JPH06501162A - ウイルス類の成長または複製を抑制するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オリゴヌクレオチド類；該オリゴヌクレオチド類を含む医薬および医 薬組成物；該オリゴヌクレオチド類を使用して、微生物、ウィルスおよび自己複 製能を有する核酸を検出する方法；該オリゴヌクレオチド類を使用して、微生物 、ウィルスおよび自己複製能を有する核酸の成長または複製を抑止する方法；お よび該オリゴヌクレオチド類を使用して、微生物、ウィルスまたは自己複製能を 有する核酸の相同的（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）および非相同的（ｈｅｔｅｒｏｌ ｏｇｏｕｓ）な成長或いは複製を抑制する治療方法に関する。

発明の背景 翻訳或いはｍＲＮＡプロセッシングのレベルで遺伝子の発現を選択的に抑制し得 るアンチセンスＲＮＡが、病気の予防および処置に対する遺伝子的なアプローチ の可能性の一つとして提案されている。直接細胞内に導入されたアンチセンスＲ ＮＡまたは発現されたトランスフェクトＤＮＡが、内在性の真核遺伝子の発現を 抑制することが示されている。しかしながら、ＲＮＡの固有の性質およびＲＮＡ を使用する際の問題点、例えば、細胞、試薬および供給品中のほとんど至るとこ ろに見られるＲＮアーゼの存在の結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド類を使 用して、特定の遺伝子の発現を遺伝子的に抑制する代わりの手段をめる研究が盛 んに行なわれる様になってきた。

この様な発展の一つが、通常オリゴヌクレオチド類において見出されるマイナス に荷電したホスホジエステル基に代えて、３″−５′メチルホスホネート基を含 む非イオン性核酸類似体である。この様な類似体は、ヌクレアーゼによる加水分 解に対して抵抗性を有し、培地中の細胞のプラズマ膜を通過する。他の発展形態 は、末端ブロッキング基、インターカレート化剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ　）またはホスホロチオエートの使用を含むものである。

アンチセンス　オリゴヌクレオチド類は、ラウス　サルコーマ　ウィルス、水痘 性口内炎ウィルス、シミアンウィルス　４０、インフルエンザ　ウィルスおよび ヒト免疫不全ウィルスの生育を抑止するには、あまり目覚ましい効果を達成して いない。

発明の要約 従って、本発明の１つの目的は、より優れた程度にヘルペス　ウィルスの生育成 いは複製を阻止するオリゴヌクレオチド類を提供することにある。

本発明の第２の目的は、微生物、ウィルスまたは自己複製性核酸の生育成いは複 製を阻止するための新規な組成物および方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、微生物、ウィルス或いは自己複製能のある核酸のゲ ノム中の非重複部位に対する複数のヌクレオチド類の使用により、これらの生育 成いは複製を阻止することにある。

本発明の第４の目的は、ヘルペス　ウィルスの様な一次微生物、ウィルスまたは 自己複製性核酸、ならびにヒト免疫不全ウィルスの様な二次ウィルスの生育乃至 複製を抑制する新規組成物および方法を提供することにあり、上記の一次微生物 、ウィルスまたは自己複製性の核酸とハイフリットを形成し得る１または２以上 のオリゴヌクレオチドを使用する。

上記のおよびその他の目的は、微生物、ウィルスまたは自己複製性の核酸のゲノ ム中で特定のターゲット部位とハイブリッドを形成する新規なオリゴヌクレオチ ド類を形成することにより、達成される。

本発明は、下記のステップからなるヘルペスウィルスの検知方法を提供する： （１）核酸を含む生物学的サンプルを得るステップ；（２）上記のサンプルを処 理して、そこに含まれる核酸を一本鎖とするステップ； （３）上記の処理されたサンプルを、ヘルペスウィルスの核酸とハイブリッドし 得るオリゴヌクレオチドを含む標識化オリゴヌクレオチドに接触させるステップ ；および （４）ハイブリッド化された配列を検知するステップ。

本発明は、さらに、ヘルペスウィルスの核酸とハイブリッドを形成し得るオリゴ ヌクレオチドを含むことを特徴とするヘルペスウィルスの生育乃至複製を抑制す るための組成物を提供する。

本発明は、さらにまた、ヘルペスウィルスの核酸をこのヘルペスウィルスの核酸 とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドに接触させるステップを含むこ とを特徴とするヘルペスウィルスの生育乃至複製を抑制する方法を提供する。

本発明は、さらに、ヘルペスウィルスの核酸とハイブリッドを形成し得るオリゴ ヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を 含むことを特徴とするヘルペスウィルスの生育または複製を抑制するための治療 用組成物を提供する。

本発明は、さらに、ヘルペスウィルスに感染した宿主におけるヘルペスウィルス の生育乃至複製を抑制するための治療方法に関し、この方法は、ヘルペスウィル スの核酸とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許 容される塩を含む治療用組成物を治療に有効な量で投与することを特徴とする。

本発明は、さらにまた、微生物、ウィルスまたは自己複製性の核酸中の非重複部 位とハイブリッドを形成し得る少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含むこと を特徴とする微生物、ウィルスまたは自己複製性の核酸の生育乃至複製を抑制す るための組成物を提供する。

本発明は、さらにまた、微生物、ウィルスまたは自己複製性核酸の核酸と、これ ら微生物、ウィルスまたは自己複製性核酸の核酸中の非重複部位とハイブリッド を形成し得る少な（とも２個のオリゴヌクレオチドとを接触させるステップを含 むことを特徴とする微生物、ウィルスまたは自己複製性核酸の生育乃至複製を抑 制するための方法を提供する。

本発明は、さらにまた、微生物、ウィルスまたは自己複製性の核酸中の非重複部 位とハイブリッドを形成し得る少なくとも２個のオリゴヌクレオチド或いはその 薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする微 生物、ウィルスまたは自己複製性核酸の生育乃至複製を抑制するための治療用組 成物を提供する。

本発明は、さらに、微生物、ウィルスまたは自己複製性核酸のキャリヤーである 宿主における微生物、ウィルスまたは自己複製性核酸の生育乃至複製を抑制する ための治療方法であって、微生物、ウィルスまたは自己複製性の核酸中の非重複 部位とハイブリッドを形成し得る少なくとも２個のオリゴヌクレオチド或いはそ の薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を治療に有効な量で宿主 に投与することを特徴とする方法を提供する。

本発明は、さらにまた、ヒト免疫不全ウィルスと第２のウィルスとを含むスベリ メン中でヒト免疫不全ウィルスの生育乃至複製を抑制するための組成物であって 、該第２のウィルスの核酸とハイブリッドを形成し得る少なくとも１つのオリゴ ヌクレオチドを含むことを特徴とする組成物を提供する。

本発明は、さらに、ヒト免疫不全ウィルスと第２のウィルスとを含むスベリメン 中でヒト免疫不全ウィルスの生育乃至複製を抑制するための方法であって、第２ のウィルスの核酸とハイブリッドを形成し得る少なくとも１つのオリゴヌクレオ チドと、第２のウィルスの核酸とを接触させることを特徴とするステップを備え た方法を提供する。

本発明の他の態様は、ヒト免疫不全ウィルスと第２のウィルスとのキャリヤーで ある宿主におけるヒト免疫不全ウィルスの生育乃至複製を抑制するための治療用 組成物であって、該第２のウィルスの核酸とハイブリッドを形成し得る少なくと も１つのオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩および薬学的に許 容される担体を含むことを特徴とする組成物を提供する。

最後に、本発明は、ヒト免疫不全ウィルスと第２のウィルスとのキャリヤーであ る宿主におけるヒト免疫不全ウィルスの生育乃至複製を抑制するための治療方法 であって、該第２のウィルスの核酸とハイブリッドを形成し得る少なくとも１つ のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩の薬学的有効量を宿主に 投与することを特徴とする治療方法を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、ヘルペス　シンプレックス　ウィルス（Ｈ３■）のゲノムを模式的に示 すものであり、幾つかの遺伝子がアンチセンス　オリゴヌクオチドの好ましいタ ーゲットとして強調されている。図において、ＵＬは、末端のＴＲと内部のＩＲ ＬＮ繰り返しシーケンスと接するし 長いユニーク　シーケンス　セグメントを示す。Ｕ　は、内部のＩＲおよび末端 のＴＲ繰り返しシーケンスとＳ　Ｓ 接する短いユニーク　シーケンス　セグメントを示す。

遺伝子マツプの上方には、相対的スケールがあり、その“１”は、全体のＨ３Ｖ ゲノムを意味する。

図２は、他の関連する遺伝子を示すＨ３Ｖゲノムの模式図である。長い領域は、 制限酵素により決定される機能ドメインとして分割され、Ｃ，Ｆ、ＥおよびＤと して示されている。ＯＲＦサイズは、予測されているオープン　リーディング　 フレーム　サイズをキロベース（Ｋ）で示すものである。遺伝子マツプ上の相対 的スケールにおいて、塗り潰しボックスは、反復部に接する長いセグメントを意 味し、中空ボックスは、反復部に接する短いセグメントを意味する。遺伝子は、 ＵＬ５の様な番号で規定されるか或いは機能で規定されており、ＤＮＡの巻き戻 しに関与する主要ＤＮＡ結合蛋白をコードするｄｂ図３は、アンチセンス　オリ ゴヌクレオチドと接触させられた細胞内でのＨＳＶ−１の成長のドーズ応答時間 曲線（ｄｏｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｉｍｅ　ｃｕｒｖｅｓ　）を示す。ＨＳ Ｖ−１細胞１個当り１０ｐｆｕの割合でベロ細胞を感染させ、感染の時点でオリ ゴヌクレオチドの濃度を増大させて処理した。２４時間後に感染性のウィルスに ついて、各培地を評価した。結果は、非処理のＨＳＶ−１感染細胞と比較して、 ウィルス滴定濃度の％抑止率（ｐｅｒｃｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖ ｉｒｕｓ　ｔｉｔｅｒｓ　）として示した。図において、塗り潰した円は、オリ ゴヌクレオチド　ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧを示す。×は、オリゴヌクレオチド 　ＴＣＣＴＣＣＴＧを示す。白地の方形は、オリゴヌクレオチド　ＧＣＧＧＧＡ ＡＧＧＣＡＣを示す。塗り潰した方形は、オリゴヌクレオチド　ＴＣＣＴＧＣＧ ＧＧＡＡＧを示す。塗り潰した三角形は、オリゴヌクレオチド　ＴＴＣＣＴＣＣ Ｔを示す。白地の三角形は、オリゴヌクレオチド　ＴＣＣＴＧＣＧＧを示す。

図４は、ＩＥＩＩＯ遺伝子生成物によるＨＳＶの活性化および特定のオリゴヌク レオチド類によるＩＥＩＩＯ誘導活性化の抑制を示す。ベロ　ウィルスをｐｌｃ Ｐｌｏ−ｃａｔによりトランスフェクトした。Ｊ）ＩＣＰＩＯ−ｃａｔは、Ｈ３ ＶプロモーターおよびＣＡＴ構造遺伝子を有し、ＩＥＩＩＯを活性化するプラス ミドである。グラフにおいて、無修飾のバーは、オリゴヌクレオチドの不存在下 での細胞成長を示す。

（ａ）と表記されたハツチングされたバーは、オリゴヌクレオチド　ＴＴＣＣＴ ＣＣＴＧＣＧＣの存在下での細胞成長を示す。

（ｂ）と表記された点を付されたバーは、オリゴヌクレオチド　ＧＣＧＧＧＧＣ ＴＣＣＡＴの存在下での細胞成長を示す。

（Ｃ）と表記された破線点を付されたバーは、オリゴヌクレオチド　ＡＧＴＣＴ ＧＣＴＧＣＡＡを示す。

図５は、図３におけると同様に、アンチセンス　オリゴヌクレオチドによる、細 胞内でのＨＳＶ−１生育のドーズ応答および抑制を示す。図において、塗り潰し た円は、オリゴヌクレオチド　ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧを示す。塗り潰した三 角形は、オリゴヌクレオチド　ＧＣＴＴＡＣＣＣＧＴＧＣを示す。Ｘは、オリゴ ヌクレオチド　ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴを示す。

白地の円は、オリゴヌクレオチド　ＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＡを示す。

図６は、あるオリゴヌクレオチドによるＨＳＶ−１生育のドーズ応答抑制に対す るウィルス　ｍ、ｏ、ｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏ ｎ　）の効果を示す。このオリゴヌクレオチドは、ＩＥＩＩＯと命名される配列 　ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴを有するＨＳＶ−Ｉ　ＩＥ　ｍＲＮＡの翻訳開始部 位と相補性を有する。図において、塗り潰した円は、ＨＳＶ−１細胞１個当りＯ ，１ｐｆｕの割合で感染されたベロ　細胞を示し、白地の円は、ＨＳＶ−１細胞 １個当り１０ｐｆｕの割合で感染された細胞を示す。

図７Ａおよび７Ｂは、アンチセンス　オリゴヌクレオチドと接触させたベロ　細 胞中でのＨＳＶ−１生育のドーズ応答抑制を示す。

図７Ａにおいて、ＨＳＶ−１細胞１個当りＱ、１ｐｆｕの割合で感染されたベロ 　細胞中でのＨＳＶ−１生育が観察された。図において、Ｘは、オリゴヌクレオ チドＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴ　（ＩＥＩＩＯとして表示されている）を示す。

円は、オリゴヌクレオチド　ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧ　（ＩＥ４．５として表 示されている）を示す。方形は、両オリゴヌクレオチドの同時使用を示す。

図７Ｂにおいて、ＨＳＶ−２複製の抑制に対するＩＥＩＩＯおよびＩＥ４．５オ リゴマーの相乗効果が明らかにされている。個々のオリゴヌクレオチドの濃度を ともに変えて、プラーク形成の抑制を決定した。ＦＩＣなる語は、固定濃度のＩ ＥＩＩＯの存在下にプラーク形成を６０％抑制するに必要とされるＩＥ４．５濃 度とＩＥＩＩＯの不存在下に必要とされる濃度との比を意味する。Ｘ軸の単位は 、ＩＥＩＩＯの固定濃度とＩＥ４．５の不存在下にプラーク形成を６０％抑制し たＩＥＩＩＯの濃度との比である。斜線（Ｘ）は、各オリゴヌクレオチドを単独 で使用した場合の理論値をプロットして示す。塗り潰した円は、組み合わせの相 乗的効果を示す。

図８は、アンチセンス　オリゴヌクレオチドと接触した細胞中でのＨＳＶ−１成 長のドーズ応答曲線を示す。

図において、小さな円は、ＩＥ５開始部位に特異的であって、ＴＥ１２と命名さ れる配列ＧＧＣＣＣＡＣＧＡＣＡＴを有するオリゴマーを示す。ＴＥ１２は、有 意的な抑制を示さない。三角形は、オリゴヌクレオチド　ＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣ ＡＴ　（ＩＥ６８と命名され、ＩＥ４開始部位に特異的である）を示す。大きな 円は、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせにより得られる抑制を表す。全て の点において、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、その単独のいずれを 使用する場合に比しても、より低い濃度でより高いレベルの抑制を達成する。組 み合わせによる処理において、各点は、両オリゴヌクレオチドの合計濃度を示す 。

図９は、ヘルペスウィルスに特異的なオリゴヌクレオチドによるＨＩＶ活性化の 抑制を示す。細胞は、ＣＡＴ構造遺伝子の上流にＨＩＶプロモーターを有するプ ラスミドとＨＳ　Ｖ　−Ｉ　ＩＥＩＩＯ蛋白をコードするプラスミドとにより共 トランスフェクトされている。形質転換体は、次いで、種々異なる濃度のオリゴ ヌクレオチドに接触させられた。ＩＥＩＩＯの開始部位へのオリゴマーは、ＧＣ ＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴであり、ＴＥ１１０の第２のスプライス　アクセプタ一部 位へのオリゴマーは、ＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡ人であり、ＩＥ４．５のスプライ ス　アクセプタ一部位へのオリゴマーは、ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧである。

図１０は、ヘルペスに対し特異なオリゴヌクレオチドＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴ 　（ＩＥＩＩＯオリゴマーと命名される）によるＨＩＶ活性化の抑制、およびＨ ＳＶ−１１１７）ＩＥＩＩＯ蛋白とサイトメガロウィルス（ＣＭＶと命名される ）からの相同遺伝子産物とによる活性化を示す。ＩＥＩＩＯ蛋白およびオリゴヌ クレオチドは、１回の処理において組み合されている。ＰＢＲと付記された曲線 は、ＰＢＲ３２２を使用するコントロールである。ＩＦＵは、感染性形成単位（ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ　）である。

発明の詳細な説明 本発明は、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）、ウィルス又は自己複製性核酸の増殖な いし複製を、又は、増殖又は複製に必須である微生物、ウィルス又は自己複製性 核酸の遺伝子の翻訳又は発現を、微生物、ウィルス又は自己複製性核酸ゲノム中 の特異的ターゲット部位（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔａｒｇｅｔｅｄｓｉｔｅｓ）に 相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、必須の遺伝子（ｃｒｉｔ ｉｃａｌ　ｇｅｎｅｓ）の発現の通常の手段を阻害することによって、抑制する ことに関する。

本発明の組成物及び方法は、ヘルペスウィルスの検出、診断及び操作（ｍａｎｉ ｐｕｌａｔｉｏｎ）に、また、ヘルペスウィルスにより直接的に又は間接的に惹 起される疾病の治療に有用である。

いずれの微生物、ウィルス又は自己複製性核酸についても、−を越えるオリゴヌ クレオチドが使用され、該オリゴヌクレオチドが、該微生物、ウィルス又は自己 複製性核酸のゲノムの非重複部位（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　５ｉｔｅ ｓ）に、即ち、別個のターゲット部位（ｔａｒｇｅｔ　５ｉｔｅｓ）に向けられ た場合に、特に利点が得られる。

本明細書では、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、核酸において通常見出され る糖であるデオキシリボース及びリボース及びその修飾されたアナログ、例えば ２′−０−メチルリボースからなるオリゴマーを包含するものとして使用されて いる。該オリゴヌクレオチドは、−重鎖核酸に又は二本鎖核酸に結合しても良い 。

また、本明細書では「自己複製性核酸」なる用語は、例えば、クロロプラスト、 ミトコンドリアのようなオルガネラ中に見出される核酸及びプラスミド、ウィロ イド（ｖｉｒｏｉｄｓ）などの単独で見出される核酸を包含するものとして使用 されている。

本明細書では「ウィルス」なる用語は、独立の代謝が存在しないこと及び生体宿 主細胞中においてのみ複製する能力によって特徴付けられる細胞内物質（ｉｎｔ ｒａｃｅｌ　１ｕｌａｒ　ａｇｅｎｔｓ）を包含するものとして使用されている 。

本明細書では「微生物Ｊ　（ｍｉｃｒｏｂｅ）なる用語は、バクテリア、放線菌 （ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）　、クラミジア属（ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、 マイコプラズマ属（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｅ）などの原核生物及び、原生動物（ ｐｒｏｔｏｚｏａ）、真菌（ｆｕｎｇｉ）　、寄生虫（ｐａｒａｓｉ　ｔｅｓ） 等の真核生物を包含するものとして使用されている。

例えば、ヘルペスウィルスは、その自然宿主がヒト（ｈｕｍａｎ　５ｐｅｃｉｅ ｓ）であるが、７つの種（ｓｐｅｃｉｅｓ）　、即ち、単純ヘルペス（ｈｅｒｐ ｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ）タイプｌ　（ＨＳＶ−１）及びタイプ２　（ＨＳＶ−２ ）　、水痘帯状庖疹（ｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒ）　（Ｖ　Ｓ　Ｖ）　、 −Ｌプスタインーバール（Ｅ　Ｂ　Ｖ）、サイトメガロウィルス（ｃｙｔｏｍｅ ｇａｌｏｖｉｒｕｓ）　（ＨＣＭ　Ｖ　）、ヒトヘルペスウィルス５　（ｈｕｍ ａｎ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）　（ＨＨＶ−６）及び７　（ＨＨＶ−７）を包 含する。（本明細書では、「ヘルペスウィルス」なる用語は、上記した７種を含 むものとする。）これらは、大きなゲノムを有するＤＮＡウィルスである。共通 の遺伝的特徴は、反復配列（ｒｅｐｅａｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）、長及び短ユ ニーク配列（ｌｏｎｇ　ａｎｄｓｈｏｒｔ　ｕｎｉｑｕｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ ）及び中間−初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）調節遺伝子（下流 の遺伝子の転写及び発現を支配する）を含む。

上記オリゴヌクレオチドは、当業者に知られている任意の方法、例えば通常使用 されている固相トリエステル（ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｔｒｉｅｓｔｅｒ）又 はホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学により製造する ことができる。インビトロでの核酸合成は、当業者に容易に入手できる装置によ って高度に自動化されて来ている。しかも、各種の商業上の入手源との契約によ って注文生産されたオリゴヌクレオチドを得ることができる。或いは、アンチセ ンスヌクレオチドは、適当なりローン化された配列で細胞をトランスフェクトす ることにより系内で合成することもできる。

オリゴヌクレオチドは、膜バリヤー（ｍｅｍｂｒａｎｅｏｕｓ　ｂａｒｒｉｅｒ ）を通り抜ける能力、ミリュー（ｍｉｌｉｅｕ）中に存在する分解的手段に抵抗 する能力、及び微生物、ウィルス又は自己複製性核酸の核酸とハイブリダイズす る能力を有していなければならない。従って、非修飾オリゴデオキシリボヌクレ オチド及びオリゴリボヌクレオチド及び他のオリゴヌクレオチドが、電気穿孔法 （ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マイクロイミュニゼイション（ｍｉｃｒ ｏｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、リポソームフュージョン（ｌｉｐｏｓｏｍｅ　 ｆｕｓｉｏｎ）　、沈殿、及び微粒子砲撃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏ ｍｂａｒｄｍｅｎｔ）等の方法により細胞内に直接導入されるならば、使用でき る。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、適当な組換体でトランスフェクトすること により、宿主細胞中で内生的に製造することもできる。アンチセンス分子をコー ドする配列は、ベクターの必要な宿主ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を有する発現 カセット中の適当な部位中にクローン化される。次いで、該組換体は、上記した ような標準的な方法を用いて細胞内に導入される。

化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド（又は本明細書で使用されているように 「修飾されたオリゴヌクレオチド又は修飾されたオリゴヌクレオシド又は修飾さ れたヌクレオシド」）を使用しても良く、例えば米国特許第４．４６９，８６３ 号又は第４，５１１，７１３号に記載されたオリゴヌクレオシドメチルホスホネ ート；マツクラ（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ）ら（ＰＮＡＳ　８４，７７０６−７７１ ０．１９８７）により記載されたホスホロチオエートアナログ（ｐｈｏｓｐｈｏ ｒｏｔｈｉｏａｔｅ　ａｎａｌｏｇｓ）　；末端基を有するオリゴヌクレオチド 及び例えばンラジン（ｐｓｏｒａ　１ｅｎ）により置換されて誘導体化されたオ リゴマー類が使用できる。

修飾されたヌクレオチドは、疎水性又はヌクレアーゼ抵抗性又はこれら両者を増 大させる利点を有する。従って、ある種の修飾された塩基を有するオリゴヌクレ オチドは、哺乳類細胞形質膜を通過する能力を有する。また、オリゴヌクレオチ ドの末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）も、修飾することができ、これによって、オリゴマ ーを細胞内エクソヌレアーゼ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｅｘｏｎｕｃｌｅ ａｓｅｓ）に対して抵抗性を有するものにすることができる。化学的に修飾され たオリゴヌクレオチドの使用は、本発明の実施において好ましいものであり、特 に好ましいのは、オリゴヌクレオシドアルキル又はアリールホスホネートである 。

オリゴヌクレオチドは、所望の特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、期待される 細胞内安定性及び技術的な考慮によってサイズを変えることができる。一般に、 少なくとも８〜２０ヌクレオチドの範囲では、オリゴヌクレオチドが長いほど、 特異性が高い。しかしながら、ターゲットにされた配列が小さな微生物、ウィル ス又は自己複製性核酸のゲノムの一部である場合は、ゲノムターゲット部位とオ リゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応におけるドライバーＤＮ Ａ、即ち該微生物、ウィルス又は自己複製性核酸のゲノムの有効濃度は、高く、 それにより、より短いオリゴヌクレオチドを用いて充分な特異性を達成すること ができる。８〜２０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましく、１２〜２０塩基のも のが特に好ましい。アンチセンスベクターを用いて導入する場合、オリゴヌクレ オチドは、より多くなくても、５０〜６０塩基もの大きいものとすることができ る。より大きい領域を包含（ｓｐａｎ）するために、隣接する末端にハイブリダ イズする２以上のオリゴマーを使用することもでき、例えば、二つの１５量体（ １５ｍｅｒｓ）を用いて系内で３０塩基対部位を包含（ｓｐａｎ）することもで きる。

オリゴヌクレオチドを微生物、ウィルス又は自己複製性核酸と接触させる手段は いずれも、本発明の実施に適している。治療的なセツティングにおいては、好ま しい手段は、単独で又は組成物として末梢循環（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｃｉｒｃ ｕｌａｔｉｏｎ）において安定であり、且つ、細胞膜を通過できるオリゴヌクレ オチドを使用することである。オリゴヌクレオチドを治療的に有効な濃度で導入 することは、現在、生物学的物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）　、例えば、イム ノグロブリン、ペプチド、酵素等をプリバー（ｄｅｌｉｖｅｒ）するのに使用さ れている任意の方法、例えば、静脈内投与、筋肉的免疫化（ｉｎｔｒａｍｕｓｃ ｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、移植片（ｉｍｐｌａｎｔｓ）、鼻内投 与により、リポソームに包まれ、抗体等の細胞結合剤に結合され、リボザイム（ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）に結合され、その他罪経口投与により行なうことができる。

しかも、多くの微生物、ウィルス又は自己複製性核酸は、上皮傷（ｅｐｉｔｈｅ ｌｉａｌ　１ｅｓｉｏｎｓ）を作るので、オリゴヌクレオチドはクリーム又は軟 膏を包含する賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）中に存在する形でプリバーすることもで きる。

微生物、ウィルス又は自己複製性核酸の増殖又は複製を抑制するのに必要とされ るオリゴヌクレオチドの適当な濃度は、当業者であれば容易に決定することがで きる。

例えば、本明細書に開示されている動物実験は、マウスと他の種との体重比較に 基づき、他の種での投与量を補作するためのベースを提供するものである。また 、本明細書において使用されている量も、他の種での使用のための参照点を提供 するものである。必要とされる濃度は、部分的には、例えば、オリゴヌクレオチ ドの化学；生理的バリヤー例えば血液脳関門、血液精巣関門（ｂｌｏｏｄ−ｔｅ ｓｔｉｓ　ｂａｒｒｉｅｒ）を通り抜けること；毒性；例えば経口、経皮、経鼻 等の投与経路；例えば、イボ（ｖｅｒｒｕｃａ）　、帯状ヘルペス（ｓｈｉｎｇ ｌｅｓ）の突発、腸内回虫感染（ａｓｃａｒｉｔｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）およ び画面症等の治療を要する疾病：及び末梢循環における半減期に依存する。適当 な治療投与量は、内部投与量（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｄｏｓａｇｅ）　（即ち、身 体の必要とされる部位での投与量）として、１０量Ｍ〜１０μＭの間である。

所望の投与様式に応じて、オリゴヌクレオチドは、各種の薬学的に許容される方 法でプリバーできる。組成物は、固体又は半固体のいずれでも良いが、オリゴマ ーを液状で投与する場合が最も多くなるであろう。組成物は、オリゴマー、又は その薬学的に許容される塩、慣用されている賦形剤、例えば、殺菌緩衝生理食塩 水、及び他の成分、担体（ｃａｒｒｉｅｒｓ）、補助薬（ａｄｊｕｖａｎｔｓ） 　、稀釈剤等を含み、これにより、安定性を増大させ、組成物の湿潤性その他を 向上させる。

実際の方法及び投与量は公知であるか、又は当業者にとって自明である。例えば レミントンズファーマスーテイ力ルサイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ−ｓ　Ｐ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ’ｌ、Ｃ ｏ、、Ｅａｓ　ｔｏｎ。

ＰＡ参照。

本発明は、更に、微生物、ウィルス又は自己複製性核酸のゲノムにおける非重複 部位に向けて少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを使用することを包含する。

ターゲットにされた部位が重複しておらず、且つ、宿主細胞内又は系内での微生 物、ウィルス又は自己複製性核酸のゲノムの３次元折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ） が予測できないかもしれないので、複数のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレ オチドは、単一部位（ａ　ｓｉｎｇｌｅ　５ｉｔｅ）に相補的な複数の配列を含 んでいる。一つを越えるオリゴヌクレオチドを使用する場合には、微生物、ウィ ルス又は自己複製性核酸の増殖又は複製に対して予想外に増強された抑制が得ら れる。ここで、該複数のオリゴヌクレオチドは、一つの遺伝子内の又は別個の遺 伝子内の異なる部位にハイブリダイズする。

本発明によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドのためのターゲットとして好 ましい、微生物、ウィルス又は自己複製性核酸のゲノムの成る部分がある。

好ましいターゲットは、微生物、ウィルス又は自己複製性核酸の増殖の基本的メ カニズムに対して直接的又は間接的支配を有する部分である。例えば、主要な発 生経路を引き起こす、発生初期に発現される調節遺伝子が適している（マスター 調節遺伝子として知られている）。

また、オペロンにおける様に、より少ない数の遺伝子の発現を支配する他の調節 遺伝子も好ましい。他の好適なターゲットは、微生物、ウィルス又は自己複製性 核酸の複製に関与している遺伝子、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素 である。他の好適なターゲットのセットは、組織又は細胞に特異性、ビルジンス （ｖｉｒｕ］ｅｎｃｅ）及び潜在性（Ｉａｔｅｎｃｙ）を与える遺伝子のような 、病因（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与する遺伝子である。

ターゲット内の重要な部位は、転写開始部位（プロモーター又はポリメラーゼ結 合部位としても知られている）、翻訳開始部位、スプライスドナー及びアクセプ タ一部位（ｓｐｌｉｃｅ　ｄｏｎｏｒ　ａｎｄ　ａｃｃｅｐｔｏｒ　５ｉｔｅｓ ）　、メツセンジャーキャップ部位及び転写開始部位である。例えば、Ｈ３ｖ− １においては、５−−ＡＴＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＣＣＡＴ−３−（以下 全ての配列は５′から３“への方向にあるものとする）のようなＩＥ２翻訳開始 部位にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが好適である。同様に、ＧＧＣ ＣＣＡＣＧＡＣＡＴのようなＩＥ５翻訳開始部位にハイブリダイズし得るオリゴ ヌクレオチド；ＧＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＴ、ＧＧＣＧＣＣＧＴＣＴＧＣ及びＧＴ ＧＧＣＣＧＧＣＧＣＣのようなＩＥ４ｍＲＮＡキャップサイトにハイブリダイズ し得るオリゴヌクレオチド、ＧＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＴ、ＧＧＣＧＣＣＧＴＣＴ ＧＣ及びＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＣＣのようなＩＦ５　ｍＲＮＡキャップサイトに ハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド；ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧのような ＩＦ５，５スプライスアクセプタ一部位にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオ チド、ＧＣＴＴＡＣＣＣＧＴＧＣのようなＩＦ５．５スプライスドナ一部位にハ イブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴのようなＩ ＥＩ翻訳開始部位にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド：ＧＴＴＣＴＣＣ ＧＡＣＧＣＣＡＴのようなｒＥ３翻訳開始部位にハイブリダイズし得るオリゴヌ クレオチド、ＣＧＣＴＣＣＧＴＧＴＧＧのようなＩＥ３キャップ部位にハイブリ ダイズし得るオリゴヌクレオチド；及びＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴのようなＩＥ ４翻訳開始部位にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドも好適である。

上述したように、また、後記実施例において更に例示するように、オリゴヌクレ オチドのサイズは、変わっても良く、該オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載 した配列の側方に位置するターゲットゲノム部位に相補的な塩基を含んでいても 良いし、本明細書に記載した配列の塩基を欠くものであってもよい。従って、Ｉ Ｅ４翻訳開始部位の配列ＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴは、相補的な従ってハイブリ ダイズし得る塩基を用いて、５′又は３′方向に延長して１２塩基を越えるオリ ゴヌクレオチドを得てもよく；１以上の塩基を切形（ｔｒｕｎｃａｔｅ）　して 、１２塩基を下回る有効なオリゴヌクレオチドを得てもよく；５′又は３一方向 に延長すると同時に非延長末端から１以上の塩基を欠失させて記載した配列の一 部のみを含むオリゴヌクレオチドを得てもよい。但し、得られるオリゴヌクレオ チドがＩＦ５の正常な転写又は翻訳を阻害する能力があることを条件とする。

スプライス部位についての理想的なターゲツティングは、できるだけ平等にエク ソン／イントロンジャンクションにまたがる（ｓｐａｎ）オリゴヌクレオチドに より達成できる。翻訳開始部位についての理想的なターゲツティングは、相補的 な３′から５′方向において、ＡＴＧ開始コドンから始まり、コード領域へと延 びるオリゴヌクレオチド（従って５′から３″方向へのオリゴヌクレオチドは最 後の３つの塩基としてＣＡＴを有する）により達成できる。

微生物、ウィルス又は自己複製性核酸の核酸を合成するのに必須の遺伝子は、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドにとり好ましいターゲットである（図２）。かか る遺伝子の例は、ＤＮＡ結合蛋白質、ジャイレース（ｇｙｒａｓｅｓ）、ヌクレ オチドトリホスフェート合成に関する酵素、ＤＮＡ複製に必要とされるＤＮＡヌ クレアーゼ及びポリメラーゼをコードするものである。また、転写開始部位又は プロモーター配列も含まれる。例示の生体ＨＳＶ−１において、適当な遺伝子は 、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、リボヌクレオ チドリダクターゼ遺伝子（ＲＲＩ　ｆｏｃｕｓ　（ＩＣＰ６としても知られる） 、及びＲＲ２１ｏｃｕｓ　（３８にとしても知られる））及びリボヌクレオチド リダクタ−おいて、ＶｍＷ６５　１ｏｃｕｓは、そのようなマスクゼに対する１ ８０にのような蛋白質を安定化する酵素をコードする遺伝子である。ポリメラー ゼ遺伝子にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、ＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣ ＣＧＧＡＡＡＡＧＡＴであり；ＴＫにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド は、ＴＧＧＣＡＧＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＣＣＡＴであり、ＲＲｌにハイブリダイ ズし得るオリゴヌクレオチドは、ＧＣＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＣＣＡＴで ある。

また、ターゲットとして好ましいのは、プロモーター配列のような転写に不可欠 の配列である。例えば、Ｈ８Ｖにおいては、ＩＥ遺伝子のプロモーターに共通の コンセンサス配列があり、その配列はＴＡＡＴＧＡＲＡＴであり、ここにおいて ＲはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ，Ｕ又はその機能的均等物を含む任意の塩基であり、上記機 能的均等物は置換されることができ相補性を保ち得る窒素含有塩基である。その 例は、イノシン及び５−メチル−シトシンである。

更に、その多くは翻訳されず、下流の遺伝子の順序圧しい発現を支配する調節遺 伝子も、アンチセンスオリゴヌクレオチドにとりターゲットとして特に適してい る。

これら初期に発現される調節遺伝子の多くは、マスター遺伝子（ｍａｓｔｅｒ　 ｇｅｎｅｓ）と呼ばれる。Ｈ３Ｖ−１ゲノムにあり−ＬＡＴ　０ＲＦ−２の開始 部位にハイブリダイズ−遺伝子の一つである。ＶｍＷ６５開始部位にハイブリダ イズし得るオリゴヌクレオチドが好適であり、例えば、ＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡ ＧＡＧＧＴＣＣＡＴ、ＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＴ、ＣＣＡＴＧＴＣＧＧＣＡＡ、 ＧＴＣＣＧＣＧＴＣＣＡＴ、ＧＣＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣ及びＴＧＧＣＧＡＡＧＣ ＧＣＣを挙げることができ；ＶｍＷ６５　ｍＲＮＡキャップ部位にハイブリダイ ズし得るオリゴヌクレオチドも充分なものであり、例えば、ＡＣＡＧＣＣＣＧＴ ＧＧＴｌＣＣＧＡＧＧＡＡＴＧＡＣ及びＣＣＧＴＴＣＣＣＧＡＧＧを挙げること ができる。

ターゲティングのために好適な他のセットの遺伝子は、病因に必須の遺伝子であ る。例えば、ウィルスにおいて、かかる遺伝子は、潜在性、細胞向性（ｃｅｌｌ 　ｔｒｏｐｉｓｍ）、感染すべき特異的細胞の選択又はビルジンスの決定に関与 するものである。Ｈ３Ｖ−１において、その様な遺伝子の一つは、ＬＡＴ（潜在 性−開運転写物、１ａｔｅｎｃｙ−ａｓｓ。

ｃｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）であり、適当なオリゴヌクレオチドは、 ＬＡＴ　０ＲＦ−１の開始部位にハイブリダイズし得るもの、例えば、ＣＡＣＴ ＧＧＣＡＴＧＧＡ、ＧＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＣＳＣＣＣＣＧＡＡＡＧＣＡＴ、Ｇ ＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＧ及びＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴでし得るもの、例えば、 ＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴ、ＣＣＡＴＧＴＴＧＧＧＣＡＳ　ＴＧＧＧＧＧＴＧＣ ＣＡＴ、ＧＡＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣ及びＧＧＴＧＣＧＴＧＧＧＡＧである。

既述のように、ＩＥ遺伝子は、Ｈ３Ｖ−１に限定されるものではなく、ヘルペス ウィルスに共通の特徴である。

関連するヘルペスウィルスにおけるＩＥ遺伝子ホモログは、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドにとり適当なターゲットである。従って、ＨＣＭｖにおいては、Ｈ ＣＭｖＩＥ２開始部位にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが適当であり 、例えば、ＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡ、ＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣＡＡ、ＡＧＡＧＧ ＡＣＴＣＣＡＴ、ＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣ及びＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣであ り、ＩＥ２ホモログｍＲＮＡキャップ部位にハイブリダイズし得るオリゴヌクレ オチドも適当であり、例えば、ＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡ、ＣＡＧＧＣＧＡＴＣ ＴＧＡ及びＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧを挙げることができる。

ＶＺｖにおいて、Ｈ３Ｖ−Ｉ　ＩＥＩＩＯ遺伝子ホモログは、遺伝子６１として 知られている。適当なオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＴ Ａ。

ＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＡＡ、、ＴＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＴ。

ＴＡＡＴＡＴＧＧＴＡＴＣ及びＡＣＣＧＣＣＣＧＣＴＡＡのような６１翻訳開始 部位にハイブリダイズし得るもノテアル。ＶＺＶ６２遺伝子は、Ｈ８Ｖ−Ｉ　Ｉ Ｅ３遺伝子のホモログである。適当なオリゴヌクレオチドは、例えば、ＴＧＧＧ ＧＴＧＡＡＴＴＴ、ＣＣＡＴＣＧＣＡＣＴＧＧＳＣＧＧＣＧＴＡＴＣＣＡＴＳＣ ＧＧＣＧＧＣＧＴＡＴＣ及びＧＣＧＣＴＧＣＡＴＣＧＧのような６２翻訳開始部 位にハイブリダイズし得るものである。

特に好ましいのは、互いの発現及び／又は機能を補いあう二つの遺伝子をターゲ ットとすることであり、例えば、代謝経路の蛋白質をコードする二つの遺伝子、 発生経路（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｐａｔｈｗａｙ）の二つの遺伝子、又 はそれぞれ異なる発生プログラム（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｐｒｏｇｒａ ｍ）の発現をコントロールする二つのマスター調節遺伝子、又はこれらのコンビ ネーションである。戦略（ｓｔｒａｔｅｇｙ）を知ることにより、当業者は、微 生物、ウィルス又は自己複製性核酸のターゲットとするべき適当な部分、従って オリゴヌクレオチドの適当なコンビネーションを容易に決定することができる。

好ましい実施態様において、本発明は２又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの使 用を企図するものであるが、単一のオリゴヌクレオチドが９０％を越えて有効で ある例がある。例えば、オリゴヌクレオチドＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧ、ＧＣＴ ＴＡＣＣＣＧＴＧＣ，ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴ及びＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴ は、それぞれ、単独使用した場合、Ｈ８Ｖ−１の増殖を抑制するのに有効である 。しかしながら、他のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用した場合、オリゴ ヌクレオチドの活性は、相加的又は相乗的に増大される。この現象は、より高い レベルの抑制又はより低い用量での有効性又はこれら両者の形で現れる。

正常な遺伝子発現に影響を与えることができるオリゴヌクレオチドの性質は、微 生物、ウィルス又は自己複製性核酸の核酸中の、天然の一本鎖核酸及び部分的に 溶解（ｍｅｌｔｅｄ）された二本鎖の領域を含む、存在する一本鎖領域に結合す ること、並びに、二本鎖核酸に結合して核酸三重式構造（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃ ｉｄ　ｔｒｉｐｌｅｘ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成することを含み、これは、 自らベースベアリングを起こし、又は自らの上に折り返された（ｆｏｌｄ　ｂａ ｃｋ　）−重鎖核酸に通常見出されるクローバ−リーフ構造（ｃｌｏｖｅｒｌｅ ａｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）及びステム−ループ構造（ｓｔｅｍ−１ｏｏｐ　５ ｔｒｕｃｔｕｒｅ）に結合することを含む。該トビツクの概説については、ウー ルマン及ペイマン（Ｕｈｌｒｎａｎｎ　＆　Ｐｅｙｍａｎｎ）　（Ｃｈ　ｅ　ｍ Ｒｅｖ　９０，５４４−５７９．１９９０）を参照されたい。

関連して興味深いことは、ＨＩＶ　（ヒト免疫不全ウィルス）に感染した多くの 人は、ＡＩＤＳ　（好天性免疫不全症候群）を発現させない。ＨＩＶの活性化に よりＡＩＤＳを引起こすのに必要とされるレベルまでその複製を増加するのには 、ＨＩＶ以外のファクターが必須であると信じられている。かかるファクターと しては、ＪＣを含むウィルス、Ｈ３Ｖ−１、Ｈ８Ｖ−２、ＨＣＭＶ、ＶＺＶＳＥ ＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＨｖ７を含むヘルペスウィルス及びアデノウィルスが挙げ られる。これらウィルスの特異的な遺伝子が、ウィルス複製レベルで直接的に、 又は、ＨＩＶプロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅ ｒ　ｇｅｎｅ）発現を活性化することにより間接的に、ＨＩＶの発現を活性化さ せる。従って、ヘルペ・　ス特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてヘ ルペスウィルスの増殖または複製を抑制することにより、ＨＩＶの活性化を防止 することができ、ＨＩ　Ｖｊｌ露からＡ、　Ｉ　Ｄ　Ｓの臨床的な症状発現に至 る事項の進行を間接的に妨げ得る。

以下、下記の非制限的な実施例により本発明をより一層詳しく説明する。

参考例 次に示す材料及び方法が、実施例で記載された実験において用いられた。

ベロ（Ｖｅｒｏ）　（アフリカのグリーンモンキーの腎臓）細胞は、２５ｍＭ　 ＨＥＰＥＳ及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清を含むイーグル最小必須培地（Ｍ　 Ｅ　Ｍ）で増殖させた。ＨＥｐ−２（人の類表皮癌（ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒ ｍｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞は、１０％子牛血清を含む１９９培地で増殖 させた。Ｕ９３７（人の組織球のリンパ腫）細胞は、熱不溶化子牛血清を含むＲ ＰＭ１１６４０で増殖させた。

オリゴ（ヌクレオシド−メチルホスホネート）は、例えばミラーら（Ｍｉｌｌｅ ｒ　ｅｔ、ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ　１８，５１３４−５１４３゜１９７９）　 、ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ、ａｌ、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１０ ゜９７９−９９１．１９８２）　、ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ、ａｌ、、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ　２５゜５０９２−５０９７．１９８６）　、米国特許第４４６９ ８６３号明細書及び米国特許第４５１１７１３号明細書のいずれかの記載に従い 合成した。簡潔には、そのプロセスは、例えば支持体としてポリスチレンを用い たソリッドフェイズテクニックである。該プロセスは、例えばメシチレンスルホ ニルテトラゾライド等の縮合剤の存在下に、３′−ヒドロキシ基を有する５′− 〇−保護ヌクレオシドをアルキル又はアリールホスホン酸でエステル化すること よりなる。その結果、５′−〇−保護ヌクレオシドー３′−〇−アルキル又はア リールホスホネートが得られる。この得られる化合物は、次いで、縮合剤の存在 下に、５′−ヒドロキシ基を有する３′−〇−保護ヌクレオシドでエステル化さ れて、全て保護されたジヌクレオシド−アルキル又はアリールホスホネートが得 られる。保護基はこのジヌクレオシド化合物から除去されて、ジヌクレオシド− アルキル又はアリールホスホネートが得られる。

例えばＮ−ベンゾイル保護基を有するｄＡ−含有オリゴマーの場合には、保護さ れたジヌクレオシドはヒドラジンで処理される。３′−〇−アセチル及び５′− 〇−ジメトキシトリチル保護基は、水酸化アンモニウム及び８０％酢酸で連続処 理することにより除去される。

適当な保護ヌクレオシドを用いて上記プロセスをステップの必要な回数だけ繰返 して、決められた長さとシーフェンスを有するオリゴヌクレオチドを得る。

また、このプロセスは、活性化剤の存在下に５′−ヒドロキシ基を有する３′− 〇−保護ヌクレオシドをアルキル又はアリールホスホネートでエステル化するこ とによっても行なうことができ、斯くして３′−〇−保護ヌクレオシドー５′− 〇−アルキル又はアリールホスホネートが得られる。この化合物は、次いで、活 性化剤の存やかに攪拌し、１０分間氷上に置いた。溶菌後、該懸濁右下に、３′ −ヒドロキシ基を有する５’　−〇−保護ヌクレオシドでエステル化されて、全 て保護されたジヌクレオシド−アルキル又はアリールホスホネートが得られる。

上述したように、保護基は除去されてジヌクレオシドアルキル又はアリールホス ホネートが得られる。より詳細な事柄は、上記各文献のうちの一つを参照するこ とにより得られる。

Ｈ３Ｖ−１は、５ｔｒｎａｄ　＆　Ａｕｒｅｌｉａｎ（Ｖｉｒｏｌ　８７，４０ １−４１５゜１９７８）に記載されているように、ベロ細胞又はＨＥｐ−２細胞 上で成長させ、滴定された。

細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）　ＲＮ　Ａは、ウィルス感染した細胞から抽 出した。ある場合には、感染された細胞をシクロヘキシイミド（５０μｇ／ｍｌ ）で処理すれば、ｍＲＮＡの生成が高められる。インフェクション後（ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）　６時間で、細胞を洗浄し、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを 含有する１００ｍＭトリス／塩酸（ｐＨ７，４）に採取した。この細胞を２Ｘ１ ０　／ｍｌ濃度で、１０ｍＭｈリス／塩酸（ｐＨ７，５）、１５０ｍＭ塩化ナト リウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ） 　Ｐ　−４０及び２０ｍＭバナジル　リボヌクレオシド　コンプレックスを含む 溶菌（ｌｙｓｉｓ）緩衝液に再懸濁させた。この懸濁液を穏ｏＨ４−５／２ｍＭ 硫酸亜鉛３００ｕｌ中、２８℃で１液を４００Ｘｇ、５分間遠心分離し、上澄液 を除去し、時間待なった。Ｓ１消化されたハイブリッドをフエノールスルホニル フルオライド）中に再懸濁させた。この懸濁液を１５分間氷上に置き、次いで冷 凍−解凍を５回行なった。この懸濁液を５０００Ｘｇで１０分間遠心分離を行な い、細胞崩壊物を取り除いた。８．５％ポリアクリルアミドゲル中、還元条件下 に電気泳動を行なった。

インビボでのアッセイのために、オリゴヌクレオチドの抗ウィルス作用をマウス で調べた。マウスを例えばエーテルを用いるか、又はベントパルビタールナトリ ウムを腹腔内注射することにより、麻酔にかけた。実験動物を約２Ｘ１０　〜ｌ Ｘｌ０６ｐｆｕのＨＳＶ−１で感染させた。この動物に、はぼ１０μｍ容量を耳 注射するか、又は約同容量をフットパッド（ｆｏｏｔ　ｐａｄ）注射した。実験 マウス群は、感染後０日又は０〜５日に注射した箇所にＰＥＧベース中のオリゴ マーで経皮的に（ｄｅｒｍａｌｌｙ）処理するか、或いは感染時にオリゴマーを 注射した。感染後６日にウィルスタイター（ｖｉｒｕｓ　ｔｉｔｅｒ）をめるべ く組織を試験した。ウィルスタイターはベロ細胞上で決定された。

クロラムフェニコール　アセチル　トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイのた めに、プラスミドｐＣＡＴＢ’及びライマーら（Ｗｙｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、Ｖｉｒｏ１６３、２７７３−２７８４．１９８９）により記載された方法を 用いて構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を調製した。このプラスミドは真核プロ モーター配列のないＣＡＴ構造遺伝子を含んでいる。

構築物ｐｌｃＰ１０−ｃａｔは、ＣＡＴ構造遺伝子の５′にインサートされたＩ ＣＰＩＯプロモーター、ＨＳＶ−２ＤＮＡの６４９塩基対フラグメントを含んで いる。

ＣＡＴ遺伝子をドライブするＨＩＶプロモーター（ＨＩＶ−ＬＴＲ）を持つプラ スミドもまた使用された。適当な転写シグナルをもって、ＣＡＴ　ｍＲＮＡが製 造され、細菌型ＣＡＴの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）が起こる。

ＣＡＴ活性を当業者に周知のアッセイを用いてモニターした。即ち、〔１４Ｃ〕 クロラムフエニコール基質０．２μＣｉを試験溶液と混合し、１時間インキュベ ートした。放射能を液体シンチレーションカウンターでモニターした。一般にベ ロ細胞を、ターゲットプラスミドｐ　ＩＣＰＩＯ−ｃａ　を及び上記ライマーら （Ｗｙｍｅｒ　ｅｔａｌ、　、　５ｕｐｒａ、　）に記載されたプラスミド（ｐ 　Ｉ　ＧＡ−１５）を含むトランスアクティベーティング（ｔｒａｎｓａｃｔｉ ｖａｔｉｎｇ）ＩＥＩＩＯで二トランスフェクト（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ）　 Ｌ、、た。

トランスフェクションされた混合物は、ターゲットプラスミド１ｍｇ及びトラン スアクティベー９−ＤＮＡＯ，１ｍｇを含んでいる。パラレル（ｐａｒａｌ　１ ｅｌ）コトランスフエクションは、非特異的ＤＮＡとしてｐＢＲ３２２を使い、 濃度効果を平等化（６ｑｕａｌｉｚｅ）する。組換えプラスミドｐＳＶ２ＣＡＴ をポジティブコントロールとして用い、プラスミドｐＣＡＴＢ’　をネガティブ コントロールとして用いた。トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクシ ョン後直ちに（０時間）加えられたオリゴマーの濃度を増加させている（０〜２ ５０μＭ）状態下に又はそうでない状態下にインキュベートし、４０〜４４時間 後に回収した。

ＨＩＶ力価（ｔｉｔｅｒ）は、シンシチウムフォーメーションアッセイにより決 定した。即ち、ＡＡ２細胞（２Ｘ１０４）を、１０％熱失活された子牛血清、非 必須アミノ酸、１ｍＭピルベート及び１．５μｇ／ｍｌポリブレン（ｐｏｌｙｂ ｒｅｎｅ　ｓシグマ社製）を含むＲＰＭ　１１６４０中、９６ウエル平底マイク ロリツタープレート中で生育させた。ＨＴＬＶ−１ｒ　ＩＢは、１０％熱失活さ れた子牛血清を含むＲＰＭＩ　１６４０中で生育させた感染ＭＯＬＴ−３細胞ラ インの上澄をきれいにすることにより得られた。ＭＯＬＴ−３上澄の２倍希釈物 １００μｍをＡＡ２カルチャーに加え、５〜８日間インキュベートした。感染ユ ニット（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｕｎｉｔ）として表わされた力価を、シンシチ ウムフォーメーションを起こす最高希釈の逆数で表わした。

実施例Ｉ ＨＳＶ−１による感染（細胞当り１０ｐｆｕ）時に、Ｖｅｒｏ細胞をドデカｖ　 −（ｄｏｄｅｃａｍｅｒ　）　、Ｔ　Ｔ　ＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧ　（０−１００ μＭ）に暴露し、２４時間後にウィルス力価（ｖｉｒｕｓ　ｔｉｔｅｒｓ）を測 定した。他のオリゴマーを同様な様式で使用した。それらの実験結果を図３に示 し、以下のページの表１に要約する。

オクトｖ　−（ｏｃｔｏｍｅｒ　）　ＴＣＣＴＣＣＴＧ及びドデカマーに暴露し た培養物は、用量に依存するＨＳＶ−１力価（ＨＳＶ−１ｔｉｔｅｒ　）の減少 を示した。１００μＭの濃度のドデカマーに暴露した培養物においてウィルスの 成長の有意な減少（９０−９８％）が見られた。

ＩＥ　ｍＲＮＡ４及び５は、スプライスアクセプター型（ｓｐｌｉｃｅ　ａｃｃ ｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ）において６５％の塩基配列の相同性を有するＨＳＶ−１ 及びＨＳＶ−２ゲノムに対して共直線性（ｃｏｌｉｎｅａｒ）である。表１に示 すように、オリゴヌクレオチドのいくつかは、他のオリゴヌクレオチドがＨＳＶ −１に特異的であるにもかかわらず両方の株に効力を有する。

表１ Ｈ３Ｖの成長に対するオリゴ（デオキシヌクレオシドメチルホスホネート配列） の効果 オリゴマー　％阻害 エクソン　インドｏン　Ｈ３Ｖ−Ｉ　Ｈ８Ｖ−２（３−ＡＡＧＧＡＧ　ＧＡＣＧ ＣＣ５＝）ＴＣＣＴＣＣＴＧ　８５　４０ ＴＴＣＣＴＣＣＴ　１４　ＮＤ ＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧ　３０　０ ＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧ　２６　０ ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧ　’　９８　０ＴＣＣＴＧＣＧＧ　ＯＯ ＴＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＧ　９　１２ ＧＣＧＧＧＡＡＧＧＣＡＣ００ ＴＣＣＣＴ　ＣＴＧ　０　０ Ｈ３Ｖ−１−又はＨ３Ｖ−２−感染したＶｅｒｏ細胞を感染後０時間で夫々のオ リゴマー（１００μＭ）で処理した。感染後２４時間でプラークアッセイによっ て感染性ウィルスを決定した。結果は各オリゴマーについての３から６実験の平 均値である。それらを適当なコントロール（オリゴマーなし）と比較したウィル ス力価のパーセント抑止率として表す。Ｈ３Ｖ−Ｉ　ＩＥ　ｍＲＮＡ　４アクセ プタ一スプライス部位を括弧内に示す。Ｈ８Ｖ−２１Ｅ　ｍＲＮＡ　４アクセプ タ一スプライス部位はＧＧＧＣＣＧ　ＧＡＣＧＣＴである。

感染時に１００μＭのドデカマーＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧで処理しなかった又 は処理したＨ８Ｖ−１−感染したＨＥｐ−２細胞から抽出した細胞質ＲＮＡ（１ ０μｇ）を、標識したＨ３Ｖプローブとハイブリッド形成させ（ｈｙｂｒｉｄｉ ｚｅｄ）　、その後、Ｓ１ヌクレアーゼで消化した。

非処理（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　）細胞からのヌクレアーゼ耐性生産物の中性ゲル 上でのバンドパターンは、５−リーダー（１ｅａｄｅｒ）からＨｉｎｄＩ　Ｉ　 Ｉ部位（１２００塩基対、ｂｐ）とスプライスジャンクションからＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位（９３０ｂ　ｐ）とを表すと解釈される二つの主要なバンド（ｍａｊｏｒ 　ｂａｎｄｓ　）からなっていた。

オリゴマー処理した細胞からのヌクレアーゼ耐性生産物は三つのバンドからなっ ていた。それらは、非処理細胞において特定されたものに相当する９３０ｂｐ及 び１２００ｂｐ生産物並びに非スプライス（ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ　）　ｍＲＮＡ 及び１２００ｂｐリーダーに結合した１４５ｂｐイントロンからなる追加のバン ドを含んでいた。

Ｓ１ヌクレアーゼ耐性生産物のアルカリ性ゲル上での分析によって、オリゴマー 処理した細胞中に非スプライスＩＥ　ｍＲＮＡ　４が存在することが確認された 。このように、スプライスジャンクションからＨｉｎｄＩ１１部位（約９００ｂ ｐ）に伸びる３′末端の転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を示す非処理Ｈ３Ｖ− １−感染した細胞における一つのバンドが観察された。

オリゴマー処理した細胞からのヌクレアーゼ耐性生産物は、９００ｂｐのバンド と５−リーダーがらイントロンを経て３−ＨｉｎｄＩＩＩ部位まで広がるＲＮＡ 転写物にたぶん対応した付加的な１３００ｂｐのバンドを含む二つのバンドを示 した。

比重走査（ｄｅｎｓｉｔｍｅｔｒｉｃ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　）により測定すると 、オリゴマー処理した細胞からのＩＥ　ｍＲＮＡ　４のおよそ１６−２０％が非 スプライスメツセージ（ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ　ｍｅｓｓａｇｅ）として存在して いた。

その結果、スプライスしたｍＲＮＡのレベル（ｌｅｖｅｌｓ）が約２０％低下し た。

実施例３ ２．８ｍＭのし一力ナバニンの存在下でＨＥｐ−２細胞をＨ３Ｖ−１（細胞当り ２５ｐｆｕ）で感染させるが又はＰＢＳで偽（ｍｏｃｋ）感染させた。（Ｌ−カ ナバニンは遺伝子発現をＩＥ（α）及びＥ（β）タンパク質のサブクラスに制限 する。）その後、その細胞を１００ｍＭのドデカマー、ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧ Ｇで処理した。

その細胞を感染後６−７時間で［３５Ｓ］メチオニン（１５０μＣｉ／ｍｌ）で 標識した。細胞抽出物を同じタンパク質濃度に調整し、ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ゲル分析から、細胞のタンパク質ではな くてウィルスのタンパク質の合成がオリゴマー処理によって有意に減少したこと が示された。

実施例４ 各オリゴマーについての二つの独立した実験において、ＩＥＩＩＯの翻訳開始部 位に相補的なドデカマーＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴと、ＩＥＩＩＯ第二のスプラ イスアクセプタ一部位（ｓｅｃｏｎｄ　５ｐｌｉｃｅ　ａｃｃｅｐｔｏｒ　５ｉ ｔｅ　）に相補的なドデカマーＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＡとによるＨ８Ｖ−１感 染した細胞の処理によって、ＣＡＴアッセイにおけるＩＥＩＩＯ−仲介トランス アクチベーション（ＩＥＩＩＯ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔ ｉｏｎ）について用量に依存する阻害が起こった。これらの実験においては、Ｖ ｅｒＯ細胞を１ｍｇのｐＩｃＰｌｏ−ｃａｔ　ＤＮＡ及び０．１ｍｇの活性化Ｉ ＥＩＩＯＤＮＡによってコトランスフエクションした（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃ ｔｅｄ）　。その細胞を、増大する濃度のオリゴマーの非存在下又は存在下で４ ０−４４時間成長させた。その細胞を収集してＣＡＴ活性をアッセイした。

２５０ｍＭのＧ　ＣＧ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　ＣＴ　ＣＣＡ　Ｔ　ｌ：暴露した細胞にお いて１００％の最高阻害が観察された。他のドデカマーはやや効力が小さかった 。阻害は特異的であり、ＩＥ　ｍＲＮＡ　４，５スプラスアクセプタ一部位に相 補的なドデカマーＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧはＩＥＩＩＯ−仲介トランスアクチ ベーションを阻害しなかった（図４）。

実施例５ ＨＳＶ−１の成長に対するＩＥ　ｍＲＮＡ４，５のドナースプライス部位（ｄｏ ｎｏｒ　５ｐｌｉｃｅ　５ｉｔｅ　）に対するオリゴマーの効果を、実施例１に 示したアクセプタースプライス部位（ａｃｃｅｐｔｏｒ　５ｐｌｉｃｅ　５ｉｔ ｅ）に対する該オリゴマーの効果と比較して決定した。

Ｖｅｒｏ細胞を細胞当たり１０ｐｆｕのＨＳＶ−１で感染させ、０−２００μＭ の濃度の四種の異なるドデカマーによって処理した。それらドデカマーは、実施 例４の二つ、実施例１のドデカマー、及びＩＥ４．　５　ｍＲＮＡスプライスド ナ一部位に相補的なドデカマー、ＧＣＴＴＡＣＣＣＧＴＧＣである。２４時間後 にウィルス力価を決定した。

図５に記載したように、ＩＥ　ｍＲＮＡ４．５アクセプター及びドナースプライ ス部位に相補的なドデカマーの双方により、１００−２００ｍＭの濃度範囲で、 ウィルス成長についての８５−９８％の阻害が起った。しかし、ｌＱｍ、ｏ、ｉ 、においては、ＩＥ　ｍＲＮＡ１翻訳開始部位に相補的なドデカマーによってウ ィルスの成長について最大的１５−２０％の阻害が生じ、ＩＥ　ｍＲＮＡ１第二 のスプライスアクセプタ一部位に相補的なドデカマーによっては阻害が起らなか った。

実施例６ 実施例４のドデカマーはＣＡＴ活性のＩＥＩＩＯ−仲介トランスアクチベーショ ンに対して用量に依存する阻害を示したが、該オリゴマーは１０ｍ、ｏ、ｉ、で はＨＳＶ−１の成長に対して最小の作用を有するか又は作用を有しなかった。

ＨＳＶ−１の成長の阻害に対するウィルス濃度の役割とＩＥＩＩＯオリゴマーの 能力とについて試験した。細胞当り１０ｐｆｕ又は０．１ｐｆｕの双方でＨＳＶ −１によって感染させたＶｅｒｏ細胞を感染時に０−２００ｍＭの濃度範囲にあ るオリゴマーＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴに暴露した。２４時間後にウィルス力価 を決定した。

二つの独立した実験について図６に結果を要約する。

ドデカマーによって、低ｍ、ｏ、ｉ、で感染させたＶｅｒｏ細胞においてウィル スの成長について有意な阻害がベロ細胞（Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌ）におけるウィル ス成長の阻害についての複数のオリゴヌクレオチドの使用の有効性を検討した。

−細胞当りＨＳＶ−１０，１ｐｆＵで感染時に、ベロ細胞を０〜２００ｍＭの濃 度のドデカｖ−（ｄｏｄｅｃａｍｅｒ）ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴ及びＴＴＣＣ ＴＣＣＴＧＣＧＧに暴露した。ウィルス力価（ｖｉｒｕｓ　ｔｉｔｅｒ）を２４ 時間後に測定した。

結果を図７Ａ及び７Ｂに示す。図中、ＩＥＩＩＯ及びＩＥ４，５として示された 二種のオリゴヌクレオチドのいずれもが、上記実施例１〜６に示されたものと同 様に、用量に依存した形で、１００〜２００ｍＭで９０〜９８％の最大阻害率（ ｍａｘｉｍａｌ　１ｎｈｉｂｉｔｉ。

ｎ）で、ウィルスの成長阻害を引き起こした。しかしながら、感染細胞を両方の オリゴマーで同時に処置した場合には、ウィルス阻害についての有効濃度範囲は 、いずれかのオリゴヌクレオチドを単独で用いて処置した場合よりも広（なる（ ２５〜２００　ｍＭ）。更に、複数のヌクレオチドによる処置では２５〜７５ｍ Ｍで大きな阻害率となり（８０〜９９．８％）、１０ｍＭではウィルス力価を５ ０％減少させる結果となった。

図７Ｂにおいて、データの結果は、２種類のオリゴマーの間の相乗的な相互作用 を証明する式にしたがって、算出され、提示された。この様にして示されたデー タは、非常に劇的な方法で、二種類のオリゴヌクレオチドの組み合わせにより、 ウィルスの複製が相乗的に阻害されたということを示している。

実施例８ 同様な研究として、ＩＥ４の開始部位（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）に相 補的なオリゴヌクレオチド（図８において、ＩＥ６８として示す）及びＩＥ５の 開始部位に相補的なオリゴヌクレオチド（図８において、ＩＥ１２として示す） について、上記した方法と同様にしてテストした。

図８に示したデータは、ＩＥ１２オリゴヌクレオチドはウィルスの成長阻害には 有効ではないが、他のヌクレオチドはオリゴヌクレオチド２５〜２００ｍＭの範 囲で、ウィルス成長について８５〜９５％の阻害率であったことを示している。

二種類のオリゴヌクレオチドを混合した場合には、ＩＥ５開始部位オリゴヌクレ オチドの結合及び抑制活性は減少しなかった。

実施例９ マウスをＨＳＶ−１（２０００ｐｆｕ）ｉ：感染させ、感染後０日、または０〜 ５日にオリゴマーで処置し、感染後６日に組織のウィルス力価を調べた。オリゴ マーによる一回の処置（５００μＭ）では、ウィルス成長にわずかな効果しかな かったが（２７％阻害率）、毎日適用した場合には、ウィルス力価について８２ ％の阻害率となった。投与量当りのウィルス濃度が高い場合（２×１０６ｐｆｕ ）には、ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧで一日二回処置した動物は（−日について合 計１０００μＭ投与）、病変の発現はなかった（未処理動物５１５に対して、０ １５）。

これらの研究と同様に、足部（ｆｏｏｔ　ｐａｄ）にＨＳＶ−１を接種しくｌＸ ｌ０６ｐ　ｆｕ）　、ついでドデカマー５０／ｉＭで二回処置した（免疫後１及 び２日）動物では、ウィルス力価の約８６％の減少が示された。

実施例１０ ）（ＩＶに感染した全ての人にＡＩＤＳが発現するわけではない理由は明らかで はないが、ＨＩＶ以外の多くの要因かウィルスの活性化に必要であることが明ら かになってきている。ＨＩＶ活性を高めることのできる要因の内で重要なものは 、ＪＣを含むウィルス、アデノウィルス及ヒＨＳ　Ｖ−１、Ｉ（ＳＶ−２、ＨＣ ＭＶ、ＶＺＶＳＥＢＶ、ＨＨＶ−６及びＨＨＶ−７を含むヘルペスウィルスであ る。ヘルペスウィルスの特定の遺伝子は、ウィルス複製のレベルで直接的に、ま たはＨＩＶプロモーターによって駆動されるリポータ−遺伝子の発現を活性化す ることによって、ＨＩＶの発現を活性化する。

Ｕ９３７細胞は、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターをＣＡＴ構造遺伝子の上流に有す る構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）及びＨＳＶ−Ｉ　ＩＥＩＩＯをコード化する配 列を有する構築物でコトランスフェクト（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ）された。つ いで、これらの同じトランスフェクトされた細胞を、ＩＥＩＩＯ遺伝子の開始部 位又はスプライシング部位（ａｐｌｉｃｅ　５ｉｔｅ）に相補的なオリゴマーで 処置した。４０時間培養した後、ＣＡＴの存在又は不存在を調べた。

代表的な実験結果を図９に示す。この実験では、三種類の異なったオリゴマーに ついてテストした。このうちの二種類はＩＥＩＩＯ配列に相補的であり、ＩＥ４ ，５として示されたオリゴマーは、関係のない遺伝子（ｕｎｒｅｌａｔｅｄ　ｇ ｅｎｅ）に相補的である。これらのオリゴマーは、二種類の異なった濃度で用い られた。ＩＥ１１０配列に相補的な二種類のオリゴマーは、第２のスプライシン グ部位に相補的なオリゴマーよりも高いレベルの活性を示す開始部位に相補的な オリゴマーにより、ＨＩＶプロモーターについて用量関連性の阻害率（ｄ。

５ｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）となった。この効果は、ＩＥ４ ，５オリゴマーが、ＨＩｖの活性化を大きくは阻害しないので、特異的である。

ウィルス成長をアッセイすることによりＨＩＶの活性化をモニターする他の実験 では（図１０）、ＨＩＶの成長は、ＨＳＶ　ＩＥ１１０’＋７）添加により２５ ００倍に高められ、開始部位に相補的なＩＥＩＩＯオリゴマーの添加により、有 意に減少することがわかった。

この図において、未処理細胞及び該オリゴマーで処置した細胞は、８日後にＨＩ Ｖの活性化を示さなかったが、Ｈ３Ｖ遺伝子生成物で処置した細胞はかなりの増 殖を示したということが理解されるであろう。

細胞を１５０ｒｎＭのオリゴマー及びＩＥＩＩＯの組み合わせで処置すると、中 程度のＨＩＶ成長が認められた。

しかしながら、ウィルス成長のレベルは、対照として示したプラスミドｐ　ＢＲ ３２２に細胞を暴露した場合に得られるＨＩＶ活性の程度と異ならなかった。

ヘルペスウィルスの関連性についての証明として、Ｕ９３７細胞をサイトメガロ ウィルスの同種（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）のＩＥ遺伝子生成物にも暴露した。活性 化の程度はＨ８ｖ遺伝子生成物について得られたもの程は大きくなかったが、Ｃ ＭＶ遺伝子生成物によりＨＩＶ成長の有意な増加があった。

実施例１１ 付加的な動物実験により、オリゴヌクレオチドの皮膚への塗布がウィルス複製の 阻害に有効であることが示された。

マウスをＨＳＶ−１に感染させ、感染時にオリゴヌクレオチドＴＴＣＣＴＣＣＴ ＧＣＧＧを皮肉注射した。ついで、その後、−日一回、ＰＥＧ　（ポリエチレン グリコール）クリームに懸濁させたオリゴヌクレオチドを感染位置に塗布した。

クリーム中のオリゴヌクレオチドの濃度は非経口投与の使用量の５倍量である５ ００μＭであった。

結果を表２に示す。

表２ ウィルスクリアランス（ｖｉｒｕｓ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ　）に対するＩＦ５， ５オリゴマーの効果 グループ（ｎ＝１０）　平均ウィルス力価／ｅａｒ　％阻害率　（３日） ウィルス投与量（Ｉ　Ｘ　１０’　ＰＦＵ）ビヒクル（無オリゴマー）２×１０ −４オリゴマー（５００μＭ）　５．０ｘｌＯ’　７５ウイルス投与量（Ｉ　Ｘ 　１０’　ＰＦＵ）ビヒクル（無オリゴマー’）　８Ｘ１０２オリゴマー（５０ ０μＭ）　’　６．８ｘｌＯＩ　９１．５二種類の投与量のいずれにおいても、 ウィルス力価は大きく減少したが、初期のウィルス投与量が少ない１×１０’ｐ ｆｕの場合にいくぶん良好な阻害率となった。

本明細書で引用されたすべての刊行物は、これに言及することにより本明細書に 含まれるものである。

本発明の組成物及び方法は、種々の具体化の形態によって本発明に含まれるもの であり、これらのうちのわずか数種のものが上記記載されたものであることは当 業者によって認識されるであろう。本発明は、その趣旨及び中心的な特徴から逸 脱することなく、他の具体的な形態で具体化することができる。記載された具体 例は、全ての点において、例示であってこれに限定的されるものではないという ことを考慮すべきである。請求の範囲と同等の意味を有し、同等の範囲内にある すべての変更は、明細書の開示を考慮して、請求の範囲に含まれるものとすべき である。

オリゴマー　μＭ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７Ａ ＥＩＥ１１０１／ＩＣ６ｏｒｒｅｎｏ＞ＦＩＧ、　７Ｂ オリゴマー１度　（ｕＭ） ＦＩＧ、８ 活性ｆｄ告数 口コ　オリゴマー；ム 乙　ＩＥ４，５のスプライス卸値 ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　７０ 国際調査報告 １．、．１４ｗ４ｗ−ＮＳ　ＰＣＴ／ＬＩＳ９１１０６６（＋６ＰＣＴ／１Ｊｓ ９１１０６６４６ ＡＪｔＵｎ＋ｔ　１６０６ フロントページの続き （７２）発明者　ツォー　ポール　オー、ビー。

アメリカ合衆国　２１０４３　メリーランドエリコツト　シティ−フロー　アベ ニュ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の群から選ばれるオリゴヌクレオチド；（ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】； （ｄ）【配列があります】； （ｅ）【配列があります】； （ｆ）【配列があります】； （ｇ）【配列があります】； （ｈ）【配列があります】； （ｉ）【配列があります】； （ｊ）【配列があります】； （ｋ）【配列があります】； （ｌ）【配列があります】； （ｍ）【配列があります】； （ｎ）【配列があります】； （ｏ）【配列があります】； （ｐ）【配列があります】； （ｑ）【配列があります】； （ｒ）【配列があります】； （ｓ）【配列があります】； （ｔ）【配列があります】； （ｕ）【配列があります】； （ｖ）【配列があります】； （ｗ）【配列があります】； （ｘ）【配列があります】； （ｙ）【配列があります】； （ｚ）【配列があります】； （ａａ）【配列があります】； （ｂｂ）【配列があります】； （ｃｃ）【配列があります】； （ｄｄ）【配列があります】； （ｅｅ）【配列があります】； （ｆｆ）【配列があります】； （ｇｇ）【配列があります】； （ｈｈ）【配列があります】； （ｉｉ）【配列があります】； （ｊｊ）【配列があります】； （ｋｋ）【配列があります】； （ｌｌ）【配列があります】； （ｍｍ）【配列があります】； （ｎｎ）【配列があります】； （ｏｏ）【配列があります】； （ｐｐ）【配列があります】； （ｑｑ）【配列があります】； （ｒｒ）【配列があります】； （ｓｓ）【配列があります】； （ｔｔ）【配列があります】； （ｕｕ）【配列があります】； （ｖｖ）【配列があります】； （ｗｗ）【配列があります】； （ｘｘ）【配列があります】； （ｙｙ）【配列があります】； （ｚｚ）【配列があります】； （ａ′）【配列があります】； （ｂ′）【配列があります】； （ｃ′）【配列があります】；および （ｄ′）【配列があります】； または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンであり、Ｒは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕまたはそ れらの機能性等価体である上記オリゴヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチ ドを含むリボース。 ２．下記の群から選択される請求項１のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ オチドを含むリボース；（ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】； （ｄ）【配列があります】； （ｅ）【配列があります】； （ｆ）【配列があります】； （ｇ）【配列があります】； （ｈ）【配列があります】； （ｉ）【配列があります】； （ｊ）【配列があります】； （ｋ）【配列があります】； （ｌ）【配列があります】； （ｍ）【配列があります】； （ｎ）【配列があります】； （ｏ）【配列があります】； （ｐ）【配列があります】； （ｑ）【配列があります】； （ｒ）【配列があります】； （ｓ）【配列があります】； （ｔ）【配列があります】； （ｕ）【配列があります】； （ｖ）【配列があります】； （ｗ）【配列があります】； （ｘ）【配列があります】； （ｙ）【配列があります】； （ｚ）【配列があります】； （ａａ）【配列があります】； （ｂｂ）【配列があります】； （ｃｃ）【配列があります】； （ｄｄ）【配列があります】； （ｅｅ）【配列があります】； （ｆｆ）【配列があります】； （ｇｇ）【配列があります】； （ｈｈ）【配列があります】； （ｉｉ）【配列があります】； （ｊｊ）【配列があります】； （ｋｋ）【配列があります】；および （ｌｌ）【配列があります】。 ３．下記の群から選択される請求項２のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ オチドを含むリボース；（ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】。４．下記の群から選択される請求項１のオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボース；（ａ）【配列があります】 ； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】； （ｄ）【配列があります】； （ｅ）【配列があります】； （ｆ）【配列があります】； （ｇ）【配列があります】；および （ｈ）【配列があります】。 ５．下記の群から選択される請求項１のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ オチドを含むリボース；（ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】； （ｄ）【配列があります】； （ｅ）【配列があります】； （ｆ）【配列があります】； （ｇ）【配列があります】； （ｈ）【配列があります】； （ｉ）【配列があります】；および （ｊ）【配列があります】。 ６．１または２以上の修飾されたヌクレオシドを含む、請求項１，２，３，４ま たは５のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボース。 ７．修飾されたヌクレオシドが、アリールまたはアルキル　ホスホネート　ヌク レオシドである請求項６のオリゴヌクレオチド。 ８．アリールまたはアルキル　ホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホネ ート　ヌクレオシドである請求項７のオリゴヌクレオチド。 ９．ヘルペスウイルスの核酸とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドを 含むヘルペスウイルスの生育乃至複製を抑制するための組成物。 １０．オリゴヌクレオチドが、キャップ部位、転写開始部位、翻訳開始部位或い はスプライス部位とハイブリッドを形成する請求項９の組成物。 １１．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エク ソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数とイ ントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項１０の組成物。 １２．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ 開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、そ の結果、５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基が Ｃ，ＡおよびＴの順序である請求項１０の組成物。 １３．オリゴヌクレオチドが、制御遺伝子、核酸複製に必要な遺伝子或いは発病 に関与する遺伝子とハイブリッドを形成する請求項９，１０，１１または１２の 組成物。 １４．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項１３の組成物。 １５．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項１３の組成物。 １６．オリゴヌクレオチドが、 （ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項１３の組成物。 １７．オリゴヌクレオチドが、１または２以上のアルキルまたはアリールホスホ ネート　ヌクレオシドを含む請求項９の組成物。 １８．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホネ ート　ヌクレオシドである請求項１７のオリゴヌクレオチド。 １９．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１また は２以上のアルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドを含む請求項１ ６の組成物。 ２０．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホネ ート　ヌクレオシドである請求項１９の組成物。 ２１．ヘルペスウイルスの核酸を、このヘルペスウイルスの核酸とハイブリッド を形成し得るオリゴヌクレオチドに接触させるステップを含むことを特徴とする ヘルペスウイルスの生育乃至複製を抑制する方法。 ２２．オリゴヌクレオチドが、キャップ部位、転写開始部位、翻訳開始部位或い はスプライス部位とハイブリッドを形成する請求項２１の方法。 ２３．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エク ソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数とイ ントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項２２の方法。 ２４．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ 開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、そ の結果、５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つのの基が Ｃ，ＡおよびＴの順序である請求項２２の方法。 ２５．オリゴヌクレオチドが、制御遺伝子、核酸複製に必要な遺伝子或いは発病 に関与する遺伝子とハイブリッドを形成する請求項２１，２２，２３または２４ の方法。 ２６．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項２５の方法。 ２７．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項２５の方法。 ２８．オリゴヌクレオチドが、 （ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項２５の方法。 ２９．オリゴヌクレオチドが、１または２以上のアルキルまたはアリールホスホ ネート　ヌクレオシドを含む請求項２１の方法。 ３０．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホネ ート　ヌクレオシドである請求項２９の方法。 ３１．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１また は２以上のアルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドを含む請求項２ ８の方法。 ３２．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホネ ート　ヌクレオシドである請求項３１の方法。 ３３．ヘルペスウイルスの核酸とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチド またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含むことを特 徴とするヘルペスウイルスの生育または複製を抑制するための治療用組成物。 ３４．オリゴヌクレオチドが、キャップ部位、転写開始部位、翻訳開始部位或い はスプライス部位とハイブリッドを形成する請求項３３の治療用組成物。 ３５．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エク ソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数とイ ントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項３４の治療用組成 物。 ３６．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ 開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、そ の結果５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基がＣ ，ＡおよびＴの順序である請求項３４の治療用組成物。 ３７．オリゴヌクレオチドが、制御遺伝子、核酸複製に必要な遺伝子或いは発病 に関与する遺伝子とハイブリッドを形成する請求項３３，３４，３５または３６ の治療用組成物。 ３８．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項３７の治療用組成物。 ３９．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項３７の治療用組成物。 ４０．オリゴヌクレオチドが、 （ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項３７の治療用組成物。 ４１．オリゴヌクレオチドが、１または２以上のアルキルまたはアリールホスホ ネート　ヌクレオシドを含む請求項３３の治療用組成物。 ４２．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホネ ート　ヌクレオシドである請求項４１の治療用組成物。 ４３．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１また は２以上のアルキルまたはアリール　ホスホネート　ヌクレオシドを含む請求項 ４０の治療用組成物。 ４４．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホネ ート　ヌクレオシドである請求項４３の治療用組成物。 ４５．ヘルペスウイルスに感染した宿主におけるヘルペスウイルスの生育乃至複 製を抑制するための治療方法であって、ヘルペスウイルスの核酸とハイブリッド を形成し得るオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩を含む治療用 組成物を医薬的有効量で該宿主に対して投与することを特徴とする方法。 ４６．オリゴヌクレオチドが、キャップ部位、転写開始部位、翻訳開始部位或い はスプライス部位とハイブリッドを形成する請求項４５の治療方法。 ４７．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エク ソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数とイ ントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項４６の治療方法。 ４８．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ 開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、そ の結果５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基がＣ ，ＡおよびＴの順序である請求項４６の治療方法。 ４９．オリゴヌクレオチドが、制御遺伝子、核酸複製に必要な遺伝子或いは発病 に関与する遺伝子とハイブリッドを形成する請求項４５，４６，４７または４８ の治療方法。 ５０．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項４９の治療方法。 ５１．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項４９の治療方法。 ５２．オリゴヌクレオチドが、 （ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項４９の治療方法。 ５３．オリゴヌクレオチドが、１または２以上のアルキルまたはアリールホスホ ネートヌクレオシドを含む請求項４５の治療方法。 ５４．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネー トヌクレオシドである請求項５３の治療方法。 ５５．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１また は２以上のアルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項５２ の治療方法。 ５６．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネー トヌクレオシドである請求項５５の治療方法。 ５７．下記のステップからなるヘルペスウイルスの検知方法： （１）核酸を含む生物学的サンプルを得るステップ；（２）上記のサンプルを処 理して、そこに含まれる核酸を一本鎖とするステップ； （３）上記の処理されたサンプルに、下記の群から選ばれ、標識化されたオリゴ ヌクレオチドを接触させるステップ、 （ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】； （ｄ）【配列があります】； （ｅ）【配列があります】； （ｆ）【配列があります】； （ｇ）【配列があります】； （ｈ）【配列があります】； （ｉ）【配列があります】； （ｊ）【配列があります】； （ｋ）【配列があります】； （ｌ）【配列があります】； （ｍ）【配列があります】； （ｎ）【配列があります】； （ｏ）【配列があります】； （ｐ）【配列があります】； （ｑ）【配列があります】； （ｒ）【配列があります】； （ｓ）【配列があります】； （ｔ）【配列があります】； （ｕ）【配列があります】； （ｖ）【配列があります】； （ｗ）【配列があります】； （ｘ）【配列があります】； （ｙ）【配列があります】； （ｚ）【配列があります】； （ａａ）【配列があります】； （ｂｂ）【配列があります】； （ｃｃ）【配列があります】； （ｄｄ）【配列があります】； （ｅｅ）【配列があります】； （ｆｆ）【配列があります】； （ｇｇ）【配列があります】； （ｈｈ）【配列があります】； （ｉｉ）【配列があります】； （ｊｊ）【配列があります】； （ｋｋ）【配列があります】； （ｌｌ）【配列があります】； （ｍｍ）【配列があります】； （ｎｎ）【配列があります】； （ｏｏ）【配列があります】； （ｐｐ）【配列があります】； （ｑｑ）【配列があります】； （ｒｒ）【配列があります】；または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース；および （４）ハイブリッド化配列を検知するステップ。 ５８．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１また は２以上の修飾されたヌクレオシドを含む請求項５７の方法。 ５９．修飾されたヌクレオシドが、アリールまたはアルキルホスホネートヌクレ オシドである請求項５８の方法。 ６０．アリールまたはアルキルホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネー トヌクレオシドである請求項５９の方法。 ６１．微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸中の非重複部位とハイブリッド を形成し得る少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする微生 物、ウイルスまたは自己複製性の核酸の生育乃至複製を抑制するための組成物。 ６２．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、キャップ部位、転写開始部位、 翻訳開始部位或いはスプライス部位とハイブリッドを形成し得る請求項６１の組 成物。 ６３．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エク ソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数とイ ントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項６２の組成物。 ６４．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ 開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、そ の結果５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基がＣ ，ＡおよびＴの順序である請求項６２の組成物。 ６５．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、制御遺伝子、核酸複製に必要な 遺伝子或いは発病に関与する遺伝子とハイブリッドを形成し得る請求項６１，６ ２，６３または６４の組成物。 ６６．オリゴヌクレオチドの１つが、微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸 中の核酸の第１の部分とハイブリッドを形成することができ、この第１の部分の 発現或いは機能はこれら微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸の第２の部分 の発現或いは機能のために必要であり、他のオリゴヌクレオチドが、該第２の部 分とハイブリッドを形成することができる請求項６５の組成物。 ６７．ウイルスが、ヘルペスウイルスである請求項６６の組成物。 ６８．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項６７の組成物。 ６９．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項６７の組成物。 ７０．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、（ｓｓ）【配列があります】； （ｔｔ）【配列があります】； （ｕｕ）【配列があります】； （ｖｖ）【配列があります】； （ｗｗ）【配列があります】； （ｘｘ）【配列があります】； （ｙｙ）【配列があります】； （ｚｚ）【配列があります】； （ａ′）【配列があります】； （ｂ′）【配列があります】； （ｃ′）【配列があります】；および （ｄ′）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項６７の組成物。 ７１．少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが、１または２以上のアルキルまた はアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項６１の組成物。 ７２．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネー トヌクレオシドである請求項７１の組成物。 ７３．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１また は２以上のアルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項７０ の組成物。 ７４．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネー トヌクレオシドである請求項７３の組成物。 ７５．微生物、ウイルスまたは自己複製性核酸の核酸を、これら微生物、ウイル スまたは自己複製性核酸の核酸中の非重複部位とハイブリッドを形成し得る少な くとも２つのオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含むことを特徴とする 微生物、ウイルスまたは自己複製性核酸の生育乃至複製を抑制するための方法。 ７６．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、キャップ部位、転写開始部位、 翻訳開始部位或いはスプライス部位とハイブリッドを形成し得る請求項７６の方 法。 ７７．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エク ソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数とイ ントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項７６の方法。 ７８．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ 開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、そ の結果５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基がＣ ，ＡおよびＴの順序である請求項７６の方法。 ７９．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、制御遺伝子、核酸複製に必要な 遺伝子或いは発病に関与する遺伝子とハイブリッドを形成し得る請求項７５，７ ６，７７または７８の方法。 ８０．オリゴヌクレオチドの１つが、微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸 中の核酸の第１の部分とハイブリッドを形成することができ、この第１の部分の 発現或いは機能はこれら微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸の第２の部分 の発現或いは機能のために必要であり、他のオリゴヌクレオチドが、該第２の部 分とハイブリッドを形成することができる請求項７９の方法。 ８１．ウイルスが、ヘルペスウイルスである請求項８０に記載の方法。 ８２．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項８１の方法。 ８３．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項８１の方法。 ８４．少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、（ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項８１の方法。 ８５．少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが、１または２以上のアルキルまた はアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項７５の方法。 ８６．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネー トヌクレオシドでむる請求項８５の方法。 ８７．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１また は２以上のアルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項８４ の方法。 ８８．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネー トヌクレオシドである請求項８７の方法。 ８９．微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸中の非重複部位とハイブリッド を形成し得る少なくとも２つのオリゴヌクレオチド或いはその薬学的に許容され る塩および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする微生物、ウイルスま たは自己複製性の核酸の生育乃至複製を抑制するための治療用組成物。 ９０．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、キャップ部位、転写開始部位、 翻訳開始部位或いはスプライス部位とハイブリッドを形成し得る請求項８９の治 療用組成物。 ９１．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エク ソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数とイ ントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項９０の治療用組成 物。 ９２．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ 開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、そ の結果５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基がＣ ，ＡおよびＴの順序である請求項９０の治療用組成物。 ９３．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、制御遺伝子、核酸複製に必要な 遺伝子或いは発病に関与する遺伝子とハイブリッドを形成し得る請求項８９，９ ０，９１または９２の治療用組成物。 ９４．オリゴヌクレオチド１つが、微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸中 の核酸の第１の部分とハイブリッドを形成することができ、この第１の部分の発 現或いは機能はこれら微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸の第２の部分の 発現或いは機能のために必要であり、他のオリゴヌクレオチドが、該第２の部分 とハイブリッドを形成することができる請求項９３の治療用組成物。 ９５．ウイルスが、ヘルペスウイルスである請求項９４の治療用組成物。 ９６．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項９５の治療用組成物。 ９７．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項９５の治療用組成物。 ９８．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、（ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項９５の治療用組成物。 ９９．少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが、１または２以上のアルキルまた はアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項８９の治療用組成物。 １００．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネ ートヌクレオシドである請求項９９の方法。 １０１．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１ま たは２以上のアルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項９ ８の方法。 １０２．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネ ートヌクレオシドである請求項１０１の方法。 １０３．微生物、ウイルスまたは自己複製性核酸のキャリヤーである宿主におけ る微生物、ウイルスまたは自己複製性核酸の生育乃至複製を抑制するための治療 方法であって、微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸中の非重複部位とハイ ブリッドを形成し得る少なくとも２つのオリゴヌクレオチド或いはその薬学的に 許容される塩および薬学的に許容される担体を治療を必要とする宿主に対し治療 有効量で投与することを特徴とする方法。 １０４．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、キャップ部位、転写開始部位 、翻訳開始部位或いはスプライス部位とハイブリッドを形成し得る請求項１０３ の治療方法。 １０５．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エ クソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数と イントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項１０４の治療方 法。 １０６．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴ Ｇ開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、 その結果５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基が Ｃ，ＡおよびＴの順序である請求項１０４の治療方法。 １０７．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、制御遺伝子、核酸複製に必要 な遺伝子或いは発病に関与する遺伝子とハイブリッドを形成し得る請求項１０３ ，１０４，１０５または１０６の治療方法。 １０８．オリゴヌクレオチドの１つが、微生物、ウイルスまたは自己複製性の核 酸中の核酸の第１の部分とハイブリッドを形成することができ、この第１の部分 の発現或いは機能はこれら微生物、ウイルスまたは自己複製性の核酸の第２の部 分の発現或いは機能のために必要であり、他のオリゴヌクレオチドが、該第２の 部分とハイブリッドを形成することができる請求項１０７の治療用組成物。 １０９．ウイルスが、ヘルペスウイルスである請求項１０８の治療方法。 １１０．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項１０９の治療方法。 １１１．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項１０９の治療用組成物。 １１２．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、（ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項１０９の治療用組成物。 １１３．オリゴヌクレオチドの少なくとも２つが、１または２以上のアルキルま たはアリールホスホネート　ヌクレオシドを含む請求項１０３の治療用組成物。 １１４．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホ ネート　ヌクレオシドである請求項１１３の方法。 １１５．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースが、１ま たは２以上のアルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドを含む請求項 １１２の方法。 １１６．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホ ネート　ヌクレオシドである請求項１１５の方法。 １１７．ヒト免疫不全ウイルスと第２のウイルスとを含むスペシメン中でヒト免 疫不全ウイルスの生育乃至複製を抑制するための方法であって、該第２のウイル スの核酸とハイブリッドを形成し得る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを上 記スペシメンに接触させるステップを含むことを特徴とする方法。 １１８．オリゴヌクレオチド少なくとも１つが、キャップ部位、転写開始部位、 翻訳開始部位或いはスプライス部位とハイブリッドを形成し得る請求項１１７の 方法。 １１９．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エ クソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数と イントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項１１８の方法。 １２０．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴ Ｇ開始コドンと相補的であって旦つコード領域中の３′塩基に隣接しており、そ の結果、５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基が Ｃ，ＡおよびＴの順序である請求項１１８の方法。 １２１．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、制御遺伝子、核酸複製に必要 な遺伝子或いは発病に関与する遺伝子とハイブリッドを形成し得る請求項１１７ ，１１８，１１９または１２０の方法。 １２２．第２のウイルスが、ヘルペスウイスルである請求項１２１の方法。 １２３．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項１２２の方法。 １２４．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項１２２の方法。 １２５．オリゴヌクレオチドが、 （ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項１２２の方法。 １２６．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、１または２以上のアルキルま たはアリールホスホネート　ヌクレオシドを含む請求項１１７の方法。 １２７．アルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオシドが、メチルホスホ ネート　ヌクレオシドである請求項１２６の方法。 １２８．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースの少なく とも１つが、１または２以上のアルキルまたはアリールホスホネート　ヌクレオ シドを含む請求項１２５の方法。 １２９．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネ ートヌクレオシドである請求項１２８の方法。 １３０．スペシメンが、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドと接触させられる 請求項１１７の方法。 １３１．ヒト免疫不全ウイルスと第２のウイルスとのキャリヤーである宿主にお けるヒト免疫不全ウイルスの生育乃至複製を抑制するための治療用組成物であっ て、該第２のウイルスの核酸とハイブリッドを形成し得る少なくとも１つのオリ ゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩および薬学的に許容される担体 を含むことを特徴とする組成物。 １３２．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、キャップ部位、転写開始部位 、翻訳開始部位或いはスプライス部位とハイブリッドを形成し得る請求項１３１ の治療用組成物。 １３３．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エ クソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数と イントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項１３２の治療用 組成物。 １３４．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴ Ｇ開始コドンと相補的であって、旦つコード領域中の３′塩基に隣接しており、 その結果５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基が Ｃ，ＡおよびＴの順序である請求項１３２の治療用組成物。 １３５．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、制御遺伝子、核酸複製に必要 な遺伝子或いは発病に関与する遺伝子とハイブリッドを形成し得る請求項１３１ ，１３２，１３３または１３４の治療用組成物。 １３６．第２の遺伝子が、ヘルペスウイルスである請求項１３５の治療用組成物 。 １３７．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項１３６の治療用組成 物。 １３８．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項１３６の治療用組成物。 １３９．オリゴヌクレオチドが、 （ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選はれるか、または ＴがＵにより置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項１３６の治療用組成物。 １４０．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、１または２以上のアルキルま たはアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項１３１の治療用組成物。 １４１．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネ ートヌクレオシドである請求項１４０の治療用組成物。 １４２．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースの少なく とも１つが、１または２以上のアルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシ ドを含む請求項１３９の治療用組成物。 １４３．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネ ートヌクレオシドである請求項１４２の治療用組成物。 １４４．少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む請求項１３１の治療用組成 物。 １４５．ヒト免疫不全ウイルスと第２のウイルスとのキャリヤーである宿主にお けるヒト免疫不全ウイルスの生育乃至複製を抑制するための治療方法であって、 該第２のウイルスを核酸とハイブリッドを形成し得る少なくとも１つのオリゴヌ クレオチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む治療用組成物を宿主に投与す ることを特徴とする方法。 １４６．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、キャップ部位、転写開始部位 、翻訳開始部位或いはスプライス部位とハイブリッドを形成し得る請求項１４５ の治療方法。 １４７．スプライス部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、エ クソン配列およびイントロン配列を有しており、エクソン配列を含む塩基の数と イントロン配列を含む塩基の数との差が０または１である請求項１４６の治療方 法。 １４８．翻訳開始部位とハイブリッドを形成し得るオリゴヌクレオチドが、ＡＴ Ｇ開始コドンと相補的であって、且つコード領域中の３′塩基に隣接しており、 その結果５′から３′への配向中の該オリゴヌクレオチドの最後の３つの塩基が Ｃ，ＡおよびＴの順序である請求項１４６の治療方法。 １４９．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、制御遺伝子、核酸複製に必要 な遺伝子或いは発病に関与する遺伝子とハイブリッドを形成し得る請求項１４５ ，１４６，１４７または１４８の治療方法。 １５０．第２のウイルスが、ヘルペスウイルスである請求項１４９の治療方法。 １５１．制御遺伝子が、即時型（ＩＥ）遺伝子である請求項１５０の治療方法。 １５２．制御遺伝子が、Ｖｍｗ６５である請求項１５０の治療方法。 １５３．オリゴヌクレオチドが、 （ａ）【配列があります】； （ｂ）【配列があります】； （ｃ）【配列があります】；および （ｄ）【配列があります】； からなる群から選ばれるか、または ＴがＵ的より置換されており；Ａ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＣは、アデニン、チミン、 グアニン、ウラシルおよびシトシンである上記オリゴヌクレオチドに対応するオ リゴヌクレオチドを含むリボース である請求項１５０の治療方法。 １５４．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、１または２以上のアルキルま たはアリールホスホネートヌクレオシドを含む請求項１５３の治療方法。 １５５．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネ ートヌクレオシドである請求項１５４の治療方法。 １５６．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むリボースの少なく とも１つが、１または２以上のアルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシ ドを含む請求項１４５の治療方法。 １５７．アルキルまたはアリールホスホネートヌクレオシドが、メチルホスホネ ートヌクレオシドである請求項１５６の治療方法。 １５８．細胞を少なくとも２種のオリゴヌクレオチドと接触させる請求項１４５ の治療方法。