LU85594A1 - Oligodeoxynucleotide und polydeoxynucleotide,die mit einem bereich einer bei der virusvermehrung synthetisierten mrna hybridisieren und ihre anwendung als therapeutische wirkstoffe - Google Patents

Description

Γ~ _ • I — _ î _ » ή* ~Â 5 Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Oligo- und Polydeoxynucleotide , die mit einem Bereich einer bei der Virusvermehrung synthetisierten mRNA {Messenger RNA) hybridisie-* ren und ihre Anwendung als therapeutische Wirkstoffe. Insbesondere betrifft die Erfindung die Anwendung der genannten ^0 Oligo- und Polydeoxynucleotide als die Virusvermehrung in-hybierende Wirkstoffe.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Arzneimittel/ die entweder ein einzelnes oder ein Gemisch der vor-; 15 stehend genannten Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide sowie ein pharmazeutisch verträgliches Excipiens enthalten. Sie v s bezieht sich darüber hinaus insbesondere auf Arzneimittel zur Behandlung von Virusinfektionen/ die die vorstehend ~ genannten Substanzen enthalten. Derartige Arzneimittel können beispielsweise als Injektions-Lösung/ als Augentropfen oder als Suppositorien konfektioniert werden. Die genannten Arzneimittel können so eingesetzt werden, daß die verabreichte Wirkstoffmenge entweder 1 bis 20 000 μg pro kg und

Tag beträgt.

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Bislang werden zur Behandlung von Viruskrankheiten chemisch . synthetisierte Arzneimittel und Antibiotika als antivirale

Wirkstoffe zur Inhibition der Virusvermehrung verwendet.

Das antivirale SDektrum der chemisch synthetisierten 30

Arzneimittel ist jedoch verhältnismäßig schmal und häufig haben derartige Arzneimittel schädliche Nebenwirkungen. Andererseits haben die verwendeten Antibiotika den Nachteil, daß ständig neue Antibiotika sowie Anstrengungen zur

Verminderung jealicher schädlicher Nebenwirkungen dieser Anti-* 35 ~ biotika erforderlich sind, denn im Laufe der Zeit werden die Viren resistent und schließlich immun gegenüber den verwendeten Antibiotika.

• _ 2 - ,£ 1 in Rahmen der neueren Entwicklung der Biotechnologie, insbe sondere der Gentechnologie, wurde die Identifizierung von Virus-Struttur-Genen ein großer Forschungsbereich innerhalb der Studien von Mikroorganismen. 1977 beschrieben 5 S.C. Inglis et al. die in vitro Translation cytoplasraati-scher^aus mit Influenza A-Virus infizierten Hühner-Embryo-Fibroblasten extrahierter RITA im zellfreien Weizenkeim-Protein-Synthesesystem mit dem Ergebnis, daß die Synthese Virus-spezifischer Polypeptide, die dem hybridisierten 10 v-RNA-Segment entsprechen^vermindert ist (Virology 78,

Seiten 522 - 536 (1977)). Die in dieser Veröffentlichung beschriebenen Experimente wurden jedoch in einem zellfreien System ausgeführt und haben keine Beziehung zur Untersuchung von Arzneimitteln. Eine solche Strukturgen-15 Identifizierung wird auch beschrieben von B.M. Paterson * et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74, Seiten 4370 - 4374 (1977)). Die Experimente von Paterson et al. wurden ebenfalls im zell -freien System ausgeführt. In den beiden genannten Veröffentlichungen wurde für die Inhibition der Protein- 20 synthèse eine riesige genetische Struktur wie RNA verwendet. Im ersten Fall wurde die RNA aus Influenzaviren extrahiert, im zweiten Fall aus dem Kaninchen-ß-Globin-Clon pßG1. Es konnte nicht erwartet werden, daß eine solche riesige Struktur die intrazelluläre Proteinsynthese inhi- __ 25 biert.

1978-berichteten P.C. Zamecnik et al. das ein zur " 3'- und 51-terminalen repetitiven Sequenz des Rous- Sarco- ma-Virus (RSV) komplementäres Oligodeoxy-Nucleotid-Tri-30 decamer ein wirksamer Inhibitor der Proteinsynthese ausgehend von viraler RNA sowohl im zellfreien Weizenkeim-System ij (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 75, Seiten 285 - 288 (1978)) 1.1 euch einAÿgtt hinzu-als/ m einem in vitro-Gewebe-Kultur-System ist (Proc. ge/? Natl. Acad. Sei. USA. 75, Seiten 280 - 284 (1978)). In » 35 der ersten Referenz wird das zellfreie System noch wie I vorstehend beschrieben verwendet. Bezüglich der Verwen- jj düng von DNA ist es jedoch leicht verbessert. Hier wird

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I· - - b “ - j ein kleineres DNA-Molekül zur Inhibition -der Translation von p t f, mRNA verwendet. In der zweiten Veröffentlichuna werden I ^ Experimente durchgeführt, bei denen in einem Gewebskultur- | System zur Hemmung der Virusreplikation und der Zell-Trans- I c Formation das Tridecamer verwendet wird. Die in diesen Ar-

Fl ö I beiten zur Inhibition der Reolikation und der Trar.sfcrma- y Û tion verwendete DNA wurde nicht aus einem spezifischen * | codierenden Bereich ausgewählt, im ! gleichen Jahr berichteten auch N.D. Hastie et al., daß die i 10 Hybridisierung vo.n Globin mRNA mit ihrer korrespondierenden cDNA in einem zellfreien System spezifisch die Translation der mRNA inhibiert (Proc. Natl. Acad. Sei USA 75, Seiten 1217 - 1221 (1978)). Neu ist in dieser Arbeit lediglich, daß eine bestimmte codierende DNA-Region für die Inhibition 15 der Translation mittels Hybridisierung von mRNA ausgewählt wurde. Die dort erwähnten Versuche wurden jedoch immer noch ' in einem zellfreien System ausgeführt. Seit diesen

Veröffentlichungen im Jahre 1978 bestand ein Bedürf- nis für die Entwicklung von Arzneimitteln aufgrund der 20 genannten Hypothesen. Bis heute gibt es jedoch keine Veröffentlichungen, die die praktische Anwendung der genannten Theorie in in vivo-Experimenten beschreibt.

— 1-983 wurde eine PCT-Patentanmeldung veröffentlicht, die sich 25 auf Oligonucleotide als therapeutische Wirkstoffe und Ver-' fahren zu ihrer Herstellung bezieht (Molecular Biosystems

Inc.,* Nr. WO83/01451). In dieser Anmeldung I» wird jedoch lediglich * offenbart, daß (-)-Strang DNA aus einem bestimmten codierenden Bereich SV40-trans /30 formierte Zellen inhibierte.

// :in Worl^/hinzu- lichung gefügt* Obwohl die in vivo-Expression im Beispiel 1 dieser Veröffent-/ "* ü/ / k / häufig verwendet wird, legen die dort genannten Beschreibun gen aus dem Gesamtzusammenhang heraus betrachtet,nur in vitro- I= 35 Experimente in Zellkultur-Systemen nahe. Selbst wenn solche in vitro-Experimente als in vivo-Experimente betrachtet « -.¾ !‘ 1 t . r * Γ* _ _ Z 1 werden, fehlen doch entsprechende genaue Angaben für die

Bedingungen und sind niches weiter als die -bloße Erwähnung der Erwartung gewünschter Wirkungen. Wie dem auch sei, diese Veröffentlichung legt zum ersten Mal die Anwendung von RNA-DNA-Hyb r id i-5 sierungstechniken in einem Arzneimittel nahe, jedoch fehlen darin detaillierte Beschreibungen zur Verwendung als Arzneimittel. Deshalb ist die in dieser Patentanmeldung gegebene Lehre lediglich eine Zusairmenfassung des in den voraenannten

A

Veröffentlichungen beschriebenen Stand 'der Technik.

J°

Deshalb bestand ein dringendes Bedürfnis für einen völlig neuen antiviralen Wirkstoff zur Inhibition der Virusver-mehrung in vivo in einem lebenden Tier, dessen Funktionsprinzip auf der RNA-DNA-Hybridisierungstechnik und damit auf 1R

der Inhibition der Translation viraler mRNA beruht.

c Es wurde gefunden, daß die Virusvermehrung am Infektionsort mit einem Oligodeoxynucleotid oder einem Polydeoxynucleotid, welches mit einer während der Virusvermehrung synthetisier-ten mRNA hybridisiert, gehemmt werden kann, sofern die genannten Wirkstoffe an den Infektionsort gelangen. Durch die Verabreichung der Oligo- und Polydeoxynucleotide an Tiere mit einer Virusinfektion, wird ein antiviraler Wirkstoff bereitgestellt, der die Virusvermehrung in vivo inhibiert.

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Wie vorstehend beschrieben, war die Hybridisierung von viraler odér von Globin-RNA mit der entsprechenden DNA zur Inhibition der Protein-Synthese bekannt. Die Mehrzahl der diesbezüglichen Expérimenté wurde jedoch in einem zellfreien System

Ort durchgeführt. Ausnahmen sind Zamecnik s

Veröffentlichung- (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, Seiten 280 - 284 (1978)) sowie die Veröffentlichung von

Molecular Biosystems Inc. (PCT-Anmeldung Nr. WO 83/01451).

In letzterer wird die in vitro-Inhibition der Virus-Ver-35 ' mehrung in einem Zellkultur-System beschrieben. In den

in vitro-Experimenten von Zamecnik wird jedoch nicht DNA

_ 5 - 1 aus einem spezifischen codierenden Bereich des Virus verwendet. Der Begriff "codierender Bereich" bezeichnet dabei den i Bereich viraler Gene, der eine wichtige Rolle bei der Trans lation viraler Proteine spielt und der durch die RNA-Poly-5 merase in mRNA transkribiert wird. In der Veröffentlichung von Molecular Biosvstems Inc. werden keine genauen Hinweise auf die experimentellen Bedingungen gegeben. Der vorliegen-4 den Erfindung liegen sowohl umfassende Forschungsarbeiten und Experimente in in vitro als auch in in vivo-Systemen unter Ί0 Verwendung spezifischer Oligo- oder Polydeoxynucleotide aus einem spezifischen codierenden Bereich zugrunde. Diese haben es zum ersten Mal ermöglicht, die Virusvermehrung mittels der RNA-DNA-Hybridisierungs-Technik in einem praktisch für - die Therapie verwertbaren Ausmaß zu inhibieren. Dadurch wird ~ ff ^ die Verwendun9 bestimmter Oligo- oder Polydeoxynucleotiden als aLti ΐίοΓ/C hmzu-Arz— gefugt neimittel zur Inhibition der Virusvermehrung möglich. Damit unterscheidet sich die vorliegende Erfindung in zwei wichtigen Punkten vom Stand der Technik, nämlich dadurch, daß r. mit der Virus mRNA hybridisierende DNA aus einem spezifi- 20 sehen codierenden Bereich ausgewählt wurde und dieses ausgewählte Deoxynucleotid kurz und einzelsträngig ist und außerdem dadurch, daß die vorstehend genannten Wirkstoffe durch umfassende in vivo-Experimente bis zur praktischen

Anwendbarkeit entwickelt wurden.

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Erfindungsgemäß wird also ein Arzneimittel zur Behandlung von Virus-Infektionen bereitgestellt, welches als Wirkstoff in geeigneter Konzentration ein Oligo- oder Polydeoxy-nucleotid oder ein Gemisch dieser Moleküle zusammen mit 30 einem gebräuchlichen flüssigen Vehiculum oder Excipiens enthält. Diese Oligo- oder Polydeoxynucleotide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie komplementär zu einem Bereich einer bei der Virusvermehrung synthetisierten mRNA sind und deshalb mit dieser mRNA hybridisieren können. Vorzugsweise be-35 trägt die Länge der erfindungsgemäßen Oligo- und Polydeoxynucleotide etwa 9 bis 100 Nucleotide.

- · _ 6 _ * 1 Es wird zum ersten Mal beschrieben, daß die Proteinsynthese, ausgehend von einer synthetischen RNA als mRNA in einem in vitro-Protein-Synthese-System durch ein mit dieser synthetischen RNA hybridisierendes Oligodeoxynucleotid inhibiert 5 wird (vgl. das nachstehend beschriebene Beispiel 25) .

Oligodeoxynucleotide, die nicht mit der RNA hybridisieren, inhibierten die Proteinsynthese in diesem System nicht.

* Darüber hinaus wurde gefunden, daß de (-)-Strang der 10 α-Globin- oder ß-Globin-DNA entsprechende Oligodeoxynucleotide die Translation der zugehörenden mRNA spezifisch inhibieren (vgl. das nachstehend beschriebene Beispiel 26)-Ferner ... wurde gefunden, daß die ß-Globin-DNA in die sem in vitro-System die Translation von ß-Globin-mRNA spe-15 zifisch inhibiert. Wenn bei diesen Versuchen DNA verwendet : wurde, die nicht mit der cx-Globin-mRNA hybridisiert, wurde die Bildung von α-Globin nicht inhibiert. Ebenso wurde die t " ß-Globin-Synthese nicht durch DNA inhibiert, die nicht mit der ß-Globin-mRNA hybridisiert. Weiterführend wurde gefun-* 20 den, daß nicht nur langkettige DNA, sondern auch Oligodeoxy nucleotide in diesem System aufgrund der Hybridisierung eine stark inhibierende Wirkung haben.

Auf der Grundlage dieser Experimente wurden weitere Experi-25 mente mit Herpes-simplex-Virus (HSV)-Infektionen durchgeführt. Es wurde gefunden, daß die Anzahl von Syncytien -(Plaque-ähnliche Löcher, die durch HSV mittels der Fusion , infizierter Zellen hervorgerufen werden), die durch HSV

hervorgerufen wurden, durch Verabreichung 30 von DNA oder von Oligodeoxynucleotiden, die mit der sofort synthetisierten frühen mRNA von HSV hybridisieren an mit diesem Virus infizierten Zellen deutlich vermindert ist.

Bei den vorstehend beschriebenen Experimenten wurde CaC^ 33 und Calcium-Phosphat zusammen mit der DNA verwendet, um die DNA-Aufnähme in die Zelle zu stimulieren. In anderen ΐ - 7 - ^ Experimenten wurde jedoch gefunden, daß die Oligodeoxy- nucleotide auch ohne diese Calciumsalze aufgenommen wer-k den können und, daß sie auch unter diesen Bedingungen die

Vermehrung von HSV hemmen und die entsprechenden cvtopati-5 sehen Effekte unterdrücken (vgl: das nachstehend beschriebene Beispiel 7).

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...(/ . Aus diesen Experimenten wurde deutlich, daß (-) -Strang-DNA

zwei Wörter hin- Syncvtien durch zugefügt durch Hybridisierung an eine HSV-1-mRNA die Bildung von/ • f.ilO dieses Virus inhibiert. Aufgrund dieser Beobachtung wur de die genannte DNA HSV- in fizierten Mäusen verabreicht. Dadurch wurde gezeigt, daß eine solche DNA als antivirales Arzneimittel für die Behandlung von Virusinfektionen in vivo verwendet werden kann.

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Dabei ist bemerkenswert, daß im erfindungsgemäßen Arznei-mittel als Wirkstoff nur die (-)-Strang-DNA, die der mRNA eines bestimmten Virus-Gens entspricht, verwendet wird. Aus „ diesem Grund wird die Biosynthese zellulärer Proteine, die 20 von anderen mRNA-Molekülen gesteuert wird, nicht durch die Verwendung der vorstehend beschriebenen DNA-Moleküle beeinflußt.

Es 'gibt zwei Gruppen von Viren, nämlich DNA-Viren (Herpes simplex- -25 Virus, Adeno-Virus, Vaccinia-Virus u.a.) und RNA-Viren (Influenza-Virus, Rhino-Virus, Polio-Virus u.a.). RNA-Viren tragen entweder einzelsträngige RNA oder doppelsträngige RNA als Genom. Einzelstrang-RNA-Viren werden in solche klassifiziert, die (+)-Strang-RNA tragen und in solche, die 30 (-)-Strang-RNA als Genom tragen.

Virale Proteine müssen immer durch Translation einer viralen mRNA mit (+)-Strang-Polarität synthetisiert werden. Viren mit einem doppelsträngigen DNA-Genom bilden ausgehend von ihrer (-)-Strang-DNA ( + )-Strang-RNA (mRNA). Was die doppelsträngigen RNA-Viren betrifft, so wird (+)-strängige RNA (mRNA) - 8 ~ Π § ι ausgehend vom {-) -KNA.-St.rang gebildet. Das Genom (+)-strängi-ger RNA-Viren fungiert selbst als mRNA, während das Genom (-)-strängiger RNA-Viren als Matrize für die Bildung (+)-strängiger RNA (mRNA) dient.

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Erfindungsgemäß wird, unabhängig vom Entstehungsmechanismus der mRNA, die Translation einer Virus-mRNA und damit die Synthese viraler Proteine durch eine hybridisierende (-)-Strang-DNA inhibiert. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung .10 kann allgemein zur Inhibition der VirusVermehrung verwendet - werden. Die in den Beispielen beschriebene Verwendung von /:/ _ Herpes-simplex-Virus (Doppelstrang-DNA-Virus) und Influenzaein Wo#}: hinzu- lediglich gefug^' Virus (Einzelstrang-RNA-Virus) dient/der Erläuterung. Durch * i* ! r ' die erfindungsgemäßen Wirkstoffe kann also die Vermehrung 15 von Viren inhibiert werden, wie Influenza-Virus, Adeno-Virus, Leukämie-Virus, Dengue-Virus, Rabies-Virus, Hepatitis-Virus, Masern-Virus, Encephalitis-Virus, Parainfluenza-Virus, ' Rhino-Virus, Gelbfieber-Virus oder Epstein-Barr-Virus.

20 Damit können die erfindungsgemäßen Wirkstoffe allgemein für /Prophylaxe oder Behandlung verschiedener Virusinfektionen von • Msrisoh hin2U~Tier,/ünd Pflanze verwendet werden* Die entsprechenden Arznei-I -f mittel sind folglich sehr nützlich für verschiedene Anwen- I düngen.— 25

Aufgrund des Wirkungsprinzips der erfindungsgemäßen Wirkstoffe/ wird die Vermehrung von RNA- oder DNA-Viren sowie das Auftreten der entsprechenden cytopathischen Effekte blockiert, ohne dabei die Wirtszellen zu beeinflussen. Außer-30 dem kann durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe die Infektion von noch nicht infizierten Wirtszellen verhindert werden. Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß die alleinige Anwendung von mit der sofort synthetisierten frühen mRNA des Herpes-simplex-Virus hybridisierenden 35 Oligodeoxynucleotiden weder Auswirkungen auf normale, nicht-infizierte Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK-Zellen) noch Aus- * " _ 9 _ r 1 Wirkungen auf Mäuse hatte. Daraus wurde gefolgert, daß die

Oligodeoxynucleotide weder gefährliche Auswirkungen auf nor-« male Zellen und Tiere haben, noch daß sie die Wachstumsge- schwindigkeit dieser Zellen in irgendeiner Weise beeinflus-' 5 sen.

Die erfindungsgemäßen (-)-strängigen Deoxynucleotide kennen . durch enzymatische Hydrolyse von DNA, Denaturierung und anschließende Trennung durch Affinitätschromatographie erhal-‘10 ten werden. Andererseits können auch synthetische (-)-strängi-ge Oligodeoxynucleotide verwendet werden. Die bei den Experimenten verwendeten, erfindungsgemäßen (-}-strängigen Deoxynucleotide können also durch Anwendung verschiedener Verfahren erhalten werden.

. 15

Bei der Clonierung eines RNA-Virus-Gens kann die Reverse ^Transkriptase verwendet werden. In manchen Fällen kann virale DNA verwendet werden, die in den infizierten Zellen vorliegt . ς und vom ursprünglichen RNA-Virus-Genom abgeleitet ist. Als 20 Clonierungsvektor kann beispielsweise der Λ·-Phage (Charon-

Phage) oder das Plasmid pBR 322 verwendet werden. Um eine / einzelsträngige (-)-Strang-DNA zu erhalten, wird der M 13- * . // Phage als Vektor verwendet. Erfindungsgemäß können clonierte (riet Wörter ----------- aus dem codierenden Bereich irnz^gefugt Fragmente/des gesamten Virus-Genoms verwendet werden. Bevor-*ij 25 zugt für die Hemmung der Virus-Vermehrung und der damit einhergehenden cytopathischen Effekte ist jedoch die Verwendung von Oligo- oder Polydeoxynucleotiden,. die den sofort expri-mierten frühen Virus-Genen entsprechen. Ein rekombinanter M 13-Phage, der (-)-strängige Virus-DNA enthält, oder ein re-30 kombinanter DNA-Vektor, der doppelsträngige Virus-DNA-ent- hält, kann durch Züchtung großer Mengen von ,E. cöli-Bakterien die diese Vektoren tragen oder mit dem genannten M 13-Phagen infiziert sind, isoliert werden. Die die viralen Gene tragen-

Iden Vektoren wurden isoliert und zur Gewinnung der viralen " 35 Gene mit Restriktionsendonucleasen geschnitten. Das Gemisch der ausgeschnittenen Virus-Gene und der Vektor-DNA wurde an-| schließend einer Agarose-Gel-Elektrophorese oder einer y ' »i

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Γ -ΙΟ- ε 1 Sephadex-Säulen-Cnromatographie zur Trennung des Virusgens von der Vektor-DNA unt erzogen - Dre so erhaltenen DI1« A-Moleküle wurden durch partiellen Abbau mi t DNA-Restriktionsendo- *> nuclease oder durch Ultraschall-Behandlung verkürzt.

5 Mit Hilfe der Gel-Elektrophorese oder der Sephadex—Chromatographie wurden Virus-DNA-Fragmente einer Kettenlänge von 9 bis 100 Nucleotiden isoliert.

* JO Es wird darauf hingewiesen, daß nur der (-) -Strang der VirusDNA wirksam bei der Inhibition der Virus-Protein-Synthese ist. DNA von Vektoren, wie pBR 322 oder des h-Phagen öder von der replikativen Form des M 13-Phagen ist doppelsträngige DNA. Deshalb muß diese doppelsträngige DNA vor der Isolierung der 15 (-)-Strang-DNA zunächst in einzelsträngige DNA übergeführt werden. Zu diesem Zweck können verschiedene Methoden angewendet werden. Beispielsweise kann DNA durch 10 Minuten langes Erhitzen auf 100°C und anschließendes schnelles Abkühlen denaturiert werden.

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Aus einem Gemisch der voneinander getrennten (-)-strängigen und (+)-strängigen DNA kann.der {-)-Strang beispielsweise durch Affinitätschromatographie isoliert werden. Zu diesem Zweck wird zunächst der (+)-DNA-Strang durch Clonierung im 25 M 13-Phagen hergestellt. Dieser wird nachfolgend zur Verwendung bei der Chromatographie an einen Träger konjugiert. Ein Gemisch aus (-)- und (+)-Strang-DNA wird dann über eine Säule, die dieses Konjugat enthält, chromatographiert. Der (-)-Strang der DNA wird an diese Säu-30 le gebunden, während der ( + )-Strang durchläuft. Der gebundene (-)-DNA-Strang wird anschließend von der Säule eluiert.

In einem anderen Verfahren wird die (-)-Strang-DNA in Form von Oligo- oder Polydeoxynucleotiden durch chemische Synthe-^ 35 se erhalten.

\ ! ___· **« —_ λ i- __ ? 1 Äines der sofort exprimierten frühen Gene des Doppelstrang- DHA-tragenden Herpes-Simplex-Virus, Vmw 175, hat beispiels- \ weise die {+}-Strang-DNA-Sequenz 5’-ATG.GCG.TCG.GAG.....) und die (-}-Strang-DNA-Seguenz (3 ’ -TAC.CGC.AGC.CTC......).

! 5 Nur die {-)-Strang-DNA mit der bei TAC beginnenden Sequenz

l kann mit einer ausgehend von Vmw 175 synthetisierten mRNA

i ^ | hybridisieren. Deshalb wird für die Qligodeoxynucleotid- r

Synthese ein DNA-Fragment ausgewählt, das identisch mit einer J ' Partialstruktur des (-)-DNA-Strances ist. Das Influenza-Virus- ! 10 Genom enthält das Hämagglutinin-Gen und NS-(nicht-Struktur)-Gene. Das Hämagglutinin-Gen verschiedener Serotypen des Influenza-Virus unterscheidet sich in der RNA-Sequenz.

Deshalb wird erfindungsgemäß eine einzelsträngige DNA bevorzugt, die mit mRNA der NS-Gene hybridisiert. Die Verwendung 15 von (-)-Strang-DNA, die mit mRNA der NS-Gene hybridisiert, wird erfindungsgemäß deshalb gegenüber der Verwendung von (-)-Strang-DNA, die mit mRNA des Hämagglutinin-Gens hybridi-- siert, bevorzugt, weil das 'Hämagglutinin-Gen sehr häufig mutiert. Eine (-)-Strang-DNA, die mit mRNA des Hä >magglutinin-20 Gens eines bestimmten Influenza-Virus-Stammes hybridisiert, wird deshalb nicht mit mRNA des Hämaglutinin-Gens eines anderen Serotyps des Influenza-Virus kreuzhybridisieren.

Eine weitere Erläuterung„des Influenza-Virus-Gens NS-4 .

25 det sich in der Veröffentlichung von Lamb et al., (Cell 21,

Seite 47 (198Ό)). Die DNA-Sequenz, die mit einer mRNA des NS-1 Gens hybridisiert, ist- 5 ......ACT.TGA.CAC.AGT.GTT.GGA.ATC.

- CAT.....-3'. Deshalb wird ein Teil dieser Sequenz oder die | gesamte Sequenz ausgewählt und synthetisiert.

{ 30

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können auch gegen Viren, wie das Rous-Sarcoma-Virus, verwendet werden, die im Bereich der Viehzucht eine wichtige Rolle spielen. Beispielsweise sollte durch eine Inhibition der Expression eines der jj 35 Gene gag, pol oder env die Vermehrung dieses Virus inhibier- | bar sein. Wenn beispielsweise die Expression des gag-Gens », inhibiert werden soll, wird ein hybridisierendes DNA-Mole- 1/ ; - 12 -I * i 2 -j kül, ein Oligo- oder ein Polydeoxynucleotid verwendet, das I einen Teil der Sequenz 5'-.....AAT.CAT.CTT.TAT.GAC.GGC.TTC.

\ ' c .....-3’ enthält, ausgewählt und synthetisiert. Die genannte ; RNA-Sequenz von p19 ist ein Teil des gag-Gens.

5 ! 5 I Aus den vorstehenden Erläuterungen ergibt sich, daß im [ Prinzip, für die Inhibition der Virusvermehrung mittels j eines einzelsträngigen (-)-Strang-DNA-Moleküls ein solches [ Molekül verwendet werden muß, daß mit der MRNA des Virus . 10 hybridisiert.

Im allgemeinen bezeichnet der Ausdruck "Oligodeoxynucleo-tid" ein Molekül, das eine kleinere Anzahl von Deoxy-nucleotid-Einheiten enthält, während der Begriff "Poly-15 deoxynucleotid" ein Molekül beschreibt,das eine größere Anzahl von Deoxynucleotid-Einheiten enthält. Im Falle der Oligodeoxynucleotide ist die Anzahl der Nucleotid-Einheiten in dieser Erfindung beispielsweise bis zu 25. Deshalb können De-oxynucleotide, die mehr als 25 Deoxynucleotid-Einheiten 20 enthalten in dieser Erfindung als' "Polydeoxynucleotide" bezeichnet werden. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Behandlung von Virusinfektionen enthalten Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide, oder ein Gemisch dieser Moleküle, zusammen mit einem geeigneten flüssigen Vehiculum oder 25 Excipiens oder gegebenenfalls mindestens einem Zusatzstoff. Sie werden in an sich bekannten Verfahren beispielsweise als'Flüssigpräparate, Injektionspräparate oder Suppositorien I hergestellt. Gegebenenfalls können die Oligo- und/oder Poly deoxynucleotide entweder einzeln oder in Kombination mit 30 anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen verwendet werden. Dabei ist es selbstverständlich, daß diese anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen der antiviralen Wirkung der genannten Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide nicht entgegenstehen sollten.

v 35 S '.· 14 U /.

i * - 13 - Γ" d 1 Die Oiigo- und/oder Polydeoxynucleotide können gegebenenfalls zu äußerlich anwendbaren Präparaten konfektioniert c werden, wie Cremes, Salben, Tropfen oder Pflaster. Zu die sem Zweck werden die Oiigo- und/oder Polydeoxynucleotide mit 5 einem geeigneten pharmakologisch inerten Vehikulum oder Excipiens vermischt.

Die flüssigen Träger oder Excipientien sowie die gegebenenfalls verwendeten Zusatz-Stoffe, die erfindungsgemäß als Zu-•“•0 satz zu den antiviralen Wirkstoffen verwendet werden, sind bekannt und im Handel erhältlich.

Beispiele der in den antiviral wirksamen Arzneimitteln verwendeten flüssigen Träger-Excipientien und Hilfsstoffe sind destilliertes Wasser für Injektionszwecke, physiologische Kochsalzlösung, eine wäßrige Dextroselösung, Pflanzenöle für Injektionszwecke, Propylenglykol, Polyäthylenglykol und Benzylalkohol (für Injektions-.und flüssige Präparate); Vaseline, Pflanzenöle, tierische Fette sowie Polyäthylenglykol 20 (für äußerlich anwendbare Präparate); isotonisch wirksame Stoffe, die Löslichkeitseigenschaften verbessernde Stoffe, Stabilisatoren, Farbstoffe, Antiseptika, Gleitmittel, und ähnliche Zusatzstoffe. Bei den Injektionspräparaten ist der Wirkstoff vorzugsweise in einem sterilisierten flüssigen 25 Vehikulum gelöst. Es ist selbstverständlich, daß die vorstehend genannten verschiedenen flüssigen Vehiculie, Excipientien und Hilfsstoffe weder die antivirale Wirkung der Oligo-und/oder Polydioxynucleotide inhibieren noch diese stören sollen.

30

Die Oiigo- und/oder Polydeoxynucleotide der vorliegenden Erfindung werden zusammen mit den vorstehend genannten Vehiculi oder Excipientien und gegebenenfalls zusammen . 35 i Γ - U - b 1 mit den vorstehend beschriebenen . Hilfsstoffen in an sich bekannter Weise verarbeitet- Injek-^ tionspräparate und Suppositorien können 1 bis 10 mg der Oligo- und ./oder Polvdeoxynucleotice pro Ampulle oder 5 Kapsel enthalten. Bei menschlichen Patienten beträgt die tägliche Dosis etwa 0,1 bis 1000 mg, vorzugsweise 1 bis 100 mg (von 10 bis 20 μρ/kg bis 1000 bis 2000 pg/kg Körpergewicht) . Die jeweilige Dosis für bestimmte Patien ten hängt jedoch von einer Vielzahl von Faktoren ab, bei-•10 spielsweise von der Wirksamkeit des verwendeten bestimmten Oligo- und/oder Polydeoxynucleotids, vom Alter, vom Gewicht, vom allgemeinen Gesundheitszustand, vom Geschlecht, von der Ernährung, von der, Zeit und der Art der Anwendung, von der Abbaugeschwindigkeit, von der Kombination mit ande-15 ren in Zusammenhang damit verwendeten Medikamenten sowie von der Schwere der entsprechenden Krankheit, gegen die diese Therapie angewendet wird.

Die erfindungsgemäßen antiviralen Arzneimittel werden intra-20 venös angewendet oder direkt auf den mit dem Virus infizierten Körperteil des Patienten aufgebracht, so daß die Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide in geeigneter Menge zu den infizierten Körperteilen gelangen.

25 das Verständnis der Grundlagen der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, wird im folgenden eine kurze Zusammenfassung der Eigenschaften von für die Erfindung nützlichen Nuclein-säure-Molekülen gegeben: 1. Eigenschaften und Struktur von DNA: 3° Eine für die vorliegende Erfindung geeignete DNA muß mit einer mRNA hybridisieren, die während der Virusvermehrung erzeugt wird: - 35

i J

- 15 ~ Γ c 1 ___

j "1 mRNA

t : v I i I * 1 __|

2 ΛΛΛΛΛΛιΐ _ "J

\ («a) 5 __jC__' ( 'WVWH_ J j Kit der mRNA hybri

disierende DNA

vwwvj «J

K {b)

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.10 ΛΛΛΛΛΑΑΛΑΓνΛΛΑΛΛΛΛΛΛΑΛΛΛΛΛΛΛΛΑΛΛ/VVVi ^βΓ mRNA nicht

hybridisierende DNA

DNA (a) die ein Segment enthält, das vollständig mit der 15 mRNA hybridisiert und DNA (b) , die ein Segment enthält, das teilweise mit der mRNA hybridisiert, ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet. Dieses Merk-~ ma:l wird durch den Ausdruck "mit der mRNA hybridisieren de DNA" wiedergegeben.

' 20 2. Der für die Hybridisierung mit der mRNA gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählte DNA-Bereich muß innerhalb des Segmentes liegen, das.vollständig oder zumindest teilweise 25 (i) (Ü) wvwf Y////A V/////////A jwwvwv/wvwv. (c) (iü) , ΛΑΠΑΛΛ> jvw^y^^^'VWVi (d) 30

Im Falle von (c) wird ein Bereich (i) oder (ii) für die Hybridisierung ausgewählt, der vollständig mit der mRNA hybridisiert und damit den Anforderungen entspricht. Im Fall von (d) dagegen wird ein Bereich (iii) für die Hy-35 bridisierung ausgewählt, der außerhalb des Segmentes

liegt, welches vollständig oder teilweise mit der mRNA

L i . j - 16 - 1 hybridisiert. Der letztere erfüllt die entsprechenden An forderungen nicht.

3. Daraus ergibt sich, daB die erfindungsgemäß verwendeten 5 C'iigo- oder Pclydeoxynucleotide (A) oder (B) für die

Hybridisierung an ikRIIA und die dadurch verursachte Inhibition der Translation von mRNA, d.h. die Proteinsynthe-• se, in ihrer DNA-Sequenz identisch mit dem Bereich einer mit der mRNA hybridisierenden DNA (c) sein muß (bei-10 spielsweise 5’-.. .ACT.TGA.CAC. .. .ATC.CAT.....-3').

(λ) (2)

Ucsscss Oligo- oder Poly- deoxynucleotid 1 *· ' ; (i) ; ; (ii) • i * -.15 ; : : ·

Υ///////////////////Δ >λλλλλ, (c) DNA

y Vorzugsweise ist die Deoxynucleotidkette (A) oder (B) so -//. kurz als möglich, denn die Synthese eines kurzen Deoxy-n Wor/c/hinzu- ist : fügt λ/ 20 nucleotids /Leicht und wirtschaftlich. Die Verwendung bestimm- ° i \ ter Eicosamere (d.h. von Oligonucleotiden, die aus 20 Nucleo-tid-Einheiten bestehen) zum Erhalt einer stabilen Hybridisierung an mRNA, wird in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben.

25

Die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe > ist aus den Diagrammen der Figuren 1 bis 4 und den folgen den Beispielen ersichtlich.

30 Figur 1 ist eine graphische Darstellung der Resultate von

Experimenten, die die inhibitorischen Wirkungen des Oligodeoxynucleotids 20A auf die cytophatischen Effekte von HSV-1 zeigen.

Figur 2 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von 35 Experimenten, die die inhibitorischen Wirkungen des

Oligodeoxynucleotids 20A auf die Virusvermehrung zeigen.

_ 17 _ - 1 Figur 3 ist eine graphische Darstellung der Wirkung einer bestimmten Kombination von Oligodaoxynucleotiden zur ^ Inhibition der Virusvermehrung und der dadurch ver ursachten pathogenen Veränderungen im Vergleich mit 5 der Verwendung eines einzelnen Oligodeoxynucleotids.

Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von

Experimenten, die durchgeführt wurden, um die in vivo-Wirksamkeit der erfindungsgemäßen antiviralen Wirkstoffe zu zeigen.

1.0

Die Beispiele 1 bis 5 beziehen sich auf die Herstellung von erfindungsgemäßen Oligo- und Polydeoxynucleotiden.

Beispiel 1 15

Herpes simplex-Virus DNA wurde durch eine Phenol-Chloroform-•ExtraKtion isoliert. Die isolierte DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten.

20 Die gespaltene DNA wurde dann in Gegenwart von T 4-Phagen-Ligase mit vorher mit BamHI behandelter pBR 322 Plasmid-DNA vermischt.

Das entstandene ,ligierte Plasmide enthaltende Gemisch wurde 25 E.coli-Bakterien verabreicht und die Bakterien, die das re- kombinante Plasmid enthielten, wurden durch Inkubation auf mit Ampicillin"angereicherten Agarplatten, auf denen sie

Kolonien bildeten sowie durch Untersuchung auf Tetracyclin-

Sensitivität selektiert. Unter den Tetracyclin-sensitiven 30 Kolonien wurden die Bakterien, die Herpes simples-Virus- DNA enthalten durch die Filter-Hybridisierungs-Methode mit 32 P-markierter Herpes-Virus-DNA als Sondenmolekül selektiert.

Um DNA des rekombinanten Plasmids zu enthalten, wurden 6 7 2 x 10 - 10 E.coli-Zellen, die das rekombinante Plasmid ~ 35 enthalten, in 2 ml TSB eingebracht (Tryptose-Sojabohnenöl-Brühe).

: L· - 18 - - 1 Das inoculierte Medium wurde bei 37°C in einem 20 mi Proben röhrchen etwa 15 Stunden . geschüttelt, bis die optische * Dichte (OD) des Kulturmediums bei 540 nm einen Wert von 0,5 (ODr-^q=0,5) erreichte. Bei dieser optischen Dichte wurde 5 Chloramphenicol zu einer Endkonzentration von 100 μ geben und die Inkubation wurde weitere 15 Stunden lang fortgesetzt. Die Bakteriensuspension wurde anschließend zentrifugiert, .und das Pellet wurde in einen Puffer, der 25 % Saccharose sowie 50 roM Tris-HCl (pH 8,0) enthielt, resuspen-.10 diert. Die Suspension wurde bei 0°C 5 Minuten stehengelassen. Zu dieser Suspension wurden 4 ml Triton X 100 zugegeben und die sich ergebende viskose Lösung wurde 30 Minuten bei 0°C und 30 000 g zentrifugiert. Zum Überstand dieser Lösung (8 ml) wurden 8 g CsCl und 1 ml einer Ethidiumbromidlösung 15 (5 ug Ethidiumbromid/ml) zugegeben. Die Mischung wurde weiter 48 Stunden bei 100 000 g zentrifugiert. Die rohe Plasmid-Fraktion, die durch diese Zentrifugation erhalten wurde, wurde mit 2 Volumina Isopropylalkohol vermischt und ein paar Minuten stehengelassen. Die obere Schicht wurde abge-20 nommen und die DNA enthaltende Lösung wurde gegen 0,1 molar T-ris-HCl und 10 mM EDTA (pH 8,0) über Nacht dialysiert.

Die dialysierte Lösung wurde konzentriert und die 200 ug DNA-enthaltende Lösung wurde mit einem Überschuß des Restrik-25 tionsenzyms BamHI behandelt. Die gespaltene DNA wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt und die Herpes Simplex-Virus-DNÂ’wurde aus dem Gel mittels Eléktroelution iso-* liert. Weiterhin wurde die DNA partiell mit DNase verdaut, . 10 Minuten . · auf 100°C erhitzt und anschließend schnell 30 abgekühlt. Auf diese Weise wurde DNA mit einer Kettenlänge von 9 bis 100 Oligodeoxynucleotiden erhalten.

Beispiel2 35 Die replikative Form der M*13-Phagen-DNA (Doppelstrang-DNA) wurde mit BamHI geschnitten. Die so gespaltete M 13-DNA wur- [__ ! ! . ’s 1_Q "* =irr- Wor-t? hinzu- mit gefiigo'V-· 1 de vorher/mit BamHI gespaltener und wie vorstehend heschrie-

t/ X

>: ben isolierter Herpes simplex-Virus-BKA vermischt. Die Ligie- . rung erfolgte mit T 4-Phagen-Ligase. E. coli wurden mit der li'gierten DNA in Gegenwart von CaCl2 transfiziert. Die trans-5 fizierten Bakterien wurden auf Agarplatten ausplattiert. Dabei wurde ein Top-Agar verwendet, der IPTG (Isopropyl-ß-D-thio-glactopyranosid und X-gal (ein Indikator) enthielt. Herpessimplex-Virus DNA enthaltende rekombinante Μ 13-Phagen bilden innerhalb von 24 Stunden farblose Plagues aus. M 13-Phagen .10 ohne Insertion bilden keine Plaques aus. Deshalb wurden die farblosen Plaques ausgewählt. Um rekombinante M 13-Phagen zu selektieren, die die (-)-Strang-HSV-DNA enthalten, wurden die Phagen auf ihre Fähigkeit der Hybridisierung mit markierter .·/ (+)-Strang-HSV-DNA, die chemisch synthetisiert wurde, über- . IJ15. prüft. Auf diese Weise wurden M 13-Phagen selektiert, die einen

•reijort/r hin- (-)-Strang-DNA

Jgefugcj Teil der - J von HSV enthalten. Die gewünschten rekombi-

.*/ nanten M 13-Phagen wurden vermehrt und einzelsträngige DNA

3 f wurde aus diesen Phagen isoliert. Zur weiteren Reinigung der einzelsträngigen HSV-DNA kann die M 13-Phagen-DNA aus dem Ge-20 misch mit Hilfe einer Spaltung mit einem Restriktionsenzym in Gegenwart bestimmter Oligodeoxynucleotide entfernt werden. Andererseits kann das DNA-Gemisch ohne Reinigung partiell mit DNase gespalten werden und Oligodeoxynucleotide mit piner Kettenlänge zwischen 9 und 100 können isoliert werden.

25 ‘ Beispiel3

Eine DNA-Synthese-Vorrichtung (Applied Biosystem Company) wurde verwendet, um (-)-Strang-DNA des sofort exprimierten 30 frühen Gens vmw 175 oder ICP 4 des Herpes-simplex-Virus zu synthetisieren. In diesem Beispiel wurde die DNA-Sequenz 3'-CGC.AGC.CTC.TTG.TTC.GTC.GC-5’ synthetisiert, die mit der mRNA von Vmw 175 hybridisiert. Dieses Deöxynucleotid ist ein Eicosamer und wird nachstehend einfach als 20 A bezeichnet.

. 35 i '1 Beispiel4 ç Eine DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystem Company) wur de zur Synthese von (-)-Strang-DNA des sofort exprimierten 5 frühen Gens Vmw 12 des Herpes-simplex-Virus verwendet. In diesem Beispiel war die synthetisierte DNA-Sequenz 3 1-GCA.CCC.GGG.ACC-TTT-ACC-GC-51. Diese hybridisiert mit mRNA von Vmw 12. Dieses Deoxynucleotid ist ein Eicosamer und wird nachstehend einfach als 20 B bezeichnet.

• 10

Beispiel 5

Eine DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystem Company) wurde zur Synthese einer (-)-Strang-DNA des NS 1-Gens des 15 Influenza-Virus verwendet. In diesem Beispiel war die synthetisierte DNA-Sequenz 3'-CTA.AGT.TTG.TGA.CAC.AGT.TCA-5’. Diese * hybridisiert mit mRNA von NS-1. Dieses Deoxynucleotid ist ein Heneicosamer und wird nachstehend einfach als 20 C bezeichnet.

20

Beispiel 6

Dieses Beispiel bezieht sich auf einen Versuch, durch den bestätigt wird, daß das Oligodeoxynucleotid die Synthese von 25 Virusprotein in vitro inhibiert.

Tabelle I zeigt den inhibitorischen Effekt von 20 A auf die Vmw 175-Bildung und die entsprechenden cytopatischen Effekte (Syncytium-Bildung) von HSV 1 30

Tabelle I

20 A/Bohrung Relative Mengen von Relative Ausprägung

Vmw 175 des cytopathisehen _ _ Effekts (Syncytium) : 35 _ 1 1 33,6 μg 0,48 0,35 - 21 - 1 BHK-Zeilen (1,5 x îôS) wurden in jede Bohrung (1,5 cia im - Durchmesser} einer Lirihrc-Platte plattiert und MEM angerei- chert mit 10 5 Kälberserum wurde zugegeben. Die Zellen wurden dann in einer 5prozentigen Ci^-Atmosphäre bei 36°C inku-5 biert. Nachfolgend wurden die Zellen mit 5 moi HSV-1 in Gegenwart oder Abwesenheit von 20 A infiziert. Nach 5 Stunden wurde aas Medium entnommen. Die Zellen wurden dann 1 Stunde lang mit ü-Methionin (100 uCi/Pl) in Kontakt gebracht. Anschließend wurde 20 A abgebaut und die Proteine wurden über . 10 eine Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese mit nachfolgender Autoradiographie analysiert. Zur Auswertung des relativen cyto-pathischen Effekts wurden identische Bedingungen zu den vorstehend beschriebenen angewendet7mit der Ausnahme, daß die Anzahl der Syncytien 13 Stunden nach der Infektion bestimmt IS wurde. Unter diesen Bedingungen wurde kein Absinken *der zellulären Protein-Synthese beobachtet.

„ Beispiel7

Dieses Beispiel bezieht sich auf einen Versuch, durch den 20 bestätigt wird, daß das Oligodeoxynucleotid von Zellen aufgenommen wird.

Dieses Beispiel zeigt, daß das einzelsträngige Oligodeoxynucleotid 20 A tatsächlich in kultivierte Zellen ein- 25 dringt.BHK-Zellen (Baby-Hamster-Nieren-Zellen; 4,4 x 10^Zel- len) wurden mit 7,6 x 10^ PFU von HSV-1/ml infiziert. Kontrollzellen wurden nicht infiziert, jedoch mit der gleichen Menge Kulturmedium versehen. Die Zellen wurden 3 Stunden in einem CO--Inkubator bei 37°C inkubiert. Nach ^ 32 der Inkubation wurden die Zellen 7,66 pMol P-markier-tem 20 A ausgesetzt. Nach der Behandlung mit dem markierten 20 A wurde das Kulturmedium entfernt und die'Zellen wurden zweimal mit 0,3 ml PBS gewaschen.

35 Die Zellen wurden dann 30 Minuten bei 36°C in einer Lösung mit 0,1 M NaCl, 33 μΜ ZnCl2, 3360 Einheiten Nuclease S1 und 33,3 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,5) stehengelassen.

t i_ ' 22 i. 1 Nachfolgend wurden die Zellen zweimal mit dem vorstehend be- : schriebenen Puffer, jedoch ohne Nuclease S1, gewaschen. Die

c gewaschenen Zellen wurden in 0,3 ml einer Lösung mit 10 mM

EDTA, 0,6 % Natriumdodecylsulfat und 10 mM T.ris-HCl-Puffer 5 (pH 7,5) aufgeschlossen. An diesem Punkt wurde TCÄ-unlös-liches, Nuclease S1-sensitives radioaktives 20 A gémessen.

Es wurde gefunden, daß mindestens 4,68 x 103 Moleküle 20 A pro Zelle während der Behandlungsdauer von 8 Stunden aufgenommen worden waren.Die tatsächliche Menge ist wahrschein- •10 lieh 10 mal höher als dieser Wert, denn die terminalen 32 P-Phosphate werden schnell hydrolysiert.

Das folgende Beispiel 8 veranschaulicht, daß 20 A eine inhi- bitorische Wirkung auf die Virusvermehrung hat.

15

Beispiel 8 5 5

Etwa 1,5 x-10 BHK-Zellen wurden pro Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte ausgebracht. Diese Zellen 20 wurden in 5 % CC>2 48 Stunden ; bei 36°C inkubiert und mit HSV-1 (7,6 x 104 PFU/ml) in 160 μΐ MEM infiziert. Die Infektion wurde 3 Stunden _ bei 36°C in 5 % C02 ausgeführt. Nach der Infektion wurden die infizierten Zellen mit 20 A behandelt. Nach einer Behandlungsdauer von 8 Stunden 25 wurde das Medium gegen normales MEM mit 10 % Kälberserum ausgetauscht. 15 Stunden nach der Infektion wurde das Kulturmedium geerntet und die Virustiter wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt.

30

Tabelle II

Menge von 20 A/Bohrung Relative Virus-Menge 0 100 35 0,112 μg 45 0,224 μg 35

I I

^ r rI ο 1 Die Beispiele 9 bis 13 beziehen sich auf Experimente, durch v die bestätigt wird, daß das Oligodeoxynucleotid die Serstö- rung von Tier-Zellen in vitro durch das Virus inhibieren.

S Beispiel9 5 (a) Etwa 1,5 x 10 BHK-Zellen wurden in jede Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte für Zellkultur ausgebracht. Die Zellen wurden 47 Stunden bei 36°C in 5 % CO, inkubiert und anschließend mit 160 μΐ HSV-1 ^ 4 (7,6 x 10 PFü/ml)3 Stunden bei 36°C infiziert. Zu die sen infizierten Zellen wurde ein Komplex aus Calciurnphosphat und 20 A in verschiedenen Mengen zugegeben.Die Calciun-Konzentration der Medien betrug zwischen 1,36 itiMdI und 24,8 mMol, je nach 20 A-Konzentra-^ tion. Der Komplex wurde, wie von Ruddle et al beschrieben, hergestellt -(boiter et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 79, S. 422 (1982)). Die infizierten Zellen wurden 8 Stunden mit 20 A behandelt. Das Kulturmedium wurde 7 dann entfernt und gegen ein normales Kulturmedium ohne 20 A ausgetauscht.

Die Zellen wurden anschließend weitere 13 Stunden gezüchtet.

20 (b) Die Kontrollzellen wurden auf die gleiche Art und Weise behandelt, mit Ausnahme der Zugabe von 20 A (Ca-Phosphat-Kontrolle).

25 (c) Als weitere Kontrolle wurde eine infizierte Kultur hergestellt, die weder mit Ca-Ionen noch mit 20 A behan delt wurde (Virus-Kontrolle). Die wie vorstehend beschrieben präparierten Gewebekultur-Zellen (a) , (b) und (c) wurden fixiert, gefärbt und' die Anzahl der Syncytien wurde be-^ stimmt.

Das Ergebnis dieses Experiments ist in Figur 1 dargestellt.

Dabei gibt die X-Achse ( Abszisse) die DNA-Menge als zu- * gegebene Menge in μg pro Bohrung an (d.h. '^g DNA/Bohrung") .

35

Die Y-Achse (Ordinate) gibt die Anzahl der in einer Zellkultur ausgebildeten Syncytien im Vergleich zu einem Wert Ï - 24 - - - 1 an, der im Versuch (c) ("Virus-Kontrolle") erhalten wurde r /.·, (d.h. "% Syncvtien-Anzahl") , wobei der letztere Wert immer .«„Wort hinzu- angenommen ;erugr; f als -jqq / wurde. Die Kurve (a) (-·-) zeigt die Ergebnisse des Experimentes (a), die Kurve (b) (—°—) zeigt 5 die Ergebnisse des Experimentes (b). Wie in Figur 1 gezeigt, wurde die Ausbildung von Svncytien durch 20 A bemerkenswert inhibiert. Calciumphosphat oder Calciumchlorid beeinflußten die Syncytien-Anzahl nicht.

*t0 Beispiel 10 (a) etwa 1,5 x 105 BHK-Zellen wurden pro Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte ausgebracht. Die Zellen wurden 47 Stunden lang bei 36°C mit 5 % CO--Atmosphäre inku- ^ 4 „ 15 biert. Zu diesen Zellen wurden 160 μΐ HSV-1 (7,6 x 10 PFU/ml)

zugegeben. Die Infektion wurde 3 Stunden bei 36°C

„ w durchgeführt. Zu auf diese Weise infizierten Zellen wurden verschiedene Mengen 20 A in Form eines Calciumchlorid-- Komplexes zugegeben, so daß die End-Ca-Ionen-Konzentration 20 4,55 mM betrug. Die Behandlung wurde 8 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden dann weitere 14 Stunden inku biert.

(b) Zusätzlich”wurde eine zur vorstehend beschriebenen Kul-25 tur (a) identische Kultur hergestellt, wobei jedoch ein Oligo- deoxynucleotid, hergestellt wurde, das nicht mit der HSV-1-Sequenz - 5’-CAC.GAC.AGA.GGG.CGA.-31 verwandt war, a und mit diesem inkubiert · Alle anderen Bedingungen waren identisch zum Versuch (a).

30 (c) Es wurde eine ähnliche Kultur, jedoch ohne 20 A hergestellt und unter den vorstehend genannten Bedingungen inkubiert. Diese wird nachstehend als "Virus-Kontrolle" bezeichnet.

35 - 25 - -1 Die Zellen der vorstehend beschriebenen Versuche (a), (b) 5 sowie (c) wurden fixiert, gefärbt und die Anzahl der t Syncytien wurde bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 2 dargestellt. Dabei gibt die X-Achse 5 (Abszisse) die pro Bohrung zugegebene DNA-Menge in μg an (d.h. "ug DNA/Bohrung") und die Y-Achse ( Ordinate) gibt die Anzahl der in einer Zellkultur ausgebildeten Syncytien im Vergleich zu einem Wert an, der im Versuch (c) ("Viruskontrolle") erhalten wurde (d.h. "% Anzahl der Syncytien"), .10 wobei der letztere Wert immer als 100 angenaimen wurde.

Die Kurve (a) (- · -) zeigt die Resultate des Experimentes (a) , die Kurve (b) (— o —) zeigt die Ergebnisse des Expe rimentes (b) .

15 wie in Figur 2 gezeigt, hat 20 A eine inhibitorische Wirkung auf die Anzahl der von HSV-1 gebildeten Syncytien. Aus diesem Experiment kann geschlossen werden, daß 20 A die ~ Syncytien-Bildung in Gegenwart von 4,55 mM Calcium-Ionen inhibiert. Oligodeoxynucleotide, die nicht mit der bekannten '20 DNA-Sequenz des Herpes-simplex-Virus verwandt sind, hatten keine inhibitorische Wirkung. Aus diesem Experiment wurde deutlich, daß die (-)-Strang DNA des Herpes simplex-Virus spezifisch die cytopathisehen Effekte des Herpes simplex-

Virus inhibiert.

25 '// Beispiel 11 ff - ------- iwei Wörter hin- erzielte Wirkung SUcef 7^: In Beispiel 9 wird die/unter Verwendung des synthetischen *7 Eicosamers 20 A, das mit dem (-)-Strang der HSV-DNA verwandt 30 ist, gezeigt. Dieses Experiment bezieht sich auf die Wirkung clonierter Herpes simplex-Virus-DN A. Es war auch unter Verwendung eines HSV 1-DNA-enthaltenden,rekombinanten pBR 322 Vektors möglich die Syncytium-Bildung durch HSV-1 zu in-έ hibieren (1,45 Megadalton, erhalten durch Spaltung der HSV-1- 3£> DNA BamHI und Einbau der Fragmente in pBR322) . In diesem Experiment wurde die HSV-1^DNA nicht aus dem rekombinanten Plasmid ausgeschnitten. Die dena- i Γ" — _ 26 _ 1 turierte und partiell gespaltene HSV-1-DNA-enthaltende, ^ rekombinante pBR 322-DNÄ wurde wie in Beispiel 9 beschrieben, ÿ in jede Bohrung einer Limbro-Platte eingebracht (0,16 ug) .

Die Wirkung wurde wie in Beispiel 9 beschrieben ausgewertet 5 und eine Inhibition der Syncytien-Bildung wurde beobachtet. Als Kontrolle wurde für dieses Experiment pBR 322 DNA verwendet. In diesem Kontrollexperiment wurde keine Inhibition beobachtet.

10 Beispiel 12

Dieses Beispiel zeigt einen synergistischen Effekt eines Gemisches aus Oligodeoxynucleotiden.

15 Etwa 1,5 x 10^ BHK-Zellen wurden in jede Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte ausgebracht. Die Zellen wurden 47 bis 48 Stunden bei 36°C in 5 % CC>2 inkubiert _ ; und mit HSV-1 (7,6 x 10^ PFü/ml) in 160 μΐ MEM infiziert.

Die Infektion wurde 3 Stunden · bei 36 °C in 5 % CC>2 ausge-: 20 führt. Nach der Infektion wurde '20 A alleine oder im Gemisch mit 20 B (224 : 1) in einem Lösungsmittel gelöst und 0,3 ml dieser Lösung wurden in Gegenwart von 4,55 mM Calciurm-Ionen zur Behandlung der Zellen verwendet. Die Behandlung der Zel-- len mit 20 A und 20 B wurde 8 Stunden durchgeführt.

25

Andere Zellen wurden wie vorstehend beschrieben behandelt, jedoch^wurde kein 20 A und 20 B zugegeben. Dieser Versuch , wird nachstehend als"Virus-Kontrolle"bezeichnet.

30 zellen wurden fixiert, gefärbt und die Anzahl der

Syncytien wurde bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Figur 3 dargestellt. Dabei steht die X-Achse (Abszisse) für die zu jeder Bohrung zugegebene DNA Menge in μg und die Y-Achse ( Ordinate) gibt die Anzahl der in

^ QC

einer Zellkultur ausgebildeten Syncytien im Vergleich zu einem Wert an, der im Versuch "Virus-Kontrolle" erhalten

' L

- 27 - Γ~ i

P

, '/ 1 wurde (d.h. "% Anzahl der Syncytien"), wobei der letztere iSsI?“ ttl“u-Wert ^ als ^„angenommen Dle als „20 A» fce2Sichne- ! te Kurve ( — «* — ) zeigt die Resultate der Experimente mit 20 A allein, die als ”20 A + 20 B (224 : 1)" bezeicnnete Kur- 5 ve (-·-) zeigt die Resultate der Experimente mit 20 A und 20 B in einem Mischungsverhältnis von 224 : 1. Wie in Figur 3 gezeigt, war der beobachtete in vitro-Effekt bei Verwendung eines Gemisches von 20 A und 20 B stärker als bei Verwendung von 20 A alleine. Aus diesem Ergebnis wird geschlossen, daß v10 die gemeinsame Verwendung (-)-strängiger DNA-Moleküle die verschiedenen Bereichen der DNA-Sequenz (-)-strängiger DNA aus Herpes simplex-Virus entsprechen, die Wirksamkeit als antiviralem Wirkstoff signifikant erhöht.

^ Beispiel 13

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung von (-)-Strang-Oligodeoxy- 1 nucleotiden von NS-1 auf den von Influenza-Viren hervorgerufenen cytopathischen Effekt. Die Ergebnisse der Untersuchung ^ sind in Tabelle III zusammengefaßt, das experimentelle Vorgehen wird nachstehend genauer beschrieben.

Tabelle III

.. Oligodeoxynucleotide Relativer Wert, bezogen auf die * _____ 25 _(ug/ml)_ Anzahl überlebender Zellen_ 0 0,21 ----------- . o,02 0,49 1,30 0,49 5,00 0,49 30 -..Schweine-Nieren-Kitazato (SKK)-Zellen (1,5 x 105/0,1 ml) wurden in 5 % fötalem Kälberserum enthaltendem MEM gezüchtet und in je eine Bohrung (0,5 cm im Durchmesser) einer Mikrotiterplatte au.sgebracht. Diese Zellen wurden 24 Stunden bei 2 35 35,5°C in einer 5prozentigen CC^-Atmosphäre im vorstehend genannten Medium inkubiert. Das Medium wurde dann entfernt und 100 μΐ eines Mediums, enthaltend verschiedene Mengen Γ 4.

_ Ί Ο — X- υ „ 1 des Oligodeoxynucleotids 20 C#wurden in jede Bohrung zugegeben- r Anschließend wurden die Zellen weitere 24 Stunden in einer 5prozentigen CO2“Atmosphäre inkufciert. Die Lösung wurde dann entfernt und 50 μΐ Medium, enthaltend 10 TCID50 Einheiten 5 Influenza A-Virus,wurden zu jeder Bohrung zugegeben. Außerdem wurden 50 μΐ des Kulturmediums, enthaltend verschiedene Mengen 20 C zu jeder Bohrung zugegeben. Anschließend wurden die Zellen weitere 48 Stunden inkubiert. Danach wurde das Medium entfernt und 100 μΐ Hank's Losung, enthaltend 0,1 % Neutral-* 10 Rot,wurden zu jeder Bohrung zugegeben und die Zellen wurden 1 Stunde bei 35,5°C in 5 % CC^-Atmosphäre inkubiert. Die Lösung wurde entnommen und die Zellen wurden mit 10 μΐ 80pro-zentigem Äthanol gewaschen und anschließend wurden 50 μΐ . 0,1.N HCl zugegeben. Die relative Anzahl der überlebenden ^ Zellen wurde durch Messung der optischen Absorption bei 577 nm mit ELISA bestimmt. Die überlebenden Zellen nahmen Neutral-Rot auf, während die Nicht-überlebenden Zellen kein j Neutral'-Rot auf nahmen. Deshalb entspricht die höhere optische

Dichte einer höheren Anzahl überlebender Zellen.

20

Die nachfolgenden Beispiele 14 bis 20 zeigen die in vivo-Wir-kung der Oligodeoxynucleotide als antiviralem Wirkstoff.

Beispiel 14 ~ 25 4

Etwa 1x10 PFU HSV-1 (F-Stamra) in 30 μΐ MEM wurden in die Intrace'rebralhöhlen von 3 Wochen alten BALB/c-Mäusen injiziert. Die Virus-Suspension enthielt verschiedene Mengen 20 A.

Zusätzlich wurden täglich während 3 Tagen 200 μΐ einer MEM-Lö-30 sung, enthaltend 1 % Penicillin, Streptomycin und 2 mM Glutaminsäure und ; verschiedene Mengen 20 A in die Intraperitoneal-Höhlen injiziert, wobei 1 Tag nach der Injektion von HSV-1 begonnen wurde. Für den 7. Tag wurde die Mortalitätsrate in

Prozent berechnet. Das Ergebnis des Experiments ist in Figur 4 35 ^ dargestellt. Dabei gibt die X-Achse ( Abszisse) die in je de Maus injizierte DNA-Menge in μ9 an, d.h. '^g DNA/Maus" l. t - 29 - -, 1 und die Y-Achse { Ordinate) die Mortalitäts-Rate in % im - Vergleich zu derjenigen an, die in einem Kontroll-Versuch er halten wurde, bei dem die Mäuse eine Injektion derselben Lösung, jedoch ohne 20 A erhielten, wobei die Mortalitäts-Rate der 5 Kontrolle immer als 100 angenommen wurde. Aus Figur 4 geht hervor, daß die Mortalitätsrate in Abhängigkeit von der anae-wendeten Menge von 20 A reduziert wurde.

Die Zeichnung gibt die Mortalitätsrate als Prozentsatz im Ver-M0 gleich mit der Kontroll-Mäuse-Gruppe an, die überhaupt kein 20 A erhielt.

Beispiel 15 4 15 Etwa 1x10 PFÜ HSV-1 (F-Stamm) in 30 μΐ MEM-Lösung, die

*T

verschiedene Mengen 20 A enthielt, wurden in die Intracerebral-; höhlen 3 Wochen alter BALB/c.-Mäuse injiziert. Zusätzlich wur- ' den einmal täglich 200 μΐ einer Lösung, enthaltend verschie dene Mengen 20 A, 1 % Penicillin und Streptomycin sowie 2 mM 20 Glutaminsäure intraperitoneal injiziert. Dabei wurde 1 Tag nach der. Injektion von HSV-1 begonnen.

Die Behandlung wurde während 6 aufeinanderfolgender Tage fort- ........ gesetzt. Die Mortalität" der Mäuse wurde 64 bis 68 Stunden 25 nach der HSV-1-Injektion bestimmt. Die Ergebnisse sind in; . ’ Tabelle IV zusammengefaßt. '

Tabelle IV

Dosis_Mortalität der Mäuse_ 30 - 5/19 0,224 μg/Maus 0/9 2,240 μg/Maus 0/10 H Wie aus der Tabelle entnommen werden kann, starben in der " 33 Kontrollgruppe 5 von insgesamt 19 Mäusen, wenn kein 20 A ver abreicht wurde. Andererseits starben bei Verabreichung t— , - 30 - rei Wörter zu diesem Zeitpüruct ir.zogefügt t von 0,224 p,g 20 A oder 2,240 μα 20 A ykeine Mäuse {insgesamt - wurden 19 Mäuse mit beiden Konzentrationen behandelt ) -

Beispiel 16 5

Etwa 5 x 104 PFU HSV-1 (F-Stamm) in 30 ul einer MEM-Lösung, die verschiedene Mengen 20 A enthielt, wurden in die Intra-cerebral-Höhlen von 3 Wochen alten BALB,fc -Mäusen injiziert.

Die Mortalitätsrate der Mäuse wurde 64 bis 68 Stunden oder i 10 71 bis 78 Stunden nach der Injektion untersucht. Die Ergeb nisse sind in Tabelle V zusammengefaßt:

Tabelle V

Dosis Mortalität zwischen Mortalität zwischen ^5 _64 und 68 Stunden_71 und 78 Stunden 3/10 3/10 I, 12 ug/Maus 0/10 2/10 II, 2 ug/Maus 0/10 0/10 20 Aus dieser Tabelle kann entnommen werden, daß in der Kontrollgrup-pe, die kein 20 A enthielt, 3 Mäuse von insgesamt 10 Mäusen starben. Andererseits war die Mortalität der Mäuse, die das Virus in Gegenwart von 20 A erhielten, stark reduziert.

25 Beispiel17

Etwa 5 x 104 PFU HSV-1 (F-Stamm) in 30 μΐ MEM-Lösung, die bestimmte Mengen 20 A enthielt, wurde in die Intracerebral- hohlen von 3 Wochen alten BALB/ c-Mäusen injiziert. Zusätz-30 lieh wurden ab dem Tag nach der Injektion 30 μΐ einer MEM-Lösung, enthaltend verschiedene Mengen 20 A, 1 % Penicillin und Streptomycin sowie 2 mM Glutaminsäure in die Intracere- t.. bralhöhlen injiziert.

35 Die Behandlung wurde 2 Tage lang fortgesetzt und die Mortalität der Mäuse wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion des Virus untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

t · )— —, - 31 -

* ^ Tabelle VI

Mortalität i Dosis Zwischen Zwischen Zwischen _64 und 68 Stunden 71 und 78 Stunden 38 und 92 Stunden 5 - 1/10 3/10 7/10 1,12 μ5/Μ3ΐιε 0/20 2/2C 5/20

Wie aus dieser Tabelle entnommen werden kann, war die Mortali-„ 10 tat bei den Kontrollmäusen, die kein 20 A erhielten, signifikant höher als bei den Mäusen, die mit 20 A behandelt wurden. Obwohl die Wirksamkeit von 20 A anscheinend bei 88 bis 92 Stunden nach der Injektion abnimmt, war die Mortalität bei den Kontrollmäusen selbst unter diesen Bedingungen noch höher.

15

Beispiel 18 ; Etwa 1 x 10^ PFü HSV-1 (F-Stamm) in 200 μΐ MEM-Lösung, die 1,12 μg 20 A enthielt, wurden in die Peritonealhöhlen 3 Wo-20 chen alter BALB/c-Mäuse injiziert. Zusätzlich wurden etwa 3 oder 2 Stunden vor der HSV-1-Injektion sowie 1 Tag nach der Injektion von HSV-1 200 μΐ einer MEM-Lösung, enthaltend verschiedene Mengen 20 A, intraperitoneal in die infizierten Mäu-se~injiziert. Die intraperitoneale Injektion von 20 A wurde 25 2 Tage lang fortgesetzt. Die Mortalität wurde 211 und 259 Stun den nach der Injektion von HSV-1 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Tabelle VII 30

Dosis Mortalität bei Mortalität bei _211 Stunden _259 Stunden - 1/10 2/10 ^ 0,224 μg/Maus 0/10 0/10 - 35

L

i Γ" — 1 Wie aus dieser Tabelle entnommen werden kann, starb eine von : 10 Mäusen (bei 211 Stunden nach der Injektion) oder zwei von insgesamt 10 Mäusen (bei 259 Stunden nach der Injektion), wenn 20 A nicht verabreicht wurde. Andererseits starben unter 5 den gleichen Versuchsbedingungen keine Mäuse, die 0,224 ug 20 A erhielten.

Beispiel 19 = 10 Die Cornea 3 Wochen alter BALB/c-Mäuse wurde durch 5-maliges Kratzen mit einer scharfen Injektions-Nadel verletzt. Auf diese verwundete Cornea wurden 30 μΐ MEM-Lösung, enthaltend 1 % Penicillin, Streptomycin, 2 mM Glutaminsäure, 5 % Kälber- 4 serum sowie 3x10 PFU HSV-1 (F-Stamm) aufgebracht. Die so 15 behandelten Mäuse wurden in vier Gruppen (A), (B), (C) und (D) wie nachstehend beschrieben eingeteilt, die Augen dieser Mäuse wurden untersucht und die Ergebnisse wurden photo-graphisch festgehalten.

20 (A) Auf die Cornea-Membran dieser Mäuse wurden 10 μΐ einer MEM-Lösung, enthaltend 22,4 μg 20 A/ml 2 Stunden vor dem Aufbringen von HSV-1 (F-Stamm) aufgetropft. Zusätzlich wurde eine solche.Behandlung täglich ab dem auf die HSV-1 (F-Stamm) Verabreichung folgenden Tag durchgeführt.

25 Zusätzlich erhielten diese Mäuse 5 Stunden vor der Injektion von HSV-1 (F-Stamm) Tropfen einer Lösung, enthaltend Corti-son-Äcetat (2 mg/kg Maus-Körpergewicht). Die Cortisonbehandlung wurde ebenso täglich fortgesetzt.

ΟΛ (B) In die Augen der Mäuse wurden 2 Stunden vor der Verabreichung von HSV-1 (F-Stamm) 10 μΐ einer MEM-Lösung, die 22,4 μg 20 A/ml enthielt, eingebracht. Die Behandlung mit 20 A 1 wurde jeden zweiten Tag fortgesetzt.

35 (C) Diese Mäuse erhielten wie vorstehend in (A) beschrieben, 30 μΐ einer Cortison-Acetat enthaltenden Lösung (2 mg/kg Körpergewicht).

L i - 33 - ·> ~ ΐ ‘ (D) Auf die Cornea-Membran dieser Mäuse wurden 2 Stunden vor der Behandlung mi x. HSV— 1 (F-Stamm) 10 μg einer MEM-Lösung aufgebracht. Zusätzlich wurde ab dem Tag nach der Behandlung mit KSV-1 (F-Stamm) eine ähnliche Behandlung mit MEM-Lösung ^ jeden zweiten Tag durchgeführt.

Der Zustand der Augen und der die Augen umgebenden Bereiche jeder Maus wurden unter besonderer Beachtung von Entzündungen und der Schließung der Augen mit pathologischen Symptomen 10 untersucht. Die Untersuchung wurde am 4. 7. oder 12. Tag nach der Behandlung durchgeführt. Die Mäuse der Gruppe (A) und der Gruppe (B) zeigten viel weniger pathologische Symptome an den Augen und den umgebenden Bereichen als die Mäuse der Gruppen (C) und (D) , die nicht 20 A erhielten.

* 15

Weiterführend kann also gefolgert werden, daß die Wirksamkeit

-- 'W

~ von 20 A nicht durch die Verwendung von Cortison beeinflußt wird.

20

Die folgenden Beispiele 20 bis 22 erläutern die Herstellung verschiedener erfindungsgemäßer· antiviraler Arzneimittel.

Bei s p i e 1 20 25 4 Ein Oligodeoxynucleotid identisch zum 20 A, das in Beispiel 3

erhalten wurde, wird gemäß der Triestermethode (unter Verwendung eines Triesters der entsprechenden Nucleotide in flüssiger Phase) synthetisiert. Zu 2 g so hergestelltem 20 A

wird eine isotonische MEM-Lösung bis zu einem Endvolumen von 30 1 Liter Injektions-Lösung zugegeben. Anschließend wird die Lösung in Ampullen abgefüllt. Dieses Injektions-Präpa- *1 rat enthält 2 mg 20 A/ml und wird subkutan in einer Dosis » von 1 bis 5 ml so nahe als möglich zum infizierten Körperteil v verabreicht, wenn ein Sympton beobachtet wird.

w « - 34 -

Beispiel 21 ' Ein Oligodeoxynucleotid identisch zum 20 B, das in Beispiel 4 erhalten wurde, wird nach der Triestermethode synthetisiert.

5 Zu 10 g des auf diese Weise synthetisierten 20 B wird eine isotonische MEM-Lösung bis zu einem Endvolumen von 1 Liter zugegeben. Dies ist eine Stammlösung für ein Iprozentiges Äugentropfen-Präparat. Dieses Augentropfen-Präparat wird mehrfach täglich in einer Dosis von 2 bis 3 Tropfen verab-• 10 reicht, wenn ein Symptom beobachtet wird.

Beispiel 22

Ein Oligodeoxynucleotid identisch zum 20 A, das in Beispiel 3 15 erhalten wurde, wird nach der Triester-Methode synthetisiert.

1 g des auf diese Weise synthetisierten 20 A wird zu einem j feinen Pulver vermahlen und 999g gereinigter Kakaobutter wer-; den zu diesem feinen Pulver zugegeben. Das Gemisch wird in einem Wasserbad bei 60eC geknetet und dann zu Suppositorien ^ niit jeweils 2 g verformt. Jedes Suppositörium enthält 2 mg 20 A und wird entsprechend dem Sympton verwendet.

Die folgenden Beispiele 23 und 24 erläutern die Sicherheit ^ der erfindungsgemäßen antiviralen -Wirkstoffe.

*

Beispiel 23

Wenn 20 A in einer Menge von 100 μg/kg intraperitoneal 30 BALB/c-Mäusen verabreicht wird, werden bei den Versuchs-Tieren keine Veränderungen beobachtet.

Beispiel 24 35 Als Test für die Bestätigung der im vorstehenden Beispiel beschriebenen Wirkung, wurde der gleiche Test wie in Bei- L j i Ψ - 35 - j 1 spiel 19 beschrieben, ausgeführt,mit der Ausnahme, daß nicht HSV-1 verwendet wurde. Bei diesem Test wird kein Unterschied zwischen der Gruppe der Versuchstiere, der 20 A verabreicht wurde und der Gruppe,der 20 A nicht verabreicht wurde, gefunden.

5

Im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen Beispiele ist es offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen antiviralen Wirkstoffe in einer wirksamen Dosis des Oligo- und Poly-deoxynucleotids sicher sind.

.10

Die nachstehend beschriebenen Beispiele sollen zeigen, daß ein in vitro-Protein-Synthese-System tatsächlich durch die Hybridisierung des (-)-Strang-Oligodeoxynucleotids mit der mRNA inhibiert wird. Diese Ergebnisse untermauern den 15 theoretischen Hintergrund dieser Erfindung.

Beispiel 25 '· >> (Referenzbeispiel 1) -fr * y 20 Dieses Beispiel erläutert die Inhibition der Polyphenylalanin-Synthese in Abhängigkeit von Poly U durch Oligodeoxy-adenylsäure.

14

Das Reaktionsgemisch (40 μΐ) enthielt 140 ug Poly U, C OE 5 25 Phenylalanin (10 cpm , 300 microcurie/Mikromol), E. coli

Extrakt, hergestellt nach Nirenberg und Mathaei ( Proc. Nat.

Acad. Sei USA 47, Seite 1588 (1961)), 13 mM Magnesiumacetat, 1 mM ATP, 1 mM Creatinphosphat, 1 |ig Creatinphosphokinase, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und verschiedene Mengen Oligodeoxy- qn e, adenylsäure. Die Reaktionsgemische werden in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen eingebracht und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Menge synthetisierten Polyphenylalanins wurde > durch Messung der in 95°c heißer r 1Oprozentiger Trichlor- 3 · ' essigsäure unlöslichen Radioaktivität bestimmt. Die Zählung 1 qc - wurde in einem Flüssig-Scintillations-Zähler durchgeführt.

Die Hemmung in Prozent wurde als Verhältnis zum Polyphenyl- i_

K

Γ c.

ψ ·\ 1 alanin-Synthese-Wert in Abwesenheit der Oiigodeoxyadenyi- säure berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VÏII zu-r sammengefaßt.

5 Tabelle VIII

Inhibitor Dosis Inhibition der polv- ^g) Phenvialanin-Synthese _ (%)__

Kontrolle - 0 ,10 poly-Deoxyadenylsäure 50 98 oligo-Deoxyadenylsäure 100 88 (10 Nucleotide) oligo-Deoxyadenylsäure 100 99 (9 Nucleotide) 15 oligo-Deoxyadenylsäure 100 15 (8 Nucleotide) oligo-Deoxyadenylsäure 100 0 1 (7 Nucleotide) <= Aus Tabelle VIII geht hervor, daß die poly-Deoxyadenylsäu- 20 re die mit Polyuridylsäure hybridisiert, ein bemerkenswert starker Inhibitor der Polyphenylalanin-Synthese ist. Weiterhin kann aus dieser Tabelle entnommen werden, daß oligo-Deoxyadenylsäure mit einer Kettenlänge von mehr 9 Nucleoti-den eine stark inhibitorische Wirkung hat.

25 , Beispiel 26 - (Referenzbeispiel 2) -------- i ff ein Wo*·/ hinzu-^as nachstehend beschriebene Experiment ist ein Nachweis da-sefuEtoa daß b ; ou für,/Oligodeoxynucleotide eukariontische mRNA-Aktivität durch

Ausbildung von Hybriden mit dieser mRNA inhibieren können.

Das Reaktionsgemisch (30 μΐ) enthält 4,2 mM Calciumphosphat, :Λ 2 mM Dimethylthiothreit ·. (DTT) , 0,08 mM jeder Aminosäure (außer Methionin) 6 mM Calciumacetat, 8 mM Magnesiumacetat, 35 35 4,5 ug Spermidin, 0,1 μΰΐ S-Methionin und 10 μΐ eines

Kaninchen-Retikulocyten-Extraktes, das nach Jackson und

Pelham hergestellt wurde (Europ.. J. Biochem. 67, Seiten 247 -

/ L

- - 37 - r 1 256 {1976}}. Der Inhibitor wurde in einer 21 mM HEPES-Lösung

V

; gelöst und wie in Tabelle IX beschrieben, dem Reaktionsge- Γ misch zugesetzt.

5 Tabelle IX

Inhibitor Dosis % Inhibition % Inhibition (μσ) der c.-Globin- der 8-Globin- _ Synthese_Synthese_ * Kontrolle 0 0 genomische a-Globin- .10 DNA 0,06 60 0 genomische ß-Globin- DNA 0 r06 0 65

Kalbsthymus DNA 0,06 10 10 15 Oligodeoxy-nucleotid von geno- 15 mischer a-Globin-DNA 0,06 88 0 15-01igodeoxy- * nucleotid vom M 13 0,06 5 2 « Wie aus Tabelle IX hervorgeht, inhibiert (-)-strängige 20 cc-Globin-DNA spezifisch die a-Globin-Synthese, während (-)-strängige ß-Globin-DNA spezifisch die ß-Globin-Synthese inhibiert. Mit Kalbsthymus-DNA wurde keine signifikante Inhibition beobachtet. Aus diesen Befunden kann geschlossen werden, daß (-)-Strang-DNA eines eukariontischen Gens spezi-25 fisch die Synthese des von diesem Gen codierten Proteins inhibiert. Oligodeoxynucleotide mit einer Kettenlänge von 15, _/ die der Nl^-terminalen Aminosäuresequenz des α-Globins ent-?/' sprechen, inhibierten die Synthese^von a-Globin. Diese Be-a|efuf^er hiSbachtung deutet darauf hin^daß/DNA^mit einer Ketten länge j-jt 30 von nur 15 Nucleotiden ausreicht, um spezifisch die Synthese des entsprechenden Proteins zu inhibieren. Das Kontroll-Oligonucleotid (M 13 Phagen-DNA mit einer Kettenlänge von rj 15 Nucleotiden) zeigte keine signifikante inhibitorische

Wirkung.

' 35

Claims (7)

1. 2. Oligo- und Polydeoxynucleotide nach Anspruch 1 zur An-25 Wendung als die Virusvermehrung inhibierende Wirkstoffe. r λ 3. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Oligo- und /oder Polydeoxynucleotid nach Anspruch 1 und ein pharmazeutisch verträgliches Excipiens. 30
2. 4. Arzneimittel zur Behandlung von Virusinfektionen, enthaltend mindestens ein Oligo- und/oder Polydeoxynucleotid-nach Anspruch 1 und ein pharmazeutisch verträgliches Excipiens. 35 ' - 39- . · "J 1 5. Arzneimittel nach Anspruch 4 zur Behandlung von RNA-Virus-Infektionen. v V
3. 6. Arzneimittel nach Anspruch 4 zur Behandlung von
4. 5 Influenza-Virus-Infektionen.
5. 7. Arzneimittel nach Anspruch 4, zur Behandlung von DNA-Virus-Infektionen. *10 8* Arzneimittel nach Anspruch 4 zur Behandlung von Herpes simplex-Virus.-Infektionen.
6. 9. Arzneimittel nach Anspruch 4, enthaltend ein Gemisch von Oligo- und/oder Polydeoxynucleotiden nach An-15 spruch 1. Y tr ί - . 'v 10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be- • handlung von Virusinfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß ^ man aus mindestens einem Fragment aus dem codierenden Bereich 20 des Virus-Genoms ein Oligo- oder Polydeoxynucleotid isoliert, das mit einem Bereich einer bei der Virusvermehrung synthetisierten. mRNA hybridisiert und das Oligo- oder Polydeoxynucleo-tid gegebenenfalls mit·einem zur Behandlung .von Virusinfektionen geeigneten Excipients versetzt. 25
7. 11. Verfahren nach Anspruch 10,dadurch gekennzeichnet, daß -, man ein Oligo- oder Polydeoxynucleotid verwendet, das durch chemische Synthese hergestellt wird. / ✓ 30 --yy'· ' 1 7 · .· / * · Λ. - C/ u ·*„ - / / y f f / ^ / / 1 35 t i ; ? à - ä-i