighedsraten i "kontrolgruppen" altid sættes til 100. Som vist i figur 4 blev dødelighedsraten reduceret i afhængighed af mængden af den administrerede 20 A.

10 Den grafiske afbildning viser dødelighedsraten udtrykt i procent i sammenligning med kontrolmusegruppen, som ikke modtog 20 A.

Eksempel 15

Ca. 1 x 104 PFU af HSV-1 (F-stamme) i 30 /il MEM-opløsning 15 indeholdende forskellige mængder 20 A, injiceredes i det intra-cerebrale hulrum på 3 uger gamle BALB/C-mus. Desuden injiceredes 200 /il af en opløsning indeholdende forskellige mængder af 20 A, 1% penicillin og streptomycin og 2 mM glutaminsyre intra-peritonealt én gang dagligt, begyndende én dag efter injektionen af HSV-1.

20 Behandlingen fortsattes i 6 efter hinanden følgende dage.

Dødeligheden blandt musene mellem 64 og 65 timer efter injektionen af HSV-1 blev undersøgt. Resultaterne er vist i tabel IV.

Tabel IV

25 Dosering Dødelighed blandt musene 5/19 0,224 /ig/mus 0/9 2,240 /ig/mus 0/10 30

Som vist i denne tabel døde i kontrolgruppen uden administrering af 20 A 5 mus ud af det samlede antal på 19 mus. Modsat var mus, som enten modtog 0,224 /ig 20 A eller 2,240 /ig 20 A, ikke døde på dette tidspunkt (19 mus ialt blev behandlet i de to tilfælde).

Eksempel 16

Ca. 5 x 104 PFU af HSV-1 (F-stamme) i 30 /il MEM-opløsning indeholdende forskellige mængder 20 A injiceredes i det intra-cerebrale hulrum 35 DK 168061 B1 20 på 3 uger gamle BALB/C-mus. Dødeligheden blandt musene mellem 64 og 68 timer eller 71 til 78 timer efter injektionen undersøgtes. Resultaterne er vist i tabel V.

5 Tabel V

Dosering Dødeligheden mellem Dødeligheden mellem 64 og 68 timer 71 og 78 timer 3/10 3/10 10 1,12 øg/mus 0/10 2/10 11,2 /ig/mus 0/10 0/10

Som vist i denne tabel, døde i kontrolgruppen, som ikke modtog 20 A, 3 mus ud af et samlet antal på 10 mus. Modsat var dødeligheden blandt 15 musene i den gruppe, som modtog virus, i nærværelse af 20 A meget reduceret.

Eksempel 17

Ca. 5 x 10^ PFU af HSV-1 (F-stamme) i 30 /ti MEM-opløsning indeholdende forskellige mængder 20 A injiceredes i det intra-cerebrale hulrum 20 på 3 uger gamle BALB/C-mus. Desuden injiceredes fra dagen efter injektionen af de 30 μ\ MEM-opløsning, som indeholdt en given mængde 20 A, 1% penicillin og streptomycin og 2 mM giutaminsyre i det intra-cerebrale hulrum.

Behandlingen forsattes i 2 dage og dødeligheden blandt musene 25 undersøgtes i forskellige perioder efter injiceringen af virus. Resultaterne er vist i tabel VI.

Tabel VI

30 Dosering Dødelighed mellem 64 og 68 timer 71 og 78 timer 88 og 92 timer 1/10 3/10 7/10 1,12 Mg/mus 0/20 2/20 5/20 35

Som vist i denne tabel var dødeligheden blandt kontrolmusene, som ikke modtog 20 A, betydeligt højere end blandt de mus, der modtog 20 A. Selvom effektiviteten af 20 A tilsyneladende aftager mellem 88 og 92 i — r»-—^—— ----- t DK 168061 B1 21 timer efter injektionen, var dødeligheden stadig højere blandt kontrol -musene selv under disse betingelser.

Eksempel 18 5 Ca. 1 x 106 PFU af HSV-1 (F-stamme) i 200 /il MEM-opløsning inde holdende 1,2 /tg 20 A injiceredes i det per i toneal e hulrum på 3 uger gamle BALB/C-mus.

Desuden injiceredes ca. 3 eller 2 timer før HSV-l-injektionen og én dag efter HSV-l-injektionen 200 /il MEM-opløsning indeholdende forskel-10 lige mængder af 20 A intra-peritonealt i de inficerede mus. Intra-peritoneal injektion af 20 A fortsattes i 2 dage. Dødeligheden mellem 211 og 259 timer efter HSV-l-injektionen undersøgtes. Resultaterne er vist i tabel VII.

15

Tabel VII

Dosering Dødelighed efter Dødelighed efter 211 timer 259 timer 20 _ 1/10 2/10 0,224 /tg/mus 0/10 0/10

Som vist i denne tabel døde én ud af et samlet antal på 10 (211 25 timer efter injektionen) eller 2 ud af et samlet antal på 10 (259 timer efter injektionen) mus, når der ikke administreredes 20 A. Modsat døde musene, som modtog 0,224 /ug 20 A, ikke under identiske betingelser.

Eksempel 19 30 Hornhinden på 3 uger gamle BALB/C-mus såredes ved at skrabe den 5 gange med en skarp injektionsnål. Til denne sårede hornhinde administreredes 30 μΐ MEM-opløsning indeholdende 1% penicillin, streptomycin og 2 mM glutaminsyre 5% kalveserum og 3 x 10 PFU af HSV-1 (F-stamme). De behandlede mus opdel tes i fire grupper (A), (B), (C) og 35 (D) som vist nedenfor og øjnene på disse mus blev undersøgt og resultaterne optegnet fotografisk.

(A) På hornhindemembranen hos disse mus dryppedes 10 μΐ MEM-opløsning indeholdende 22,4 μ$ 20 A/ml 2 timer før administrering af DK 168061 B1 22 HSV-1 (F-stamme). Desuden blev denne behandling givet hver anden dag begyndende fra næstedagen efter administrering af HSV-1 (F-stamme).

Desuden modtog disse mus dråber af en opløsning indeholdende cortisonacetat (2 mg/kg muselegemsvægt) 5 timer før injektionen af HSV-1 5 (F-stamme). Cortisonbehandlingen fortsattes også hver anden dag.

(B) Nusene modtog i øjnene 10 /ti MEM-opløsning indeholdende 22,4 /tg 20 A/ml 2 timer før administrering af HSV-1 (F-stamme). Behandlingen med 20 A fortsattes hver anden dag.

(C) Musene modtog 30 /ti af en opløsning indeholdende cortison-10 acetat (2 mg/kg legemsvægt) som beskrevet i (A).

(D) Musene modtog på deres hornhindemembran 10 /ti MEM-opløsning 2 timer før HSV-l-behandlingen (F-stamme). Desuden fortsattes fra næstedagen efter HSV-l-behandlingen (F-stammen) en lignende behandling med MEM-opløsning hver anden dag.

15 Øjnenes og øjenområdets tilstand undersøgtes hos hver mus med speciel opmærksomhed på betændelse og lukning af øjne med patologiske symptomer. Undersøgelsen udførtes på fjerde-, syvende- og tolvtedagen efter behandlingen. Musene, som tilhørte gruppe (A) og gruppe (B), havde meget færre patologiske symptomer i øjnene og det omgivende område i 20 sammenligning med de mus, der tilhørte gruppe (C) og gruppe (D), som ikke modtog 20 A.

Endvidere kan det konkluderes, at effektiviteten af 20 A ikke blev påvirket af administreringen af cortison.

25 De efterfølgende eksempler 20-22 belyser fremstillingen af forskellige typer af anti-virale midler ifølge opfindelsen.

Eksempel 20

Et oligodeoxynukleotid, der er identisk med den i eksempel 3 opnåe-30 de 20 A, syntetiseres iht. triestermetoden (under anvendelse af en tri-ester af de tilsvarende nukleotider i flydende fase). Til 2 g således syntetiseret 20 A sættes en isotonisk MEM-opløsning til et slutvolumen på 1 liter opløsning til injektion, og opløsningen fyldes på ampuller til fremstilling af injektionspræparaterne. Dette injektionspræparat 35 indeholder 2 mg 20 A per ml og administreres, når et symptom iagttages, subkutant i en dosis på 1-5 ml så tæt som muligt ved den inficerede del.

DK 168061 B1 23

Eksempel 21

Et oligodeoxynukleotid, der er identisk med den i eksempel 4 opnåede 20 B, syntetiseres iht. triestermetoden. Til 10 g således syntetiseret 20 B sættes en isotonisk MEM-opløsning til et slutvolumen på 1 5 liter, som er en standardopløsning for et 1% øjendråbepræparat. Dette øjendråbepræparat påføres flere gange dagligt i en dosis på 2-3 dråber, når et symtom iagttages.

Eksempel 22 10 Et oligodeoxynukleotid, som er identisk med den i eksempel 3 opnåede 20 A, syntetiseres iht. triestermetoden. 1 g af den således syntetiserede 20 A formales til et fint pulver og dernæst tilsættes 999 g renset kakaosmør til det fine pulver. Blandingen æltes på et vandbad ved 60°C og formes dernæst til dannelse af suppositorier, som hvert 15 vejer 2 g.

Hvert suppositorium indeholder 2 mg 20 A og anvendes iht. symptomet.

De efterfølgende eksempler 23 og 24 belyser sikkerheden af det 20 anti-virale middel ifølge opfindelsen.

Eksempel 23 Når 20 A i en mængde på 100 /jg/kg administreredes intra-peritonealt til BALB/C-mus, iagttoges der ingen forandring af forsøgsdyret.

25

Eksempel 24

Som en test til bekræftelse af den i de foregående eksempler beskrevne virkning udførtes samme forsøg som beskrevet i eksempel 19 med undtagelse af, at der ikke anvendtes HSV-1. I denne test blev der ikke 30 fundet nogen forskel mellem gruppen af forsøgsdyr, til hvilke der var blevet administreret 20 A, og sådanne, til hvilke der ikke var blevet administreret 20 A.

De foregående eksempler taget i betragtning, er det åbenlyst, at de anti-virale midler ifølge den foreliggende opfindelse er sikre i en 35 effektiv dosis af oligo- og polydeoxynukleotiderne.

De efterfølgende eksempler er optaget heri for at vise, at in vitro proteinsyntesesystemet faktisk bliver inhi beret ved at hybridisere DK 168061 B1 24 mRNA'en med (-)-strenget oligodeoxynukleotid. Disse resultater underbygger det teoretiske grundlag for den foreliggende opfindelse.

Eksempel 25 fReferenceeksempel 1) 5 Dette eksempel illustrerer inhiberingen af polypheny!al aninsyntese, som er afhængig af poly U, med oligodeoxyadenylsyre.

Reaktionsblandingen (40 mikroliter) indeholdt 140 mikrogram poly U, 14 5 C -phenylalanin (10 cpm, 300 mikrocurie/mikromol, E. coli ekstrakt (fremstillet iht. Nirenberg og Mathaei, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 47 10 1588 (1961)), 13 mM Mg acetat, 1 mM ATP, 1 mM creatinphosphat, 1 mikrogram creatinphosphokinase, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og forskellige mængder oligodeoxyadenylsyre. Reaktionsblandingerne anbragtes i 1,5 ml Eppendorf-rør og inkuberedes ved 37°C i 30 minutter. Mængden af syntetiseret polyphenylalanin måltes ved tælning af radioaktiviteten, der var 15 uopløselig i en varm (95°C) 10% trichloreddikesyre. Tælningen gennemførtes med en væskescinti1lationstæller. Den procentuelle inhibering beregnedes til sammenligning med værdien af polyphenylal aninsyntese i fravær af oligodeoxyadenylsyren. Resultaterne er vist i tabel VIII.

20 Tabel VIII

Inhibitor Dosering Inhibering af (mikrogram) polyphenylalanin- syntese (%) 25 _ kontrol - 0 polydeoxyadenylsyre 50 98 oligodeoxyadenylsyre 30 (10 nukleotider) 100 88 ol igodeoxyadenylsyre (9 nukleotider) 100 89 oligodeoxyadenylsyre (8 nukleotider) 100 15 35 oligodeoxyadenylsyre (7 nukleotider) 100 0 i DK 168061 B1 25

Som vist i tabel VIII, er polydeoxyadenylsyren, som hybridiserer med polyuridyl syre, en bemærkelsesværdigt stærk inhibitor af polyphenyl-alaninsyntese. Det kan ses af denne tabel, at oligodeoxyadenylsyre med en kædelængde på mere end 9 nukleotider har en stærk inhibitorisk virk-5 ning.

Eksempel 26 (Referenceeksempel 2)

Det nedenfor beskrevne forsøg demonstrerer, at oligodeoxynukleotirier kan inhibere eukaryotisk mRNA-aktivitet ved at danne et hybrid med 10 denne mRNA. Reaktionsblandingen (30 /il) indeholder 4,2 mM calciumphos-phat, 2 mM dimethyl thiothreitol (DTT), 0,08 mM af hver aminosyre (med undtagelse af methionin), 6 mM calciumacetat, 8 mM magnesiumacetat, 4,5 35 /tg spermidin, 0,1 /iCi S-methionin og 10 /ti af et kanin-reticulocyt-ekstrakt fremstillet iht. Jackson og Pelham (Europ. J. Biochem, 67, 247-15 256, 1976). Inhibitoren opløstes i 21 mM HEPES-opløsning og sattes til reaktionsblandingen som vist i tabel IX.

Tabel IX

20 Inhibitor Dosering % inhibering % inhibering (/tg) af α-globin- af /3-globin- syntese syntese

Kontrol - - 0 0

25 genom DNA

af a-globin 0,06 60 0

genom DNA

af Ø-globin 0,06 0 65 kalvetymus- 30 DNA 0,06 10 10 15 oligodeoxy-nukleotid af ot-globin genom DNA 0,06 88 0 35 15 oligodeoxy- nukleotid af M 13 0,06 5 2 DK 168061 B1 26

Som vist i tabel IX inhiberer (-)-strenget DNA af α-globin specifikt a-globin-syntesen, mens (-)-strenget DNA af /J-globin specifikt inhiberer Ø-globin-syntesen. Der iagttoges ingen inhibering af betydning med kalvetymus-DNA. Ud fra disse iagttagelser kan man konkludere, at DNA 5 af eukaryotisk gen (-streng) specifikt inhiberer syntesen af proteinet, som dette gen koder for. Oligodeoxynukleotidet med en kædelængde på 15, der svarer til den NHg-terminale aminosyresekvens af α-globin, inhibere-de syntesen af α-globin. Denne iagttagelse indikerer, at enkelt-strenget DNA (-streng) med en kædelængde på kun 15 er tilstrækkelig til den spe-10 cifikke inhibering af syntesen af dens respektive protein. Kontrol-oli-gonukleotidet (M 13 fag DNA med en kædelængde på 15 nukleotider) udviste ingen inhibitorisk virkning af betydning.

Det må forstås, at fagmanden kan variere de foregående repræsentative eksempler, både hvad angår virus-type og kodningsregionen, inden 15 for opfindelsens rammer, og i princippet opnå de samme resultater.

i

Claims (10)

1. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, AT det i det væsentlige består af en effektiv anti-viral mængde af et oligo- eller polydeoxynu-kleotid, som har en sekvens, der er identisk med en del af DNA, som er 5 hybridiserbar med mRNA hos herpes-virus, hvilket oligo- eller polydeoxy-nukleotid kan hybridiseres med mRNA'en, samt en farmaceutisk acceptabel bærer.

2. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at virussen er en herpes-simplex-virus.

3. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at virussen er en herpes-simplex-virus-1.

4. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at oligodeoxynukleotid-et eller polydeoxynukleotidet er hybridiserbart med øjeblikkeligt, tidligt mRNA fra herpes-simplex-virus.

5. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at oligodeoxynukleotiri et eller polydeoxynukleotidet er hybridiserbart med et non-strukturelt gen hos herpes-virus.

6. Præparat ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at det non-strukturelle gen er ICP 4.

7. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at oligodeoxy- nukleotidet eller polydeoxynukleotidet har sekvensen 3'-CGC.AGC.CTC.TTG.TTC.GTC.GC-5'.

8. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at oligodeoxy-nukleotidet eller polydeoxynukleotidet har sekvensen 3'-

25 GCA.CCC.GGG.ACC.TTT.ACC.GC-5'.

9. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det foreligger i form af en injektionsopløsning, en lokal tilberedning eller en opløsning af øjendråber.

10. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det indeholder en 30 blanding af oligodeoxynukleotiderne eller polydeoxynukleotiderne. 35